BR112020002636A2 - composições, métodos e/ou kits que compreendem um domínio extracelular recombinante de cd38 humano - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a uma composição que se liga a um anticorpo anti-CD38 e inclui uma sequência específica de uma forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 e/ou um fragmento do mesmo que interfere na atividade de ligação do anticorpo anti-CD38. A composição pode ser incluída em um kit para investigação de biomonitoração e ensaios de diagnóstico. A composição pode ser utilizada para neutralizar um anticorpo anti-CD38 em uma amostra e/ou para selecionar uma unidade de hemácias adequada para um paciente tratado com anticorpos anti-CD38.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES, MÉTODOS E/OU KITS QUE COMPREENDEM UM DOMÍNIO EXTRACELULAR RECOMBINANTE DE CD38 HUMANO".

DESCRIÇÃO LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS EM FORMATO ELETRÔNICO

[0001] O presente pedido está sendo depositado juntamente com uma Listagem de Sequências eletrônica como um arquivo de texto ASCII via EFS-Web. A Listagem de Sequências eletrônica é fornecida como um arquivo intitulado SEQLISTCD38PCT.txt, criado e salvo pela última vez em 31 de maio de 2018, que tem 73.000 bytes de tamanho. As informações na Listagem de Sequências eletrônica são aqui incorporadas na íntegra como referência.

ANTECEDENTES Campo

[0002] A presente invenção está relacionada com o campo dos produtos farmacêuticos. Algumas modalidades da presente invenção referem-se a composições, métodos e/ou kits que compreendem uma forma recombinante solúvel do domínio extracelular de CD38 e/ou de fragmentos do mesmo expressos em células de mamíferos e/ou em bactérias. A presente invenção também está relacionada com proteínas de fusão que compreendem um marcador de oligomerização e métodos para a oligomerização de proteínas de fusão recombinantes, utilizando esse marcador. Descrição do Estado da Técnica

[0003] Proteína transmembranar humana CD38 é altamente expressa em certo mieloma maligno. Anticorpos monoclonais anti- CD38 são utilizados como agentes terapêuticos para matar mieloma múltiplo e outros tumores hematológicos.

SUMÁRIO

[0004] Em algumas modalidades, é proporcionada uma composição para ligação com um anticorpo anti-CD38. Em algumas modalidades, a composição compreende uma forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 e/ou de um fragmento do mesmo que interfere com uma atividade de ligação de um anticorpo anti-CD38, em que uma sequência da forma recombinante solúvel do domínio extracelular de CD38 e/ou do fragmento do mesmo é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 7, SEQ ID Nº: 8, SEQ ID Nº: 9, SEQ ID Nº: 10, e SEQ ID Nº: 11, SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº: 13 e SEQ ID Nº: 14.

[0005] Em algumas modalidades da composição, o tamanho da forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 e/ou de um fragmento do mesmo varia de cerca de 5 aminoácidos e cerca de 300 aminoácidos.

[0006] Em algumas modalidades da composição, o anticorpo anti- CD38 é contra CD38 humano, CD38 não humano ou uma combinação dos mesmos.

[0007] Em algumas modalidades da composição, o anticorpo anti- CD38 é monoclonal, policlonal ou uma combinação dos mesmos.

[0008] Em algumas modalidades da composição, o anticorpo anti- CD38 é selecionado do grupo que consiste em Darzalex, isatuximab e MOR202.

[0009] Em algumas modalidades da composição, a forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 e/ou de um fragmento do mesmo é expressa em um sistema de expressão eucariótico ou um sistema de expressão procariótico.

[00010] Em algumas modalidades da composição, a concentração da forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 e/ou de um fragmento do mesmo varia de cerca de 1 mg/ml a cerca de 400 mg/ml.

[00011] Em algumas modalidades, é proporcionado um kit para investigação de biomonitoração e ensaios de diagnóstico. Em algumas modalidades, o kit compreende uma composição que contém uma forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 e/ou de um fragmento do mesmo que interfere na atividade de ligação de um anticorpo anti-CD38, em que uma sequência da forma recombinante solúvel do domínio extracelular de CD38 e/ou do fragmento do mesmo é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 7, SEQ ID Nº: 8, SEQ ID Nº: 9, SEQ ID Nº: 10, SEQ ID Nº: 11, SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº: 13 e SEQ ID Nº: 14, uma placa e reagentes para identificar a presença de anticorpos.

[00012] Em algumas modalidades do kit, a placa e os reagentes do kit são configurados para um ensaio ELISA.

[00013] Em algumas modalidades do kit, a placa e os reagentes do kit são aqueles de um kit de ensaio vendido sob a marca PROMONITOR® a partir da data de depósito do presente pedido.

[00014] Em algumas modalidades, é proporcionado um método de neutralização ou bloqueio da ligação de um anticorpo anti-CD38 em uma amostra. Em algumas modalidades, o método de neutralização ou bloqueio da ligação de um anticorpo anti-CD38 compreende proporcionar um volume da amostra que compreende o anticorpo anti- CD38, e incubar um volume da composição de acordo com a reivindicação 1 suficiente para neutralizar o anticorpo anti-CD38 na amostra.

[00015] Em algumas modalidades do método de neutralização ou bloqueio da ligação de um anticorpo anti-CD38, a amostra é selecionada do grupo que consiste em sangue, plasma e soro.

[00016] Em algumas modalidades do método de neutralização ou bloqueio da ligação de um anticorpo anti-CD38, o anticorpo anti-CD38 é selecionado do grupo que consiste em darzalex, isatuximab e MOR202.

[00017] Em algumas modalidades do método de neutralização ou bloqueio da ligação de um anticorpo anti-CD38, o volume da amostra varia de cerca de 25 μΙ a cerca de 250 μΙ.

[00018] Em algumas modalidades do método de neutralização ou bloqueio da ligação de um anticorpo anti-CD38, o volume da composição varia de cerca de 0,5 μΙ a cerca de 50 μΙ.

[00019] Em algumas modalidades do método de neutralização ou bloqueio da ligação de um anticorpo anti-CD38, a concentração do anticorpo anti-CD38 na amostra varia de cerca de 0,005 mg/ml a cerca de 2.000 mg/ml.

[00020] Em algumas modalidades do método de neutralização ou bloqueio da ligação de um anticorpo anti-CD38, a concentração da forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 e/ou de um fragmento do mesmo na composição varia de cerca de 1 mg/ml a cerca de 400 mg/ml.

[00021] Em algumas modalidades do método de neutralização ou bloqueio da ligação de um anticorpo anti-CD38, o efeito de neutralização da forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 e/ou de um fragmento do mesmo varia de cerca de 70% a cerca de 100%.

[00022] Em algumas modalidades do método de neutralização ou bloqueio da ligação de um anticorpo anti-CD38, a atividade de ligação do anticorpo anti-CD38 é selecionada do grupo que consiste em interferência no teste de pré-transfusão de sangue, interferência no teste de compatibilidade sanguínea e interferência na terapia com anticorpos.

[00023] Em algumas modalidades, é proporcionado um método para a seleção de uma unidade adequada de hemácias para um paciente tratado com anticorpos anti-CD38. Em algumas modalidades, o método para a seleção de uma unidade adequada de hemácias compreende obter uma amostra do paciente, essa amostra sendo sangue ou uma amostra derivada de sangue do paciente, neutralizar um anticorpo anti-CD38 na amostra de acordo com o método aqui proporcionado de neutralização ou de bloqueio da ligação de um anticorpo anti-CD38 em uma amostra, testar a amostra em relação à compatibilidade com unidades particulares de glóbulos vermelhos e selecionar a unidade de hemácias que é compatível com a amostra com base no teste.

[00024] Em algumas modalidades, é proporcionado um método para a remoção de anti-CD38 no plasma humano, no soro e/ou no sangue durante tratamento do plasma, soro e/ou sangue. Em algumas modalidades, o método para a remoção de anti-CD38 compreende a exposição do plasma, soro e/ou sangue a uma composição que compreende uma forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 e/ou de um fragmento do mesmo que interfere na atividade de ligação de um anticorpo anti-CD38, em que uma sequência da forma recombinante solúvel do domínio extracelular de CD38 e/ou do fragmento do mesmo é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 7, SEQ ID Nº: 8, SEQ ID Nº: 9, SEQ ID Nº: 10, SEQ ID Nº: 11, SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº: 13 e SEQ ID Nº: 14, em que a forma recombinante solúvel do domínio extracelular de CD38 e/ou do fragmento do mesmo é marcada com um marcador de afinidade.

[00025] Em algumas modalidades do método para a remoção de anti-CD38, o tratamento compreende um tratamento selecionado do grupo que consiste em hemodiálise, diálise peritoneal, hemofiltração, hemodiafiltração, terapia de troca de plasma e plasmaferese.

[00026] Em algumas modalidades do método para a remoção de anti-CD38, o marcador de afinidade é selecionado do grupo que consiste em glutationa-S-transferase (GST), pequenos modificadores do tipo ubiquitina (SUMO), AviTag, marcador calmodulina, marcador poliglutamato, marcador E, marcador FLAG, marcador HA, marcador His, marcador Myc, marcador NE, marcador S, marcador SBP, marcador Sof 1, marcador Sof 3, marcador Strep, marcador TC, marcador V5, marcador VSV, marcador Xpress, marcador Isopep, marcador Spy, marcador Snoop, Proteína Veículo de Biotina Carboxila (BCCP), marcador glutationa-S-transferase, marcador proteína fluorescente verde, outros marcadores de proteínas fluorescentes, HaloMarcador, marcador proteína de ligação da maltose, marcador Nus, marcador tiorredoxina, marcador Fc, marcadores desordenados intrinsecamente projetados contendo aminoácidos promotores de desordem, marcador Ty.

[00027] Em algumas modalidades é proporcionada uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo recombinante fundido com um marcador de oligomerização. Em algumas modalidades, o marcador de oligomerização compreende uma região Fc de imunoglobulina ou um fragmento da mesma e um domínio poli-His.

[00028] Em algumas modalidades da proteína de fusão, o marcador de oligomerização é capaz de formar uma ordem mais elevada de dímeros de até 12meros ou 6meros ou 2meros e, possivelmente, grau maiores de oligômeros.

[00029] Em algumas modalidades da proteína de fusão, o domínio poli-His possui entre 4 e 24 resíduos de histidina.

[00030] Em algumas modalidades da proteína de fusão, o domínio poli-His tem entre 6 e 10 resíduos de histidina.

[00031] Em algumas modalidades da proteína de fusão, o domínio poli-His tem 6, 8 ou 10 resíduos de histidina.

[00032] Em algumas modalidades da proteína de fusão, a sequência da região Fc de imunoglobulina é a SEQ ID Nº: 15. Em algumas modalidades, a sequência da região Fc de imunoglobulina tem pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID Nº: 15.

[00033] Em algumas modalidades da proteína de fusão, a sequência do polipeptídeo recombinante e/ou do fragmento do mesmo é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 25, SEQ ID Nº: 26 e SEQ ID Nº: 27.

[00034] Em algumas modalidades da proteína de fusão, a sequência da proteína de fusão e/ou do fragmento da mesma é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 7, SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº: 20 ou SEQ ID Nº: 21.

[00035] Em algumas modalidades, é proporcionado um marcador de oligomerização para uma proteína recombinante. Em algumas modalidades da presente invenção, o marcador de oligomerização compreende uma região Fc de imunoglobulina ou um fragmento da mesma e um domínio poli-His.

[00036] Em algumas modalidades do marcador de oligomerização para uma proteína recombinante, o domínio poli-His possui entre 4 e 24 resíduos de histidina.

[00037] Em algumas modalidades do marcador de oligomerização para uma proteína recombinante, o domínio poli-His tem entre 6 e 10 resíduos de histidina.

[00038] Em algumas modalidades do marcador de oligomerização para uma proteína recombinante, o domínio poli-His tem 6, 8 ou 10 resíduos de histidina.

[00039] Em algumas modalidades do marcador de oligomerização para uma proteína recombinante, a sequência da região Fc de imunoglobulina é a SEQ ID Nº: 15.

[00040] Em algumas modalidades do marcador de oligomerização para uma proteína recombinante, a sequência da região Fc de imunoglobulina tem pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID Nº:

15.

[00041] Em algumas modalidades do marcador de oligomerização para uma proteína recombinante, a sequência do marcador de oligomerização é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº: 16, SEQ ID Nº: 17 e SEQ ID Nº: 18.

[00042] Em algumas modalidades, é proporcionado um método para a oligomerização de uma proteína de fusão recombinante. Em algumas modalidades, o método para a oligomerização de uma proteína de fusão recombinante compreende as etapas de: a) fundir geneticamente uma sequência de nucleotídeos que codifica um marcador de oligomerização de acordo com a presente invenção com uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo; b) expressar a sequência de nucleotídeo resultante da etapa a) em uma célula hospedeira; c) purificar a proteína de fusão recombinante obtida na etapa b).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00043] A Figura 1 mostra uma modalidade de um aminoácido sinteticamente concebido que codifica CD38ecd-Fc-10H recombinante (SEQ ID Nº: 7).

[00044] A Figura 2 mostra uma modalidade de um aminoácido sinteticamente concebido que codifica CD38ecd-10H recombinante (SEQ ID Nº: 8).

[00045] A Figura 3 mostra uma modalidade de um aminoácido sinteticamente concebido que codifica 10H-MBPt-CD38ecd recombinante (SEQ ID Nº: 9).

