BR112020005774A2 - biossíntese de retinoides - Google Patents

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Abstract

BIOSSÍNTESE DE RETINOIDES A presente invenção se refere a um processo enzimático inovador para a produção de retinoides através de um processo de múltiplas etapas, cujo processo inclui o uso de enzimas heterólogas que têm atividade em uma célula hospedeira produtora de caroteno, particularmente, em que tal processo resulta em alta porcentagem de retinoides, em isoforma trans.

Description

“BIOSSÍNTESE DE RETINOIDES”
[0001] A presente invenção se refere a um processo enzimático inovador para a produção de retinoides através de um processo de múltiplas etapas, cujo processo inclui o uso de enzimas heterólogas que têm atividade em uma célula hospedeira produtora de caroteno, particularmente, em que tal processo resulta em alta porcentagem de retinoides, em isoforma trans.
[0002] Os retinoides, incluindo a vitamina A, são um dos fatores nutricionais muito importantes e indispensáveis para os seres humanos, que precisam ser supridos através da nutrição. Os retinoides promovem o bem-estar dos seres humanos, entre outros, em relação à visão, ao sistema imunológico e ao crescimento.
[0003] Os métodos de produção química atuais para retinoides, incluindo vitamina A e precursores da mesma, têm algumas características indesejáveis, como, por exemplo, consumo de alta energia, etapas de purificação complicadas e/ou subprodutos indesejáveis. Portanto, nas últimas décadas, outras abordagens para fabricar retinoides, incluindo vitamina A e precursores da mesma, incluindo etapas de conversão microbiana, que seriam mais econômicas assim como ecológicas, foram investigadas.
[0004] Em geral, os sistemas biológicos que produzem retinoides são industrialmente intratáveis e/ou produzem os compostos em níveis tão baixos que o isolamento em escala comercial não é praticável. Há várias razões para isso, incluindo instabilidade dos retinoides em tais sistemas biológicos ou na produção relativamente alta de subprodutos.
[0005] Assim, uma tarefa contínua consiste em melhorar a especificidade do produto e/ou a produtividade da conversão enzimática de betacaroteno em vitamina A. particularmente, é desejável otimizar a produtividade e a seletividade de enzimas envolvidas na conversão de precursores e/ou intermediários.
[0006] De modo surpreendente, agora pode-se identificar um processo para a produção de ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, com uso de um organismo hospedeiro modificado, como uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, que compreende e que expressa genes envolvidos na conversão de betacaroteno em acetato de retinila, com uma conversão total de pelo menos cerca de 10 % para a geração de retinol e com uma porcentagem de acetato de trans-retinila de pelo menos 65 %.
[0007] Em particular, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira, particularmente, uma célula hospedeira produtora de carotenoide, como uma célula hospedeira fúngica, que compreende (1) uma betacaroteno oxidase estereosseletiva/trans-seletiva (BCO) que catalisa a conversão de betacaroteno em uma mistura retinal com uma porcentagem de pelo menos 65 % presente como trans-retinal, e (2) acetil transferases (ATFs) que catalisam a conversão de retinol em uma mistura de acetato de retinila com uma conversão total de pelo menos 10 % de retinol acetilado em ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila e em que as ATFs têm uma preferência para acetilação de trans- retinol. De preferência, pelo menos 80 % dos ésteres retinílicos estão na forma de acetato de retinila, de preferência, como acetato de trans-retinila.
[0008] Uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, de acordo com a presente invenção compreende opcional e adicionalmente (3) retinol desidrogenase (RDH) (de preferência, heterólogo) que tem capacidade para converter retinal em retinol, particularmente, com uma conversão total de pelo menos cerca de 90 % para a geração de retinol.
[0009] Uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, de acordo com a presente invenção compreende opcional e adicionalmente (4) uma modificação na atividade de aciltransferase endógena, isto é, atividade para acilação de retinol em ésteres retinílicos de cadeia longa, em que a dita modificação leva à redução ou supressão da dita atividade de aciltransferase endógena.
[0010] Como usado no presente documento, o termo "célula hospedeira fúngica" inclui particularmente levedura como célula hospedeira, como, por exemplo, Yarrowia ou Saccharomyces.
[0011] Como usado no presente documento, os termos enzima "estereosseletiva", "seletiva", "trans-seletiva" ou "seletiva de isômero trans" em relação à BCO são usados intercambiavelmente no presente documento. Os mesmos se referem às enzimas, isto é, BCOs como revelado no presente documento, com atividade catalítica aumentada para isômeros trans, isto é, atividade aumentada para catálise de betacaroteno em trans-retinal. Uma enzima de acordo com a presente invenção é trans-específica, se a porcentagem de trans-isoformas, como, por exemplo, trans-retinal, estiver na faixa de pelo menos cerca de 65 % com base nas quantidades totais de retinoides produzidas por tal enzima ou por tal célula hospedeira produtora de caroteno, particularmente, célula hospedeira fúngica, que compreende/expressa tal enzima.
[0012] Como usado no presente documento, os termos “enzima de oxidação de betacaroteno”, “betacaroteno oxigenase”, “enzima que tem atividade de oxidação de betacaroteno” ou “BCO” são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a enzimas que têm capacidade de catalisar a conversão de betacaroteno em retinal de uma maneira seletiva de isômero trans, que leva a uma mistura retinal com pelo menos cerca de 65 %, como, por exemplo, 68, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 % ou até 100 %, de retinal em isoforma trans, com base na quantidade total de retinoides que incluem retinal produzido pela dita célula hospedeira.
[0013] BCOs trans-seletivas como definido no presente documento devem ser obtidas a partir de qualquer fonte, como, por exemplo, de planta, animal, de bactéria, fúngica e de algas. BCOs estereosseletivas úteis particulares são obtidas a partir de fungos, em particular, Dikarya, incluindo, porém sem limitação, fungos selecionados a partir de Ascomycota ou Basidiomycota, de preferência, obtidas a partir de Fusarium ou Ustilago, com mais preferência, isoladas de F. fujikuroi ou U. maydis, como, por exemplo, FfCarX (sequência de polipeptídeos derivada de AJ854252), UmCCO1 (sequência de polipeptídeos derivada de EAK81726). Além disso, particularmente, BCOs estereosseletivas úteis são obtidas a partir de insetos, em particular, Diptera, de preferência, obtidas a partir de Drosophila, com mais preferência, de D.
melanogaster, como, por exemplo, DmNinaB ou DmBCO (sequência de polipeptídeos derivada de NP_650307.2). Além disso, particularmente, BCOs estereosseletivas úteis são obtidas a partir de plantas, em particular, Angiosperms, de preferência, obtidas a partir de Crocus, com mais preferência, de C. sativus, como, por exemplo, CsZCO (sequência de polipeptídeos derivada de Q84K96.1). Além disso, particularmente, BCOs estereosseletivas úteis são obtidas a partir de eucariotos, em particular, pesces, de preferência, obtidas a partir de Danio ou Ictalurus, com mais preferência, de D. rerio ou I. punctatus, como, por exemplo, DrBCO1, IpBCO (sequência de polipeptídeos derivada de XP_017333634).
[0014] Assim, em um aspecto, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, uma célula hospedeira fúngica, usada para biossíntese de retinoides que incluem vitamina A, em que a dita célula hospedeira compreende um polipeptídeo com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade para um polipeptídeo conhecido a partir da base de dados selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7 ou polinucleotídeos que codificam tais sequências, ou um polipeptídeo com pelo menos 50 %, como, por exemplo, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 93, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade para um polipeptídeo de acordo com SEQ ID NOs:9, 11, 13, 15, 17 ou polinucleotídeos que codificam tais sequências.
[0015] Além da BCO estereosseletiva como descrito acima, que é, de preferência, heterólogo expressado na célula hospedeira produtora de caroteno, particularmente, célula hospedeira fúngica, como definido no presente documento, a célula hospedeira compreende adicionalmente (2) acetil transferases (ATFs) que catalisa a conversão de retinol em uma mistura de acetato de retinila com uma conversão total de pelo menos 10 % de retinol acetilado em ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila e em que as ATFs têm uma preferência para acetilação de trans-retinol.
[0016] Como usado no presente documento, os termos “acetil transferase”, “enzima de acetilação de retinol”, “enzima que tem atividade de acetilação de retinol” ou “ATF” são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a enzimas [EC 2.3.1.84] que têm capacidade para catalisar a conversão de retinol em acetato de retinila com uma quantidade de pelo menos 80 %, cerca de 87, 90, 92, 95, 97, 99 ou até 100 % de acetato de retinila produzido na isoforma trans. As ditas ATFs têm capacidade de converter retinol, de preferência, trans-retinol, em éster retinílico, particularmente, acetato de retinila, com uma conversão total de pelo menos cerca de 10 %, de preferência, 12, 15, 20, 30, 40, 50, 80, 90 ou mesmo 100 % (com base na quantidade total de retinoides contida na mistura de retinol produzida pela dita célula hospedeira) para geração de ésteres retinílicos, por exemplo, acetato de retinila. Uma isoforma preferencial é ATF1.
