BR112020002654A2 - métodos e composições para melhorar micróbios modificados - Google Patents

Abstract

A presente descrição refere-se a composição bacteriana que compreende: pelo menos uma cepa bacteriana geneticamente modificada que fixa nitrogênio atmosférico em um sistema agrícola, em que a cepa bacteriana compreende uma modificação em um ou mais genes selecionados a partir do grupo constituído por bcsll, bcsIII, yjbE, fhaB, pehA, glgA, otsB, treZ e cysZ. A presente descrição refere-se ainda a uma composição bacteriana e método para aumentar a colonização de uma cepa bacteriana promotora de crescimento vegetal em uma planta, em que a cepa bacteriana promotora de crescimento vegetal em uma planta tem sido remodelada para aumentar a colonização da dita planta. Em um aspecto ainda, a presente descrição refere-se a métodos de aumentar nitrogênio e fixação de nitrogênio adequado a uma planta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTO- DOS E COMPOSIÇÕES PARA MELHORAR MICRÓBIOS MODIFI- CADOS”. Referência cruzada

[0001] Este pedido de patente reivindica a benefício de prioridade deste ao Pedido de Patente U.S. Provisório No 62/543 288, depositado em 09 de agosto de 2017, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência neste pedido de patente. Antecedentes da invenção

[0002] Até 2050, a Organização das Nações Unidas para Alimen- tação e Agricultura projeta que a produção total de alimentos precisa aumentar 70% para atender as necessidades da população em cresci- mento, um desafio que é exacerbado por inúmeros fatores, incluindo a diminuição dos recursos de água potável, a competição crescente por terras cultiváveis, a subida dos preços da energia, o aumento dos custos de insumos e a provável necessidade de culturas que se adaptem às pressões de condições climáticas mais secas, mais quentes e mais extremas.

[0003] Uma área de interesse está em melhorar a fixação de nitro- gênio. O nitrogênio gasoso (N2) é um componente principal da atmos- fera da Terra. Além disso, o elemento nitrogênio (N) é um componente importante de muitos compostos químicos que compõem os organismos vivos. No entanto, muitos organismos não conseguem utilizar N2 diretamente para sintetizar as substâncias químicas usadas em proces- sos fisiológicos, tais como crescimento e reprodução. Para que seja utilizado, o N2 precisa ser combinado com hidrogênio. A combinação de hidrogênio com N2 é referida como fixação do nitrogênio. A fixação do nitrogênio, quer realizada química ou biologicamente, requer investir grandes quantidades de energia. Em sistemas biológicos, uma enzima conhecida como nitrogenase catalisa a reação que resulta na fixação do nitrogênio. Um objetivo importante da pesquisa sobre fixação do nitrogê- nio é a extensão desse fenótipo para plantas não leguminosas, espe- cialmente gramíneas de valor agronômico como trigo, arroz e milho. Apesar de enormes avanços no entendimento sobre o desenvolvimento da simbiose para fixação do nitrogênio entre rizóbios e leguminosas, o caminho para utilizar esse conhecimento para induzir nós fixadores de nitrogênio em culturas não leguminosas ainda não está claro. Enquanto isso, o desafio de suprir fontes suplementares suficientes de nitrogênio, tal como em fertilizantes, continuará a aumentar com a necessidade crescente de maior produção de alimentos. Sumário da invenção

[0004] Em um aspecto, a presente descrição provê uma composi- ção bacteriana que compreende: pelo menos uma cepa bacteriana modificada geneticamente que fixa o nitrogênio atmosférico em um sistema agrícola, em que a cepa bacteriana compreende uma modifi- cação em um ou mais genes selecionados a partir do grupo que consiste em bcsll, bcsIII, yjbE, fhaB, pehA, glgA, otsB, treZ e cysZ.

[0005] Em outro aspecto, a presente descrição provê uma compo- sição bacteriana que compreende: uma cepa bacteriana que promove o crescimento vegetal, em que a dita cepa foi remodelada para aumentar a colonização da dita cepa bacteriana promotora de crescimento vegetal em uma planta. Em alguns casos, a dita colonização da dita cepa bacteriana promotora de crescimento vegetal ocorre em uma raiz da dita planta. Em alguns casos, a dita cepa bacteriana compreende uma modificação genética em uma enzima ou via envolvida na produção de exopolissacarídeos. Em alguns casos, a dita modificação genética é em um gene selecionado a partir do grupo que consiste em bcsII, bcsIII e yjbE. Em alguns casos, a dita cepa bacteriana compreende uma modifi- cação genética em uma enzima ou via envolvida na produção de uma hemaglutinina filamentosa. Em alguns casos, a dita modificação genética é em um gene fhaB. Em alguns casos, a dita cepa bacteriana compreende uma modificação genética em uma enzima ou via envol- vida na produção de uma endo-poligalaturonase. Em alguns casos, a dita modificação genética é em um gene pehA. Em alguns casos, a dita cepa bacteriana compreende uma modificação genética em uma enzima ou via envolvida na produção de trealose. Em alguns casos, a dita modificação genética é em um gene selecionado a partir do grupo que consiste em: otsB e treZ. Em alguns casos, a dita composição bacteriana é formulada para aplicação a um campo. Em alguns casos, a dita bactéria promotora de crescimento vegetal fornece um nutriente para a dita planta. Em alguns casos, a dita bactéria promotora de crescimento vegetal fornece nitrogênio fixado para a dita planta. Em alguns casos, a dita planta é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, cevada, trigo, sorgo, soja e arroz.

[0006] Em um aspecto adicional, a presente descrição provê um método para aumentar a colonização de uma cepa bacteriana promo- tora de crescimento vegetal em uma planta, o dito método compreen- dendo: introduzir na dita cepa bacteriana promotora de crescimento vegetal uma modificação genética em um gene envolvido em uma via selecionada a partir do grupo que consiste em: produção de exopolis- sacarídeos, produção de endo-poligalaturonase e produção de trealose.

[0007] Em um aspecto adicional, a presente descrição provê um método para aumentar o nitrogênio disponível para uma planta, o dito método compreendendo: aplicar uma pluralidade de bactérias remode- ladas sobre uma planta, a dita pluralidade de bactérias remodeladas exibindo expressão diminuída de glgA.

[0008] Em alguns casos, as ditas bactérias remodeladas apresen- tam menor grau de assimilação de nitrogênio dentro das ditas bactérias remodeladas quando comparado com um grau de assimilação de bactérias não remodeladas de uma mesma espécie que as ditas bactérias remodeladas.

[0009] Em um aspecto adicional, a presente descrição provê um método para aumentar a fixação do nitrogênio disponível para uma planta, o dito método compreendendo: aplicar uma pluralidade de bactérias remodeladas sobre uma planta, a dita pluralidade de bactérias remodeladas exibindo aumento da expressão de pelo menos um cofator da nitrogenase. Em alguns casos, o dito cofator aumentado da nitroge- nase é enxofre. Em alguns casos, as ditas bactérias remodeladas apre- sentam maior expressão de cysZ. Em alguns casos, cysZ é um transpor- tador de enxofre. Incorporação por referência

[0010] Todas as publicações, as patentes e os pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados por refe- rência na mesma medida em que o seriam caso cada publicação, patente ou pedido de patente individual tivesse sido específica e indivi- dualmente indicado para ser incorporado por referência. Breve descrição dos desenhos

[0011] As novas características da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexadas. Uma compreensão melhor das características e vantagens da presente invenção será obtida por referência à descrição detalhada a seguir que apresenta modalidades ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são utilizados, e os desenhos anexos, dos quais:

[0012] Figura 1A representa um mapa de textura de solos de vários solos de campos testados quanto à colonização. Solos que foram originalmente a fonte de poucos micróbios são indicados como estrelas.

[0013] A Figura 1B representa a taxa de colonização da Cepa 1 e Cepa 5 que são testadas em quatro tipos diferentes de solo (círculos). As duas cepas revelaram um perfil de colonização relativamente robusto em diversos tipos de solo.

[0014] A Figura 1C representa a colonização da Cepa 1 como testada em um ensaio em campo ao longo do período de uma estação de cultivo. A Cepa 1 persiste no tecido do milho até 12 semanas depois do plantio, e sua colonização começa a mostrar declínio depois desse tempo.

[0015] A Figura 2A representa um desenho esquemático do melho- ramento genético microbiano de acordo com modalidades.

[0016] A Figura 2B representa uma vista ampliada da medição da composição do microbioma como mostrado na Figura 2A.

[0017] A Figura 2C representa a amostragem de raízes utilizadas no Exemplo 7.

[0018] As Figuras 3A-3C ilustram micróbios derivados que fixam e excretam nitrogênio in vitro sob condições semelhantes a solos agrícolas com alto teor de nitrato. A Figura 3A ilustra uma rede de regulação que controla a fixação e assimilação do nitrogênio em PBC6.1, incluindo os nós (nodes) principais NifL, NifA, GS, GlnE repre- sentados como a enzima com dois domínios ATase-AR e AmtB. A Figura 3B ilustra o genoma do isolado PBC6.1 de Kosakonia sacchari. As três faixas delimitando o genoma transmitem os dados de transcrição de PBC6.1, PBC6.38, e a expressão diferencial entre as cepas respecti- vamente. A Figura 3C ilustra o cluster gênico para fixação do nitrogênio gene e os dados de transcrição são ampliados para reprodução mais detalhada.

[0019] A Figura 4 ilustra a colonização de PBC6.1 até quase 21% de abundância da microbiota associada à raiz em raízes de milho. Os dados de abundância baseiam-se no sequenciamento do amplicon 16S da rizosfera e endosfera de plantas de milho inoculadas com PBC6.1 e cultivadas sob condições de estufa.

[0020] A Figura 5 ilustra a maior expressão de três genes de interes- se em cepas remodeladas de K. sacchari, mostrada por qPCR. As cepas foram cultivadas em meio contendo glutamina 5 mM.

[0021] A Figura 6 ilustra a atividade de redução do nitrogênio de diversas cepas remodeladas na presença ou ausência de glutamina.

[0022] A Figura 7 ilustra os resultados de um ensaio de adesão in vitro com diversas cepas aqui descritas.

[0023] A Figura 8A ilustra os resultados de um ensaio de adesão in vitro com uma cepa remodelada apresentando maior expressão de fhaB como aqui descrito. Essa cepa mostrou recuperação relativa (fold recovery) significativamente aumentada quando comparada à cepa parental, 6-848 (2,3x, p = 0,013).

[0024] A Figura 8B ilustra os resultados de um ensaio de adesão in vitro com diversas cepas aqui descritas.

[0025] A Figura 9 ilustra a maior adesão por cepas com o gene yjbE2 regulado positivamente e óperon bcsIII. Duas cepas remodeladas mostraram um leve aumento em comparação a 6-848: 6-112 (6-848 + yjbE2-prm1): 1,9x (p = 0,07), e 6-1126 (6-848 + bcsIII-prm2): 1,7x (p = 0,06). A Cepa 6-1127 (6-848 + bcsIII-prm9) mostrou um aumento significativo de 2,5x em relação a 6-848 (p = 0,0005)

[0026] A Figura 10 ilustra os resultados de um ensaio de adesão in vitro. 0 é nenhum micróbio adicionado à água, 462 é DH10B E. coli (um controle não associado a plantas) adicionado à água, 6-848 e 6-881 são cepas parentais de outras cepas usadas nos ensaios do presente (controles positivos). Os controles não inoculados e. coli mostraram algum background, no entanto, a cepa 6 do tipo selvagem e os controles parentais 6-848 e 6-881 mostraram adesão significativa em relação aos controles negativos (p < 0,05).

[0027] A Figura 11 ilustra maior adesão de cepas com modificações no gene pehA, no gene yjbE2 e no óperon bcsII.

[0028] A Figura 12 ilustra a superexpressão de genes modificados em cepas remodeladas na presença e ausência de glutamina.

[0029] A Figura 13A ilustra a superexpressão de genes modificados em cepas remodeladas na presença e ausência de glutamina.

[0030] A Figura 13B ilustra a superexpressão de genes modificados em cepas remodeladas na presença e ausência de glutamina.

[0031] A Figura 13C ilustra a superexpressão de genes modificados em cepas remodeladas na presença e ausência de glutamina.

[0032] A Figura 14 ilustra a excreção de amônio sob condições anaeróbicas para as três cepas aqui descritas.

[0033] A Figura 15 ilustra a excreção de amônio para diversas cepas aqui descritas.

[0034] A Figura 16 ilustra a excreção de amônio para outras cepas aqui descritas.

[0035] A Figura 17 ilustra a excreção de amônio para outras cepas aqui descritas.

[0036] A Figura 18 ilustra a atividade de redução do nitrogênio para diversas cepas aqui descritas.

[0037] A Figura 19 ilustra a excreção de amônio para outras cepas aqui descritas.

[0038] A Figura 20 ilustra a atividade de redução do nitrogênio para diversas cepas aqui descritas.

[0039] A Figura 21 ilustra a excreção de amônio para outras cepas aqui descritas.

[0040] A Figura 22A ilustra a atividade de redução do nitrogênio para diversas cepas aqui descritas na presença ou ausência de nitrogênio.

[0041] A Figura 22B ilustra a atividade de redução do nitrogênio para diversas cepas aqui descritas na presença ou ausência de nitrogê- nio.

[0042] A Figura 23A ilustra a excreção de amônio para cepas aqui descritas.

[0043] A Figura 23B ilustra a excreção de amônio para cepas aqui descritas.

[0044] A Figura 24 ilustra a atividade de redução do nitrogênio para diversas cepas aqui descritas na presença ou ausência de nitrogênio.

[0045] A Figura 25 ilustra a excreção de amônio para cepas aqui descritas.

[0046] A Figura 26A ilustra a atividade de redução do nitrogênio para diversas cepas aqui descritas na presença ou ausência de nitrogênio.

[0047] A Figura 26B ilustra a atividade de redução do nitrogênio para diversas cepas aqui descritas na presença ou ausência de nitrogênio.

[0048] A Figura 27A ilustra a excreção de amônio para cepas aqui descritas.

[0049] A Figura 27B ilustra a excreção de amônio para cepas aqui descritas.

[0050] A Figura 28 ilustra a colonização de cepas aqui descritas em um ensaio em estufa. O ensaio em estufa para colonização não teve poder estatística para distinguir diferenças com p < 0,05.

[0051] A Figura 29 ilustra a colonização de outras cepas aqui descritas em um ensaio em estufa.

[0052] A Figura 30 ilustra a colonização de cepas aqui descritas em um ensaio em estufa.

[0053] A Figura 31 ilustra a colonização de cepas aqui descritas em um ensaio em estufa.

[0054] A Figura 32 ilustra a colonização de cepas aqui descritas em um ensaio em estufa.

[0055] A Figura 33 ilustra a excreção de amônio para cepas aqui descritas.

[0056] A Figura 34 ilustra a atividade de redução do nitrogênio para diversas cepas aqui descritas na presença ou ausência de nitrogênio.

[0057] A Figura 35 ilustra a excreção de amônio para cepas aqui descritas.

[0058] A Figura 36 ilustra atividade de redução do nitrogênio para diversas cepas aqui descritas na presença ou ausência de nitrogênio.

[0059] A Figura 37 ilustra a colonização de cepas aqui descritas.

[0060] A Figura 38 ilustra a colonização de cepas aqui descritas. Descrição detalhada da invenção

[0061] Embora várias modalidades da invenção tenham sido mos- tradas e descritas, será óbvio para os técnicos no assunto que tais modalidades são fornecidas a título de exemplo somente. Inúmeras variações, alterações e substituições podem ocorrer aos técnicos no assunto sem que se desviem da invenção. Deve ser entendido que várias alternativas às modalidades da invenção aqui descritas podem ser empregadas.

[0062] A maior utilização de fertilizantes acarreta preocupações ambientais e também provavelmente não é possível para muitas regiões do globo economicamente estressada. Além disso, muitos operadores do setor na arena microbiana estão centrados em criar micróbios intergenéricos. No entanto, há uma carga regulamentar pesada colo- cada sobre micróbios modificados que são caracterizados/classificados como intergenéricos. Esses micróbios intergenéricos enfrentam não só uma carga regulamentar maior, o que dificulta sua adoção generalizada e implementação, mas também muito sujeitos ao escrutínio da opinião pública.

[0063] Atualmente, não existem micróbios modificados no mercado que sejam não intergenéricos e que são capazes de aumentar a fixação do nitrogênio em culturas não leguminosas. Essa escassez de tal micróbio é um elemento que falta para ajudar a entrar em um sistema agrícola do século XXI verdadeiramente amigável ao meio ambiente e mais sustentável.

[0064] A presente descrição soluciona os problemas mencionados acima e provê um micróbio não intergenérico que foi modificado para fixar rapidamente nitrogênio em culturas. Esses micróbios são caracte- rizados/classificados como micróbios intergenéricos e, assim, não enfrentarão as cargas regulamentares acentuadas de tais. Além disso, os micróbios não intergenéricos ensinados servirão para ajudar os agricultores do século XXI a dependerem menos de usar quantidades sempre crescentes de fertilizante como fonte exógena de nitrogênio.

[0065] O remodelamento microbiano guiado é um processo de tec- nologia de ponta que identifica, caracteriza e ajusta micróbios a fim de que alcancem todo o potencial para colonizar raízes de culturas e aumentar a absorção de nutrientes. Em alguns casos, o remodelamento microbiano guiado pode fazer uso do material genético naturalmente presente em cada para aumentar a absorção de nitrogênio pela cultura. A disponibilidade melhor de nutrientes melhora a qualidade da cultura e o potencial de rendimento.

[0066] Existe um complexo de enzimas chamadas nitrogenases nos micróbios que são responsáveis pela redução do nitrogênio atmosférico para amônia, e ambos, os micróbios e as plantas convertem a amônia em glutamina por meio da glutamina sintase (GS) e, consequentemente, em outros aminoácidos que são essenciais para o crescimento e o desenvolvimento dos micróbios e das plantas. Os genes nif são genes que codificam o complexo de enzimas nitrogenase. Além das enzimas nitrogenase, os genes nif também codificam várias proteínas regulado- ras envolvidas na fixação do nitrogênio. A expressão dos genes nif é induzida em resposta a níveis baixos de nitrogênio fixado e concentra- ções de oxigênio na rizosfera. Na maioria das bactérias fixadoras de nitrogênio, a transcrição dos genes nif é regulada pela proteína NifA sensível ao nitrogênio. Quando não há nitrogênio fixado suficiente disponível para o uso do organismo, a expressão de NifA é ativada, e NifA ativa o resto dos genes nif. Se houver uma quantidade suficiente de nitrogênio reduzido ou oxigênio presente na rizosfera, outra proteína é ativada, NifL. NifL inibe a atividade de NifA resultando na inibição da formação de nitrogenase.

[0067] Exemplos de aspectos de fixação microbiana do nitrogênio que pode ser alterada para aumentar a disponibilidade de nitrogênio para a cultura cerealífera incluem: a) reforçar a interação entre o micróbio e as raízes da cultura na rizosfera. b) reforçar a fixação microbiana do nitrogênio removendo-se a regulação negativa da proteína NifA. Por exemplo, a deleção do gene nifL abole a inibição da atividade de NifA e melhora a expressão de nif na presença tanto de oxigênio como de nitrogênio fixado exógeno. Além disso, a expressão de nifA sob o controle de um promotor independente de nitrogênio pode dissociar a biossíntese de nitrogenase da detecção de nitrogênio e oxigênio ambientais. c) reforçar a disponibilidade de amônia para a planta inibin- do-se a assimilação de amônia para glutamina no micróbio e aumen- tando a excreção de amônia pelo micróbio. Por exemplo, a assimilação rápida do nitrogênio fixado pelo micróbio para glutamina por GS é regulada reversivelmente pela enzima com dois domínios adeniltrans- ferase (ATase), GlnE, através da adenilação e desadenilação de GS para atenuar e restaurar a atividade, respectivamente. O truncamento da proteína GlnE para deleção de seu domínio adenyiyi4emoving [sic] (AR) leva à glutamina sintetase constitutivamente adenilada, limitando a assimilação de amônia pelo micróbio e aumenta a amônia intra e extracelular. Finalmente, a deleção do gene amtB, que codifica o transportador responsável pela absorção de amônia pelo micróbio, leva a maior excreção de amônia.

[0068] Em alguns casos, os micróbios finais produzidos pelos méto- dos aqui descritos não contêm material genético estranho (transgênico), e podem ser adequados para liberação em um campo. As alterações genéticas no micróbio podem consistir em deleções de sequências ou pequenos rearranjos da sequência dentro do próprio genoma do organismo, tal como criando uma cópia de uma sequência promotora dentro do genoma do micróbio e inserindo a cópia na frente de um gene diferente. Portanto, quaisquer elementos genéticos introduzidos no genoma do micróbio podem ser derivados do mesmo micróbio parental. Além disso, os elementos genéticos introduzidos no genoma microbiano podem ser elementos genéticos não codificantes. As mutações resul- tantes podem ser “markerless” (sem marcador), significando que elas não contêm genes marcadores introduzidos de resistência a antibióticos ou outros selecionáveis que são frequentemente usados para gerar mutações em bactérias. Em alguns casos, o processo de remodela- mento microbiano guiado pode envolver introduzir algumas moléculas de DNA helper (auxiliar) nas células bacterianas para facilitar a geração das mutações não transgênicas. No entanto, todo o DNA helper pode ser completamente removido das cepas. Por exemplo, em alguns casos, todo o DNA estranho pode ser removido de uma cepa antes que a dita cepa seja considerada para liberação em campo. A remoção de todo o DNA helper pode ser confirmada, por exemplo, através do sequencia- mento Illumina, um método sensível que consegue detectar mesmo moléculas únicas de sequências de DNA helper. Assim, micróbios gerados através do remodelamento microbiano guiado podem não conter transgenes ou DNA estranho, e as alterações genéticas na cepa consistem somente de deleções de sequências e rearranjos de promo- tores, cuja ocorrência foi demonstrada na natureza. Definições

[0069] Os termos “polinucleotídeo”, “nucleotídeo”, “sequência de nucleotídeos”, “ácido nucleico” e “oligonucleotídeo” são usados alterna- damente. Eles referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, quer desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotí- deos, ou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ter qual- quer estrutura tridimensional, e podem executar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitantes de polinucleotídeos: regiões de codificação ou não codificação de um gene ou fragmento gênico, loci (locus) definidos por análise de ligação, éxons, introns, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA), RNA ribossômico (rRNA), pequeno RNA interferente (siRNA), pequeno RNA em grampo de cabelo (hairpin) (shRNA), micro-RNA (miRNA), ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores (iniciadores). Um polinucleotídeo pode compreender um ou mais nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos. Se presentes, as modificações à estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou depois da montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ainda ser modificado após a polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação.

[0070] Neste relatório descritivo, “expressão” refere-se ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito a partir de um molde de DNA (tal como em e transcrito de mRNA ou outro RNA) e/ou o processo pelo qual um mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Transcritos e polipeptídeos codificados podem ser coletivamente referidos como “ produto gênico”. Se o polinu- cleotídeo for derivado de DNA genômico, a expressão pode incluir o splicing (processamento) do mRNA em uma célula eucariótica.

[0071] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados alternadamente no presente para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácidos que foi modificado; por exemplo, formação de ligações dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação o qualquer outra manipulação, tal como conjugação com um componente de mar- cação. Neste relatório descritivo, o termo “aminoácido” inclui aminoáci- dos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e os isômeros ópticos D ou L, além de análogos de aminoácidos e peptidomi- méticos.

[0072] Neste relatório descritivo, o termo “cerca de” é usado como sinônimo do termo “aproximadamente”. Ilustrativamente, o uso do termo “cerca de” em relação a uma quantidade indica valores ligeiramente fora dos valores citados, p. ex., mais ou menos 0,1% a 10%.

[0073] Micróbios dentro e em volta de culturas alimentares podem influenciar os atributos dessas culturas. Os atributos de plantas que podem ser influenciados por micróbios incluem: produtividade (p. ex., produção de grãos, geração de biomassa, desenvolvimento de frutos, vingamento floral); nutrição (p. ex., aquisição de nitrogênio, fósforo, potássio, ferro, micronutrientes); manejo de estresse abiótico (p. ex., tolerância à seca, tolerância à salinidade, tolerância ao calor); e manejo de estresse biótico (p. ex., praga, ervas daninhas, insetos, fungos e bactérias). As estratégias para alterar atributos de culturas incluem: aumentar concentrações de metabólicos essenciais; mudar a dinâmica temporal da influência microbiana em metabólitos essenciais; vincular a produção/degradação de metabólitos microbianos a novos estímulos ambientais; reduzir metabólitos negativos; e melhorar o equilíbrio de metabólitos ou proteínas subjacentes.

[0074] Em algumas modalidades, sequências controle nativas ou endógenas de genes da presente invenção são substituídas por uma ou mais sequências controle intragenéricas.

[0075] Neste relatório descritivo, “introduzido” refere-se à introdu- ção por meio de biotecnologia moderna e não uma introdução natural.

[0076] Em algumas modalidades, as bactérias da presente inven- ção foram modificadas de tal modo que não são bactérias naturais.

[0077] Em algumas modalidades, as bactérias da presente inven- ção estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos 103 cfu, 104 cfu, 105 cfu, 106 cfu, 107 cfu, 108 cfu, 109 cfu, 1010 cfu, 1011 cfu ou 1012 cfu por grama de massa fresca ou seca da planta. Em algumas modalidades, as bactérias da presente invenção estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos aproximadamente 103 cfu, aproximadamente 104 cfu, aproximadamente 105 cfu, aproximadamente 106 cfu, aproximadamente 107 cfu, aproximadamente 108 cfu, aproxi- madamente 109 cfu, aproximadamente 1010 cfu, aproximadamente 1011 cfu, ou aproximadamente 1012 cfu por grama de massa fresca ou seca da planta. Em algumas modalidades, as bactérias da presente invenção estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos 103 a 109, 103 a 107, 103 a 105, 105 a 109, 105 a 107, 106 a 1010, 106 a 107 cfu por grama de massa fresca ou seca da planta.

[0078] Os fertilizantes e o nitrogênio exógeno da presente invenção podem compreender as seguintes moléculas contendo nitrogênio: amônio, nitrato, nitrito, amônia, glutamina etc. As fontes de nitrogênio da presente invenção podem incluir amônia anidra, sulfato de amônia, ureia, fosfato de diamônio, forma de ureia, fosfato de monoamônio, nitrato de amônio, soluções nitrogenadas, nitrato de cálcio, nitrato de potássio, nitrato de sódio etc.

[0079] Neste relatório descritivo, “nitrogênio exógeno” refere-se ao nitrogênio não atmosférico facilmente disponível no solo, campo ou meio de crescimento que está presente sob condições sem limitações de nitrogênio, incluindo amônia, amônio, nitrato, nitrito, ureia, ácido úrico, ácidos de amônio etc.

[0080] Neste relatório descritivo, “condições sem limitações de nitrogênio” refere-se ao nitrogênio não atmosférico disponível no solo, campo, meios em concentrações de nitrogênio superiores a aproxima- damente 4 mM, conforme descrito por Kant at al. (2010. J. Exp. Biol. 62(4):1499-1509), aqui incorporado por referência.

[0081] Neste relatório descritivo, “microrganismo intergenérico” é um microrganismo que é formado pela combinação intencional de mate- rial genético originalmente isolado de organismos de gêneros taxonô- micos diferentes. “Mutante intergenérico” pode ser usado alternadamen- te com “microrganismo intergenérico”. Um “microrganismo intergenéri- co” exemplar inclui um microrganismo contendo um elemento genético móvel que foi inicialmente identificado em um microrganismo de um gênero diferente do microrganismo receptor.

[0082] Neste relatório descritivo, “microrganismo intragenérico” é um microrganismo e é formado pela combinação intencional de material genético originalmente isolado de organismos dos mesmos gêneros taxonômicos. “Mutante intragenérico” pode ser usado alternadamente com “microrganismo intragenérico”.

[0083] Neste relatório descritivo, “material genético introduzido” significa material genético que é adicionado e que permanece como um componente do genoma do receptor.

[0084] Em algumas modalidades, uma rede de regulação genética da fixação e assimilação do nitrogênio compreende polinucleotídeos que codificam genes e sequências não codificantes que direcionam, modulam e/ou regulam a fixação e/ou assimilação microbianas do nitrogênio e que pode compreender sequências polinucleotídicas do cluster de nif (p. ex., nifA, nifB, nifC,…….nifZ), polinucleotídeos que codificam a proteína C reguladora de nitrogênio, polinucleotídeos que codificam a proteína B reguladora de nitrogênio, sequências polinucleotídicas do cluster de gln (p. ex., glnA e glnD), draT e transportadores/permeases de amônia. Em alguns casos, o cluster de Nif pode compreender NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa e NifV. Em alguns casos, o cluster de Nif pode compreender um subconjunto de NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa e NifV.

[0085] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente invenção compreende pelo menos 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% de nitrogênio em massa.

[0086] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente inven- ção compreende pelo menos aproximadamente 5%, aproximadamente 6%, aproximadamente 7%, aproximadamente 8%, aproximadamente 9%, aproximadamente 10%, aproximadamente 11%, aproximadamente 12%, aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamen- te 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximada- mente 18%, aproximadamente 19%, aproximadamente 20%, aproxima- damente 21%, aproximadamente 22%, aproximadamente 23%, aproximadamente 24%, aproximadamente 25%, aproximadamente 26%, aproximadamente 27%, aproximadamente 28%, aproximadamen- te 29%, aproximadamente 30%, aproximadamente 31%, aproximada- mente 32%, aproximadamente 33%, aproximadamente 34%, aproximadamente 35%, aproximadamente 36%, aproximadamente

37%, aproximadamente 38%, aproximadamente 39%, aproximada- mente 40%, aproximadamente 41%, aproximadamente 42%, aproxima- damente 43%, aproximadamente 44%, aproximadamente 45%, aproximadamente 46%, aproximadamente 47%, aproximadamente 48%, aproximadamente 49%, aproximadamente 50%, aproximadamen- te 51%, aproximadamente 52%, aproximadamente 53%, aproximada- mente 54%, aproximadamente 55%, aproximadamente 56%, aproximadamente 57%, aproximadamente 58%, aproximadamente 59%, aproximadamente 60%, aproximadamente 61%, aproximadamen- te 62%, aproximadamente 63%, aproximadamente 64%, aproximada- mente 65%, aproximadamente 66%, aproximadamente 67%, aproxima- damente 68%, aproximadamente 69%, aproximadamente 70%, aproxi- madamente 71%, aproximadamente 72%, aproximadamente 73%, aproximadamente 74%, aproximadamente 75%, aproximadamente 76%, aproximadamente 77%, aproximadamente 78%, aproximada- mente 79%, aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproxi- madamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximada- mente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproxima- damente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproxi- madamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% ou aproximadamente 99% de nitrogênio em massa.

[0087] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente inven- ção compreende entre aproximadamente 5% e 50%, entre aproxima- damente 5% e 75%, entre aproximadamente 10% e 50%, entre aproxi- madamente 10% e 75%, entre aproximadamente 15% e 50%, entre aproximadamente 15% e 75%, entre aproximadamente 20% e 50%, entre aproximadamente 20% e 75%, entre aproximadamente 25% e 50%, entre aproximadamente 25% e 75%, entre aproximadamente 30%

e 50%, entre aproximadamente 30% e 75%, entre aproximadamente 35% e 50%, entre aproximadamente 35% e 75%, entre aproxima- damente 40% e 50%, entre aproximadamente 40% e 75%, entre aproximadamente 45% e 50%, entre aproximadamente 45% e 75% ou entre aproximadamente 50% e 75% de nitrogênio em massa.

[0088] Em algumas modalidades, o aumento de fixação do nitrogên- io e/ou a produção de nitrogênio na planta são medidos em relação a plantas controle, que não foram expostas às bactérias da presente invenção. Todos os aumentos ou diminuições em bactérias são medidos em relação a bactérias controle. Todos os aumentos ou diminuições em plantas são medidos em relação a plantas controle.

[0089] Neste relatório descritivo, “promotor constitutivo” é um promotor que é ativo sob a maioria das condições e/ou durante a maioria dos estágios de desenvolvimento. Há diversas vantagem no uso de promotores constitutivos em vetores de expressão utilizados em biotec- nologia, tais como: nível elevado de produção de proteínas utilizadas para selecionar células ou organismos transgênicos; nível elevado de expressão de proteínas repórteres ou marcadores pontuáveis, permitir fácil detecção e quantificação; nível elevado de produção de um fator de transcrição que faz parte de um sistema regulador da transcrição; produção de compostos que requerem atividade onipresente no organismo; e produção de compostos que são necessários em todos os estágios de desenvolvimento. Promotores constitutivos exemplares não limitantes incluem o promotor 35S do CaMV, promotores de opina, promotor de ubiquitina, promotor da álcool desidrogenase etc.

[0090] Neste relatório descritivo, “promotor não constitutivo” é um promotor que é ativo sob certas condições, em certos tipos de células e/ou durantes certos estágios do desenvolvimento. Por exemplo, promotores específicos de tecidos, de tecidos preferidos, de tipos espe- cíficos de células e de tipos preferidos de células, promotores induzíveis, e promotores sob controle no desenvolvimento são promo- tores não constitutivos. Exemplos de promotores sob controle no desenvolvimento inclui promotores que dão início preferencialmente à transcrição em certos tecidos.

[0091] Neste relatório descritivo, promotor “induzível” ou “reprimí- vel” é um promotor que está sob controle de fatores químicos ou ambientais. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis sob condições anaeróbicos, certas substâncias químicas, a presença de luz, condições ácidas ou básicas etc.

[0092] Neste relatório descritivo, um promotor “tecido-específico” é um promotor que inicia a transcrição somente em certos tecidos. Diferentemente da expressão de genes constitutivos, a expressão teci- do-específica é resultante de diversos níveis interatuantes da regulação gênica. Assim, na técnica, às vezes, é preferível utilizar promotores de espécies homólogas ou intimamente relacionadas para alcançar a expressão eficiente e confiável de transgenes em determinados tecidos. Esta é uma das principais razões para a grande quantidade de promo- tores tecido-específicos isolados de determinados tecidos encontrados na literatura científica e de patentes.

[0093] Neste relatório descritivo, o termo “operacionalmente ligado” refere-se à associação da sequência de ácido nucleico em um único fragmento de ácido nucleico de modo que a função de um seja regulada pelo outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando este é capaz de regular a expres- são daquela sequência de codificação (ou seja, aquela sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor). As sequên- cias de codificação podem ser operacionalmente ligadas a sequências reguladoras em orientação sense ou antisense. Em outro exemplo, as regiões complementares de RNA da invenção podem ser operacionalmente ligadas, quer direta ou indiretamente, 5′ ao mRNA alvo, ou 3′ ao mRNA alvo ou dentro do mRNA alvo, ou uma primeira região complementar é 5′ e seu complemento é 3′ ao mRNA alvo.

[0094] Em aspectos, “aplicar à planta uma pluralidade de bactérias não intergenéricas” inclui qualquer meio pelo qual a planta (incluindo partes da planta como uma semente, raiz, caule, tecido, etc.) é feita a entrar em contato (ou seja, exposta) com as ditas bactérias em qualquer estágio do ciclo de vida da planta. Consequentemente, “aplicar à planta uma pluralidade de bactérias não intergenéricas” inclui qualquer um dos meios seguintes para expor uma planta (incluindo partes da planta como uma semente, raiz, caule, tecido, etc.) às ditas bactérias: pulverizar sobre a planta, gotejar sobre a planta, aplicar como uma cobertura de semente, aplicar a um campo que será plantado com sementes, aplicar a um campo já plantado com sementes, aplicar a um campo com plantas adultas, etc.

[0095] O termo mmol é uma abreviação para milimol, que é um milésimo (10−3 ) de um mol, aqui abreviado como mol.

[0096] Neste relatório descritivo os termos “microrganismo” ou “micróbio” devem ser generalizados. Esses termos, usados alternada- mente, incluem, entre outros, os dois domínios procarióticos, Bacteria e Archaea. O termo pode também abranger fungos e protistas eucarióti- cos.

[0097] O termo “consórcios microbianos” ou “consórcio microbiano” refere-se a um subconjunto de uma comunidade microbiana de espé- cies microbianas individuais, ou cepas de uma espécie, as quais podem ser descritas como realizando uma função comum, ou podem ser descritas como participando em ou levando a ou correlacionando-se com um parâmetro reconhecível, tal como um atributo fenotípico de interesse.

[0098] O termo “comunidade microbiana” significa um grupo de micróbios que compreende duas ou mais espécies ou cepas. Diferente- mente dos consórcios microbianos, uma comunidade microbiana não precisa realizar uma função comum ou não precisa ter que participar em ou levar a ou correlacionar-se com um parâmetro reconhecível, tal como um atributo fenotípico de interesse.

[0099] Neste relatório descritivo, “isolar”, “isolado”, “micróbio isola- do” e termos semelhantes destinam-se a significar que um ou mais dos microrganismos foi separado de pelo menos um dos materiais com os quais está associado em um ambiente em particular (por exemplo, solo, água, tecido vegetal etc.). Assim, um “micróbio isolado” não existe em seu ambiente natural; em vez disso, é através das várias técnicas aqui descritas que o micróbio foi removido de sua configuração natural e colocado em um estado de existência não natural. Desse modo, a cepa isolada ou o micróbio isolado pode existir como, por exemplo, uma cultura biologicamente pura, ou como esporos (ou outras formas da cepa). Em aspectos, o micróbio isolado pode estar associado com um carreador aceitável, o qual pode ser um carreador agricolamente aceitá- vel.

[0100] Em certos aspectos da invenção, os micróbios isolados exis- tem como “culturas isoladas e biologicamente puras”. Será apreciado pelo técnico no assunto, que uma cultura isolada e biologicamente pura de um micróbio em particular indica que a dita cultura é substancial- mente livre de outros organismos vivos e que contém somente o micróbio individual em questão. A cultura pode conter concentrações variáveis do dito micróbio. A presente invenção salienta que micróbios isolados e biologicamente puros muitas vezes “diferem necessariamen- te de materiais menos puros ou impuros”. Ver, p. ex., In re Bergstrom, 427 F.2d 1394, (CCPA 1970) (discussão sobre prostaglandinas purifi- cadas), ver também, In re Bergy, 596 F.2d 952 (CCPA 1979) (discussão sobre micróbios purificados), ver também, Parke-Davis & Co. v. H.K.

Mulford & Co., 189 F. 95 (S.D.N.Y. 1911) (Learned Hand discutindo adrenalina purificada), aff’d in part, rev’d in part, 196 F. 496 (2d Cir. 1912), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Além disso, em alguns aspectos, a invenção provê certas medidas quanti- tativas da concentração, ou limitações de pureza, que precisam ser encontradas em uma cultura microbiana isolada e biologicamente pura. A presença desses valores de pureza, em certas modalidades, é um atributo adicional que distingue os micróbios presentemente revelados daqueles micróbios existindo em um estado natural. Ver, p. ex., Merck & Co. v. Olin Mathieson Chemical Corp., 253 F.2d 156 (4th Cir. 1958) (discussão sobre limitações de pureza para vitamina B12 produzida por micróbios), aqui incorporado por referência.

[0101] Neste relatório descritivo, por “isolados individuais”, deve-se entender uma composição, ou cultura, que compreende uma predomi- nância de um único gênero, espécie ou cepa de microrganismo, após a separação de um ou mais outros microrganismos.

[0102] Os micróbios da presente invenção podem incluir esporos e/ou células vegetativas. Em algumas modalidades, os micróbios da presente invenção incluem micróbios em estado viável, mas não culti- vável (VBNC). Neste relatório descritivo, “esporo” ou “esporos” referem- se a estruturas produzidas por bactérias e fungos que são adaptados para sobrevivência e dispersão. Os esporos são geralmente caracte- rizados como estruturas adormecidas; no entanto, os esporos são capa- zes de diferenciação através do processo de germinação. A germinação é a diferenciação de esporos em células vegetativas que são capazes de atividade metabólica, crescimento e reprodução. A germinação de um único esporo resulta em uma única célula vegetativa fúngica ou bacteriana. Os esporos de fungos são unidades de reprodução assexuada e, em alguns casos, são estruturas necessárias nos ciclos de vidas dos fungos. Os esporos bacterianos são estruturas para condições de sobrevivência que podem normalmente não conduzir à sobrevivência ou crescimento de células vegetativas.

[0103] Neste relatório descritivo, “composição microbiana” refere-se a uma composição que compreende um ou mais micróbios da presente invenção. Em algumas modalidades, uma composição microbiana é administrada a plantas (incluindo várias partes da planta) e/ou em campos agrícolas.

[0104] Neste relatório descritivo, “carreador”, “carreador aceitável”, ou “carreador agricolamente aceitável” refere-se a um diluente, adjuvan- te, excipiente ou veículo com o qual o micróbio pode ser administrado, o qual não afeta prejudicialmente o micróbio.

[0105] O uso dos termos “um“, “uma“, “o“ e “a“ “um“ e referentes similares no contexto de descrever a invenção (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) deverão ser interpretados no sentido de incluir o singular e o plural, a menos que indicado o contrário no presente ou claramente desmentido pelo contexto. Os termos “compreendendo”, “tendo”, “incluindo” e “contendo” deverão ser interpretados como termos abertos (ou seja, significando “incluindo, entre outros”,) a menos que anotado de outra forma. A recitação de faixas de valores no presente destina-se simplesmente a servir como um método abreviado para referir-se individualmente a cada valor separado situado dentro da faixa, a menos que indicado o contrário no presente, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como o seria caso fosse recitado individualmente no presente. Por exemplo, se a faixa 10-15 é descrita, então 11, 12, 13 e 14 são também descritos. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada a menos que indicado o contrário no presente ou de outra forma claramente desmentido pelo contexto. O uso de todos e quaisquer exemplos, ou de linguagem exemplar (p. ex., “tal como”), neste relatório descritivo, destina-se simplesmente a esclarecer melhor a invenção e não impõe uma limitação sobre o âmbito da invenção a menos que reivindicado de outra forma. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicativo de qualquer elemento não reivindicado como essencial à prática da invenção. Colonização bacteriana

[0106] Em algumas modalidades, os micróbios podem ser modifi- cados para aumentar a entrega de nitrogênio a plantas. Por exemplo, os micróbios podem ser modificados para aumentar a colonização de raízes da planta ou para aumentar cofatores necessários para a fixação do nitrogênio.

[0107] Em alguns casos, exopolissacarídeos podem estar envolvi- dos na colonização bacteriana de plantas. Em alguns casos, micróbios colonizadores de plantas podem produzir um biofilme. Em alguns casos, micróbios colonizadores de plantas secretam moléculas que podem ajudar na adesão à planta, ou na evasão de uma resposta imune da planta. Em alguns casos, micróbios colonizadores de plantas podem excretar moléculas de sinalização que alteram a resposta das plantas aos micróbios. Em alguns casos, micróbios colonizadores de plantas podem secretar moléculas que alteram o microambiente local. Em alguns casos, um micróbio colonizador da planta pode alterar expressão de genes para adaptar-se a uma planta à qual o dito micróbio está próximo. Em alguns casos, um micróbio colonizador de planta pode detectar a presença de uma planta no ambiente local e pode mudar a expressão de genes em resposta. Regulação de fixação do nitrogênio

[0108] Em alguns casos, a via de fixação do nitrogênio pode atuar como alvo para engenharia genética e otimização. Um atributo que pode servir de alvo para regulação pelos métodos aqui descritos é a fixação do nitrogênio. Fertilizantes nitrogenados representam a maior despesa operacional em uma fazenda, e o maior motor para rendimentos mais altos de culturas em fileiras como milho e trigo. A presente invenção descreve produtos microbianos que podem fornecer novas formas renováveis de nitrogênio em culturas não leguminosas. Embora alguns endófitos disponham da genética necessária para fixar nitrogênio na cultura pura, o desafio técnico fundamental é que os endófitos do tipo selvagem de cereais e gramíneas param de fixar nitrogênio em campos fertilizados. A aplicação de fertilizantes químicos e os níveis residuais de nitrogênio em solos do campo sinalizam para o micróbio que encerre a via bioquímica para fixação do nitrogênio.