[00046] A Figura 4 mostra uma modalidade de um aminoácido sinteticamente concebido que codifica 10Ht-CD38ecd recombinante (SEQ ID Nº: 10).

[00047] A Figura 5 mostra uma modalidade de um aminoácido sinteticamente concebido que codifica epítopos de 10H-MBPt-DARA recombinantes (SEQ ID Nº: 11).

[00048] A Figura 6 mostra uma modalidade da sequência de aminoácidos do domínio extracelular de CD38 (CD38ecd) (SEQ ID Nº: 1).

[00049] A Figura 7 mostra uma modalidade da sequência de aminoácidos de epítopos de DARA (SEQ ID Nº: 2).

[00050] A Figura 8 mostra uma modalidade da sequência de aminoácidos de epítopos de DARA (epítopo nº 1) (SEQ ID Nº: 3).

[00051] A Figura 9 mostra uma modalidade da sequência de aminoácidos de epítopos de DARA (epítopo nº 2) (SEQ ID Nº: 4).

[00052] A Figura 10 mostra uma modalidade da sequência de aminoácidos de rato Fc-10H (SEQ ID Nº: 5).

[00053] A Figura 11 mostra uma modalidade da sequência de aminoácidos de 10H-MBPt (SEQ ID Nº: 6).

[00054] A Figura 12 descreve um esquema das várias proteínas CD38 recombinantes, usando estruturas alternativas.

[00055] A Figura 13 mostra dados relacionados com a identificação de um anticorpo anti-D de baixo título após a inibição de anti-CD38 por CD38ecd-Fc-10H.

[00056] A Figura 14 mostra dados relacionados com a identificação de anticorpos inesperados quase indetectáveis após a inibição de anti- CD38 por CD38ecd-Fc-10H.

[00057] A Figura 15 mostra dados relacionados com a inibição de anti-CD38 por CD38ecd-Fc-10H ou rhCD38.

[00058] A Figura 16 mostra uma funcionalidade equivalente de pré- tratamentos com CD38ecd-Fc-10H em diferentes temperaturas e tempos de incubação.

[00059] A Figura 17 mostra uma melhor funcionalidade de CD38ecd-Fc-10H e CD38ecd-flex-Fc-10H contra CD38ecd-10H.

DESCRIÇÃO DETALHADA CD38ecd RECOMBINANTE HUMANO

[00060] Daratumumab (DARA) é um anticorpo monoclonal humano (mAb) a imunoglobulina (Ig)G1k que se direciona à proteína transmembranar CD38 altamente expressa em células de mieloma malignas (de Weers, M. et al. Daratumumab, a novel therapeutic human CD38 monoclonal antibody, induces killing of multiple myeloma and other hematological tumors. J. Immunol., 1 de fevereiro de 2011; 186(3): 1840-8; Lokhorst, H.M. et al. Targeting CD38 with Daratumumab monotherapy in multiple myeloma. N. Engl. J. Med., 24 de setembro de 2015; 373(13): 1207-19) e é usado para terapia humana. Em 2016, monoterapia com DARA foi aprovada pela Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento de pacientes com mieloma múltiplo que receberam pelo menos três linhas anteriores de terapia.

[00061] Tem sido relatado que DARA interfere nos testes de compatibilidade sanguínea de rotina (Chapuy, C.I. et al. Resolving the DARA interference with blood compatibility testing. Transfusion. Junho de 2015; 55(6 Pt 2): 1545-54; Oostendorp, M. et al. When blood transfusion medicine becomes complicated due to interference by monoclonal antibody therapy. Transfusion. Junho de 2015; 55 (6 Pt 2): 1555-62). DARA reconhece especificamente domínio extracelular CD38 endógeno na superfície das células de glóbulos vermelhos (RBCs), levando a reações positivas falsas em certos testes de diagnóstico in vitro.

[00062] Amostras de plasma de pacientes tratados com DARA produzem consistentemente reações positivas em testes antiglobulina indiretos (IATs), tais como testes de detecção de anticorpos (rastreio), painéis de identificação de anticorpos e referências cruzadas de globulina anti-humana (AHG). Detecção de anticorpos irregulares no plasma do paciente é mascarada por até seis meses após a última infusão de DARA. Anticorpos inesperados/irregulares, como aloanticorpos e autoanticorpos, são todos os anticorpos que podem causar incompatibilidade em transfusões de sangue. Os anticorpos irregulares são mais geralmente do tipo IgG. Essa interferência impede testes de pré-transfusão de rotina e complica a seleção de unidades de RBCs adequadas para pacientes tratados com DARA. Além de DARA, dois outros anticorpos específicos para CD38 (isatuximab e MOR202) estão em desenvolvimento clínico e vários outros estão em desenvolvimento pré-clínico (van de Donk, N.W. et al. Monoclonal antibodies targeting CD38 in hematological malignancies and beyond. Immunol. Rev. Março de 2016; 270 (1): 95-112).

[00063] Para superar esse problema, soluções diferentes foram desenvolvidas e relatadas. Cada solução tem suas próprias vantagens e desvantagens, que são descritas na Tabela 1 (Chapuy, C.I. et al. DARA-DTT Study Group* for the BEST Collaborative. International validation of a dithiothreitol (DTT)-based method to resolve the daratumumab interference with blood compatibility testing. Transfusion. Dezembro de 2016; 56(12): 2964-2972).

Tabela 1 - Vantagens e desvantagens de métodos correntes de atenuação da interferência anti-CD38. TABELA 1. Vantagens e desvantagens de métodos correntes de atenuação da interferência anti-CD38

Método Mecanismo de Vantagens Desvantagens atenuação

DTT6 CD38 desnatura em Econômico Deve fornecer unidades K células reagentes Bastante fácil Sempre falha em detectar anticorpos a: KEL, DO, IN, JMH, KN, LW DTT comumente usado em muitos bancos de sangue Falha frequentemente em detectar anticorpos a: YT, LU, MER2, CROM12 Tripsina6 CD38 cliva a partir de Econômico Menos comumente usado do que DTT células reagentes Bastante fácil Sempre falha em detectar anticorpos a: Anticorpos a antígenos do Bpa, Ch/Rg, XG, IN, JMH, M, N, EnaTS, Ge2, Ge4, LU, grupo KEL detectados.

MER2, KN, DO12 Rastreio de Expressão de CD38 Econômico Não comercialmente disponível anticorpos a diminui em células do células do cordão umbilical Bastante fácil Não é prático para identificação de anticorpos cordão Tratamento necessário sem Sempre falha em detectar anticorpos a: umbilical8 produto químico ou enzima Lea, Ch/Rg, AnWj, Sda Falha frequentemente em detectar anticorpos a: Leb, P1, Lua, Lub, Yta, JMH, Xga, Vel, Bg, KN, DO, Fy312 CD38 solúvel6,7,13 Neutralização de anti- Fácil Econômico CD38 Sem anticorpos perdidos Curta validade Comercialmente disponível Exigência de validação adicional Funciona com qualquer anti- CD38 Anti-CD38 Neutralização de anti- Fácil Não disponível comercialmente idiótipo6,7 CD38 Sem anticorpos perdidos Exigência de validação adicional Precisa de um anti-idiótipo diferente para cada anti- CD38 do fabricante Correspondência Método não Comumente realizado em Raramente, anticorpos clinicamente significativos de fenótipos sorológico bancos de sangue seriam perdidos dependendo do grau de correspondência Fenotipificação inicial deve ser efetuada antes de começar anti-CD38 Raramente, mesmo com correspondência estendida, pode ser produzido anticorpo adicional clinicamente significativo Disponibilidade de unidades correspondentes e possível obtenção de tempo estendido Correspondência Método não Permite identificação de Econômico de genótipos9 sorológico indivíduos em que faltam antígenos de alta frequência Raramente, resulta falhar o genótipo em predizer (por exemplo, Yta) corretamente o fenótipo

Pode ser realizado após ter Raramente, anticorpos clinicamente significativos começado tratamento com seriam perdidos dependendo do grau de anti-CD38 correspondência Raramente, mesmo com correspondência estendida, pode ser produzido anticorpo adicional clinicamente significativo Disponibilidade de unidades correspondentes e possível obtenção de tempo estendido

[00064] A neutralização de anti-CD38 por uma forma solúvel de domínio extracelular CD38 e/ou um fragmento do mesmo (sCD38ecd, também aqui referido como sCD38) é um método atraente porque não danifica qualquer epítopo na superfície de RBCs, pode neutralizar qualquer anticorpo ant-CD38 e sua aplicação em testes laboratoriais de rotina exige apenas a incubação do sangue do paciente, plasma e/ou amostra de soro com sCD38. A principal desvantagem é o elevado custo possível de sCD38ecd recombinante. Essa desvantagem é subjetiva porque proteínas recombinantes são amplamente utilizadas para vários diagnósticos in vitro (DIV), permitindo que o custo seja mantido acessível para uso de rotina. Uma desvantagem adicional possível de utilizar sCD38 é a diluição do sangue do paciente e/ou do plasma que ocorre quando se neutralizam anticorpos anti-CD38 usando uma solução de sCD38, o que poderia levar à falta de anticorpos irregulares clinicamente relevantes de grupos sanguíneos no rastreio e/ou identificação subsequente de anticorpos. Portanto, é desejável ter sCD38 altamente concentrado disponível de tal forma que somente pequenos volumes de sCD38 sejam necessários quando se neutralizam anticorpos anti-CD38 na amostra de sangue e/ou plasma de um paciente.

[00065] Soluções alternativas incluem o uso de desnaturantes químicos para tratar os glóbulos vermelhos que têm um efeito muito amplo e não específico. Atualmente, o método de escolha para eliminar a interferência de DARA é tratamento com DTT dos glóbulos vermelhos, levando CD38 a ser reduzido de tal modo que não seja reconhecido pelos anticorpos DARA. No entanto, esse tratamento também destrói alguns outros antígenos dos grupos sanguíneos, cujos anticorpos não podem mais ser detectados e identificados nas respectivas células. Por exemplo, o tratamento dos glóbulos vermelhos em um kit células vermelhas do sangue reagentes com o agente redutor ditiotreitol (DTT) e refazer o teste anulará efetivamente a ligação de DARA com CD38 na superfície de células vermelhas do sangue. No entanto, DTT inativa e destrói vários antígenos na superfície dos glóbulos vermelhos rompendo não especificamente ligações dissulfeto, por exemplo, o sistema Kell de antígenos que são importantes na tipificação sanguínea e reações de transfusão.

[00066] Em contraste, sCD38 não danifica qualquer epítopo na superfície de RBCs e pode neutralizar qualquer anticorpo anti-CD38, contanto que sCD38 compreenda um ou mais epítopos que podem ser ligados pelo anticorpo anti-CD38.

[00067] A presente invenção refere-se a composições, métodos e/ou kit que compreendem sCD38 recombinante humano e seus fragmentos. A presente revelação também se refere a composições, métodos e/ou kits que compreendem sCD38 recombinante humano e seus fragmentos expressos em sistemas de expressão eucarióticos e/ou procarióticos.

[00068] Em algumas modalidades, o sCD38 recombinante e/ou seus fragmentos são solubilizados utilizando métodos conhecidos no estado da técnica. Em algumas modalidades, os presentes inventores desenvolveram um sCD38 recombinante como bloqueador para interferir em DARA e/ou outros anticorpos terapêuticos anti-CD38 em desenvolvimento. Portanto, em algumas modalidades, a presente invenção está relacionada com sCD38 recombinante e/ou seus fragmentos para interferir em um ou mais anticorpos que se ligam a CD38. Em algumas modalidades, sCD38 recombinante e/ou fragmentos do mesmo interferem em um ou mais anticorpos policlonais que se ligam a CD38. Em algumas modalidades, sCD38 recombinante e/ou fragmentos dos mesmos interferem em um ou mais anticorpos monoclonais que se ligam a CD38. Em algumas modalidades, sCD38 recombinante e/ou seus fragmentos interferem em um ou mais anticorpos policlonais e monoclonais que se ligam a CD38. Em algumas modalidades, sCD38 recombinante e/ou fragmentos dos mesmos interferem em uma ou mais proteínas que se ligam a CD38.

[00069] Em algumas modalidades, a presente invenção está relacionada com a proteína sCD38 recombinante e/ou fragmentos dessa proteína para interferir na ligação com DARA. Em algumas modalidades, sCD38 recombinante e/ou seus fragmentos interferem na ligação de isatuximab. Em algumas modalidades, sCD38 recombinante e/ou seus fragmentos interferem na ligação de MOR202. Em algumas modalidades, sCD38 recombinante e/ou seus fragmentos interferem em ligação de um ou mais de DARA, isatuximab ou MOR202. Em algumas modalidades, sCD38 e/ou um fragmento do mesmo referem-se à proteína CD38 humana e/ou seus fragmentos. Em algumas modalidades, sCD38 e/ou um fragmento seu referem-se à proteína CD38 humana. Exemplos não limitativos de fontes não humanas de CD38 incluem cães, gatos, coelho, rato, cobaia, macaco, vaca, carneiro, cabra, zebra etc.

[00070] Em algumas modalidades, CD38ecd (expresso como sCD38) é tal como apresentado na Figura 6. Em algumas modalidades, CD38ecd (expresso como sCD38) é tal como apresentado na SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, CD38ecd é um fragmento da proteína CD38 que compreende os resíduos 45 a 300 (SEQ ID Nº: 1) da sequência de aminoácidos de CD38 humano de acordo com UniProt Nº P28907. Em algumas modalidades, o CD38ecd é um fragmento da parte da proteína CD38 prevista para ser exposta na superfície de uma célula quando expressa naturalmente em uma superfície celular. Em algumas modalidades , o CD38ecd é o domínio extracelular putativo da proteína CD38 quando expressa naturalmente na superfície de uma célula.