[0017] ATFs como definido no presente documento devem ser obtidas a partir de qualquer fonte, como, por exemplo, plantas, animais, incluindo humanos, algas, fungos, incluindo levedura ou bactéria. ATFs úteis particulares, de preferência, enzimas ATF1, são obtidas a partir de levedura, em particular, Saccharomyces ou Lachancea, de preferência,
obtidas a partir de Saccharomyces bayanus, como, por exemplo, SbATF1 (sequência de polipeptídeos derivada de AHX23958.1), Lachancea mirantina (LmATF1; SEQ ID NO:33), ou Lachancea fermentati como LfATF1 (sequência de polipeptídeos derivada de SCW02964.1) ou LffATF1 sequência de polipeptídeos derivada de LT598487). Além disso, particularmente, enzimas ATF1 úteis são obtidas a partir de plantas, incluindo, porém sem limitação, plantas selecionadas a partir de Petunia, Euonymus, Malus, ou Fragaria, de preferência, obtidas a partir de P. hybrida, como PhATF (sequência de polipeptídeos derivada de ABG75942.1), E. alatus, como EaCAcT (sequência de polipeptídeos derivada de ADF57327.1), M. domestica (sequência de polipeptídeos derivada de AY517491) ou F. ananassa (sequência de polipeptídeos derivada de AEM43830.1). Além disso, particularmente, as enzimas ATF1 úteis são obtidas a partir de Escherichia, de preferência, E. coli, como, por exemplo, EcCAT (sequência de polipeptídeos derivada de EDS05563.1).
[0018] Assim, em um aspecto, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, uma célula hospedeira fúngica, usada para biossíntese de retinoides que incluem vitamina A, em que a dita célula hospedeira compreende: (1) um polipeptídeo com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade para um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1, 3, 5 e 7 ou um polipeptídeo com pelo menos 50 %, como, por exemplo, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 93, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade para um polipeptídeo selecionado a partir de SEQ ID NO:9,
11, 13, 15 ou 17; e (2) um polipeptídeo com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade para um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 36, ou 38 como codificado por um polinucleotídeo que inclui uma sequência de nucleotídeos de acordo com SEQ ID NO:22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 37 ou 39.
[0019] De acordo com um aspecto da presente invenção, a célula hospedeira produtora de carotenoide que compreende (1) BCOs estereosseletivas como definido no presente documento e (2) ATFs de ação trans, de preferência, enzimas ATF1, usadas em um processo para a produção de acetato de retinila com uma porcentagem de pelo menos 80 % presente como isoformas trans na mistura de acetato de retinila, dita célula hospedeira que compreende adicionalmente desidrogenase de retinol seletiva (RDHs) que catalisa a redução de retinal em retinol com uma conversão total de pelo menos 90 % para a produção de retinol.
[0020] Como usado no presente documento, os termos “retinal reductase”, “retinol desidrogenase”, “enzima que tem atividade de redução de retinal” ou “RDH” são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a enzimas [EC 1.1.1.105] que quase exclusivamente (90 % ou mais) têm capacidade para catalisar a conversão de retinal em retinol, isto é, que têm capacidade para catalisar a conversão de retinal em retinol com uma conversão total de pelo menos cerca de 90 %, de preferência, 92, 95, 97, 98, 99 ou até mesmo 100 % para formação de retinol.
[0021] Para o propósito da presente invenção, qualquer enzima de redução de retinal que resulta em um aumento de pelo menos cerca de 18 %, como, por exemplo, pelo menos cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 % para a formação de retinol pode ser usada em um processo como definido no presente documento, em que tal aumento é calculado sobre a formação de retinol com uso de RDHs endógenas presentes em células hospedeiras de produção de carotenoide adequadas, particularmente, células hospedeiras de fungos, como, por exemplo, cepas de Yarrowia ou Saccharomyces.
[0022] AS RDHs com atividade para a formação de retinol, isto é, reação de redução de retinal, como definido no presente documento, podem ser obtidas a partir de qualquer fonte, como, por exemplo, plantas, animais, incluindo seres humanos, algas, fungos, incluindo levedura e bactérias. As RDHs úteis particulares são obtidas a partir de fungos, em particular, Dikarya, incluindo, porém sem limitação, fungos selecionados a partir de Ascomycota, de preferência, obtidas a partir de Fusarium, com mais preferência, isoladas de F. fujikuroi, como, por exemplo, FfRDH12 (SEQ ID NO:19).
[0023] Assim, em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, uma célula hospedeira fúngica, usada para biossíntese de retinoides que incluem vitamina A, em que a dita célula hospedeira compreende: (1) um polipeptídeo com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade para um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1, 3, 5 e 7 ou um polipeptídeo com pelo menos 50 %, como, por exemplo, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 93, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade para um polipeptídeo selecionado a partir de SEQ ID NO:9, 11, 13, 15 ou 17; (2) um polipeptídeo com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade para um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 36, ou 38 como codificado por um polinucleotídeo que inclui uma sequência de nucleotídeos de acordo com SEQ ID NO:22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 37 ou 39; e (3) um polipeptídeo com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade para um polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:19, codificado por um polinucleotídeo que inclui uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com SEQ ID NO:20.
[0024] De acordo com um outro aspecto da presente invenção, a célula hospedeira produtora de carotenoide de acordo com a presente invenção é usada em um processo para a produção de acetato de retinila com uma porcentagem de pelo menos 65 % presente as isoformas trans, em que a dita célula hospedeira compreende (1) estereosseletiva ou BCOs trans-seletivas como definido no presente documento, (2) ATFs como definido no presente documento, como ATF1, com preferência para acetilação de trans-retinol, (3) RDHs com cerca de 90 % ou mais atividade para a formação de retinol através da redução de retinal, que compreende opcional e adicionalmente modificações na atividade de aciltransferase endógena, como atividade endógena suprimida ou reduzida para acilação de retinol em ésteres retinílicos de cadeia longa.
[0025] Como usado no presente documento, os termos “aciltransferase”, “enzima de acilação de retinol”, “enzima que tem atividade de acilação de retinol” são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a enzimas que têm capacidade para catalisar a conversão de retinol em ésteres retinílicos de cadeia longa. As enzimas de acilação adequadas devem ser selecionadas a partir de membros da família acil-CoA:diacilglicerol aciltransferase [EC 2.3.1], incluindo, porém sem limitação, DGATs [EC 2.3.1.20] como, por exemplo, DGAT1 ou DGAT2, ARATs, mdy.
[0026] Assim, em uma modalidade, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, uma célula hospedeira fúngica, usada para biossíntese de retinoides que incluem vitamina A, em que a dita célula hospedeira compreende: (1) um polipeptídeo com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade para um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1, 3, 5 e 7 ou um polipeptídeo com pelo menos 50 %, como, por exemplo, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 93, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade para um polipeptídeo selecionado a partir de SEQ ID NO:9, 11, 13, 15 ou 17; (2) um polipeptídeo com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade para um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 36, ou 38 como codificado por um polinucleotídeo que inclui uma sequência de nucleotídeos de acordo com SEQ ID NO:22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 37 ou 39; (3) um polipeptídeo com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade para um polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:19, codificado por um polinucleotídeo que inclui uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com SEQ ID NO:20; e (4) atividade reduzida ou suprimida de um polipeptídeo que tem atividade de aciltransferase que catalisa a acetilação de retinol em ésteres retinílicos de cadeia longa, como DGATs [EC 2.3.1.20].
[0027] A modificação em relação à atividade de acilação em um processo para a produção de retinoides com uso da célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como definido no presente documento, significa uma redução ou supressão do gene (ou genes) endógeno que codifica a atividade de aciltransferase, de modo que a atividade de aciltransferases endógenas seja reduzida ou suprimida, de preferência, suprimida, em que a dita célula hospedeira tem capacidade ou é usada para a produção de uma mistura de acetato de retinila que compreende pelo menos cerca de 65 % em isoforma trans em comparação a uma célula hospedeira que expressa as respectivas aciltransferases endógenas antes da modificação da célula hospedeira, isto é, em que as aciltransferases endógenas ainda são ativas. Ao usar a dita célula hospedeira em um processo de produção de vitamina A, a porcentagem de isoformas trans, como acetato de trans-retinila, pode ser aumentada para cerca de 65 % ou mais, de preferência, como 68, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou até 100 % com base na quantidade total de ésteres retinílicos.
