BR112019028007A2

BR112019028007A2 - composição nutricional, uso de uma combinação de bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis, e método para prevenir e/ou reduzir o risco de ocorrência de doença hepática gordurosa

Info

Publication number: BR112019028007A2
Application number: BR112019028007-3A
Authority: BR
Inventors: Eefje ENGELS; Cornelus Johannes Petrus VAN LIMPT; Annemarie Oosting; Akhtar Raish OOZEER; Jan Knol; Mona MISCHKE
Original assignee: N.V. Nutricia
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2020-07-07
Also published as: WO2019002612A1; EP3645025B1; RU2020103340A; US11641868B2; CN110809475A; RU2020103342A3; US20200254031A1; BR112019028006A2; RU2020103342A; RU2020103340A3; WO2019002609A1; US11638438B2; EP3645025A1; US20200253258A1; CN110831609A; EP3645024B1; EP3645024A1

Abstract

A invenção refere-se à saúde hepática e ao metabolismo lipídico aprimorados mais tarde na vida após a ingestão de simbióticos no início da vida.

Description

COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, USO DE UMA COMBINAÇÃO DE BIFIDOBACTERIUM BREVE E OLIGOSSACARÍDEOS NÃO DIGERÍVEIS, E MÉTODO PARA PREVENIR E/OU REDUZIR O RISCO DE OCORRÊNCIA DE

DOENÇA HEPÁTICA GORDUROSA Campo da Invenção

[001] A presente invenção é no campo de composições nutricionais para lactentes e visa a prevenção de disfunções metabólicas mais tarde na vida. Antecedentes da Invenção

[002] O aleitamento materno é o método preferencial para alimentar lactentes. Tem sido sugerido que a amamentação no início da vida pode influenciar na ocorrência de disfunções mais tarde na vida. No entanto, existem circunstâncias que tornam impossível o aleitamento ou menos desejável. Nesses casos, fórmula infantil e fórmula de seguimento são uma boa alternativa. A composição de fórmulas infantis modernas ou de seguimento já é altamente adaptada de tal forma que satisfaça muitas das necessidades nutricionais especiais do rápido crescimento e desenvolvimento do lactente.

[003] Ainda podem ser feitos aprimoramentos para a constituição de fórmulas de leite infantil. Em comparação a lactentes amamentados, lactentes alimentados com fórmula têm um risco aumentado de se tornarem obesos, desenvolverem doenças metabólica de saúde mais tarde na vida, desenvolverem aumento de peso do fígado ou doença hepática gordurosa não alcoólica (NFALD), ou desenvolverem doenças cardiovasculares mais tarde na vida. A alimentação no início da vida tem um efeito na programação duradoura sobre esses riscos de doenças na idade adulta. Estas condições são os principais problemas de saúde no mundo ocidental e a principal causa de morte evitável em todo o mundo, com prevalência crescente em adultos e crianças, e as autoridades as veem como um dos mais sérios problemas de saúde pública do século 21. Cerca de 12 a 25% das pessoas nos Estados Unidos têm NAFLD, enquanto NASH afeta entre 2 a 5% das pessoas nos Estados Unidos. Estima-se GED - 4645039v2 que disfunções do espectro de doença hepática gordurosa não alcoólica afetem aproximadamente 1 bilhão de indivíduos em todo o mundo.

[004] O documento WO 2006/091103 descreve uma composição que compreende Bifidobacterium e dois oligossacarídeos não digeríveis para estimular a flora intestinal de um lactente alimentado com leite humano.

[005] O documento WO 2013/036102 descreve composições com um componente gorduroso específico que tem efeitos de programação sobre o corpo e resulta em um nível reduzido de colesterol total no sangue mais tarde na vida ao consumir uma Dieta de Estilo Ocidental, reduzindo assim o risco de doenças do estilo de vida ocidental.

[006] A patente US refere-se a métodos terapêuticos que envolvem o uso de probiótico Dorea, e opcionalmente prebióticos, para restaurar uma microbiota intestinal bacteriana de mamíferos, saudável.

[007] O documento WO 2011/096808 descreve uma composição que compreende oligossacarídeo sialila e Bacteroides spp vivos, para reduzir o risco de sobrepeso ou obesidade de um lactente mais tarde na vida. Descrição Resumida da Invenção

[008] Os inventores surpreendentemente descobriram que ao empregar modelos animais, a suplementação dietética com Bifidobacterium breve, em combinação com oligossacarídeos não digeríveis no início da vida resultou em benefícios mais tarde na vida. Em particular, descobriu-se que mais tarde na vida, após exposição a uma Dieta de Estilo Ocidental aumentada em calorias e gordura, o metabolismo lipídico foi aprimorado, resultando em melhor saúde do fígado e parâmetros lipídicos plasmáticos aprimorados, em comparação ao grupo de controle que não tinha recebido esta intervenção dietética e foi desafiado com a dieta de estilo ocidental.

[009] Os inventores descobriram que em um modelo de camundongo era possível programar os lactentes de tal maneira que eles poderiam suportar melhor os riscos comumente associados com uma Dieta de Estilo Ocidental. Quando os lactentes receberam uma dieta suplementada com Bifidobacterium GED - 4645039v2 breve, em combinação com oligossacarídeos não digeríveis durante o início da vida, descobriu-se que o excesso de ganho de peso do fígado foi prevenido. O acúmulo de gordura no fígado, em particular, triglicerídeos, mais tarde na vida, foi reduzido e a formação de corpos cetônicos foi aumentada, conforme determinado pela quantidade de ácido beta-hidroxibutírico no plasma, ambos dos quais são indicativos de absorção reduzida de gordura e gasto de gordura no fígado aumentado. Estudos de expressão gênica mostraram que no grupo que recebeu B. breve com oligossacarídeos não digeríveis no início da vida, o metabolismo lipídico e as vias de biossíntese de colesterol foram alteradas, em comparação ao grupo de controle, e mais comparável a um grupo de referência saudável não exposto a uma Dieta de Estilo Ocidental. Surpreendentemente, não foram observados efeitos, ou em um grau muito menor, no grupo que recebeu somente oligossacarídeos não digeríveis sem B. breve.

[0010] Portanto, o uso de B. breve juntamente com oligossacarídeos não digeríveis administrados durante a infância é particularmente adequado para aprimorar o metabolismo lipídico mais tarde na vida e prevenir o metabolismo lipídico associado a disfunções, em particular, doença hepática gordurosa e/ou hipercolesterolemia e/ou aterosclerose associada a colesterol no plasma. Descrição Detalhada da Invenção

[0011] Dessa forma, a presente invenção refere-se a um método para prevenir e/ou reduzir o risco de ocorrência de disfunções associadas com metabolismo lipídico prejudicado selecionadas a partir do grupo que consiste em doença hepática gordurosa, hipercolesterolemia e aterosclerose associada a colesterol no plasma, mais tarde na vida em um sujeito humano, administrando uma composição nutricional que compreende uma combinação de Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis no início da vida. Preferencialmente, a presente invenção refere-se a um método para prevenir e/ou reduzir o risco de ocorrência de uma disfunção associada com metabolismo lipídico prejudicado, a disfunção sendo doença hepática gordurosa mais tarde na vida em um sujeito humano, administrando uma composição nutricional que GED - 4645039v2 compreende uma combinação de Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis no início da vida. Em particular, a presente invenção refere-se a um método para prevenir e/ou reduzir o risco de ocorrência de doença hepática gordurosa, mais tarde na vida em um sujeito humano, administrando uma composição nutricional que compreende uma combinação de Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis no início da vida.