[0109] Mudanças aos níveis transcricionais e pós-traducionais de componentes da rede de regulação de fixação do nitrogênio podem ser benéficas para o desenvolvimento de um micróbio capaz de fixar e transferir nitrogênio para milho na presença de fertilizante. Para tanto, é aqui descrita a tecnologia Host-Microbe Evolution (HoME) para evolução com precisão das de regulação e indução de novos fenótipos. São também aqui descritas bibliotecas únicas de propriedade exclusiva de endófitos fixadores de nitrogênio isolados de milho, emparelhado com dados ômicos extensos que envolvem a interação de micróbios e planta hospedeira sob diferentes condições ambientais como estresse e excesso de nitrogênio. Em algumas modalidades, essa tecnologia possibilita a evolução com precisão da rede de regulação genética de endófitos para produzir micróbios que fixem ativamente nitrogênio mesmo na presença de fertilizante no campo. São também descritas avaliações do potencial técnico de micróbios em desenvolvimento que colonizam tecidos radiculares do milho e produzem nitrogênio para plantas fertilizadas, e avaliações da compatibilidade de endófitos com práticas padrão de formulação e diversos solos para determinar a viabilidade de integrar os micróbios em estratégias modernas para manejo do nitrogênio.

[0110] Para que o elemento nitrogênio (N) seja utilizado em síntese química, as formas de vida combinam nitrogênio gasoso (N2) disponível na atmosfera com hidrogênio em um processo conhecido como fixação do nitrogênio. Por causa da natureza altamente energética da fixação biológica do nitrogênio, os diazotróficos (Bacteria e Archaea que fixam nitrogênio atmosférico gasoso) desenvolveram uma regulação sofisti- cada e rígida do cluster de genes nif em resposta ao oxigênio ambiental e o nitrogênio disponível. Os genes Nif codificam enzimas envolvidas na fixação do nitrogênio (tais como o complexo de nitrogenases) e proteí- nas que regulam a fixação do nitrogênio. Shamseldin (2013. Global J. Biotechnol. Biochem. 8(4):84-94) apresenta descrições detalhadas dos genes nif e de seus produtos, sendo aqui incorporado por referência. A presente invenção descreve métodos de produção de uma planta com um atributo melhorado, os quais compreendem isolar bactérias de uma primeira planta, introduzir uma variação genética em um gene das bactérias isoladas para aumentar a fixação do nitrogênio, expor uma segunda planta às bactérias variantes, isolar bactérias da segunda planta tendo um atributo melhorado em relação à primeira planta e repetir as etapas com bactérias isoladas da segunda planta.

[0111] Nas Proteobacteria, a regulação de fixação do nitrogênio centra-se em torno da proteína intensificadora de ligação (enhancer- binding protein) dependente de σ54, NifA, o regulador transcricional positivo do cluster nif. Os níveis intracelulares de NifA ativa são controlados por dois fatores essenciais: transcrição do óperon nifLA e inibição da atividade de NifA por interação proteína-proteína com NifL. Esses dois processos respondem aos níveis intracelulares de glutamina através da cascata de sinalização da proteína PII. Essa cascata é mediada por GlnD, que percebe diretamente o nível de glutamina e catalisa a uridilação ou desuridilação das duas proteínas reguladoras de PII – GlnB e GlnK – em resposta à ausência ou presença, respectiva- mente, de glutamina ligada. Sob condições com excesso de nitrogênio,

GlnB não modificada sinaliza para a desativação do promotor de nifLA. No entanto, sob condições com limitação de nitrogênio, GlnB é modifi- cada após a tradução, o que inibe sua atividade e leva à transcrição do óperon nifLA. Desse modo, a transcrição de nifLA é rigidamente contro- lada em resposta ao nitrogênio ambiental através da cascata de sinali- zação da proteína PII. Em nível pós-traducional da regulação de NifA, GlnK inibe a interação NifL/NifA em uma matéria dependente sobre o nível global de GlnK livre dentro da célula.

[0112] NifA é transcrito a partir do óperon nifLA, cujo promotor é ativado por NtrC fosforilado, outro regulador σ54-dependente. O estado de fosforilação de NtrC é mediado pela histidina quinase NtrB, que inte- rage com GlnB desuridilada, mas não com GlnB uridilada. Sob condi- ções de excesso de nitrogênio, um alto nível intracelular de glutamina leva à desuridilação de GlnB, que interage, então, com NtrB para desati- var sua atividade de fosforilação e ativar sua atividade de fosfatase, resultando na desfosforilação de NtrC e na desativação do promotor de nifLA. No entanto, sob condições com limitação de nitrogênio, um nível baixo de glutamina intracelular resulta na uridilação de GlnB, o que inibe sua interação com NtrB e permite a fosforilação de NtrC e transcrição do óperon nifLA. Desse modo, a expressão de nifLA é rigidamente controlada em resposta ao nitrogênio ambiental através da cascata de sinalização da proteína PII. nifA, ntrB, ntrC e glnB, são todos genes que podem sofrer mutação nos métodos aqui descritos. Esses processos podem também responder aos níveis intracelulares ou extracelulares de amônia, ureia ou nitratos.

[0113] A atividade de NifA é também regulada após a tradução em resposta ao nitrogênio ambiental, mais tipicamente através de inibição mediada por NifL da atividade de NifA. Em geral, a interação de NifL e NifA é influenciada pela cascata de sinalização da proteína PII através de GlnK, embora a natureza das interações entre GlnK e NifL/NifA varie significativamente entre os diazotróficos. Em Klebsiella pneumoniae, ambas as formas de GlnK inibem a interação NifL/NifA, e a interação entre GlnK e NifL/NifA é determinada pelo nível global de GlnK livre dentro da célula. Sob condições com excesso de nitrogênio, GlnK desuridilada interage com o transportador de amônio AmtB, que tem como função bloquear a absorção de amônio por AmtB e sequestrar GlnK para a membrana, permitindo a inibição de NifA por NifL. Por outro lado, em Azotobacter vinelandii, a interação com GlnK desuridilada é necessária para a interação NifL/NifA e inibição de NifA, enquanto a uridilação de GlnK inibe sua interação com NifL. Em diazotróficos desprovidos do gene nifL, há evidência de que a atividade de NifA é inibida diretamente pela interação com as formas desuridiladas de GlnK e GlnB sob condições com excesso de nitrogênio. Em algumas bacté- rias, o cluster Nif pode ser regulado por glnR e, ainda em alguns casos, pode compreender regulação negativa. Independentemente do meca- nismo, a inibição pós-traducional de NifA é um regulador importante do cluster nif na maioria dos diazotróficos conhecidos. Além disso, nifL, amtB, glnK e glnR são genes que podem sofrer mutação nos métodos aqui descritos.

[0114] Além de regulação da transcrição do cluster dos genes nif, muitos diazotróficos desenvolveram um mecanismo para a modificação direta pós-traducional e inibição da própria enzima nitrogenase, conhe- cido como desligamento da nitrogenase. Esse é mediado por ADP-ribo- silação da proteína Fe (NifH) sob condições com excesso de nitrogênio, o que perturba sua interação com o complexo proteico MoFe (NifDK) e abole a atividade da nitrogenase. DraT catalisa a ADP-ribosilação da proteína Fe e o desligamento da nitrogenase, enquanto DraG catalisa a remoção de ADP-ribose e reativação da nitrogenase. Tal como com a transcrição de nifLA e inibição de NifA, o desligamento da nitrogenase é também regulado através da cascata de sinalização da proteína PII.

Sob condições com excesso de nitrogênio, GlnB desuridilada interage com e ativa DraT, enquanto GlnK desuridilada interage com DraG e AmtB para formar um complexo, sequestrando DraG para a membrana. Sob condições com limitação de nitrogênio, as formas uridiladas de GlnB e GlnK não interagem com DraT e DraG, respectivamente, levando à inativação de DraT e a difusão de DraG para a proteína Fe, onde remove o ADP-ribose e ativa a nitrogenase. Os métodos aqui descritos também contemplam introduzir uma variação genética nos genes nifH, nifD, nifK e draT.

[0115] Embora alguns endófitos sejam capazes de fixar nitrogênio in vitro, frequentemente a genética é silenciada no campo por níveis elevados de fertilizantes químicos exógenos. É possível dissociar a detecção de nitrogênio exógeno da expressão da enzima nitrogenase para facilitar a fixação do nitrogênio baseada no campo. Melhorar a atividade global da nitrogenase no tempo também tem como função aumentar a produção de nitrogênio para utilização pela cultura. Os alvos específicos de variação genética para facilitar a fixação do nitrogênio baseada no campo empregando os métodos aqui descritos incluem um ou mais genes selecionados a partir do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ.

[0116] Um alvo adicional de variação genética para facilitar a fixação do nitrogênio baseada no campo empregando os métodos aqui descritos é a proteína NifA. A proteína NifA é tipicamente o ativador para expressão de genes de fixação do nitrogênio. Aumentar a produção de NifA (quer constitutivamente ou durante condição com alto nível de amônia) contorna a via nativa de detecção de amônia. Além disso, reduzir a produção de proteínas NifL, um inibidor conhecido de NifA, também leva a um nível maior de NifA livremente ativa. Além do mais, aumentar o nível de transcrição do óperon nifAL (quer constitutivamente ou durante condição com alto nível de amônia) também leva a um nível global maior de proteínas NifA. Elevar o nível de expressão de nifAL é conseguido alterando o próprio promotor ou reduzindo a expressão de NtrB (parte da cascata de sinalização de ntrB e ntrC que originalmente resultaria no desligamento do óperon nifAL durante condição com alto nível de nitrogênio). O nível elevado de NifA alcançado por esses ou quaisquer outros métodos aqui descritos aumenta a atividade de fixação do nitrogênio dos endófitos.

[0117] Outro alvo de variação genética para facilitar a fixação do nitrogênio baseada no campo empregando os métodos aqui descritos é a cascata de sinalização GlnD/GlnB/GlnK PII. O nível intracelular de glutamina é detectado através da cascata de sinalização GlnD/GlnB/GlnK PII. Mutações ativas no sítio em GlnD que abolem a atividade removedora de uridila de GlnD rompem a cascata de detecção de nitrogênio. Além disso, reduzir a concentração de GlnB atua como curto-circuito na cascata de detecção de glutamina. Essas mutações “enganam” as células na detecção de um estado com nitrogênio limita- do, aumentando, com isso, a atividade do nível de fixação do nitrogênio. Esses processos podem também responder a níveis intracelulares ou extracelulares de amônia, ureia ou nitratos.

[0118] A proteína amtB é também um alvo de variação genética para facilitar a fixação do nitrogênio baseada no campo empregando os métodos aqui descritos. A absorção de amônia do ambiente pode ser reduzida diminuindo-se o nível de expressão da proteína amtB. Sem amônia intracelular, o endófito não é capaz de detectar o nível elevado de amônia, impedindo a regulação negativa de genes de fixação do nitrogênio. Qualquer amônia que consiga penetrar no compartimento intracelular é convertida em glutamina. O nível intracelular de glutamina é a principal moeda de detecção do nitrogênio. Diminuir o nível intrace- lular de glutamina impede que as células detectem níveis elevados de amônio no ambiente. Esse efeito pode ser conseguido aumentando-se o nível de expressão de glutaminase, uma enzima que converte gluta- mina em glutamato. Além disso, a glutamina intracelular pode também ser reduzida diminuindo-se a glutamina sintase (uma enzima que converte amônia em glutamina). Nos diazotróficos, a amônia fixada é rapidamente assimilada em glutamina e glutamato a serem utilizados para processos celulares. Perturbações à assimilação de amônia pode permitir o desvio do nitrogênio fixado a ser exportado da célula como amônia. A amônia fixada é predominantemente assimilada em glutami- na pela glutamina sintetase (GS), codificada por glnA e, subsequente- mente em glutamina pela glutamina oxoglutarato aminotransferase (GOGAT). Em alguns exemplos, glnS codifica uma glutamina sintetase. GS é regulada pós-traducionalmente pela GS adenil transferase (GlnE), uma enzima bifuncional codificada por glnE que catalisa a adenilação e a desadenilação de GS através da atividade de seus domínios adenil- transferase (AT) e remoção de adenila (AR), respectivamente. Sob condições com limitação de nitrogênio, glnA é expresso, e o domínio AR de GlnE desadenila GS, permitindo-o ser ativo. Sob condições de excesso de nitrogênio, a expressão de glnA é desligada, e o domínio AT de GlnE é ativado alostericamente por glutamina, provocando a adenilação e desativação de GS.

[0119] Além do mais, o gene draT pode também ser um alvo de variação genética para facilitar a fixação do nitrogênio baseada no campo empregando os métodos aqui descritos. Uma vez produzidas enzimas fixadoras de nitrogênio pela célula, o desligamento da nitroge- nase representa outro nível no qual a célula regula negativamente a atividade de fixação sob condições de alto nível de nitrogênio. Esse desligamento poderia ser removido diminuindo-se o nível de expressão de DraT.

[0120] Os métodos para transmitir novos fenótipos microbianos podem ser realizados no nível transcricional, traducional e pós- traducional. O nível transcricional inclui mudanças no promotor (tais como mudar a afinidade pelo fator sigma ou sítios de ligação de fatores de transcrição, incluindo a deleção de todo ou de uma parte do promo- tor) ou mudar terminadores e atenuadores da transcrição. O traducional inclui mudanças nos sítios de ligação ao ribossomo e mudanças em sinais de degradação do mRNA. O nível pós-traducional incluir mutação no sítio ativo de uma enzima e mudanças em interações proteína- proteína. Essas mudanças podem ser conseguidas de múltiplas manei- ras. A redução do nível de expressão (ou abolição completa) pode ser conseguida trocando o sítio nativo de ligação ao ribossomo (RBS) ou promotor por outro com menor força/eficiência. Sítios de partida com ATG podem ser trocados por um códon de partida GTG, TTG ou CTG, resultando em redução na atividade de tradução da região de codifica- ção. A abolição completa da expressão pode ser efetuada por desativa- ção (knocking out) (deleção) da região de codificação de um gene. Alteração na fase de leitura aberta (ORF) (frameshifting) provavelmente resultará em um códon de parada prematuro ao longo da ORF, criando, assim, um produto truncado não funcional. A inserção de códons de parada in frame (sem alterar a matriz) também igualmente criará um produto truncado não funcional. A adição de um tag (etiqueta) de degra- dação no N ou C terminal pode também ser realizada para reduzir a concentração eficaz de um gene em particular.

[0121] Por outro lado, o nível de expressão dos genes aqui descritos pode ser conseguido utilizando um promotor mais forte. A fim de assegurar alta atividade do promotor durante uma condição com alto nível de nitrogênio (ou qualquer outra condição), um perfil de transcrição do genoma inteiro em uma condição de alto nível de nitrogênio poderia ser obtido e promotores ativos com um nível desejado de transcrição podem ser escolhidos dentre aquele conjunto de dados para substituir o promotor fraco. Códons de partida fracos podem ser desativados (swapped out) com um códon de partida ATG para eficiência melhor no início da tradução. Sítios de ligação ao ribossomo (RBS) fracos podem também ser desativados com um RBS diferente de eficiência maior no início da tradução. Além disso, a mutagênese sítio-específica pode também ser realizada para alterar a atividade de uma enzima.

[0122] Além da regulação de genes de nitrogenases e da assimila- ção de nitrogênio, os níveis de nitrogênio excretado podem também ser afetados pela disponibilidade de cofatores envolvidos na fixação e/ou assimilação. Por exemplo, enxofre é um componente de algumas nitrogenases. O enxofre precisa, geralmente, ser transferido através das membranas celulares. Em L. japonicus, o transportador de sulfato LjSST1 é essencial para fixação do nitrogênio; mutantes knockout (desabilitados) são incapazes de desenvolver nós funcionais. Em algu- mas modalidades, a atividade da nitrogenase pode ser aumentada regulando positivamente transportadores que aumentam a disponibili- dade de cofatores como enxofre. Por exemplo, a expressão ou atividade do transportador de enxofre, cysZ, pode ser aumentada.

[0123] Aumentar o nível de fixação do nitrogênio que ocorre em uma planta pode levar a uma redução na quantidade de fertilizante químico necessário para produção da cultura e reduzir as emissões de gases estufa (p. ex., óxido nitroso). Geração de populações bacterianas Isolamento de bactérias

[0124] Micróbios úteis nos métodos e composições aqui revelados podem ser obtidos extraindo micróbios de superfícies ou tecidos de plantas nativas. Os micróbios podem ser obtidos moendo sementes para isolar micróbios. Micróbios podem ser obtidos plantando-se sementes em diversas amostras de solo e recuperando micróbios de tecidos. Além disso, os micróbios podem ser obtidos inoculando-se plantas com micróbios exógenos e determinando quais micróbios apa- recem em tecidos vegetais. Exemplos não limitantes de tecidos vegetais podem incluir uma semente, plântula, folha, corte, planta, bulbo ou tubérculo.

[0125] Um método de obtenção de micróbios pode ser através do isolamento de bactérias de solos. As bactérias podem ser coletadas de vários tipos de solo. Em alguns exemplos, o solo pode ser caracterizado por atributos como alta ou baixa fertilidade, níveis de umidade, níveis de minerais e várias práticas de cultivo. Por exemplo, o solo pode estar envolvido em uma rotação de culturas quando culturas diferentes são plantadas no mesmo solo em estações sucessivas de plantio. O cresci- mento sequencial de culturas diferentes no mesmo solo pode prevenir o esgotamento desproporcional de certos minerais. As bactérias podem ser isoladas das plantas em crescimento nos solos selecionados. As plantas jovens podem ser colhidas com 2-6 semanas de crescimento. Por exemplo, pelo menos 400 isolados podem ser coletados em um ciclo de colheita. Os tipos de solo e planta revelam o fenótipo da planta bem como as condições, que permitem o enriquecimento a jusante de certos fenótipos.

[0126] Os micróbios podem ser isolados de tecidos vegetais para avaliar atributos microbianos. Os parâmetros para o processamento de amostras de tecido podem ser variados para isolar tipos diferentes de micróbios associativos, tais como bactérias rizoféricas, epífitos ou endófitos. Os isolados podem ser cultivados em meio livre de nitrogênio para enriquecer bactérias que realizam fixação do nitrogênio. Alternati- vamente, os micróbios podem ser obtidos de bancos mundiais de cepas.

[0127] A analítica in planta é realizada para avaliar atributos microbianos. Em algumas modalidades, o tecido vegetal pode ser processado para rastreamento por processamento de alto rendimento de DNA e RNA. Além disso, podem ser utilizadas medições não invasivas para avaliar características da planta, tais como colonização. Medições em micróbios selvagens podem ser obtidas de planta para planta. Medições em micróbios selvagens podem também ser obtidas no campo utilizando métodos de rendimento médio. As medições po- dem ser efetuadas sucessivamente ao longo do tempo. Sistema modelo em planta pode ser utilizado, incluindo, entre outros, Setaria.

[0128] Micróbios em um sistema de planta podem ser rastreados via determinação do perfil de transcrição de um sistema de planta. Os exemplos de rastreamento através do perfil de transcrição são métodos que utilizam a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), códigos de barra molecular para detecção de transcritos, Sequência da Próxima Geração e marcação de micróbios com marcadores fluores- centes. Fatores de impacto podem ser medidos para avaliar a coloni- zação na estufa incluindo, entre outros, microbioma, fatores abióticos, condições do solo, oxigênio, umidade, temperatura, condições do inócu- lo e localização de raízes. A fixação do nitrogênio pode ser avaliada em bactérias medindo-se 15N gás/fertilizante (diluição) com IRMS ou NanoSIMS como aqui descrito. NanoSIMS é espectrometria de massa de íon secundário de alta resolução. A técnica NanoSIMS é uma maneira para investigar a atividade química de amostras biológicas. A catálise de redução de reações de oxidação que direcionam o metabo- lismo de microrganismos pode ser investigada em nível celular, subce- lular, molecular e elementar. NanoSIMS pode oferecer alta resolução especial superior a 0,1 µm. NanoSIMS pode detectar o uso de traçado- res isotópicos como 13C, 15N e 18O. Portanto, NanoSIMS pode ser utiliza- da para o nitrogênio com atividade química na célula.

[0129] Estufas automatizadas podem ser utilizadas para analítica de plantas. A métrica de plantas em resposta à exposição microbiana inclui, entre outros, biomassa, análise de cloroplastos, câmara CCD, medições volumétricas por tomografia.

[0130] Uma maneira de enriquecer uma população de micróbios é de acordo com o genótipo. Por exemplo, um ensaio de reação em cadeia da polimerase (PCR) com um iniciador direcionado ou iniciador específico. Iniciadores desenhados para o gene nifH podem ser utiliza- dos para identificar diazotróficos porque os diazotróficos expressam o gene nifH no processo de fixação do nitrogênio. Uma população microbiana pode também ser enriquecida através de abordagens de células únicas independentes de cultura e abordagens de isolamento guiadas por quimiotaxia. Alternativamente, o isolamento de micróbios pode ser direcionado pela cultura dos micróbios em meios de seleção. Abordagens premeditadas visando enriquecer populações microbianas para atributos desejados podem ser orientadas por dados de bioinfor- mática e são descritas abaixo. Domesticação de micróbios

[0131] Micróbios isolados da natureza podem passar por um processo de domesticação em que os micróbios são convertidos em uma forma que seja geneticamente rastreável e identificável. Uma maneira de domesticar um micróbio é modificá-lo com resistência a antibióticos. O processo de modificação por resistência a antibiótico pode iniciar determinando-se a sensibilidade a antibióticos na cepa microbiana do tipo selvagem. Se as bactérias forem sensíveis ao antibiótico, então o antibiótico pode ser um bom candidato para modifi- cação por resistência a antibiótico. Subsequentemente, um gene de resistência ao antibiótico ou um vetor suicida de seleção negativa (counterselectable) pode ser incorporado no genoma de um micróbio utilizando métodos de recombinação. Um vetor suicida de seleção negativa pode consistir em uma deleção do gene de interesse, um marcador selecionável e o marcador de seleção negativa sacB. A seleção negativa pode ser utilizada para trocar sequências nativas do DNA microbiano por genes de resistência a antibiótico. Um método de rendimento médio pode ser utilizado para avaliar múltiplos micróbios simultaneamente permitindo a domesticação paralela. Métodos alterna- tivos de domesticação incluem o uso de nucleases teleguiadas (do inglês, homing) para impedir que sequências do vetor suicida saiam fora da alça ou que sejam obtidas sequências que intervenham com o vetor.

[0132] Vetores de DNA podem ser introduzidos em bactérias atra- vés de diversos métodos, inclusive eletroporação e transformações químicas. Uma biblioteca padrão de vetores pode ser utilizada para as transformações. Um exemplo de um método de edição gênica é CRISPR precedido por testes com Cas9 para assegurar a atividade de Cas9 nos micróbios.

[0133] O processo de remodelamento pode incluir transfectar transi- toriamente certos plasmídeos nos micróbios. Esses plasmídeos podem então ser curados dos micróbios para removê-los. Vários métodos envolvendo agentes químicos e físicos foram desenvolvidos para elimi- nar plasmídeos. Os protocolos para curar plasmídeos consistem fre- quentemente na exposição de uma cultura a concentrações subini- bidoras de alguns agentes químicos, p. ex., laranja de acridina, acrifla- vina e dodecil sulfato de sódio, ou a uma temperatura acima da ótima seguido pela seleção de derivados curados.

[0134] Em casos em que o plasmídeo é estável ou a perda de propriedade difícil de determinar, as bactérias podem ser tratadas com agentes de cura. Esses incluem agentes químicos e físicos, sendo que alguns destes podem ocasionar mutação ao DNA, interferir especifica- mente com sua replicação ou afetar componentes estruturais em particular ou enzimas da célula bacteriana. Os protocolos para curar plasmídeos consistem frequentemente na exposição de uma cultura a concentrações subinibidoras de alguns agentes químicos, p. ex., laranja de acridina, acriflavina e dodecil sulfato de sódio, ou a uma temperatura acima da ótima seguido por seleção de derivados curados. Os agentes intercalantes do DNA, como laranja de acridina e brometo de etídio, são os mais comumente usados porque demonstram ser eficazes contra plasmídeos em uma grande variedade de gêneros. Embora todos esses agentes tenham sido usados para intensificar a recuperação de plasmí- deo menos derivados de várias bactérias, eles são individualmente eficazes somente contra alguns plasmídeos e sua resposta provável é imprevisível. A eficiência da cura pode também variar bastante depen- dendo do plasmídeo do hospedeiro bacteriano em particular que o carrega. Em alguns casos, um plasmídeo difícil de curar pode ser remo- vido introduzindo-se um plasmídeo adicional, mais fácil de curar ou um sistema capaz de atingir e degradar o plasmídeo difícil de curar. Por exemplo, um plasmídeo difícil de curar pode ser curado introduzindo-se um plasmídeo que codifica um sistema CRIPSR direcionado contra o plasmídeo difícil de curar. Uma vez uma cepa bacteriana tenha sido curada, amostras podem ser sequenciadas para assegurar a remoção completa da sequência plasmidial. Modificação não transgênica de micróbios

[0135] Uma população microbiana com atributos favoráveis pode ser obtida através de evolução direcionada. A evolução direcionada é uma abordagem em que o processo de seleção natural é imitado para o desenvolvimento de proteínas ou ácidos nucleicos em direção a um objetivo definido pelo usuário. Um exemplo de evolução direta é quando mutações aleatórias são introduzidas em uma população microbiana, os micróbios com os atributos mais favoráveis são selecionados e o cresci- mento dos micróbios selecionados é continuado. Os atributos mais favo- ráveis em rizobactérias promotoras de crescimento (PGPRs) podem ser na fixação do nitrogênio. O método de evolução dirigida pode ser iterativo e adaptativo tendo por base o processo de seleção depois de cada iteração.

[0136] Rizobactérias promotoras de crescimento vegetal (PGPRs)

com capacidade elevada de fixação do nitrogênio podem ser geradas. A evolução de PGPRs pode ser realizada por intermédio da introdução de variação genética. A variação genética pode ser introduzida por mutagênese com reação em cadeia da polimerase, mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, mutagênese por saturação, mutagênese com embaralhamento (shuffling) de fragmentos, recombinação homóloga, sistemas CRISPR/Cas9, mutagênese química e combinações destas. Essas abordagens podem introduzir mutações aleatórias na população microbiana. Por exemplo, é possível gerar mutantes usando DNA ou RNA sintético via mutagênese oligonucleotídeo-dirigida. Mutantes po- dem ser gerados utilizando ferramentas contidas em plasmídeos, que são posteriormente curados. Genes de interesse podem ser identifica- dos utilizando bibliotecas de outras espécies com atributos melhorados, inclusive, entre outros, propriedades melhoradas de PGPR, colonização melhorada de cereais, maior sensibilidade ao oxigênio, fixação do nitrogênio aumentada e maior excreção de amônia. Genes intragené- ricos podem ser desenhados tendo por base essas bibliotecas usando software como o software de desenho Geneious ou Platypus. Mutações podem ser projetadas com a ajuda do aprendizado em máquina. Mutações podem ser projetadas com a ajuda de um modelo metabólico. O desenho automatizado da mutação pode ser realizado utilizando a la Platypus e orientará RNAs para mutagênese dirigida por Cas.

[0137] Os genes intragenéricos podem ser transferidos para o micróbio hospedeiro. Adicionalmente, sistemas repórteres podem ser transferidos também para o micróbio. Os sistemas repórteres caracte- rizam promotores, determinam o sucesso da transformação, rastreiam mutantes e atuam como ferramentas de rastreamento negativo.

[0138] Os micróbios portadores da mutação podem ser cultivados através de passagens seriadas. Uma colônia bacteriana contém uma única variante do micróbio. Colônias microbianas são rastreadas com a ajuda de um coletor automático de colônias e manipulador de líquidos. Mutantes com duplicação de genes e número maior de cópias expres- sam um genótipo com mais atributos desejados. Seleção de micróbios promotores de crescimento vegetal com base em fixação do nitrogênio

[0139] As colônias microbianas podem ser rastreadas utilizando vários ensaios para avaliar a fixação do nitrogênio. Uma maneira de medir a fixação do nitrogênio é através de um ensaio fermentativo sim- ples, que mede a excreção de nitrogênio. Um método alternativo é o ensaio de redução de acetileno (ARA) com amostragem em linha ao longo do tempo. O ARA pode ser realizado em placas de alto rendimen- to de arranjos de microtubos. O ARA pode ser realizado com plantas vivas e tecidos vegetais. A formulação do meio e a concentração de oxigênio no meio podem ser variadas em ensaios ARA. Outro método para rastrear variantes microbianas é utilizando biossensores. O uso de NanoSIMS e microespectroscopia de Raman podem ser empregados para investigar a atividade dos micróbios. Em alguns casos, as bactérias podem também ser cultivadas e expandidas com métodos de fermen- tação em biorreatores. Os biorreatores são projetados para melhorar a robustez do crescimento das bactérias e para diminuir a sensibilidade das bactérias ao oxigênio. Microfermentadores baseados em placas de meio a alto TP são utilizados para avaliar sensibilidade ao oxigênio, necessidades nutricionais, fixação do nitrogênio e excreção de nitrogê- nio. As bactérias podem também ser cocultivadas com micróbios competitivos ou benéficos para elucidar vias crípticas. Pode-se utilizar citometria de fluxo para rastrear bactérias que produzem níveis eleva- dos de nitrogênio utilizando indicadores químicos, colorimétricos ou fluorescentes. As bactérias podem ser cultivadas na presença ou ausên- cia de uma fonte de nitrogênio. Por exemplo, as bactérias podem ser cultivadas com glutamina, amônia, ureia ou nitratos.

Melhoramento genético microbiano

[0140] Melhoramento genético microbiano é um método para identi- ficar sistematicamente e melhorar a função de espécies dentro do microbioma de culturas. O método compreende três etapas: 1) seleção de espécies candidatas por mapeamento de interações planta-micróbio e predizer redes de regulação vinculadas a um fenótipo em particular, 2) melhoria pragmática e previsível de fenótipos microbianos através do cruzamento intra-espécie de redes de regulação e clusters de genes e 3) rastreamento e seleção de novos genótipos microbianos que produ- zem os fenótipos desejados para culturas. Para avaliar sistemática- mente a melhoria de cepas, é criado um modelo que vincula a dinâmica de colonização da comunidade microbiana à atividade genética por espécie-chave. O modelo é utilizado para predizer o melhoramento de alvos genéticos e melhora a frequência de melhorias selecionadas em atributos codificados no microbioma de relevância agronômica. Ver, a Figura 2A para uma representação gráfica de uma modalidade do processo. Especificamente, a Figura 2A representa um desenho esque- mático do melhoramento genético microbiano, de acordo com modali- dades. Como ilustrado Figura 2A, a melhoria racional do microbioma da cultura pode ser utilizada para aumentar a biodiversidade do solo, ajustar o impacto de espécies-chave e/ou alterar o momento e a expressão de vias metabólicas importantes. Para tanto, os inventores desenvolveram um pipeline de melhoramento genético microbiano para identificar e melhorar o papel de cepas dentro do microbioma de cultu- ras. O método compreende três etapas: 1) seleção de espécies candi- datas por mapeamento de interações planta-micróbio e predizer redes de regulação vinculadas a um fenótipo em particular, 2) melhoria pragmática e previsível de fenótipos microbianos através do cruzamento intragenômico de redes de regulação gênica e clusteres de genes e 3) rastreamento e seleção de novos genótipos microbianos que produzem fenótipos desejados para culturas. Para avaliar sistematicamente a melhoria de cepas, os inventores empregam um modelo que vincula a dinâmica de colonização da comunidade microbiana à atividade gené- tica por espécies-chave. Esse processo representa uma metodologia para melhoramento genético e seleção de melhorias em atributos codificados no microbioma de relevância agronômica.

[0141] A produção de bactérias para melhorar atributos de plantas (p. ex., fixação do nitrogênio) pode ser conseguida através de passagem seriada. A produção dessa bactéria pode ser realizada selecionando-se plantas, que possuam um atributo melhorado específico que seja influenciado pela flora microbiana, além de identificar bactérias e/ou composições que sejam capazes de transmitir um ou mais atributos melhorados a uma ou mais plantas. Um método de produção de bacté- rias para melhorar um atributo vegetal inclui as etapas de: (a) isolar bactérias do tecido ou solo de uma primeira planta; (b) introduzir uma variação genética em uma ou mais das bactérias para produzir uma ou mais bactérias variantes; (c) expor uma pluralidade de plantas às bactérias variantes; (d) isolar bactérias do tecido ou solo de uma da pluralidade de plantas, em que a planta da qual as bactérias são isola- das possui um atributo melhorado em relação a outras plantas na plurali- dade de plantas; e (e) repetir as etapas (b) a (d) com bactérias isoladas da planta com um atributo melhorado (etapa (d)). As etapas (b) a (d) podem repetir diversas vezes (p. ex., uma vez, duas, três, quatro, cinco, dez ou mais vezes) até que o atributo melhorado em uma planta atinja um nível desejado. Além disso, a pluralidade de plantas pode ser mais de duas plantas, como 10 a 20 plantas, ou 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 300 ou mais, 500 ou mais, ou 1000 ou mais plantas.

[0142] Além de obter uma planta com um atributo melhorado, é obtida uma população bacteriana que compreende bactérias incluindo uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes (p.

ex., genes que regulam a fixação do nitrogênio). Repetindo-se as etapas descritas acima, pode-se obter uma população de bactérias que incluem os membros mais adequados da população que se correlacionam com um atributo de interesse.

As bactérias nessa população podem ser identificadas e suas propriedades benéficas determinadas, tal como por análise genética e/ou fenotípica.

A análise genética de bactérias isola- das pode ocorrer na etapa (a). Informações fenotípicas e/ou genotípicas podem ser obtidas utilizando técnicas que incluem: rastreamento de alto rendimento de componentes químicos de origem vegetal, técnicas de sequenciamento incluindo sequenciamento de alto rendimento de mate- rial genético, técnicas de exibição diferencial (incluindo DDRT-PCR e DD-PCR), técnicas de microarranjos de ácido nucleico, sequenciamento de RNA (Sequenciamento Shogun de Transcriptoma Inteiro) e qRT- PCR (PCR quantitativa em tempo real). As informações adquiridas po- dem ser utilizadas para obter informações sobre o perfil da comunidade sobre a identidade e atividade de bactérias presentes, tais como análise filogenética ou rastreamento baseado em microarranjos de ácido nuclei- cos que codificam componentes de óperons de rRNA ou outros loci taxonomicamente informativos.

Exemplos de loci taxonomicamente informativos incluem gene 16S rRNA, gene 23S rRNA, gene, 5S rRNA, gene 5.8S rRNA, gene 12S rRNA, gene 18S rRNA, gene 28S rRNA, gene gyrB, gene rpoB, gene fusA, gene recA, gene coxl, gene nifD.

Processos de exemplo de determinação do perfil taxonômico para determinar um táxon presente em uma população são descritos em US20140155283. A identificação de bactérias pode compreender carac- terizar a atividade de um ou mais genes ou uma ou mais vias de sinali- zação, tal como genes associados com a via de fixação do nitrogênio.

Interações sinérgicas (quando dois componentes, em virtude de sua combinação, aumentam um efeito desejado mais do que em quantidade aditiva) entre diferentes espécies bacterianas podem também estar presentes nas populações bacterianas. Variação genética – Localizações e fontes de alteração genômica

[0143] A variação genética pode ser um gene selecionado a partir do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK , nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, bcsII, bcsIII, yjbE, fhaB, pehA, glgA, otsB, treZ e cysZ. A variação genética pode ser uma variação em um gene que codifica uma proteína com funcionalidade selecionada a partir do grupo que consiste em: glutamina sintetase, glutaminase, glutamina sintetase adeniltransferase, ativador transcricional, ativador anti- transcricional, piruvato flavodoxina oxidoredutase, flavodoxina, NAD+- dinitrogênio-redutase aDP-D-ribosiltransferase, produção de exopolissacarídeo, hemaglutinina filamentosa, glicogênio sintase, síntese de trealose ou um transportador de sulfato. A variação genética pode ser uma mutação que resulta em um ou mais dentre: maior expressão ou atividade de NifA glutaminase, bcsII, bcsIII, yjbE, fhaB, pehA, otsB, treZ ou CysZ; menor expressão ou atividade de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB, ou glgA; atividade diminuída de remoção de adenila de GlnE; ou atividade diminuída de remoção de uridila de GlnD. Introduzir uma variação genética pode compreender a inserção e/ou deleção de um ou mais nucleotídeos em um sítio-alvo, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 ou mais nucleotídeos. A variação genética introduzida em uma ou mais bactérias dos métodos aqui revelados pode ser uma mutação desabilitante (p. ex., deleção de um promotor, inserção ou deleção para produzir um códon de parada prematuro, deleção de um gene inteiro), ou pode ser a elimi- nação ou abolição da atividade de um domínio proteico (p. ex., mutação pontual afetando um sítio ativo ou deleção de uma parte de um gene que codifica a parte relevante do produto proteico), ou pode alterar ou abolir uma sequência reguladora de um gene alvo. Uma ou mais sequências reguladoras podem também ser inseridas, incluindo sequências reguladoras heterólogas e sequências reguladoras encon- tradas em um genoma de uma espécie ou gênero bacteriano correspon- dente às bactérias nas quais a variação genética é introduzida.

Além do mais, sequências reguladoras podem ser selecionadas com base no nível de expressão de um gene em uma cultura bacteriana ou dentro de um tecido vegetal.

A variação genética pode ser uma variação genética predeterminada que seja especificamente introduzida em um sítio-alvo.

A variação genética pode ser uma mutação aleatória dentro do sítio- alvo.

A variação genética pode ser uma inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos.

Em alguns casos, uma pluralidade de variações genéticas diferentes (p. ex., 2, 3, 4, 5, 10 ou mais) é introduzida em uma ou mais das bactérias isoladas antes de expor as bactérias a plantas para avaliar a melhoria do atributo.

A pluralidade de variações genéticas pode ser qualquer um dos tipos acima, os mesmos ou tipos diferentes e em qualquer combinação.

Em alguns casos, uma pluralidade de diferen- tes variações genéticas é introduzida serialmente, introduzido uma primeira variação genética depois de uma primeira etapa de isolamento, uma segunda variação genética depois de uma segunda etapa de isolamento e assim por diante de modo a acumular uma pluralidade de variações genéticas em bactérias transmitindo atributos progressiva- mente melhorados nas plantas associadas.

Alvo gênico Genótipo Fenótipo bcsii, bcsiii yjbE Codificam uma enzima para produção de Regulação positiva leva a maior adesão exopolissacarídeos nos micróbios de micróbios às raízes de milho, provavelmente devido à maior aglutinação bacteriana e formação de filme na superfície radicular. fhaB Codifica uma hemaglutinina filamentosa Regulação positiva leva a maior aglutinação e adesão do micróbio às raízes de milho. pehA Codifica um precursor da endo-poligalaturonase Regulação positiva leva a maior colonização do micróbio em raízes de milho, possivelmente devido à decomposição de componentes da parede

Alvo gênico Genótipo Fenótipo celular das raízes e maior entrada de endófitos. gigA Codifica glicogênio sintase Deleção de gigA leva a maior excreção de amônia, provavelmente devido ao fluxo aumentado de carbono para fora da síntese de glicogênio e para glicólise e fosforilação oxidativa, levando à mais ATP disponível para fixação do nitrogênio. otsB e treZ Genes da síntese de trealose Regulação positiva de genes da síntese de trealose otsB e treZ leva a maior expressão de nitrogenase na presença de nitrogênio extracelular por um mecanismo desconhecido. cysZ Codifica um transportador de sulfato Regulação positiva do gene cysZ leva a maior atividade de nitrogenase, provavelmente devido a mais absorção de enxofre, aumentando a síntese de clusters ferro-enxofre na proteína nitrogenase. nifA e nifL Alteração na expressão de NifL ou eliminação do Cepas são capazes de fixar nitrogênio na domínio de detecção de amônia de NifA desregula presença de níveis mais altos de amônia repressões de fixação do nitrogênio por amônia. exógena do que em cepas do tipo Em alguns cepas, o gene nifL foi substituído por selvagem. DNA regulador bem caracterizado não codificante para melhorar a expressão de NifA. ginB Alteração na expressão de GinB contribui para Cepas são capazes de fixar nitrogênio na desregular a expressão gênica de nitrogenase de presença de níveis mais altos de amônia detecção da amônia ambiental exógena do que em cepas do tipo selvagem. amtB Alteração na expressão de AmtB leva a menor Cepas são capazes de excretar amônia absorção da amônia ambiental pela cepa. em níveis mais elevados do que cepas do tipo selvagem. glnE O gene glnE foi deletado em algumas e em outras Cepas exibiram menor síntese de cepas somente a região N-terminal do gene glnE. glutamina e maior excreção de amônia sob condições fixadoras de nitrogênio. glnA Mutações pontuais em glnA. Cepas exibiram menor síntese de glutamina e maior excreção de amônia sob condições fixadoras de nitrogênio. draT O gene draT foi deletado. Cepas exibiram maior atividade de nitrogenase na presença de amônia e oxigênio ambientais. ginD O gene ginD foi deletado. Alteração na expressão Cepas são capazes de fixar nitrogênio na de GinD contribui para desregular a expressão presença de níveis mais altos de amônia gênica de nitrogenase de detecção da amônia exógena do que cepas do tipo selvagem. ambiental.

Variação genética – Métodos de introdução da alteração genômica

[0144] Em geral, o termo “variação genética” refere-se a qualquer mudança introduzida em uma sequência polinucleotídica em relação a um polinucleotídeo de referência, tal como um genoma de referência ou parte deste, ou um gene de referência ou parte deste.

Uma variação genética pode ser referida como uma “mutação”, e uma sequência ou organismo que compreende uma variação genética pode ser referido como “variante genética” ou “mutante”. As variações genéticas podem ter vários efeitos, tais como o aumento ou diminuição de alguma ativi- dade biológica, incluindo expressão gênica, metabolismo e sinalização celular.

As variações genéticas podem ser especificamente introduzidas em um sítio-alvo, ou introduzidas aleatoriamente.

Há disponível uma variedade de ferramentas moleculares para introdução de variação genética.

Por exemplo, a variação genética pode ser introduzida via mutagênese por reação em cadeia da polimerase, mutagênese oligonu- cleotídeo-dirigida, mutagênese por saturação, mutagênese por emba- ralhamento de fragmentos, recombinação homóloga, reengenharia, recombinação mediada por lambda red, sistemas CRISPR/Cas9, mutagênese química e combinações destas.