[0028] Redução ou supressão de atividade de gene/proteína endógena, como atividade de retinol aciltransferase, deve ser alcançada por, por exemplo, introdução de mutação (ou mutações) no gene (ou genes) endógeno que codifica as enzimas que têm a dita atividade, como atividade de aciltransferase. A pessoa versada sabe como manipular geneticamente uma célula hospedeira como definido no presente documento que resulta na redução ou supressão de tal atividade, por exemplo, atividade de aciltransferase. Essas manipulações genéticas incluem, porém sem limitação, por exemplo, substituição de gene, amplificação de gene, rompimento de gene, transfecção, transformação com uso de plasmídeos, vírus ou outros vetores.
[0029] A geração de uma mutação em ácidos nucleicos ou aminoácidos, isto é, mutagênese, pode ser realizada de formas diferentes, como, por exemplo, por mutagênese aleatória ou lateral, danos físicos provocados por agentes, como, por exemplo, radiação, tratamento químico ou inserção de elemento genético. A pessoa versada sabe como introduzir as mutações.
[0030] As modificações a fim de terem a célula hospedeira como definido no presente documento para produzir poucas ou nenhuma cópia de genes e/ou proteínas, como, por exemplo, enzimas de acilação como definido no presente documento, isto é, a fim de terem poucas ou nenhuma atividade de aciltransferase, podem incluir o uso de promotores fracos, ou a mutação (por exemplo, inserção, deleção ou mutação de ponto) das (partes ou) respectivas enzimas (como descrito no presente documento), em particular, seus elementos reguladores. Um exemplo de tal manipulação genética pode, por exemplo, afetar a interação com o DNA que é mediado pela região de terminal N de enzimas como definido no presente documento ou interação com outras moléculas efetoras. Em particular, modificações que levam à atividade de enzima específica reduzida ou suprimida podem ser executadas em partes funcionais, como funcional para a atividade catalítica, das proteínas. Além disso, a redução ou supressão de atividade específica de enzima deve ser alcançada ao colocar as ditas enzimas em contato com inibidores específicos ou outras substâncias que interagem especificamente entre si. A fim de identificar tais inibidores, as respectivas enzimas, como, por exemplo, as enzimas de acilação como definido no presente documento, podem ser expressas e testas para atividade na presença de compostos suspeitos de inibir sua atividade.
[0031] As modificações a fim de terem a célula hospedeira como definido no presente documento para produzir mais cópias de genes e/ou proteínas, como, por exemplo, BCOs estereosseletivas, ATFs e/ou RDHs (de ação trans) com seletividade para a formação de retinol como definido no presente documento, podem incluir o uso de promotores fortes, melhoradores transcricionais e/ou translacionais ou a introdução de uma ou mais cópias de gene na célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, que leva ao acúmulo aumentado das respectivas enzimas em um determinado tempo. A pessoa versada sabe quais técnicas usar na dependência da célula hospedeira. O aumento ou a redução de expressão de gene pode ser medida por vários métodos, como, por exemplo, tecnologia de Northern, Southern ou Western blot como conhecido na técnica.
[0032] Os termos “conversão”, “oxidação”, “redução”, “acilação”, “acetilação” em conexão com catálise enzimática de enzimas como definido no presente documento são reconhecidos na técnica e se referem às ações das enzimas para a formação/produção de retinoides, em particular, acetato de retinila.
[0033] De preferência, as enzimas usadas em um processo para a produção de retinoides, em particular, acetato de retinila como definido no presente documento, são expressas como enzimas heterólogas. As mesmas devem ser integradas em vetores de expressão adequados ou devem ser integradas no DNA cromossomal. Tal célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, que compreende um polinucleotídeo heterólogo em um vetor de expressão ou integrada no DNA cromossomal da célula hospedeira que codifica enzimas envolvidas na produção de retinoide, em particular, produção de acetato de retinila como descrito no presente documento, é chamada de uma célula hospedeira recombinante.
[0034] Em um aspecto particular, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, que porta uma ou mais modificações (genéticas) como definido no presente documento, a serem usadas em um processo para a produção de retinoides, em particular, acetato de retinila com pelo menos cerca de 65-90 % do acetato de retinila em isoforma trans e em que a porcentagem de formas de retinol acetilado, isto é, ésteres retinílicos, como acetato de retinila, é cerca de pelo menos 10 % com base na quantidade total de retinoides produzidos pela dita célula hospedeira.
[0035] De acordo com um outro aspecto da presente invenção, a quantidade de retinoides extracelulares produzidos com uma célula hospedeira produtora de carotenoide como definido no presente documento pode ser aumentada, em particular, com uso de uma célula hospedeira produtora de carotenoide que é selecionada a partir de fungos que incluem levedura, como, por exemplo, Yarrowia ou Saccharomyces. Assim, um processo como descrito no presente documento leva a pelo menos 80 % de retinoides exportados para fora da célula, como, por exemplo, 85, 90, 92, 95, 98, 99 ou até 100 % dos retinoides, em particular, acetato de retinila com, de preferência, uma porcentagem de cerca de pelo menos 80 % em isoforma trans. Isso é, em particular, útil em relação às etapas de purificação e isolamento adicionais.
[0036] As células hospedeiras de produção de carotenoide conhecidas usadas para o processo como descrito no presente documento devem ser selecionadas a partir de quaisquer (micro)organismos, que é adequado para a produção de carotenoide/retinoide e que permite a expressão dos ácidos nucleicos que codificam uma das enzimas como revelado no presente documento, incluindo derivados ou equivalentes funcionais como descrito no presente documento. Os exemplos de (micro)organismos hospedeiros de produção de carotenoide/retinoide adequados são bactéria, algas, fungos, incluindo células de leveduras, planta ou animal. As bactérias preferenciais são aquelas do gênero Escherichia, como, por exemplo, Escherichia coli, Streptomyces, Pantoea (Erwinia), Bacillus, Flavobacterium, Synechococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Mixococcus, Brevibacterium, Bradyrhizobium, Gordonia, Dietzia, Muricauda, Sphingomonas, Synochocystis, Paracoccus, como, por exemplo, Paracoccus zeaxanthinifaciens. Os microrganismos eucarióticos preferenciais, em particular, fungos incluindo levedura, são selecionados a partir de Saccharomyces, como
Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, como Aspergillus niger, Pichia, como Pichia pastoris, Hansenula, como Hansenula polymorpha, Phycomyces, como Phycomyces blakesleanus, Mucor, Rhodotorula, Sporobolomyces, Xanthophyllomyces, Phaffia, Blakeslea, como, por exemplo, Blakeslea trispora, ou Yarrowia, como Yarrowia lipolytica. A expressão é particularmente preferencial em uma célula hospedeira fúngica, como, por exemplo, Yarrowia ou Saccharomyces, ou expressão in Escherichia, com mais preferência expressão em Yarrowia lipolytica ou Saccharomyces cerevisiae.
[0037] Em relação à presente invenção, entende-se que os organismos, como, por exemplo, microrganismos, fungos, algas ou plantas, incluem também sinônimos ou basônimos de tais espécies que têm as mesmas propriedades fisiológicas, como definido pelo Código Internacional de Nomenclatura de Procariotas ou pelo Código Internacional de Nomenclatura para algas, fungos e plantas (Código de Melbourne). Assim, por exemplo, a cepa Lachancea mirantina é um sinônimo da cepa Zygosaccharomyces sp. IFO 11066, originada do Japão.
[0038] Dependendo da célula hospedeira, os polinucleotídeos como definido no presente documento, como, por exemplo, os polinucleotídeos que codificam BCOs, RDHs, ATFs como definido no presente documento, devem ser otimizados para expressão na respectiva célula hospedeira. A pessoa versada sabe como gerar tais polinucleotídeos modificados. Entende-se que os polinucleotídeos como definido no presente documento abrange também tais moléculas de ácido nucleico otimizadas por hospedeiro desde que os mesmos expressem o polipeptídeo com as respectivas atividades como definido no presente documento.
[0039] Assim, em uma modalidade, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, que compreende polinucleotídeos que codificam BCOs, ATFs e/ou RDHs como definido no presente documento que são otimizadas para expressão na dita célula hospedeira, sem impacto no crescimento do padrão de expressão da célula hospedeira ou das enzimas. Particularmente, uma célula hospedeira produtora de carotenoide é selecionada a partir de Yarrowia, como Yarrowia lipolytica, que compreende sequências de polinucleotídeos otimizadas selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 35, 37 e 39 ou sequências com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade das mesmas.