[0012] Em uma realização, o presente método é um método não medicinal para prevenir e/ou reduzir o risco de ocorrência de disfunções associadas com metabolismo lipídico prejudicado selecionadas a partir do grupo que consiste em doença hepática gordurosa, hipercolesterolemia e aterosclerose associada a colesterol no plasma, mais tarde na vida em um sujeito humano, administrando uma composição nutricional que compreende uma combinação de Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis no início da vida. Preferencialmente, a presente invenção refere-se a um método não médico para prevenir e/ou reduzir o risco de ocorrência de uma disfunção associada com metabolismo lipídico prejudicado, a disfunção sendo doença hepática gordurosa mais tarde na vida em um sujeito humano, administrando uma composição nutricional que compreende uma combinação de Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis no início da vida. Em particular, a presente invenção refere-se a um método não médico para prevenir e/ou reduzir o risco de ocorrência de doença hepática gordurosa, mais tarde na vida em um sujeito humano, administrando uma composição nutricional que compreende uma combinação de Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis no início da vida.

[0013] A invenção, também pode ser redigida como o uso de uma combinação de Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis para a fabricação de uma composição nutricional para uso na prevenção e/ou redução do risco de ocorrência de disfunções associadas com metabolismo lipídico prejudicado selecionadas a partir do grupo que consiste em doença hepática gordurosa, hipercolesterolemia e aterosclerose associada a colesterol no GED - 4645039v2 plasma, mais tarde na vida em um sujeito humano, por administração da composição nutricional para o sujeito humano no início da vida. Preferencialmente, a presente invenção refere-se ao uso de uma combinação de Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis para a fabricação de uma composição nutricional para uso na prevenção e/ou redução do risco de ocorrência de disfunções associadas com metabolismo lipídico prejudicado, a disfunção sendo doença hepática gordurosa, mais tarde na vida em um sujeito humano, por administração da composição nutricional para o sujeito humano no início da vida. Em particular, a presente invenção refere-se ao uso de uma combinação de Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis para a fabricação de uma composição nutricional para uso na prevenção e/ou redução do risco de ocorrência de doença hepática gordurosa, mais tarde na vida em um sujeito humano, por administração da composição nutricional para o sujeito humano no início da vida.

[0014] A invenção também pode ser redigida como uma composição nutricional que compreende uma combinação de Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis para uso na prevenção e/ou redução do risco de ocorrência de disfunções associadas com metabolismo lipídico prejudicado selecionadas a partir do grupo que consiste em doença hepática gordurosa, hipercolesterolemia e aterosclerose associada a colesterol no plasma, mais tarde na vida em um sujeito humano, por administração da composição nutricional para o sujeito humano no início da vida. Preferencialmente, a presente invenção refere-se ao uso de uma composição nutricional que compreende uma combinação de Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis para uso na prevenção e/ou redução do risco de ocorrência de uma disfunção associada com metabolismo lipídico prejudicado, a disfunção sendo doença hepática gordurosa, mais tarde na vida em um sujeito humano, por administração da composição nutricional para o sujeito humano no início da vida. Em particular, a presente invenção refere-se a uma composição nutricional que compreende uma combinação de Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis para uso GED - 4645039v2 na prevenção e/ou redução do risco de ocorrência de doença hepática gordurosa, mais tarde na vida em um sujeito humano, por administração da composição nutricional para o sujeito humano no início da vida.

[0015] Em uma realização, o presente método ou uso é para uso na prevenção e/ou redução do risco de ocorrência de doença hepática gordurosa mais tarde na vida. Em uma realização, o presente método ou uso é para uso na prevenção e/ou redução do risco de ocorrência de doença hepática gordurosa não alcoólica mais tarde na vida.

[0016] Em uma realização, o presente método ou uso é para uso na prevenção e/ou redução do risco de ocorrência de hipercolesterolemia e/ou aterosclerose associada a colesterol no plasma mais tarde na vida. Bifidobacterium breve

[0017] A composição nutricional no método ou uso de acordo com a presente invenção, a seguir também citada como a presente composição (nutricional), compreende Bifidobacterium breve. Descobriu-se que a presença de B. breve juntamente com oligossacarídeos não digeríveis afetou beneficamente o metabolismo lipídico e a saúde do fígado mais tarde na vida. Bifidobacterium breve é uma bactéria Gram-positiva, anaeróbica, em forma de bastão ramificado. A B. breve tem preferencialmente pelo menos 95% de identidade com a sequência de rRNA 16S da linhagem tipo B. breve, mais preferencialmente pelo menos 97% de identidade (Stackebrandt & Goebel, 1994, Int. J. Syst. Bacteriol. 44:846-849). Linhagens de B. breve preferenciais são as isoladas das fezes de lactentes saudáveis alimentados com leite humano. Tipicamente, estas estão comercialmente disponíveis junto a produtores de bactérias ácido-lácticas, mas elas também podem ser isoladas diretamente a partir de fezes, identificadas, caracterizadas e produzidas. De acordo com uma realização preferencial, a presente composição compreende pelo menos uma B. breve selecionada a partir do grupo que consiste em B. breve Bb-03 (Rhodia/Danisco), B. breve M-16V (Morinaga), B. breve R0070 (Institute Rosell, Lallemand), B. breve BR03 (Probiotical), B. breve BR92) (Cell Biotech), DSM GED - 4645039v2

20091, LMG 11613, YIT4065, FERM BP-6223 e CNCM I-2219. Com a máxima preferência, a B. breve é selecionada a partir do grupo que consiste em B. breve M-16V e B. breve CNCM I-2219, com a máxima preferência B. breve é uma M- 16V. B. breve I-2219 foi publicada a.o. no documento WO 2004/093899 e na patente US 7.410.653 e foi depositada na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos, Instituto Pasteur, Paris, França, em 31 de maio de 1999 pela Compagnie Gervais Danone. B. breve M-16V foi depositada como BCCM/LMG23729 e está comercialmente disponível junto à Morinaga Milk Industry Co., Ltd.