Os métodos químicos de introdução de variação genética incluem a exposição do DNA a um mutágeno químico, p. ex., metanossulfonato de etila (EMS), metanos- sulfonato de metila (MMS), N-nitrosoureia (EN U), N-metil-N-nitro-N′- nitrosoguanidina, 4-N-óxido de nitroquinolina, dietilsulfato, benzopireno, ciclofosfamida, bleomicina, trietilmelamina, monômero de acrilamida, mostarda nitrogenada, vincristina, diepoxialcanos (por exemplo, diepoxibutano), ICR-170, formaldeído, cloridato de procarbazina, óxido de etileno, dimetilnitrosamina, 7,12-dimetilbenz(a)antraceno, clorambu- cil, hexametilfosforamida, bissulfano e semelhantes.

Os agentes indu- tores de mutação por radiação incluem radiação ultravioleta, irradiação γ, raios X e bombardeio rápido de nêutrons.

A variação genética pode também ser introduzida em um ácido nucleico utilizando, p. ex., trimetilpsoraleno com luz ultravioleta.

A inserção aleatória ou direcionada de um elemento móvel do DNA, p. ex., um elemento trans- ponível, é outro método adequado para a geração de variação genética. As variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucleico durante a amplificação em um sistema in vitro sem células, p. ex., empregando uma técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) como PCR error-prone (introdução de erros). As variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucleico in vitro por técnicas de embaralhamento (shuffling) do DNA (p. ex., embaralhamento de éxons, troca de domínio e os semelhantes). As variações genéticas podem também ser introduzidas em um ácido nucleico como resultado de uma deficiência em uma enzima de reparo do DNA em uma célula, p. ex., prevê-se que a presença em uma célula de um gene mutante que codifica uma enzima mutante de reparo do DNA gere mutações com alta frequência (ou seja, aproximadamente 1 mutação/100 genes-1 muta- ção/10.000 genes) no genoma da célula. Exemplos de genes que codifi- cam enzimas de reparo do DNA incluem, entre outros, Mut H, Mut S, Mut L e Mut U, e homólogos destes em outras espécies (p. ex., MSH 1 6, PMS 1 2, MLH 1, GTBP, ERCC-1 e semelhantes). Descrições de exemplo de vários métodos para a introdução de variações genéticas são fornecidos em, p. ex., Stemple (2004) Nature 5:1-7; Chiang at al. (1993) PCR Methods Appl 2(3): 210-217; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; e Patentes U.S. Nos 6 033 861 e 6 773

900.

[0145] As variações genéticas introduzidas em micróbios podem ser classificadas como transgênicas, cisgênicas, intragenômicas, intragené- ricas, intergenéricas, sintéticas, evoluídas, rearranjadas ou SNPs.

[0146] A variação genética pode ser introduzida em inúmeras vias metabólicas dentro dos micróbios para induzir melhorias nos atributos descritos acima. As vias representativas incluem vias de absorção de enxofre, biossíntese de glicogênio, a via de regulação da glutamina, a via de absorção de molibdênio, a via de fixação do nitrogênio, assimila- ção de amônia, excreção ou secreção de amônia, absorção de nNitrogê- nio, biossíntese de glutamina, annamox, solubilização de fosfato, trans- porte de ácidos orgânicos, produção de ácidos orgânicos, produção de aglutininas, genes de sequestradores de radicais reativos de oxigênio, biossíntese de ácido indol acético, biossíntese de trealose, vias ou enzimas de degradação da parede celular vegetal, genes para adesão às raízes, secreção de exopolissacarídeos, via da glutamato sintase, vias de absorção de ferro, via de sideróforos, via da quitinase, ACC desaminase, biossíntese de glutationa, genes de sinalização de fósforo, a via de biossíntese de hiona, genes de sinalização de fósforo, vias de quorum quenching (bloqueio de comunicação), vias de citocromos, a via da hemoglobina, a via de hemoglobina do tipo bacteriana, pequeno RNA rsmZ, biossíntese de rizobitoxina, proteína de adesão lapA, a via de quorum sensing AHL (detecção de sinais de comunicação), biossíntese de fenazina, biossíntese de lipopeptídeo cíclicos e produção de antibióti- cos.

[0147] Os sistemas CRISPR/Cas9 (do inglês Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (Repetições palindrômicas curtas agrupas regularmente interespaçadas))/CRISPR-associadas (Cas) podem ser utilizados para introduzir mutações desejadas. CRISPR/Cas9 proporciona a bactérias e arqueas imunidade adaptativa contra vírus e plasmídeos utilizando CRISPR RNAs (crRNAs) para guiar o silenciamento dos ácidos nucleicos invasores. A proteína Cas9 (ou equivalente funcional e/ou variante desta, ou seja, proteína Tipo Cas9) contém naturalmente atividade de DNA endonuclease que depende da associação da proteína com duas moléculas de DNA naturais ou sintéticas denominadas crRNA e tracrRNA (também chamados RNAs guias). Em alguns casos, as duas moléculas são ligadas covalente- mente e formam uma única molécula (também chamada RNA guia único

(“sgRNA”). Assim, a proteína Cas9 ou Tipo Cas9 associa-se com um RNA direcionado para o DNA (termo este que abrange a configuração de duas moléculas de RNA guia e a configuração de molécula única de RNA guia), que ativa a proteína Cas9 ou Tipo Cas9 e guia a proteína para uma sequência de ácido nucleico alvo. Caso retenha sua função enzimática natural, a proteína Cas9 ou Tipo Cas9 clivará o DNA alvo para criar uma quebra da fita dupla, que pode levar à alteração do genoma (ou seja, edição: deleção, inserção (quando um polinucleotídeo doador está presente), substituição, etc.), alterando, com isso, a expres- são gênica. Algumas variantes de Cas9 (variantes essas que são abran- gidas pelo termo Tipo Cas9) foram alteradas de tal modo que apresen- tam atividade diminuída de clivagem do DNA (em alguns casos, clivam uma fita simples em vez de ambas as fitas do DNA alvo, enquanto, em outros casos, não apresentam ou têm atividade de clivagem do DNA intensamente reduzida). Descrições exemplares adicionais de sistemas CRISPR para a introdução de variação genética podem ser encontradas em, p. ex., US8795965.

[0148] Como uma técnica de amplificação cíclica, a mutagênese por reação em cadeia da polimerase (PCR) usa iniciadores mutagênicos para introduzir mutações desejadas. PCR é realizada por ciclos de desnaturação, anelamento e extensão. Depois da amplificação por PCR, a seleção de DNA com mutação e a remoção do DNA de um plasmídeo parental podem ser realizadas por: 1) substituição de dCTP por dCTP hidroximetilada durante a PCR, seguida por digestão com enzimas de restrição para remover somente o DNA parental não hidroximetilado; 2) mutagênese simultânea de um gene de resistência a antibiótico e o gene estudado mudando o plasmídeo para uma resis- tência a antibiótico diferente, a nova resistência a antibiótico facilitando a seleção da mutação desejada posteriormente; 3) depois de introdu- zida uma mutação desejada, digestão do DNA molde metilado parental pela enzima de restrição Dpnl que cliva somente DNA metilado, pelo qual as cadeias não metiladas mutagenizadas são recuperadas; ou 4) circularização dos produtos de PCR com mutação em uma reação de ligadura adicional para aumentar a eficiência de transformação de DNA com mutação. Descrição adicional de métodos exemplares podem ser encontrados em, p. ex., US7132265, US6713285, US6673610, US6391548, US5789166, US5780270, US5354670, US5071743 e US20100267147.

[0149] Mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, também chamada mutagênese sítio-dirigida, tipicamente utiliza um iniciador de DNA sintético. Esse iniciador sintético contém a mutação desejada e é com- plementar ao DNA molde em volta do sítio de mutação de modo que pode hibridizar-se com o DNA no gene de interesse. A mutação pode a mudança de uma única base (mutação pontual), mudanças de múltiplas bases, deleção, ou inserção, ou uma combinação dessas. O iniciador de fita simples é então ampliado utilizando uma DNA polimerase, que copia o resto do gene. O gene assim copiado contém o sítio com mutação e pode ser introduzido, a seguir, em uma célula hospedeira como um vetor e clonado. Finalmente, os mutantes podem ser sele- cionados por sequenciamento do DNA para verificar se contêm a mutação desejada.

[0150] As variações genéticas podem ser introduzidas por PCR error-prone. Nessa técnica, o gene de interesse é amplificado utilizando uma DNA polimerase sob condições com deficiência na fidelidade de replicação da sequência. O resultado é que os produtos da amplificação contêm pelo menos um erro na sequência. Quando um gene é amplifi- cado e o(s) produto(s) resultante(s) da reação contém/contêm uma ou mais alterações na sequência quando comparados à molécula molde, os produtos resultantes são mutagenizados quando comparados ao molde. Outro meio para introduzir mutações aleatórias é expor as células a um mutágeno químico, como nitrosoguanidina ou metanossul- fonato de etila (Nestmann, Mutat Res 1975 June; 28(3):323-30), e o vetor contendo o gene é então isolado do hospedeiro.

[0151] Mutagênese por saturação é outra forma de mutagênese aleatória, na qual se tenta gerar todas ou praticamente todas as muta- ções possíveis em um sítio específico, ou uma região estreita de um gene. Em sentido geral, a mutagênese por saturação engloba a mutagê- nese de um conjunto completo de cassetes mutagênicos (em que cada cassete contém, por exemplo, 1-500 bases de comprimento) em uma sequência polinucleotídica definida para sofrer mutagênese (em que a sequência a sofrer mutagênese contém, por exemplo, de 15 a 100.000 bases de comprimento). Portanto, um grupo de mutações (p. ex., varian- do de 1 a 100 mutações) é introduzido em cada cassete a sofrer muta- gênese. Um agrupamento de mutações a ser introduzido em um cassete pode ser diferente ou igual a um segundo agrupamento de mutações a ser introduzido em um segundo cassete durante a aplicação de um ciclo de mutagênese por saturação. Tais agrupamentos são exemplificados por deleções, adições, agrupamentos de códons em particular e agrupamentos de cassetes de nucleotídeos em particular.

[0152] Mutagênese por embaralhamento de fragmentos, também chamada DNA shuffling, é uma maneira de propagar rapidamente mutações benéficas. Em um exemplo de um processo de embaralha- mento, usa-se DNAse para fragmentar um conjunto de genes originais em pedaços de, p. ex., cerca de 50-100 bp de comprimento. A isso, segue-se uma reação em cadeia da polimerase (PCR) sem iniciadores -- fragmentos de DNA com sequências homólogas suficientes sobrepondo-se anelarão uma com a outra e são então estendidas por DNA polimerase. Podem ocorrer diversos ciclos dessa extensão por PCR, depois que algumas das moléculas de DNA atingem o tamanho dos genes originais. Esses genes podem então ser amplificados com outra PCR, essa vez com a adição de iniciadores que são desenhados para complementar as extremidades das fitas. Os iniciadores podem ter mais sequências adicionais às suas extremidades 5', tais como sequên- cias para sítios de enzimas de reconhecimento para ligação em um vetor de clonagem. Outros exemplos de técnicas de embaralhamento são fornecidos em US20050266541.

[0153] A mutagênese por recombinação homóloga envolve a recombinação entre um fragmento de DNA exógeno e a sequência polinucleotídica visada. Depois de ocorrer uma quebra da fita dupla, seções de DNA em volta das extremidades 5' da quebra são cortadas para fora em um processo denominado ressecção. Na etapa de invasão da fita que se segue, uma extremidade saliente 3' da molécula do DNA quebrado então “invade” uma molécula de DNA semelhante ou idêntica que não está quebrada. O método pode ser utilizado para deletar um gene, remover éxons, adicionar um gene e introduzir mutações pon- tuais. A mutagênese por recombinação homóloga pode ser permanente ou condicionada. Tipicamente, um molde de recombinação é também fornecido. Um molde de recombinação pode ser um componente de outro vetor, contido em um vetor separado ou fornecido como um polinucleotídeo separado. Em algumas modalidades, um molde de recombinação é criado para servir como molde na recombinação homóloga, tal como dentro ou perto de uma sequência alvo nicked (cortada) ou clivada por uma nuclease sítio-específica. Um polinu- cleotídeo molde pode ter qualquer comprimento adequado, como com aproximadamente ou mais de 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo molde é complementar a uma parte de um polinu- cleotídeo que compreende a sequência alvo. Quando alinhadas de modo ótimo, pode haver sobreposição de um mais nucleotídeos de uma sequência alvo por um polinucleotídeo molde (p. ex., aproximadamente ou mais de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos). Em algumas modalidades, quando uma sequência molde e um polinucleotídeo compreendendo uma sequência alvo são alinhados de modo ótimo, o nucleotídeo mais próximo do polinucleotídeo molde está dentro de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000 ou mais nucleotídeos da sequência alvo. Exemplos não limitantes de nucleases sítio-dirigidas úteis em métodos de recombinação homóloga incluem nucleases dedo de zinco, nucleases CRISPR, nucleases TALE e mega- nuclease. Para uma descrição mais detalhada do uso de tais nucleases, ver, p. ex., US8795965 e US20140301990.

[0154] Mutágenos que criam mutações primariamente pontuais e deleções curtas, inserções, transversões e/ou transições, incluindo mutágenos químicos ou radiação, podem ser utilizados para criar varia- ções genéticas. Os mutágenos incluem, entre outros, metanossulfonato de etila, metilmetano sulfonato, N-etil-N-nitrosureia, trietilmelamina, N- metil-N-nitrosoureia, procarbazina, clorambucil, ciclofosfamida, sulfato de dietila, monômero de acrilamida, melfalano, mostarda nitrogenada, vincristina, dimetilnitrosamina, N-metil-N'-nitro-Nitrosoguanidina, nitrosoguanidina, 2-aminopurina, 7,12-dimetil-benz(a)antraceno, óxido de etileno, hexametilfosforamida, bissulfano, diepoxialcanos (diepoxioctano, diepoxibutano e outros), dicloridrato de 2-metóxi-6- cloro-9[3-(etil-2-cloro-etil)aminopropilamino]acridina e formaldeído.

[0155] A introdução de uma variação genética pode ser um proces- so incompleto, tal que algumas bactérias em uma população de bac- térias tratadas sejam portadoras de uma mutação desejada enquanto outras não o são. Em alguns casos, é conveniente aplicar uma pressão de seleção de modo a enriquecer bactérias que carregam uma variação genética desejada. Tradicionalmente, a seleção de variantes genéticas bem-sucedidas tem envolvido a seleção por ou contra alguma funcionalidade transmitida ou abolida pela variação genética, tal como no caso de inserir um gene de resistência a antibiótico ou abolir uma atividade metabólica capaz de converter um composto não letal em um metabólito letal. É possível também aplicar uma pressão de seleção tendo por base a própria sequência polinucleotídica, tal que somente uma variação genética desejada precise ser introduzida (p. ex., sem requerer também um marcador selecionável). Nesse caso, a pressão de seleção pode compreender clivar genomas desprovidos da variação genética introduzida em um sítio-alvo, de tal modo que a seleção é efetivamente dirigida contra a sequência de referência na qual se busca introduzir a variação genética. Tipicamente, a clivagem ocorre em até 100 nucleotídeos do sítio-alvo (p. ex., em até 75, 50, 25, 10 ou menos nucleotídeos do sítio-alvo, incluindo a clivagem em ou dentro do sítio- alvo). A clivagem pode ser direcionada por uma nuclease sítio-espe- cífica selecionada a partir do grupo que consiste em nuclease dedo de zinco, nuclease CRISPR, nuclease TALE (TALEN) ou meganuclease. Tal processo é semelhante a processos que intensificam a recombi- nação homóloga em um sítio-alvo, exceto que nenhum molde para recombinação homóloga é fornecido. Como resultado, bactérias despro- vidas da variação genética desejada são mais propensas a sofrer cliva- gem que, deixada não reparada, resulta em morte celular. As bactérias que sobreviverem a seleção podem então ser isoladas para uso na exposição a plantas para avaliar a atribuição de um atributo melhorado.

[0156] Uma nuclease CRISPR pode ser utilizada como a nuclease sítio-específica para direcionar a clivagem para um sítio-alvo. É possível obter uma seleção melhorada de micróbios com mutação utilizando Cas9 para eliminar as células sem mutação. As plantas são então inoculadas com os micróbios com mutação para reconfirmar a simbiose e criar a pressão evolutiva e selecionar simbiontes eficientes. Os micróbios podem então voltar a ser isolados de tecidos vegetais. Os sistemas CRISPR nuclease usados para seleção contra não variantes podem empregar elementos semelhantes àqueles descritos acima em relação à introdução de variação genética, exceto que nenhum molde para recombinação homóloga é fornecido. A clivagem direcionada para o sítio-alvo reforça, assim, a morte de células afetadas.

[0157] Há disponíveis outras opções para induzir especificamente a clivagem em um sítio-alvo, tais como nucleases zinc finger, sistemas com nuclease TALE nuclease (TALEN) e meganuclease. As nucleases zinc finger (ZFNs) são DNA endonucleases artificiais geradas por fusão de um domínio de ligação zinc finger ao DNA com um domínio de clivagem de DNA. As ZFNs podem ser projetadas para atingir sequên- cias desejadas do DNA e isso permite que nucleases zinc finger clivem sequências alvo únicas. Quando introduzidas em uma célula, as ZFNs podem ser utilizadas para editar um DNA alvo na célula (p. ex., no genoma da célula) ao induzirem quebras de fitas duplas. Nucleases com efetores do tipo ativador transcricional (do inglês, transcription activactor-like effector nucleases, TALENs) são DNA endonucleases artificiais geradas pela fusão de um domínio de ligação de efetor TAL (do tipo ativador transcricional) ao DNA com um domínio de clivagem de DNA. As TALENS podem ser rapidamente projetadas para se ligarem a praticamente qualquer sequência de DNA desejada e, quanto introduzidas em uma célula, as TALENs podem ser utilizadas para editar um DNA alvo na célula (p. ex., no genoma da célula) ao induzirem quebras de fitas duplas. As meganucleases (endonuclease homing) são endodesoxirribonucleases caracterizadas por um sítio de reconheci- mento grande (sequências de DNA dupla fita com 12 a 40 pares de base). As meganucleases podem ser utilizadas para substituir, eliminar ou modificar sequências de modo altamente direcionado. Com a modifi- cação de sua sequência de reconhecimento através de engenharia proteica, a sequência visada pode ser alterada. As meganucleases podem ser utilizadas para modificar todos os tipos de genomas, sejam bacterianos, vegetais ou animais, e são comumente agrupadas em quatro famílias: a família LAGLIDADG (SEQ ID NO: 1), a família GIY- YIG, a família His-Cyst box e a família HNH. As endonucleases homing exemplares incluem I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I- PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII. Variação genética – Métodos de identificação

[0158] Os micróbios da presente invenção podem ser identificados por uma ou mais modificações ou alterações genéticas, que foram introduzidas no dito micróbio. Um método pelo qual a dita modificação ou alteração genética pode ser identificada é através de referência a uma SEQ ID NO que contém uma parte da sequência genômica do micróbio que é suficiente para identificar a modificação ou alteração genética.

[0159] Além disso, no caso de micróbios que não tenham tido uma modificação ou alteração genética (p. ex., do tipo selvagem, WT) introduzida em seus genomas, a invenção pode utilizar a sequência 16S de ácido nucleico para identificar os ditos micróbios. Uma sequência 16S de ácido nucleico é um exemplo de “marcador molecular” ou “marcador genético”, que se refere a um indicador que é usado em métodos para visualizar diferenças em características de sequência de ácido nucleico. Exemplos de outros de tais indicadores são marcadores de polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), marcadores de polimorfismo no comprimento de fragmento amplificado (AFLP), polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), mutações por inserção, marcadores de microssatélite (SSRs), regiões amplificadas de sequência caracterizada (SCARs), marcadores de sequência polimór- fica amplificada clivada (CAPS) marcadores de isozimas ou combina- ções dos marcadores aqui descritos que definem uma localização genética específica e cromossômica. Os marcadores incluem ainda sequências polinucleotídicas que codificam 16S ou 18S rRNA, e sequências de espaçador interno transcrito (ITS), as quais são sequên- cias encontradas entre genes rRNA de subunidade pequena e subuni- dade grande que comprovaram ser especialmente úteis em elucidar relações ou distinções quando comparados um contra o outro. Além disso, a invenção utiliza sequências exclusivas encontradas em genes de interesse (p. ex., nif H,D,K,L,A, glnE, amtB etc.) para identificar os micróbios aqui revelados.

[0160] A estrutura primária da subunidade importante 16S rRNA compreende uma combinação especial de regiões conservadas, variá- veis e hipervariáveis que evoluem em taxas at diferentes e possibilitam a resolução de linhagens muito antigas, tais como domínios, e linhagens mais modernas como gêneros. A estrutura secundária da subunidade 16S inclui aproximadamente 50 hélices que resultam no pareamento de bases de aproximadamente 67% dos resíduos. Essas características secundárias altamente conservadas são de grande importância funcio- nal e podem ser utilizadas para assegurar homologia posicional em múltiplos alinhamentos de sequência e na análise filogenética. Ao longo de algumas décadas anteriores, o gene 16S rRNA tornou-se o marcador taxonômico mais sequenciado e constitui a pedra angular para a classificação sistemática atual de Bacteria e Archaea (Yarza at al. 2014. Nature Rev. Micro. 12:635-45). Variação genética – Métodos de detecção: Iniciadores, sondas e ensaios

[0161] A presente invenção ensina iniciadores, sondas e ensaios que são úteis para detectar os micróbios ora ensinados. Em alguns aspectos, a invenção provê métodos de detecção das cepas parentais WT. Em outros aspectos, a invenção provê métodos de detecção dos micróbios modificados não intergenéricos, derivados das cepas WT. Em aspectos, a presente invenção provê métodos de identificação de alterações genéticas não intergenéricas em um micróbio.

[0162] Em aspectos, os métodos de engenharia genômica da pre- sente invenção levam à criação de sequências de “junção“ não natural de nucleotídeos nos micróbios derivados não intergenéricos. Essas junções de nucleotídeos não naturais podem ser utilizadas como um tipo de diagnóstico que é indicativo da presença de uma alteração genética em particular em um micróbio ora ensinado.

[0163] As presentes técnicas são capazes de detectar essas jun- ções de nucleotídeos não naturais através da utilização de métodos especializados de PCR quantitativa, incluindo iniciadores e sondas exclusivamente desenhados. Em alguns aspectos, as sondas da inven- ção ligam-se às sequências com junções de nucleotídeos não naturais. Em alguns aspectos, é utilizada PCR tradicional. Em outros aspectos, é utilizada PCR em tempo real. Em alguns aspectos, é utilizada PCR quantitativa (qPCR).

[0164] Assim, a invenção pode abranger a utilização de dois méto- dos comuns para a detecção de produtos de PCR em tempo real: (1) corantes fluorescentes não específicos que se intercalam com qualquer DNA de fita dupla e (2) sondas de DNA sequência-específicas que consistem em oligonucleotídeos que são marcados com um repórter fluorescente que permite a detecção apenas depois da hibridização da sonda com sua sequência complementar. Em alguns aspectos, apenas a junção de nucleotídeos não naturais será amplifica através dos iniciadores ensinados e, consequentemente, pode ser detectada por intermédio de um corante não específico ou por intermédio da utilização de uma sonda de hibridização específica. Em outros aspectos, os iniciadores da invenção são escolhidos de tal modo que os iniciadores flanqueiem qualquer lado de um sequência com junção, tal que se uma reação de amplificação ocorrer, então a dita sequência com junção está presente.

[0165] Aspectos da invenção envolvem moléculas da sequência com junção de nucleotídeos não naturais per se, juntamente com outras moléculas de nucleotídeos que são capazes de se ligar às ditas sequências com junções de nucleotídeos não naturais sob condições de hibridização leves a rigorosas. Em alguns aspectos, as moléculas de nucleotídeos que são capazes de se ligar às ditas sequências com junções de nucleotídeos não naturais sob condições de hibridização leves a rigorosas são denominadas “sondas nucleotídicas”.

[0166] Em aspectos, DNA genômico pode ser extraído de amostras e usado para quantificar a presença de micróbios da invenção utilizando qPCR. Os iniciadores utilizados na reação qPCR podem ser iniciadores desenhados por Iniciador Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) para amplificar regiões exclusivas do genoma do tipo selvagem ou regiões exclusivas das cepas mutantes não intergenéricas modificadas. A reação qPCR pode ser realizada com o kit SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal (Thermo Fisher, P/N 11762100), usando apenas iniciadores dianteiro e reverso de amplificação; alternativamente, o kit Kapa Sonda Force (Kapa Biosystems, P/N KK4301) pode ser utilizado com iniciadores de amplificação e uma sonda TaqMan contendo uma marcação por corante FAM na extremidade 5’, um quencher (supressor de sinal) interno ZEN e um ligante do sulco estreito (minor groove binder) e quencher fluores- cente na extremidade 3’ (Integrated DNA Technologies).

[0167] A eficiência da reação qPCR pode ser medida por uma curva padrão gerada a partir de uma quantidade conhecida de gDNA do genoma alvo. Os dados podem ser normalizados para cópias do geno- ma por g de massa fresca usando a massa de tecido e o volume de extração.

[0168] A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) é um método para quantificar, em tempo real, a amplificação de uma ou mais sequências de ácido nucleico. A quantificação em tempo real do ensaio PCR permite determinar a quantidade de ácidos nucleicos gerados pelas etapas de amplificação por PCR ao comparar os ácidos nucleicos de interesse amplificados e uma sequência de ácido nucleico controle adequada, a qual pode atuar como um padrão de calibração.

[0169] Sondas TaqMan são frequentemente utilizadas em ensaios de qPCR que requerem maior especificidade para quantificar uma sequência de ácido nucleico alvo. As sondas TaqMan compreendem uma sonda de oligonucleotídeo com um fluoróforo anexado à extremi- dade 5’ e um quencher anexado à extremidade 3’ da sonda. Quando as sondas TaqMan permanecem como estão, com as extremidades 5’ e 3’ da sonda em contato íntimo uma com a outra, o quencher impede a transmissão do sinal fluorescente pelo fluoróforo. As sondas TaqMan são projetadas para anelar dentro de uma região do ácido nucleico amplificada por um conjunto específico de iniciadores. À medida que a Taq polimerase estende o iniciador e sintetiza a fita nascente, a ativi- dade de 5’ a 3’ exonclease da Taq polimerase degrada a sonda que se anelou ao molde. Essa degradação da sonda libera o fluoróforo, rom- pendo, assim, a grande proximidade ao quencher e permitindo a fluores- cência do fluoróforo. A fluorescência detectada no ensaio qPCR é diretamente proporcional ao fluoróforo liberado e a quantidade do molde de DNA presente na reação.

[0170] As características de qPCR permitem ao usuário eliminar a etapa trabalhosa pós-amplificação de preparação da eletroforese em gel, a qual é em geral necessária para observação dos produtos amplificados de ensaios tradicionais de PCR. Os benefícios de qPCR em relação à PCR convencional são consideráveis, e incluem maior velocidade, facilidade de uso, reprodutibilidade e capacidade quantita- tiva. Melhoria de atributos

[0171] Os métodos da presente invenção podem ser empregados para introduzir ou melhorar um ou mais de uma variedade de atributos desejáveis. Os atributos a serem melhorados podem ser atributos da bactéria, ou a bactéria pode ser modificada para melhorar um atributo em uma planta associada. Exemplos de atributos que podem ser introduzidos ou melhorados incluem: biomassa radicular, comprimento de raízes, altura, comprimento de ramos, número de folhas, eficiência no uso de água, biomassa global, rendimento, tamanho de frutos, tamanho de grãos, taxa de fotossíntese, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância à salinidade, resistência ao estresse por nematódeos, resistência a um patógeno fúngico, resistência a um patógeno bactéria- no, resistência a um patógeno viral, nível de um metabólito e expressão do proteoma. Os atributos desejáveis, incluindo altura, biomassa global, biomassa radicular e/ou de ramos aérea, germinação de sementes, sobrevivência de plântulas, eficiência fotossintética, taxa de transpira- ção, número ou massa de sementes/frutos, rendimento de graus ou frutos da planta, teor foliar de clorofila, taxa fotossintética, comprimento de raízes, ou qualquer combinação dos mesmos, podem ser utilizado para medir o crescimento, e comparados com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (p. ex., plantas sem os atributos melho- rados) cultivadas sob condições idênticas.

[0172] Exemplos adicionais de atributos que podem ser melhorados incluem a capacidade de uma bactéria para aderir e colonizar uma planta. Por exemplo, uma bactéria pode ser modificada para aderir melhor a uma raiz de uma planta, ou para produzir ou secretar um composto benéfico para a colonização.

[0173] Um atributo preferido a ser introduzido ou melhorado é a fixação do nitrogênio, como aqui descrita. Em alguns casos, uma planta resultante dos métodos aqui descritos exibe uma diferença no atributo que é pelo menos aproximadamente 5% maior, por exemplo, pelo menos aproximadamente 5%, pelo menos aproximadamente 8%, pelo menos aproximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 15%, pelo menos aproximadamente 20%, pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximada- mente 40%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproxi- madamente 60%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo me- nos aproximadamente 90%, ou pelo menos 100%, pelo menos aproxi- madamente 200%, pelo menos aproximadamente 300%, pelo menos aproximadamente 400% ou mais do que uma planta agrícola de referência cultivada sob as mesmas condições do solo. Em exemplos adicionais, uma planta resultante dos métodos aqui descritos exibe uma diferença no atributo que é pelo menos aproximadamente 5% maior, por exemplo, pelo menos aproximadamente 5%, pelo menos aproximada- mente 8%, pelo menos aproximadamente 10%, pelo menos aproxima- damente 15%, pelo menos aproximadamente 20%, pelo menos aproxi- madamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo me- nos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 90%, ou pelo menos 100%, pelo menos aproximadamente 200%, pelo menos aproximadamente 300%, pelo menos aproximadamente 400% ou mais do que uma planta agrícola de referência cultivada sob condições semelhantes no solo.

[0174] O atributo a ser melhorado pode ser avaliado sob condições que incluem a aplicação de um ou mais fatores estressantes bióticos ou abióticos. Os exemplos de fatores estressantes incluem estresses abióticos (como estresse pelo calor, estresse pela salinidade, estresse pela seca, estresse pelo frio e estresse por baixo nutriente) e estresses bióticos (como estresse por nematódeos, estresse por insetos herbívoros, estrese por patógeno fúngico, estresse por patógeno bacte- riano e estresse por patógeno viral).

[0175] O atributo melhorado por métodos e composições da pre- sente invenção pode ser fixação do nitrogênio, incluindo em uma planta não anteriormente capaz de fixação do nitrogênio. Em alguns casos, bactérias isoladas de acordo com um método aqui descrito produzem 1% ou mais (p. ex., 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20% ou mais) do nitrogênio de uma planta, o que pode representar um aumento na capacidade de fixação do nitrogênio de pelo menos 2 vezes (p. ex., 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 1000 vezes ou mais) quando comparadas a bactérias isoladas da primeira planta antes de introduzida qualquer variação genética. Em alguns casos, as bactérias produzem 5% ou mais do nitrogênio de uma planta. O nível desejado de fixação do nitrogênio pode ser alcançado depois de repetir as etapas de intro- dução de variação genética, exposição a uma pluralidade de plantas e isolamento de bactérias de plantas com um atributo melhorado uma ou mais vezes (p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25 ou mais vezes). Em alguns casos, níveis reforçados de fixação do nitrogênio são alcançados na presença de fertilizante suplementado com glutamina, amônia ou outra fonte química de nitrogênio. Métodos para avaliar o grau de fixação do nitrogênio são conhecidos, cujos exemplos são aqui descritos.

[0176] Melhoramento genético microbiano é um método para identi- ficar sistematicamente e melhorar o papel de espécies dentro do microbioma de culturas. O método compreende três etapas: 1) seleção de espécies candidatas pelo mapeamento de interações planta-micró- bio e predizer redes de regulação vinculadas a um fenótipo em parti- cular, 2) melhoria pragmática e previsível de fenótipos microbianos através do cruzamento intra-espécie de redes de regulação e clusters de genes, e 3) rastreamento e seleção de novos genótipos microbianos que produzem fenótipos desejados para culturas. A fim de avaliar sistematicamente a melhoria de cepas, é criado um modelo que vincula a dinâmica de colonização da comunidade microbiana à atividade genética por espécies principais. O modelo é usado para predizer alvos genéticos para o melhoramento e melhora a frequência de melhorias selecionadas em atributos codificados no microbioma de relevância agronômica. Medição do nitrogênio entregue em contexto de campo de relevância agrícola

[0177] No campo, a quantidade de nitrogênio entregue pode ser determinada pela função de colonização multiplicada pela atividade. Nitrogênio entregue Colonização x atividade Tempo e espaço

[0178] A equação acima requer (1) a colonização média por unidade de tecido vegetal e (2) a atividade quer como a quantidade de nitrogênio fixado ou a quantidade de amônia excretada por cada célula microbiana. Para converter libras de nitrogênio por área, a fisiologia do crescimento de milho é rastreada ao longo do tempo, p. ex., tamanho da planta e sistema radicular associado por todo os estágios de maturidade.

[0179] As libras de nitrogênio entregue a uma cultura por área- estação podem ser calculadas pela seguinte equação: Nitrogênio entregue Tecido vegetal (t) x Colonização (t) x atividade (t) dt

[0180] O Tecido vegetal (t) é a massa fresca de tecido da planta de milho ao longo do tempo crescente (t). Os valores para executar razoavelmente os cálculos são descritos detalhadamente na publicação intitulada Roots, Growth and Nutrient Uptake (Mengel. Departamento de Agronomia, Publicação no AGRY-95-08 (Rev. Maio 95., p. 1-8.).

[0181] A Colonização (t) é a quantidade dos micróbios de interesse encontrados no tecido vegetal por grama de massa fresca de tecido vegetal, em qualquer momento específico, t, durante a estação de culti- vo. No caso de haver um único momento disponível, o único momento é normalizado como a taxa de colonização máxima ao longo da estação, e a taxa de colonização dos demais momentos são ajustadas de acordo.

[0182] A atividade (t) é a rate na qual N é fixado pelos micróbios de interesse por unidade de tempo, em qualquer momento específico, t, durante a estação de cultivo. Nas modalidades aqui reveladas, essa taxa de atividade é aproximada pelo ensaio in vitro de redução de acetileno (ARA) em meio ARA na presença de glutamina 5 mM ou no ensaio de excreção de amônio em meio ARA media na presença de íons amônio 5 mM.

[0183] A quantidade de nitrogênio entregue é então calculada inte- grando numericamente a função acima. Em casos em que os valores das variáveis descritas acima são medidos distintamente em momentos definidos, os valores intermediários entre aqueles momentos são aproximados por interpolação linear. Fixação do nitrogênio

[0184] A presente invenção descreve métodos para aumentar a fixação do nitrogênio em uma planta, os quais compreendem expor a planta a bactéria incluindo uma ou mais variações genéticas introduzi- das em um ou mais genes que regulam a fixação do nitrogênio, em que as bactérias produzem 1% ou mais de nitrogênio na planta (p. ex., 2%, 5%, 10% ou mais), o que pode representar uma capacidade para fixação de nitrogênio de pelo menos 2 vezes em comparação à planta na ausência das bactérias. As bactérias podem produzir o nitrogênio na presença de fertilizante suplementado com glutamina, ureia, nitratos ou amônia. As variações genéticas podem ser qualquer variação genética aqui descrita, incluindo os exemplos fornecidos acima, em qualquer número e qualquer combinação. A variação genética pode ser introdu- zida em um gene selecionado a partir do grupo que consiste em nifA,

nifL, ntrB, ntrC, glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK , nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. A variação genética pode ser uma mutação que resulta em um ou mais dentre: maior expressão ou atividade de nifA ou glutaminase; menor expressão ou atividade de nifL, ntrB, glutamina sintetase, glnB, glnK, draT, amtB; menor atividade removedora de adenila de GlnE; ou menor atividade removedora de uridila de GlnD. A variação genética introduzida em uma ou mais bactérias dos métodos aqui revelados pode ser uma mutação de desativação (knock-out) ou pode abolir uma sequência reguladora de um gene alvo, ou pode compreender a inserção de uma sequência reguladora heteróloga, por exemplo, a inserção de uma sequência reguladora encontrada no genoma de bactérias da mesma espécie ou gênero. A sequência reguladora pode ser escolhida tendo por base o nível de expressão de um gene em uma cultura bacteriana ou no tecido vegetal. A variação genética pode ser produzida por mutagênese química. As plantas cultivadas na etapa (c) podem ser expostas a fatores estressantes bióticos ou abióticos.

[0185] A quantidade de fixação do nitrogênio que ocorre nas plantas aqui descritas pode ser medida de diversas maneiras, por exemplo, por um ensaio de redução de acetileno (AR). Um ensaio de redução de acetileno pode ser realizado in vitro ou in vivo. A evidência de que uma determinada bactéria está fornecendo nitrogênio fixado a uma planta pode incluir: 1) o N total da planta aumenta significativamente quando da inoculação, de preferência com um aumento concomitante na concentração de N na planta; 2) os sintomas de deficiência de nitrogênio são aliviados sob condições com limitação de N quando da inoculação (que deve incluir um aumento em matéria seca); 3) a fixação de N2 é 15 documentada através do uso de uma abordagem para N (que pode ser experimentos de diluição com isótopo, ensaios de redução com 15N2 ou ensaios de abundância natural com N); 4) N fixado é incorporado em uma proteína ou metabólito da planta; e 5) todos esses efeitos não são vistos em plantas não inoculadas ou em plantas inoculadas com um mutante da cepa inoculada.

[0186] A cascata reguladora de fixação do nitrogênio do tipo selva- gem pode ser representada como circuito lógico digital onde as entradas O2 e NH4+ passam através de uma porta NOR, cuja saída entra em uma porta AND além de ATP. Em algumas modalidades, os métodos aqui revelados interrompem a influência de NH4+ nesse circuito, em múltiplos pontos na cascata reguladora, de modo que os micróbios podem produ- zir nitrogênio mesmo em campos fertilizados. No entanto, os métodos aqui revelados também preveem alterar o impacto de ATP ou O2 no circuito, ou substituir o circuito por outras cascatas reguladoras na célu- la, ou alterar circuitos genéticos além de fixação do nitrogênio. Clusters de genes podem voltar a ser modificados para gerar produtos funcionais sob o controle de um sistema regulador heterólogo. Eliminando-se elementos reguladores nativos fora e dentro de sequências de codifica- ção de clusters de genes, e substituindo-os por sistemas reguladores alternativos, os produtos funcionais de óperons genéticos complexos e outros clusters gênicos podem ser controlados e/ou movidos para células heterólogas, incluindo células de uma espécie diferente da espé- cie da qual os genes nativos foram derivados. Uma vez modificados de volta, os clusters gênicos sintéticos podem ser controlados por circuitos genéticos ou outros sistemas reguladores induzíveis, controlando, assim, a expressão dos produtos conforme desejado. Os cassetes de expressão podem ser criados para atuar como portas lógicas, gerados de pulso, osciladores, interruptores ou dispositivos de. O cassete de expressão controlador pode ser ligado a um promotor de tal modo que o cassete de expressão funcione como um sensor ambiental, tal como um sensor de oxigênio, temperatura, toque, estresse osmótico, estresse na membrana ou redox.

[0187] Como exemplo, os genes nifL, nifA, nifT e nifX podem ser eliminados do cluster de genes nif. Genes sintéticos podem ser proje- tados por randomização de códons do DNA que codifica cada sequência de aminoácidos. A seleção de códons é realizada, especificando o uso dos códons o mais divergente possível do uso de códons no gene nativo. As sequências propostas são examinadas quanto a quaisquer características indesejadas, tais como sítios de reconhecimento de enzi- mas de restrição, sítios de reconhecimento de transposons, sequências repetitivas, promotores sigma 54 e sigma 70, sítios crípticos de ligação ribossômica e terminadores independentes de rho. Os sítios sintéticos de ligação ribossômica são escolhidos para equivaler a força de cada sítio de ligação ribossômica nativo correspondente, tal como construin- do um plasmídeo repórter fluorescente no qual os 150 bp em volta de um códon de partida do gene (de −60 a +90) são fundidos a um gene fluorescente. Essa quimera pode ser expressa sob o controle do promo- tor Ptac, e a fluorescência medida por citometria de fluxo. Para gerar sítios sintéticos de ligação ribossômica, é gerada uma biblioteca de plasmídeos repórteres utilizando 150 bp (−60 a +90) de um cassete de expressão sintético. Resumidamente, um cassete de expressão sintéti- co pode consistir em um espaçador de DNA aleatório, uma sequência degenerada que codifica uma biblioteca de RBS e a sequência de codi- ficação para cada gene sintético. Múltiplos clones são rastreados para identificar o sítio sintético de ligação ribossômica que se equipara me- lhor ao sítio nativo de ligação ribossômica. Óperons sintéticos que consistem nos mesmos genes que os óperons nativos são assim cons- truídos e testados para complementação funcional. Uma descrição exemplar adicional de óperons sintéticos é fornecida em US20140329326. Espécies bacterianas

[0188] Micróbios úteis nos métodos e composições aqui revelados podem ser obtidos de qualquer fonte. Em alguns casos, os micróbios podem ser bactérias, arqueas, protozoários ou fungos. Os micróbios dessa invenção podem ser micróbios fixadores de nitrogênio, por exem- plo, bactérias fixadoras de nitrogênio, arqueas fixadoras de nitrogênio, fungos fixadores de nitrogênio, leveduras fixadoras de nitrogênio ou protozoários fixadores de nitrogênio. Os micróbios úteis nos métodos e composições aqui revelados podem ser micróbios formadores de espo- ros, por exemplo, bactérias formadoras de esporos. Em alguns casos, as bactérias úteis nos métodos e composições aqui revelados podem ser bactérias Gram positivas ou bactérias Gram negativas. Em alguns casos, as bactérias podem ser bactérias formadoras de endósporo do filo Firmicute. Em alguns casos, as bactérias podem ser diazotróficas. Em alguns casos, as bactérias podem não ser diazotróficas. Klebsiella variicola

[0189] Klebsiella variicola é uma bactéria fixadora de nitrogênio que vive livremente no solo, e foi isolada das rizosferas de banana, arroz, cana de açúcar e milho. A cepa 137 foi isolada originalmente de uma amostra de solo coletada da rizosfera de raízes de milho de um campo em Missouri no Condado St. Charles. A mesma cepa foi também encontrada em campos na Califórnia e Porto Rico, como confirmado por alinhamentos entre o 16S rRNA da cepa 137 e o 16S rRNA de organis- mos K. variicola naturais nos solos da Califórnia e Porto Rico. Klebsiella variicola não é conhecida por exibir características de praga vegetal; apesar de um grupo de pesquisa ter relatado que uma cepa de K. variicola pode causar podridão-mole1 em banana na China. Não foram encontrados fatores de virulência no genoma da cepa 137 de K. variicola. Kosakonia sacchari

[0190] Kosakonia sacchari é uma nova espécie dentro do novo gênero Kosakonia, que foi incluída no gênero Enterobacter2. K sacchari é uma bactéria fixadora de nitrogênio de vida livre, denominada por sua associação com a cana de açúcar (Saccharum officinarum L.). As bactérias K sacchari são bastonetes Gram-negativos, aeróbicas, não formadoras de esporos, e são capazes de colonizar e fixar nitrogênio em com plantas de cana de açúcar, promovendo, assim, o crescimento vegetal. A Cepa CI006 foi isolada de uma amostra de solo retirada do Condado de San Joaquin, Califórnia. Kosakonia sacchari não é conhe- cida por exibir características de praga vegetal.