[0040] A presente invenção se refere a um processo para a produção de uma mistura de retinil éster que compreende acetato de retinila, de preferência, com uma porcentagem de pelo menos 65 % de um acetato de trans-retinila, através da atividade enzimática de (1) BCO estereoespecífica como definido no presente documento, que compreende colocar o betacaroteno em contato com a dita BCO que leva a uma mistura retinal com uma porcentagem de pelo menos 65 %, como, por exemplo, pelo menos 65-90 %, de trans-retinal, e (2) uma das enzimas Atf1 como definido no presente documento, que compreendem colocar o retinol, de preferência, trans-retinol ou uma mistura de retinol com pelo menos 65-90 % em isoforma trans, em contato com a dita enzima Atf1. Particularmente, a invenção se refere a um processo para a produção de vitamina A, em que o dito processo compreende (a) introduzir uma molécula de ácido nucleico que codifica (1) uma das enzimas de BCO estereosseletiva como definido no presente documento e (2) uma das enzimas Atf1 como definido no presente documento em uma célula hospedeira adequada de produção de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como definido no presente documento, (b) conversão enzimática de betacaroteno em retinal, com pelo menos cerca de 65 % de trans-retinal, conversão enzimática, isto é, acetilação, de retinol, de preferência, com uma porcentagem de pelo menos 65-90 % de trans-retinol, através da ação da dita Atf1 expressada em uma mistura de acetato de trans- e cis-retinila, e (3) conversão do dito acetato de retinila em vitamina A sob condições adequadas conhecidas à pessoa versada.
[0041] Os termos "identidade de sequência", "% de identidade" ou "homologia de sequência" são usados de modo intercambiável no presente documento. Para o propósito desta invenção, é definido aqui que, para determinar a percentagem de homologia de sequência ou identidade de sequência de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ideal. De modo a otimizar o alinhamento entre as duas sequências, podem ser introduzidas lacunas em qualquer uma das duas sequências que são comparadas. Esse alinhamento pode ser realizado ao longo de todo o comprimento das sequências a serem comparadas. Alternativamente, o alinhamento pode ser realizado ao longo de um comprimento menor, por exemplo, ao longo de cerca de 20, cerca de 50, cerca de 100 ou mais ácidos nucleicos/bases ou aminoácidos.
A identidade de sequência é o percentual de correspondências idênticas entre as duas sequências sobre a região alinhada relatada. A identidade de sequência em porcentagem entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada com o uso do algoritmo Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências (Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Ambas as sequências de aminoácidos e sequências nucleotídicas podem ser alinhadas pelo algoritmo. O algoritmo de Needleman-Wunsch foi implementado no programa de computador NEEDLE. Para os propósitos da presente invenção, foi usado o programa NEEDLE do pacote EMBOSS (versão 2.8.0 ou superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, Longden and Bleasby, Trends in Genetics 16, (6) páginas 276—277, http://emboss.bioinformatics.nl/). É usado EBLOSUM62 para as sequências de proteínas para a matriz de substituição. Para a sequência de nucleotídeos, é usado EDNAFULL. Os parâmetros opcionais usados são uma penalidade de abertura de lacunas de 10 e penalidade de extensão de lacuna de 0,5. Um técnico no assunto compreenderá que todos estes parâmetros diferentes produzirão resultados ligeiramente diferentes, mas que a porcentagem total de identidade de duas sequências não é significativamente alterada quando são usados diferentes algoritmos.
[0042] Após o alinhamento pelo programa NEEDLE como descrito acima, a porcentagem de identidade de sequência entre uma sequência de consulta e uma sequência da invenção é calculada como a seguir: número de posições correspondentes no alinhamento que mostra um aminoácido idêntico ou um nucleotídeo idêntico em ambas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento após a subtração do número total de vãos no alinhamento. A identidade como definido no presente documento pode ser obtida a partir de NEEDLE através do uso da opção NOBRIEF e é etiquetada na saída do programa como "identidade mais longa". Se ambas as sequências de aminoácidos que são comparadas não diferirem em que qualquer um dos seus aminoácidos, as mesmas são idênticas ou têm 100 % de identidade. Em relação às enzimas originadas a partir de plantas como definido no presente documento, o elemento versado na técnica sabe que enzimas derivadas de planta podem conter um sinal de direcionamento de cloroplasto deve ser clivado através de enzimas específicas, como, por exemplo, enzimas de processamento de cloroplasto (CPEs).
[0043] As enzimas como definido no presente documento também abrangem enzimas que portam substituição (ou substituições) de aminoácido que não alteram a atividade de enzima, isto é, que mostram as mesmas propriedades em relação à enzima do tipo selvagem e catalisam a conversão de betacaroteno em retinal, retinal em retinol, retinol em acetato de retinila, em particular, com uma conversão total de pelo menos cerca de 65 %, como, por exemplo, pelo menos cerca de 65-90 %, para a produção de isoforma trans de acetato de retinila. Tais mutações são denominadas também “mutações silenciosas”, que não alteram a atividade (enzimática) das enzimas como descrito no presente documento.
[0044] Uma molécula de ácido nucleico de acordo com invenção pode compreender apenas uma porção ou um fragmento da sequência de ácidos nucleicos fornecida pela presente invenção, por exemplo, um fragmento que pode ser usado como uma sonda ou iniciador ou um fragmento que codifica uma porção de uma enzima como definido no presente documento. A sequência de nucleotídeos determinada a partir da clonagem dos genes que codificam as BCOs, ATFs e/ou RDHs como definido no presente documento permite a geração de sondas e iniciadores projetados para uso na identificação e/ou clonagem de outros homólogos de outras espécies. A sonda/iniciador compreende tipicamente oligonucleotídeos substancialmente purificados que compreendem tipicamente uma região de sequência de nucleotídeos que hibridiza, de preferência, sob condições altamente rigorosas a pelo menos cerca de 12 ou 15, de preferência, cerca de 18 ou 20, com mais preferência, cerca de 22 ou 25, ainda com mais preferência, cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, ou 75 ou mais nucleotídeos consecutivos de uma sequência de nucleotídeos descrita no presente documento.
[0045] Um exemplo não limitante preferencial de tais condições de hibridização em 6x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 °C, seguida por uma ou mais lavagens em 1x SSC, 0,1 % de SDS a 50 °C, de preferência, a 55 °C, com mais preferência, a 60 °C em ainda com mais preferência, a 65 °C.
[0046] As condições altamente rigorosas incluem, por exemplo, incubação de 2 h a 4 dias a 42 °C com o uso de uma sonda de DNA etiquetada com digoxigenina (DIG)(preparada através do uso de um sistema de etiquetagem de DIG; Roche Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Alemanha) em uma solução, como solução DigEasyHyb (Roche Diagnostics GmbH) com ou sem 100 µg/ml de DNA de esperma de salmão, ou uma solução que compreende 50 % de formamida, 5x SSC (NaCl a 150 mM, citrato de trissódio a 15 mM), 0,02 % de dodecil sulfato de sódio, 0,1 % de N-lauroilsarcosina, e 2 % de reagente de bloqueio (Roche Diagnostics GmbH), seguido por lavagem dos filtros duas vezes por 5 a 15 minutos em 2x SSC e 0,1 % de SDS à temperatura ambiente e, então, lavagem de duas vezes por 15- 30 minutos em 0,5x SSC e 0,1 % de SDS ou 0,1x de SSC e 0,1 % de SDS a 65-68 °C.
[0047] A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como definido no presente documento, que é capaz de expressar genes de produção de betacaroteno, as betacaroteno oxidases como descrito no presente documento, as enzimas de acetilação de retinol como definido no presente documento, as enzimas de redução de retinal como definido no presente documento e/ou genes opcional e adicionalmente exigidos para biossíntese de vitamina A, podem ser cultivadas em um meio aquoso suplementado com nutrientes apropriados sob condições aeróbicas ou anaeróbicas e como conhecido pela pessoa versada para as diferentes células hospedeiras. Opcionalmente, tal cultivo é na presença de proteínas e/ou cofatores envolvidos na transferência de elétrons, como definido no presente documento. O cultivo/crescimento da célula hospedeira pode ser conduzido na batelada, batelada alimentada, modo semicontínuo ou contínuo. Dependendo da célula hospedeira, de preferência, a produção de retinoides, como, por exemplo, a vitamina A e precursores, como retinal, retinol, podem variar, como é conhecido pelo elemento versado. O cultivo e isolamento de betacaroteno e células hospedeiras de produção de retinoide selecionadas a partir de Yarrowia são descritos, por exemplo, no documento WO2008042338. Em relação à produção de retinoides em células hospedeiras selecionadas a partir de E. coli, os métodos são descritos, por exemplo, em Jang et al, Microbial Cell Factories, 10:95 (2011). Os métodos específicos para a produção de betacaroteno e retinoides em células hospedeiras de levedura, como, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, são revelados, por exemplo, no documento WO2014096992.