[0018] A presente composição compreende preferencialmente B. breve viável. A presente composição preferencialmente compreende 10 4 a 1012 unidades formadoras de colônia (ufc) de B. breve por grama de peso seco da presente composição nutricional, preferencialmente 10 4 a 1011, mais preferencialmente 105 a 1010, com a máxima preferência de 106 a 1 x 109 ufc de B. breve por grama de peso seco da presente composição. Preferencialmente, a composição compreende 104 a 1013 ufc de B. breve por 100 mL, mais preferencialmente 106 a 1011 ufc de B. breve por 100 mL, com a máxima preferência 107 a 1010 ufc de B. breve por 100 mL. No contexto da presente invenção, deve-se entender que a composição nutricional preferencialmente não compreende outras bactérias probióticas, então bactérias probióticas exceto Bifidobacterium breve são preferencialmente excluídas da composição nutricional no método ou uso de acordo com a presente invenção. Oligossacarídeos Não Digeríveis

[0019] A composição nutricional no método ou uso de acordo com a presente invenção compreende oligossacarídeos não digeríveis (NDO). O termo “oligossacarídeo”, como usado na presente invenção, preferencialmente refere- se a sacarídeo com um grau de polimerização (DP) de 2 a 250, preferencialmente um DP de 2 a 100, mais preferencialmente de 2 a 60. Entende-se que no contexto desta invenção um sacarídeo com um DP em uma determinada faixa pode incluir uma mistura de sacarídeos com diferentes DP’s GED - 4645039v2 médios, por exemplo, se um oligossacarídeo com um DP de 2 a 100 for incluído na presente composição, isto pode incluir composições que compreendem oligossacarídeos com DP médio entre 2 e 5, um DP médio entre 50 e 70 e um DP médio entre 7 e 60. O termo “oligossacarídeo não digerível”, como usado na presente invenção, refere-se a oligossacarídeos que não são digeridos, ou apenas parcialmente digeridos no intestino pela ação de ácidos ou enzimas digestivas presentes no trato digestivo superior humano (estômago e intestino delgado), mas que são fermentados pela flora intestinal humana. Por exemplo, sacarose, lactose, maltose e maltodextrinas são consideradas digeríveis. Por exemplo, galacto-oligossacarídeos, fruto-oligossacarídeos são considerados oligossacarídeos não digeríveis.

[0020] Preferencialmente os oligossacarídeos não digeríveis são solúveis. O termo “solúvel”, como usado no presente pedido, ao fazer referência a um oligossacarídeo, significa que o oligossacarídeo é solúvel de acordo com o método descrito por L. Prosky et al., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71, 1017-1023 (1988).

[0021] O oligossacarídeo não digerível é preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em fruto-oligossacarídeos, galacto- oligossacarídeos, glico-oligossacarídeos, arabino-oligossacarídeos, manano- oligossacarídeos, xilo-oligossacarídeos, fuco-oligossacarídeos, arabinogalacto- oligossacarídeos, glucomanano-oligossacarídeos, galactomano- oligossacarídeos, oligossacarídeos que compreendem ácido siálico e oligossacarídeos que compreendem ácido urônico.

[0022] Preferencialmente, a presente composição compreende fruto- oligossacarídeos e/ou galacto-oligossacarídeos, mais preferencialmente galacto-oligossacarídeos, com a máxima preferência transgalacto- oligossacarídeos. Em uma realização preferencial, a composição compreende uma mistura de galacto-oligossacarídeos e fruto-oligossacarídeos. Preferencialmente, a presente composição compreende galacto- oligossacarídeos com um DP de 2 a 10, preferencialmente com um DP médio GED - 4645039v2 entre 2 e 10, e/ou fruto-oligossacarídeos com um DP de 2 a 60, preferencialmente com um DP médio entre 2 e 60, preferencialmente com um DP médio entre 10 e 60, preferencialmente com um DP médio entre 15 e 60, preferencialmente com um DP médio entre 20 e 60. A presença de oligossacarídeos não digeríveis nestas realizações preferenciais terá um efeito aprimorado sobre o metabolismo lipídico e a saúde do fígado mais tarde na vida.

[0023] O galacto-oligossacarídeo é preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em transgalacto-oligossacarídeos. Em uma realização particularmente preferencial, o presente método compreende a administração de transgalacto-oligossacarídeos ((galactose)n-glicose; em que n é um número inteiro entre 1 e 60, isto é, 2, 3, 4, 5, 6, …., 59 ,60; preferencialmente n é selecionado a partir de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10). Transgalacto-oligossacarídeos (TOS) são, por exemplo, vendidos sob o nome comercial VivinalTM (Borculo Domo ingredients, Países Baixos). Preferencialmente, os sacarídeos dos transgalacto-oligossacarídeos são β-ligados.

[0024] Em uma realização, a composição nutricional no método ou uso de acordo com a presente invenção compreende preferencialmente fruto- oligossacarídeo. O termo “fruto-oligossacarídeo”, como usado no presente pedido, refere-se a um polissacarídeo não digerível que compreende uma cadeia de pelo menos 2 unidades de frutose β-ligada, com um DP de 2 a 250, preferencialmente 7 a 100, mais preferencialmente 20 a 60. Em uma realização é preferencialmente usada inulina. A inulina está, por exemplo, disponível sob o nome comercial “Raftilin HP–”, (Orafti). O DP médio do presente fruto- oligossacarídeo é preferencialmente pelo menos 7, mais preferencialmente pelo menos 10, preferencialmente abaixo de 100. O fruto-oligossacarídeo usado tem preferencialmente a maioria das unidades de frutose ligadas com uma ligação β(2→1). Outros termos para fruto-oligossacarídeos incluem inulina, frutopolissacarídeo, polifrutose, frutanos e oligofrutose. A presente composição compreende preferencialmente fruto-oligossacarídeos com um DP de 2 a 200.

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[0025] Em uma realização preferencial, a presente composição compreende dois ou mais carboidratos que diferem na composição da unidade de monossacarídeo, ou que diferem no grau de polimerização (DP) ou ambos. Dois carboidratos não digeríveis diferem na composição de monossacarídeo quando há pelo menos 30% de diferença de número, mais preferencialmente pelo menos 50% de diferença de número na composição de monossacarídeo com base no número total de unidades de monossacarídeo. Por exemplo, galacto-oligossacarídeos com uma composição média de Glu-Gal3 e fruto- oligossacarídeos com uma composição média de Glu-Fru3 diferem em 75% em número. Dois carboidratos não digeríveis diferem no DP se o DP médio dos dois carboidratos diferirem em mais que 5 unidades de monossacarídeo, preferencialmente mais que 10 unidades, ainda mais preferencialmente mais que 15 unidades. Por exemplo, inulina hidrolisada com um DP médio de 4 e inulina de cadeia longa com um DP médio de 25 têm uma diferença no DP de 21 unidades.

[0026] Preferencialmente, a presente composição compreende galacto- oligossacarídeos com umj DP médio entre 2 e 10 e fruto-oligossacarídeos com um DP médio entre 10 e 60. Preferencialmente, a presente composição compreende fruto-oligossacarídeos com um DP médio entre 2 e 10, e fruto- oligossacarídeos com um DP médio entre 15 e 60. Preferencialmente, a presente composição compreende galacto-oligossacarídeos com um DP médio entre 2 e 10, e fruto-oligossacarídeos com um DP médio entre 2 e 10. A presença de oligossacarídeos não digeríveis nestas realizações preferenciais terá um efeito aprimorado sobre o metabolismo lipídico e a saúde do fígado mais tarde na vida.

[0027] Preferencialmente, a presente composição compreende galacto- oligossacarídeos e fruto-oligossacarídeos em uma razão, em peso, de 20 para 0,5, mais preferencialmente 20 para 1, com a máxima preferência de 12 para 2.

[0028] Preferencialmente, a presente composição compreende de 80 mg a 2 g de oligossacarídeos não digeríveis por 100 mL, mais preferencialmente 150 mg a 1,50 g, até mais preferencialmente 300 mg a 1 g por 100 mL. Com GED - 4645039v2 base no peso seco, a composição preferencialmente compreende 0,25%, em peso, a 20%, em peso, mais preferencialmente 0,5%, em peso, a 10%, em peso, ainda mais preferencialmente 1,5%, em peso, a 7,5%, em peso, de oligossacarídeos não digeríveis.