[0191] As identidades dos dois micróbios do tipo selvagem descritos acima (cepas 137 e CI006) foram-confirmadas por análise de sequência do gene 16S rRNA, um método estabelecido para estudos filogenéticos de procarióticos. As informações de depósito biológico para essas duas cepas estão incluídas neste pedido de patente.

[0192] Os métodos e as composições dessa invenção podem ser usados com uma arquea, tal como, por exemplo, Methoutromobacter thermoautotrophicus.

[0193] Em alguns casos, as bactérias que podem ser úteis incluem, entre outros, Agrobacterium radiobacter, Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus agri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus alcalophilus, Bacillus alvei, Bacillus aminoglucosidicus, Bacillus aminovorans, Bacillus amylolyticus (também conhecida como Paenibacillus amylolyticus) Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aneurinolyticus, Bacillus atrophaeus, Bacillus azotoformans, Bacillus badius, Bacillus cereus (synonyms: Bacillus endorhythmos, Bacillus medusa), Bacillus chitinosporus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus Bacillus fastidiosus, Bacillus firmus, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus (também conhecida como Brevibacillus laterosporus), Bacillus lautus, Bacillus lentimorbus,

Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus maroccanus, Bacillus megaterium, Bacillus metiens, Bacillus mycoides, Bacillus natto, Bacillus nematocida, Bacillus nigrificans, Bacillus nigrum, Bacillus pantothenticus, Bacillus popillae, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus smithii, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus uniflagellatus, Bradyrhizobium japonicum, Brevibacillus brevis Brevibacillus laterosporus (anteriormente Bacillus laterosporus), Chromobacterium subtsugae, Delftia acidovorans, Lactobacillus acidophilus, Lysobacter antibioticus, Lysobacter enzymogenes, Paenibacillus alvei, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus popilliae (anteriormente Bacillus popilliae), Pantoea agglomerans, Pasteuria penetrans (anteriormente Bacillus penetrans), Pasteuria usgae, Pectobacterium carotovorum (anteriormente Erwinia carotovora), Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas cepacia (anteriormente known as Burkholderia cepacia), Pseudomonas clororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas proradix, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Serratia entomophila, Serratia marcescens, Streptomyces colombiensis, Streptomyces galbus, Streptomyces goshikiensis, Streptomyces griseoviridis, Streptomyces lavendulae, Streptomyces prasinus, Streptomyces saraceticus, Streptomyces venezuelae, Xanthomonas campestris, Xenorhabdus luminescens, Xenorhabdus nematophila, Rhodococcus globerulus AQ719 (No de acesso NRRL B-21663), Bacillus sp.

AQ175 (No de acesso ATCC 55608), Bacillus sp.

AQ 177 (No de acesso ATCC 55609), Bacillus sp.

AQ178 (No de acesso ATCC 53522), e Streptomyces sp. cepa No de acesso NRRL B-30145. Em alguns casos, a bactéria pode ser Azotobacter chroococcum, Methanosarcina barkeri, Klesiella pneumoniae, Azotobacter vinelandii, Rhodobacter spharoides, Rhodobacter capsulatus, Rhodobcter palustris, Rhodosporillum rubrum,

Rhizobium leguminosarum ou Rhizobium etli.

[0194] Em alguns casos, a bactéria podem ser uma espécie de Clostridium, por exemplo, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium acetobutylicum.

[0195] Em alguns casos, as bactérias utilizadas com os métodos e as composições da presente invenção podem ser cianobactérias. Os exemplos de gêneros de cianobactérias incluem Anabaena (por exemplo, Anagaena sp. PCC7120), Nostoc (por exemplo, Nostoc punctiforme) ou Synechocystis (por exemplo, Synechocystis sp. PCC6803).

[0196] Em alguns casos, as bactérias utilizadas com os métodos e as composições da presente invenção podem pertencer ao filo Clorobi, por exemplo, Clorobium tepidum.

[0197] Em alguns casos, os micróbios utilizados com os métodos e as composições da presente invenção podem compreender um gene homólogo a um gene NifH conhecido. Sequências de genes NifH conhe- cidos podem ser encontradas em, por exemplo, o banco de dados Zehr lab NifH, (https://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, April 4, 2014), ou o banco de dados Buckley lab NifH (http://www.css.milhoell.edu/faculty/buckley/nifh.htm, e em Gaby, John Christian e Daniel H. Buckley. “A comprehensive aligned nifH gene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixing bacteria”. Database 2014 (2014):bau001.). Em alguns casos, os micróbios utilizados com os métodos e as composições da presente invenção podem compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo com pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% ou mais de 99% de identidade de sequência com uma sequência do banco de dados Zehr lab NifH, (https://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, April 4, 2014).

Em alguns casos, os micróbios utilizados com os métodos e as compo- sições da presente invenção podem compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo com pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% ou mais de 99% de identidade de sequência com uma sequência do banco de dados Buckley lab NifH, (Gaby, John Christian e Daniel H. Buckley. “A comprehensive aligned nifH gene database: a multipurpose tool for studies de nitrogen-fixing bacteria” Database 2014 (2014):bau001).

[0198] Os micróbios úteis nos métodos e composições aqui reve- lados podem ser obtidos extraindo micróbios de superfícies ou tecidos de plantas nativas; moendo sementes para isolar os micróbios; plantan- do as sementes em diversas amostras de solo e recuperando os micró- bios de tecidos; ou inoculando plantas com micróbios exógenos e deter- minando quais micróbios aparecem em tecidos vegetais. Exemplos não limitantes de tecidos vegetais incluem semente, plântula, folha, corte, planta, bulbo ou tubérculo. Em alguns casos, as bactérias são isoladas de uma semente. Os parâmetros para o processamento de amostras podem ser variados para isolar tipos diferentes de micróbios associati- vos, tais como rizosféricos, epífitos ou endófitos. As bactérias podem também ser adquiridas em um repositório, tais como coleções de cepas ambientais, em vez de inicialmente isolar de uma primeira planta. Os micróbios podem ser genotipados e fenotipados, por sequenciamento dos genomas de micróbios isolados; determinar o perfil da composição de comunidades in planta; caracterização da funcionalidade transcrip- tômica de comunidades ou micróbios isolados; ou rastreamento de características microbianas utilizando meios seletivos ou fenotípicos (p. ex., fenótipos de fixação do nitrogênio ou solubilização de fosfato). As cepas ou populações candidatas selecionadas podem ser obtidas por dados sobre sequência, dados sobre fenótipo, dados sobre plantas (p. ex., dados sobre genoma, fenótipo e/ou rendimento); dados sobre solo

(p. ex., pH, teor de N/P/K e/ou comunidades bióticas volumosas no solo); ou qualquer combinação desses.

[0199] As bactérias e métodos de produção de bactérias aqui des- critos podem aplicar-se a bactérias capazes de autopropagação efi- ciente na superfície foliar, superfície radicular ou em tecidos vegetais internos, sem induzir uma reação de defesa nociva para a planta, ou as bactérias são resistentes a respostas de defesa da planta. As bactérias aqui descritas podem ser isoladas pela cultura de um extrato de tecido vegetal ou lavado da superfície foliar em um meio sem nitrogênio adicio- nado. No entanto, as bactérias podem ser não ser cultiváveis, ou seja, não conhecidas como cultiváveis ou difíceis de cultivar utilizando méto- dos padrão conhecidos na técnica. As bactérias aqui descritas podem ser um endófito ou um epífito ou uma bactéria que habita a rizosfera vegetal (bactérias rizosféricas). As bactérias obtidas, depois de repetir as etapas de introdução de variação genética, exposição a uma plurali- dade de plantas e isolamento de bactérias de plantas com um atributo melhorado uma ou mais vezes (p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25 ou mais vezes), podem ser endofíticas, epifíticas ou rizosféricas. Endófitos são organismos que penetram o interior de plantas sem causar sintomas de doença ou suscitar a formação de estruturas simbióticas, e são de interesse agronômico por serem capazes de reforçar o crescimento vegetal e melhorar a nutrição de plantas (p. ex., através da fixação do nitrogênio). As bactérias podem ser um endófito em semente. Os endó- fitos em semente incluem bactérias associadas com ou derivadas da semente de uma gramínea ou planta, tal como endófitos bacterianos em semente encontrados em sementes maduras, secas, não danificadas (p. ex., sem rachaduras, infecção fúngica visível ou prematuramente germinadas). O endófito bacteriano em semente por estar associado com ou ser derivado da superfície da semente; alternativamente ou além de, pode estar associado com ou ser derivado do compartimento interior da semente (p. ex., de uma semente com superfície esterili- zada). Em alguns casos, um endófito bacteriano em semente é capaz de replicação dentro do tecido vegetal, por exemplo, no interior da semente. Além disso, em alguns casos, o endófito bacteriano em semente é capaz de sobreviver à secagem.

[0200] As bactérias isoladas de acordo com métodos da invenção, ou usadas em métodos ou composições da invenção, podem compreen- der uma pluralidade de diferentes táxons bacterianos em combinação. A título de exemplo, as bactérias podem incluir Proteobacteria (como Pseudomonas, Enterobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, Rhizobium, Herbaspirillum, Pantoea, Serratia, Rahnella, Azospirillum, Azorhizobium, Azotobacter, Duganella, Delftia, Bradyrhizobiun, Sinorhizobium e Halomonas), Firmicutes (como Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Mycoplasma e Acetabacterium) e Actinobacteria (como Streptomyces, Rhodacoccus, Microbacterium e Curtobacterium). As bactérias usadas em métodos e composições dessa invenção podem incluir consórcios bacterianos fixadores de nitrogênio de duas ou mais espécies. Em alguns casos, uma ou mais espécies bacterianas dos consórcios bacterianos podem ser capaz de fixar nitrogênio. Em alguns casos, uma ou mais espécies dos consórcios bacterianos podem facilitar ou realçar a capacidade de outras bactérias para fixar nitrogênio. As bactérias que fixam nitrogênio e as bactérias que realçam a capaci- dade de outras bactérias para fixar nitrogênio podem ser iguais ou diferentes. Em alguns exemplos, uma cepa bacteriana pode ser capaz de fixar nitrogênio quando em combinação com uma cepa bacteriana diferente, ou em certos consórcios bacterianos, mas pode ser incapaz de fixar nitrogênio em monocultura. Exemplos de gêneros bacterianos que podem ser encontrados em consórcios bacterianos fixadores de nitrogênio incluem, entre outros, Herbaspirillum, Azospirillum, Enterobacter e Bacillus.

[0201] As bactérias que podem ser produzidas pelos métodos aqui revelados incluem Azotobacter sp., Bradyrhizobium sp., Klebsiella sp. e Sinorhizobium sp. Em alguns casos, as bactérias podem ser selecio- nadas a partir do grupo que consiste em: Azotobacter vinelandii, Bradyrhizobium japonicum, Klebsiella pneumoniae e Sinorhizobium meliloti. Em alguns casos, as bactérias podem ser do gênero Enterobacter ou Rahnella. Em alguns casos, as bactérias podem ser do gênero Frankia ou Clostridium. Exemplos de bactérias do gênero Clostridium incluem, entre outros, Clostridium acetobutilicum, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens e Clostridium tetani. Em alguns casos, as bactérias podem ser do gênero Paenibacillus, por exemplo, Paenibacillus azotofixans, Paenibacillus borealis, Paenibacillus durus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus alvei, Paenibacillus amylolyticus, Paenibacillus campinasensis, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus glucanolyticus, Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus larvae subsp. Larvae, Paenibacillus larvae subsp. Pulvifaciens, Paenibacillus lautus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus pabuli, Paenibacillus peoriae ou Paenibacillus polymyxa.

[0202] Em alguns exemplos, as bactérias isoladas de acordo com métodos da invenção podem pertencer a um ou mais dos seguintes táxons: Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Acidovoraz, Acinetobacter, Actinoplanes, Adlercreutzia, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agromyces, Ancylobacter, Arthrobacter, Atopostipes, Azospirillum, Bacillus, Bdellovibrio, Beijerinckia, Bosea, Bradyrhizobium, Brevibacillus, Brevundimonas, Burkholderia, Candidatus Haloredivivus, Caulobacter, Cellulomonas, Cellvibrio, Chryseobacterium, Citrobacter, Clostridium, Coraliomargarita, Corynebacterium, Cupriavidus, Curtobacterium, Curvibacter, Deinococcus, Delftia, Desemzia, Devosia,

Dokdonella, Dyella, Enhydrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Escherichia/Shigella, Exiguobacterium, Ferroglobus, Filimonas, Finegoldia, Flavisolibacter, Flavobacterium, Frigoribacterium, Gluconacetobacter, Hafnia, Halobaculum, Halomonas, Halosimplex, Herbaspirillum, Hymenobacter, Klebsiella, Kocuria, Kosakonia, Lactobacillus, Leclercia, Lentzea, Luteibacter, Luteimonas, Massilia, Mesorhizobium, Metilobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Microvirga, Mycobacterium, Neisseria, Nocardia, Oceanibaculum, Ochrobactrum, Okibacterium, Oligotropha, Oryzihumus, Oxalophagus, Paenibacillus, Panteoa, Pantoea, Pelomonas, Perlucidibaca, Plantibacter , Polynucleobacter, Propionibacterium, Propioniciclava, Pseudoclavibacter, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoxanthomonas, Psychrobacter, Rahnella, Ralstonia, Rheinheimera, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Roseateles, Ruminococcus, Sebaldella, Sediminibacillus, Sediminibacterium, Serratia, Shigella, Shinella, Sinorhizobium, Sinosporangium, Sphingobacterium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Sphingosinicella, Staphylococcus, 25 Stenotrophomonas, Strenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Stygiolobus, Sulfurisphaera, Tatumella, Tepidimonas, Thermomonas, Thiobacillus, Variovorax, WPS-2 genera incertae sedis, Xanthomonas e Zimmermannella.

[0203] Em alguns casos, são utilizadas espécies bacterianas sele- cionadas a partir de pelo menos um dos gêneros seguintes: Enterobacter, Klebsiella, Kosakonia e Rahnella. Em alguns casos, é utilizada uma combinação de espécies bacterianas dos seguintes gêneros: Enterobacter, Klebsiella, Kosakonia e Rahnella. Em alguns casos, a espécie utilizada pode ser uma ou mais dentre: Enterobacter sacchari, Klebsiella variicola, Kosakonia sacchari e Rahnella aquatilis.

[0204] Em alguns casos, um micróbio Gram positivo pode ter um sistema de Molibdênio-Ferro nitrogenase compreendendo: nifH, nifD, nifK, nifB, nifE, nifN, nifX, hesA, nifV, nifW, nifU, nifS, nifI1 e nifI2. Em alguns casos, um micróbio Gram positivo pode ter um sistema de vanádio nitrogenase system compreendendo: vnfDG, vnfK, vnfE, vnfN, vupC, vupB, vupA, vnfV, vnfR1, vnfH, vnfR2, vnfA (regulador transcricional). Em alguns casos, um micróbio Gram positivo pode ter um sistema somente de ferro nitrogenase compreendendo: anfK, anfG, anfD, anfH, anfA (regulador transcricional). Em alguns casos, um micróbio Gram positivo pode ter um sistema de nitrogenase compre- endendo glnB e glnK (proteínas sinalizadoras de nitrogênio). Alguns exemplos de enzimas envolvidas no metabolismo de nitrogênio em micróbios Gram-positivos incluem glnA (glutamina sintetase), gdh (glutamato desidrogenase), bdh (3-hidroxibutirato desidrogenase), glutaminase, gltAB/gltB/gltS (glutamato sintase), asnA/asnB (aspartato- amônia ligase/asparagina sintetase) e ansA/ansZ (asparaginase). Alguns exemplos de proteínas envolvidas no transporte de nitrogênio em micróbios Gram-positivos incluem amtB (transportador de amônio), glnK (regulador do transporte de amônio), glnPHQ/ glnQHMP (trans- portadores de glutamina/glutamato dependentes de ATP), glnT/alsT/yrbD/yflA (transportadores simportes de prótons semelhantes à glutamina) e gltP/gltT/yhcl/nqt (transportadores de simportes de prótons semelhantes ao glutamato).

[0205] Os exemplos de micróbios Gram-positivos que podem ser de interesse particular incluem Paenibacillus polymixa, Paenibacillus riograndensis, Paenibacillus sp., Frankia sp., Heliobacterium sp., Heliobacterium clorum, Heliobacillus sp., Heliophilum sp., Heliorestis sp., Clostridium acetobutylicum, Clostridium sp., Mycobacterium flaum, Mycobacterium sp., Arthrobacter sp., Agromyces sp., Corynebacterium autitrophicum, Corynebacterium sp., Micromonspora sp., Propionibacteria sp., Streptomyces sp. e Microbacterium sp.

[0206] Alguns exemplos de alterações genéticas que podem feitas em micróbios Gram-positivos incluem: deletar glnR para remover a regulação negativa de BNF na presença de nitrogênio ambiental, inserir promotores diferentes diretamente a montante do cluster de nif para eliminar a regulação por GlnR em resposta ao nitrogênio ambiental, induzir mutação em glnA para reduzir a taxa de assimilação de amônio pela via GS-GOGAT, deletar amtB para reduzir a absorção de amônio do meio, induzir mutação em glnA de modo que este fique constituti- vamente no estado de inibido por feedback (FBI-GS) para reduzir a assimilação de amônio pela via GS-GOGAT.

[0207] Em alguns casos, glnR é o principal regulador do metabolis- mo e fixação de N na espécie Paenibacillus. Em alguns casos, o genoma de uma espécie Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnR. Em alguns casos, o genoma de uma espécie Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnE ou glnD. Em alguns casos, o genoma de uma espécie Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnB ou glnK. Por exemplo, Paenibacillus sp. WLY78 não contém um gene para glnB, ou seus homólogos encon- trados na arqueia Methanococcus maripaludis, nifI1 e nifI2. Em alguns casos, os genomas de espécies Paenibacillus podem ser variáveis. Por exemplo, Paenibacillus polymixa E681 é desprovida de glnK e gdh, possui diversos compostos transportadores de nitrogênio, mas somente amtB parece ser controlado por GlnR. Em outro exemplo, Paenibacillus sp. JDR2 possui glnK, gdh e a maioria dos genes centrais para o metabolismo de nitrogênio, muito menos compostos transportadores de nitrogênio, mas tem glnPHQ controlado por GlnR. Paenibacillus riograndensis SBR5 contém um óperon glnRA padrão, um gene fdx, um óperon nif principal, um óperon nif secundário e um óperon anf (codifi- cando somente ferro nitrogenase). Supostos sítios de glnR/tnrA foram encontrados a montante de cada um desses óperons. GlnR pode regular todos os óperons acima, exceto o óperon anf. GlnR pode ligar- se a cada uma dessas sequências reguladoras como um dímero.

[0208] Cepas fixadoras de N de Paenibacillus podem situar-se em dois subgrupos: Subgrupo I, que contém apenas um cluster mínimo de genes nif e subgrupo II, que contém um cluster mínimo, mais um gene não caracterizado entre nifX e hesA e, frequentemente, outros clusters duplicando alguns dos genes nif, como nifH, nifHDK, nifBEN ou clusters codificando os genes vanádio nitrogenase (vnf) ou somente ferro nitrogenase (anf).

[0209] Em alguns casos, o genoma de uma espécie Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnB ou glnK. Em alguns casos, o genoma de uma espécie Paenibacillus pode conter um cluster nif mínimo com 9 genes transcritos a partir de um promotor sigma-70. Em alguns casos um cluster nif de Paenibacillus pode ser regulado negati- vamente por nitrogênio ou oxigênio. Em alguns casos, o genoma de uma espécie Paenibacillus pode não conter um gene para produzir sigma-54. Por exemplo, Paenibacillus sp. WLY78 não contém um gene para sigma-54. Em alguns casos, um cluster nif pode ser regulado por glnR e/ou TnrA. Em alguns casos, a atividade de um cluster nif pode ser alterada alterando-se a atividade de glnR e/ou TnrA.

[0210] Em Bacilli, glutamina sintetase (GS) é inibida por feedback de concentrações elevadas de glutamina intracelular, provocando um desvio na confirmação (referido como FBI-GS). Clusters de nif contêm sítios de ligação distintos para os reguladores GlnR e TnrA em diversas espécies Bacilli. GlnR liga-se e reprime a expressão gênica na presença de glutamina intracelular em excesso e AMP. Uma função de GlnR pode ser impedir o influxo e a produção intracelular de glutamina e amônio sob condições de alta disponibilidade de nitrogênio. TnrA pode ligar-se e/ou ativar (ou reprimir) a expressão gênica na presença de glutamina intracelular limitante e/ou na presença de FBI-GS. Em alguns casos, a atividade de um cluster nif de Bacilli nif pode ser alterada alterando-se a atividade de GlnR.

[0211] A glutamina sintetase inibida por feedback (FBI-GS) pode ligar-se a GlnR e estabilizar a ligação de GlnR a sequências de reco- nhecimento. Diversas espécies bacterianas possuem um sítio de liga- ção a GlnR/TnrA a montante do cluster nif. Alterar a ligação de FBI-GS e GlnR pode alterar a atividade da via nif. Fontes de Micróbios

[0212] As bactérias (ou qualquer micróbio de acordo com a inven- ção) podem ser obtidas de qualquer ambiente terrestre geral, incluindo seus solos, plantas, fungos, animais (incluindo invertebrados) e outro biota, incluindo os sedimentos, água e biota de lagos e rios; do ambiente marinho, seu biota e sedimentos (por exemplo, água do mar, lamas marinhas, plantas marinhas, invertebrados marinhos (por exemplo, esponjas), vertebrados marinhos (por exemplo, peixe); a geosfera ter- restre e marinha (regolito e rocha, por exemplo, rochas subterrâneas esmagadas, areia e argilas); a criosfera e sua água de degelo; a atmosfera (por exemplo, poeiras aéreas filtradas, nuvem e gotículas de chuva); ambientes urbanos, industriais e outros feitos pelo homem (por exemplo, matéria orgânica e mineral acumulada em concreto, calhas na beira de estradas, superfícies de telhados e superfícies de estradas).

[0213] As plantas das quais as bactérias (ou qualquer micróbio de acordo com a invenção) são obtidas podem ser uma planta dispondo de um ou mais atributos desejáveis, por exemplo, uma planta que cresce naturalmente em um ambiente em particular sob certas condições de interesse. A título de exemplo, certa planta pode crescer naturalmente em solo arenoso ou em areia de alta salinidade, ou sob temperaturas extremas, ou com pouca água, ou pode ser resistente a certas pragas ou doença presentes no ambiente, e pode ser desejável para uma cultura comercial ser cultivada em tais condições, especialmente se estas são, por exemplo, as únicas condições disponíveis em uma localização geográfica específica. A título de exemplo adicional, as bac- térias podem ser coletadas de culturas comerciais cultivadas em tais ambientes ou, mais especificamente, de plantas de culturas individuais que exibem melhor um atributo de interesse entre uma cultura cultivada em qualquer ambiente específico: por exemplo, as plantas de cresci- mento mais rápido entre uma cultura cultivada em solos de salinidade limitada, ou as plantas menos danificadas em culturas expostas a lesão grave por insetos ou doença epidérmica, ou plantas com as quantidades desejadas de certos metabólitos e outros compostos, incluindo teor de fibras, teor de óleo e outras, ou plantas exibindo cores, sabor ou cheiro desejáveis. As bactérias podem ser coletadas de uma planta de interes- se ou qualquer material existente no ambiente de interesse, incluindo fungos e outra biota animal e vegetal, solo, água, sedimentos e outros elementos do ambiente como referido anteriormente.

[0214] As bactérias (ou qualquer micróbio de acordo com a inven- ção) podem ser isoladas de tecido vegetal. Esse isolamento pode ocorrer de qualquer tecido adequado tecido na planta, incluindo por exemplo, raiz, caule e folhas, e tecidos vegetais reprodutivos. A título de exemplo, os métodos convencionais de isolamento a partir de plantas incluem tipicamente a excisão estéril do material vegetal de interesse (p. ex., comprimentos da raiz ou caule, folhas), esterilização da superfí- cie com uma solução (p. ex., hipoclorito de sódio 2%), depois do que o material vegetal é colocado em meio nutriente para crescimento microbiano. Alternativamente, o material vegetal com superfície esterili- zada pode ser esmagado em um líquido estéril (normalmente água) e a suspensão líquida, incluindo pequenos pedaços do material vegetal esmagado, é espalhada sobre a superfície de um meio de ágar sólido adequado, ou meios, que podem ou não ser seletivos (p. ex., conter somente ácido fítico como fonte de fósforo). Essa abordagem é especialmente útil para bactérias que formam colônias isoladas e po- dem ser apanhadas individualmente e transferidas para placas sepa- radas de meio nutriente e purificadas mais até uma única espécie por métodos bem conhecidos. Alternativamente, as amostras da raiz ou folhagem da planta podem não ter a superfície esterilizada, mas somen- te lavadas gentilmente, incluindo, assim, microrganismos epifíticos que vivem na superfície, no processo de isolamento, ou os micróbios epifíti- cos podem ser isolados separadamente, apertando para impressão e levantando pedaços de raízes, caule ou folhas da planta sobre a superfí- cie de um meio de ágar e, a seguir, isolando colônias individuais como acima. Essa abordagem é especialmente útil para bactérias, por exem- plo. Alternativamente, as raízes podem ser processadas sem lavar pequenas quantidades de solo aderido às raízes, incluindo, assim, micróbios que colonizam a rizosfera da planta. Caso contrário, o solo aderido às raízes pode ser removido, diluído e espalhado sobre ágar de meios seletivos e não seletivos adequados para isolar colônias indivi- duais de bactérias rizosféricas. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósi- to de microrganismos para fins de procedimentos de patente

[0215] Os depósitos microbianos da presente invenção foram reali- zados segundo as disposições do Tratado de Budapeste sobre o reco- nhecimento internacional do depósito de microrganismos para fins de procedimentos de patente (Tratado de Budapeste).

[0216] Os Requerentes declaram que, segundo 37 C.F.R. §

1.808(a)(2), “todas as restrições impostas pelo depositante sobre a disponibilidade para o público do material depositado serão removidas irrevogavelmente quando da concessão da patente”. Esta declaração está sujeita ao parágrafo (b) desta seção (ou seja, 37 C.F.R. § 1.808(b)).

[0217] Uma cultura biologicamente pura de Kosakonia sacchari (WT) foi depositada em 06 de janeiro de 2017 junto ao Bigelow National

Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA), situado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e recebeu o número de Designação de Depósito para Patente NCMA 201701001. As informa- ções aplicáveis ao depósito encontram-se abaixo na Tabela 1.

[0218] Uma cultura biologicamente pura de Klebsiella variicola (WT) foi depositada em 11 de agosto de 2017 situado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e recebeu o número de Designação de Depósito para Patente NCMA 201708001. As informações aplicáveis ao depósito encontram-se abaixo na Tabela 1.

[0219] Tabela 1: Microrganismos depositados sob o Tratado de Budapeste Designação principal da Número de Depositante cepa (alguns cepas têm Taxonomia Data do depósito acesso múltiplas designações) 06 de janeiro de NCMA CI006, PBC6.1, 6 Kosakonia sacchari (WT) 201701001 2017 11 de agosto de NCMA CI137, 137, PB137 Klebsiella variicola (WT) 201708001 2017 Microrganismos isolados e biologicamente puros

[0220] A presente invenção, em certas modalidades, provê microrganismos isolados e biologicamente puros que têm aplicações, entre outros, na agricultura. Os microrganismos revelados podem ser utilizados em seus estados de isolado e biologicamente puro, bem como ser formulados em composições (ver abaixo a seção de descrições de composições exemplares). Além disso, a invenção provê composições microbianas contendo pelo menos dois membros dos microrganismos revelados isolados e biologicamente puros, bem como métodos de utili- zação das ditas composições microbianas. Ademais, a invenção provê métodos de modulação de fixação do nitrogênio em plantas por intermé- dio da utilização dos micróbios revelados isolados e biologicamente puros.

[0221] Em alguns aspectos, os microrganismos isolados e biologi- camente puros da invenção são aqueles da Tabela 1. Em outros aspectos, os microrganismos isolados e biologicamente puros da invenção são derivados de um microrganismo da Tabela 1. Por exem- plo, a cepa, filho, mutante ou derivado de um microrganismo da Tabela 1 são providos no presente. A invenção contempla todas as possíveis combinações de micróbios listados na Tabela 1, as ditas combinações formando, às vezes, um consórcio microbiano. Os micróbios da Tabela 1, quer individualmente ou em qualquer combinação, podem ser combi- nados com qualquer planta, composto ativo (sintético, orgânico etc.), adjuvante, carreador, suplemento ou agente biológico mencionado na invenção. Composições

[0222] As composições, compreendendo bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com métodos aqui descritos e/ou tendo características como aqui descritas, podem estar na forma de líquido, espuma ou um produto seco. As composições, compreendendo bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com méto- dos aqui descritos e/ou tendo características como aqui descritas, po- dem também ser usadas para melhorar atributos de plantas. Em alguns exemplos, uma composição compreendendo populações bacterianas pode estar na forma de pó seco, uma pasta de pó e água ou de trata- mento molhável de sementes. As composições compreendendo popula- ções bacterianas podem ser revestidas sobre a superfície de uma semente, e podem estar em forma líquida.

[0223] A composição pode ser fabricada em biorreatores como reatores do tipo tanque agitado contínuo, reatores de batelada e na fazenda. Em alguns exemplos, as composições podem ser armaze- nadas em um recipiente, como um jarro, ou em mini a granel. Em alguns exemplos, as composições podem ser armazenadas dentro de um objeto selecionado a partir do grupo que consiste em frasco, ampola, embalagem, vaso, saco, caixa, caixote, envelope, caixa de papelão,

recipiente, silo, recipiente de embarque, carroceria de caminhão e/ou estojo.

[0224] As composições podem também ser usadas para melhorar atributos de plantas. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas sobre uma semente. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas sobre uma plântula. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas sobre uma superfície de uma semente. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas como uma camada em cima de uma superfície de uma semente. Em alguns exemplos, uma compo- sição que é revestida sobre uma semente pode estar em forma líquida, em forma de produto seco, em forma de espuma, em forma de uma pasta de pó e água ou em tratamento molhável de sementes. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser aplicadas a uma semente e/ou plântula por pulverização, imersão, revestimento, encap- sulação e/ou empoeiramento da semente e/ou plântula com um ou mais das composições. Em alguns exemplos, múltiplas bactérias ou popula- ções bacterianas podem ser revestidas sobre uma semente e/ou uma plântula da planta. Em alguns exemplos, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais de dez bactérias de uma combinação bacteriana podem ser selecionadas dentre um dos seguintes gêneros: Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Escherichia, Metilobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Saccharibacillus, Sphingomonas e Stenotrophomonas.

[0225] Em alguns exemplos, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais de dez bactérias e populações bacterianas de uma combinação endofítica são selecionadas dentre uma das seguintes famílias: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Metilobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae e Pleosporaceae.

[0226] Em alguns exemplos, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais de dez bactérias e populações bacterianas de uma combinação endofítica são selecionadas dentre uma das seguintes famílias: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Metilobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae, Pleosporaceae.

[0227] Os exemplos de composições podem incluir revestimentos de sementes para culturas agrícolas comercialmente importantes, por exemplo, sorgo, canola, tomate, morango, cevada, arroz, milho e trigo. Os exemplos de composições podem também incluir revestimentos de sementes para milho, soja, canola, sorgo, batata, arroz, legumes, cereais e sementes oleaginosas. As sementes, ora providas, podem ser organismos geneticamente modificados (GMO), não GMO, orgânicos ou convencionais. Em alguns exemplos, as composições podem ser pulverizadas sobre os ramos das plantas ou aplicadas às raízes, inse- rindo em sulcos nos quais as sementes da planta são plantadas, regan- do o solo ou imergindo as raízes em uma suspensão da composição. Em alguns exemplos, as composições podem ser desidratadas de maneira adequada que mantenha a viabilidade celular e a capacidade para inocular artificialmente e colonizar plantas hospedeiras. As espé- cies bacterianas podem estar presentes nas composições a uma concentração entre 108 e 1010 CFU/mL. Em alguns exemplos, as com- posições podem ser suplementadas com íons de metais atributo, como íons molibdênio, íons ferro, íons manganês ou combinações desses íons. A concentração de íons em exemplos de composições como aqui descritas pode ser entre aproximadamente 0,1 mM e 50 mM. Alguns exemplos de composições podem também ser formulados com um carreador, como beta-glicano, carboximetilcelulose (CMC), substância polimérica extracelular (EPS) bacteriana, açúcar, leite animal ou outros carreadores adequados. Em alguns exemplos, turfa ou materiais de plantio podem ser utilizados como carreadores, ou biopolímeros nos quais uma composição está aprisionada no biopolímero podem ser utilizados como carreador. As composições compreendendo as popu- lações bacterianas aqui descritas podem melhorar atributos de plantas, como promover o crescimento vegetal, manter teor foliar elevado de clorofila, aumentar o número de frutos ou sementes e aumentar a massa unitária de frutos ou sementes.

[0228] As composições compreendendo as populações bacterianas aqui descritas podem ser revestidas sobre a superfície de uma semente. Assim, composições que compreendem uma semente revestida com uma ou mais bactérias aqui descritas são também contempladas. O revestimento de sementes pode ser formado misturando a população bacteriana com um carreador granular poroso, quimicamente inerte. Alternativamente, as composições podem ser inseridas diretamente nos sulcos nos quais a semente é plantada, ou pulverizadas sobre as folhas da planta ou aplicada imergindo as raízes em uma suspensão da com- posição. Uma quantidade eficaz da composição pode ser utilizada para povoar a região no subsolo adjacente às raízes da planta com crescimento bacteriano viável, ou povoar as folhas da planta com cres- cimento bacteriano viável. Em geral, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para resultar em plantas com atributos melho- rados (p. ex., um nível desejado de fixação do nitrogênio).

[0229] As composições bacterianas aqui descritas podem ser formuladas utilizando um carreador agricolamente aceitável. A formu- lação útil para essas modalidades pode incluir pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em um tackifier (adesivo), um estabilizante microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um conservante, um estabilizante, um tensoativo, um agente anticom- plexo, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento vegetal, um fertilizante, um rodenticida, um dessecante, um bactericida, um nutriente ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, as composições podem ser estáveis à temperatura ambiente. Por exemplo, qualquer uma das composições aqui descritas pode incluir um carreador agricolamente aceitável (p. ex., um ou mais dentre um fertilizante como um fertilizante não natural, um agente de adesão como um agente de adesão não natural e um pesticida como um pesticida não natural). Um agente de adesão não natural pode ser, por exemplo, um polímero, copolímero ou cera sintética. Por exemplo, qualquer uma das sementes revestidas, plântulas ou plantas aqui des- critas podem conter tal carreador agricolamente aceitável no revesti- mento da semente. Em qualquer uma das composições ou métodos aqui descritos, um carreador agricolamente aceitável pode ser ou incluir um composto não natural (p. ex., um fertilizante não natural, um agente de adesão não natural, como um polímero, copolímero ou cera sintética, ou um pesticida não natural). Exemplos não limitantes de carreadores agricolamente aceitáveis são descritos abaixo. Exemplos adicionais de carreadores agricolamente aceitáveis são conhecidos na técnica.

[0230] Em alguns casos, as bactérias são misturadas com um carreador agricolamente aceitável. O carreador pode ser um carreador sólido ou carreador líquido, e em várias formas incluindo microesferas, pós, emulsões e as semelhantes. O carreador pode ser qualquer um ou mais dentre vários carreadores que conferem uma variedade de propriedades, como estabilidade, maior molhabilidade ou dispersibi- lidade. Agentes umectantes, tais como tensoativos naturais ou sintéti- cos, os quais podem ser tensoativos não iônicos ou iônicos, ou uma combinação destes, podem ser incluídos na composição. Emulsões água em óleo podem também ser usadas para formular uma compo- sição que inclui as bactérias isoladas (ver, por exemplo, Patente U.S. No 7 485 451). As formulações adequadas que podem ser preparadas incluem pós molháveis, grânulos, géis, tiras de ágar ou pellets, espes- santes, e os semelhantes, partículas microencapsuladas e os seme- lhantes, líquidos como flowables aquosos, suspensões aquosas, emul- sões água em óleo etc. A formulação pode incluir produtos de grãos ou legumes, por exemplo, grão ou feijões moídos, caldo ou farinha derivado de grão ou feijões, amido, açúcar ou óleo.

[0231] Em algumas modalidades, o carreador agrícola pode ser o solo ou um meio de crescimento vegetal. Outros carreadores agrícolas que podem ser usados incluem água, fertilizantes, óleos baseados em vegetais, umectantes, ou combinações destes. Alternativamente, o carreador agrícola podem ser um sólido, como terra diatomácea, argila, sílica, alginato, barro, bentonita, vermiculita, cascas de sementes, ou- tros produtos vegetais e animais, ou combinações, incluindo grânulos, pellets ou suspensões. Misturas de qualquer um dos ingredientes men- cionados acima são também contemplados como carreadores, tal co- mo, entre outros, pesta (farinha e argila de caulim), ágar ou pellets à base de farinha em argila, areia ou barro etc. As formulações podem incluir fontes de alimento para as bactérias, como cevada, arroz ou outros materiais biológicos como sementes, partes de plantas, bagaço de cana de açúcar, cascas ou hastes provenientes do processamento de grãos, material vegetal moído ou madeira de refugo de canteiro de obras, serragem ou fibras pequenas proveniente da reciclagem de papel, tecido ou madeira.

[0232] Por exemplo, pode-se usar um fertilizante como ajuda para promover o crescimento ou para fornecer nutrientes a uma semente, plântula ou planta. Exemplos não limitantes de fertilizantes incluem nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, enxofre, magnésio, boro, cloreto, manganês, ferro, zinco, cobre, molibdênio e selênio (ou um sal dos mesmos). Exemplos adicionais de fertilizantes incluem um ou mais aminoácidos, sais, carboidratos, vitaminas, glicose, NaCl, extrato de leveduras, NH4H2PO4, (NH4)2SO4, glicerol, valina, L-leucina, ácido lácti- co, ácido propiônico, ácido succínico, ácido málico, ácido cítrico, tartara- to de KH, xilose, lixose e lecitina. Em uma modalidade, a formulação pode incluir um tackifier ou aderente (referido como agente adesivo) para ajudar na ligação de outros agentes ativos a uma substância (p. ex., superfície de uma semente). Tais agentes são úteis para combinar bactérias com carreadores que podem conter outro compostos (p. ex., agentes de controle que não são biológicos), para produzir uma compo- sição de revestimento. Tais composições ajudam a criar revestimentos em volta da planta ou semente para manter o contato entre o micróbio e outros agentes com a planta ou parte da planta. Em uma modalidade, os adesivos são selecionados a partir do grupo que consiste em: algi- nato, gomas, amidos, lecitinas, formononetina, álcool polivinílico, formononetinato alcalino, hesperetina, acetato de polivinila, cefalinas, goma arábica, goma xantana, óleo mineral, polietilenoglicol (PEG), polivinilpirrolidona (PVP), Arabino-galactano, metilcelulose, PEG 400, quitosana, poliacrilamida, poliacrilato, poliacrilonitrila, glicerol, trietilenoglicol, acetato de vinila, goma gelana, poliestireno, polivinila, carboximetilcelulose, goma Ghatti e copolímeros de polioxietileno-

polioxibutileno.

[0233] Em algumas modalidades, os adesivos podem ser, p. ex., uma cera como cera de carnaúba, cera de abelhas, cera chinesa, goma laca (shellac), cera de espermacetes, cera de candelila, cera de óleo de rícino, cera de ouricuri e cera de farelo de arroz, um polissacarídeo (p. ex., amido, dextrinas, maltodextrinas, alginato e quitosanas), uma gordura, óleo, uma proteína (p. ex., gelatina e zeínas), gomas aráveis e esmaltes. Os agentes adesivos podem ser compostos não naturais, p. ex., polímeros, copolímeros e ceras. Por exemplo, exemplos não limi- tantes de polímeros que podem ser utilizados como agente adesivo incluem: acetatos de polivinila, copolímeros de acetato de polivinila, acetato de vinil etileno (EVA) copolímeros, álcoois polivinílicos, copolí- meros de álcool polivinílico, celuloses (p. ex., etilceluloses, metilceluloses, hidroximetilceluloses, hidroxipropilceluloses e carboximetilceluloses), polivinilpirrolidonas, cloreto de vinila, copolíme- ros de cloreto de vinilideno, lingnossulfonatos de cálcio, copolímeros acrílicos, polivinilacrilatos, óxido de polietileno, polímeros e copolímeros de acilamida, polihidroxietil acrilado, monômeros de metilacrilamida e policloropreno.

[0234] Em alguns exemplos, um ou mais dentre os agentes de adesão, agentes antifúngicos, agentes de regulação do crescimento e pesticidas (p. ex., inseticida) são compostos não naturais (p. ex., em qualquer combinação). Exemplos adicionais carreadores agricolamente aceitáveis incluem dispersantes (p. ex., polivinilpirrolidona/acetato de vinila PVPIVA S-630), tensoativos, aglutinantes e agentes de preenchi- mento.

[0235] A formulação pode também conter um tensoativo. Exemplos não limitantes de tensoativos incluem misturas de tensoativos nitroge- nados como Prefer 28 (Cenex), Surf-N(US), Inhance (Brandt), P-28 (Wilfarm) e Patrol (Helena); óleos esterificados de sementes incluindo

Sun-It II (AmCy), MSO (UAP), Scoil (Agsco), Hasten (Wilfarm) e Mes- 100 (Drexel); e tensoativos organo-siliconados incluindo Silwet L77 (UAP), Silikin (Terra), Dyne-Amic (Helena), Kinetic (Helena), Sylgard 309 (Wilbur-Ellis) e Century (Precision). Em uma modalidade, o tensoativo está presente a uma concentração entre 0,01% v/v e 10% v/v. Em outra modalidade, o tensoativo está presente a uma concen- tração entre 0,1% v/v e 1% v/v.

[0236] Em certos cases, a formulação inclui um estabilizante microbiano. Esse agente pode incluir um dessecante, que pode incluir qualquer composto ou mistura de compostos que podem ser classifi- cados como dessecante independentemente se o composto ou com- postos são usados em tais concentrações que façam com que tenham de fato um efeito dessecante em um inoculante líquido. Tais dessecan- tes são idealmente compatíveis com a população bacteriana utilizada, e devem promover a capacidade da população microbiana para sobrevi- ver a aplicação sobre as sementes e para sobreviver à secagem. Os exemplos de dessecantes adequados incluem um ou mais dentre trealo- se, sacarose, glicerol e metilenoglicol. Outros dessecantes adequados incluem, entre outros, açúcares não redutores e álcoois de açúcar (p. ex., manitol ou sorbitol). A quantidade de dessecante introduzido na formulação pode variar entre aproximadamente 5% e 50% em mas- sa/volume, por exemplo, entre aproximadamente 10% e 40%, entre aproximadamente 15% e 35% ou entre aproximadamente 20% e 30%. Em alguns casos, é vantajoso que a formulação contenha agentes tais como um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nema- ticida, um inseticida, um regulador de crescimento vegetal, um rodenti- cida, bactericida ou um nutriente. Em alguns exemplos, os agentes podem incluir protetores que proporcionam proteção contra patógenos na superfície de sementes. Em alguns exemplos, os protetores podem proporcionar algum nível de controle de patógenos presentes no solo.