[0048] A presente invenção se refere a um processo para a produção de retinoides, em particular, acetato de retinila com pelo menos cerca de 65 % presente na isoforma trans e uma porcentagem de pelo menos cerca de 10 % na forma de acetilado, isto é, como o acetato de retinila com base na quantidade total de retinoides produzidos pela respectiva célula hospedeira, em uma célula hospedeira produtora de carotenoide sob condições como descrito no presente documento. Os retinoides produzidos, em particular, acetato de retinila devem ser isolados e opcional e adicionalmente purificados a partir do meio e/ou célula hospedeira.
[0049] Como usado no presente documento, o termo "atividade específica" ou "atividade" em relação às enzimas significa sua atividade catalítica, isto é, sua habilidade de catalisar a formação de um produto a partir de um determinado substrato. A atividade específica define a quantidade de substrato consumida e/ou produto produzido em um determinado período de tempo e por quantidade definida de proteína em uma temperatura definida. Tipicamente, a atividade específica é expressa em µmol de substrato consumido ou produto formado por min por mg de proteína. Tipicamente, µmol/min é abreviado por U (= unidade). Portanto, as definições de unidade para atividade específica de µmol/min/(mg de proteína) ou U/(mg de proteína) são usadas de modo intercambiável ao longo desse documento. Uma enzima é ativa, se realizar sua atividade catalítica in vivo, isto é, na célula hospedeira como definido no presente documento ou em um sistema na presença de um substrato adequado. A pessoa versada sabe como medir a atividade de enzima, em particular, atividade de BCOs, RDHs ou ATFs como definido no presente documento. Os métodos analíticos para avaliar a capacidade de uma enzima adequada como definido no presente documento para produção de retinoide são conhecidos na técnica, como, por exemplo, descritos no Exemplo 4 do documento WO2014096992. Brevemente, as titulações dos produtos de retinoides e carotenoides e similares podem ser medidas por HPLC.
[0050] Como usado no presente documento, uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, é uma célula hospedeira, em que os respectivos polipeptídeos são expressos e ativos in vivo que levam à produção de carotenoides, por exemplo, betacaroteno. Os genes e métodos para gerar célula hospedeira produtora de carotenoide são conhecidos na técnica, consulte, por exemplo, o documento WO2006102342. Dependendo do carotenoide a ser produzido, genes diferentes podem ser envolvidos.
[0051] Como usado no presente documento, uma célula hospedeira produtora de retinoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, é uma célula hospedeira em que, os respectivos polipeptídeos são expressos e ativos in vivo, levando à produção de retinoides, por exemplo, vitamina A e seus precursores, através da conversão enzimática de betacaroteno através de retinal, retinol e acetato de retinila. Esses polipeptídeos incluem as BCOs, RDHs e ATFs como definido no presente documento. Os genes da via da vitamina A e métodos para gerar células hospedeiras de produção de retinoide são conhecidos na técnica. De preferência, o betacaroteno é convertido em retinal através da enzimas de oxidação de ação de betacaroteno, o retinal é adicionalmente convertido em retinol através da ação de RDHs como definido no presente documento, e o retinol, de preferência, trans-retinol, é convertido em acetado de retinol através da ação de enzimas acetil-transferase, como, por exemplo, ATF1. O acetato de retinol poderia ser o retinoide de escolha que é isolado a partir da célula hospedeira.
[0052] Os retinoides como usado no presente documento incluem produtos de clivagem de betacaroteno conhecidos também como apocarotenoides, incluindo, mas não se limita ao retinal, ácido retinólico, retinol, metóxido retinoico, acetato de retinila, ésteres retinílicos, 4-ceto-retinoides, 3 hidroxi-retinoides ou combinações dos mesmos. Os ésteres retinílicos de cadeia longa como usado no presente documento definem ésteres de hidrocarboneto que consiste em pelo menos cerca de 8, como, por exemplo, 9, 10, 12, 13, 15 ou 20 átomos de carbono e ou até cerca de 26, como, por exemplo, 25, 22, 21 ou menos átomos de carbono, de preferência, com até cerca de 6 ligações insaturadas, como, por exemplo, 0, 1, 2, 4, 5, 6 ligações insaturadas. Os ésteres retinílicos de cadeia longa incluem, porém sem limitação, o ácido linoleico, ácido oleico ou ácido palmítico. A biossíntese de retinoides é descrita, por exemplo, no documento WO2008042338.
[0053] O retinal como usado no presente documento é conhecido sob o nome de IUPAC (2E,4E,6E,8E)-3,7-Dimetil-9- (2,6,6-trimetilciclo-hexen-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenal. É chamado de modo intercambiável no presente documento de retinaldeído ou aldeído de vitamina A inclui tanto isoformas cis- quanto trans-isoformas, como, por exemplo, 11-cis retinal, 13-cis retinal, trans-retinal e todos os trans retinal.
[0054] O termo “carotenoides” como usado no presente documento é bem conhecido na técnica. Inclui 40 polienos de isoprenoide conjugado com e longos que são formados na natureza pela ligação de duas moléculas de pirofosfato de geranilgeranila de 20 carbonos. Esses incluem, mas não se limitam a fitoeno, licopeno e caroteno, como, por exemplo, betacaroteno, que pode ser oxidado na posição 4-ceto ou na posição 3-hidróxi para render cantaxantina, zeaxantina ou astaxantina. A biossíntese de carotenoides é descrita, por exemplo, no documento WO2006102342.
[0055] A vitamina A como usado no presente documento pode ser qualquer forma química de vitamina A encontrada em soluções aquosas, como, por exemplo, não dissociada, na sua forma ácida livre ou dissociada como um ânion. O termo como usado no presente documento inclui todos os precursores ou intermediários na trajetória de vitamina A biotecnológica. O mesmo também inclui acetato de vitamina A.
[0056] Em particular, a presente invenção apresenta as presentes modalidades: - uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, que compreende: (a) enzima de oxidação de betacaroteno (BCO) estereosseletiva, em que a dita célula hospedeira produz uma mistura retinal que compreende cis- e trans-retinal, em que a porcentagem de trans-retinal na mistura é pelo menos cerca de 65 %, de preferência, 68, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 % ou até 100 % produzida pela dita célula hospedeira; e (b) uma acetil transferase (ATF) [EC 2.3.1.84], de preferência, uma enzima com atividade de acetil transferase 1 (Atf1), em que a dita enzima catalisa a conversão de retinol, de preferência, trans-retinol, em uma mistura de acetato de retinila, com uma porcentagem de pelo menos 10 % de acetilado retinol, isto é, acetato de retinila, com base na quantidade total de retinoides produzidos pela dita célula hospedeira.
[0057] - uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como descrito acima e definido no presente documento, em que a acetil transferase [EC 2.3.1.84], de preferência, uma enzima com atividade de acetil transferase 1, catalisa a conversão de retinol em uma mistura de acetato de retinila, em que a mistura compreende pelo menos cerca de 65 %, de preferência, 68, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 % ou até 100 % de acetato de retinila, como, por exemplo, pelo menos 65-90 % de acetato de retinila, em isoforma trans.
[0058] - A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como descrito acima e definido no presente documento, que compreende adicionalmente uma retinol desidrogenase (RDH) (de preferência, heteróloga) [EC 1.1.1.105] com capacidade para converter retinal em retinol com uma conversão total de pelo menos cerca de 90 % para a geração de retinol, de preferência, RDH obtida a partir de fungos, em particular Dikarya,
incluindo, porém sem limitação, fungos selecionados a partir de Ascomycota, com mais preferência, obtida a partir de Fusarium, ainda com mais preferência, isolados de F. fujikuroi, como um polipeptídeo com pelo menos cerca de 60 % de identidade para FfRDH12 (SEQ ID NO:19).
[0059] - A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como descrito acima e definido no presente documento, que compreende adicionalmente uma modificação na atividade de aciltransferase endógena, em que a atividade de aciltransferase endógena, de preferência, atividade [EC
2.3.1], com mais preferência atividade de aciltransferase [EC 2.3.1.20], foi reduzida ou suprimida.
[0060] - A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como descrito acima e definido no presente documento, em que a BCO é selecionada a partir de fungos, plantas ou animal, de preferência, selecionada a partir de Fusarium, Ustilago, Crocus, Drosophila, Danio, Ictalurus, Esox, Latimeria, com mais preferência, selecionada a partir de Fusarium fujikuroi, Ustilago maydis, Crocus sativus, Drosophila melanogaster, Danio rerio, Ictalurus punctatus, Esox lucius, Latimeria chalumnae, ainda com mais preferência, selecionada a partir de um polipeptídeo com pelo menos cerca de 60 % de identidade para um polipeptídeo de acordo com SEQ ID NOs:1, 3, 5 ou 7 ou um polipeptídeo com pelo menos cerca de 50 % de identidade para uma sequência de polipeptídeos de acordo com SEQ ID NOs:9, 11, 13, 15 ou 17.