[0029] Preferencialmente, a presente composição compreende 104 a 1012 ufc de B. breve por grama de peso seco e 0,25%, em peso, a 20%, em peso, de oligossacarídeos não digeríveis, com base no peso seco, mais preferencialmente 105 a 1010 ufc de B. breve por grama de peso seco e 0,5%, em peso, a 10%, em peso, de oligossacarídeos não digeríveis, com base no peso seco. Preferencialmente, a presente composição não compreende bactérias probióticas, exceto Bifidobacterium breve.

[0030] Preferencialmente, a presente composição compreende 104 a 1013 ufc de B. breve e 80 mg a 2 g de oligossacarídeos não digeríveis por 100 mL, mais preferencialmente, 106 a 1011 ufc de B. breve e 300 mg a 1 g de oligossacarídeos não digeríveis por 100 mL. Preferencialmente, a presente composição não compreende bactérias probióticas, exceto Bifidobacterium breve.

[0031] Preferencialmente, a presente composição nutricional compreende i) 1 x 105 ufc a 1 x 1010 ufc de B. breve por grama de peso seco, mais preferencialmente 1 x 106 ufc a 1 x 1010 ufc; e tanto ii) 0,5 a 20%, em peso, de galacto-oligossacarídeos, com base no peso seco, mais preferencialmente 0,5 a 10%, em peso, de galacto-oligossacarídeos ou iii) 0,05 a 2% de fruto- oligossacarídeos, com base no peso seco, mais preferencialmente 0,1 a 1%, em peso, de fruto-oligossacarídeos, ou ambos, ii) e iii). Preferencialmente, a presente composição nutricional não compreende bactérias probióticas, exceto Bifidobacterium breve. Composição Nutricional

[0032] A composição nutricional no método ou uso de acordo com a presente invenção é particularmente preferencialmente adequada para fornecer os requisitos nutricionais diários para um sujeito humano com idade abaixo de GED - 4645039v2

36 meses, particularmente para um sujeito humano com idade abaixo de 24 meses, até mais preferencialmente para um sujeito humano com idade abaixo de 18 meses, com a máxima preferência para um lactente abaixo de 12 meses de idade. Portanto, a composição nutricional é para alimentação ou é usada para alimentação de um sujeito humano. A presente composição compreende preferencialmente um componente lipídico, uma proteína e um carboidrato digerível, em que o componente lipídico fornece preferencialmente 30 a 60% de calorias totais, o componente proteico fornece preferencialmente 5 a 20%, mais preferencialmente 5 a 15%, em peso, das calorias totais e o componente carboidrato digerível fornece preferencialmente 25 a 75% das calorias totais. Preferencialmente, a presente composição compreende um componente lipídico que fornece 35 a 50% das calorias totais, um componente proteico que fornece 6 a 12% das calorias totais e um componente carboidrato digerível que fornece 40 a 60% das calorias totais. A quantidade de calorias totais é determinada pela soma de calorias derivadas de proteínas, lipídeos e carboidratos digeríveis.

[0033] A presente composição não é leite materno humano. A presente composição compreende preferencialmente lipídeos vegetais. A presente composição preferencialmente compreende outras frações, como vitaminas e minerais, de acordo com as diretivas internacionais para fórmulas infantis. Preferencialmente, a composição nutricional é uma fórmula infantil, fórmula de seguimento ou uma fórmula para criança de primeira infância, mais preferencialmente uma fórmula infantil ou uma fórmula de seguimento.

[0034] Preferencialmente, a composição nutricional, não compreende lactobacilos. Descobriu-se que lactobacilos estavam reduzidos no grupo que recebeu B. breve e oligossacarídeos não digeríveis no início da vida e que tinham metabolismo lipídico e saúde do fígado aprimorados mais tarde na vida.

[0035] Em uma realização, a presente composição é um pó adequado para produzir uma composição líquida após reconstituição com uma solução aquosa, preferencialmente com água. Preferencialmente, a presente composição é um pó para ser reconstituído com água.

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[0036] A fim de satisfazer os requisitos calóricos do lactente, a composição compreende preferencialmente 50 a 200 kcal/100 mL de líquido, mais preferencialmente 60 a 90 kcal/100 mL de líquido, até mais preferencialmente 60 a 75 kcal/100 mL de líquido. Esta densidade calórica assegura uma ótima razão entre a água e o consumo de calorias. A osmolaridade da presente composição é preferencialmente entre 150 e 420 mOsmol/L, mais preferencialmente 260 a 320 mOsmol/L. A osmolaridade baixa visa reduzir o estresse gastrointestinal. O estresse pode induzir formação de adipócito.

[0037] Preferencialmente, a presente composição está sob a forma líquida, com uma viscosidade abaixo de 35 mPa.s, mais preferencialmente abaixo de 6 mPa.s, conforme medido em um viscosímetro Brookfield a 20ºC a uma taxa de cisalhamento de 100 s-1. Adequadamente, a composição está sob a forma de pó, que pode ser reconstituído com água para formar um líquido, ou sob a forma de líquido concentrado, que deve ser diluído com água. Quando a composição está sob a forma líquida, o volume preferencial administrado diariamente está na faixa de cerca de 80 a 2500 mL, mais preferencialmente cerca de 450 a 1000 mL por dia. Uso

[0038] Empregando um modelo animal, descobriu-se que a combinação de B. breve e oligossacarídeos não digeríveis, mas não oligossacarídeos não digeríveis isoladamente sem B. breve, quando administrada no início da vida, afetou beneficamente os parâmetros que são indicativos de metabolismo lipídico e saúde do fígado aprimorados mais tarde na vida, em comparação ao grupo de controle que não tinha recebido esta intervenção dietética e foi desafiado com a Dieta de Estilo Ocidental.

[0039] A presente invenção refere-se a uma composição nutricional que compreende Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis para uso no aprimoramento do metabolismo lipídico e saúde do fígado, mais tarde na vida GED - 4645039v2 em um sujeito humano, por administração da composição nutricional para o sujeito humano no início da vida.