[00071] Em algumas modalidades, a presente invenção está relacionada com a expressão de CD38ecd (SEQ ID Nº: 1) como sCD38, em que CD38ecd (SEQ ID Nº: 1) é parte da proteína CD38 humana prevista para ser exposta em uma superfície celular. Em algumas modalidades, a presente invenção está relacionada com a expressão de um fragmento de CD38ecd (SEQ ID Nº: 1) como sCD38, em que CD38ecd (SEQ ID Nº: 1) é parte da proteína CD38 humana prevista para ser exposta em uma superfície celular.

[00072] Seria concebível para aquele versado no estado da técnica que CD38ecd recombinante ou um fragmento seu podem ser expressos usando um ou mais sistemas de expressão conhecidos no estado da técnica. Exemplos não limitativos incluem sistemas bacterianos de expressão e/ou sistemas de expressão eucarióticos que incluem, mas sem limitação, células de inseto, levedura e tipos de células de mamíferos.

[00073] Em algumas modalidades, o sistema de expressão é uma sistema de expressão eucariótico que compreende células de mamíferos, células de levedura, células de inseto etc. Em algumas modalidades, o sistema de expressão eucariótico é selecionado do grupo que consiste em células CHO, HEK, BHK, NSO, Sp2/0, COS, C127, HT-10780, PER.C6, HeLa e/ou Jurkat. Em algumas modalidades, vantagens não limitativas de um sistema de expressão eucariótico (por exemplo, compreendendo células de mamíferos) relacionadas com a expressão de sCD38 ou seus fragmentos incluem o enovelamento correto da sCD38 ou seus fragmentos para a ligação por anticorpos anti-CD38, modificações corretas pós-tradução, separação adequada nos compartimentos de vias secretoras, funcionalidade adequada etc.

[00074] Em algumas modalidades, sCD38 é expresso como uma proteína de fusão que compreende uma região Fc de imunoglobulina

IgG1, como mostrado na Figura 1 (aqui referido como CD38ecd-Fc- 10H; SEQ ID Nº: 7). Em algumas modalidades, CD38ecd-Fc-10H é uma proteína recombinante codificada por um ácido nucleico sinteticamente concebido que codifica um fragmento de uma região constante de imunoglobulina IgG2. Em algumas modalidades, CD38ecd Fc-1-OH é uma proteína recombinante codificada por um ácido nucleico sinteticamente concebido que codifica um fragmento de uma região constante de imunoglobulina IgG2. Em algumas modalidades, CD38ecd-Fc-10H é uma proteína recombinante codificada por um ácido nucleico sinteticamente concebido que codifica um fragmento de uma região constante de imunoglobulina IgG3. Em algumas modalidades, CD38ecd-Fc-1-OH é uma proteína recombinante codificada por um ácido nucleico sinteticamente concebido que codifica um fragmento de uma região constante de imunoglobulina IgG4. Em algumas modalidades, CD38ecd-Fc-10H é uma proteína recombinante codificada por um ácido nucleico sinteticamente concebido que codifica um fragmento de uma imunoglobulina de qualquer um dos isótipos de IgG de região constante acima com uma região articulada modificada de modo que seja expressa uma fusão de Fc monomérica.

Em algumas modalidades, CD38ecd-Fc-10H compreende CD38ecd fundido no término N-terminal da SEQ ID Nº: 5 (Figura 10) contendo um fragmento de uma região constante de imunoglobulina IgG que compreende uma região articulada, um domínio CH2 e um domínio CH3, fragmento este que é fundido no término C com um marcador de 10 histidinas e um códon de terminação.

Em algumas modalidades, CD38ecd-Fc-10H é expresso em uma superfície celular.

Em algumas modalidades, a região constante de IgG1 murina melhora um ou mais de expressão, solubilidade e estabilidade de uma proteína expressa.

Em algumas modalidades, a região constante de IgG1 murina melhora um ou mais de expressão, solubilidade e estabilidade de uma proteína expressa em superfície celular. Em algumas modalidades, o marcador His permite a purificação de CD38ecd Fc-1-OH por purificação por Cromatografia de Afinidade com Metal Imobilizado (IMAC).

[00075] Como aqui usado, o termo "ácido nucleico" pode ser baseado em DNA, baseado em RNA ou uma combinação dos mesmos. Exemplos não limitativos incluem plasmídeos, cosmídeos, fase, vetores virais, vetores adenovirais, minicírculos, ácidos nucleicos modificados, análogos de ácidos nucleicos etc. que são bem conhecidos no estado da técnica. Em algumas modalidades , um ácido nucleico é concebido para expressão eficiente de uma proteína, um peptídeo ou ambos em um sistema de expressão eucariótico, um sistema de expressão procariótico ou ambos. Também estão englobados vetores de vacinas baseados em ácidos nucleicos. Exemplos não limitativos incluem vetores de vacina de DNA, vetores de vacina de RNA, vetores de vacina à base de vírus (por exemplo, vetores de vacina à base de vírus adenoassociados) etc.

[00076] Sem estar ligado a qualquer teoria, acredita-se no estado da técnica que o estado natural para CD38 em uma membrana é dimérico e/ou tetramérico (Bruzzone, S. et al. Dimeric and tetrameric forms of catalytically active transmembrane CD38 in transfected HeLa cells. FEBS Lett . 21 de agosto de 1998; 433(3): 275-8). Em algumas modalidades, CD38ecd-Fc-10H é expresso como uma proteína dimérica. Em algumas modalidades, a proteína dimérica é um homodímero de CD38ecd-Fc-10H. Em algumas modalidades, CD38ecd-Fc-10H pode ser expresso como uma proteína oligomérica, compreendendo mais de duas cópias de CD38ecd-Fc-10H. Em algumas modalidades, CD38ecd-Fc-10H é expresso como uma proteína oligomérica. Em algumas modalidades, CD38ecd-Fc-10H é expresso como uma proteína oligomérica, compreendendo mais de duas cópias de CD38ecd-Fc-10H a 12 cópias de CD38ecd-Fc-10H. Em algumas modalidades, o marcador His permite purificação de CD38ecd-Fc-10H por purificação por IMAC.

[00077] Em algumas modalidades, sCD38 é expresso como uma proteína de fusão como mostrado na Figura 2 (aqui referido como CD38ecd-10H; SEQ ID Nº: 8). Em algumas modalidades, CD38ecd- 10H é uma proteína recombinante codificada por um ácido nucleico sinteticamente concebido que codifica CD38ecd com um marcador His (ou seja, um marcador que compreende 10 resíduos de histidina). Em algumas modalidades, o marcador His permite a purificação de CD38ecd-10H por purificação por IMAC.

[00078] Em algumas modalidades, a atividade do D38ecd-Fc-10H oligomérico é melhor do que a atividade do CD38ecd-10H monomérico em solução, sobre uma superfície sólida ou ambos. Em algumas modalidades, "atividade" refere-se à capacidade de sCD38 em neutralizar um anticorpo anti-CD38. Em algumas modalidades, "atividade" refere-se à capacidade de sCD38 em neutralizar um ou mais efeitos relacionados com o anticorpo anti-CD38 em uma superfície sólida ou em solução, ou ambos. Em algumas modalidades, a eficácia/eficiência da "atividade" varia de cerca de > 70% a cerca de 100%. Em algumas modalidades, a eficácia/eficiência da "atividade" é de cerca de 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%, ou um valor no intervalo definido por quaisquer dois dos valores acima mencionados. Em algumas modalidades, a eficácia/eficiência da "atividade" varia de cerca de > 90% a 100%. Em algumas modalidades, a eficácia/eficiência da "atividade" é de cerca de > 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 98,5; 99; 99,5 ou 100%, ou um valor em um intervalo definido por quaisquer dois dos valores acima mencionados.

[00079] Em algumas modalidades, sCD38 é expresso em um sistema de expressão bacteriano. Em algumas modalidades,

vantagens não limitativas de um sistema de expressão bacteriano incluem custo inferior ainda e manutenção da funcionalidade de uma proteína eucariótica. Em algumas modalidades, o sistema de expressão é um sistema de expressão bacteriano. Em algumas modalidades, sCD38 é expresso como uma proteína de fusão, como mostrado na Figura 3 (aqui referido como 10H-MBPt-CD38ecd; SEQ ID Nº: 9). Em algumas modalidades, 10H-MBPt-CD38ecd é uma proteína recombinante codificada por um ácido nucleico sinteticamente concebido que codifica CD38ecd fundido em seu término N com um marcador de 10H-MBPt (SEQ ID Nº: 6; Figura 11 ou SEQ ID Nº: 19) que compreende 10 resíduos de histidina e a proteína inteira bacteriana de ligação a maltose (MBP) (UniProt Nº P0AEX9; resíduos de aminoácidos 29 a 393). Em algumas modalidades, o marcador de 10 histidinas é usado para a purificação por IMAC. Em algumas modalidades, a MBP melhora um ou mais de expressão, solubilidade ou enovelamento.

[00080] Em algumas modalidades, 10H-MBPt-CD38ecd compreende uma sequência de clivagem da protease do vírus do mosaico do tabaco (TEV). Em algumas modalidades, 10H-MBPt- CD38ecd compreende uma sequência de clivagem da protease de TEV entre MBP e CD38ecd (Figura 3). Em algumas modalidades, a sequência de clivagem da protease de TEV entre MBP e CD38ecd permite a clivagem de 10H-MBP de CD38ecd resultando em CD38ecd purificado sem quaisquer sequências adicionais.

[00081] Um ou mais outros sítios de clivagem de protease e não protease também são contemplados. Exemplos não limitativos incluem protease do vírus da febre aftosa (FMDV), Arg-C proteinase, Asp-N endopeptidase, BNPS-escatol, caspases, quimotripsina de alta especificidade, quimotripsina de baixa especificidade, clostripaína (clostridiopeptidase B), CNBr, enterocinase, fator Xa, ácido fórmico,

glutamil endopeptidase, granzime B, hidroxilamina, ácido lodosobenzoico, LysC, LysN, NTCB (ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico), elastase de neutrófilos, pepsina, prolina-endopeptidase, proteinase K, peptidase I de estafilococos, termolisina, trombina, tripsina e outras enzimas específicas a sítios conhecidas daquele versado no estado da técnica.

[00082] Em algumas modalidades, sCD38 é expresso como uma proteína de fusão, como mostrado na Figura 4 (aqui referido como 10Ht-CD38ecd; SEQ ID Nº: 10). Em algumas modalidades, 10Ht- CD38ecd é uma proteína recombinante codificada por um ácido nucleico sinteticamente concebido que codifica CD38ecd fundido em seu término N com um marcador que compreende 10 resíduos de histidina. Em algumas modalidades, o marcador de 10 histidinas é usado para purificação IMAC. Em algumas modalidades, 10H- CD38ecd compreende uma sequência de clivagem da protease do vírus do mosaico do tabaco (TEV). Em algumas modalidades, 10H- CD38ecd compreende uma sequência de clivagem da protease de TEV entre 10H e CD38ecd (Figura 4). Em algumas modalidades, a sequência de clivagem da protease de TEV entre 10H e CD38ecd permite clivar 10H de CD38ecd resultando em CD38ecd purificado sem quaisquer sequências adicionais.

[00083] Em algumas modalidades, sCD38 é expresso como uma proteína de fusão, como mostrado na Figura 5 (aqui referido como epítopos de 10H-MBPt-DARA; SEQ ID Nº: 11). Em algumas modalidades, 10H-MBPt-DARAepítopos é uma proteína recombinante codificada por um ácido nucleico sinteticamente concebido que codifica a sequência de aminoácidos (a partir dos resíduos 230 a 280 de UniProt Nº P28907; como mostrado na SEQ ID Nº: 2) de CD38 humano compreendendo dois epítopos de DARA fundidos em seu término N com um marcador de 10 histidinas e a proteína de ligação de maltose como mostrado na Figura 5. Em algumas modalidades, os dois epítopos de DARA são DARAepitope Nº 1 (UniProt Nº P28907 a partir dos resíduos 235 a 246, como mostrado na SEQ ID Nº: 3) e DARAepitope Nº 2 (UniProt Nº P28907 a partir dos resíduos 267 a 280, como mostrado na SEQ ID Nº: 4).

[00084] Em algumas modalidades, um ou mais epítopos de sCD38 podem ligar-se a um anticorpo anti-CD38 com uma afinidade mensurável de cerca de 10e-6 (afinidade por peptídeo) a 10e-10 (afinidade muito forte por anticorpo).

[00085] Em algumas modalidades, um marcador de 10 histidinas é usado para purificação IMAC. Em algumas modalidades, 10H-MBPt- DARAepítopos compreende uma sequência de clivagem da protease do vírus do mosaico do tabaco (TEV). Em algumas modalidades, 10H- MBPt-DARAepítopos compreende uma sequência de clivagem da protease de TEV entre MBP e DARAepítopos (Figura 5). Em algumas modalidades, a sequência de clivagem da protease de TEV entre MBP e DARAepítopos permite a clivagem de 10H-MBP de DARAepítopos resultando em DARAepítopos purificados sem quaisquer sequências adicionais. Em algumas modalidades, o MBP melhora um ou mais de expressão, solubilidade ou enovelamento.