Em alguns exemplos, os protetores podem ser eficazes predominan- temente em uma superfície de sementes.

[0237] Em alguns exemplos, um fungicida pode incluir um composto ou agente, seja químico ou biológico, que possa inibir o crescimento de um fungo ou matar um fungo. Em alguns exemplos, um fungicida pode incluir compostos que podem ser fungistáticos ou fungicidas. Em alguns exemplos, o fungicida pode ser a protetor, ou agentes que são eficazes predominantemente sobre a superfície de sementes, proporcionando proteção contra patógenos presentes na superfície de sementes e conferindo algum nível de controle de patógenos no solo. Exemplos não limitantes de fungicidas protetores incluem captan, maneb, tiram ou fludioxonil.

[0238] Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um fungicida sistêmico, que pode ser absorvido pela plântula emergente e inibir ou matar o fungo dentro dos tecidos da planta hospedeira. Os fungicidas sistêmicos utilizados para o tratamento de sementes incluem, entre outros, os seguintes: azoxistrobina, carboxina, mefenoxam, metalaxil, tiabendazol, trifloxistrobina e vários fungicidas triazólicos, incluindo difenoconazol, ipconazol, tebuconazol e triticonazol. Mefenoxam e metalaxil são usados primariamente para atingir os fungos embolarado- res em água Pythium e Phytophthora. Alguns fungicidas são preferidos a outros, dependendo da espécie vegetal, quer por causa de diferenças sutis na sensibilidade da espécie fúngica patogênica, quer por causa das diferenças na distribuição ou sensibilidade ao fungicida das plantas. Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um agente biológico de controle, tal como uma bactéria ou fungo. Tais organismos podem ser parasitas dos fungos patogênicos, ou secretar toxinas ou outras subs- tâncias que possam matar ou que de outra forma impeçam o cresci- mento dos fungos. Qualquer tipo de fungicida, especialmente aqueles que são comumente usados em plantas, pode ser utilizado como agente de controle em uma composição para sementes.

[0239] Em alguns exemplos, a composição de revestimento de sementes compreende um agente de controle com propriedades antibacterianas. Em uma modalidade, o agente de controle com proprie- dades antibacterianas é selecionado dentre os compostos descritos em outro lugar no presente. Em outra modalidade, o composto é estreptomi- cina, oxitetraciclina, ácido oxolínico ou gentamicina. Outros exemplos de compostos antibacterianos que podem ser utilizados como parte de uma composição de revestimento de sementes incluem aqueles à base de diclorofeno e álcool benzílico hemiformal (Proxel® da ICI ou Acticide® RS da Thor Chemie e Kathon® MK 25 da Rohm & Haas) e derivados de isotiazolinona tais como alquil-isotiazolinonas e benzisotiazolinonas (Acticide® MBS da Thor Chemie).

[0240] Em alguns exemplos, o regulador do crescimento é selecio- nado a partir do grupo que consiste em: ácido abscísico, amidoclor, ancimidol, 6-benzilaminopurina, brassinolide, butralina, clormequate (cloreto de clormequate), cloreto de colina, ciclanilide, daminozida, dikegulac, dimetipina, 2,6-dimetilpuridina, etefon, flumetralina, flurprimidol, flutiacet, forclorfenuron, ácido giberélico, inabenfide, ácido indole-3-acético, hidrazida maleica, mefluidide, mepiquate (cloreto de mepiquate), ácido naftalenoacético, N-6-benziladenina, paclobutrazol, fosforotioato de prohexadiona, ácido 2,3,5-tri-iodobenzoico, trinexapac- etílico e uniconazol. Exemplos adicionais não limitantes de reguladores do crescimento incluem brassinosteroides, citocininas (p. ex., cinetina e zeatina), auxinas (p. ex., ácido indolacético e aspartato de indolacetila), flavonoides e isoflavanoides (p. ex., formononetina e diosmetina), fitoaixinas (p. ex., gliceolina) e oligossacarídeos indutores de fitoalexina (p. ex., pectina, quitina, quitosana, ácido poligalacturônico e ácido oligogalacturônico) e gibelerinas. Tais agentes são idealmente compatí- veis com a semente ou plântula agrícola sobre a qual a formulação é aplicada (p. ex., não devem ser prejudiciais para o crescimento ou a saúde da planta). Além disso, o agente é idealmente aquele que não causa preocupações relativas à segurança para uso em humanos, animais ou industrial (p. ex., nenhuma questão relativa à segurança, ou o composto é suficientemente lábil de modo que o produto vegetal como mercadoria, derivado da planta contém quantidades descartáveis do composto).

[0241] Alguns exemplos de agentes de controle antagonista de nematódeos incluem ARF18; 30 Arthrobotrys spp.; Chaetomium spp.; Cylindrocarpon spp.; Exophilia spp.; Fusarium spp.; Gliocladium spp.; Hirsutella spp.; Lecanicillium spp.; Monacrosporium spp.; Myrothecium spp.; Neocosmospora spp.; Paecilomyces spp.; Pochonia spp.; Stagonospora spp.; fungos micorrizas do tipo vesicular-arbuscular, Burkholderia spp.; Pasteuria spp., Brevibacillus spp.; Pseudomonas spp.; e Rhizobacteria. Os agentes especialmente preferidos de biocontrole antagonista de nematódeos incluem ARF18, Arthrobotrys oligospora, Arthrobotrys dactyloides, Chaetomium globosum, Cylindrocarpon heteronema, Exophilia jeanselmei, Exophilia pisciphila, Fusarium aspergilus, Fusarium solani, Gliocladium catenulatum, Gliocladium roseum, Gliocladium vixens, Hirsutella rhossiliensis, Hirsutella minnesotensis, Lecanicillium lecanii, Monacrosporium drechsleri, Monacrosporium gephyropagum, Myrotehcium verrucaria, Neocosmospora vasinfecta, Paecilomyces lilacinus, Pochonia chlamydosporia, Stagonospora heteroderae, Stagonospora phaseoli, fungos micorrizas do tipo vesicular-arbuscular, Burkholderia cepacia, Pasteuria penetrans, Pasteuria thornei, Pasteuria nishizawae, Pasteuria ramosa, uso de Pastrueia, Brevibacillus laterosporus cepa G4, Pseudomonas fluorescens e Rhizobacteria.

[0242] Alguns exemplos de nutrientes podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em um fertilizante nitrogenado incluindo,

entre outros, ureia, nitrato de amônio, sulfato de amônio, soluções nitrogenadas não pressurizadas, amônia aquosa, amônia anidra, tiossulfato de amônio, ureia revestida com enxofre, ureia-formaldeídos, IBDU, ureia revestida com polímero, nitrato de cálcio, Ureia-form e metileno-ureia, fertilizantes fosforados como fosfato de diamônio, fosfato de monoamônio, polifosfato de amônio, superfosfato concen- trado e superfosfato triplo, e fertilizantes potássicos como cloreto de potássio, sulfato de potássio, sulfato de potássio-magnésio, nitrato de potássio. Tais composições podem existir como sais livres ou íons na composição de revestimento de sementes. Alternativamente, os nutrien- tes/fertilizantes podem ser complexados ou quelados para fornecer liberação prolongada ao longo do tempo.

[0243] Alguns exemplos de rodenticidas podem ser selecionados a partir do grupo de substâncias que consiste em 2-isovalerilindan-1,3- diona, 4-(quinoxalin-2-ilamino) benzenossulfonamida, alfa-cloridrina, fosfeto de alumínio, antu, óxido arsenioso, carbonato de bário, bistiosemi, brodifacoum, bromadiolona, brometalina, cianeto de cálcio, cloralose, clorofacinona, colecalciferol, coumaclor, coumafurila, coumatetralila, crimidina, difenacoum, difetialona, difacinona, ergocalciferol, flocoumafeno, fluoroacetamida, flupropadina, cloridrato de flupropadina, cianeto de hidrogênio, iodometano, lindano, fosfeto de magnésio, brometo de metila, norbormide, fosacetim, fosfina, fósforo, pindona, arsenito de potássio, pirinuron, esciliroside, arsenito de sódio, cianeto de sódio, fluoroacetato de sódio, estricnina, sulfato de tálio, varfarina e fosfeto de zinco.

[0244] Na forma líquida, por exemplo, soluções ou suspensões, populações bacterianas podem ser misturadas ou suspensas em água ou em soluções aquosas. Os diluentes ou carreadores líquidos adequados incluem água, soluções aquosas, destilados de petróleo ou outros carreadores líquidos.

[0245] Composições sólidas podem ser preparadas dispersando as populações bacterianas em e sobre um carreador sólido finamente dividido, tal como turfa, trigo, farelo, vermiculita, argila, talco, bentonita, terra diatomácea, terra de Fuller, solo pasteurizado e outros. Quando tais formulações são usadas como pós molháveis, agentes dispersantes biologicamente compatíveis, tais como agentes dispersantes e emulsio- nantes não iônicos, aniônicos, anfotéricos ou catiônicos, podem ser utilizados.

[0246] Os carreadores sólidos quando da formulação incluem, por exemplo, carreadores minerais tais como argila de caulim, pirofilita, bentonita, montmorilonite, terra diatomácea, solo branco ácido, vermicu- lita e perlita, e sais inorgânicos como sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, ureia, cloreto de amônio e carbonato de cálcio. Além disso, podem ser utilizados pós orgânicos finos, como farinha de trigo, farelo de trigo e farelo de arroz. Os carreadores líquidos incluem óleos vegetais como óleo de soja e óleo de semente de algodão, glicerol, etilenoglicol, polietilenoglicol, propilenoglicol, polipropilenoglicol etc. Aplicação de populações bacterianas em culturas

[0247] A composição das bactérias ou população bacteriana aqui descrita podem ser aplicada sulco, em talco ou como tratamento de sementes. A composição pode ser aplicada a sementes em embalagem a granel, mini granel, em um saco ou em talco.

[0248] O agricultor pode plantar a semente tratada e cultivar a cultura de acordo com modos convencionais, fileira dupla, ou maneiras que não requeiram aragem. As sementes podem ser distribuídas usan- do um funil de controle ou um funil individual. As sementes podem também ser distribuídas usando ar pressurizado ou manualmente. O posicionamento de sementes pode ser realizado empregando tecnolo- gias de taxas variáveis. Além disso, a aplicação das bactérias ou população bacteriana aqui descritas pode ser efetuada empregando tecnologias de taxas variáveis. Em alguns exemplos, as bactérias podem ser aplicadas a sementes de milho, soja, canola, sorgo, batata, arroz, legumes, cereais, pseudocereais e sementes oleaginosas. Os exemplos de cereais podem incluir cevada, painço, aveia, Distichlis palmeri, centeio, milheto, sorgo, espelta, teff, triticale e trigo. Os exem- plos de pseudocereais podem incluir fruta-pão, trigo sarraceno, taboa, chia, linhaça, grão amaranto, hanza, quinoa e gergelim. Em alguns exemplos, as sementes podem ser organismos geneticamente modifi- cados (GMO), não GMO, orgânicas ou convencionais.

[0249] Aditivos, como micro-fertilizante, PGR, herbicida, inseticida e fungicida podem ser utilizados igualmente para tratar as culturas. Os exemplos de aditivos incluem protetores de culturas como inseticidas, nematicidas, fungicidas, agentes de melhoramento como corantes, polímeros, de peletização, preparação e desinfetantes, e outro agentes como inoculante, PGR, amaciante (softener) e micronutrientes. Os PGRs podem ser hormônios naturais ou sintéticos de plantas que afetam o crescimento de raízes, a floração ou o alongamento do caule. Os PGRs podem incluir auxinas, giberelinas, citocininas, etileno e ácido abscísico (ABA).

[0250] A composição pode ser aplicada no sulco em combinação com fertilizante líquido. Em alguns exemplos, o fertilizante líquido pode ser conservado em tanques. Os fertilizantes NPK contêm macronu- trientes de sódio, fósforo e potássio.

[0251] A composição pode melhorar atributos de plantas, tais como promover o crescimento vegetal, manter alto teor foliar de clorofila, aumentar os números de frutos ou sementes aumentar a massa unitária de frutos ou sementes. Os métodos da presente invenção podem ser empregados para introduzir ou melhorar um ou mais de uma variedade de atributos desejáveis. Os exemplos de atributos que podem ser introduzidos ou melhorados incluem: biomassa radicular, comprimento de raízes, altura, comprimento de ramo, número de folhas, eficiência no uso de água, biomassa global, rendimento, tamanho de frutos, tamanho de grãos, taxa de fotossíntese, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância à salinidade, tolerância ao estresse por baixo nível de nitrogê- nio, eficiência no uso de nitrogênio, resistência ao estresse por nemató- deos, resistência a um patógeno fúngico, resistência a um patógeno bacteriano, resistência a um patógeno viral, nível de a metabólito, modu- lação em nível de metabólito, expressão de proteoma. Os atributos desejáveis, incluindo altura, biomassa global, biomassa radicular e/ou de ramos, germinação de sementes, sobrevivência de plântulas, efi- ciência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de sementes/frutos, rendimento de graus ou frutos da planta, teor foliar de clorofila, taxa fotossintética, comprimento de raízes, ou qualquer combi- nação dos mesmos, podem ser utilizada para medir o crescimento, e comparados com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (p. ex., plantas sem os atributos introduzidos e/ou melhora- dos) cultivadas sob condições idênticas condições. Em alguns exem- plos, os atributos desejáveis, incluindo altura, biomassa global, biomas- sa radicular e/ou de ramos, germinação de sementes, sobrevivência de plântulas, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de sementes/frutos, rendimento de graus ou frutos da planta, teor foliar de clorofila, taxa fotossintética, comprimento de raízes, ou qual- quer combinação dos mesmos, podem ser utilizados para medir o cres- cimento, e comparados com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (p. ex., plantas sem os atributos introduzidos e/ou melho- rados) cultivadas sob condições semelhantes.

[0252] Um atributo agronômico para uma planta hospedeira pode incluir, entre outros, os seguintes: alteração do teor de óleo, alteração do teor de proteínas, alteração da composição de carboidratos em sementes, alteração da composição de óleos em sementes e alteração da composição de proteínas em sementes, tolerância a substâncias químicas, tolerância ao frio, retardamento da senescência, resistência a doenças, tolerância à seca, peso de espigas, melhora do crescimento, melhoramento da saúde, tolerância ao calor, tolerância a herbicidas, fixação do nitrogênio melhorada por resistência a herbívoros, melhor utilização do nitrogênio, melhor arquitetura radicular, melhor eficiência no uso de água, maior biomassa, maior comprimento de raízes, maior massa de sementes, maior comprimento de ramos, maior rendimento, maior rendimento sob condições de limitação de água, massa de grãos, teor de umidade de grãos, tolerância a metais, número de espigas, número de grãos por espiga, número de vagas, melhoramento da nutri- ção, resistência a patógenos, resistência a pragas, melhor capacidade fitossintética, tolerância à salinidade, permanecer verde, melhor vigor, maior massa seca de sementes maduras, maior massa fresca de sementes maduras, maior número de sementes maduras por planta, maior teor de clorofila, maior número de vagens por planta, maior comprimento de vagens por planta, menor número de folhas murchas por planta, menor número de folhas gravemente murchas por planta e maior número de folhas não murchas por planta, modulação detectável no nível de um metabólito, modulação detectável no nível de um transcrito e modulação detectável no proteoma, em comparação a uma planta isolinha cultivada a partir de uma semente sem a dita formulação para o tratamento de sementes.

[0253] Em alguns casos, as plantas são inoculadas com bactérias ou populações bacterianas que são isoladas da mesma espécie de planta que o elemento vegetal da planta inoculada. Por exemplo, uma bactéria ou população bacteriana que é normalmente encontrada em uma variedade de Zea mays (milho) é associada com um elemento vegetal de uma planta de outra variedade de Zea mays que, em seu estado natural, carece das ditas bactérias e populações bacterianas. Em uma modalidade, as bactérias e populações bacterianas são derivadas de uma planta de uma espécie relacionada de planta à do elemento vegetal da planta inoculada. Por exemplo, uma bactérias e populações bacterianas que são normalmente encontradas em Zea diploperennis Iltis at al., (diploperennial teosinte) são aplicadas a Zea mays (milho) ou vice-versa. Em alguns casos, as plantas são inoculadas com bactérias e populações bacterianas que são heterólogas ao elemento vegetal da planta inoculada. Em uma modalidade, as bactérias e populações bacte- rianas são derivadas de uma planta de outra espécie. Por exemplo, uma bactéria e populações bacterianas que são normalmente encontradas em dicotiledôneas é aplicada a uma planta monocotiledônea (p. ex., inoculação de milho com uma bactéria e populações bacterianas deri- vadas de soja) ou vice-versa. Em outros casos, as bactérias e popula- ções bacterianas a serem inoculadas em uma planta são derivadas de uma espécie relacionada da planta que está sendo inoculada. Em uma modalidade, as bactérias e populações bacterianas são derivadas de um táxon relacionado, por exemplo, de uma espécie relacionada. A planta de outra espécie pode ser uma planta agrícola. Em outra moda- lidade, as bactérias e populações bacterianas fazem parte de uma composição projetada inoculada em qualquer elemento da planta hos- pedeira.

[0254] Em alguns exemplos, a bactéria ou população bacteriana é exógena, em que a bactéria e população bacteriana são isoladas de uma planta diferente da planta inoculada. Por exemplo, em uma moda- lidade, as bactérias ou população bacteriana podem ser isoladas de uma planta diferente da mesma que espécie que a planta inoculada. Em alguns casos, as bactérias ou população bacteriana podem ser isoladas de uma espécie relacionada à planta inoculada.

[0255] Em alguns exemplos, as bactérias e populações bacterianas aqui descritas são capazes de se deslocarem para em um tipo de tecido para outro.

Por exemplo, a detecção e isolamento de bactérias e popu- lações bacterianas da presente invenção dentro dos tecidos maduros de plantas depois do revestimento sobre o exterior de uma semente demonstra a capacidade delas para se deslocar do exterior da semente para tecidos vegetativos de uma planta em amadurecimento.

Portanto, em uma modalidade, a população de bactérias e populações bacteria- nas são capazes de se deslocarem do exterior da semente para os tecidos vegetativos de uma planta.

Em uma modalidade, as bactérias e populações bacterianas que são revestidas sobre a semente de uma planta são capazes de, quando da germinação da semente em um estado vegetativo, ser localizadas em um tecido diferente da planta.

Por exemplo, as bactérias e populações bacterianas podem ser capazes de ser localizadas em qualquer um dos tecidos na planta, incluindo: a raiz, raiz adventícia, raiz seminal, pelo radicular, ramo, folha, flor, broto, pen- dão, meristema, pólen, pistilo, ovários, estame, fruto, estolão, rizoma, nódulo, tubérculo, tricoma, células-guarda, hidatódio, pétala, sépala, gluma, ráquis, câmbio vascular, floema e xilema.

Em uma modalidade, as bactérias e populações bacterianas são capazes de ser localizadas na raiz e/ou no pelo radicular da planta.

Em outra modalidade, as bactérias e populações bacterianas são capazes de ser localizadas nos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e ranis da planta.

Em outros casos, as bactérias e populações bacterianas são localizadas nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, xilema e floema.

Em ainda outra modalidade, as bactérias e populações bacterianas são capazes de ser localizadas nos tecidos reprodutivos (flor, pólen, pistilo, ovários, estame, fruto) da planta.

Em outra modalidade, as bactérias e popula- ções bacterianas são capazes de ser localizadas na raiz, ramos, folhas e tecidos reprodutivos da planta.

Em ainda outra modalidade, as bacté- rias e populações bacterianas colonizam um tecido de fruto ou semente da planta. Em ainda outra modalidade, as bactérias e populações bac- terianas são capazes de colonizar a planta de tal modo que estão presentes na superfície da planta (ou seja, sua presença pode ser detectada no exterior da planta ou episfera da planta). Em ainda outras modalidades, as bactérias e populações bacterianas são capazes de ser localizadas em substancialmente todos ou em todos os tecidos da planta. Em certas modalidades, as bactérias e populações bacterianas não são localizadas na raiz de uma planta. Em outros casos, as bacté- rias e populações bacterianas não são localizadas nos tecidos fotossin- téticos da planta.

[0256] A efetividade das composições pode também ser avaliada medindo-se a maturidade relativa da cultura ou a unidade térmica da cultura (CHU). Por exemplo, a população bacteriana pode ser aplicada ao milho, e o crescimento do milho pode ser avaliado de acordo com a maturidade relativa dos grãos de milho ou o tempo até que os grãos de milho estejam com massa máxima. A unidade térmica da cultura (CHU) pode também ser usada para predizer a maturidade da cultura de milho. A CHU determina a quantidade de calor acumulado medindo-se as temperaturas diárias máximas durante o crescimento da cultura.

[0257] Em exemplos, as bactérias podem ser localizadas em qual- quer um dos tecidos na planta, incluindo: a raiz, raiz adventícia, raiz seminal, pelo radicular, ramo, folha, flor, botão, pendão, meristema, pólen, pistilo, ovários, estame, fruto, estolão, rizoma, nódulo, tubérculo, tricoma, células-guarda, hidatódio, pétala, sépala, gluma, ráquis, câm- bio vascular, floema e xilema. Em outra modalidade, a bactéria ou popu- lação bacteriana é capaz de ser localizada nos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e ramos da planta. Em outros casos, a bactéria e populações bacterianas são localizadas nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e floema. Em outra modalidade, a bacté- ria ou população bacteriana é capaz de ser localizada em tecidos reprodutivos (flor, pólen, pistilo, ovários, estame ou fruto) da planta. Em outra modalidade, as bactérias e populações bacterianas são capazes de ser localizadas na raiz, ramos, folhas e tecidos reprodutivos da plan- ta. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana coloniza um tecido de fruto ou semente da planta. Em ainda outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de colonizar a planta tal que esteja presente na superfície da planta. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de ser localizada em substancialmente todos ou em todos os tecidos da planta. Em certas modalidades, a bac- téria ou população bacteriana não é localizada na raiz de uma planta. Em outros casos, as bactérias e populações bacterianas não são loca- lizadas nos tecidos fotossintéticos da planta.

[0258] A efetividade das composições bacterianas aplicadas a cul- turas pode ser avaliada medindo-se várias características do crescimen- to da cultura incluindo, entre outros, taxa de plantio, vigor da semeadura, força radicular, tolerância à seca, altura da planta, perda de umidade dos grãos (dry down) e peso volumétrico. Espécies vegetais

[0259] Os métodos e as bactérias aqui descritos são adequados fora qualquer uma de uma variedade de plantas, como plantas nos gêneros Hordeum, Oryza, Zea e Triticeae. Outros exemplos não limi- tantes de plantas adequadas incluem musgos, líquens e algas. Em alguns casos, as plantas têm valor econômico, social e/ou ambiental, como culturas alimentares, culturas fibrosas, culturas oleaginosas, plantas de espécies florestais ou das indústrias de polpa e papel, matéria-prima para produção de biocombustível e/ou plantas ornamen- tais. Em alguns exemplos, as plantas podem ser usadas para gerar produtos de valor econômico como um grão, uma farinha, um amido, um xarope, uma refeição, um óleo, um filme, uma embalagem, um produto nutracêutico, uma polpa, uma ração para animais, uma ração para peixes, uma forragem para peixes, um material a granel para substâncias químicas industriais, um produto de cereal, um produto alimentar processado para humanos, um açúcar, um álcool e/ou uma proteína. Exemplos não limitantes de plantas de cultura incluem milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, milheto, aveia, centeio, triticale, trigo sarraceno, milho doce, cana de açúcar, cebola, tomate, morango e aspargo.

[0260] Em alguns exemplos, as plantas que podem ser obtidas ou melhoras utilizando os métodos e a composição aqui revelados podem incluir plantas que são importantes ou interessantes para agricultura, horticultura, biomassa para produção de moléculas de biocombustível e outras substâncias químicas e/ou silvicultura. Alguns exemplos dessas plantas podem incluir abacaxi, banana, coco, lírio, plantas de ervilha e gramíneas; e plantas dicotiledôneas, como, por exemplo, ervilhas, alfafa, tomatilo, melão, grão de bico, chicória, trevo, couve frisada, lentilha, soja, tabaco, batata, batata doce, rabanete, repolho, colza, macieiras, videira, algodoeiro, girassol, Aradopsis thaliana, canola, citros (incluindo laranja, mandarina, kumquat, limão, lima, toranja, tangerina, tangelo, cidra e pomelo), pimenta, feijão, alface, Panicum virgatum (switchgrass), Sorgo bicolor (sorgo, Sudão), Miscanthus giganteus (miscanthus), Saccharum sp. (cana energia), Populus balsamifera (choupo), Zea mays (milho), Glycine max (soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algo- dão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfafa), Beta vulgaris (beterraba), Pennisetum glaucum (milheto), Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Secale cereale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum - trigo X centeio), bambu, Carthamus tinctorius (açafrão), Jatropha curcas (Jatropha), Ricinus communis (rícino), Elaeis guineensis (palmeira oleaginosa), Phoenix dactylifera (tamareira), Archontophoenix cunninghamiana (palmeira do rei), Syagrus romanzoffiana (palmeira da rainha), Linum usitatissimum (linhaça), Brassica juncea, Manihot esculenta (madioca), Lycopersicon esculentum (tomato), Lactuca saliva (alface), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve de Bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimenta malagueta e doce), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (abóbora), Cucurbita moschata (abóbora), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum melongena (berinjela), Papaver somniferum (papoula dormideira), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis saliva, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Coichicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpureia, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guaiúle), Hevea spp. (seringueira), Mentha spicata (hortelã), Mentha piperita (hortelã), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (carvo), Petunia spp. (petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsétia), Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (tremoço-branco), Uniola paniculata (aveia), Hordeum vulgare (cevada) e Lolium spp. (centeio).

[0261] Em alguns exemplos, pode ser utilizada uma planta monocotiledônea. As planta monocotiledônea pertencem às ordens de Alismatales, Arales, Arecales, Bromeliales, Commelinales, Cyclanthales, Cyperales, Eriocaulales, Hydrocharitales, Juncales, Lilliales, Najadales, Orchidales, Pandanales, Poales, Restionales, Triuridales, Typhales e Zingiberales. As plantas que pertencem à classe das Gymnospermae são Cycadales, Ginkgoales, Gnetales e Pinales. Em alguns exemplos, a planta monocotiledônea pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, cevada e cana de açúcar.

[0262] Em alguns exemplos, pode ser utilizada uma planta dicotiledônea, incluindo aquelas pertencentes às ordens de Aristochiales, Asterales, Batales, Campanulales, Capparales, Caryophyllales, Casuarinales, Celastrales, Cornales, Diapensales, Dilleniales, Dipsacales, Ebenales, Ericales, Eucomiales, Euphorbiales, Fabales, Fagales, Gentianales, Geraniales, Haloragales, Hamamelidales, Middles, Juglandales, Lamiales, Laurales, Lecythidales, Leitneriales, Magniolales, Malvales, Myricales, Myrtales, Nymphaeales, Papeverales, Piperales, Plantaginales, Plumb aginales, Podostemales, Polemoniales, Poligalales, Polygonales, Primulales, Proteales, Rafflesiales, Ranunculales, Rhamnales, Rosales, Rubiales, Salicales, Santales, Sapindales, Sarraceniaceae, Scrophulariales, Theales, Trochodendrales, Umbellales, Urticales e Violates. Em alguns exemplos, a planta dicotiledônea pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em algodão, soja, pimenta e tomate.

[0263] Em alguns casos, a planta a ser melhorada não é rapidamen- te receptiva a condições experimentais. Por exemplo, uma planta de cultura pode demorar demais para crescer o suficiente para avaliar praticamente um atributo melhorado em série ao longo de múltiplas iterações. Assim, uma primeira planta da qual as bactérias são inicial- mente isoladas e/ou a pluralidade de plantas às quais bactérias geneticamente manipuladas são aplicadas podem ser planta modelo, tal como uma planta mais receptiva à avaliação sob condições desejadas. Exemplos não limitantes de plantas modelo incluem Setaria, Brachypodium e Arabidopsis. A capacidade de bactérias isoladas de acordo com um método da invenção, usando uma planta modelo, pode então ser aplicada a uma planta de outro tipo (p. ex., uma planta de cultura) para confirmar a delegação do atributo melhorado.

[0264] Os atributos que podem ser melhorados pelos métodos aqui revelados incluem qualquer característica observável da planta, incluin- do, por exemplo, taxa de crescimento, altura, massa, cor, sabor, odor, variações na produção de uma ou mais compostos pela planta (incluin- do por exemplo, metabólitos, proteínas, fármacos, carboidratos, óleos e quaisquer outros compostos). A seleção de plantas com base em infor- mações genotípicas é também contemplada (por exemplo, incluindo o padrão de expressão gênica da planta em resposta às bactérias, ou identificar a presença de marcador genéticos, como aqueles associados com maior fixação do nitrogênio). As plantas podem também ser selecionadas com base na ausência, supressão ou inibição de certa característica ou atributo (como uma característica ou atributo indese- jável) ao contrário da presença de certa característica ou atributo (como uma característica ou atributo desejável). Concentrações e taxas de aplicação de composições agrícolas

[0265] Como mencionado antes, as composições agrícolas da pre- sente invenção, que podem compreender um micróbio ensinado, podem ser aplicadas a plantas de múltiplas maneiras. Em dois aspectos em particular, a invenção contempla um tratamento no sulco ou um trata- mento de sementes.

[0266] Para modalidades de tratamento de sementes, os micróbios da invenção podem estar presentes na semente em uma variedade de concentrações. Por exemplo, os micróbios podem ser encontrados em um tratamento de sementes em uma concentração cfu, por semente, de: 1 × 101, 1 × 102, 1 × 103, 1 × 104, 1 × 105, 1 × 106, 1 × 107, 1 × 108, 1 × 109, 1 × 1010 ou mais. Em aspectos em particular, as composições para o tratamento de sementes compreendem entre aproximadamente 1 × 104 e 1 × 108 cfu por semente. Em outros aspectos em particular, as composições para o tratamento de sementes compreendem entre aproximadamente 1 × 105 e 1 × 107 cfu por semente. Em outros aspec- tos, as composições para o tratamento de sementes compreendem entre aproximadamente 1 × 106 cfu por semente.

[0267] Nos Estados Unidos, cerca de 10% da área de milho é plan- tada com uma densidade de semente acima de aproximadamente

36.000 sementes por área; 1/3 da área de milho é plantado com uma densidade de semente entre aproximadamente 33.000 e 36.000 sementes por área; 1/3 da área de milho é plantado com uma densidade de semente entre aproximadamente 30.000 e 33.000 sementes por área, e o restante da área é variável. Ver, “Corn Seeding Rate Considerations”, escrito por Steve Butzen, disponível em: https://www.pioneer.com/home/site/us/agronomy/library/corn-seeding- rate-considerations/.

[0268] A Tabela 2 abaixo utiliza várias concentrações cfu por semente em uma modalidade contemplada de tratamento de sementes (linhas perpendiculares) e várias densidades de semente na área de plantio (1a coluna: 15K-41K) para calcular a quantidade total de cfu por área, as quais seriam utilizadas em vários cenários agrícolas (ou seja, concentração por semente × densidade de sementes plantadas por área do tratamento de sementes). Assim, se fosse utilizado um tratamento de sementes com 1 × 106 cfu por semente e 30.000 sementes da planta por área, então, o teor total em cfu por área seria 3 × 1010 (ou seja, 30K * 1 × 106).

[0269] Tabela 2: Cálculo de CFU total por área para modalidades de tratamento de sementes População de milho (ou seja, sementes 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 1.00E+06 1.00E+07 1.00E+08 1.00E+09 por área)

15.000 1,50E+06 1,50E+07 1,50E+08 1,50E+09 1,50E+10 1,50E+11 1,50E+12 1,50E+13

16.000 1,60E+06 1,60E+07 1,60E+08 1,60E+09 1,60E+10 1,60E+11 1,60E+12 1,60E+13

17.000 1,70E+06 1,70E+07 1,70E+08 1,70E+09 1,70E+10 1,70E+11 1,70E+12 1,70E+13

18.000 1,80E+06 1,80E+07 1,80E+08 1,80E+09 1,80E+10 1,80E+11 1,80E+12 1,80E+13

19.000 1,90E+06 1,90E+07 1,90E+08 1,90E+09 1,90E+10 1,90E+11 1,90E+12 1,90E+13

20.000 2,00E+06 2,00E+07 2,00E+08 2,00E+09 2,00E+10 2,00E+11 2,00E+12 2,00E+13

21.000 2,10E+06 2,10E+07 2,10E+08 2,10E+09 2,10E+10 2,10E+11 2,10E+12 2,10E+13

22.000 2,20E+06 2,20E+07 2,20E+08 2,20E+09 2,20E+10 2,20E+11 2,20E+12 2,20E+13

23.000 2,30E+06 2,30E+07 2,30E+08 2,30E+09 2,30E+10 2,30E+11 2,30E+12 2,30E+13

24.000 2,40E+06 2,40E+07 2,40E+08 2,40E+09 2,40E+10 2,40E+11 2,40E+12 2,40E+13

25.000 2,50E+06 2,50E+07 2,50E+08 2,50E+09 2,50E+10 2,50E+11 2,50E+12 2,50E+13

26.000 2,60E+06 2,60E+07 2,60E+08 2,60E+09 2,60E+10 2,60E+11 2,60E+12 2,60E+13

27.000 2,70E+06 2,70E+07 2,70E+08 2,70E+09 2,70E+10 2,70E+11 2,70E+12 2,70E+13

28.000 2,80E+06 2,80E+07 2,80E+08 2,80E+09 2,80E+10 2,80E+11 2,80E+12 2,80E+13

29.000 2,90E+06 2,90E+07 2,90E+08 2,90E+09 2,90E+10 2,90E+11 2,90E+12 2,90E+13

30.000 3,00E+06 3,00E+07 3,00E+08 3,00E+09 3,00E+10 3,00E+11 3,00E+12 3,00E+13

31.000 3,10E+06 3,10E+07 3,10E+08 3,10E+09 3,10E+10 3,10E+11 3,10E+12 3,10E+13

32.000 3,20E+06 3,20E+07 3,20E+08 3,20E+09 3,20E+10 3,20E+11 3,20E+12 3,20E+13

33.000 3,30E+06 3,30E+07 3,30E+08 3,30E+09 3,30E+10 3,30E+11 3,30E+12 3,30E+13

34.000 3,40E+06 3,40E+07 3,40E+08 3,40E+09 3,40E+10 3,40E+11 3,40E+12 3,40E+13

35.000 3,50E+06 3,50E+07 3,50E+08 3,50E+09 3,50E+10 3,50E+11 3,50E+12 3,50E+13

36.000 3,60E+06 3,60E+07 3,60E+08 3,60E+09 3,60E+10 3,60E+11 3,60E+12 3,60E+13

37.000 3,70E+06 3,70E+07 3,70E+08 3,70E+09 3,70E+10 3,70E+11 3,70E+12 3,70E+13

38.000 3,80E+06 3,80E+07 3,80E+08 3,80E+09 3,80E+10 3,80E+11 3,80E+12 3,80E+13

39.000 3,90E+06 3,90E+07 3,90E+08 3,90E+09 3,90E+10 3,90E+11 3,90E+12 3,90E+13

40.000 4,00E+06 4,00E+07 4,00E+08 4,00E+09 4,00E+10 4,00E+11 4,00E+12 4,00E+13

41.000 4,10E+06 4,10E+07 4,10E+08 4,10E+09 4,10E+10 4,10E+11 4,10E+12 4,10E+13

[0270] Para modalidades no sulco, os micróbios da invenção podem ser aplicados a uma concentração cfu por área de: 1 × 106, 3,20 × 1010, 1,60 × 1011, 3,20 × 1011, 8,0 × 1011, 1,6 × 1012, 3,20 × 1012 ou mais. Portanto, em aspectos, as composições líquidas no sulco podem ser aplicadas a uma concentração entre aproximadamente 1 × 106 e 3 × 1012 cfu por área.

[0271] Em alguns aspectos, as composições no sulco estão conti- das em uma formulação líquida. Nas modalidades de líquido nos sulco, os micróbios podem estar presentes a uma concentração cfu por mililitro de: 1 × 101, 1 × 102, 1 × 103, 1 × 104, 1 × 105, 1 × 106, 1 × 107, 1 × 108, 1 × 109, 1 × 1010, 1 × 1011, 1 × 1012, 1 × 1013 ou mais. Em certos aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios a uma concentração entre aproximadamente 1 × 106 e 1 × 1011 cfu por mililitro. Em outros aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios a uma concentração entre aproximadamente 1 × 107 e 1 × 1010 cfu por mililitro. Em outros aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios a uma concentração entre aproxima- damente 1 × 108 e 1 × 109 cfu por mililitro. Em outros aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios a uma concen- tração de até aproximadamente 1 × 1013 cfu por mililitro. Exemplos

[0272] Os exemplos fornecidos abaixo descrevem métodos de isolamento bacteriano, análise de bactérias e plantas e melhoramento de atributos de plantas. Os exemplos são para fins ilustrativos somente e não devem ser interpretados como limitações de modo algum. Exemplo 1: Determinação do perfil transcriptômico de micróbios candidatos

[0273] A determinação do perfil transcriptômico da cepa CI010 foi realizada para identificar promotores que são ativos na presença de nitrogênio ambiental. A Cepa CI010 foi cultivada em um meio definido, livre de nitrogênio, suplementado com glutamina 10 mM. O RNA total foi extraído dessas culturas (Kit QIAGEN RNeasy) e submetido ao sequen- ciamento RNAseq por intermédio de Illumina HiSeq (SeqMatic, Fremont CA). As leituras do sequenciamento foram mapeadas contra os dados do genoma de CI010 utilizando Geneious, e genes de alta expressão sob o controle de promotores transcricionais proximais foram identifica- dos.

[0274] As Tabelas 3 e 4 listam genes e seus níveis de expressão relativa conforme medidos através do sequenciamento RNASeq do

RNA total.

Sequências dos promotores proximais foram registradas para uso em mutagênese de vias nif, vias relacionadas à utilização de nitrogênio, vias relacionadas à colonização, ou outro genes com um nível de expressão desejado.

Tabela 3 Nome Mínimo Máximo Comprimento Sentido

CDS lipoproteína mureína 2.929.898 2.930.134 237 dianteiro

CDS proteína de membrana 5.217.517 5.217.843 327 dianteiro

CDS proteína de ligação ao zinco/cádmio 3.479.979 3.480.626 648 dianteiro

CDS proteína transportadora de acila 4.563.344 4.563.580 237 dianteiro

CDS ompX 4.251.002 4.251.514 513 dianteiro

CDS HU-beta proteína de ligação ao DNA 375.156 375.428 273 dianteiro

CDS sspA 629.998 630.636 639 reverso

CDS tatE 3.199.435 3.199.638 204 reverso

CDS repressor LexA 1.850.457 1.851.065 609 dianteiro

CDS hisS <3999979 4.001.223 >1245 dianteiro

Tabela 4 Expressão RNASeq_ RNASeq_ RNASeq_WT diferencial Razão da nifL – nifL – contagem - Contagem RNASeq_WT - confiança Expressão Contagem bruta bruta de bruta de contagem bruta Nome absoluta diferencial de leituras transcritos leituras de transcritos CDS lipoproteína 1000 -1,8 12950,5 10078,9 5151,5 4106,8 mureína CDS proteína de 1000 -1,3 9522,5 5371,3 5400 3120 membrana CDS proteína de ligação ao 3,3 1,1 6461 1839,1 5318 1550,6 zinco/cádmio CDS proteína transportadora de 25,6 1,6 1230,5 957,6 1473,5 1174,7 acila CDS ompX 1,7 1,1 2042 734,2 1687,5 621,5 CDS HU-beta proteína 6,9 -1,3 1305 881,7 725 501,8 de ligação ao DNA CDS sspA 0,2 1 654 188,8 504,5 149,2 CDS tatE 1,4 1,3 131 118,4 125 115,8 CDS repressor LexA 0,1 -1,1 248 75,1 164 50,9 CDS hisS 0 -1,1 467 69,2 325 49,3

Exemplo 2: Mutagênese de micróbios candidatos

Knockouts mediados por lambda red

[0275] Geraram-se diversos mutantes de micróbios candidatos usando o plasmídeo pKD46 ou um derivado contendo um marcador de resistência à canamicina (Datsenko at al. 2000; PNAS 97(12): 6640- 6645). Os cassetes de knockout (silenciamento) foram desenhados com homologia de 250bp flanqueando o gene alvo e gerados via PCR com extensão da sobreposição. Os micróbios candidatos foram transforma- dos com pKD46, cultivados na presença de arabinose para induzir a expressão do maquinário Lambda-Red, preparados para eletroporação e transformados com os cassetes de knockout para produzir cepas mutantes candidatas. Quatro micróbios candidatos e uma cepa de laboratório, Klebsiella oxytoca M5A1, foram utilizados para gerar treze mutantes candidatos dos genes reguladores da fixação do nitrogênio nifL, glnB, e amtB, como mostrado na Tabela 5.