[0040] Foi observado um efeito significativo sobre a prevenção de peso excessivo do fígado mais tarde na vida quando os camundongos eram adultos e após os camundongos serem submetidos a uma Dieta de Estilo Ocidental. Da mesma forma, uma redução significativa de triglicerídeos no fígado e uma redução de colesterol no fígado foram observadas. Isto foi observado em 98 dias pós-natal, que é um ponto no tempo correspondente à idade adulta em humanos. Isto indica que a nutrição inicial tem um efeito benéfico sobre o ganho de peso do fígado, prevenindo o ganho de peso excessivo do fígado e a prevenção de condições indesejadas do fígado que se estendem para além do período no qual é realmente administrada. Além disso, descobriu-se surpreendentemente que os sujeitos exibiram acúmulo de gordura reduzido, formação de corpos cetônicos aumentada, conforme indicado por efeitos dos níveis de beta-hidroxibutirato e GIP no plasma. A formação de corpos cetônicos aumentada sob jejum ou exercício é indicativa de mudança metabólica rápida aprimorada da oxidação de carboidratos para oxidação de gordura. A cetogênese sob condições de dieta alta em gordura ou aumentada pode contribuir para a eliminação de grande parte da gordura que entra no fígado, e a disfunção nessa via poderia promover o desenvolvimento de NAFLD. A cetogênese pode desempenhar um papel importante na prevenção de NAFLD induzida por dieta. O grupo de controle que foi exposto a uma Dieta de Estilo Ocidental e não tinha recebido uma composição simbiótica no início da vida inclinou-se em direção a um fenótipo NAFDL, indicado pelos efeitos adversos sobre a homeostase lipídica ainda apoiado pelos efeitos na homeostase de glicose. Além disso, a inflamação crônica de baixo grau é fundamental para a progressão de NAFLD para estados cirróticos de risco mais alto. Além disso, o estudo de expressão gênica mostrou que as vias lipídicas no grupo simbiótico foram mais comparáveis ao grupo de referência saudável do que ao grupo de controle exposto à Dieta de Estilo Ocidental que não tinha recebido simbióticos no início da vida. A desregulação da homeostase GED - 4645039v2 metabólica, como alterações na sensibilidade à insulina ou metabolismo lipídico, pode estar associada ao desenvolvimento de doença hepática gordurosa (FLD). Portanto, o fenótipo NAFDL e a doença hepática gordurosa e sua progressão é prevenida no grupo que foi administrado com simbióticos no início da vida.

[0041] A doença hepática gordurosa compreende doença hepática gordurosa alcoólica e doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD). Preferencialmente, a presente composição simbiótica é administrada no início da vida para uso na prevenção ou redução do risco de ocorrência de NAFLD mais tarde na vida. NAFLD abrange um espectro de atividade da doença. Este espectro começa como o acúmulo de gordura no fígado (esteatose hepática). O fígado pode permanecer gordo sem perturbar a função hepática, mas também pode evoluir para se tornar esteato-hepatite não alcoólica (NASH), um estado no qual a esteatose é combinado com inflamação e fibrose (esteato-hepatite). NASH é uma doença progressiva: Durante um período de 10 anos, até 20% dos pacientes com NASH irão desenvolver cirrose do fígado, e 10% irão sofrer morte relacionada à doença hepática.

[0042] Em uma realização, a presente invenção refere-se a uma composição nutricional que compreende Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis para uso na prevenção e/ou redução do risco de ocorrência de aumento de peso do fígado e/ou doença hepática gordurosa, mais tarde na vida em um sujeito humano, por administração da composição nutricional para o sujeito humano no início da vida, mais preferencialmente para uso na prevenção e/ou redução do risco de ocorrência de NAFLD.

[0043] Uma redução significativa no colesterol no plasma foi observada mais tarde na vida no grupo que tinha recebido simbióticos no início da vida. Além disso, estudos de expressão gênica mostraram que a biossíntese, armazenamento, distribuição e transporte de colesterol e homeostase celular no grupo simbiótico foram mais comparáveis ao grupo de referência saudável do que ao grupo de controle exposto à Dieta de Estilo Ocidental que não tinha recebido simbióticos no início da vida. Níveis de colesterol reduzidos no plasma GED - 4645039v2 são indicativos de prevenção ou redução do risco de ocorrência de hipercolesterolemia e/ou aterosclerose. Em uma realização, a presente invenção refere-se a uma composição nutricional que compreende Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis para uso na redução de níveis de colesterol no plasma mais tarde na vida, e/ou para uso na prevenção e/ou redução do risco de hipercolesterolemia e/ou aterosclerose associada a colesterol no plasma mais tarde na vida, em um sujeito humano, por administração da composição nutricional para o sujeito humano no início da vida.

[0044] A presente composição deve ser administrada ao sujeito humano no início da vida. Início da vida preferencialmente refere-se quando o sujeito humano tem idade abaixo de 36 meses, preferencialmente quando o sujeito humano tem idade abaixo de 24 meses, até mais preferencialmente quando o sujeito humano tem idade abaixo de 18 meses, mais preferencialmente quando o sujeito humano é um lactente com idade abaixo de 12 meses, com a máxima preferência quando o sujeito humano é um lactente com idade abaixo de 6 meses. Em uma realização, a presente composição é administrada a um sujeito humano saudável no início da vida, preferencialmente a um sujeito humano nascido a termo.

[0045] De acordo com a presente invenção, mais tarde na vida, preferencialmente significa quando o sujeito humano é uma criança ou preferencialmente um adulto. Preferencialmente mais tarde na vida refere-se a quando o sujeito humano tem idade acima de 5 anos, e mais preferencialmente acima de 18 anos. Prevenir mais tarde na vida ou reduzir o risco de ocorrência mais tarde na vida é diferente de um efeito preventivo direto, um efeito que ocorre ao consumir a intervenção nutricional, já que se estende o seu efeito à saúde ainda mais na vida bem após o consumo da composição nutricional ter sido interrompido, por exemplo, pelo menos 2 anos após ter interrompido a administração da fórmula, mais preferencialmente pelo menos 4 anos, mais preferencialmente pelo menos 15 anos. Acredita-se que este efeito mais tarde na vida seja devido a um efeito na programação, em que no início da vida, GED - 4645039v2 quando o sujeito humano ainda está em crescimento e desenvolvimento, os órgãos e sua capacidade metabólica (como formação de adipócitos, formação da massa de células B pancreáticas, desenvolvimento do fígado) são programados durante uma janela crítica no início da vida, e os efeitos que acontecem neste período de tempo têm um efeito mais tarde na vida. Na verdade, a transferência de microbiota no dia 42 pós-natal não teve efeito na saúde metabólica indicando que a janela crítica tinha passado nos camundongos.

[0046] Em uma realização preferencial, a composição nutricional que compreende B. breve e oligossacarídeos não digeríveis deve ser usada em sujeitos humanos que foram expostos ou criados em um ambiente obesogênico e/ou que consomem uma Dieta de Estilo Ocidental após a infância. Uma Dieta de Estilo Ocidental é aumentada em gordura e é aumentada em ácidos graxos saturados, com a gordura fornecendo mais que 35% do total de calorias da dieta, e com os ácidos graxos saturados fornecendo mais que 10% do total de calorias da dieta. O termo ambiente obesogênico refere-se a um ambiente que promove o ganho de peso e a um ambiente que não é propício à perda de peso dentro de casa ou no local de trabalho (Swinburn, et al., 1999, Prev Med 29:563-570). Em outras palavras, o ambiente obesogênico refere-se a um ambiente que promove, induz, ajuda ou contribui para a obesidade. Fatores que contribuem são urbanização, frequentemente acompanhada por uma redução na atividade física e fácil acesso aos alimentos. Em uma realização, a composição nutricional é de benefício particular para lactentes que são expostos a um ambiente em que a dieta média é uma Dieta de Estilo Ocidental que é aumentada ou rica em gordura e é aumentada ou rica em ácidos graxos saturados, com a gordura fornecendo mais de 35% das calorias totais da dieta, e com os ácidos graxos saturados fornecendo mais de 10% das calorias totais da dieta, mais particularmente, uma Dieta de Estilo Ocidental que é caracterizada por compreender gordura fornecendo entre 35 e 45% das calorias totais da dieta e compreendendo ácidos graxos saturados fornecendo entre 10 e 20% das calorias totais da dieta.