[00086] Em algumas modalidades, o fragmento de sCD38 é um ou mais epítopos em CD38ecd que são ligados por um ou mais anticorpos policlonais e/ou monoclonais anti-CD38 policlonal. Em algumas modalidades, o tamanho da sCD38 e/ou de seu fragmento varia de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 300 aminoácidos. Em algumas modalidades, o tamanho varia de cerca de 10 a cerca de 150 aminoácidos. Em algumas modalidades, o tamanho é de cerca de 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300 ou 350 aminoácidos, ou um valor na faixa definida por quaisquer dois dos valores acima mencionados.

[00087] Um ou mais outros marcadores para purificação, solubilização, detecção etc. são também contemplados. Exemplos não limitativos incluem GST, SUMO, AviTag, marcador calmodulina, marcador poliglutamato, marcador E, marcador FLAG, marcador HA, marcador His, marcador Myc, marcador NE, marcador S, marcador SBP, marcador Sof 1, marcador Sof 3, marcador Strep, marcador TC, marcador V5, marcador VSV, marcador Xpress, marcador Isopep, marcador Spy, marcador Snoop, BCCP (Proteína Veículo de Biotina Carboxila), marcador glutationa-S-transferase, marcador proteína fluorescente verde, outros marcadores de proteínas fluorescentes, HaloMarcador, marcador proteína de ligação da maltose, marcador Nus, marcador tiorredoxina, marcador Fc, marcadores desordenados intrinsecamente projetados contendo aminoácidos promotores de desordem (por exemplo, P, E, S, T, A, Q, G), marcador Ty etc.

[00088] A presente invenção está relacionada com uma ou mais composições, métodos e/ou kits que compreendem qualquer uma ou mais das modalidades de sCD38 e/ou seus fragmentos aqui descritos e suas variantes.

[00089] Em algumas modalidades, uma ou mais composições, métodos e/ou kits que compreendem sCD38 e/ou seus fragmentos referem-se a um pré-tratamento de sangue universal, soro e/ou plasma. Em algumas modalidades, o pré-tratamento atenua qualquer interferência por anticorpo anti-CD38 na amostra na detecção e/ou identificação de anticorpos irregulares, bem como outros anticorpos, por uma ou mais técnicas conhecidas daquele versado no estado da técnica.

[00090] Em algumas modalidades, a interferência por um anticorpo anti-CD38 compreende uma ou mais de interferência nos testes de compatibilidade sanguínea, interferência em terapia com anticorpos, aglutinação de glóbulos vermelhos do sangue, interferência em testes de pré-transfusão sanguínea e similares.

[00091] Em algumas modalidades, o pré-tratamento neutraliza qualquer anticorpo anti-CD38 para permitir a detecção e/ou identificação de anticorpos irregulares, bem como outros anticorpos, por uma ou mais técnicas conhecidas daquele versado no estado da técnica na amostra. Exemplos não limitativos de uma ou mais técnicas conhecidas daquele versado no estado da técnica incluem ensaios em tubo convencionais, cartões múltiplos, testes de aderência de hemácias em fase sólida, tecnologias de gel, quaisquer outras tecnologias atuais ou futuras para a detecção/identificação de anticorpos irregulares.

[00092] Atenuação de interferência por e/ou neutralização de anticorpos anti-CD38 por pré-tratamento permite a detecção e/ou identificação de anticorpos irregulares, bem como outros anticorpos que são relevantes e importantes para testes de compatibilidade. Portanto, em algumas modalidades, a neutralização por sCD38 e/ou seus fragmentos de anticorpos anti-CD38 em uma amostra de plasma, sangue e/ou soro pode ser combinada com usos para diagnóstico, por exemplo, rastreio de anticorpos, identificação de anticorpos irregulares dos grupos sanguíneos etc.

[00093] Em algumas modalidades, sCD38 e/ou seus fragmentos podem ser utilizados como um reagente de pré-tratamento no rastreio em sangue, rastreio em plasma, rastreio em soro, ou uma combinação dos mesmos para anticorpos irregulares, bem como outros anticorpos. Em algumas modalidades, sCD38 e/ou seus fragmentos podem ser usados como um antígeno em investigação de biomonitoração e ensaios de diagnóstico. Por exemplo, em algumas modalidades, sCD38 e/ou seus fragmentos podem ser usados em PROMONITOR® ELISA para testar biodisponibilidade e imunogenicidade do fármaco, por exemplo, de anticorpos anti-CD38 tais como DARA, isatuximab ou

MOR202, em pacientes com prescrição de terapia biológica para o tratamento de doenças inflamatórias crônicas e outras indicações (por exemplo, mieloma múltiplo). Em algumas modalidades, sCD38 pode ser usado para a família de testes PROMONITOR® para medir tanto os níveis de fármaco quanto os níveis de anticorpos antifármaco com ELISA validado. Uma brochura para a família de testes PROMONITOR® é anexada como Apêndice A.

[00094] Em algumas modalidades, a eficácia de atenuação de interferência por e/ou neutralização de anticorpos anti-CD38 por pré- tratamento pode ser testada utilizando uma ou mais técnicas conhecidas daquele versado no estado da técnica. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais composições aqui proporcionadas podem ser usadas em DG Gel®, um único cartão de gel de 8 colunas baseado na tecnologia de aglutinação de colunas para a tipificação de grupos sanguíneos e investigação de anticorpos inesperados. Assim, em algumas modalidades, as composições aqui proporcionadas podem ser utilizadas como um reagente cartões DG Gel® para testar a eficiência de neutralização anti-CD38. Em algumas modalidades, a eficácia varia de cerca de > 70% a cerca de 100%. Em algumas modalidades, a eficácia é de cerca de 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%, ou um valor em um intervalo definido por quaisquer dois dos valores acima mencionados. Em algumas modalidades, a eficácia varia de cerca de > 90% a 100%. Em algumas modalidades, a eficácia é de cerca de > 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 98,5; 99; 99,5 ou 100%, ou um valor em um intervalo definido por quaisquer dois dos valores acima mencionados. Em algumas modalidades, o volume de uma ou mais composições que compreendem sCD38 utilizado em cartões DG Gel® podem variar de cerca de 0,1 μΙ a cerca de 40 μΙ. Em algumas modalidades, o volume das composições que compreendem sCD38 utilizado em cartões DG Gel® podem variar de cerca de 0,4 μΙ a cerca de 10 μΙ. Em algumas modalidades, o volume da composição que compreende sCD38 utilizado em cartões DG Gel® é de cerca de 2 μΙ.

[00095] Em algumas modalidades, as composições aqui proporcionadas podem ser usadas em ensaios para bloquear e/ou neutralizar um ou mais de DARA, isatuximab ou MOR202 em amostras de sangue, soro e/ou plasma dos pacientes.

[00096] Em algumas modalidades, as composições, métodos e/ou kits aqui proporcionados podem ser usados em ensaios para remover um ou mais anticorpos anti-CD38 de amostras de sangue, soro e/ou plasma do paciente. Por exemplo, uma amostra do paciente compreendendo anticorpo anti-CD38 pode ser incubada com uma composição que compreende sCD38 e/ou fragmentos do mesmo compreendendo um ou mais marcadores aqui descritos para permitir que o sCD38 marcado e/ou seus fragmentos liguem-se ao anticorpo anti-CD38. O complexo de sCD38-anti-CD38 pode então ser removido por uma ou mais técnicas de cromatografia de afinidade conhecidas daquele versado no estado da técnica.

[00097] Em algumas modalidades, um sCD38 marcado e/ou seus fragmentos podem ser usados para remover anti-CD38 no plasma, soro e/ou sangue humano durante hemodiálise, diálise peritoneal, hemofiltração, hemodiafiltração, terapia de troca de plasma, plasmaferese, aférese e leucorredução. Por exemplo, um sCD38 marcado e/ou seus fragmentos podem ser utilizados para remover um ou mais de DARA, isatuximab ou MOR202 em amostras de sangue, soro e/ou plasma do paciente.

[00098] Em algumas modalidades, um intervalo de concentrações de anticorpo anti-CD38 em uma amostra varia de cerca de 0,005 μl/ml a cerca de 2.000 μl/ml. Em algumas modalidades, um intervalo de concentrações de anticorpo anti-CD38 em uma amostra varia de cerca de 0,05 μl/ml a cerca de 1.000 μl/ml. Em algumas modalidades, um intervalo de concentrações de anticorpo anti-CD38 em uma amostra varia de cerca de 0,05 μl/ml a cerca de 500 μl/ml. Em algumas modalidades, um intervalo de concentrações de anticorpo anti-CD38 em uma amostra varia de cerca de 0,05 μl/ml a cerca de 20 μl/ml. Em algumas modalidades, um intervalo de concentrações de anticorpo anti- CD38 em uma amostra varia de amostra de cerca de 0,05 μl/ml a cerca de 100 μl/ml. Em algumas modalidades, um intervalo de concentrações de anticorpo anti-CD38 em uma amostra é de cerca de 0,005; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1, 5; 25; 50; 75; 100; 150; 250; 300; 400; 500; 750; 1.000;

1.500 ou 2.000 μl/ml, ou um valor em um intervalo definido por quaisquer dois dos valores acima mencionados. Em outras modalidades, um intervalo de concentrações de anticorpo anti-CD38 em uma amostra varia de cerca de 0,05 μl/ml a cerca de 2.000 μl/ml.

[00099] Em algumas modalidades, o volume de uma ou mais composições que compreendem sCD38 e/ou seus fragmentos usado nos métodos e/ou kits aqui descritos pode variar de cerca de 0,05 μΙ a cerca de 50 μΙ. Em algumas modalidades, o volume de uma ou mais composições que compreendem sCD38 e/ou seus fragmentos utilizado nos métodos e/ou kits aqui descritos pode variar de cerca de 0,25 μΙ a cerca de 10 μΙ. Em algumas modalidades, o volume de uma ou mais composições que compreendem sCD38 utilizado nos métodos e/ou kits aqui descritos é de cerca de 2 μΙ.

[000100] Em algumas modalidades, o volume de uma amostra (por exemplo, sangue, plasma, soro etc.) pode variar de cerca de 1 μΙ a cerca de 100 μΙ. Em algumas modalidades, o volume de uma amostra (por exemplo, sangue, plasma, soro etc.) pode variar de cerca de 100 μΙ a cerca de 5 ml. Em algumas modalidades, o volume de uma amostra (por exemplo, sangue, plasma, soro etc.) pode variar de cerca de 5 ml a cerca de 500 ml. Em algumas modalidades, o volume de uma amostra (por exemplo, sangue, plasma, soro etc.) pode variar de cerca de 250 ml a cerca de 10.000 ml. Em algumas modalidades, o volume de uma amostra (por exemplo, sangue, plasma, soro etc.) pode variar de cerca de 25 μΙ a cerca de 250 μΙ.

[000101] Em algumas modalidades, a concentração de sCD38 e/ou seus fragmentos nas composições aqui proporcionadas varia de cerca de 0,25 mg/ml a cerca de 400 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de sCD38 e/ou seus fragmentos nas composições e composições em kits) aqui proporcionadas varia de cerca de 4 mg/ml a cerca de 100 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de sCD38 e/ou seus fragmentos nas composições aqui proporcionadas varia de cerca de 0,25; 0,5; 1; 2,5; 5; 7,5; 10; 15; 20; 25; 30; 50; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 225; 250; 275; 300; 325; 350; 375 ou 400 mg/ml ou um valor no intervalo definido por quaisquer dois dos valores acima mencionados. Em algumas modalidades, a concentração de sCD38 e/ou seus fragmentos nas composições aqui proporcionadas é de cerca de 20 mg/ml.

[000102] Em algumas modalidades, um intervalo de concentração de sCD38 e/ou seus fragmentos para uma inibição ótima de anti-CD38 varia de cerca de 1 mg/ml a cerca de 500 mg/ml. Em algumas modalidades, um intervalo de concentração de sCD38 e/ou seus fragmentos para uma inibição ótima de anti-CD38 varia de cerca de 5 mg/ml a cerca de 100 mg/ml.

[000103] Em algumas modalidades , a estabilidade das modalidades de sCD38 e/ou seus fragmentos de acordo com a presente invenção varia de cerca de 30 dias até cerca de 300 dias a 37°C. Em algumas modalidades, a estabilidade de sCD38 e/ou seus fragmentos varia de cerca de 6 meses a cerca de 48 meses a 2 a 8°C.

[000104] Em algumas modalidades, as composições aqui descritas podem ser fornecidas sob a forma de um ou mais kits.

[000105] Em algumas modalidades, as composições e as composições em kits são fornecidas em forma líquida, sólida ou semissólida. Exemplos não limitativos incluem cápsulas, comprimidos, óvulos, inserções, hóstia, grânulos, péletes, contas, pílulas, sachê, "sprinkle", filme, creme, gel, xarope, sólido reconstituível, suspensão, emulsão, trocisco, pó, triturado, plaquetas etc.

[000106] Em algumas modalidades, as composições e as composições em kits compreendem ingredientes ativos, ingredientes inativos, excipientes, aditivos e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos não limitativos incluem compostos de polímeros, sais inorgânicos, aminoácidos (exemplos não limitantes incluem arginina, histidina, prolina etc.), ligantes, lubrificantes, desintegrantes, agentes tensoativos, espessantes, agentes de revestimento, ajustadores de pH, antioxidantes, agentes aromatizantes, conservantes, corantes etc. Exemplos não limitativos de outros veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem veículos líquidos tais como água, álcool, emulsão e veículos sólidos, tais como gel, pó etc. Em algumas modalidades, as composições e as composições em kits podem compreender sais e tampões adequados para tornar estáveis os veículos de administração e permitir a absorção por células-alvo.