[0061] - A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como descrito acima e definido no presente documento, em que a acetil transferase, de preferência, Atf1, é selecionada a partir de plantas, animais, incluindo humanos, algas, fungos, incluindo levedura ou bactéria, de preferência, selecionada a partir de Saccharomyces, Fragaria, Escherichia, Euonymus, Malus, Petunia ou Lachancea, com mais preferência, selecionada a partir de Saccharomyces bayanus, Fragaria ananassa, Escherichia coli, Euonymus alatus, Malus domestica, Petunia hybrida, Lachancea mirantina ou Lachancea fermentati, ainda com mais preferência, selecionada a partir de um polipeptídeo com pelo menos cerca de 60 % de identidade para um polipeptídeo de acordo com SEQ ID NOs:21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 36 ou 38.
[0062] - A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como descrito acima e definido no presente documento, que produz uma mistura de acetato de retinila que compreende pelo menos cerca de 65 %, de preferência, 68, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 % ou até 100 % isoforma de acetato de trans-retinila, como pelo menos 65-90 % de isoforma de acetato de trans- retinila.
[0063] - A célula hospedeira produtora de carotenoide como descrito acima e definido no presente documento, em que a célula hospedeira é selecionada a partir de plantas, fungos, algas ou microrganismos, de preferência, selecionada a partir de fungos incluindo levedura, com mais preferência, de Saccharomyces, Aspergillus, Pichia, Hansenula, Phycomyces, Mucor, Rhodotorula, Sporobolomyces, Xanthophyllomyces, Phaffia, Blakeslea ou Yarrowia, ainda com mais preferência, de Yarrowia lipolytica ou Saccharomyces cerevisiae.
[0064] - A célula hospedeira produtora de carotenoide como descrito acima e definido no presente documento, em que a célula hospedeira é selecionada a partir de plantas, fungos, algas ou microrganismos, de preferência, selecionada a partir de Escherichia, Streptomyces, Pantoea, Bacillus, Flavobacterium, Synechococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Mixococcus, Brevibacterium, Bradyrhizobium, Gordonia, Dietzia, Muricauda, Sphingomonas, Synochocystis ou Paracoccus.
[0065] - A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como descrito acima e definido no presente documento, usada em um processo para conversão de betacaroteno em vitamina A.
[0066] - Um processo para a produção de acetato de trans- retinila que compreende o cultivo da célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como descrito acima e definido no presente documento, em um meio aquoso sob condições de cultura adequadas e que isola e opcional e adicionalmente purifica o dito acetato de trans-retinila do meio e/ou da célula hospedeira.
[0067] - Um processo para a produção de vitamina A que compreende as etapas de: (a) introdução de uma molécula de ácido nucleico que codifica BCO estereosseletiva como definido no presente documento, acetil transferase [EC 2.3.1.84], como definido no presente documento, opcionalmente retinol desidrogenase [EC
1.1.1.105], como definido no presente documento, em uma célula hospedeira adequada de produção de caroteno, particularmente, célula hospedeira fúngica; (b) redução e supressão opcional da atividade de aciltransferase endógena [EC 2.3.1] como definido no presente documento da célula de (a), (c) conversão enzimática de betacaroteno em mistura de acetato de retinila que compreende uma razão entre acetato de trans e cis-retinila de 4; e (d) conversão de acetato de retinila em vitamina A sob condições de cultura adequadas.
[0068] - Um processo para a produção de vitamina A que compreende as etapas de: (a) introdução de uma molécula de ácido nucleico que codifica BCO estereosseletiva, acetil transferase [EC 2.3.1.84], opcionalmente retinol desidrogenase [EC 1.1.1.105], em uma célula hospedeira adequada; (b) redução ou supressão opcional da atividade de aciltransferase endógena [EC 2.3.1] da célula de (a), (c) conversão enzimática de betacaroteno em retinoides compreendendo pelo menos uma porcentagem de 10 % de acetato de retinila, os ditos acetatos de retinila compreendem pelo menos uma porcentagem de 65 % em isoforma trans com base na quantidade total de retinoides produzidos; e (d) conversão de acetato de retinila em vitamina A sob condições de cultura adequadas.
[0069] Os exemplos a seguir são ilustrativos somente e não se destinam a limitar o escopo da invenção de modo algum. Os conteúdos de todas as referências, pedidos de patente, patentes e pedidos de patente publicados citados ao longo deste pedido são incorporados a título de referência pelo presente documento, em particular, o documento WO2006102342, WO2008042338 ou WO2014096992. Exemplos
Exemplo 1: Métodos Gerais, cepas e plasmídeos
[0070] Todos os procedimentos de biologia molecular básica e manipulação de DNA descritos no presente documento são, em geral, realizados de acordo com Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Nova York (1989) ou Ausubel et al. (eds). Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: Nova York (1998).
[0071] Ensaio de placa de agitação. Tipicamente, 800 µl de Extrato de levedura a 0,075 %, peptona a 0,25 % (0,25X YP) são inoculados com 10 µl de Yarrowia crescido recentemente e sobreposto com 800 µl de fonte de carbono de óleo mineral (Drakeol 5, Penreco Personal Care Products, Karns City, PA, EUA) a 5 % de óleo de milho em óleo mineral e/ou 5 % em glicose em fase aquosa. Os transformantes foram crescidos em placas de 24 poços (Microplate Devices 24 Deep Well Plates Whatman 7701-5102), cobertos com vedação de manta (Analytical Sales and Services Inc. Plate Mats 24010CM), vedados de modo estéril com Qiagen Airpore Tape Sheets (19571) e agitados em agitador de múltiplas placas Infors (Multitron), 30 °C, 800RPM em meios de YPD por 4 dias. A fração de óleo mineral foi removida dos poços de placa de agitação e analisada por HPLC em uma coluna de fase normal, com um detector de matriz de fotodiodo. Esse método é usado nos exemplos 2, 3, 4.
[0072] Transformação de DNA. As cepas são transformadas através de crescimento durante a noite no meio de placa de YPD de 50 µl de células são raspadas a partir de uma placa e transformadas através de incubação em 500 µl com 1 µg de DNA de transformação, tipicamente, DNA linear para transformação integrativa, PEG 3550MW a 40 %, acetato de lítio a 100 mM, Ditiotreitol a 50 mM, Tris-Cl a 5 mM com pH 8,0, EDTA a 0,5 mM por 60 minutos a 40 °C e semeadas diretamente para o meio seletivo ou no caso de seleção de marcador antibiótico dominante, as células são crescidas em meio líquido de YPD por 4 horas a 30 °C antes de semear no meio seletivo.
[0073] Biologia molecular de DNA. Os genes foram sintetizados com as extremidades NheI e MluI no vetor pUC57 (GenScript, Piscataway, NJ). Tipicamente, os genes foram subclonados nos vetores MB5082 ‘URA3’, MB6157 HygR e MB8327 NatR para seleção de marcador em transformações de Yarrowia lipolytica, como no documento WO2016172282. Para a inserção de gene limpa através da junção de extremidade não homóloga aleatório do gene e do marcador HindIII/XbaI (MB5082) ou PvuII (MB6157 e MB8327), purificados respectivamente através de eletroforese em gel e coluna de purificação em gel Qiagen. O marcador MB5082 ‘URA3’ poderia ser reusado devido às sequências de flanqueamento repetidas gratuitas que possibilitam seleção de excisantes circulares do cassete URA3 em FOA. Os marcadores NatR e HygR podem ser removidos por expressão transiente de Cre recombinase que resulta em excisantes devido aos sítios de Lox de flanqueamento.