GED - 4645039v2

[0047] Em uma realização preferencial, o sujeito humano está em risco de desenvolver disfunções relacionadas a um metabolismo lipídico prejudicado ou saúde do fígado prejudicada, mais tarde na vida. Portanto, o sujeito humano é preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em um lactente pré-termo, um lactente pequeno para a idade gestacional, um lactente grande para a idade gestacional, um lactente nascido de uma mãe com sobrepeso ou obesa, um lactente nascido de uma mãe que sofre de diabetes tipo 2 ou diabetes gestacional, um lactente nascido por cesariana e um lactente que está sendo tratado ou foi tratado com antibióticos.

[0048] Neste documento e nas suas reivindicações, o verbo “compreender” e suas conjugações é usado em seu sentido não limitante para significar que itens após a palavra estão incluídos, mas itens não especificamente mencionados não estão excluídos. Além disso, referência a um elemento pelo artigo indefinido “um” ou “uma” não exclui a possibilidade de que mais do que um elemento esteja presente, a menos que o contexto claramente exija que haja um e somente um dos elementos. O artigo indefinido “um” ou “uma”, dessa forma, geralmente significa “pelo menos um”. Descrição das Figuras

[0049] A Figura 1 mostra marcadores no plasma para metabolismo lipídico e parâmetros hepáticos em idade adulta após intervenção nutricional no início da vida. Os dados são médias ± SEM. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01. Marcadores sistêmicos para homeostase lipídica: beta-hidroxibuturato, bHB (A), colesterol total, TC (B), triglicerídeos, TG (C). Marcadores hepáticos: peso do fígado (D), TC no fígado (E) TG no fígado (F).

[0050] SYN: grupo que recebeu B. breve e oligossacarídeos não digeríveis no início da vida, seguido por uma Dieta de Estilo Ocidental no dia 42 a 98. G/F: grupo que recebeu oligossacarídeos não digeríveis no início da vida, seguido por uma Dieta de Estilo Ocidental no dia 42 a 98. CTR: grupo que não recebeu B. breve e oligossacarídeos não digeríveis no início da vida, seguido por uma Dieta de Estilo Ocidental no dia 42 a 98. REF: grupo de controle que foi criado na ração GED - 4645039v2 padrão sem intervenção nutricional no início da vida ou de um desafio de Dieta de Estilo Ocidental mais tarde na vida.

[0051] A Figura 2 mostra marcadores no plasma para homeostase de glicose em idade adulta após intervenção nutricional no início da vida. Os dados são médias ± SEM. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01. Marcadores sistêmicos para homeostase de glicose: modelo de avaliação homeostático de resistência à insulina HOMA-IR (A), glicose (B), insulina (C), amilina (D), polipeptídeo inibidor gástrico, GIP (E) e polipeptídeo pancreáticos, PP (F).

[0052] SYN: grupo que recebeu B. breve e oligossacarídeos não digeríveis no início da vida, seguido por uma Dieta de Estilo Ocidental no dia 42 a 98. G/F: grupo que recebeu oligossacarídeos não digeríveis no início da vida, seguido por uma Dieta de Estilo Ocidental no dia 42 a 98. CTR: grupo que não recebeu B. breve e oligossacarídeos não digeríveis no início da vida, seguido por uma Dieta de Estilo Ocidental no dia 42 a 98. REF: grupo de controle que foi criado na ração padrão sem intervenção nutricional no início da vida ou de um desafio de Dieta de Estilo Ocidental mais tarde na vida. Exemplo 1 Assinaturas no Plasma e Fígado Mais Tarde na Vida Indicativas para Homeostase Lipídica e Saúde do Fígado são Afetadas Beneficamente por Intervenção Simbiótica no Início da Vida Materiais e Métodos

[0053] Os ratos foram alojados em 2 gaiolas tipo Macrolon sob condições de alojamento padrão controlada e comida e água à vontade. Camundongos C57BL/6J machos e fêmeas foram obtidos junto à Harlan Laboratories B.V., Países Baixos, e acasalamento sincronizado. No dia pós-natal (PN)2, as ninhadas foram escolhidas e quatro filhotes machos e duas fêmeas foram atribuídos aleatoriamente por fêmea prenhe. Durante adaptação, gravidez e lactação, os animais foram alimentados com uma dieta semissintética padrão irradiada apropriado para melhoramento de acordo com a receita do American Institute of Nutrition (AIN-93G; 16,4% de kcal de gordura, 18,8 % de kcal de GED - 4645039v2 proteína; RDS, Países Baixos). No PN2, fêmea prenhe em lactação foram atribuídas a diferentes dietas de intervenção, isto é, diferentes suplementações da dieta AIN-93G, tanto com oligossacarídeos não digeríveis (G/F: 2% p/p de scGOS (galacto-oligossacarídeos de cadeia curta (Vivinal® GOS)) : lcFOS (fruto- oligossacarídeos de cadeia longa-oligossacarídeos (Inulina HP®) p/p 9:1), simbióticos (SYN: (2% p/p G/F + 109 ufc/g de Bifidobacterium breve M-16V (Morinaga Milk Industries Ltd.)) como veículo de controle (CTRL: 2% p/p de maltodextrina). Em adição à suplementação das dietas, os filhotes receberam diariamente (PN10-15) uma dose oral (30 µL) como gotas do respectivo suplemento (G/F e maltodextrina aprox. 10 a 15 mg/dia, 1 x 10 9 ufc de B. breve M-16V). Após desmamar (PN21), a prole de machos foi alojada em pares e continuaram na respectiva dieta de intervenção suplementada até PN42, um período correspondente à infância e primeira infância em humanos. Após PN42 até PN98, durante a adolescência e a idade adulta, os animais CTRL, G/F e SYN foram alimentados com uma Dieta de Estilo Ocidental (WSD; dieta AIN-93G com uma fração de lipídeo ajustada contendo 20%, em peso, de lipídeos (17%, em peso, de banha, 3%, em peso, de óleo de soja, 0,1%, em peso, de colesterol), representando uma Dieta de Estilo Ocidental branda fornecendo cerca de 40% do total de calorias em gordura e que continha cerca de 14,5% de ácidos graxos saturados com base nas calorias totais) como desafio. Esta dieta tem um nível aumentado de gordura baseado na energia total e uma porcentagem aumentada de ácidos graxos saturados em comparação ao que é considerado saudável.

[0054] De PN21 em diante, a ingestão de comida foi determinada em intervalos contínuos pesando a diferença entre a comida fornecida e as sobras.

[0055] Em PN98, após 6h de jejum, os animais foram eutanasiados por isofluran/anestesia de O2 seguido por deslocamento cervical. As amostras de sangue foram coletadas em microtubos revestidos com K 3EDTA (Greiner Bio- One, Alemanha). O plasma foi obtido a partir de amostras de sangue por centrifugação (1350 g, 10 min, 4ºC) e, subsequentemente, congelado instantaneamente em nitrogênio líquido e armazenado a -80ºC. O fígado foi GED - 4645039v2 coletado durante a dissecção, pesado, congelado instantaneamente em nitrogênio líquido e armazenado a -80ºC até análise posterior.