[000107] Em algumas modalidades, veículos farmaceuticamente aceitáveis podem incluir um ou mais solventes, tampões, soluções, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes quelantes de metais (por exemplo, EDTA), agentes isotônicos e agentes de retardamento de absorção, e similares.

[000108] Composições aquosas e composições em kits compreendem uma quantidade eficaz de sCD38 e/ou de um fragmento do mesmo (por exemplo, como uma proteína, ácido nucleico ou ambos) em um veículo de administração (por exemplo, lipossomas,

nanopartículas ou outros complexos), dissolvido ou disperso em um veículo ou meio aquoso farmaceuticamente aceitável. Outros excipientes incluem polímero solúvel em água, polímeros insolúveis em água, materiais hidrofóbicos, materiais hidrofílicos, ceras, agentes de desintegração, superdesintegrantes, diluentes, ligantes etc.

[000109] Como aqui empregado, o termo "indivíduo" ou "paciente" refere-se a qualquer animal vertebrado, incluindo, sem limitação, humanos, primatas não humanos, gado, ovelhas, porcos, cabras, cavalos, cães, gatos, ratinhos, ratos, cobaias, frangos, perus, patos, gansos. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um macho ou uma fêmea.

MARCADOR DE OLIGOMERIZAÇÃO PARA PROTEÍNAS DE FUSÃO

[000110] A presente invenção também se refere a proteínas de fusão que compreendem um marcador de oligomerização e métodos para a oligomerização de uma proteína de fusão recombinante. A presente invenção também se refere a marcadores de oligomerização de proteínas de fusão recombinantes que compreendem uma região Fc de imunoglobulina ou um fragmento da mesma e um domínio poli-His.

[000111] Proteínas de fusão podem opcionalmente ser fundidas com um marcador de oligomerização para a formação de oligômeros tais como dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros e/ou oligômeros de ordem superior. Um marcador de oligomerização pode favorecer uma estequiometria específica, por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros ou pentâmeros, ou um marcador de oligomerização pode permitir uma distribuição de oligômeros com diferentes estequiometrias. Um marcador de oligomerização pode ser concebido para formar homo- oligômeros, embora a distinção entre homo-oligômeros e hetero- oligômeros não seja particularmente limitativa. Em algumas modalidades, o marcador de oligomerização é capaz de formar um homodímero, homotrímero, homotetrâmero ou homopentâmero, por exemplo, em que a oligomerização de um polipeptídeo recombinante resulta em um oligômero predominantemente monodisperso. Um marcador de oligomerização proporciona várias vantagens para proteínas de fusão que são usadas em ensaios. Um marcador de oligomerização pode orientar polipeptídeos recombinantes um em relação ao outro. Um marcador de oligomerização também pode aumentar a afinidade de um polipeptídeo recombinante por um alvo. Um marcador de oligomerização também pode aumentar a avidez de um polipeptídeo recombinante que se refere à acumulação funcional de afinidade com vários grupos de ligação.

[000112] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo recombinante fundido com um marcador de oligomerização. Em algumas modalidades, a sequência do polipeptídeo recombinante e/ou do fragmento do mesmo é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 25, SEQ ID Nº: 26 e SEQ ID Nº: 27. Em algumas modalidades, o marcador de oligomerização compreende uma região Fc de imunoglobulina ou um fragmento seu e um domínio poli-His. Em algumas modalidades, a sequência da proteína de fusão e/ou do fragmento da mesma é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 7, SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº: 20 e SEQ ID Nº: 21.

[000113] Em algumas modalidades, o domínio poli-His é um domínio de purificação fundido com uma proteína recombinante. Em algumas modalidades, o domínio poli-His é um marcador de afinidade fundido com uma proteína recombinante. Em algumas modalidades, o domínio poli-His é um marcador de oligomerização fundido com uma proteína recombinante. Em algumas modalidades, o domínio poli-His está compreendido em um marcador de oligomerização juntamente com outros domínios. Em algumas modalidades, o domínio poli-His está compreendido em um marcador de oligomerização com uma região Fc de imunoglobulina ou um fragmento seu. Um domínio poli-His de acordo com as modalidades aqui contém tipicamente entre 2 e 24 resíduos de histidina. Em algumas modalidades, o domínio poli-His contém entre 6 e 12 resíduos de histidina. Um domínio poli-His de acordo com as modalidades aqui contém tipicamente 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos de histidina.

[000114] Em algumas modalidades, a proteína de fusão aqui é expressa fundida com um marcador de oligomerização que compreende uma região Fc de imunoglobulina ou um fragmento desta. Em algumas modalidades, o marcador de oligomerização inclui a sequência de aminoácidos de uma região articulada do domínio Fc de imunoglobulina. Em algumas modalidades, esta proteína de fusão é expressa fundida com um marcador de oligomerização que compreende uma região Fc de imunoglobulina ou um fragmento da mesma. Em algumas modalidades, o marcador de oligomerização compreende uma região constante de imunoglobulina IgG1. Em algumas modalidades, o marcador de oligomerização compreende uma região constante de imunoglobulina IgG2. Em algumas modalidades, o marcador de oligomerização compreende uma região constante de imunoglobulina IgG3. Em algumas modalidades, o marcador de oligomerização compreende uma região constante de imunoglobulina IgG4. Em algumas modalidades, o marcador de oligomerização compreende um fragmento de uma imunoglobulina de qualquer um dos isótipos de IgG de região constante acima, com uma região articulada modificada de modo que seja expressa uma fusão de Fc monomérico. Em algumas modalidades, o marcador de oligomerização compreende um fragmento de uma região constante de imunoglobulina IgG que compreende uma região articulada, um domínio CH2 e um domínio CH3, fragmento este que é fundido no término C com um domínio poli-His e um códon de terminação.

[000115] As espécies de um domínio Fc de imunoglobulina podem ser selecionadas com base no uso pretendido de uma proteína de fusão. Por exemplo, as espécies do domínio Fc de imunoglobulina podem ser selecionadas de modo que um reagente específico alcance ou ignore o domínio Fc de imunoglobulina em um ensaio. Um domínio Fc de ratinho pode ser útil, por exemplo, se nenhum anticorpo secundário antirrato é usado para detectar outros anticorpos de ratinho em um ensaio. Similarmente, um domínio Fc de ratinho pode ser útil para reticular uma proteína de fusão em um suporte sólido ou outro componente de um ensaio que utiliza um anticorpo antirratinho. As espécies de domínio Fc podem ser humanas, de ratinho, coelho, rato, hamster, cobaia, cabra, ovelha, cavalo, galinha ou uma quimera de qualquer uma das espécies anteriores, embora as espécies de domínio Fc não sejam particularmente limitativas.

[000116] Um marcador de oligomerização exemplar é o domínio Fc de IgG de ratinho compreendendo a região articulada, o que permite que polipeptídeos recombinantes que compreendem o marcador de oligomerização formem um homodímero covalente.

[000117] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da região Fc do marcador de oligomerização é a SEQ ID Nº: 15. Em algumas modalidades, a sequência da região Fc de imunoglobulina tem pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID Nº: 15. Em algumas modalidades, a sequência da região Fc de imunoglobulina tem entre 90% e 100% de identidade com a SEQ ID Nº: 15. Em algumas modalidades, a sequência da região Fc de imunoglobulina tem pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID Nº: 15.

[000118] Além dos benefícios de marcadores de oligomerização anteriormente descritos, domínios Fc muitas vezes aumentam a expressão e/ou secreção de um polipeptídeo recombinante em células de expressão.

[000119] Domínios Fc podem também auxiliar a purificação de um polipeptídeo recombinante na medida em que métodos de purificação de polipeptídeos que compreendem domínios Fc são bem conhecidos.

[000120] Outros marcadores de oligomerização são conhecidos no estado da técnica e a escolha específica de marcador de oligomerização não é particularmente limitante. Em algumas modalidades, a proteína de fusão da invenção compreende um polipeptídeo recombinante e/ou um fragmento seu. Em algumas modalidades, o polipeptídeo recombinante e/ou o fragmento do mesmo é qualquer proteína de interesse que pode ser fundida com um marcador de oligomerização de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo recombinante é uma forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo recombinante é um domínio extracelular de CD47 modificado ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo recombinante é um domínio extracelular modificado de plaquetas de glicoproteína Ibα (Gplbα) ou um fragmento seu. Em algumas modalidades, a sequência do polipeptídeo recombinante e/ou seu fragmento é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 25, SEQ ID Nº: 26 e SEQ ID Nº: 27.

[000121] Em algumas modalidades, a sequência do marcador de oligomerização é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº: 16, SEQ ID Nº: 17 e SEQ ID Nº: 18.

[000122] Em algumas modalidades, o marcador de oligomerização compreende ainda uma região ou domínio com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 28, SEQ ID Nº: 29 e SEQ ID Nº: 30.

[000123] A presente invenção refere-se também a métodos para a oligomerização de uma proteína de fusão recombinante. Em algumas modalidades, os métodos para a oligomerização de uma proteína de fusão recombinante compreendem as etapas de: a) fundir geneticamente uma sequência de nucleotídeos que codifica um marcador de oligomerização de acordo com as modalidades das presentes descrições com uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo; b) expressar a sequência de nucleotídeos resultante da etapa a) em uma célula hospedeira; c) purificar a proteína de fusão recombinante obtida na etapa b).

[000124] Em algumas modalidades, o marcador de oligomerização usado no método para a oligomerização de uma proteína de fusão recombinante compreende uma região Fc de imunoglobulina ou um fragmento da mesma e um domínio poli-His. Em algumas modalidades, o domínio poli-His contém entre 2 e 24 resíduos de histidina. Em algumas modalidades, o domínio poli-His contém entre 6 e 12 resíduos de histidina. Um domínio poli-His de acordo com as modalidades tipicamente contém 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos de histidina. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da região Fc do marcador de oligomerização utilizado no método para a oligomerização de uma proteína de fusão recombinante é a SEQ ID Nº: 15. Em algumas modalidades, a sequência da região Fc de imunoglobulina tem pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID Nº:

15. Em algumas modalidades, a sequência da região Fc da imunoglobulina tem entre 90% e 100% de identidade com a SEQ ID Nº: 15. Em algumas modalidades, a sequência da região Fc da imunoglobulina tem pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID ID Nº: 15.

[000125] Em algumas modalidades, a sequência do marcador de oligomerização usado no método para a oligomerização de uma proteína de fusão recombinante é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº: 16, SEQ ID Nº: 17 e SEQ ID Nº: 18.

[000126] Em algumas modalidades, o marcador de oligomerização usado no método para a oligomerização de uma proteína de fusão recombinante compreende ainda uma região ou domínio com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 28, SEQ ID Nº: 29 e SEQ ID Nº: 30.

[000127] Em algumas modalidades, a sequência da proteína de fusão recombinante obtida na etapa c) do método para a oligomerização de uma proteína de fusão recombinante aqui descrito é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 7, SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº: 20 e SEQ ID Nº: 21.

EXEMPLOS

[000128] Os seguintes exemplos não são limitantes e outras variantes contempladas por aquele versado no estado da técnica estão incluídas no escopo desta invenção. Exemplo 1

[000129] Várias versões da proteína CD38 foram construídas de modo a tentar recriar o enovelamento correto da CD38ecd e bloquear um mAb terapêutico de causar problemas na detecção do ensaio de anticorpos irregulares. Uma versão era domínio extracelular monomérico fundido com um marcador de afinidade (CD38ecd-10His). Em uma segunda versão, fusão CD38ecd-Fc, CD38ecd foi fundida com uma região Fc murina (articulação-CH2-CH3) que assim cria versões diméricas (dupletos) mantidas juntas pela região Fc. Em outra versão, fusão CD38ecd-Fc-10H, CD38ecd foi fundido com um marcador oligomérico, que assim cria versões multiméricas. Em outra versão, CD38ecd-Clath, CD38ecd foi fundido com um domínio de clatrina. O domínio de clatrina permitiu trimerização. Outra versão, CD38ecd-p53, envolveu fusão com um domínio p53. O domínio p53 é sabido produzir tetramerização. Em todos os casos, estas são novas composições não encontradas na natureza. As versões foram expressas em células de mamíferos a fim de preservar quaisquer modificações pós-tradução essencial para a manutenção da função de CD38. Exemplo 2

[000130] Uma proteína CD38 recombinante é vendida por várias empresas para fins de pesquisa. No entanto, a quantidade e o preço da CD38 comercialmente disponível são proibitivos para muitas finalidades. Tentativas por outras empresas para produzir CD38 recombinante estão repletas de problemas, incluindo os problemas de solubilidade, obtenção de alta concentração e avidez dos epítopos por ancoragem, e nenhuma dessas proteínas CD38 comercialmente disponíveis tem a composição das proteínas CD38 e/ou seus fragmentos como aqui proporcionada.