[0276] Tabela 5: Lista de mutantes de knockout único criados atra- vés de mutagênese pelo sistema Lambda-red Cepa Mutagênese oligo-dirigida com seleção utilizando Cas9

[0277] Usou-se mutagênese oligo-dirigida para direcionar altera- ções genômicas para o gene rpoB em E. coli DH10B, e mutantes foram selecionados com um sistema CRISPR-Cas. Foi projetado um oligo mutagênico (ss1283: “G*T*T*G*ATCAGACCGATGTTCGGACCTTCcaagGTTTCGATCGGA

CATACGCGACCGTAGTGGGTCGGGTGTACGTCTCGAACTTCAAAG CC” (SEQ ID NO: 2), onde * indica ligação fosforotioato) para conferir resistência à rifampicina através de uma mutação 4-bp ao gene rpoB. Células contendo um plasmídeo codificador de Cas9 foram induzidas a expressarem Cas9, preparadas para eletroporação e, a seguir, eletro- poradas com o oligo mutagênico e um plasmídeo codificador da expres- são constitutiva de um RNA guia (gRNA) direcionado para clivagem por Cas9 da sequência de rpoB WT. As células eletroporadas foram recu- peradas em meio não seletivo durante a noite para permitir segregação suficiente dos cromossomos mutantes resultantes. Depois de plaquea- mento em meio para seleção do plasmídeo codificador de gRNA, duas em dez colônias rastreadas mostraram conter a mutação desejada, enquanto o resto revelou ser mutantes de escape gerados através de mutação do protoespaçador no plasmídeo de gRNA ou perda do plasmí- deo de Cas9. Mutagênese mediada por lambda-red e seleção com Cas9

[0278] Geraram-se mutantes dos micróbios candidatos CI006 e CI010 por intermédio de mutagênese pelo sistema lambda-red com seleção por CRISPR-Cas. Os cassetes de knockout continham um promotor endógeno identificado através do perfil transcricional (como representado nas Tabelas 3-4) e regiões com homologia de ~250bp flanqueando o alvo da deleção. CI006 e CI010 foram transformados com plasmídeos codificadores do sistema de recombinação Lambda-red (genes exo, beta, gam), sob o controle de um promotor induzível por arabinose, e Cas9 sob o controle de um promotor induzível por IPTG. Os sistemas de recombinação Red e Cas9 foram induzidos em trans- formantes resultantes, e cepas foram preparadas para eletroporação. Cassetes de knockout e gRNA de seleção codificado por um plasmídeo foram subsequentemente transformados nas células competentes. Depois de plaqueamento em meio seletivo com antibióticos para o plasmídeo de Cas9 e o plasmídeo de gRNA, 7 das 10 colônias rastrea- das revelaram a mutação pretendida por knockout. Exemplo 3: Fenotipagem in planta de micróbios candidatos Colonização de plantas por micróbios candidatos

[0279] A colonização de plantas hospedeiras desejadas por um micróbio candidato foi quantificada através de experimentos de cresci- mento vegetal de curta duração. Plantas de milho foram inoculadas com cepas que expressam RFP quer a partir de um plasmídeo ou de um cassete de expressão de RFP integrado a Tn5. As plantas foram cultiva- das em meio com areia esterilizada e turfa não esterilizada, e a inocu- lação foi realizada introduzindo 1 mL de cultura celular com uma pipeta diretamente sobre o coleóptilo da planta emergente três dias após a germinação. Os plasmídeos foram mantidos regando as plantas com uma solução contendo o antibiótico adequado. Depois de três semanas, raízes da planta foram coletadas, enxaguadas três vezes com água estéril para remover o solo visível e divididas em duas amostras. Uma amostra de raiz foi analisada por microscopia de fluorescência para identificar padrões de localização de micróbios candidatos. A microsco- pia foi realizada em raízes intactas mais finas da planta com 10 mm de comprimento.

[0280] Um segundo método quantitativo para avaliar a colonização foi desenvolvido. Realizou-se um ensaio de PCR quantitativa em prepa- rados de DNA inteiro das raízes de plantas inoculadas com os endófitos. Sementes de milho (Dekalb DKC-66-40) foram germinadas em areia previamente submetida à autoclave em um vaso de 2,5 polegadas por 2,5 polegadas por 10 polegadas (6,4 cm x 6,4 cm x 25,4 cm). Um dia depois do plantio, 1 mL de cultura de endófitos durante a noite (meio SOB) foi esguichado (drenched) bem no ponto onde a semente estava localizada. 1 mL dessa cultura durante a noite é quase equivalente a 109 cfu, variando dentro de 3 vezes uma da outra, dependente de qual cepa está sendo utilizada. Cada plântula foi fertilizada 3x com 50 mL de solução modificada de Hoagland, suplementada com nitrato de amônio quer a 2,5m M ou 0,25 mM. Quatro semanas depois do plantio, amos- tras de raízes foram coletadas para extração de DNA. Resíduos do solo foram lavados usando pulverização com água pressurizada. Essas amostras de tecido foram, a seguir, homogeneizadas com QIAGEN Tissuelyzer e o DNA foi então extraído usando o QIAmp DNA Mini Kit (QIAGEN) de acordo com o protocolo recomendado. Realizou-se o ensaio de qPCR com Stratagene Mx3005P RT-PCR nesses extratos de DNA usando iniciadores que foram desenhados (com o Iniciador BLAST do NCBI) para serem específicos para um lócus no genoma de cada endófito. A presença das cópias do genoma dos endófitos foi quantifi- cada. Para confirmar ainda mais a identidade dos endófitos, os produtos de amplificação por PCR foram sequenciados e confirmado que tinham a sequência correta. O resumo do perfil de colonização da cepa CI006 e CI008 a partir de micróbios candidatos são apresentados na Tabela

6. Uma taxa de colonização de até 107x cfu/g fw de raiz foi demostrada na cepa CI008. Tabela 6: Colonização do milho conforme medida por qPCR Cepa Taxa de colonização (CFU/g fw) CI006 1,45 x 105 CI008 1,24 x 107 Determinação do perfil de RNA in planta

[0281] A Biossíntese de componentes da via nif in planta foi estimada medindo-se a transcrição de genes nif. RNA total foi obtido do tecido de raiz de plantas inoculadas com CI006 (métodos de plantio como descritos anteriormente). Realizou-se a extração de RNA usando o RNEasy Mini Kit de acordo com o protocolo recomendado (QIAGEN). O RNA total desses tecidos vegetais foi então analisado com os kits

Nanostring Elements (NanoString Technologies, Inc.) usando sondas que eram específicas para os genes nif no genoma da cepa CI006. Os dados da expressão de genes nif in planta são resumidos na Tabela 7. A expressão de genes nifH foi detectada em plantas inoculados pelas cepas CM013 ao passo que a expressão de nifH não foi detectável em plantas inoculadas com CI006. A cepa CM013 é uma derivada da cepa CI006 na qual o gene nifL foi silenciado (knocked out).

[0282] Genes altamente expressos de CM011, classificados por transcritos por milhão de quilobases (TPM), foram medidos in planta sob condição fertilizada. Os promotores controladores da expressão de alguns desses genes altamente expressos foram usados como moldes para recombinação homóloga em loci direcionados para fixação e assimilação do nitrogênio. Extraíram-se amostras de RNA de plantas inoculadas com CM011, cultivadas em estufa, o rRNA foi removido com o kit Ribo-Zero, sequenciado usando a plataforma Truseq da Illumina e mapeado de volta contra o genoma de CM011. Genes altamente expresso de CM011 estão listados na Tabela 8. Tabela 7: Expressão de nifH in planta Cepas Expressão relativa de transcritos CI006 9,4 CM013 103,25 Tabela 8 Contagem bruta de TPM (Transcritos por milhão Nome do gene Localização do gene Sentido leituras de quilobases) rpsH CDS 18196 - 18588 reverso 4841,5 27206,4 rplQ CDS 11650 - 12039 reverso 4333 24536,2 rpsJ CDS 25013 - 25324 reverso 3423 24229 rplV CDS 21946 - 22278 reverso 3367,5 22333 rpsN CDS 18622 - 18927 reverso 2792 20150,1 rplN CDS 19820 - 20191 reverso 3317 19691,8 rplF CDS 17649 - 18182 reverso 4504,5 18628,9 rpsD CDS 13095 - 13715 reverso 5091,5 18106,6 rpmF CDS 8326 - 8493 dianteiro 1363,5 17923,8

Contagem bruta de TPM (Transcritos por milhão Nome do gene Localização do gene Sentido leituras de quilobases)

rplW CDS 23429 - 23731 reverso 2252 16413,8 rpsM CDS 14153 - 14509 reverso 2269 14036,2 rplR CDS 17286 - 17639 reverso 2243,5 13996,1 rplC CDS 24350 - 24979 reverso 3985 13969,2 rplK CDS 25526 - 25954 reverso 2648,5 13634,1 rplP CDS 20807 - 21217 reverso 2423 13019,5 rplX CDS 19495 - 19809 reverso 1824 12787,8 rpsQ CDS 20362 - 20616 reverso 1460,5 12648,7 bhsA 3 CDS 79720 - 79977 reverso 1464 12531,5 rpmC CDS 20616 - 20807 reverso 998,5 11485 rpoA CDS 12080 - 13069 reverso 4855 10830,2 rplD CDS 23728 - 24333 reverso 2916,5 10628,5 bhsA 1 CDS 78883 - 79140 reverso 1068 9141,9 rpsS CDS 22293 - 22571 reverso 1138,5 9011,8 rpmA CDS 2210 - 2467 dianteiro 1028,5 8803,7 rpmD CDS 16585 - 16764 reverso 694,5 8520,8 rplB CDS 22586 - 23410 reverso 3132 8384 rpsC CDS 21230 - 21928 reverso 2574,5 8133,9 rplE CDS 18941 - 19480 reverso 1972,5 8066,9 rplO CDS 16147 - 16581 reverso 1551 7874,2

Subunidade SecY CDS da pré-proteína 14808 - 16139 reverso 4657 7721,2 translocase rpsE CDS 16771 - 17271 reverso 1671,5 7368 rpsK CDS 13746 - 14135 reverso 1223,5 6928,2 tufA CDS 27318 - 28229 reverso 2850 6901,3 rpmI CDS 38574 - 38771 dianteiro 615 6859,5 rplU CDS 1880 - 2191 dianteiro 935,5 6621,7 rplT CDS 38814 - 39170 dianteiro 1045 6464,4 bhsA 2 CDS 79293 - 79550 reverso 754 6454,1 rpmB CDS 8391 - 8627 reverso 682 6355,1 rplJ CDS 23983 - 24480 reverso 1408 6243,9 fusA 2 CDS 481 - 2595 reverso 5832 6089,6 rpsA CDS 25062 - 26771 reverso 4613 5957,6 rpmJ CDS 14658 - 14774 reverso 314 5926,9 rpsR CDS 52990 - 53217 dianteiro 603 5840,7 rpsG CDS 2692 - 3162 reverso 1243 5828,2 rpsI CDS 11354 - 11746 reverso 980,5 5509,8 cspC 1 CDS 8091 - 8300 reverso 509 5352,8 rpsF CDS 52270 - 52662 dianteiro 916 5147,4 rpsT CDS 55208 - 55471 reverso 602 5035,9 infC CDS 38128 - 38478 dianteiro 755 4750,3 cspG CDS 30148 - 30360 dianteiro 446 4624,2

Exemplo 4: Compatibilidade entre geografia

[0283] A capacidade dos micróbios melhorados para colonizar uma planta inoculada é fundamental para o sucesso da planta em condições no campo. Embora os métodos descritos para o isolamento sejam projetados para selecionar micróbios do solo que podem exibem uma relação íntima com plantas de cultura como o milho, muitas cepas podem não colonizar efetivamente em uma série de genótipos vegetais, ambientes, tipos de solo ou condições de inoculação. Como a coloni- zação é um processo complexo que requer um conjunto de interações entre uma cepa microbiana e a planta hospedeira, o rastreamento referente à competência para colonização tornou-se um método centrar para selecionar cepas com prioridade para o desenvolvimento futuro. Inicialmente, tentou-se avaliar a colonização usando marcação fluores- cente das cepas, o que era eficaz, mas demandava muito tempo e não era escalável com base em cepas individuais. Como a atividade de colonização não é passível de melhoria direta, é imperativo que os produtos candidatos potenciais sejam selecionados de cepas que são colonizadoras naturais.

[0284] Delineou-se um ensaio para testar colonização robusta das cepas do tipo selvagem em qualquer dada planta hospedeira usando iniciadores de qPCR desenhados para serem cepa-específicos em uma amostra de comunidade. Esse ensaio destina-se a medir rapidamente a taxa de colonização dos micróbios de amostras de tecidos do milho. Os testes iniciais usando cepas avaliadas como colonizadoras prováveis por microscopia de fluorescência e técnicas baseadas em placas indi- caram que uma abordagem com qPCR seria quantitativa e escalável.

[0285] Um ensaio típico é realizado como segue: Plantas, princi- palmente variedades de milho e trigo, são cultivadas em uma mistura de turfa para vasos na estufa com 6 réplicas por cepa. Quatro ou cinco dias depois do plantio, um esguicho (drench) de 1 mL de culturas na fase estacionária inicial de bactérias diluídas para OD590 de 0,6-1,0 (aproximadamente 5E+08 CFU/mL) é administrado com pipeta sobre o coleóptilo emergente. As plantas são regadas com água corrente somente e deixadas crescer por quatro semanas antes da amostragem, quando então, as plantas são desenraizadas e as raízes lavadas abun- dantemente para remover a maioria dos resíduos de turfa. Amostras de raiz limpas são removidas e homogeneizadas para criar uma pasta de resíduos celulares da planta e células bacterianas associadas. Desen- volveu-se um protocolo para extração de DNA de alto rendimento que efetivamente produziu uma mistura de planta e DNA bacteriano para usar como molde para qPCR. Tendo por base experimentos spike-in (pico) em células bacterianas, esse processo de extração de DNA fornece uma amostra quantitativa do DNA bacteriano em relação à massa fresca das raízes. Cada cepa é avaliada usando iniciadores cepa-específicos desenhados por intermédio do Iniciador BLAST (Ye 2012) e comparados à amplificação de fundo de plantas não inoculadas. Como alguns iniciadores exibem off-target amplificação fora do alvo em plantas não inoculadas, a colonização é determinada quer pela presen- ça de amplificação ou amplificação elevada do produto correto em comparação ao nível de fundo.

[0286] Usou-se esse ensaio para medir a compatibilidade do produ- to microbiano entre diferentes geografias do solo. As qualidades do solo no campo e as condições do campo podem ter uma influência imensa sobre o efeito de um produto microbiano. O pH do solo, a capacidade de retenção de água e micróbios competitivos são apenas alguns poucos exemplos de fatores no solo que podem afetar a sobrevivência do inóculo e a capacidade de colonização. Realizou-se um ensaio de colonização usando três tipos diversos de solo de campos agrícolas na Califórnia como o meio de crescimento das plantas (Figura 1A). Uma densidade intermediária de inoculação foi empregada para aproximação com as condições reais de agricultura. Em até 3 semanas, a Cepa 5 colonizou todas as plantas com 1E+06 a 1E+07 CFU/g FW. Depois de 7 semanas de crescimento das plantas, uma versão desenvolvida da Cepa 1 exibiu altas taxas de colonização (1E+06 CFU/g FW) em todos os tipos de solo (Figura 1B).

[0287] Além disso, para avaliar a colonização na complexidade de condições do campo, foi iniciado um ensaio em campo de 1 acre em San Luis Obispo em junho de 2015 para avaliar os impactos e a coloni- zação de sete das cepas do tipo selvagem em duas variedades de milho de campo. O delineamento agronômico e a execução do estudo foram executados por uma organização contratada para pesquisa em campo, Pacific Ag Research. Para inoculação, empregou-se a mesma técnica de revestimento de sementes em cultura com turfa, testada no experi- mento dos métodos de inoculação. No decorrer da estação de cultivo, foram coletadas amostras de plantas para avaliar a colonização na raiz e no interior do caule. Coletaram-se amostras de três parcelas em dupli- cata de cada tratamento em quatro e oito semanas depois do plantio, e de todas as seis réplicas de cada tratamento um pouco da colheita em 16 semanas. Amostras adicionais foram coletadas de todas as seis parcelas de tratamento, em duplicata, inoculadas com a Cepa 1 e a Cepa 2, bem como de controles não tratados, em 12 semanas. Os números de células por grama massa fresca de raízes lavadas foram avaliadas tal como em outros ensaios de colonização com qPCR e iniciadores cepa-específicos. Duas cepas, Cepa 1 e Cepa 2, mostraram colonização consistente e generalizada de raízes que atingiu o pico em 12 semanas e então declinou precipitadamente (Figura 1C). Embora aparentasse estar presente em números em uma ordem de magnitude inferior à da Cepa 1, a Cepa 2 foi encontrada em números mais consis- tentes de planta para planta. Nenhuma cepa pareceu colonizar eficaz- mente o interior do caule. Em apoio aos dados de colonização por qPCR, ambas as cepas voltaram a ser isoladas com sucesso das amos- tras de raízes usando plaqueamento e sequenciamento de 16S para identificar isolados de sequências concordantes. Exemplo 5: Melhoramento genético microbiano

[0288] Os exemplos de melhoramento genético microbiano podem ser resumidos no desenho esquemático da Figura 2A. A Figura 2A representa o melhoramento genético microbiano em que a composição do microbioma pode ser inicialmente medido e uma espécie de interes- se é identificada. O metabolismo do microbioma pode ser mapeado e vinculado à genética. Depois disso, uma variação genética direcionada pode ser introduzida usando métodos que incluem, entre outros, conju- gação e recombinação, mutagênese química, evolução adaptativa e edição gênica. Derivados dos micróbios são utilizados para inocular culturas. Em alguns exemplos, são selecionadas as culturas com os melhores fenótipos.

[0289] Como mostrado na Figura 2A, a composição do microbioma pode ser inicialmente medida e uma espécie de interesse é identificada. A Figura 2B representa uma vista ampliada da medição da etapa no microbioma. O metabolismo do microbioma pode ser mapeado e vincu- lado à genética. O metabolismo de nitrogênio pode envolver a entrada de amônia (NH4+) desde a rizosfera para o citosol das bactérias através do transportador AmtB. Amônia e L-glutamato (L-Glu) são catalisados pela glutamina sintetase e ATP a glutamina. Glutamina pode levar à formação de biomassa (crescimento vegetal), e pode também inibir a expressão do óperon nif. Depois disso, uma variação genética direcio- nada pode ser introduzida empregando métodos que incluem, entre outros, conjugação e recombinação, mutagênese química, evolução adaptativa e edição gênica Derivados dos micróbios são utilizados para inocular culturas. As culturas com os melhores fenótipos são seleciona- das.

Exemplo 6: Ensaios em campo com micróbios da invenção

[0290] Uma diversidade de bactérias fixadoras de nitrogênio pode ser encontrada na natureza, incluindo em solos agrícolas. No entanto, o potencial de um micróbio para fornecer nitrogênio suficiente para culturas que permita diminuir o uso de fertilizantes pode ser restringido pela repressão de genes nitrogenase em solos fertilizados, bem como baixa abundância em associação íntima com as raízes da cultura. A identificação, isolamento e melhoramento genético de micróbios que estão intimamente associados com culturas comerciais importantes poderiam romper e melhorar as redes de regulação, vinculadas à detec- ção de nitrogênio e fixação do nitrogênio, e desbloquear contribuições significativas do nitrogênio por micróbios associados às culturas. Para tanto, identificaram-se micróbios fixadores de nitrogênio que se associam com e colonizam o sistema radicular do milho.

[0291] Amostras de raízes de plantas de milho cultivadas em solos agronomicamente relevantes foram coletadas, e populações microbianas extraídas da rizosfera e endosfera. Extraiu-se o DNA genômico dessas amostras, seguido por sequenciamento do amplicon 16S para determinar o perfil da composição da comunidade. Um micróbio Kosakonia sacchari (cepa PBC6.1) foi isolado e classificado através de sequenciamento do 16S rRNA e do genoma inteiro. Este é um fixador de nitrogênio especialmente interessante, capaz de colonizar com até quase 21% de abundância da microbiota associada à raiz (Figura 4). Para avaliar a sensibilidade ao nitrogênio exógeno da cepa, mediram-se taxas de fixação do nitrogênio na cultura pura com o ensaio clássico de redução de acetileno (ARA) e níveis variáveis de suplemen- tação com glutamina. A espécie exibiu um nível elevado da atividade de fixação do nitrogênio em meio livre de nitrogênio, embora nitrogênio exógeno fixado reprimisse a expressão de genes nif e a atividade da nitrogenase (Cepa PBC6.1, Figura 3C). Além disso, quando a amônia liberada foi medida no sobrenadante de PBC6.1 cultivado em condições fixadoras de nitrogênio, muito pouca liberação de nitrogênio fixado pôde ser detectada.

[0292] Levantou-se a hipótese de que PBC6.1 poderia contribuir significativamente para nitrogênio fixado em campos fertilizados, se as redes de regulação que controlam o metabolismo do nitrogênio fossem religadas para permitir a expressão ótima de nitrogenase e a liberação de amônia na presença de nitrogênio fixado. Deve existir diversidade genética suficiente dentro do genoma de PBC6.1 para permitir amplo remodelamento fenotípico sem a inserção de transgenes ou elementos reguladores sintéticos. A cepa isolada tem um genoma de genoma de pelo menos 5,4 Mbp e um cluster canônico de genes de fixação do nitrogênio. As vias relacionadas ao metabolismo do nitrogênio em PBC6.1 são semelhantes àquelas do organismo modelo para fixação do nitrogênio, Klebsiella oxytoca m5al.

[0293] Diversos nós da rede gênica reguladora foram identificados que podem aumentar a fixação do nitrogênio e a transferência subse- quente para uma planta hospedeira, especialmente em concentrações exógenas elevadas de nitrogênio fixado (Figura 3A). O óperon nifLA regula diretamente o resto do cluster de nif através da ativação transcricional por NifA e a repressão de NifA dependente de nitrogênio e oxigênio por NifL. A disrupção de nifL pode abolir a inibição de NifA e melhorar a expressão de nif na presença de oxigênio e de nitrogênio fixado exógeno. Além do mais, a expressão de nifA sob o controle de um promotor independente de nitrogênio pode dissociar a biossíntese de nitrogenase da regulação pelo complexo de detecção de nitrogênio NtrB/NtrC. A assimilação de nitrogênio fixado pelo micróbio para gluta- mina pela glutamina sintetase (GS) é regulada reversivelmente pela enzima de dois domínios adeniltransferase (ATase) de GlnE, através da adenilação e desadenilação de GS, para atenuar e restaurar a atividade,

respectivamente. O truncamento da proteína GlnE para deletar seu domínio de remoção de adenila (AR) pode levar à glutamina sintetase constitutivamente adenilada, limitando a assimilação de amônia pelo micróbio e aumentando a amônia intra e extracelular. Finalmente, reduzir a expressão de AmtB, o transportador responsável pela absor- ção de amônia, poderia aumentar a quantidade de amônia extracelular. Para gerar fenótipos microbianos projetados racionalmente sem o uso de transgenes, empregaram-se duas abordagens: criar deleções markerless (sem marcadores) de sequências genômicas que codificam domínios proteicos ou genes inteiros, e religar as redes de regulação por rearranjo do promotor intragenômico. Através de um processo itera- tivo de mutagênese, foram geradas diversas cepas não transgênicas derivadas de PBC6.1 (Tabela 9).

[0294] Tabela 9. Lista de cepas isoladas e derivadas usadas nesse trabalho. Prm, sequência do promotor derivada do genoma de PBC6.1; ΔglnEAR1 e ΔglnEAR2, versões truncadas diferentes do gene glnE que remove a sequência do domínio removedor de adenila.

ID da cepa Espécie Genótipo CI006 K. sacchari Tipo selvagem DH10B E. coli PBC6.1 K. sacchari WT PBC6.14 K. sacchari ΔnifL::Prm1 PBC6.15 K. sacchari ΔnifL::Prm5 PBC6.22 K. sacchari ΔnifL::Prm3 PBC6.37 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE AR2 PBC6.38 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnEAR1

ID da cepa Espécie Genótipo PBC6.93 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE AR2 ΔamtB PBC6.94 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE AR1 ΔamtB

[0295] Realizaram-se diversos ensaios in vitro para caracterizar fenótipos específicos das cepas derivadas. O ensaio ARA foi usado para avaliar a sensibilidade da cepa ao nitrogênio exógeno, em que PBC6.1 exibiu repressão da atividade de nitrogenase em concentrações eleva- das de glutamina. Em contraste, a maioria das cepas derivadas mos- tram um fenótipo desreprimido com níveis variáveis de redução do acetileno, observados em concentrações elevadas de glutamina. As taxas de transcrição de nifA em amostras analisadas por qPCR correla- cionaram-se bem com as taxas de redução de acetileno, apoiando a hipótese de que a disrupção nifL e a inserção de um promotor indepen- dente de nitrogênio para dirigir nifA pode levar à desrepressão do cluster de nif. Cepas com atividade alterada de GlnE ou AmtB revelaram taxas de excreção de amônio acentuadamente aumentadas quando compa- radas a cepas do tipo selvagem ou derivadas sem essas mutações, ilus- trando o efeito desses genótipos sobre a assimilação e reabsorção de amônia.

[0296] Realizaram-se dois experimentos para estudar a interação de derivados de PBC6.1 com plantas de milho e quantificar a incorpora- ção de nitrogênio fixado em tecidos das plantas. Inicialmente, foram quantificadas as taxas de fixação do nitrogênio dos micróbios em um estudo em estufa usando traçadores isotópicos. Resumidamente, as plantas são cultivadas com fertilizante marcado com 15N, e concentra- ções diluídas de 15N em tecidos das plantas indicam contribuições de nitrogênio fixado pelos micróbios. Plântulas de milho foram inoculadas com cepas microbianas selecionadas, e as plantas foram cultivadas até o estágio V6 de crescimento. As plantas foram subsequentemente desconstruídas para permitir a medição de colonização microbiana e expressão gênica, bem como a medição das razões 15N/14N em teci- dos das plantas por espectrometria de massas de razão isotópica (IRMS). A análise do tecido aéreo mostrou uma contribuição pequena, não significativa por PBC6.38 para os níveis de nitrogênio das plantas, e uma contribuição significativa por PBC6.94 (p=0,011). Aproxima- damente 20% do nitrogênio encontrado acima de folhas trituradas do milho foi produzido por PBC6.94, com o restante vindo da semente, da mistura para vasos ou fixação “de fundo” por outros micróbios no solo. Isso ilustra que a pipeline de melhoramento genético microbiano da invenção pode gerar cepas capazes de contribuições significativas de nitrogênio a plantas na presença de fertilizante nitrogenado. A transcri- ção microbiana dentro de tecidos das plantas foi medida, e a expressão do cluster de genes nif foi observada em cepas derivadas, mas não na cepa do tipo selvagem, mostrando a importância da desrepressão de nif para contribuição de BNF para culturas em condições de fertilizadas. A colonização de raízes, medida por qPCR, demonstrou que a densidade de colonização é diferente para cada uma das cepas testadas. Uma diferença de 50 vezes na colonização foi observada entre PBC6.38 e PBC6.94. Essa diferença pode ser uma indicação de que PBC6.94 possui menos aptidão na rizosfera em relação a PBC6.38 como resultado de níveis elevados de fixação e excreção. Métodos Meios

[0297] O meio mínimo contém (por litro) 25 g de Na2HPO4, 0,1 g de CaCL2-2H2O, 3 g de KH2PO4, 0,25 g de MgSO4·7H2O, 1 g de NaCl, 2,9 mg de FeCl3, 0,25 mg de Na2MoO4·2H2O e 20 g de sacarose. O meio de crescimento é definido como meio mínimo suplementado com 50 mL de glutamina 200 mM por litro. Isolamento de diazotróficos

[0298] Plântulas de milho foram cultivadas desde semente (DKC 66-40, DeKalb, IL) por duas semanas em um ambiente de estufa com temperatura controlada de 22 ºC (noite) a 26 ºC (dia) e expostas a ciclos de 16 horas de luz em solo coletado do Condado de San Joaquin, CA. As raízes foram colhidas e lavadas com água deionizada estéril para remover resíduos do solo. Os tecidos das raízes foram homogeneizados com esferas de aço inoxidável de 2 mm em um instrumento para lise de tecidos (TissueLyser II, Qiagenm P/N 85300) por três minutos em confi- guração 30, e as amostras foram centrifugadas por 1 minuto a 13.000 rpm para separar o tecido de bactérias associadas às raízes. Os sobrenadantes foram divididos em duas frações, e uma foi usada para caracterizar o microbioma, através do sequenciamento do amplicon 16S rRNA, e a fração restante foi diluída e plaqueada em meio com Caldo livre de Nitrogênio (NfB) suplementado com ágar 1,5%. As placas foram incubadas a 30ºC por 5-7 dias. As colônias surgidas foram testadas quanto à presença do gene nifH por PCR da colônia com os iniciadores Ueda19f e Ueda406r. O DNA genômico de cepas com PCR de colônia positiva para nifH foi isolado (QIAamp DNA Mini Kit, Cat. No 51306, QIAGEN, Alemanha) e sequenciado (Illumina MiSeq v3, SeqMatic, Fremont, CA). Após a montagem e anotação das sequências, os isola- dos que continham clusters de genes para fixação do nitrogênio foram utilizados na pesquisa subsequente. Determinação do perfil do microbioma de plântulas do isolamento

[0299] DNA genômico foi isolado de bactérias associadas à raiz usando o kit ZR-96 Genomic DNA I (Zymo Research, P/N D3011), e amplicons de 16S rRNA foram gerados com iniciadores com código de barra nextera direcionados para 799f e 1114r. As bibliotecas de amplicons foram purificadas e sequenciadas com a plataforma Illumina MiSeq v3 (SeqMatic, Fremont, CA). As leituras foram classificadas taxo- nomicamente por meio de Kraken usando o banco de dados minikraken.

Ensaio de redução de acetileno (ARA)

[0300] Usou-se uma versão modificada do ensaio de redução de acetileno para medir a atividade nitrogenase em condições de cultura pura. Cepas foram propagadas a partir de uma única colônia em SOB (RPI, P/N S25040-1000) a 30ºC com agitação a 200 RPM por 24 horas e então subcultivadas 1:25 em meio de crescimento e cultivadas em condições aeróbicas por 24 horas (30ºC, 200 RPM). 1 mL da cultura em meio mínimo foi então adicionado a 4 mL de meio mínimo suplementado com glutamina 0 a 10 mM em tubos Hungate herméticos e cultivada em condições anaeróbicas por 4 horas (30ºC, 200 RPM). 10% do headspace foram removidos e, então, substituídos por volume igual de acetileno por injeção, e a incubação continuou por 1 hora. Subsequente- mente, 2 mL do headspace foram removidos através de seringa à prova de gás para quantificação da produção de etileno utilizando um cromato- grafo gasoso Agilent 6850 equipado com um detector por ionização de chama (FID). Ensaio de excreção de amônio

[0301] A excreção de nitrogênio fixado na forma de amônia foi medi- da por meio de fermentação em batelada em biorreatores anaeróbicos. Cepas foram propagadas a partir de uma única colônia a 1 mL/cavidade de SOB em uma placa DeepWell de 96 cavidades. A placa foi incubada a 30ºC com agitação a 200 RPM por 24 horas e então diluída 1:25 em uma placa fresca contendo 1 mL/cavidade de meio de crescimento. As células foram incubadas por 24 horas (30°C, 200 RPM) e então diluídas 1:10 em uma placa fresca contendo meio mínimo. A placa foi transferida para uma câmara anaeróbica com uma mistura gasosa de >98,5% de nitrogênio, 1,2-1,5% de hidrogênio e oxigênio <30 ppM e incubada a 1350 RPM, temperatura ambiente por 66-70 horas. A biomassa inicial da cultura foi comparada à biomassa final pela densidade óptica medida a 590 nm. As células foram então separadas por centrifugação, e o sobrenadante do caldo do reator foi analisado quanto à amônia livre usando o kit Megazyme Ammonia Assay (P/N K-AMIAR) normalizada para biomassa em cada momento. Extração do microbioma associado a raiz

[0302] As raízes foram agitadas gentilmente para remover partícu- las soltas, e os sistemas radiculares foram separados e embebidos em uma solução de estabilização de RNA (Thermo Fisher P/N AM7021) por 30 minutos. As raízes foram então brevemente enxaguadas com água deionizada estéril. As amostras foram homogeneizadas usando a técnica de bead beating (agitação com esferas) com rolamentos de aço inoxidável de ½ polegada em um instrumento para lise de tecidos (TissueLyser II, Qiagen P/N 85300) em 2 mL de tampão de lise (Qiagen P/N 79216). A extração do DNA genômico foi realizada com o kit ZR-96 Quick-gDNA (Zymo Research, P/N D3010), e a extração de RNA com o kit RNeasy (Qiagen P/N 74104). Ensaio de colonização de raízes

[0303] Quatro dias depois do plantio, 1 mL de uma cultura bacteria- na durante a noite (aproximadamente 109 cfu) foi aplicado ao solo acima de sementes plantadas. As plântulas foram fertilizadas três vezes por semana com 25 mL de solução modificada de Hoagland, suplementada com nitrato de amônio 0,5 mM. Quatro semanas depois do plantio, amostras de raízes foram coletadas e o DNA genômico total (gDNA) foi extraído. A colonização de raízes foi quantificada por qPCR com inicia- dores desenhados para amplificar regiões exclusivas do genoma da cepa do tipo selvagem ou de derivadas. A eficiência da reação QPCR foi medida usando uma curva padrão gerada a partir de uma quantidade conhecida de gDNA do genoma alvo. Os dados foram normalizados para cópias do genoma por g de massa fresca usando a massa de teci- do e o volume de extração. Para cada experimento, os números de colo- nização foram comparados aos de plântulas controle não tratadas.

Transcriptômica in planta

[0304] Os perfis de transcrição de micróbios associados à raiz foram medidos em plântulas cultivadas e processadas como descrito no Ensaio de colonização de raízes. RNA purificado foi sequenciado usan- do a plataforma Illumina NextSeq (SeqMatic, Fremont, CA). As leituras foram mapeadas contra o genoma da cepa inoculada utilizando os parâmetros bowtie2 de “--very-sensitive-local“ e escore mínimo para alinhamento de 30. A cobertura através do genoma foi calculada por meio de Samtools. A cobertura diferencial foi normalizada para expres- são de genes housekeeping (constitutivos) e visualizada através do genoma, usando Circos, e através do cluster de genes nif gene usando DNAplotlib. Além disso, o perfil transcricional in planta foi quantificado por intermédio de análise Nanostring. O RNA purificado foi processado em um nCounter Sprint (Core Diagnostics, Hayward, CA). Estudo de diluição de 15N em estufa

[0305] Realizou-se um experimento de diluição do fertilizante 15N para avaliar atividade otimizada de cepas in planta. Um meio de plantio, contendo N mínimo de fundo, foi preparado com uma mistura de vermi- culita e areia lavada (5 enxaguadas em H2O DI). A mistura arenosa foi submetida à autoclave por 1 hora a 122°C, e aproximadamente 600 g medidos para vasos de 40 polegadas cúbicas (656 mL), os quais foram saturados com DI H2O DI estéril e deixados escorrer 24 horas antes do plantio. Sementes de milho (DKC 66-40) tiveram a superfície esteriliza- da com hipoclorito de sódio 0,625% por 10 minutos, então foram enxa- guados cinco vezes em água destilada estéril e plantados com 1 cm de profundidade. As plantas foram mantidas debaixo de lâmpadas fluores- centes por quatro semanas com dia de 16 horas de comprimento a temperaturas ambientes em média de 22°C (noite) a 26°C (dia).

[0306] Cinco dias depois do plantio, as plântulas foram inoculadas com 1 mL de uma suspensão de células, esguichado diretamente sobre o coleóptilo emergente. O inóculo foi preparado a partir de 5 mL de cultu- ras durante a noite em SOB, as quais foram centrifugadas e ressuspen- sas duas vezes em 5 mL de PBS para remover SOB residual SOB antes da diluição final para OD de 1,0 (aproximadamente 109 CFU/mL). Plan- tas controle foram tratadas com PBS estéril, e cada tratamento foi apli- cado a dez réplicas das plantas.

[0307] As plantas foram fertilizadas com 25 mL de solução fertili- zante, contendo 2% de KNO3 2 mM, enriquecido com 15N, em 5, 9, 14 e 19 dias depois do plantio, e a mesma solução sem KNO3 em 7, 12, 16 e 18 dias depois do plantio. A solução fertilizante continha (por litro) CaCl2 3 mmol, KH2PO4 0,5 mmol, MgSO4 2 mmol, FeSO4 17,9 µmol, H3BO3 2,86 mg, MnCl2•4H2O 1,81 mg, ZnSO4•7H2O 0,22 mg, CuSO4•5H2O 51 µg , Na2MoO4•2H2O 0,12 mg e NiCl2 0,14 nmol. Todos os vasos foram regados com H2O DI estéril necessária para manter umidade consistente do solo sem escoamento.

[0308] Em quatro semanas, as plantas foram colhidas e separadas no nó mais baixo em amostras para extração de gDNA e RNA da raiz e do tecido aéreo por IRMS. Os tecidos aéreos foram limpos conforme necessário para remover a areia, colocados inteiros em sacos de papel e secos por pelo menos 72 horas a 60°C. Uma vez completamente seco, o tecido aéreo total foi homogeneizado por bead beating e amostras de 5-7 mg foram analisadas por espectrometria de massas de razão isotó- pica (IRMS) para δ15N pelo MBL Stable Isotope Laboratory (The Ecosystems Center, Woods Hole, MA). O NDFA percentual foi calculado utilizando a fórmula seguinte: % de NDFA = (δ15N de UTC médio - δ15N de amostra) / (δ15N de UTC médio) x 100. Exemplo 7: Métodos e ensaios para detecção de micróbios modificados não intergenéricos

[0309] A presente invenção ensina iniciadores, sondas e ensaios que são úteis para detectar os micróbios utilizados nos vários Exemplos mencionados acima. Os ensaios são capazes de detectar as sequên- cias com “junções” de nucleotídeos não naturais nos micróbios deriva- dos/mutantes não intergenéricos. Essas junções de nucleotídeos não naturais podem ser utilizadas como um tipo de diagnóstico que é indica- tivo da presença de uma alteração genética específica em um micróbio.

[0310] As presentes técnicas são capazes de detectar essas jun- ções de nucleotídeos não naturais via a utilização de métodos de PCR quantitativa especializada, incluindo iniciadores e sondas desenhados exclusivamente. As sondas podem ligar-se às sequências com junções de nucleotídeos não naturais. Ou seja, é possível utilizadas sondas de DNA para sequências específicas que consistem em oligonucleotídeos que são marcados com um repórter fluorescente, o qual permite a detec- ção somente depois da hibridização da sonda com sua sequência com- plementar. Os métodos quantitativos conseguem assegurar que somen- te a junção de nucleotídeos não naturais será amplificada com os inicia- dores ensinados e que, consequentemente, pode ser detectada via um corante não específico, ou via a utilização de uma sonda de hibridização específica. Outro aspecto do método é a escolha de iniciadores tais que os iniciadores flanqueiem qualquer lado de uma sequência com junção, de tal modo que que, se ocorrer uma reação de amplificação, então a dita sequência com junção está presente.

[0311] Consequentemente, o DNA genômico pode ser extraído de amostras e usado para quantificar a presença de micróbios da invenção por meio de qPCR. Os iniciadores utilizados na reação qPCR podem ser iniciadores desenhados por Iniciador Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/iniciador-blast/) para amplificar regiões exclusivas do genoma do tipo selvagem ou regiões exclusivas das cepas mutantes modificadas não intergenéricas. A reação qPCR pode ser realizada com o kit SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal (Thermo Fisher, P/N 11762100), usando somente iniciadores dianteiro e reverso para a amplificação; alternativamente, o kit Kapa Sonda Force (Kapa Biosystems, P/N KK4301) pode ser utilizado com iniciadores de amplificação e uma sonda TaqMan contendo uma marcação com corante FAM na extremidade 5’, um quencher interno ZEN e um ligante do sulco estreito e um quencher fluorescente na extremidade 3’ (Integrated DNA Technologies). Tabela 10: Micróbios modificados não intergenéricos Nome da cepa Genótipo Sequência CI006 16S rDNA - contig 5 ttgaagagtt tgatcatggc tcagattgaa cgctggcggc aggcctaaca catgcaagtc gaacggtagc acagagagct tgctctcggg tgacgagtgg cggacgggtg agtaatgtct gggaaactgc ctgatggagg gggataacta ctggaaacgg tagctaatac cgcataacgt cgcaagacca aagaggggga ccttcgggcc tcttgccatc agatgtgccc agatgggatt agctagtagg tggggtaacg gctcacctag gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggccttcggg ttgtaaagca ctttcagcgg ggaggaaggg agtaaggtta ataaccttat tcattgacgt tacccgcaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg cggtctgtca agtcggatgt gaaatccccg ggctcaacct gggaactgca tccgaaactg gcaggcttga gtctcgtaga gggaggtaga attccaggtg tagcggtgaa atgcgtagag atctggagga ataccggtgg cgaaggcggc ctcctggacg aagactgacg ctcaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcta tttggaggtt gtgcccttga ggcgtggctt ccggagctaa cgcgttaaat agaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tggtcttgac atccacagaa ctttccagag atggattggt gccttcggga actgtgagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tatcctttgt tgccagcggt ccggccggga actcaaagga gactgccagt gataaactgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat ggcccttacg accagggcta cacacgtgct acaatggcgc atacaaagag aagcgacctc gcgagagtaa gcggacctca taaagtgcgt cgtagtccgg attggagtct gcaactcgac tccatgaagt cggaatcgct agtaatcgtg gatcagaatg ccacggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt gcaaaagaag taggtagctt aaccttcggg agggcgctta ccactttgtg attcatgact ggggtgaagt cgtaacaagg taaccgtagg ggaacctgcg gttggatcac ctcctt CI006 16S rDNA - contig 8 ttgaagagtt tgatcatggc tcagattgaa cgctggcggc aggcctaaca catgcaagtc gaacggtagc acagagagct tgctctcggg tgacgagtgg cggacgggtg agtaatgtct gggaaactgc ctgatggagg gggataacta ctggaaacgg tagctaatac cgcataacgt cgcaagacca aagaggggga ccttcgggcc tcttgccatc agatgtgccc agatgggatt agctagtagg tggggtaacg gctcacctag gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggccttcggg ttgtaaagca ctttcagcgg ggaggaaggn antanggtta ataacctgtg ttnattgacg ttacccgcag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgcag gcggtctgtc aagtcggatg tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc atccgaaact ggcaggcttg agtctcgtag

Nome da cepa Genótipo Sequência agggaggtag aattccaggt gtagcggtga aatgcgtaga gatctggagg aataccggtg gcgaaggcgg cctcctggac gaagactgac gctcaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgtct atttggaggt tgtgcccttg aggcgtggct tccggagcta acgcgttaaa tagaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctggtcttga catccacaga acttagcaga gatgctttgg tgccttcggg aactgtgaga caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg ttgtgaaatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttatcctttg ttgccagcgg ttaggccggg aactcaaagg agactgccag tgataaactg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac gaccagggct acacacgtgc tacaatggcg catacaaaga gaagcgacct cgcgagagta agcggacctc ataaagtgcg tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc tagtaatcgt ggatcagaat gccacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtgggt tgcaaaagaa gtaggtagct taaccttcgg gagggcgctt accactttgt gattcatgac tggggtgaag tcgtaacaag gtaaccgtag gggaacctgc ggttggatca cctcctt Exemplo 8: Identificação de Kliebsiella variicola e Kosakonia sacchari.

[0312] As sequências do gene 16S rRNA usadas para estudar filogenia e taxonomia bacterianas tem sido até o momento o marcador marcador genético housekeeping mais comum – e por vários motivos. Esses motivos incluem (i) sua presença em quase todas as bactérias, existindo frequentemente como uma família de múltiplos genes, ou óperons; (ii) a função do gene 16S rRNA não mudou com o passar do tempo, sugerindo que mudanças aleatórias na sequência são uma medida mais exata do tempo (evolução); e (iii) o gene 16S rRNA (1.500 bp) é suficientemente grande para fins de informática.

[0313] A sequência de nucleotídeos do gene 16S rRNA de Klebsiella variicola e Kosakonia sacchari foi determinada por análise com PCR. Os iniciadores utilizados são iniciadores 16S universais, com a sequência de nucleotídeos seguinte: Iniciador Dianteiro 16S 27f (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) Iniciador Reverso 165 1492r (GGTTACCTTGTTACGACTT).

[0314] Os produtos resultantes da PCR foram sequenciados, e a sequência resultante foi comparada contra o banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) para identificação da espécie durante o isolamento original. Em qualquer produção subse- quente do micróbio, conduziu-se a mesma análise por PCR para assegurar um micróbio puro verificado que fosse livre de contaminação.