[0056] Em amostras de plasma PN98, colesterol total no plasma em jejum (TC no Plasma; cholesterol liquicolor CHOD-PAP, Instruchemie, Delfzijl, Países Baixos), triglicerídeos (TG no Plasma; método de Trinder GPO, Sigma Aldrich, Zwijndrecht, Países Baixos), beta-hidroxibutirato (bHB no Plasma; β- Hidroxibutirato LiquiColor, Stanbio Laboratory, Boerne, TX, EUA) e glicose (método GOD-PAP, Roche diagnostics, Almere, Países Baixos) foram medidos colorimetricamente com o uso de um sistema de formação de imagens de microplaca (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA). Insulina no plasma em jejum, amilina, polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose (GIP) e leptina foram medidos simultaneamente usando uma abordagem multiplexada (MILLIPLEX MAP Mouse Metabolic Hormone Magnetic Bead Panel, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha). Amostras, controles e padrões foram preparados de acordo com o protocolo do fabricante e a fluorescência foi quantificada com o uso de um instrumento Bio-PlexTM 200 Luminex instrument (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, EUA). Como medida indireta de sensibilidade à insulina, aplicou-se a modelo de avaliação da homeostase de resistência à insulina (HOMA-IR; (glu(mmol/L)*ins(pmol/L)/22,5)) para glicose e insulina no plasma em jejum. No tecido hepático de PN98, o conteúdo de proteína (Kit BCAtm Protein Assay, Thermo Scientific, Breda, países Baixos), triglicerídeo (kit Triglycerides liquicolor mono, Human Diagnostics, Wiesbaden, Alemanha) e colesterol (kit Cholesterol liquicolor mono, Human Diagnostics, Wiesbaden, Alemanha) foi avaliado colorimetricamente, usando um sistema de formação de imagens de microplaca (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, EUA).

[0057] RNA total de duodeno, jejuno, íleo, cólon, fígado e WAT foi isolado, purificado e imediatamente armazenado a -80ºC. Para este propósito, foram usados kits de DNAse tratado com TRIzol/clorofórmio (Invitrogen, Breda, Países Baixos) e RNAeasy mini (Qiagen, Venlo, Países Baixos) de acordo com as instruções dos fabricantes. O RNA foi quantificado (espectrofotômetro NanoDrop GED - 4645039v2

ND-1000 Uv-vis, Isogen, Maarsen, Países Baixos) e a sua integridade foi verificada com o Kit 6000 Nano usando o ensaio Eukaryote Total RNA Nano de acordo com o Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Amesterdã, Países Baixos). Se as amostras exibiram bandas intactas de subunidades de RNA ribossômico 18S e 28S, exibido sem picos cromossômicos ou produtos de degradação de RNA e tinham um número de integridade de RNA (RIN) acima de 8,0, elas foram consideradas adequados para hibridização para o microarranjo.

[0058] O cDNA marcado foi preparado a partir de 100 ng de RNA purificado por amostra usando o kit Ambion Whole Transcript (WT) Expression (Life Technologies, Carlsbad, EUA) e kit Affymetrix GeneChip WT Terminal Labelling (Affymetrix, Santa Clara, EUA). Todas as amostras de um tecido foram hibridizadas ao mesmo arranjo Affymetrix GeneChip Mouse Gene 1.1 ST, de acordo com os protocolos do fabricante. Integrado em um fluxo on-line, foram usados pacotes de software Bioconductor para realizar o controle de qualidade e etapas de normalização (Lin, 2011 nº287). Aplicando o algoritmo de análise de multiarranjo robusto (RMA) da biblioteca de Bioconductor AffyPLM com configurações padrão, foram calculadas estimativas de expressão normalizada de conjuntos de sonda (Irizarry, 2003 nº275). De acordo com Dai et al. (Dai, 2005 nº263), conjuntos de sonda foram redefinidos e atribuídos para identificadores de gene único (IDs) do banco de dados Entrez Gene, resultando em 21.187 IDs Entrez atribuídos.

[0059] Para reduzir o número de variáveis, somente genes com um valor de intensidade > 20 em, pelo menos, 5 arranjos e intervalo interquartil > 0,1 foram selecionados para posterior análise, resultando em 14.230 genes para fígado,

15.574 genes para WAT, 14.377 genes para cólon, 15.467 genes para duodeno, jejuno e íleo. Usando estatísticas t moderadas baseadas em intensidade (IBMT) implementando correção empírica de Bayes (Sartor, 2006 nº313), razões de sinal 2log e respectivas razões de mudança (razão 2log de 1 igual a uma razão de mudança de 2) e significâncias relacionadas de alteração foram calculadas a partir das intensidades médias de sinal dos quatro grupos. As razões de GED - 4645039v2 mudança e os correspondentes valores-p foram aplicados para análise bioinformática descritiva e visualização dos dados.

[0060] Para relacionar os dados de expressão gênica a funções biológicas e vias canônicas, foi aplicado Ingenuity Pathway Analysis (IPA, IngenuityH Systems, www.ingenuity.com) usando p = 0,05 como filtro para genes para realizar análise abrangente de via e rede.

[0061] O grupo REF representa o grupo de controle que não recebeu a intervenção com dieta (fase de início de vida) e não recebeu a dieta de desafio WSD (mais tarde na vida). Nas análises estatísticas, foram comparados os três grupos desafiados com WSD (CTRL, G/F, SYN).

[0062] Foram realizadas análises estatísticas com o uso de IBM SPSS Statistics SPSS 19,0 (Benelux, Gorinchem, Países Baixos) e GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA).

[0063] Todas as variáveis foram testadas quanto à distribuição normal usando o Teste dOne-Sample Kolmogorov-Smirnov. Se distribuído normalmente, as variáveis foram analisadas em CTRL versus G/F versus SYN por ANOVA unidirecional. Sobre efeitos significativos, foi realizada análise post hoc usando teste de comparações múltiplas de Tukey para comparar entre os grupos individuais. No caso de distribuição não gaussiana, um log de transformação foi realizado anterior à análise ANOVA unidirecional. As diferenças foram consideradas significativas com p ≤ 0,05. Os dados são apresentados como média ± SEM a menos que indicado de outra forma. Resultados

[0064] A intervenção nutricional no início da vida tanto com G/F como SYN, em comparação à dieta de controle (grupo REF e CTRL) não afetou o crescimento no desenvolvimento durante e diretamente após o período de intervenção até PN42. O peso corporal, a massa gorda e a massa magra não diferiram entre os grupos experimentais neste ponto no tempo. Também, a massa gorda em relação ao peso corporal (% de massa gorda) foi similar em todos os grupos. Mediante desafio com WSD de CTRL, os grupos G/F e SYN de GED - 4645039v2

PN42 a PN98, o comprimento animal e a massa magra mantiveram-se similares em todos os grupos, indicando uma trajetória de crescimento normal.

[0065] Nem no início da vida (PN21 a 42) nem no período de vida posterior (PN42 a 93), foram detectadas diferenças na ingestão de alimentos entre os grupos que seriam responsáveis pelos fenótipos observados.