[000131] Testes iniciais com os sistemas de expressão aqui descritos mostram que CD38ecd-Fc-10H era solúvel e funcional. Importante, a CD38ecd-Fc-10H recombinante foi solúvel em altas concentrações (até 35 mg/ml), permitindo o uso de tão pouco quanto 2 μΙ da solução concentrada de CD38ecd Fc em cartões DG Gel®. Exemplo 3 - Títulos de anti-CD38 em amostras de pacientes

[000132] O objetivo desta experiência foi estabelecer a quantidade mínima de proteína CD38ecd-Fc-10H necessária para inibir e neutralizar total e amplamente anticorpo anti-CD38 de concentração e título desconhecidos encontrado em amostras de plasma de pacientes, a fim de eliminar completamente o efeito de anticorpo anti-CD38. Plasma de três pacientes após o tratamento com anti-CD38 foi titulado em um ensaio indireto de antiglobulina (IAT) com hemácias reagentes para rastreio de anticorpos. A experiência foi realizada como segue:

[000133] Titulação de Plasma: 75 μΙ de plasma contendo anti-CD38 de cada paciente foram aritmeticamente titulados em PBS, pH 7,4, até 1:8.192.

[000134] Rastreio de Anticorpos: 50 μΙ de uma célula de Screen-Cyte 0,8% (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suíça) e 25 μΙ do respectivo título de plasma foram pipetados na câmara de incubação de uma microcoluna em um DG Gel Coombs Card (Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e incubados durante 15 min a 37°C. O cartão foi então centrifugado em uma centrífuga para cartões DG Gel e os resultados, lidos.

[000135] Os títulos estabelecidos variaram entre 1:1 e 1:4.096. Concluiu-se que para um pré-tratamento eficaz de plasma de paciente com sCD38, um título de anticorpos anti-CD38 de pelo menos 1:2.048, melhor 1:8.192, teve de ser neutralizado. Exemplo 4 - sCD38 inibe anticorpos anti-CD38 Exemplo 4a: Inibição usando uma preparação contendo 2,2 mg/ml de CD38ecd-Fc-10H

[000136] Preparação da amostra (ensaio de inibição): 25 μΙ de plasma de paciente 1 contendo anti-CD38, não diluídos ou aritmeticamente titulados em PBS, pH 7,4, foram incubados com 2 μΙ a 32 μΙ de uma preparação contendo 2,2 mg/ml de CD38ecd-Fc-10H e incubados durante 15 min a 37°C. Como experimento de controle, 2 μΙ a 32 μΙ de PBS, pH 7,4, em vez de CD38ecd-Fc-10H, foram pipetados no plasma.

[000137] Rastreio de anticorpos: 50 μΙ de Screen-Cyte 0.8%, Célula Nº 3, lote 17.005 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suíça), e 25 μΙ do plasma pré-tratado como acima foram pipetados na câmara de incubação de uma microcoluna em um DG Gel Coombs Card (lote

17612.01, exp 2018-02; Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e incubados durante 15 min a 37°C. O cartão foi então centrifugado em uma centrífuga para cartões DG Gel e os resultados, lidos. Um resultado completamente negativo (um botão plano de células no fundo da microcoluna) foi indicativo de uma inibição completa do anti- CD38 presente na amostra do paciente.

[000138] Com 2 μΙ de CD38ecd-Fc10H-20170313-NTAEPCPBS, uma diluição 1:16 do plasma pôde ser completamente inibida. Com 32 μΙ de 2,2 mg/ml de CD38ecd-Fc10H-20170313-NTAEPCPBS, o anticorpo anti-CD38 em plasma não diluído pôde ser completamente inibido. Exemplo 4b: Inibição utilizando uma preparação contendo 35mg/ml de CD38ecd-Fc-10H

[000139] Preparação da amostra (ensaio de inibição): 25 μΙ de plasma contendo anti-CD38 de paciente 2 (apresentando um título de anti-CD38 de 1:4.096) foram incubados com 2 μΙ de 35 mg/ml de CD38ecd-Fc-10H durante 15 min a 37°C. Como experimento de controle, 2 μΙ de PBS, pH 7,4, em vez de CD38ecd-Fc-10H, foram pipetados no plasma.

[000140] Rastreio de anticorpos: 50 μΙ de cada célula de Screen- Cyte 0.8%, lote 17.017 (Medion Diagnostics Grifols, Duedingen, Suíça) e 25 μΙ de plasma pré-tratado como acima foram pipetados na câmara de incubação de uma microcoluna em um DG Gel Coombs Card (lote

16681.01, exp. 2017-11; Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e incubados durante 15 min a 37°C. O cartão foi então centrifugado em uma centrífuga para cartões DG Gel e os resultados, lidos. Um resultado completamente negativo (um botão plano de células no fundo da microcoluna) foi indicativo de uma inibição completa do anti- CD38 presentes na amostra do paciente.

[000141] Com 2 μΙ de CD38ecd-Fc10H-20170915-PROTA, plasma do paciente 2 pôde ser completamente inibido.

Exemplo 4c: Inibição de plasma simulado de paciente com DARA (0,5 mg/ml) usando uma preparação contendo 33mg/ml de CD38ecd-Fc-10H

[000142] Geração de plasma simulado de paciente com DARA adicionado: fármaco terapêutico anti-CD38 (Darzalex) foi adicionado ao plasma AB humano sob uma concentração final de 0,5 mg/ml.

[000143] Preparação da amostra (ensaio de inibição): 25 μΙ de plasma simulado de paciente com DARA foram incubados com 2 μΙ de 33 mg/ml de CD38ecd-Fc-10H durante 15 min a 37°C. Como experimento de controle, 2 μΙ de PBS, pH 7,4, em vez de CD38ecd-Fc- 10H, foram pipetados no plasma.

[000144] Rastreio de anticorpos: 50 μΙ de cada célula de Screen- Cyte 0.8%, lote 180.005 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suíça) e 25 μΙ do plasma simulado pré-tratado como acima foram pipetados na câmara de incubação de uma microcoluna em um DG Gel Coombs Card (lote 17133.01, exp. 2018-10; Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e incubados durante 15 min a 37°C. O cartão foi então centrifugado em uma centrífuga para cartões DG Gel e os resultados, lidos. Um resultado completamente negativo (um botão plano de células no fundo da microcoluna) foi indicativo de uma inibição completa do anti-CD38 presente na amostra do paciente.

[000145] Com 2 μΙ de CD38ecd-FC10H-GDS20171106, uma concentração de 0,5 mg/ml adicionado ao plasma do doador pôde ser completamente inibida. Exemplo 5 - Inibição de anti-CD38 por CD38ecd-10H é específica e não interfere em aloanticorpos relevantes do grupo sanguíneo subjacente Exemplo 5a: Detecção de um baixo título de anti-D em plasma simulado com DARA após pré-tratamento com 2,2 mg/ml CD38ecd-Fc- 10H

[000146] Plasma simulado do paciente sob tratamento com Darzalex foi enriquecido com um anticorpo policlonal humano anti-D que se tornou detectável por um painel de rastreio comercial apenas após pré-tratamento com sCD38. No plasma simulado enriquecido pré- tratado com PBS foi impossível detectar corretamente o anti-D, uma vez que Darzalex interferiu no procedimento de rastreio de anticorpos, conduzindo assim a reações positivas em todas as células do ensaio de rastreio de anticorpos derivadas da reação das células de rastreio com Darzalex.

[000147] (1) Experimentos de Titulação de Fármacos: Fármaco terapêutico anti-CD38 (Darzalex; lote GHS0901, Janssen, EUA) foi usado para preparar um plasma simulado de paciente após diluição em plasma AB humano, em que o plasma humano AB foi misturado com um anticorpo policlonal humano anti-D. 75 μΙ de fármaco terapêutico anti-CD38 (Darzalex) foram titulados aritmeticamente em plasma AB humano para gerar plasma simulado de paciente. 50 μΙ de Screen-Cyte 0.8%, Célula Nº 3, lote 17.005 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suíça), e 25 μΙ de cada título de Darzalex foram pipetados na câmara de incubação de uma microcoluna em um DG Gel Coombs Card (lote 17612.01, exp. 2018-02; Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e incubados durante 15 min a 37°C. O cartão foi então centrifugado em uma centrífuga para cartões DG Gel e os resultados, lidos. Esse experimento estabeleceu o título de anti-CD38 contido em Darzalex como 1:64.000.

[000148] (2) Titulação de anti-D: Soro de doador com anti-D de alto título de foi aritmeticamente titulado em plasma AB humano. 50 μΙ de Screen-Cyte 0,8%, Célula Nº 1, lote 17.005 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suíça) e 25 μΙ de cada título de anticorpos anti-D foram pipetados na câmara de incubação de uma microcoluna em um DG Gel Coombs Card (lote 17612.01, exp. 2018-02; Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e incubados durante 15 min a 37°C. O cartão foi então centrifugado em uma centrífuga para cartões DG Gel e os resultados, lidos. Esse experimento estabeleceu o título de anti-D no soro de doador como 1:16.000 com célula 1.

[000149] (3) Plasma simulado de paciente: Uma diluição de 1:512 de anti-D em plasma AB humano foi misturada com diluições de 1:16.000 e 1:8.000 de Darzalex a fim de alcançar um plasma simulado com uma concentração de anti-CD38 que pode ser inibida com 2 μΙ de 2,2 mg/ml de CD38ecd-Fc-10H e tem propriedades anti-D próximas do limite de detecção. O plasma simulado enriquecido reagiu positivamente com todas as três células no rastreio de anticorpos realizado como fornecido abaixo em (5). Além disso, 100 μΙ de plasma do paciente 2 contendo anti-CD38 (TF1707/527) foram adicionados com diluição de 1:4.000 de anti-D.

[000150] (4) Preparação da amostra (ensaio de inibição): 25 μΙ de plasma simulado enriquecido preparado como descrito em (1) a (3) acima foram incubados, respectivamente, com 2 μΙ ou 32 μΙ de 2,2 mg/ml de CD38ecd-Fc-10H (CD38ecd-Fc10H-20170313- NTAEPCPBS) durante 15 min a 37°C. Como experimento de controle, 2 μΙ ou 32 μΙ de PBS, pH 7,4, em vez de CD38ecd-Fc-10H, foram pipetados no plasma.

[000151] (5) Rastreio de anticorpos: 50 μΙ de Screen-Cyte 0,8%, Células Nºs 1-3, lote 17.005 (Medion Diagnostics Grifols, Duedingen, Suíça) e 25 μΙ de plasma pré-tratado como acima foram pipetados na câmara de incubação de uma microcoluna em um DG Gel Coombs Card (lote 17612.01, exp. 2018-02; Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e incubados durante 15 min a 37°C. O cartão foi então centrifugado em uma centrífuga para cartões DG Gel e os resultados, lidos. Um resultado completamente negativo (um botão plano de células no fundo da microcoluna) foi indicativo de uma inibição completa do anti-CD38 presente na amostra do paciente.

[000152] Com 2 μΙ de 2,2 mg/ml de CD38ecd-Fc10H-20170313- NTAEPCPBS, o plasma simulado enriquecido pode ser completamente inibido na célula negativa D Nº 3 do Painel de Rastreio de Anticorpos. Com 32 μΙ de CD38ecd-Fc10H-20170313- NTAEPCPBS, o plasma enriquecido do paciente 2 pôde ser completamente inibido na célula negativa nº 3 de Darzalex do painel de rastreio de anticorpos (Figura 13). As células 1 e 2 permaneceram positivas após a inibição, indicando que o teste de inibição realizado como em (4) não tem impacto na reatividade do anticorpo anti-D enriquecido. Os experimentos de controle com plasma simulado não enriquecido (inibição completa de células nºs 1-3 e com plasma enriquecido usando PBS em vez de CD38ecd-Fc-10H (nenhuma inibição em absoluto) mostraram os resultados esperados (Figura 13).

[000153] Exemplo 5b: Inibição de anti-CD38 por CD38ecd-Fc-10H permite a detecção de anticorpos relevantes inesperados em plasma cravado de doador anti-CD38.

[000154] Plasma misturado com anti-CD38 de doador contendo anticorpos inesperados foi usado para avaliar a detecção de anticorpos inesperados após inibição completa de anti-CD38 por CD38ecd-Fc-10H. Anti-D, -E, -c, -Cw, -K, -Fya, -Jka, -S, -s, -M, -Lua, - Cob tornou-se detectável por um painel de rastreio comercial apenas após pré-tratamento com CD38ecd-Fc-10H.

[000155] (1) Geração de plasma simulado de paciente: plasma AB de doador misturado com anti-CD38 e com aloanticorpos: Fármaco terapêutico anti-CD38 (Darzalex) foi enriquecido em plasma AB humano em uma concentração final de 0,5 mg/ml. Cada aloanticorpo listado acima foi titulado aritmeticamente em plasma AB humano: 50 µl de Screen-Cyte 0,8% (para cada anticorpo, uma célula do painel positiva para o antígeno correspondente foi escolhida com base na matriz produto-antígeno) e 25 µl de cada diluição do aloanticorpo testado foram pipetados na câmara de incubação de uma microcoluna em um DG Gel Coombs Card (lote 17133.01, exp. 2018-10; Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e incubados durante 15 min a 37°C. O cartão foi então centrifugado em uma centrífuga para cartões DG Gel e os resultados, lidos. A última diluição que deu uma reação positiva quase detectável foi usada como diluição para detectar o anticorpo inesperado em plasma de doador misturado com anti-CD38.

[000156] (2) Preparação da amostra (teste de inibição): 25 µl de plasma de doador misturado com anti-CD38 contendo anticorpos inesperados foram misturados com 2 µl de 33,4 mg/mL de CD38ecd- Fc-10H e incubados durante 15 min a 37°C.