[0315] Foram identificadas duas cepas parentais por esse método. O nome científico da primeira é Klebsiella variicola. A identidade da espécie foi determinada por sequenciamento do 16S rRNA do organis- mo, múltiplas vezes, usando BLAST no banco de dados do NCBI para verificação do gênero e da espécie. Além disso, o genoma inteiro do organismo foi sequenciado e o 16S rRNA extraído (da sequência do genoma) foi submetido ao BLAST. Essa sequência foi alinhada às sequências de 16 rRNA anteriormente determinadas a fim de confirmar que o organismo foi isolado para uma cultura pura.

[0316] O nome científico do segundo organismo é Kosakonia sacchari. A identidade da espécie foi determinada por sequenciamento do 16S rRNA do organismo, múltiplas vezes, usando BLAST no banco de dados do NCBI para verificação do gênero e da espécie. Além disso, o genoma inteiro do organismo foi sequenciado e o 16S rRNA extraído (da sequência do genoma) foi submetido ao BLAST. Essa sequência foi alinhada às sequências de 16 rRNA anteriormente determinadas a fim de confirmar que o organismo foi isolado para uma cultura pura. Exemplo 9: Cepas remodeladas com maior colonização ou atividade de fixação do nitrogênio

[0317] Foram desenvolvidas diversas cepas mutantes cepas para investigar novas modificações que pudessem aumentar a capacidade de colonização a, a atividade de fixação do nitrogênio ou a excreção de nitrogênio. Essas cepas estão resumidas na Tabela 11. As sequências do promotor e do gene estão listadas na Tabela 12. As cepas remode- ladas foram avaliadas em relação ao tipo selvagem, ou às cepas paren- tais, para confirmar a expressão alterada do gene modificado (Figuras 5, 12 e 13), para atividade de redução do nitrogênio (Figuras 6, 18, 20, 22A, 22B, 24, 26A, 26B, 34 e 36), excreção de nitrogênio (Figuras 14, 15, 16, 17, 19, 21, 23A, 23B, 25, 27A, 27B, 33 e 35), colonização in vitro

(Figuras 7, 8, 9, 10, 11) e colonização em estufa (Figuras 28, 29, 30, 31, 32, 37 e 38). O ensaio de excreção de amônio foi realizado como des- crito abaixo.

Alguns dados estão ainda resumidos nas Tabelas 13 e 14. Tabela 11: Cepas remodeladas ID da cepa Espécie Genótipo (cromossomo) Plasmídeos Curado?

6-1098 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE ΔamtB Prm2-fahB PB401, PB402, pUC-CI6- não fhaB-prm-gRNA 462 E. coli F–endA1 deoR+ recA1 galE15 galK16 nupG rpsL nenhum N/A Δ(lac)X74 φ80lacZΔM15 araD139 Δ(ara,leu)7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) StrR λ–

6-1076 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1ΔamtB fhaB_prm1 PB401, PB402, pUC-CI6- não fhaB-prm-gRNA 6-1077 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1ΔamtB fhaB_prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não fhaB-prm-gRNA 6-1094 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB yjbE2_prm1 PB401, PB402, pUC-CI6- não yjbE_2-prm-gRNA 6-1095 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB yjbE2_prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não yjbE_2-prm-gRNA 6-1096 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB fhaB_prm9 PB401, PB402, pUC-CI6- não fhaB-prm-gRNA 6-1097 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2ΔamtB fhaB_prm1 PB401, PB402, pUC-CI6- não fhaB-prm-gRNA 6-1098 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2ΔamtB fhaB_prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não fhaB-prm-gRNA 6-1099 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB fhaB_prm9 PB401, PB402, pUC-CI6- não fhaB-prm-gRNA 6-1103 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB yjbE2_prm1 PB401, PB402, pUC-CI6- não yjbE_2-prm-gRNA 6-1104 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB yjbE2_prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não yjbE_2-prm-gRNA 6-1105 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB yjbE2_prm9 PB401, PB402, pUC-CI6- não yjbE_2-prm-gRNA 6-1106 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB bcsII_prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não bcsII-prm-gRNA 6-1107 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB bcsIII_prm1 PB401, PB402, pUC-CI6- não bcsIII-prm-gRNA 6-1108 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB bcsIII_prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não bcsIII-prm-gRNA 6-1109 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB bcsIII_prm9 PB401, PB402, pUC-CI6- não bcsIII-prm-gRNA 6-1110 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB pehA-Prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não pehA-prm-gRNA 6-1125 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB pehA-Prm1 PB401, PB402, pUC-CI6- não pehA-prm-gRNA 6-1126 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB bcsIII_prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não bcsIII-prm-gRNA 6-1127 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB bcsIII_prm9 PB401, PB402, pUC-CI6- não bcsIII-prm-gRNA 6-1129 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB ΔglgA PB401, PB402, pUC-CI6- não glgA-del-gRNA 6-1136 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB pehA-Prm9 PB401, PB402, pUC-CI6- não

ID da cepa Espécie Genótipo (cromossomo) Plasmídeos Curado?

pehA-prm-gRNA

6-1137 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB yjbE2_prm9 PB401, PB402, pUC-CI6- não yjbE_2-prm-gRNA 6-1142 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB bcsII_prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não bcsII-prm-gRNA 6-1285 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB yjbE2_prm1 nenhum sim

6-1286 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB yjbE2_prm1 nenhum sim

6-1678 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB bcsIII_prm9 PB401, PB402 não

6-1679 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 bcsIII_prm9 PB401, PB402, pUC-CI6- não bcsIII-prm-gRNA 6-1680 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 bcsIII_prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não bcsIII-prm-gRNA 6-1681 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔglgA PB401, PB402, pUC-CI6- não glgA-del-gRNA 6-1691 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 cysZ-Prm1 PB401, PB402, pUC-CI6- não cysZ-prm-gRNA 6-1692 K. sacchari ΔnifL::Prm5 ΔglnE::KO1 fhaB_prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não fhaB-prm-gRNA 6-1693 K. sacchari ΔnifL::Prm5 ΔglnE::KO1 yjbE2_prm1 PB401, PB402, pUC-CI6- não yjbE_2-prm-gRNA 6-1695 K. sacchari ΔnifL::Prm5 ΔglnE::KO1 bcsIII_prm9 PB401, PB402, pUC-CI6- não bcsIII-prm-gRNA 6-1696 K. sacchari ΔnifL::Prm5 ΔglnE::KO1 otsB-Prm1 PB401, PB402, pUC-CI6- não otsB-prm-gRNA 6-1697 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB treZ-Prm2 otsB- PB401, PB402, pUC-CI6- não Prm1 otsB-prm-gRNA 6-1698 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB treZ-Prm2 otsB- PB401, PB402, pUC-CI6- não Prm2 otsB-prm-gRNA 6-1725 K. sacchari ΔnifL::Prm5 ΔglnE::KO1 otsB-Prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não otsB-prm-gRNA 6-1726 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB treZ-Prm2 cysZ- PB401, PB402, pUC-CI6- não Prm1 cysZ-prm-gRNA 6-1776 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB bcsIII_prm2 pehA- PB401, PB402, pUC-CI6- não Prm9 pehA-prm-gRNA 6-1777 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB yjbE2_prm1 PB401, PB402, pUC-CI6- não pehA-Prm9 pehA-prm-gRNA 6-1778 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB bcsII_prm2 pehA- PB401, PB402, pUC-CI6- não Prm9 pehA-prm-gRNA 6-1779 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB bcsII_prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não yjbE2_prm1 yjbE_2-prm-gRNA 6-1848 K. sacchari ΔnifL::Prm5 ΔglnE::KO1 bcsIII_prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não bcsIII-prm-gRNA 6-1849 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 pehA-Prm9 PB401, PB402, pUC-CI6- não pehA-prm-gRNA 6-1850 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 bcsII_prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não bcsII-prm-gRNA 6-1851 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB bcsIII_prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não yjbE2_prm1 yjbE_2-prm-gRNA 6-1852 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB bcsIII_prm9 pehA- PB401, PB402, pUC-CI6- não Prm9 pehA-prm-gRNA 6-1853 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB bcsIII_prm9 PB401, PB402, pUC-CI6- não yjbE2_prm1 yjbE_2-prm-gRNA 6-1867 K. sacchari ΔnifL::Prm5 ΔglnE::KO1 pehA-Prm9 PB401, PB402, pUC-CI6- não

ID da cepa Espécie Genótipo (cromossomo) Plasmídeos Curado? pehA-prm-gRNA 6-1880 K. sacchari ΔnifL::Prm5 ΔglnE::KO1 bcsII_prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não bcsII-prm-gRNA 6-2063 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔglgA nenhum sim 6-342 K. sacchari ΔnifL::Prm5 ΔglnE::KO1 PB401, PB402, pUC-CI6- não glnE-1-gRNA 6-346 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 PB401, PB402, pUC-CI6- não glnE-1-gRNA 6-404 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 nenhum sim 6-412 K. sacchari ΔnifL::Prm5 ΔglnE::KO1 nenhum sim 6-435 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB PB401, PB402, pUC-CI6- não amtB-1-gRNA 6-848 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO2 ΔamtB nenhum sim 6-881 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB nenhum sim 6-915 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB bcsI-Prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não bcsI-prm-gRNA 6-916 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB cysZ-Prm1 PB401, PB402, pUC-CI6- não cysZ-prm-gRNA 6-921 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB otsB-Prm1 PB401, PB402, pUC-CI6- não otsB-prm-gRNA 6-922 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB otsB-Prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não otsB-prm-gRNA 6-923 K. sacchari ΔnifL::Prm1 ΔglnE::KO1 ΔamtB treZ-Prm2 PB401, PB402, pUC-CI6- não treZ-prm-gRNA CI006 K. sacchari tipo selvagem nenhum N/A PBC6.22 K. sacchari ΔnifL::Prm3 PB401, PB402, pUC-CI6- não nifL-2-gRNA 137-1382 Klebsiella ΔglnE::KO2-v2 ΔnifL-Prm1.2 nenhum sim variicola 137-1586 Klebsiella ΔnifL::PinfC ΔglnE::KO2 nenhum sim variicola 137-1857 Klebsiella ΔnifL::PinfC ΔglnE::KO2 otsB_ATG_prm8.2 nenhum sim variicola 137-1858 Klebsiella ΔnifL::PinfC ΔglnE::KO2 otsB_ATG_prm16.1 nenhum sim variicola 137-1862 Klebsiella ΔglnE::KO2-v2 ΔnifL-Prm1.2 ΔglgA nenhum sim variicola

[0318] Tabela 12: Sequências do promotor e do gene. As sequên- cias do promotor estão listadas em letras minúsculas e as sequências do gene em letras maiúsculas. No caso de mutações por deleção, a sequência antes da deleção está listada em letras minúsculas e a sequência depois da deleção está listada em letras maiúsculas

Espécie Anotação do Sequência do Prm (letras minúsculas)-gene (letras maiúsculas) Observações genótipo Kosakonia bcsII_prm2 tcaccacggcgataaccataggttttcggcgtggccacatccatggtgaatcccactttttccagcacg A sequência gênica é sacchari cgcgccacttcatcgggtcttaaatacatagattttcctcgtcatctttccaaagcctcgccaccttacatg do primeiro gene no actgagcatggaccgtgactcagaaaattccacaaacgaacctgaaaggcgtgattgccgtctggc óperon bcsII cttaaaaattatggtctaaactaaaatttacatcgaaaacgagggaggatcctATGCATAACAA

TGAACCCAAAACGCAGTCAGACCCTACTCTGGGCTATACATTCCAAA ATGATTTTCTGGCGTTAAGTAAGGCATTTTCATTGCCTGAAATTGATT ACGCCGATATTTCCCAGCGAGAACAGTTGGCGGCGGCATTTAAGCG

CTGGCCGCTGCTGGCAGAATTAGCCCGTCAACAATAA Kosakonia bcsIII_prm1 cgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattccc A sequência gênica é sacchari gcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccga do primeiro gene no tggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaa óperon bcsIII, acsAB 2 atttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacat ggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcATGCCTTT

ATTCTTTTCTGTGCAAGATGATAACAACATGAAAAAAATCATCGGAAT TATTTTCACGCTGATGCTGCTGTTATTATCGCTGCTGGTAGTGATTAC TCCCATGAGCAGCGATAAACAATACCTCTTTGGCCTTAGCGTGATGG CAGCGGTATTTATCCTGGGAAGAGTGAAAAGCAAAAAAGCCGTACTG GCAATGCTTTCCCTCTCCGTATTGATGTCGACACGTTATATTTGGTGG CGCGCCACGACAACGCTGCATTTTGATTCGACGGTAGAGATGCTGC TCGGCAGTTTACTTTTTGCTGCGGAAATTTACTCGTGGACGATTTTAC TGCTGGGTTATATTCAAATGGCGTGGCCATTAGAACGCCCGATTGCG CCTTTACCGGCAGATAAATCAACCTGGCCGACCGTCGATATTTATGT CCCCTCTTATAATGAAAGCCTTGAGGTTGTTCGCGATACGGTTCTGG CGGCGCAGTGTATCGAATATCCGCAAGATAAAGTGAAGGTTTATATT CTTGACGACGGAAAGCGCGATGAATTCCGCGATTTCGCCGCTGAAG CGGGCGTTGGGTATATTACCCGCCCGGATAACAGCCACGCCAAAGC CGGTAATCTCAACCACGCGATGACCATCACCCATGGTGAGCTTATCT GCGTGTTCGACTGCGACCACGTGGCAACGCGCGTGTTCCTGCAAGC CACGATTGGCGAGTTTTTCCGCGACGATAAACTGGCGCTGATCCAGA CGCCGCACCACTTCTATTCGCTCGATCCATTTGAGCGCAACCTGACA GCAGCAAAGCGCGTTCCCCACGAAGGGGCGCTGTTCTACGGCCCG GTGCAGCAAGGCAATGACAACTGGAACGCCACGTTCTTCTGCGGCT CCTGCGCGGTGATCCGTCGTAGCGCGCTCAATGAAGTCGGCGGCTT TGCCGTGGAAACCGTGACCGAAGATGCGCATACCGCGCTGAAATTA CAGCGTCGCGGCTGGAACACCGCGTTTCTGGATATTCCGCTGGCGG

CGGGGCTGGCAACCGAGCGTCTGGCGCTGCATGTTAACCAGCG Kosakonia bcsIII_prm2 tcaccacggcgataaccataggttttcggcgtggccacatccatggtgaatcccactttttccagcacg A sequência gênica é sacchari cgcgccacttcatcgggtcttaaatacatagattttcctcgtcatctttccaaagcctcgccaccttacatg do primeiro gene no actgagcatggaccgtgactcagaaaattccacaaacgaacctgaaaggcgtgattgccgtctggc óperon bcsIII, acsAB 2 cttaaaaattatggtctaaactaaaatttacatcgaaaacgagggaggatcctATGCCTTTATT

CTTTTCTGTGCAAGATGATAACAACATGAAAAAAATCATCGGAATTAT TTTCACGCTGATGCTGCTGTTATTATCGCTGCTGGTAGTGATTACTCC CATGAGCAGCGATAAACAATACCTCTTTGGCCTTAGCGTGATGGCAG CGGTATTTATCCTGGGAAGAGTGAAAAGCAAAAAAGCCGTACTGGCA ATGCTTTCCCTCTCCGTATTGATGTCGACACGTTATATTTGGTGGCG CGCCACGACAACGCTGCATTTTGATTCGACGGTAGAGATGCTGCTC GGCAGTTTACTTTTTGCTGCGGAAATTTACTCGTGGACGATTTTACTG CTGGGTTATATTCAAATGGCGTGGCCATTAGAACGCCCGATTGCGCC TTTACCGGCAGATAAATCAACCTGGCCGACCGTCGATATTTATGTCC CCTCTTATAATGAAAGCCTTGAGGTTGTTCGCGATACGGTTCTGGCG GCGCAGTGTATCGAATATCCGCAAGATAAAGTGAAGGTTTATATTCTT GACGACGGAAAGCGCGATGAATTCCGCGATTTCGCCGCTGAAGCGG GCGTTGGGTATATTACCCGCCCGGATAACAGCCACGCCAAAGCCGG TAATCTCAACCACGCGATGACCATCACCCATGGTGAGCTTATCTGCG

Espécie Anotação do Sequência do Prm (letras minúsculas)-gene (letras maiúsculas) Observações genótipo

TGTTCGACTGCGACCACGTGGCAACGCGCGTGTTCCTGCAAGCCAC GATTGGCGAGTTTTTCCGCGACGATAAACTGGCGCTGATCCAGACG CCGCACCACTTCTATTCGCTCGATCCATTTGAGCGCAACCTGACAGC AGCAAAGCGCGTTCCCCACGAAGGGGCGCTGTTCTACGGCCCGGT GCAGCAAGGCAATGACAACTGGAACGCCACGTTCTTCTGCGGCTCC TGCGCGGTGATCCGTCGTAGCGCGCTCAATGAAGTCGGCGGCTTTG CCGTGGAAACCGTGACCGAAGATGCGCATACCGCGCTGAAATTACA GCGTCGCGGCTGGAACACCGCGTTTCTGGATATTCCGCTGGCGGCG

GGGCTGGCAACCGAGCGTCTGGCGCTGCATGTTAACCAGCG Kosakonia bcsIII_prm9 atattgacaccatgacgcgcgtaatgctgattggttctgtgacgctggtaatgattgtcgaaattctgaac A sequência gênica é sacchari agtgccatcgaagccgtagtagaccgtattggtgcagaattccatgaactttccgggcgggcgaagg do primeiro gene no atatggggtcggcggcggtgctgatgtccatcctgctggcgatgtttacctggatcgcattactctggtca óperon bcsIII, acsAB 2 cattttcgataacgcttccagaattcgataacgccctggttttttgcttaaatttggttccaaaatcgccttta gctgtatatactcacagcataactgtatatacacccagggggcgggATGCCTTTATTCTTTT

CTGTGCAAGATGATAACAACATGAAAAAAATCATCGGAATTATTTTCA CGCTGATGCTGCTGTTATTATCGCTGCTGGTAGTGATTACTCCCATG AGCAGCGATAAACAATACCTCTTTGGCCTTAGCGTGATGGCAGCGGT ATTTATCCTGGGAAGAGTGAAAAGCAAAAAAGCCGTACTGGCAATGC TTTCCCTCTCCGTATTGATGTCGACACGTTATATTTGGTGGCGCGCC ACGACAACGCTGCATTTTGATTCGACGGTAGAGATGCTGCTCGGCA GTTTACTTTTTGCTGCGGAAATTTACTCGTGGACGATTTTACTGCTGG GTTATATTCAAATGGCGTGGCCATTAGAACGCCCGATTGCGCCTTTA CCGGCAGATAAATCAACCTGGCCGACCGTCGATATTTATGTCCCCTC TTATAATGAAAGCCTTGAGGTTGTTCGCGATACGGTTCTGGCGGCGC AGTGTATCGAATATCCGCAAGATAAAGTGAAGGTTTATATTCTTGACG ACGGAAAGCGCGATGAATTCCGCGATTTCGCCGCTGAAGCGGGCGT TGGGTATATTACCCGCCCGGATAACAGCCACGCCAAAGCCGGTAAT CTCAACCACGCGATGACCATCACCCATGGTGAGCTTATCTGCGTGTT CGACTGCGACCACGTGGCAACGCGCGTGTTCCTGCAAGCCACGATT GGCGAGTTTTTCCGCGACGATAAACTGGCGCTGATCCAGACGCCGC ACCACTTCTATTCGCTCGATCCATTTGAGCGCAACCTGACAGCAGCA AAGCGCGTTCCCCACGAAGGGGCGCTGTTCTACGGCCCGGTGCAG CAAGGCAATGACAACTGGAACGCCACGTTCTTCTGCGGCTCCTGCG CGGTGATCCGTCGTAGCGCGCTCAATGAAGTCGGCGGCTTTGCCGT GGAAACCGTGACCGAAGATGCGCATACCGCGCTGAAATTACAGCGT CGCGGCTGGAACACCGCGTTTCTGGATATTCCGCTGGCGGCGGGG

CTGGCAACCGAGCGTCTGGCGCTGCATGTTAACCAGCG Kosakonia bcsI-Prm2 tcaccacggcgataaccataggttttcggcgtggccacatccatggtgaatcccactttttccagcacg A sequência gênica é sacchari cgcgccacttcatcgggtcttaaatacatagattttcctcgtcatctttccaaagcctcgccaccttacatg do primeiro gene no actgagcatggaccgtgactcagaaaattccacaaacgaacctgaaaggcgtgattgccgtctggc óperon bcsI cttaaaaattatggtctaaactaaaatttacatcgaaaacgagggaggatcctATGGGTCATTA

CGATGATTTGCAGAGGTTTAAGGACAAGACTCGCAATCAGAAGCACG ATTTTAAGGATCTCTCCGCACAGAACCTCGCACAAGACCAGAGCAAT TGGGCAATCATTAACCAGCTTTCTCCTGCCACGGATGAATCAATGCT GGCAATGGGCGGCCATGTGTCACTGCCTGTCCCGCAATCCGTCGAT CCTGCGCTTTTTGCCGCGCAAGAGCCGGCTGCGTTGGTGGATGATA TTGCACCTGCGCCTGCGTCAACAACTTCTCTGCTAAAAGACGTCGCC AGCCAGCTTGATGCAGTGGCTCCGGCATTCAACGCCGCAGCCTACG CGCCTGCGCCTGCAAGCGTTGCACCGGTTATGCAGATGCCATCGCC TGCAAATCCTTCTTCGGCTCCTGTCAGCTATGCGCGCCTGTTCGCAG CGAAAGCGACGGAGGAGAAGCCCCGCGCGGAAAAAAATCAGCCCTT ACACTCGTTGTTAGAAAGGATCGCTTCATGCCGTTGA

Espécie Anotação do Sequência do Prm (letras minúsculas)-gene (letras maiúsculas) Observações genótipo Kosakonia cysZ-Prm1 cgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattccc sacchari gcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccga tggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaa atttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacat ggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcATGGTTTC

ATCATCCCCGTCTGTTGCTCGCAGCGGCATGTTTTACTTTTCCCAGG GCTGGAAACTGGTCACACTGCCAGGCATTCGTCGCTTTGTGATCTTG CCGTTAATGGTGAATATTTTGCTGATGGGCGGCGCGTTCTGGTGGCT GTTTACCCGCCTGGATAGTTGGATCCCTTCGCTGATGAGCCATGTGC CGGACTGGCTGCAATGGCTGAGCTATTTACTGTGGCCAATTGCCGTT GTCTCAATTCTGTTGGTCTTCGGCTACTTCTTCTCAACCCTTGCGAAC TGGATTGCCGCTCCCTTTAATGGCTTGCTGGCAGAACAGCTGGAAG CACGCCTTACCGGCGCGACACCACCCGACGTCGGCGTTTTTGGGCT GCTCAAAGATGTACCGCGCATCATGAAGCGCGAATGGCAAAAACTG GCCTGGTATCTGCCCCGCGCCTTGCTGCTGCTGGTGCTTTATTTTAT TCCCGGTATTGGGCAAACCGTCGCCCCGGTGCTGTGGTTCCTGTTC AGTGCGTGGATGTTGGCTATCCAGTATTGCGACTATCCGTTTGATAA CCATAAGGTGCCGTTTAAAGCGATGCGCGTTTCCTTGCGCGAACGC AAGGTTATTAATATGCAATTCGGTGCGCTCACCAGCCTGTTTACGAT GATTCCGGTGTTGAATTTGGTCGTGATGCCCGTAGCGGTGTGTGGC GCAACGGCGATGTGGGTCGATTGCTACCGGGAAAAACACGCGGTCT

GGCGATAA Kosakonia fhaB_prm1 cgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattccc sacchari gcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccga tggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaa atttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacat ggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcGTGATTAA

TTCGGAAAAGAAAGTCCAACGCCTTGTAAGAACTCAGCTGGCCCCGT TGACGGTAACAATGATATTCGCATTACCTGCTGTTGCGCATTCCGCT GGTTTAAGTATGAAAAATGGCACGCTATATAATGCGAATGGCGTGCC GGTCGTGGATATTAATAAACCTAACAGCAATGGCTTGTCACATAACG TCTGGGACAACCTGAACGTCGATAAAAACGGTGTTATTTTTAATAACA GCGGCTCAGCATCCGATACGGTATTGGGCGGCACCATCCAGGGTAA CAGCAATCTGACATCCGGGTCGGCAAAAGTTATTCTCAACGAAGTTA CCTCCAAAAATGCGTCGACGATCAACGGTATGATGGAAGTTGCGGG TGATAAAGCCGCGTTGATTATCGCCAACCCCAATGGCATTGCGGTAA ATGGTGGCGGTACGATCAATACCGATAAACTCACTCTGACCACTGGC ACACCAGATATTCAGAACGACAAACTCGCTGGTTATTCCGTCAACGG CGGTACCATCACGATCAGCAAACTGGATAACGCCAGCCCAACTGAAA TTTTGTCACGCAACGTAGTGCTCAGCGGGAAAGTTACCGCTGACGAA CTGAATATTGTTGCGGGTAATAACTACGTTAATACAGACGGCCAGGT GACCGGAACTGTCACTGCGTCAGGCTCGCGTAACGGCTATAGCGTT GACGTTGCGCAAGTTGGCGGCATGTACGCGAATAAAATTAATCTTAT CAGTACCGAAAGCGGCGTGGGCGTGCGTAATCAGGGCGTAATTGCC GGTGGCACTGGTGGGATCAGCATTGATGCTAATGGCCAGCTACTGA ACAGTAATGCGCAGATTCAATCGACCGGTTCGACAAAGATTAATACC AACGGCAAATTGGACAATACAACGGGTCTTATTACTTCTGCTGGTGC TATTTATCTCGATACTAATAAGAACGCTATTGTTAATGCCCGTTCAGG TACGATTTCGACGACGGCAGATATCTACGTTAATAGCGGCGCAGTTG ATAATACCAACGGCAAAATTGCCGCCAGCGGCGTGCTGGCTGTCGA TACCAATAACAATACTTTTACCAACGCCGGTAAAGGGAACGATGTCG GTATCGAAGCGGGTATTGTCACCTTAAAAACCGGTACGCTAAATAAT AGTAACGGCCAGATCCACGGCGGCTATCTGGGGCTTGAATCCGGCG CGATTAACAATAACAGCGGTATTCTGGAAACGTCAGGCGACATGGAC

Espécie Anotação do Sequência do Prm (letras minúsculas)-gene (letras maiúsculas) Observações genótipo

ATTGTCAGCCTTGGAAATGTCGACAATAACAAAGGCCTGATCCGATC TGCCAGCGGCCATATCAACATCCTGTCTGGCGGCACTATCAACAACG GCAGTACCAAAACAGCGGATACCGTCAGTTCCGACTCCTTAGGCATC GCAGCCGATACCGGTGTAGTAATCAACGCAAACAGCATCAATAATAG CGGTGGTCAGATCGCATCGAACGGCGATGTGTCGCTAAACAGTAAG GGCCTGGTCAATAACGATTCCGGTAATCTTCTTTCCAATAGCAAAGT GATTGTGAAGGGCGGTTCTTATCGTAATGACTACGGTGGCATCGGC GGCAAGAAGGGCGTGGAGGTGTCGGTTAACGGCGACCTGAGCAAC TATATCGGCGTTGTGAGTGCGGAAGAAGGTGATATCTCACTGAGTGC AAATGCAGTGGATACCCACGGCGGTTTCATGATGGGGCAAAATATCT CCATCGACGCGAAAGCCGGCGTAAATACCACCCGATCGCTGGTATT AGCCAGTGAAAAGCTGGCTATCCATGCAGGCGGAAATGTTGATAACC GTGATGGTAATAGCTTTGGCAATGACTTCGGCCTCTATTTCGGCATG CCGCAACAGACCGGTGGCTTGATCGGTAAAGGTGGCGTTGAGATTT CCGGGCAGAATATTTACAACAACAACAGCCGCATCATTGCAGAAAAT GGGCCAATGAGCCTGCAAGCGAAAGGGAACATTGATAACACGCGTG CGCTGATGGTCAGCGGGGCCGATACCGCAATCAAAACCGGCGGGG CTTTCTACAATAACTACGCAACGATTTCCAGCGGAGGCAACCTCACA CTCGATACCGTTTCCCTGGAAAACTCCAGCAGCGGCACGCTTATCGA TAATAACGCCACAGGTTTCATCAACTCAGATAAAGATATCACGCTGAA TGTGGACAACAATTTCACGAACTACGGCTGGATCAGTGGTAAAGGCG CAGTGGCGCTGAATGTCGTGAAAGGGGCGTTTTATAACCGTAATACC ATTGCGGCTGATAAGTCACTTGCGATCAGTGCCCTGAACGGTATCGA GAACTTTAAAGATATCTCTGCAGGCGGCAGCCTGACGCTGGATACG CAACGTCATGTGACAAATAACAGCAACAGCAATATGGTCGGTAACGG GATTACTATTAACGCGGTAAACGACATTAATAACCGCGGCAATATTGT CAGTGATGGCGATATGAGTGTTGTGACCAAAGGTAACCTGTATAACT ACCTCTATATGCTGGGCGCTGGTGATGTCGCGATTACCGCAAACAAC GTCAACAACAATAATTCACTTATTGAGGCTGGTGGTGATCTGACGATT ACCTCTACTGGCAATGTGGGTAATAACCGTGGCACGCTGCGCTCCC TGACGGGCGATGTAAATGTGGCGGCAAAAGGAACGGTTGATAACTA TAGCGGTAAGATTACCTCTGCTGGCGATGTCGGAGTCAGTGGAAACT GGTTGCTCAATGATTATGGTCAGATTGCTGGCTTAAGCAATATTAACC TGATTCTGACGGGCAACTTCGACAGTTACAAAGGTTCTGTGACCTCT CAAATGGGCGATATCAAGCTGGTTGCCAACTCGGTGGATAATAACAA CGGGTTAATCGCAGGTGAAAATATCTCCATTGATTCCAAATCAGGTG TCTATAACAACACGGCGCTGATTGCCGCGAATAAAACACTTACCGTA AATGCTGTCGGCAATATTGAAAACAGAGACGGTAATAACTTCAGTTAT TACAACGGCGAGTATTTTGGTGTCGCAGGCGATGTGGGTGGCATGG TGGGTAACGCGGGCATCTCGCTTTCCGCACAGAATATCTACAGCACA AACAGCCGTATTCTGGCAGAAAATGGCCCACTTAACGTGCTGTCCCG GGGCGTATTCGATAACACCCGCAGCATGCTGATGAGCGGTGCCAAC GCCATTATTAAAGCGGCCGGTGTTTTCTATAATAACTATGCGATGACA TATAGCGCAGGTAACCTCGACATCACTTCTGCTTACCTTGAGAACTA CAGCAACGGTAAGCTGGAAGATGGAACGGCAACAGGCGTTATCGCT TCGGATAAGAACCTGAACCTGAGCGTGGATAATAGCACCACCAACTA CGGCTGGATCAGCGGTAAGGGCGATGTGAATTTCAGCGTGTTAAAA GGTGTGCTGTATAACCGCAACACCATCGCCGCTAATAACGCGCTGG CGATTAATGCCCTGAACGGTATCGAGAACTTCAAAGATATCCTGGCG GGAACCAGCCTTACCCTTACTACCCAACGGCACGTTACCAACAACAG CAACAGTAATATGCTTGGGCAAAGCATTGGGATTAATGCGGTAAACG ATATTAATAACCGCGGCAATATTGTCAGCGATTATGCATTAACCGTGA AAACAGACGGGAACGTGTATAACTACCTCAATATGCTGAGTTATGGC ACCGCAAAAGTAACCGCGAATAAAGTCACGAACAGCGGCAAGGACG

Espécie Anotação do Sequência do Prm (letras minúsculas)-gene (letras maiúsculas) Observações genótipo

CGGTGCTGGGCGGTTTTTACGGCCTTGACCTTGAATCGAATGCGATC

ACCAATACCGGCACCATTGTAGGTCTGTAA Kosakonia fhaB_prm2 tcaccacggcgataaccataggttttcggcgtggccacatccatggtgaatcccactttttccagcacg sacchari cgcgccacttcatcgggtcttaaatacatagattttcctcgtcatctttccaaagcctcgccaccttacatg actgagcatggaccgtgactcagaaaattccacaaacgaacctgaaaggcgtgattgccgtctggc cttaaaaattatggtctaaactaaaatttacatcgaaaacgagggaggatcctGTGATTAATTC

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Espécie Anotação do Sequência do Prm (letras minúsculas)-gene (letras maiúsculas) Observações genótipo

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ACCAATACCGGCACCATTGTAGGTCTGTAA Kosakonia fhaB_prm9 atattgacaccatgacgcgcgtaatgctgattggttctgtgacgctggtaatgattgtcgaaattctgaac sacchari agtgccatcgaagccgtagtagaccgtattggtgcagaattccatgaactttccgggcgggcgaagg atatggggtcggcggcggtgctgatgtccatcctgctggcgatgtttacctggatcgcattactctggtca cattttcgataacgcttccagaattcgataacgccctggttttttgcttaaatttggttccaaaatcgccttta gctgtatatactcacagcataactgtatatacacccagggggcgggGTGATTAATTCGGAA

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Espécie Anotação do Sequência do Prm (letras minúsculas)-gene (letras maiúsculas) Observações genótipo

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Espécie Anotação do Sequência do Prm (letras minúsculas)-gene (letras maiúsculas) Observações genótipo

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AATACCGGCACCATTGTAGGTCTGTAA Klebsiella otsB_ATG_prm1 gaatttacttacattaaggcggcgaggggcgcctatacttgatagttctgataccagaagaaggaaga variicola 6.1 actATGGATAACCAGATATCTGTACCGCCTGCGCTAACCGGAAACTAC

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GTCTCTAA Klebsiella otsB_ATG_prm8 cgccgtcctcgcagtaccattgcaaccgactttacagcaagaagtgattctggcacgcatggaacaa variicola .2 attcttgccagtcgggctttatccgatgacgaacgcgcacagcttttatatgagcgcggagtgttgtatga tagtctcggtctgagggcattagcgcgaaatgatttttcacaagcgctggcaatccgacccgatatgcc tgaagtattcaattacttaggcatttacttaacgcaggcaggcaattttgatgctgcctatgaagcgtttga ttctgtacttgagcttgatcATGGATAACCAGATATCTGTACCGCCTGCGCTAAC

CGGAAACTACGCTTTTTTCTTTGACCTCGACGGTACTCTTGCCGATAT CCAACCGCACCCCGATCAGGTGGTGATACCCGACAACACGTTGCAG GCGCTCAACGCGCTGGCCCAGCAGCAGGGTGGGGCGGTGGCATTG ATTTCAGGGCGCTCAATGGCTGAACTTGACGCGCTAACCCATCCCTG GCGGCTACCGCTGGCCGGCGTTCACGGGGCAGAACGCCGTGATAT CAATGGTAAAACCTATATCGTTTCTCTGCCGTCGGCGCTGCGCGATG AAATCGCGACTGAGCTGACCTCGGCGCTGCAGGGGCTCTCCGGCTG CGAGCTGGAGAGTAAGGAGATGGCCTTCGCGCTGCACTACCGCCAG GCTCCGCAGCAGCAGAGCGCAGTACTGGAGCTGGCTCAGCGCATC GTTCAGCGCTACCCGCTGCTGGCACTGCAGCTGGGTAAATGTGTGG TGGAGATTAAACCCCGCGGAGTGAACAAAGGGGAGGCGATCAGCGC CTTCATGCAGGAGGCGCCGTTTGCCGGCCGCGAACCGGTTTTTGTC GGCGATGATTTGACCGATGAGGCGGGATTTAGCGTGGTTAATCAACT GCAGGGAATGTCGGTAAAAGTCGGCGCCGGGGAAACTCAGGCGCA CTGGCGGTTGGCGGATGCCGCCGCTGTAAGGACGTGGTTGCAACAT

Espécie Anotação do Sequência do Prm (letras minúsculas)-gene (letras maiúsculas) Observações genótipo

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TTAGTCGTAGTCTCTAA Kosakonia otsB-Prm1 cgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattccc sacchari gcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccga tggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaa atttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacat ggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcGTGGAAG

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TATCTAA Kosakonia otsB-Prm2 tcaccacggcgataaccataggttttcggcgtggccacatccatggtgaatcccactttttccagcacg sacchari cgcgccacttcatcgggtcttaaatacatagattttcctcgtcatctttccaaagcctcgccaccttacatg actgagcatggaccgtgactcagaaaattccacaaacgaacctgaaaggcgtgattgccgtctggc cttaaaaattatggtctaaactaaaatttacatcgaaaacgagggaggatcctGTGGAAGACG

CACTATCTATACCGCCTCTCATTTCCGGAAATTTTGCCTTTTTTTTCGA TTTGGATGGCACCCTTGCGGACATCAAACCGCACCCGGATGATGTTT TTATCCCTGAAGATGTGCTGACCAGACTTTCATTGCTTGCTGAGCTAA ATGACAGGGCGTTGGCATTGATTTCAGGGCGTTCAATTGCTGAGCTG GAACAGCTCGCCAAACCGTATCGTTTCCCGCTGGCCGGGGTACATG GGGCGGAGCGCCGCGATATCAATGGTCGAACCGAACGAATGACCTT GCCGGAAGCGGTTTTACAACCGCTGGAACGTGAACTCCGGCATGGC ATTGCGCCGCTGACCGGCGTTGAACTTGAAACCAAAGGGATGGCAT TTGCACTGCATTATCGCCAGGCGCCGCAGCATGAAGAGGCGGTCTT TGCCCTGGCAAAAACACTCATCGCGCACTACCCACAACTGGCAATGC AGCCGGGAAAATGTGTGGTCGAGCTGAAACCCTCTGGCATTCATAAA GGCGCCGCTATTGGCGCGTTTATGCAAACGCCGCCCTTTCTCGGCA AGAAACCGGTGTTTCTTGGCGACGATCTGACTGACGAACATGGATTT AAAACCGTTAATAAACTTGGCGGCATATCGATAAAAGTTGGCCCTGG CGCAACACAGGCAATGTGGCGTCTGGCTGGCGTAAATGATGTCTAT CAATGGCTTGAAAAACTTGTCGACCATCAACAACAAGAACAACGGGC GCTAACAAACAGGAGAGATGGCTATGAGTCGCTTAGTCGTAGTATCT AA

Espécie Anotação do Sequência do Prm (letras minúsculas)-gene (letras maiúsculas) Observações genótipo Kosakonia pehA-Prm1 cgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattccc A sequência gênica é sacchari gcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccga do primeiro gene no tggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaa óperon pehA atttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacat ggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcATGGGAT

ATGACGCGTGTAATTTTATTAACTCGATCGTTAAAAATTTTAAAGAATC CATTGGAATAATGAACGTGTTGTTACTGGAACCTGATGAGTCCGACG CTTTGCGCTTATTGTATCTAAAACTGGATGTTATCAGGGCTGGCATTG AGCAGGATGTCCGCATGTTAACCAAAGCCCGTCTGGACAGCAACGC CGCACTTTGCCTTTACCAGGTACATAATGCGTTAAATGCTTTGAACTA TTGCATTGGGATTGTCAGAAATACGCCGTTAAATCAGCAGGTTTATTA CGATTTCGAAGATCTAAAGCGTATTGTGAACACTCTTGATGCAACATC

CGGACGTGTTTTTAATAAACTGGATGGTAATGAGTACACATAA Kosakonia pehA-Prm2 tcaccacggcgataaccataggttttcggcgtggccacatccatggtgaatcccactttttccagcacg A sequência gênica é sacchari cgcgccacttcatcgggtcttaaatacatagattttcctcgtcatctttccaaagcctcgccaccttacatg do primeiro gene no actgagcatggaccgtgactcagaaaattccacaaacgaacctgaaaggcgtgattgccgtctggc óperon pehA cttaaaaattatggtctaaactaaaatttacatcgaaaacgagggaggatcctATGGGATATGA

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GACGTGTTTTTAATAAACTGGATGGTAATGAGTACACATAA Kosakonia pehA-Prm9 atattgacaccatgacgcgcgtaatgctgattggttctgtgacgctggtaatgattgtcgaaattctgaac A sequência gênica é sacchari agtgccatcgaagccgtagtagaccgtattggtgcagaattccatgaactttccgggcgggcgaagg do primeiro gene no atatggggtcggcggcggtgctgatgtccatcctgctggcgatgtttacctggatcgcattactctggtca óperon pehA cattttcgataacgcttccagaattcgataacgccctggttttttgcttaaatttggttccaaaatcgccttta gctgtatatactcacagcataactgtatatacacccagggggcgggATGGGATATGACGCG

TGTAATTTTATTAACTCGATCGTTAAAAATTTTAAAGAATCCATTGGAA TAATGAACGTGTTGTTACTGGAACCTGATGAGTCCGACGCTTTGCGC TTATTGTATCTAAAACTGGATGTTATCAGGGCTGGCATTGAGCAGGA TGTCCGCATGTTAACCAAAGCCCGTCTGGACAGCAACGCCGCACTTT GCCTTTACCAGGTACATAATGCGTTAAATGCTTTGAACTATTGCATTG GGATTGTCAGAAATACGCCGTTAAATCAGCAGGTTTATTACGATTTCG AAGATCTAAAGCGTATTGTGAACACTCTTGATGCAACATCCGGACGT GTTTTTAATAAACTGGATGGTAATGAGTACACATAA

Espécie Anotação do Sequência do Prm (letras minúsculas)-gene (letras maiúsculas) Observações genótipo Kosakonia treZ-Prm2 tcaccacggcgataaccataggttttcggcgtggccacatccatggtgaatcccactttttccagcacg sacchari cgcgccacttcatcgggtcttaaatacatagattttcctcgtcatctttccaaagcctcgccaccttacatg actgagcatggaccgtgactcagaaaattccacaaacgaacctgaaaggcgtgattgccgtctggc cttaaaaattatggtctaaactaaaatttacatcgaaaacgagggaggatcctATGGCGTCGA