[0074] Lista de plasmídeo. As sequências de plasmídeo, cepas, nucleotídeos e aminoácidos a serem usadas são listadas na Tabela 1, 2 e a listagem de sequências. As sequências de nucleotídeos ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 35, 37, e 39 são otimizadas por códon para expressão em Yarrowia. Tabela 1: lista de plasmídeos usados para construção das cepas que portam os genes BCO, RDH e ATF1 heterólogos. As sequências ID NOs se referem aos insertos. Para mais detalhes, consulte o texto. plasmídeo de MB MB principal Inserto SEQ ID NO: (aa/nt) 8457 5082 UmCCO1 1/2 8456 5082 FfCarX 3/4 6703 5082 CsZCO 5/6 6702 5082 DmNinaB 7/8 9068 5082 DrBCO 9/10 9279 5082 DrBCO- 11/12
TPI 9123 5082 IpBCO 13/14 9121 5082 ElBCO 15/16 9126 5082 LcBCO 17/18 8200 5082 FfRDH12 19/20 8064 5082 SbATF1 21/22 8509 6157 FaATF 23/24 8510 6157 EcCAT 25/26 8511 6157 EaCAcT 27/28 8512 6157 MdATF 29/30 8513 6157 PhATF 31/32 8849 5082 LmATF1 34/35 8610 5082 LfATF1 36/27 8806 5082 LffATF1 38/39 Tabela 2: lista de cepas de Yarrowia usadas para a produção de retinoides que portam os genes BCO, RDH e ATF1 heterólogos. Para mais detalhes, consulte o texto.
cepa Descrição Primeiramente de ML descrito em 7788 Cepa de caroteno WO2016172282 15710 ML7788 transformada com MB7311 WO2016172282 -Mucor CarG 17544 ML15710 curado de URA3 por FOA aqui e HygR por Cre/lox 17767 ML17544 transformada com MB6072 aqui DmBCO-URA3 e MB6732 SbATF1-HygR e curada de marcadores 17968 ML17544 transformada com MB8457 aqui UmCCO1-URA3 e curada de marcadores 17978 ML17968 transformada com MB8200 aqui FfRDH-URA3 e curada de marcadores
[0075] Método de retinol de fase normal. Uma bomba binária Waters 1525 ligada a um autoamostrador Waters 717 foi usada para injetar as amostras. Foi usado um Phenomenex Luna de Sílica 3 µ (2), 150 x 4,6 mm com um kit de coluna de proteção de sílica de segurança para resolver retinoides. A fase móvel consiste em 1000 ml de hexano, 30 ml de isopropanol e 0,1 ml de ácido acético para compostos relacionados à astaxantina, ou 1000 ml de hexano, 60 ml de isopropanol e 0,1 ml de ácido acético para compostos relacionados à zeaxantina. A taxa de fluxo para cada um é 0,6 ml por minuto. Temperatura de coluna é ambiente. O volume de injeção é 20 µl. O detector é um detector de matriz de fotodiodo que coleta de 210 a 600 nm. Os analitos foram detectados de acordo com a Tabela 3.
[0076] Tabela 3: lista de analitos usando o método de retinol de fase normal. A adição de todos os intermediários adicionados gera a quantidade de retinoides totais. Para mais detalhes, consulte o texto. Intermediários Tempo de retenção Lambda máx [min] [nm] 11-cis-di-hidro- 7,1 293 retinol 11-cis-retinal 4 364 11-cis-retinol 8,6 318 13-cis-retinal 4,1 364 di-hidro-retinol 9,2 292 retinil-acetato 3,5 326 retinil-éster 3 325 trans-retinal 4,7 376 trans-retinol 10,5 325
[0077] Preparação de amostra. As amostras foram preparadas por vários métodos dependendo das condições. Para as amostras de broto lavado ou broto integral, o broto foi colocado em um tubo Precellys® pesado e a fase móvel foi adicionada, as amostras foram processadas em um homogeneizador Precellys® (Bertin Corp, Rockville, MD, EUA) na definição 3X mais alta de acordo com as direções de fabricações. No caldo lavado, as amostras foram centrifugadas em um tubo de 1,7 ml em uma microcentrífuga a 10000 rpm por 1 minuto, o caldo decantado, 1 ml de água adicionado peletizado e decantado e levado ao volume original em que a mistura foi peletizada novamente e levada a uma quantidade apropriada de fase móvel e processada através de batidas de esferas de Precellys®. Para a análise de fração de óleo mineral, a amostra foi centrifugada a 4000 RPM por 10 minutos e o óleo foi decantado do topo através de pipeta de deslocamento positiva (Eppendorf, Hauppauge, NY, EUA) e diluída na fase móvel através de vórtice e medida para concentração de retinoide por análise de HPLC.
[0078] Condições de fermentação. As fermentações foram idênticas às condições previamente descritas com o uso, de preferência, de sobreposição de óleo de silicone ou óleo mineral e tanque agitado que foi, de preferência, alimentado com glicose ou óleo de milho em um reator de bancada com 0,5 l a 5 l de volume total (consulte o documento WO2016172282). Em geral, os mesmos resultados foram observados com um tanque agitado com batelada alimentada com uma produtividade aumentada que demonstra a utilidade do sistema para a produção de retinoides. De preferência, as fermentações foram produzidas em bateladas com 5 % de glicose e 20 % de óleo de silicone forma adicionados após o oxigênio dissolvido despencar e a alimentação foi retomada para alcançar 20 % de oxigênio dissolvido ao longo do programa de alimentação. Alternativamente, o óleo de milho foi usado como uma alimentação e óleo mineral foi usado como uma segunda fase para coletar os retinoides alifáticos. Exemplo 2: Conversão de betacaroteno em retinal em Yarrowia lipolytica
[0079] Para a expressão de BCOs heterólogas, uma cepa de betacaroteno ML17544 foi transformada com fragmento de DNA linear purificado por clivagem de endonucleotídeo de restrição mediada por HindII e XbaI e purificação de gel de betacaroteno oxidase (BCO) que contém fragmentos otimizados por códon ligados a um marcador nutricional de URA3. Os DNAs de transformação foram derivados do gene de BCO MB6702 Drosophila NinaB, gene de BCO MB6703 Crocus, gene de BCO MB8456 Fusarium e gene de BCO MB8457 Ustilaga e gene de BCO MB6098 Daria, através disso, as sequências otimizadas por códon (SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12) foram usadas.
Então, os genes foram crescidos triando 6-8 isolados em uma análise de placa de agitação, e os isolados que realizam bem foram executados em uma reação de tanque com batelada alimentada por 8-10 dias.
A detecção de cis- e trans-retinal foi feita através de HPLC com o uso de parâmetros padrão como descrito no documento WO2014096992, mas calibrada com padrões purificados para os analitos de retinoide.
A quantidade de trans-retinal na mistura retinal pode ser aumentada para 90 % (com uso de BCO de Crocus), 95 % (com uso de BCO de Fusarium), 98 % (com uso de BCO de Ustilago) e 98 % (com uso de BCO de Daria), respectivamente.
Uma comparação com a BCO de Drosophila melanogaster (SEQ ID NO:7) resultou em 61 % de trans-retinal com base na quantidade total de retinal (consulte a Tabela 4). Tabela 4: Produção de retinal em Yarrowia como melhorado pela ação de BCOs heterólogas. “% de trans” significa a porcentagem de retinal na mistura de retinoides.
Para mais detalhes, consulte o texto.
Organismo Gene % de % de cepa plasmídeo de BCO trans- retinoides/DCW de ML de MB Drosophila DmNinB 61 14 17544 6702 Ustilago UmCCO1 98 8 17544 8457 Fusarium FfCarX 95 5 17544 8456 Crocus ZsZCO 90 0,01 17544 6703
Organismo Gene % de % de cepa plasmídeo de BCO trans- retinoides/DCW de ML de MB Dario DrBCO 98 6 17544 9068 Dario DrBCO- 98 6 17544 9279
TPI Ictalurus IpBCO 98 5 17544 9123 Esox ElBCO 98 3 17544 9121 Latimeria LcBCO 98 2 17544 9126 Exemplo 3: Conversão de retinal em retinol em Yarrowia lipolytica
[0080] Para a expressão de heterólogo RDHs, a cepa de betacaroteno ML17767 foi transformada com fragmentos de HinDIII/XbaI purificados derivados de plasmídeos que contêm ligante de fragmentos de gene de retinol desidrogenase (RDH) a um promotor de URA3. Seis a oito isolados foram examinados em relação a uma diminuição no retinol: razão de retinal em um ensaio de placa de agitação e isolados bem-sucedidos foram executados em um reator de tanque agitado com batelada alimentada por oito dias, o que mostrou uma ordem de aumento de magnitude na produtividade do processo que indica uma utilidade na produção em larga escala. Os melhores resultados foram obtidos com o homólogo Fusarium RDH12 apenas com 2 % ou retinal residual mantido após 8 dias de incubação em frasco de agitação como descrito acima. O isolado derivado da sequência de Fusarium demonstrou uma redução de retinol aumentada. Exemplo 4: Conversão de retinol em acetato de retinila em Yarrowia lipolytica
[0081] Para a expressão de ATF1 heteróloga, a cepa de produção de retinol trans ML17968 foi transformada com fragmentos de gene PuvII purificados que contêm fragmentos de gene de acetiltransferase ligados a um Marcador de resistência de higromicina (HygR) para seleção de meios ricos (YPD) que contêm 100 μg/ml de higromicina. Antes do plaqueamento, os cultivos foram crescidos em YPD por quatro horas para sintetizar os genes resistentes ao antibiótico. Os isolados foram selecionados para acilação em ensaios de placa de agitação e isolados bem-sucedidos foram selecionados no reator de tanque agitado de lote de alimentação que mostrou uma ordem de produtividade de magnitude aumentada que indica a utilidade na produção de retinoides. Os dados da análise são mostrados na Tabela 5).