[000157] (3) Rastreio de anticorpos: 50 µl de Células Nºs 1-3 Screen- Cyte a 0,8%, lote 17.026 ou 18.003 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suíça) e 25 µl do plasma simulado pré-tratado foram pipetados na câmara de incubação de uma microcoluna em um cartão DG Gel Coombs Card (lote 17133.01, exp. 2018-10; Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e incubados durante 15 min a 37°C. O cartão foi então centrifugado em uma centrífuga para cartões DG Gel e os resultados, lidos.

[000158] Uma razão de 2μΙ de CD38ecd-Fc-10H (33,4 mg/ml) por 25 μΙ de plasma permitiu a detecção de anticorpos subjacentes 16/16 adicionados em quantidades quase detectáveis em plasma de doador misturado com DARA (Figura 14, Tabela 2 ). As especificidades dos anticorpos incluíram anti-D, -E, -c, -Cw, -K, -Fya, -Jka, -S, -s, -M, -Lua, -Cob.

Tabela 2. Detecção de anticorpos subjacentes no plasma de doadores misturado com DARA

Pré-incubação com 2 µl Especificidade CD38ecd-Fc-10H

K - - 1

K - - 1+

D 1 1 -

D +/- 1 -

E - 2 -

E - 1 -

Fya - - 1

Fya - - 1

Jka 1 - 1-

s - +/- -

S - - 1-

c - 1- 1-

Cob Fya 2- 1- 2

Lua - +/- -

Cw 1- - -

M - - +/-

Célula Nº 1 Célula Nº 2 Célula Nº 3

Exemplo 6 – Projeção da estabilidade de CD38ecd-Fc-10H (estabilidade acelerada) Exemplo 6a: inibição completa de plasma com anti-CD38 não diluído

[000159] Cinco alíquotas de 100 μΙ de preparação de CD38ecd- Fc10H CD38ecd-Fc10H-20170313-NTAEPCPBS foram colocadas em tubos separados fechados com tampas de rosca e em seguida em uma incubadora a uma temperatura constante de 37°C. Antes de iniciar a incubação (isto é, dia 0) e nos dias 7, 14, 21 e 31, um tubo foi transferido a 2-8°C até o dia 31. No 31º dia, todas as alíquotas foram testadas de acordo com o procedimento seguinte:

[000160] Preparação da amostra (ensaio de inibição): 25 μΙ de plasma não diluído contendo anti-CD38 de paciente 1 (TF1715-197) foram incubados com 32 μΙ de CD38ecd-Fc-10H e incubados durante 15 min a 37°C. Como experimento de controle, 32 μΙ de PBS, pH 7,4, em vez de CD38ecd-Fc-10H, foram pipetados no plasma. Alternativamente, plasma sozinho foi incubado durante 15 min a 37°C. Rastreio de anticorpos: 50 μΙ de diluição a 1% de hemácias do grupo sanguíneo O em DG Gel Sol (lote 16.015, exp. 2018-04; Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e 25 μΙ do plasma pré-tratado como acima foram pipetados na câmara de incubação de uma microcoluna em um DG Gel Coombs Card (lote 17612.01, exp. 2018-02; Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e incubados durante 15 min a 37°C. O cartão foi então centrifugado em uma centrífuga para cartões DG Gel e os resultados, lidos. Um resultado completamente negativo (um botão plano de células no fundo da microcoluna) foi indicativo de uma inibição completa do anti-CD38 presente na amostra do paciente. Os resultados de dias 0, 7, 14, 21 e 31 mostraram igualmente inibição completa, enquanto os experimentos de controle mostraram uma pontuação de reação de 2, ou seja, nenhuma inibição. Com base em um gráfico de Arrhenius, a estabilidade demonstrada do CD38ecd-Fc- 10H de 31 dias a 37ºC pode ser traduzida em uma estabilidade de pelo menos 24 meses, quando armazenado a 2 a 8ºC.

Exemplo 6b: Inibição de plasma com anti-CD38 titulado por 2 μΙ de 2,2 mg/ml de CD38ecd-Fc-10H

[000161] Cinco alíquotas de 100 μΙ de preparação de CD38ecd- Fc10H CD38ecd-Fc10H-20170313-NTAEPCPBS foram colocadas em tubos separados fechados com tampas de rosca e em seguida em uma incubadora a uma T constante de 37°C. Antes de iniciar a incubação e nos dias 7, 14, 21, 31 um tubo foi transferido a 2-8°C até o 31º dia. No 31º dia, todas as alíquotas foram testadas de acordo com o seguinte procedimento: 200 μΙ de plasma contendo anti-CD38 do paciente 1 (TF1715-197) foram titulados aritmeticamente em PBS, pH 7,4 (1:2, 1:4, 1:8, 1:16), após ter sido estabelecido em experimentos preliminares que 25 μΙ de plasma diluído 1:8 podem ser totalmente inibidos com um volume de 2 μΙ de CD38ecd-Fc-10H.

[000162] Preparação da amostra (ensaio de inibição): 25 μΙ da respectiva titulação de plasma contendo anti-CD38 do paciente 1 (TF1715-197) foram incubados com 2 μΙ de 2,2 mg/ml de CD38ecd-Fc- 10H durante 15 min a 37°C. Como experimentos de controle, 2 μΙ de PBS, pH 7,4, em vez de CD38ecd-Fc-10H, foram pipetados no plasma.

[000163] Rastreio de Anticorpos: 50 μΙ de diluição a 1% de hemácias do grupo sanguíneo O em DG Gel Sol (lote 16.015, exp. 2018-04; Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e 25 μΙ do plasma pré-tratado como acima foram pipetados na câmara de incubação de uma microcoluna em um DG Gel Coombs Card (lote 17612.01, exp. 2018- 02; Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e incubados durante 15 min a 37°C. O cartão foi então centrifugado em uma centrífuga para cartões DG Gel e os resultados, lidos. Um resultado completamente negativo (um botão plano no fundo da microcoluna) foi indicativo de uma inibição completa do anti-CD38 presente na amostra do paciente. Os resultados dos dias 0, 7, 14, 21 e 31 mostraram igualmente inibição completa sob o título de 1:8, enquanto o controle mostrou uma pontuação de reação de 2, ou seja, nenhuma inibição, ao longo de toda a titulação. Com base em um gráfico de Arrhenius, a estabilidade demonstrada do CD38ecd-Fc-10H de 31 dias a 37ºC pode ser traduzida em uma estabilidade de pelo menos 24 meses, quando armazenado a 2 a 8ºC. Exemplo 7 - Comparação da funcionalidade de CD38ecd-Fc-10H contra CD38 humano recombinante (rhCD38)

[000164] Geração de plasma simulado de paciente com DARA cravado: fármaco terapêutico anti-CD38 (Darzalex) foi cravado em plasma AB humano sob uma concentração final de 0,5 mg/ml.

[000165] Preparação da amostra (ensaio de inibição): 25 μΙ de plasma de doador cravado com anti-CD38 foram misturados com 2 μΙ de 33,4 mg/mL de CD38ecd-Fc-10H ou com 0,447 mg/ml de rhCD38 (CD38-6H, R&D Systems, Cat. Nº 2404-AC-010, lote PEH0417081, Minneapolis, EUA) ou com PBS, pH 7,4, e incubados durante 15 min a 37°C.

[000166] Rastreio de Anticorpos: 50 μΙ de Células Nºs 1-3 Screen- Cyte a 0,8%, lote 18.001 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suíça) e 25 μΙ do plasma simulado pré-tratado foram pipetados na câmara de incubação de uma microcoluna em um DG Gel Coombs Card (lote 17108.01, exp. 2018-09; Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e incubados durante 15 min a 37°C. O cartão foi então centrifugado em uma centrífuga para cartões DG Gel e os resultados, lidos. Um resultado completamente negativo (um botão plano no fundo da microcoluna) foi indicativo de uma inibição completa do anti-CD38 presente na amostra do paciente.

[000167] 2μΙ de CD38ecd-Fc-10H recombinante permitiram inibição completa de 0,5 mg/mL de anti-CD38. Em contraste, rhCD38 comercial usado nas mesmas condições experimentais, não pôde inibir a mesma carga de anti-CD38 (Figura 15).

Exemplo 8 - Comparação de tempos de incubação e temperaturas de incubação para inibição de anticorpos anti-CD38 por CD38ecd-Fc-10H

[000168] Preparação da amostra (ensaio de inibição): Fármaco terapêutico anti-CD38 (Darzalex; lote GHS0901, Janssen, EUA) foi diluído em BPS, pH 7,4, em uma concentração final de 2 mg/ml. 150 μΙ dessa solução foram aritmeticamente titulados em PBS, pH 7,4, até 1:8. 25 μΙ de cada diluição de anti-CD38 foram misturados com 2 μΙ de 33,4 mg/mL de CD38ecd-Fc-10H e incubados durante 15 minutos a 37°C, 15 minutos a temperatura ambiente ou 30 minutos a temperatura ambiente.

[000169] Rastreio de Anticorpos: 50 μΙ de Células Nº 3 Screen-Cyte 0,8%, lote 17.025 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suíça) e 25 μΙ da amostra pré-tratada acima foram pipetados na câmara de incubação de uma microcoluna em um DG Del Coombs Card (lote

17108.01, exp. 2018-09; Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e incubados durante 15 min a 37°C. O cartão foi então centrifugado em uma centrífuga para cartões DG Gel e os resultados, lidos. Um resultado completamente negativo (um botão plano de células no fundo da microcoluna) foi indicativo de uma inibição completa do anti- CD38 presente na amostra do paciente.

[000170] Com 2 μΙ de CD38ecd-Fc-10H, uma diluição 1:4 da amostra (correspondendo a 0,5 mg/mL de anti-CD38) pode ser inibida completamente em todos os três pré-tratamentos (Figura 16). Exemplo 9 - Comparação de atividades de CD38ecd-Fc-10H versus CD38ecd-flex-Fc-10H versus CD38ecd-10H

[000171] Preparação da amostra (ensaio de inibição): Fármaco terapêutico anti-CD38 (Darzalex; lote GHS0901, Janssen, EUA) foi diluído em BPS, pH 7,4, em uma concentração final de 1 mg/ml. 150 μΙ dessa solução foram aritmeticamente titulados em PBS, pH 7,4, até 1:8. 25 μΙ de cada diluição de anti-CD38 foram misturados com 2 μΙ de

~8,5 mg/ml de CD38ecd-Fc-10H, ou ~8,5 mg/ml de CD38ecd-flex-Fc- 10H, ou ~5 mg/ml de CD38ecd-10H, e incubados durante 15 minutos a 37°C.

[000172] Rastreio de Anticorpos: 50 μΙ de Células Nº 3 Screen-Cyte a 0,8%, lote 18.009 (Medion Diagnostics Grifols, Duedingen, Suíça) e 25 μΙ da amostra pré-tratada acima foram pipetados na câmara de incubação de um microcoluna em um DG Gel Coombs Card (lote

17133.01, exp. 2018-10; Diagnostic Grifols, Barcelona, Espanha) e incubados durante 15 min a 37°C. O cartão foi então centrifugado em uma centrífuga para cartões DG Gel e os resultados, lidos. Um resultado completamente negativo (um botão plano de células no fundo da microcoluna) foi indicativo de uma inibição completa do anti- CD38 presente na amostra do paciente.

[000173] Com 2 μΙ de CD38ecd-Fc-10H e 2 μl de CD38ecd-flex-Fc- 10H, uma diluição de 1:8 da amostra (correspondendo a 0,125 mg/mL de anti-CD38) pôde ser completamente inibida. Com 2 μΙ de CD38ecd- 10H, uma diluição de 1:8 da amostra não pôde ser completamente inibida. Apenas uma diluição 1:128 da amostra (correspondendo a 0,008 mg/mL de anti-CD38) pôde ser completamente inibida com 2 μl de CD38ecd-10H (Figura 17). Exemplo 10 - Oligomerização de proteínas de fusão Fc-poli-His

[000174] Três proteínas de interesse, CD38ecd, CD47ecd1 e Gp1bα, foram fundidas de forma recombinante com diferentes versões do marcador de oligomerização Fc-poli-His a fim de investigar a capacidade das proteínas de fusão recombinantes resultantes em formar oligômeros.

[000175] Uma versão foi a proteína sCD38 recombinante fundida com um marcador de Fc-10His. Essa proteína foi expressa e purificada até 50 mg/ml sem detecção de agregação visível. Em uma segunda versão, a proteína recombinante sCD38 foi fundida com um marcador flex-Fc-10His. Nessa versão da proteína de fusão, a região articulada de Fc foi substituída por um ligante flexível sem cisteínas. Em uma terceira versão, a proteína recombinante sCD38 foi fusível com uma região Fc. Em uma quarta versão, a proteína recombinante sCD38 foi fundida com um marcador 10His.

[000176] Com o objetivo de aplicar o método para a oligomerização de proteínas de fusão em outras proteínas de interesse, o marcador de oligomerização Fc-10His foi fundido com a proteína CD47ecd1 em uma versão dessa proteína. Uma versão diferente do marcador de oligomerização também foi fundida com uma proteína Gp1bα. Em uma primeira versão, a proteína Gp1bα recombinante foi fundida com um marcador Fc-8His. Em uma segunda versão, a proteína Gp1bα recombinante foi fundida com um marcador 6His. Em uma terceira versão, a proteína Gp1bα recombinante foi fundida com um marcador PAS-6H. Em uma quarta versão, a proteína Gp1bα recombinante foi fundida com um marcador p53-6His. Os marcadores Fc-10His e Flex- Fc-10His isoladamente também foram utilizados como controle.