AATCGTTTTGTAAAAGTTGGGGAGCCGAATACCTCGCGAATGGTCGC GTGCGTTTTCGCTTATGGGCCACCGGGCAGCAGCAGGTTTCACTGC GTTTACCGGCTGGCGAATTGCCAATGCAACGCCTTGATGACGGCTG GTTTGAACTGACCGTCGATAATATCGCCGCAGGTACGGCGTACCAGT TTGTCCTGAGCAACGGTTTGGCGGTTCCCGATCCCGCCTCGCGCGC GCAGGCCGCCGATGTTAACGGCCCTTCGCTGGTTGTCGACCCGGAT CATTACGTCTGGCAACACCCGCAGTGGCAGGGTCGCCCGTGGCAAG AATCCGTGGTCTATGAACTGCATATTGGGACATTTACCCCGCGGGGC ACTTTTCGCGCGGCAATGGAAAAACTGCCGTACCTCGCGCAACTCG GCATCACCATGATAGAGGTGATGCCCGTCTCCCAGTTTGGCGGCAA TCGCGGCTGGGGCTATGACGGCGTGCTGCTCTATGCGCCGCACTCG GCGTATGGCACGCCGGATGATTTTAAAGCCTTTATCGACGCCGCTCA CGGCTACGGCCTTTCAGTGGTGCTGGATATTGTGCTCAACCACTTTG GCCCGGAAGGTAACTACTTACCCGCGCTGTCACCGGATTTTTTCCAC GCCGAACGGCAGACGCCGTGGGGGCCGGGCATCGCGTATGACGTT GACGCGGTGCGGCGTTACATCGTTGAAGCACCGCTCTACTGGCTCA ACGAATACAACCTGGACGGGCTGCGATTTGATGCCATCGATCAGATT GAAGACAGCGCCGAACCGCCGGTGCTGGTGGAGATTGCCCGCCGT ATTCGCGAGGAGATCACCGACCGGCCGGTGCATCTGACCACCGAAG ATTGCCGCAATATTATTGCGCTGCATCCGCGCGAGCCGGATGGGCG TGCGCCGCTGTTTACCGCCGAGTGGAATGACGATCTGCACAATGCC GCGCATGTGTTTGCCACCGGTGAAACCCATGCCTATTACCAGGATTT TGCGGATAAGCCCGAAGTGTGGCTGGCGCGCACGTTAACTGAAGGA TTCGCGTTTCAGGGGGAGATTGCCCCGTCAACCGGTGAACCACGCG GAGTGGACAGCCGCAACCAGCCGCCGGTAGCGTTTGTCGATTTTAT CCAGAACCACGATCAGACCGGCAACCGCGCCCAGGGCGAGCGGCT TATCACGCTGGCGGGCGAGGAGAGAACGCGCGTGCTGCTCGGCGC GCTGCTGTTTTCCCCGCATATTCCGCTGCTGTTTATGGGCGAAGAGT ATGGCGAAACCAATCCTTTCCTGTTCTTTACCGATTTTCACGGCGATC TGGCGCGCGCCGTGCGTGAAGGGCGCGCGCGGGAATTCCAGGGCC ATGCCGGACATGAAGGGGAAGCGGTTCCCGATCCGAATGCGCCTGA CACTTTTACCCGATCACAACTGGACTGGGCAAAAACGCAGCAGGAG AGCGGCCAGCGCTGGCTGACGCAAACCCGCGACTGGCTGACGCTG CGCCAGAAATATGTGGTTCCGCTGCTGACAAATGCGCAGCGGCAAA ATGGGGAAGTGATCGCCACCGCGCCAGGGTTTGTCGCGGTCCGCT GGCGCTTCCCGCAAGGGACATTATCGCTGGCGCTCAATATTGGCGA GGCGACGCAACCGTTGCCGGATCTTCCCGGCAAAACGCTGGCAGCC TGGCCGCGCGGACAAGATGACTTGCCGCCGAATGCGTTCATTGTTC

GTCTGGCTTTGGGAGAGGGAATGTGA Kosakonia yjbE2_prm1 cgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattccc sacchari gcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccga tggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaa atttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacat ggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcATGAAAAA

AGTCCTGTATGGCATTTTTGCCATATCCGCGCTTGCGGCGACTTCTG CTTTTGCTGCACCGGTGCAAATTGGTGAAGCGGCAGGGTCGGCAGC GACCTCTGTTTCTGCGGGTAGCTCCGCAGCAACGAGCGTTAGCACC GTAGGGTCCGCGGTGGGTGTCGCGCTGGCGGCAACCGGTGGCGGT GATGGCTCCAACACGGGAACCACGACCACCACGACCACAAGTACCC AGTAA

Espécie Anotação do Sequência do Prm (letras minúsculas)-gene (letras maiúsculas) Observações genótipo Kosakonia yjbE2_prm2 tcaccacggcgataaccataggttttcggcgtggccacatccatggtgaatcccactttttccagcacg sacchari cgcgccacttcatcgggtcttaaatacatagattttcctcgtcatctttccaaagcctcgccaccttacatg actgagcatggaccgtgactcagaaaattccacaaacgaacctgaaaggcgtgattgccgtctggc cttaaaaattatggtctaaactaaaatttacatcgaaaacgagggaggatcctATGAAAAAAGT

CCTGTATGGCATTTTTGCCATATCCGCGCTTGCGGCGACTTCTGCTT TTGCTGCACCGGTGCAAATTGGTGAAGCGGCAGGGTCGGCAGCGAC CTCTGTTTCTGCGGGTAGCTCCGCAGCAACGAGCGTTAGCACCGTA GGGTCCGCGGTGGGTGTCGCGCTGGCGGCAACCGGTGGCGGTGAT GGCTCCAACACGGGAACCACGACCACCACGACCACAAGTACCCAGT

AA Kosakonia yjbE2_prm9 atattgacaccatgacgcgcgtaatgctgattggttctgtgacgctggtaatgattgtcgaaattctgaac sacchari agtgccatcgaagccgtagtagaccgtattggtgcagaattccatgaactttccgggcgggcgaagg atatggggtcggcggcggtgctgatgtccatcctgctggcgatgtttacctggatcgcattactctggtca cattttcgataacgcttccagaattcgataacgccctggttttttgcttaaatttggttccaaaatcgccttta gctgtatatactcacagcataactgtatatacacccagggggcgggATGAAAAAAGTCCTG

TATGGCATTTTTGCCATATCCGCGCTTGCGGCGACTTCTGCTTTTGCT GCACCGGTGCAAATTGGTGAAGCGGCAGGGTCGGCAGCGACCTCT GTTTCTGCGGGTAGCTCCGCAGCAACGAGCGTTAGCACCGTAGGGT CCGCGGTGGGTGTCGCGCTGGCGGCAACCGGTGGCGGTGATGGCT

CCAACACGGGAACCACGACCACCACGACCACAAGTACCCAGTAA Espécie Anotação do Junção única no ponto de deleção (a montante da deleção está em letras genótipo minúsculas , a jusante da deleção em letras maiúsculas) Kosakonia ΔglgA gataccgagtgagagcaaggcgttagaaagggtgcgaccaatcagaaactccatcgataagtagt sacchari aaacctggcgcacttcctgagagagctgtgcacgggtagaacgcagccagcgctccaccagccga tcgcgcacggcaaacagcgtggcgttcagccattcgtggcgattggcgacagccggatctttaccgat ggtgaacatcagtttgtaggcaatcgaatgttttaacgcctcaatacttaacgtaggtgaagcataagta aaaggtgcattcatataatgattcctggaaaaTATCGCTCCTGTTCAAAACCCGTTG

GCCTTGATGCCAGAAATGGGGAAACAGCGCGCGGACCCCTTCCGCG CAAGGTTATAATCAGATGCTTTCAGCTTTTAATTTGCGCAGCATTTCA CGTGTGACCAACACAATGCCTTCTTCGGAACGGTAAAAGCGACGCG CATCTTCTTCCGCATTTTCACCAATCACCGTTCCTTCCGGTATCACGC AGCCTCTGTCGATAATGCAGCGATGGAGGCGACAGGAGCGCCCCAC

CCACACTTCCGGCAGCAAGACCGAAGAGTCGATATTGCAGA Klebsiella ΔglgA cggcggctgcattatctccgggtcggtggtggtgcagtcggtgctgttcccgcgcgtgcgggtgaactc variicola attctgtaacattgattcggcagtcttgttgccagatgtctgggtggggcgctcatgccgcctgcgtcgct gcgtgattgaccgcgcctgcgtcatcccggaaggtatggtgattggtgagaacgcggaagaggatgc acgccgcttctatcgctcagaggaaggtatcgtgctggtgacccgcgacatgctgcggaaattgggg cacaaacaggagcgctaatgcaggtcTTGATGTAACCACTGGAGTCATTGTTAT

GAATGTACCCTTTAGCTATGCATCACCGACGCTGAGCGTTGAGGCGT TAAAGCACTCTATTGCCTATAAGCTGATGTTTATCATCGGTAAAGATC CGGCCATCGCCAACAAGCATGAATGGCTTAACGCCACGCTGTTTGC CGTCCGCGATCGCATGGTGGAGCGCTGGCTGCGCTCCAACCGCGC GCAGCTCTCGCAGGAAGTGCGCCAGGTATACTATCTGTCGATGGAG TTCCTGATTGGCCGTACCCTCTCTAACGCGCTGCTGTCGC

[0319] Método: Ensaio de excreção de amônio

1. Colher colônias e cultivar em meio rico na placa de cavidades profundas de 96 cavidades a 30ºC durante a noite;

2. Usar a cultura durante a noite para inocular uma cultura em meio ARA (meio livre de N), suplementado com glutamina 10 mM

(gln) (também em placa de 96 cavidades);

3. Usar a cultura em ARA+gln para inocular uma cultura em ARA sem gln;

4. Transferir para a câmara anaeróbica e incubar com agitação à temperatura ambiente por 3 dias;

5. Centrifugar a placa de 96 cavidades com as células e remover uma amostra do sobrenadante;

6. Usar o kit Megazyme Ammonium Assay para analisar a concentração de amônio no meio. Tabela 13 Vezes de aumento em relação à parental ID da ID de Δ Genótipo da Parental ATT ARA Transcrito de GOI cepa curada parental AMM cópias/cavi % ou ATT gln gln gln gln dade vezes 0 mM 5 mM 0 mM 5 mM 6-848 ds786 [Ci006 2,3x 2,8x p= 6-1098 6-1338 0,60 p=0,04 Não testado (CM093) fhaB_prm2] p=0,013 0,006 inóculo não 0,96x Não 6-848 ds778 [CI006 2,5x p= 0,49x 72x 24x 6-1127 0,93 p=0,64 quantificad p=0,8 curado (CM093) bcsIII_prm9] 0,0005 p=0,06 p=0,11 p=0,40 o 4 inóculo não 0,09x 6-848 ds777 [CI006 1,7x 0,16x 2,9x 0,9x 6-1126 6-1337 1,03 p=0,90 quantificad p=0,0 (CM093) bcsIII_prm2] p=0,06 p=0,03 p=0,12 p=0,86 o 1 inóculo não 1,5x 6-848 ds794 [CI006 1,9x 1,2x 3,9x 4,7x 6-1103 6-1286 0,71 p=0,18 quantificad p=0,0 (CM093) yjbE2_prm1] p=0,07 p=0,37 p=0,61 p=0,55 o 9 Não 6-881 ds796 [CI006 3,3x 6-1137 0,78 p=0,11 1,7x p=0,32 Não testado curado (CM094) yjbE2_prm9] p=0,03 0,76x 6-848 ds720 [CI006 1,9x 0,46x 212x 106x 6-1136 6-1331 1,46 p=0,34 0,7x p=0,68 p=0,8 (CM093) pehA-Prm9] p=0,13 p=0,24 p=0,41 p=0,39 0 0,45x 6-848 ds774 [CI006 2,0x 1,28 0,63x 3,1x 0,9x 6-1142 6-1336 1,06 p=0,34 p=0,4 (CM093) bcsII_prm2] p=0,13 p=0,62 p=0,55 p=0,61 p=0,89 5 inóculo não Não 6-848 ds795 [CI006 0,72 6-1104 1,07 p=0,45 quantificad Não testado curado (CM093) yjbE2_prm2] p=0,16 o 0,19x 6-881 ds786 [Ci006 1,06 0,94x 0,99x 3,5x 3,0x 6-1077 6-1296 0,72 p=0,39 p=0,0 (CM094) fhaB_prm2] p=0,97 p=0,94 p=0,97 p=0,05 p=0,33 9 1,1x 6-881 ds794 [CI006 1,43x 0,90 0,58x 1,0x 4,5x 16x 6-1094 6-1285 p=0,6 (CM094) yjbE2_prm1] p=0,69 p=0,87 p=0,06 p=0,96 p=0,24 p=0,01 4 Tabela 14

Significativo somente em gIn 5 ID da mM Ensaio de colonização em Genótipo Alvo cepa estufa ARA transcrito Síntese de nenhuma diferença 6-915 bcsI-Prm2 3,2x p=0,314 não testado celulose significativa Transporte de 6-916 cysZ-Prm1 5,2x p=0,103 63,2x p=0,001 não testado sulfato síntese de 173,0x 16x diminuição 6-921 otsB-Prm1 37,5x p=0,003 trealose p=0,001 significativa em CFU/g FW síntese de nenhuma diferença 6-922 otsB-Prm2 19,2x p=0,053 4,3x p=0,021 trealose significativa síntese de nenhuma diferença 6-923 treZ-Prm2 14,2x p=0,178 47,3x p=0,152 trealose significativa Exemplo 10: Estudo de toxicologia

[0320] Para confirmar a ausência de toxicidade humana ou para mamíferos de Klebsiella variicola e Kosakonia sacchari., foi conduzido um estudo de toxicidade com esses organismos. A empresa contratada foi a Smithers Avanza Toxicology Services, que possui uma experiência extensa em estudos de toxicologia.

[0321] O objetivo desse estudo era confirmar a toxicidade de isola- dos bacterianos em camundongos após uma única injeção subcutânea. Foram utilizados camundongos CD-1 para maximizar o número de isolados bacterianos por kg de peso corporal. A via subcutânea foi selecionada por ser a via adequada para a inoculação de isolados bacterianos em animais, e a que mais simula a via mais provável da exposição humana aos micróbios.

[0322] Os tratamentos com isolados bacterianos de Klebsiella variicola ou Kosakonia sacchari não afetaram a mortalidade dos camun- dongos, todos os animais sobreviveram até o encerramento planejado no final do período do estudo. Não houve anormalidades em observações clínicas de qualquer um dos animais nos grupos de tratamento com Klebsiella variicola e Kosakonia sacchari por todo o decorrer do estudo. Além disso, não foram anotadas anormalidades durante as observações ao lado das gaiolas. Ademais, não houve anormalidades com observações dérmicas para os grupos de tratamen- to com Klebsiella variicola e Kosakonia sacchari. As temperaturas corporais dos camundongos foram normais em todos os grupos, com temperaturas médias variando de 36,66°C a 37,62ºC. Houve uma ligeira perda do peso corporal para camundongos nos grupos de tratamento com Klebsiella variicola e Kosakonia sacchari, mas este situou-se dentro da faixa de normalidade para camundongos nesse estudo e de dados históricos para esse tipo de estudo. Os resultados desse estudo confirmam que isolados bacterianos de Klebsiella variicola e Kosakonia sacchari não oferecem um risco de toxicidade ou patogenicidade para humanos ou outros mamíferos.

[0323] O objetivo desse estudo era determinar a toxicidade de isolados bacterianos em camundongos após uma única injeção subcu- tânea. Foram utilizados camundongos CD-1 para maximizar o número de isolados bacterianos por kg de peso corporal. A via subcutânea foi selecionada por ser a via adequada para a inoculação de isolados bacterianos em animais.

[0324] Quarenta e cinco camundongos CD-1 fêmeas com aproxi- madamente 8 semanas de idade foram recebidas do Charles River Breeding Labs em 08 de junho de 2017. Os animais foram alojados em grupo (5 animais por gaiola) em gaiolas de policarbonato contendo forração de madeira folhosa. Os animais foram alimentados com a dieta Certified Global Teklad Laboratory Diet 2018 (pellets) à vontade e receberam água potável através de garrafas de água. Controles ambientais na sala dos animais foram configurados para manter uma temperatura de 20-26ºC, uma umidade relativa de 30-70%, no mínimo, 10 trocas de ar por hora e um ciclo de 12 horas no claro/12 horas no escuro.

[0325] Quarenta camundongos foram randomizados em oito grupos que consistiam em cinco camundongos cada. Animais extra foram levados para colônia de treinamento/estoque. Os animais foram tratados como indicado na Tabela 15. Tabela 15: Delineamento do estudo Volume do item Fêmeas Dose do item em teste Grupo Tratamento ID gênero/ espécie em teste (isolados/animal) N No de animais (mL/animal) 1 PB137 Klebsiella variicola >108 0,1 5 21994-21998 8 2 PB728 Klebsiella variicola >10 0,1 5 21999-22003 8 3 PB006 Kosakonia sacchari >10 0,1 5 22004-22008 4 PB063 Rahrella aquatiiis >108 0,1 5 22009-22013 8 5 PB019 Rahnella aquatiiis >10 0,1 5 22014-22018 6 PB747 Rahnella aquiatiiis >108 0,1 5 22019-22023 8 7 PB910 Kluyvera intermedia >10 0,1 5 22024-22028 8 PB1116 Enterobacter tabaci >108 0,1 5 22029-22033 Tabela 15: cepas usadas

[0326] Os itens em teste foram fornecidos pelo Patrocinador em forma de pronto para dose. Todos os animais receberam uma dose única através de injeção subcutânea na região pré-escapular no Dia do Estudo (SD) 1.

[0327] Exames físicos foram realizados diariamente e observações ao lado da gaiola, duas vezes ao dia. Observações dérmicas foram também realizadas diariamente de acordo com a Tabela 16. Observa- ções adicionais estão listadas nas Tabelas 17-27. Tabela 16: Observações dérmicas Escore Grau Edema Eritema 0 Nenhum Ausência de inchaço Cor normal 1 Mínimo Ligeiro inchaço (quase imperceptível) Rosa claro (quase imperceptível) 2 Leve Inchaço definido (distinto) Rosa brilhante/Vermelho claro 3 Moderado Inchaço definido (elevado) Vermelho brilhante 4 Grave Inchaço pronunciado Vermelho escuro

[0328] Os pesos corporais foram registrados antes da administra- ção da dose (SD 1) e antes do encerramento (SD 8). A temperatura corporal foi medida antes do encerramento (SD 8). Após a coleta final dos dados em SD 8, os animais foram sacrificados por inalação de CO2 seguida por deslocamento cervical e descartados sem necrópsia.

[0329] O tratamento com qualquer um dos isolados bacterianos não afetou a mortalidade. Todos os animais sobreviveram até o encerra- mento planejado.

[0330] As observações clínicas foram anotadas durante os exames físicos. Não foram observadas anormalidades em qualquer um dos animais durante todo o decorrer do estudo.

[0331] Não foram anotadas anormalidades durante as observações ao lado das gaiolas.

[0332] Foram realizadas observações no teste dérmico de Draize. Um animal do Grupo 6 exibiu edema mínimo e eritema com início em SD 7 até o final do período de observação (SD 8). Um animal do Grupo 7 exibiu eritema com início em SD 5 até o final do período de observação (SD 8). No Grupo 8, edema mínimo ou leve foi observado em dois ani- mais de um a quatro dias. Eritema leve foi observado no Animal 22029 (8f) em SD 7 até SD 8, e eritema moderado foi notado no Animal 22032 (8f) em SD 5 e 6, que diminuiu para eritema mínimo em SD 7 e 8.

[0333] Os pesos corporais e as alterações no peso corporal foram anotadas. Os Grupos 1, 2, 3, 5, 6 e 8 sofreram perda mínima de peso por todo o estudo, com uma alteração percentual média variando de - 1,91% a -6,87%. Os Grupos 4 e 7 obtiveram ganho mínimo de peso por todo o estudo, com uma alteração percentual média de 0,31% e 2,73%, respectivamente.

[0334] As temperaturas corporais foram rastreadas. As tempera- turas corporais foram normais para todos os grupos, com temperaturas médias variando de 36,66ºC a 37,62ºC. Exemplo 10: Ensaio em campo

[0335] Pode-se conduzir um ensaio em campo para avaliar a eficácia de cepas Pivot no crescimento e produtividade do milho sob esquemas variáveis de nitrogênio. Materiais e Métodos

[0336] Delineamento experimental: Desenho de Parcelas Divididas com Taxas de N como parcelas Principal e Tratamentos como Subpar- celas.

[0337] Localizações: Três locais geograficamente diferentes na Argentina.

[0338] Dados: Fornecem dentro de 1 semana do plantio, coorde- nadas geográficas com referência a TAG, Parcela de Campo, Locali- zações de Tratamento e quadro Decoder (Decoficador).

[0339] Tratamentos: 5 Parcelas Principais -100%, 100% - 25 libras, 100% - 50 libras, 100% - 75 libras, 0%

[0340] 14 Subparcelas de Tratamentos de sementes (semente tratada fornecida pela AGT)

[0341] Tempo para nitrogênio: Ureia pré-plantio ou outras práticas aprovadas de melhor manejo.

[0342] Replicações: 6

[0343] Parcelas: 420 por localização

[0344] Híbrido: Fornecido pela AgriThority, um para localizações do norte e um para localizações do sul.

[0345] NENHUM agente biológico aplicado à semente.

[0346] Tamanho mínimo da parcela: 4 filas de 30’ de comprimento (~3 acres, no total)

[0347] Observações: Todas as observações (a menos que indicado de outra forma) retiradas de 2 filas desde o centro da parcela. Toda a amostragem destrutiva a ser retirada das filas de fora.

[0348] Manutenção de amostras: Manter amostras de sementes tratadas refrigeradas até o uso. Remover as amostras da geladeira 1,5 a 2 horas antes de requeridas para aplicação.

[0349] Aplicação de fertilizante: Colaborador a fornecer a taxa recomendada para fertilizante e obter a concordância da Pivot Bio antes da aplicação.

[0350] Agricultura local: Prática ● Semente: Milho comercial (fornecido) aplicado com tratamento de sementes comercial sem agente biológico. Taxa de semeadura – prática local. ● Data de plantio: prática local. ● Práticas locais-padrão de produção – erva daninha, manejo de insetos etc. ● Devem ser seguidas as práticas padrão para o manejo com a exceção de aplicações de fungicida. As aplicações de fungicida requerem consultas com cliente. ● Registrar todas as práticas agrícolas seguidas para o cultivo da cultura.

[0351] Caracterização do solo ● Textura do solo ● Análise de fertilidade do solo ○ Para determinar o nível de fertilizante nitrogenado, reti- rar amostras do solo pré-plantio de cada local para assegurar que 0-12” e potencialmente 12”- 24” de Nitrogênio de Nitrato é menor que 50 libras/acre. Completar um teste padrão do solo mais Nitrogênio de Nitrato, Nitrogênio de Amônio, Nitrogênio Total, Matéria Orgânica e CEC. Enviar diretamente para o laboratório. ○ Responsividade aceitável para nitrogênio. Alto delta de rendimento entre 0 e 100% de fertilização com nitrogênio. ○ pH, CEC, K total e P. Procedimento padrão para amostragem do solo, p. ex., amostras de solo intacto (soil cores) 0 cm a 30cm e 30 cm - 60 cm ○ Antes do plantio e fertilização, coletar uma Amostra Pivô do Soro – 2 mL de amostra do solo com 0 a 6-12 polegadas do

UTC. Coletar uma amostra por réplica por esquema de N, usando o meio da fila. (5 esquemas de fertilizante * 6 réplicas = 30 amostras de solo). Enviar para Pivot Bio. ○ Pós-plantio (V4-V6), coletar uma Amostra Pivô do Soro – 2 mL de amostra do solo com 0 a 6-12 polegadas do UTC. Coletar uma amostra por réplica por esquema de N, usando o meio da fila. (5 esquemas de fertilizante * 6 réplicas = 30 amostras de solo). ○ Pós-colheita, coletar uma Amostra Pivô do Soro – 2 mL de amostra do solo com 0 a 6-12 polegadas do UTCV. Coletar uma amostra por réplica por esquema de N, usando o meio da fila. (5 esquemas de fertilizante * 6 réplicas = 30 amostras de solo) ○ Amostras do solo pós-colheita de cada localização com 0-12” e potencialmente 12” - 24”. Completar um teste padrão do solo mais Nitrogênio de Nitrato, Nitrogênio de Amônio, Nitrogênio Total, Matéria Orgânica e CEC. Enviar diretamente para o laboratório. ○ Amostra do solo V6-V10 de cada esquema de fertilizante (excluir o tratamento de 100% e 100% + 25 libras [no bloco de 100%] para todos os esquemas de fertilizante] com 0-12” e 12” - 24”. Completar um teste padrão do solo mais Nitrogênio de Nitrato, Nitrogê- nio de Amônio, Nitrogênio Total, Matéria Orgânica e CEC. Enviar direta- mente para o laboratório. (5 esquemas vezes 2 profundidades = 10 amostras por localização). ○ Uma amostra do solo pós-colheita de cada esquema de fertilizante (excluir o tratamento de 100% e 100% + 25 libras [no bloco de 100%] para todos os esquemas de fertilizante) com 0-12” – 24”. Completar um teste padrão do solo mais Nitrogênio de Nitrato, Nitrogê- nio de Amônio, Nitrogênio Total, Matéria Orgânica e CEC. Enviar direta- mente para o laboratório. {5 esquemas vezes 2 profundidades = 10 amostras por localização}.

[0352] Avaliações

● Sonda de temperatura (monitoramento contínuo) ● População inicial de plantas em ~50% de UTC ● População final de plantas antes da colheita ● Vigor (escala de 1 a 10, com 10 = excelente) V4 e V8-V10 ● Altura das plantas V8-V10 e V14 ● Rendimento (Bu/acre), ajustado para pct. padrão para umidade. ● Peso volumétrico ● % de umidade do grão ● Teste de nitrato na hasta com camada preta (420 parcelas X 7 localizações) ● Colonização. 1 planta por parcela em 1 saco com fecho zip e fertilizante 0% e 100% em V4–V6 (1 planta * 14 tratamentos * 6 réplicas * 2 esquemas de fertilizante = 168 plantas) ● Transcritoptômico. 1 planta por parcela em tubo com fertilizante 0% e 100% em V4-V6 (1 planta * 14 tratamentos * 6 réplicas * 2 esquemas de fertilizante – 168 plantas) ● Colonização. 1 planta por parcela em 1 saco com fecho zip e fertilizante 0% e 100% em V10-V12 (1 planta * 14 tratamentos * 6 réplicas * 2 esquemas de fertilizante = 168 plantas) ● Determinação de NDVI ou NDRE usando instrumento Greenseeker em dois momentos (V4-V6 e VT) ○ Avaliar cada parcela em todas as 7 localizações (420 parcelas X 2 momentos X 7 localizações) ● Características da haste, medidas em todas as 7 localiza- ções entre R2 e R5 ○ Registrar o diâmetro da haste de 10 plantas / parcela em 6 polegadas de altura ○ Registrar o comprimento do primeiro internódulo acima da marca de 6 polegadas

○ 10 plantas monitoradas, 5 plantas consecutivas plantas desde o centro de duas filas internas ○ Sete localizações (420 parcelas X 7 localizações)

[0353] Esquema de monitoramento ● Os profissionais da AgriThority visitam todos os estudos no estágio V3-V4 para avaliar a resposta no início da estação aos trata- mentos e durante o crescimento reprodutivo para monitorar a maturi- dade ● Visita conjunta com a Pivot, planejada conforme as condi- ções justifiquem e o cliente deseje.

[0354] b. Informações climáticas Dados climáticos desde o plantio até a colheita, consistindo em: ● Temperaturas máximas e mínimas diárias, ● Temperatura do solo na semeadura ● Chuva diária mais irrigação (se aplicada) ● Eventos climáticos incomuns, p. ex., chuva excessiva, vento, frio, calor

[0355] c. Análises e relatório de dados ● A AgriThority fornece o relatório do meio da estação para a Pivot em 1o de agosto, projeto funcional em 30 de novembro e relatório final em 31 de dezembro ● Relatórios adicionais podem ser negociados ● O Colaborador fornecerá dados de replicação (dados não processados) para a AgriThority quando da conclusão do estudo em formato Excel (fornecido) em 15 de novembro de 2016 incluindo o mapa de disposição do plantio. ● O relatório deve incluir todas as informações relevantes, inclusive aquelas observadas abaixo: ● Textura do solo e relatório dos testes

● Espaçamento entre filas, tamanho de parcela, irrigação e registros de água aplicada, cultivo e cultura anterior ● Taxa de semeadura e população de plantas ● Aportes de fertilizante para a estação – Fonte, taxa, momento, posicionamento ● Aportes agronômicos (p. ex., irrigação, herbicidas usados etc.) ● Dimensões da área de colheita Método de colheita – Manual, mecanizada, ferramenta de medição (escalas, monitor de rendimento etc.). Tabela 17 Rastreamento de isolados bacterianos quanto à toxicidade em camundongos após uma dose única subcutânea Observações no teste dérmico de Draize Escala de Draize de classificação

Escore Grau Edema Eritema 0 Nenhum Ausência de inchaço Cor normal 1 Mínimo Ligeiro inchaço (quase imperceptível) Rosa-claro (quase imperceptível) 2 Leve Inchaço definido (discernível) Rosa brilhante/ Vermelho-claro 3 Moderado Inchaço definido (elevado) Vermelho brilhante 4 Grave Inchaço pronunciado Vermelho-escuro

Tabela 18 Rastreamento de isolados bacterianos quanto à toxicidade em camundongos após uma dose única subcutânea Observações no teste dérmico de Draize Número de dias em relação à data de início

Grupo Sexo Animal Sinal clínico 1 2 3 4 5 6 7 8

1 f 21994 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 21995 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 21996 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 21997 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0

Observações no teste dérmico de Draize Número de dias em relação à data de início

Grupo Sexo Animal Sinal clínico 1 2 3 4 5 6 7 8 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 21998 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 2 f 21999 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22000 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22001 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22002 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22003 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0

Dose nominal: Os animais receberam a dose de acordo com a Tabela 1 do Texto.

Tabela 19 Rastreamento de isolados bacterianos quanto à toxicidade em camundongos após uma dose única subcutânea Observações no teste dérmico de Draize Número de dias em relação à data de início

Grupo Sexo Animal Sinal clínico 1 2 3 4 5 6 7 8

3 f 22004 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22005 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22006 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22007 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22008 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 4 f 22009 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22010 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22011 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0

Observações no teste dérmico de Draize Número de dias em relação à data de início

Grupo Sexo Animal Sinal clínico 1 2 3 4 5 6 7 8 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22012 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22013 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0

Dose nominal: Os animais receberam a dose de acordo com a Tabela 1 do Texto Tabela 20 Rastreamento de isolados bacterianos quanto à toxicidade em camundongos após uma dose única subcutânea Observações no teste dérmico de Draize Número de dias em relação à data de início

Grupo Sexo Animal Sinal clínico 1 2 3 4 5 6 7 8

5 f 22014 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22015 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22016 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22017 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22018 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 6 f 22019 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22020 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22021 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22022 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 1 1 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 1 1 22023 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0

Dose nominal: Os animais receberam a dose de acordo com a Tabela 1 do Texto

Tabela 21 Rastreamento de isolados bacterianos quanto à toxicidade em camundongos após uma dose única subcutânea Observações no teste dérmico de Draize Número de dias em relação à data de início

Grupo Sexo Animal Sinal clínico 1 2 3 4 5 6 7 8

7 f 22024 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22025 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22026 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22027 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22028 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 2 2 2 2 8 f 22029 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 2 2 22030 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22031 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 0 22032 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 1 1 1 1 1 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 3 3 1 1 22033 Edema (local tratado - 1) 0 0 0 0 0 0 0 2 Eritema (local tratado -1) 0 0 0 0 0 0 0 2

Dose nominal: Os animais receberam a dose de acordo com a Tabela 1 do Texto Tabela 22 Rastreamento de isolados bacterianos quanto à toxicidade em camundongos após uma dose única subcutânea Pesos corporais e variações do peso corporal (g) Número de dias em relação à data de início Variação Variação absoluta percentual 1 1 1 Grupo Sexo Animal 1 8 8 8 8 1 f 21994 27,11 26,39 -0,72 -0,72 -2,66

Pesos corporais e variações do peso corporal (g) Número de dias em relação à data de início Variação Variação absoluta percentual 1 1 1 Grupo Sexo Animal 1 8 8 8 8 21995 26,62 27,37 0,75 0,75 2,82 21996 28,06 27,3 -0,76 -0,76 -2,71 21997 25,01 25,49 0,48 0,48 1,92 21998 27,15 23,64 -3,51 -3,51 -12,93 ------ ------ ------ ------ ------ ------ Média 26,79 26,038 -0,752 -0,752 -2,71 DP 1,123 1,544 1,687 1,687 6,25 N 5 5 5 5 5 2 f 21999 29,78 29,85 0,07 0,07 0,24 22000 29,01 28,58 -0,43 -0,43 -1,48 22001 26,93 22,56 -4,37 -4,37 -16,23 22002 25,44 22,25 -3,19 -3,19 -12,54 22003 28,66 29,39 0,73 0,73 2,55 ------ ------ ------ ------ ------ ------ Média 27,964 26,526 -1,438 -1,438 -5,49 DP 1,755 3,791 2,217 2,217 8,34 N 5 5 5 5 5

Dose nominal: Os animais receberam a dose de acordo com a Tabela 1 do Texto Tabela 23 Rastreamento de isolados bacterianos quanto à toxicidade em camundongos após uma dose única subcutânea Pesos corporais e variações do peso corporal (g) Número de dias em relação à data de início Variação Variação absoluta percentual 1 1 1

Grupo Sexo Animal 1 8 8 8 8

3 f 22004 26,1 27.98 1.88 1.88 7.2 22005 26,65 20.82 -5.83 -5.83 -21.88 22006 26,07 25.58 -0.49 -0.49 -1.88 22007 27,02 27.11 0.09 0.09 0.33

Pesos corporais e variações do peso corporal (g) Número de dias em relação à data de início Variação Variação absoluta percentual 1 1 1

Grupo Sexo Animal 1 8 8 8 8 22008 26,31 26.88 0.57 0.57 2.17 ------ ------ ------ ------ ------ ------ Média 26,43 25.674 -0.756 -0.756 -2.81 DP 0,403 2.846 2.968 2.968 11.17 N 5 5 5 5 5

4 f 22009 26,59 28.37 1.78 1.78 6.69 22010 28,02 28.34 0.32 0.32 1.14 22011 27,21 26.25 -0.96 -0.96 -3.53 20012 26,33 25.7 -0.63 -0.63 -2.39 20013 27,06 26.96 -0.1 -0.1 -0.37 ------ ------ ------ ------ ------ ------ Média 27,042 27.124 0.082 0.082 0.31 DP 0,651 1.209 1.068 1.068 4 N 5 5 5 5 5

Dose nominal: Os animais receberam a dose de acordo com a Tabela 1 do Texto Tabela 24 Rastreamento de isolados bacterianos quanto à toxicidade em camundongos após uma dose única subcutânea Pesos corporais e variações do peso corporal (g) Número de dias em relação à data de início Variação Variação absoluta percentual 1 1 1

Grupo Sexo Animal 1 8 8 8 8

5 f 22014 24,27 24,79 0,52 0,52 2,14 22015 27 26,56 -0,44 -0,44 -1,63 22016 26,88 25,87 -1,01 -1,01 -3,76 22017 26,12 23,67 -2,45 -2,45 -9,38 22018 27,74 27,39 -0,35 -0,35 -1,26 ------ ------ ------ ------ ------ ------

Pesos corporais e variações do peso corporal (g) Número de dias em relação à data de início Variação Variação absoluta percentual 1 1 1

Grupo Sexo Animal 1 8 8 8 8 Média 26,402 25,656 -0,746 -0,746 -2,78 DP 1,323 1,463 1,098 1,098 4,25 N 5 5 5 5 5

6 f 22019 28,29 28,58 0,29 0,29 1,03 22020 26 27,64 1,64 1,64 6,31 22021 27,73 27,83 0,1 0,1 0,36 22022 27,2 21,62 -5,58 -5,58 -20,51 22023 24 24,78 0,78 0,78 3,25 ------ ------ ------ ------ ------ ------ Média 26,644 26,09 -0,554 -0,554 -1,91 DP 1,703 2,886 2,872 2,872 10,65 N 5 5 5 5 5

Dose nominal: Os animais receberam a dose de acordo com a Tabela 1 do Texto Tabela 25 Rastreamento de isolados bacterianos quanto à toxicidade em camundongos após uma dose única subcutânea Pesos corporais e variações do peso corporal (g) Número de dias em relação à data de início Variação Variação absoluta percentual 1 1 1

Grupo Sexo Animal 1 8 8 8 8

7 f 22024 26,81 27,35 0,54 0,54 2,01 22025 28,42 28,98 0,56 0,56 1,97 22026 26,73 27,06 0,33 0,33 1,23 22027 26,48 27,24 0,76 0,76 2,87 22028 27 28,5 1,5 1,5 5,56 ------ ------ ------ ------ ------ ------ Média 27,088 27,826 0,738 0,738 2,73

Pesos corporais e variações do peso corporal (g) Número de dias em relação à data de início Variação Variação absoluta percentual 1 1 1

Grupo Sexo Animal 1 8 8 8 8 DP 0,768 0,858 0,452 0,452 1,68 N 5 5 5 5 5

8 f 22029 30,52 30,39 -0,13 -0,13 -0,43 22030 25,61 20,28 -5,33 -5,33 -20,81 22031 25,35 26,14 0,79 0,79 3,12 22032 27,72 28,88 1,16 1,16 4,18 22033 26,99 21,48 -5,51 -5,51 -20,41 ------ ------ ------ ------ ------ ------ Média 27,238 25,434 -1,804 -1,804 -6,87 DP 2,078 4,448 3,335 3,335 12,66 N 5 5 5 5 5

Dose nominal: Os animais receberam a dose de acordo com a Tabela 1 do Texto Tabela 26 Rastreamento de isolados bacterianos quanto à toxicidade em camundongos após uma dose única subcutânea Temperaturas corporais (ºC) Número de dias em relação à data de início

Grupo Sexo Animal 8 Grupo Sexo Animal 8

1 f 21994 35,8 3 f 22004 37,2 21995 36,9 22005 37 21996 36,7 22006 36,8 21997 36,3 22007 37,1 21998 37,6 22008 37,1 ------ ------ ------ ------ Média 36,66 Média 37,16 DP 0,67 DP 0,34 N 5 N 5 2 f 21999 36,4 4 f 22009 37,3 22000 37,1 22010 37,2 22001 37,4 22011 37,6

Temperaturas corporais (ºC) Número de dias em relação à data de início

Grupo Sexo Animal 8 Grupo Sexo Animal 8 22002 36,8 20012 37,1 22003 36,4 20013 37,8 ------ ------ ------ ------ Média 36,82 Média 37,4 DP 0,44 DP 0,29 N 5 N 5

Dose nominal: Os animais receberam a dose de acordo com a Tabela 1 do Texto Tabela 27 Rastreamento de isolados bacterianos quanto à toxicidade em camundongos após uma dose única subcutânea Temperaturas corporais (°C) Número de dias em relação à data de início

Grupo Sexo Animal 8 Grupo Sexo Animal 8

5 f 22014 36,4 7 f 22024 37,3 22015 37,4 22025 37,7 22016 37,3 22026 37 22017 37,6 22027 37,6 22018 37,8 22028 37,8 ------ ------ ------ ------ Média 37,3 Média 37,48 DP 0,54 DP 0,33 N 5 N 5

6 f 22019 36,4 8 f 22029 38 22020 37,6 22030 38,1 22021 37,8 22031 36,8 22022 38,2 22032 38 22023 38,1 22033 37,2 ------ ------ ------ ------ Média 37,62 Média 37,62 DP 0,72 DP 0,58 N 5 N 5

Dose nominal: Os animais receberam a dose de acordo com a Tabela 1 do Texto

[0356] Embora modalidades preferidas da presente invenção te- nham sido mostradas e aqui descritas, será óbvio para os técnicos no assunto que tais modalidades são fornecidas a título de exemplo somente.

Inúmeras variações, alterações e substituições ocorrerão agora aos técnicos no assunto sem que se desviem da invenção.

Deve ser entendido que várias alternativas às modalidades da invenção aqui descritas podem ser empregadas na prática da invenção.

A intenção é que as reivindicações seguinte definam o âmbito da invenção e que os métodos e estruturas no âmbito dessas reivindicações e seus equivalen- tes sejam abrangidas pelas mesmas.

Claims (22)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição bacteriana, caracterizada pelo fato de que compreende: pelo menos uma cepa bacteriana geneticamente modificada que fixa nitrogênio atmosférico em um sistema agrícola, em que a cepa bacteriana compreende uma modificação em um ou mais genes selecio- nados a partir do grupo constituído por bcsll, bcsIII, yjbE, fhaB, pehA, glgA, otsB, treZ e cysZ.

2. Composição bacteriana, caracterizada pelo fato de que compreende: uma cepa bacteriana que promove o crescimento vegetal, em que a dita cepa foi remodelada para aumentar a colonização da dita cepa bacteriana promotora de crescimento vegetal em uma planta.

3. Composição bacteriana de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a dita colonização da dita cepa bacte- riana promotora de crescimento vegetal ocorre em uma raiz da dita planta.

4. Composição bacteriana de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a dita cepa bacteriana compreende uma modificação genética em uma enzima ou via envolvida na produção de exopolissacarídeos.

5. Composição bacteriana de acordo com a reivindicação 0, caracterizada pelo fato de que a dita modificação genética é em um gene selecionado a partir do grupo constituído por bcsII, bcsIII e yjbE.

6. Composição bacteriana de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a dita cepa bacteriana compreende uma modificação genética em uma enzima ou via envolvida na produção de uma hemaglutinina filamentosa.

7. Composição bacteriana de acordo com a reivindicação 0, caracterizada pelo fato de que a dita modificação genética é em um gene fhaB.

8. Composição bacteriana de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a dita cepa bacteriana compreende uma modificação genética em uma enzima ou via envolvida na produção de uma endo-poligalaturonase.

9. Composição bacteriana de acordo com a reivindicação 0, caracterizada pelo fato de que a dita modificação genética é em um gene pehA.

10. Composição bacteriana de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a dita cepa bacteriana compreende uma modificação genética em uma enzima ou via envolvida na produção de trealose.

11. Composição bacteriana de acordo com a reivindicação 0, caracterizada pelo fato de que a dita modificação genética é em um gene selecionado a partir do grupo constituído por: otsB e treZ.

12. Composição bacteriana de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a dita composição bacteriana é formu- lada para aplicação a um campo.

13. Composição bacteriana de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-12, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria promotora de crescimento vegetal fornece um nutriente à dita planta.

14. Composição bacteriana de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-13, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria promo- tora de crescimento vegetal fornece nitrogênio fixado à dita planta.

15. Composição bacteriana de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-14, caracterizada pelo fato de que a dita planta é selecionada a partir do grupo constituído por milho, cevada, trigo, sorgo, soja, e arroz.

16. Método para aumentar a colonização de uma cepa bacteriana promotora de crescimento vegetal em uma planta, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende: introduzir na dita cepa bacteriana promotora de crescimento vegetal uma modificação genética em um gene envolvido em uma via selecionada a partir do grupo constituído por: produção de exopolis- sacarídeos, produção de endo-poligalaturonase e produção de trealose.

17. Método para aumentar o nitrogênio disponível para uma planta, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende: aplicar uma pluralidade de bactérias remodeladas em uma planta, em que a dita pluralidade de bactérias remodeladas exibem expressão diminuída de glgA.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que as ditas bactérias remodeladas exibem menos assimi- lação de nitrogênio dentro das ditas bactérias remodeladas quando comparada à assimilação de nitrogênio de uma mesma quantidade de bactérias não remodeladas de uma mesma espécie que as ditas bacté- rias remodeladas.

19. Método para aumentar o nitrogênio disponível para uma planta, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende: aplicar uma pluralidade de bactérias remodeladas em uma planta, em que a dita pluralidade de bactérias remodeladas contêm uma quantidade aumentada de pelo menos um cofator de nitrogenase dentro das ditas bactérias remodeladas.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o dito cofator é enxofre.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que as ditas bactérias remodeladas aumentaram a expres- são de cysZ.

22. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que as ditas bactérias remodeladas aumentaram a expressão de um transportador de enxofre.