[0082] Tabela 5: A produção de retinoide trans em Yarrowia como melhorado pela ação de enzimas ATF1 heterólogas. “% de trans” significa a porcentagem de acetato de trans-retinila na mistura de retinoides. Para mais detalhes, consulte o texto. Organismo gene % de cepa de plasmídeo ATF1 acetilação- ML de MB S. bayanus SbATF1 10,3 17968 6832 P. hybrida PhATF 2,1 17968 8513 E. alatus EaCAcT 0,45 17968 8511 E. coli EcCAT 0,35 17968 8510 L. mirantina LfATF1 9,6 18523 8610 L. LffATF1 11,7 18523 8806 fermentata L. LmATF1 40,4 18523 8849 fermentata
Exemplo 5: Ensaio de atividade de ATF1
[0083] Para a expressão de ATF1 heteróloga, a cepa de produção de retinol trans ML17968 foi transformada com fragmentos de gene PuvII purificados que contêm fragmentos de gene de acetiltransferase ligados a um Marcador de resistência de higromicina (HygR) para seleção de meios ricos (YPD) que contêm 100 μg/ml de higromicina. Antes do plaqueamento, os cultivos foram crescidos em YPD por quatro horas para sintetizar os genes resistentes ao antibiótico. Os isolados foram examinados para acilação em ensaios de placa de agitação, especificamente, com o uso de 10 % de glicose como uma fonte de carbono em 0,25X YP com óleo de silicone como uma sobreposição e isolados bem-sucedidos foram examinados adicionalmente no reator de tanque agitado em batelada com alimentação de glicose e sobreposição de óleo de silicone, que mostraram uma ordem de produtividade de magnitude aumentada indicando a utilidade na produção de retinoides. Os dados da análise são mostrados na Tabela 5. Exemplo 6: Conversão de betacaroteno em acetato de retinila em Saccharomyces cerevisiae
[0084] Tipicamente, uma cepa de betacaroteno é transformada com genes heterólogos que codificam enzimas, como geranilgeranil sintase, fitoeno sintase, licopeno sintase, licopeno ciclase, construída que está produzindo betacaroteno de acordo com métodos padrão como conhecidos na técnica (como, por exemplo, como descrito no documento US20160130628 ou WO2009126890). Adicionalmente, quando transformado com betacaroteno, o retinal de genes de oxidase pode ser produzido. Adicionalmente, quando transformado com retinol desidrogenase, então, o retinol pode ser produzido.
O retinol pode ser acetilado pela transformação com genes que codificam álcool acetil transferases.
Opcionalmente, os genes aciladores de retinol endógeno podem ser deletados.
Além disso, as enzimas podem ser selecionadas para produzir e acilar a forma trans de retinol para gerar todos dentre acetato de trans retinila e ésteres de cadeia longa de trans retinol, respectivamente.
Com essa abordagem, são obtidos resultados similares relativos à especificidade para trans- isoforma ou produtividade para acetato de retinila.

Claims (1)

REIVINDICAÇÕES
1. Célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, caracterizada por compreender: (a) enzima de oxidação de betacaroteno (BCO) estereosseletiva, em que a dita célula hospedeira produz uma mistura retinal que compreende cis- e trans-retinal, em que a porcentagem de trans-retinal na mistura é pelo menos cerca de 65 %, de preferência, 68, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 % ou até 100 % produzida pela dita célula hospedeira; e (b) uma acetil transferase (ATF) [EC 2.3.1.84], de preferência, uma enzima com atividade de acetil transferase 1 (Atf1), em que a dita enzima catalisa a conversão de retinol, de preferência, trans-retinol, em uma mistura de acetato de retinila, com uma porcentagem de pelo menos 10 % de acetilado retinol, isto é, acetato de retinila, com base na quantidade total de retinoides produzidos pela dita célula hospedeira.
2. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a acetil transferase [EC 2.3.1.84], de preferência, uma enzima com atividade de acetil transferase 1, catalisa a conversão de retinol em uma mistura de acetato de retinila, em que a mistura compreende pelo menos cerca de 65 %, de preferência, 68, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 % ou até 100 % de acetato de retinila, como, por exemplo, pelo menos 65- 90 % de acetato de retinila, em isoforma trans.
3. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por compreender adicionalmente uma retinol desidrogenase preferencialmente heteróloga (RDH) [EC 1.1.1.105] com capacidade para converter retinal em retinol com uma conversão total de pelo menos cerca de 90 % para a geração de retinol, de preferência, selecionada a partir de fungos, com mais preferência, de Fusarium, como um polipeptídeo com pelo menos 60 % de identidade para um polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:19.
4. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por compreender adicionalmente uma modificação na atividade de aciltransferase endógena, em que a atividade de aciltransferase endógena, de preferência, atividade [EC
2.3.1], com mais preferência, atividade de aciltransferase [EC 2.3.1.20], foi reduzida ou suprimida.
5. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a BCO é selecionada a partir de fungos, plantas ou animal, de preferência, selecionada a partir de Fusarium, Ustilago, Crocus, Drosophila, Danio, Ictalurus, Esox, Latimeria, com mais preferência, selecionada a partir de Fusarium fujikuroi, Ustilago maydis, Crocus sativus, Drosophila melanogaster, Danio rerio, Ictalurus punctatus, Esox lucius, Latimeria chalumnae, ainda com mais preferência, selecionada a partir de um polipeptídeo com pelo menos cerca de 60 % de identidade para um polipeptídeo de acordo com SEQ ID NOs:1, 3, 5 ou 7 ou um polipeptídeo com pelo menos cerca de 50 % de identidade para uma sequência de polipeptídeos de acordo com SEQ ID NOs:9, 11, 13, 15 ou 17.
6. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a acetil transferase é selecionada a partir de plantas, animais, incluindo humanos, algas, fungos, incluindo levedura ou bactéria, de preferência, selecionada a partir de Saccharomyces, Fragaria, Escherichia, Euonymus, Malus, Petunia ou Lachancea, com mais preferência, selecionada a partir de um polipeptídeo com pelo menos cerca de 60 % de identidade para um polipeptídeo de acordo com SEQ ID NOs:21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 36, ou
38.
7. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por produzir uma mistura de acetato de retinila que compreende pelo menos cerca de 65 %, de preferência, 68, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 % ou até 100 % de isoforma de acetato de trans-retinila, como pelo menos 65-90 % de isoforma de acetato de trans-retinila.
8. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, sendo a célula hospedeira caracterizada por ser selecionada a partir de plantas, fungos, algas ou microrganismos, como selecionada a partir do grupo que consiste em Escherichia, Streptomyces, Pantoea, Bacillus, Flavobacterium, Synechococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Mixococcus, Brevibacterium, Bradyrhizobium, Gordonia, Dietzia, Muricauda, Sphingomonas, Synochocystis, Paracoccus, Saccharomyces, Aspergillus, Pichia, Hansenula, Phycomyces, Mucor, Rhodotorula, Sporobolomyces, Xanthophyllomyces, Phaffia, e Blakeslea, de preferência, selecionada a partir de fungos incluindo levedura, com mais preferência, selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces, Aspergillus, Pichia, Hansenula, Phycomyces, Mucor, Rhodotorula, Sporobolomyces, Xanthophyllomyces, Phaffia, Blakeslea e Yarrowia, com mais preferência, de Yarrowia lipolytica ou Saccharomyces cerevisiae.
9. Uso caracterizado por ser da célula hospedeira produtora de carotenoide conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em um processo para conversão de betacaroteno em vitamina A.
10. Processo para a produção de acetato de trans- retinila caracterizado por compreender o cultivo da célula hospedeira produtora de carotenoide conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em um meio aquoso sob condições de cultura adequadas e isolar e opcional e adicionalmente purificar o dito acetato de trans-retinila do meio e/ou da célula hospedeira.
11. Processo para a produção de vitamina A caracterizado por compreender as etapas de: (a) introdução de uma molécula de ácido nucleico que codifica BCO estereosseletiva, acetil transferase [EC
2.3.1.84], opcionalmente retinol desidrogenase [EC
1.1.1.105], em uma célula hospedeira adequada; (b) redução ou supressão opcional da atividade de aciltransferase endógena [EC 2.3.1] da célula de (a), (c) conversão enzimática de betacaroteno em retinoides compreendendo pelo menos uma porcentagem de 10 % de acetato de retinila, os ditos acetatos de retinila compreendem pelo menos uma porcentagem de 65 % em isoforma trans com base na quantidade total de retinoides produzidos; e
(d) conversão de acetato de retinila em vitamina A sob condições de cultura adequadas.
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