[000177] As várias versões das proteínas de fusão foram expressas e purificadas em um sistema de expressão eucariótico. Por Cromatografia por Exclusão de Tamanho-Espalhamento Dinâmica de Luz (SEC-MALS/DLS), foram medidos a massa (Mw), o raio hidrodinâmico (Rh(w)) e a polidispersão (Mw/Mn) das proteínas em solução (Tabela 3). O grau de oligomerização foi calculado a partir da razão entre a massa medida (Mw) e a massa teórica (Th. Mw).

[000178] Para as proteínas de fusão sCD38, a capacidade da proteína em titular um anticorpo como na inibição de anti-CD38 (DARATUMUMAB) IAT também foi testada usando CD38ecd-Fc-10H como referência.

Tabela 3. Grau de oligomerização de proteínas de fusão recombinantes Proteína Th. Mw Mw (kDa) Mw/Th. Polidispersão Rh* (w) Grau de Funcio- recombinante (kDa) Mw Mw/Mn (nm) oligomeri- nalidade zação CD38ecd-Fc-10H 57 668,9 (0,1%) 11,7 1,002 (0,2%) 9,8 (7%) 12meros 100% CD38ecd-flex-Fc- 57 700,8 (0,6%) 12,3 1,002 (0,8%) 9,6 (6%) 12meros 100% 10H CD38ecd-Fc 56 113,7 (0,8%) 2,3 1,009 (1%) <9 2meros 50% CD38ecd-10H 31 35,6 (3%) 1,2 1,000 (4%) <9 1mero 12,5% CD47ecd1-Fc-10H 41 513,3 (0,9%) 12,5 1,005 (1%) 9,3 (28%) 12meros nd Gp1bα-Fc-G-8H 59 144 (1,842%) 2,4 1,012 (2,6%) <9 2meros N/D + 10 mM EDTA Gp1bα-Fc-G-8H 59 773 (1,5%) 13 1,06 (2,34%) 9,10 (44%) 12meros N/D Sem tratamento com EDTA Gp1bα-6H 33 36,23 (3%) 1,1 1,016 (3,75%) <9 1mero N/D Gp1bα-SBP-6H 37 41,77 (0,6%) 1,12 1,003 (0,88%) <9 1mero N/D Gp1bα-p53-6H 37 146 (1,081%) 3,94 1,006(1,57%) <9 4meros N/A Fc-10H 30 393,6 (2%) 13,12 1,072(3%) <9 12meros 0% flex-Fc-10H 30 303,5 (2%) 10,1 1,021(3%) <9 10meros 0% *O Rh(w) de moléculas menor do que 9 nm não é confiável.

[000179] Marcadores de oligomerização que compreendem a combinação específica de uma região Fc e domínio poli-His (Fc-poli- His) desencadeiam a oligomerização (pelo menos 12meros ou 6meros de dímeros) de pelo menos três proteínas de interesse (sCD38, CD47ecd1 e Gp1bα) fundidas em seu término N. O marcador Fc-10His sem uma proteína de interesse fundida também forma ele próprio oligômeros. Os dados apresentados na Tabela 3 indicam fortemente que a oligomerização é uma propriedade intrínseca de marcadores Fc- poli-his que não estão ligados à proteína de interesse utilizada.

Oligomerização da proteína de interesse é não é dependente da região articulada de Fc, na medida em que proteínas fundidas com o Flex-fc-10His também mostram oligomerização. Proteínas de fusão que compreendem apenas um marcador poli-His sem a região Fc não desencadeiam qualquer oligomerização e as proteínas obtidas são monômeros como esperado. Todas as proteínas de fusão que compreendem um marcador de oligomerização Fc-poli-His são altamente monodispersas indicando que elas não são agregados de moléculas não enoveladas.

[000180] Finalmente, a fusão de um marcador de oligomerização Fc- poli-His com proteínas sCD38 aumenta a avidez de CD38ecd na titulação de um anticorpo anti-CD38.

[000181] Embora esta descrição esteja no contexto de certas modalidades e exemplos, aqueles versados no estado da técnica compreenderão que a presente descrição estende-se além das modalidades especificamente descritas a outras modalidades alternativas e/ou usos das modalidades e modificações óbvias e equivalentes das mesmas. Além disso, enquanto diversas variações das modalidades tenham sido mostradas e descritas em detalhes, outras modificações, que estejam dentro do escopo da presente invenção, serão prontamente evidentes àqueles versados no estado da técnica, com base nesta descrição. Contempla-se também que várias combinações ou subcombinações das características e aspectos específicos das modalidades podem ser efetuadas e ainda enquadrar-se no escopo da invenção. Deve ser entendido que várias características e aspectos das modalidades descritas podem ser combinados com ou substituídos por outros a fim de formar diferentes modos ou modalidades da presente invenção. Assim, pretende-se que o escopo da presente invenção aqui descrita não deve ser limitado pelas modalidades particulares descritas acima.

[000182] Como aqui usados, os cabeçalhos das seções são apenas para fins organizacionais e não devem ser de maneira alguma interpretados como limitativos do assunto descrito. Toda a literatura e materiais semelhantes citados neste pedido, incluindo, mas sem limitação, patentes, pedidos de patentes, artigos, livros, tratados e páginas da internet são expressamente incorporados como referência na íntegra para qualquer finalidade. Quando as definições dos termos em referências incorporadas parecem diferir das definições dadas nos presentes ensinamentos, a definição fornecida nos presentes ensinamentos deverá ser a controladora. Será entendido que existe um implícito "cerca de" antes das temperaturas, concentrações, tempos etc., discutidas nos presentes ensinamentos, tal que os desvios ligeiros e não substanciais estejam dentro do escopo dos presentes ensinamentos aqui descritos.

[000183] Neste pedido, o uso do singular inclui o plural, a menos que especificamente indicado de outra forma. Além disso, o uso dos termos "compreendem", "compreende", "compreendendo", "contêm", "contém", "contendo", "incluem", "inclui" e "incluindo" não pretendem ser limitativos.

[000184] Como usado no presente relatório descritivo e reivindicações, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem referências plurais, a menos que o conteúdo dite claramente o contrário.

[000185] Todas as referências citadas nesta invenção são aqui incorporadas na íntegra como referência.

Claims (40)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição para ligação com um anticorpo anti-CD38, caracterizada pelo fato de que compreende uma forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 e/ou de um fragmento do mesmo que interfere na atividade de ligação de um anticorpo anti- CD38, em que uma sequência da forma recombinante solúvel do domínio extracelular de CD38 e/ou do fragmento do mesmo é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 7, SEQ ID Nº: 8, SEQ ID Nº: 9, SEQ ID Nº: 10, SEQ ID Nº: 11, SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº: 13 e SEQ ID Nº: 14.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o tamanho da forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 e/ou um fragmento do mesmo varia de cerca de 5 aminoácidos e cerca de 300 aminoácidos.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-CD38 é contra o CD38 humano, CD38 não humano ou uma combinação dos mesmos.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-CD38 é monoclonal, policlonal ou uma combinação dos mesmos.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-CD38 é selecionado do grupo que consiste em Darzalex, isatuximab e MOR202.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 e/ou um fragmento do mesmo é expressa em um sistema de expressão eucariótico ou um sistema de expressão procariótico.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a concentração da forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 e/ou um fragmento do mesmo varia de cerca de 1 mg/ml a cerca de 400 mg/ml.

8. Kit para investigação de biomonitoração e ensaios de diagnóstico, caracterizado pelo fato de que compreende a composição como definida na reivindicação 1, uma placa e reagentes para identificar a presença de anticorpos.

9. Kit, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a placa e reagentes do kit são configurados para um ensaio ELISA.

10. Kit, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a placa e reagentes do kit são aqueles de um kit de ensaio vendido sob a marca PROMONITOR® a partir da data de depósito do presente pedido

11. Método de neutralização ou bloqueio da ligação de um anticorpo anti-CD38 em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer um volume da amostra que compreende o anticorpo anti-CD38; e incubar com um volume da composição como definida na reivindicação 1 suficiente para neutralizar o anticorpo anti-CD38 na amostra.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a amostra é selecionada do grupo que consiste em sangue, plasma e soro.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD38 é selecionado do grupo que consiste em Darzalex, isatuximab e MOR202.

14. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o volume da amostra varia de cerca de 25 μΙ a cerca de 250 μΙ.

15. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o volume de composição varia de cerca de 0,5 μΙ a cerca de 50 μΙ.

16. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a concentração do anticorpo anti-CD38 na amostra varia de cerca de 0,005 μg/ml a cerca de 2.000 μg/ml.

17. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a concentração da forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 e/ou um fragmento do mesmo na composição varia de cerca de 1 mg/ml a cerca de 400 mg/ml.

18. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o efeito de neutralização da forma recombinante solúvel de um domínio extracelular de CD38 e/ou um fragmento do mesmo varia de cerca de 70% a cerca de 100%.

19. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a atividade de ligação do anticorpo anti- CD38 é selecionada do grupo que consiste em interferência no teste de pré-transfusão sanguínea, interferência nos testes de compatibilidade sanguínea e interferência na terapia de anticorpos.

20. Método para a seleção de uma unidade adequada de hemácias para um paciente tratado com anticorpos anti-CD38, caracterizado pelo fato de que compreende: obter uma amostra do paciente, sendo essa amostra sangue ou uma amostra derivada de sangue do paciente; neutralizar um anticorpo anti-CD38 na amostra de acordo com o método como definido na reivindicação 11; testar a amostra em relação à compatibilidade com unidades de glóbulos vermelhos em particular; e selecionar a unidade de hemácias que é compatível com a amostra baseada no teste.

21. Método para a remoção de anti-CD38 no plasma humano, soro e/ou no sangue durante tratamento do plasma, soro e/ou sangue, caracterizado pelo fato de que compreende expor o plasma, soro e/ou sangue à composição como definida na reivindicação 1, em que o forma recombinante solúvel do domínio extracelular do CD38 e/ou o fragmento do mesmo é marcada com um marcador de afinidade.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende um tratamento selecionado do grupo que consiste em hemodiálise, diálise peritoneal, hemofiltração, hemodiafiltração, terapia de troca de plasma e plasmaferese.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o marcador de afinidade é selecionado do grupo que consiste em glutationa-S-transferase (GST), pequenos modificadores do tipo ubiquitina (SUMO), AviTag, marcador calmodulina, marcador poliglutamato, marcador E, marcador FLAG, marcador HA, marcador His, marcador Myc, marcador NE, marcador S, marcador SBP, marcador Sof 1, marcador Sof 3, marcador Strep, marcador TC, marcador V5, marcador VSV, marcador Xpress, marcador Isopep, marcador Spy, marcador Snoop, Proteína Veículo de Biotina Carboxila (BCCP), marcador glutationa-S-transferase, marcador proteína fluorescente verde, outros marcadores de proteínas fluorescentes, HaloMarcador, marcador proteína de ligação da maltose, marcador Nus, marcador tiorredoxina, marcador Fc, marcadores desordenados intrinsecamente projetados contendo aminoácidos promotores de desordem, marcador Ty.

24. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo recombinante fundido a um marcador de oligomerização, em que o marcador de oligomerização compreende uma região Fc de imunoglobulina ou um fragmento do mesmo e um domínio poli-His.

25. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o marcador de oligomerização é capaz de formar uma ordem superior de dímeros até 12meros ou 6meros de 2meros.

26. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o domínio poli-His possui entre 4 e 24 resíduos de histidina.

27. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o domínio poli-His possui entre 6 e 10 resíduos de histidina.

28. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o domínio poli-His tem 6, 8 ou 10 resíduos de histidina.

29. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizada pelo fato de que a sequência da região Fc de imunoglobulina é a SEQ ID Nº: 15.

30. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizada pelo fato de que a sequência da região Fc de imunoglobulina tem pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID Nº: 15.

31. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 30, caracterizada pelo fato de que a sequência do polipeptídeo recombinante e/ou do fragmento do mesmo é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 25, SEQ ID Nº: 26 e SEQ ID Nº: 27.

32. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 30, caracterizada pelo fato de que a sequência da proteína de fusão e/ou do fragmento da mesma é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 7, SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº: 20 e SEQ ID Nº: 21.

33. Marcador de oligomerização para uma proteína de fusão recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma região Fc de imunoglobulina ou um fragmento da mesma e um domínio poli-His.

34. Marcador de oligomerização, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o domínio poli-His possui entre 4 e 24 resíduos de histidina.

35. Marcador de oligomerização, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o domínio poli-His possui entre 6 e 10 resíduos de histidina.

36. Marcador de oligomerização, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o domínio poli-His tem 6, 8 ou 10 resíduos de histidina.

37. Marcador de oligomerização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 36, caracterizado pelo fato de que a sequência da região Fc de imunoglobulina é a SEQ ID Nº: 15.

38. Marcador de oligomerização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 36, caracterizado pelo fato de que a sequência da região Fc de imunoglobulina tem pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID Nº: 15.

39. Marcador de oligomerização, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a sequência do marcador de oligomerização é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº: 16, SEQ ID Nº: 17 e SEQ ID Nº: 18.

40. Método para oligomenzação de uma proteína de fusão recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) fundir geneticamente uma sequência de nucleotídeos que codifica um marcador de oligomerização como definido em qualquer uma das reivindicações 33 a 39 com uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo; b) expressar a sequência de nucleotídeos resultante da etapa a) em uma célula hospedeira; c) purificar a proteína de fusão recombinante obtida na etapa b).