[0066] Os resultados sobre os marcadores para metabolismo lipídico do fígado e sistêmico são mostrados na Figura 1. O ácido beta-hidroxibutírico (bHB) no plasma estava significativamente aumentado no grupo SYN (Figura 1A). bHB é uma fonte de energia durante o jejum ou exercício, bem como uma molécula de sinalização na homeostase lipídica, e indicativa para formação de cetona. Também é indicativa para um gasto aumento de ácidos graxos pela beta- oxidação, por exemplo, no fígado. Ela é indicativa para uma mudança metabólica melhorada para oxidação de no jejum. O colesterol no plasma também foi significativamente menor (p = 0,007) no grupo SYN, com um efeito intermediário no grupo G/F (Figura 1B), em comparação ao CTRL. Não houve efeitos significativos no plasma TG (Figura 1C).

[0067] A desregulação da homeostase metabólica, como mudanças no metabolismo lipídico, está associada ao desenvolvimento de doença hepática gordurosa (FLD), uma condição reversível de acúmulo de gordura ectópica no fígado. Então, parâmetros relevantes no fígado foram medidos. A média de peso do fígado dos animais SYN na dissecção foi significativamente menor, em comparação aos animais CTRL e G/F (Figura 1D). Diferenças no colesterol total no fígado em relação à proteína no fígado foram menores em tendência (p = 0,08), e seguido pelo padrão visual similar à escada (Figura 1E). O conteúdo de triglicerídeos no fígado de SYN foi significativamente menor do que em CTRL e G/F (Figura 1F).

[0068] A Figura 2 mostra o efeito do metabolismo da glicose, pois isso pode influenciar o metabolismo lipídico e a saúde do fígado. O cálculo HOMA-IR foi baseado nos níveis de glicose e insulina em jejum no plasma, dos quais o anterior foi, sem surpresa, similar em todos os grupos e o último foi GED - 4645039v2 significativamente diferente (p = 0,039), com CTRL, G/F e SYN mostrando um padrão descendente similar à estrela. O HOMA-IR foi mais baixo em SYN do que em CTRL e, então, indicou uma resposta do organismo mais sensível à insulina. Enquanto os níveis de glicose no plasma em jejum (Figura 2B) são similares em todos os grupos, o HOMA-IR (Figura 2A), que é um índice para sensibilidade à insulina, e várias moléculas sinalizadoras relevantes para a homeostase da glicose, incluindo insulina (Figura 2C), amilina (Figura 2D), GIP (Figura 2E) e PP (Figura 2F), apresentam níveis plasmáticos aprimorados (tendência) em SYN após desafio WSD sobre PN98, com insulina no plasma em SYN sendo significativamente mais baixa do que em CTRL. GIP no plasma, uma potente incretina, que também é conhecida por afetar a absorção de glicose e síntese de lipídeos, foi similarmente alta em todos os grupos esperados para SYN, que foi significativamente mais baixo que G/F (p = 0,014).

[0069] Os efeitos na homeostase lipídica indicam que o grupo CTRL inclina-se em direção a um fenótipo NAFDL, e isto é ainda apoiado pelos efeitos na homeostase de glicose. Além disso, a inflamação crônica de baixo grau é fundamental para a progressão de NAFLD para estados cirróticos de risco mais alto. Então, o fenótipo NAFDL e a doença hepática gordurosa é prevenida/resgatada em SYN.

[0070] Para identificar potenciais mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos benéficos da suplementação simbiótica no início da vida, realizamos análise de microarranjo de seis tecidos relevantes; duodeno, jejuno, íleo e cólon, fígado e tecido adiposo branco. Para SYN versus CTRL, observamos o efeito mais forte, determinado como números de genes expressos significativamente de forma diferencial (p < 0,05), no íleo (n = 1592) seguido pelo jejuno (n = 1307) e duodeno (n = 1227). 1191 genes foram significativamente regulados no fígado, enquanto a expressão de apenas 315 e 285 genes foi significativamente diferente em WAT e cólon, respectivamente. Em todos os tecidos analisados, um número similar de genes com razão de mudança maior que 1,2 em comparação de SYN versus CTRL foram tanto infra como suprarregulados, considerando no GED - 4645039v2 intestino delgado e cólon, para a maior parte dos genes regulados. No entanto, no fígado e Wat a expressão da maioria dos genes foi regulada com razão de mudança absoluta menor que 1,2, indicando que a suplementação synbioticem comparação ao CTRL induz a regulação mais fracos no fígado e WAT.

[0071] A comparação dos genes expressos diferencialmente no íleo, jejuno e duodeno revelou que somente 84 genes, que representam menos que 10% dos genes expressos diferencialmente por segmento, foram compartilhadas entre os tecidos. Isto indica que suplementação simbiótica no início da vida induz respostas transcricionais no tecido em longo prazo em segmentos intestinais em comparação a CTRL. Notavelmente, todos os genes de sobreposição alteraram a expressão gênica na mesma direção em todos os segmentos do intestino delgado, com 69 sendo suprarregulados e o restante infrarregulados. A anotação dos 84 genes com o uso da descrição GO identificou 17 e 12 genes indicados nas funções metabólicas e imunes, respectivamente.

[0072] Para identificar as funções biológicas e as vias canônicas que são especificamente direcionadas pela regulação diferencial de genes, nós usamos a Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Na IPA a significância da regulação baseia- se no número e alteração de genes regulados em relação ao número total de genes atribuídos a uma função. No íleo, as funções biológicas e vias canônicas foram fortemente reguladas com o top 5 tendo -log(valores-p) entre 14,25-11,98 e 12,80-5,27, respectivamente. No fígado, a regulação das funções biológicas e vias tiveram -log(valor-p) máximo de 7,49 e 3,04. No íleo a função biológica regulada mais forte foi o “Metabolismo Lipídico”, e a via canônica regulada mais forte foi a “Biossíntese do Colesterol”. Focando sobre o metabolismo do colesterol, descobriu-se que conjuntos de genes relacionados à biossíntese (via do mevalonato, biossíntese de esteroide), absorção de colesterol para a célula e regulação da homeostase foram suprarregulados em camundongos suplementados com SYN no início da vida, enquanto conjuntos de genes relacionados ao armazenamento, excreção e distribuição de colesterol foram bastante infrarregulados, o que poderia indicar uma necessidade maior de GED - 4645039v2 colesterol das células. Estas regulações foram, em grande medida, em linha com o grupo REF. No entanto, no grupo G/F estes efeitos não estavam presentes, ou em um menor grau, e os resultados foram mais comparáveis ao grupo CTRL. Exemplo 2 A Modulação da Microbiota Isoladamente não Resulta no Efeito em Longo Prazo na Saúde Metabólica

[0073] Camundongos machos C57/Bl6 livre de germes mantidos com ração padrão autoclavada foram usados para transplante. Na semana 5, todos os camundongos foram aclimatados ao WSD estéril por 1 semana. Os conteúdos congelados do ceco de camundongos suplementados com comida (CTRL) e simbióticos (SYN) (coletados em PN42 do experimento de amamentação) foram homogeneizados em tampão PBS suplementado com solução redutora (Na2S 0,02M e cisteína 1% dissolvida em tampão NaHCO3). Dois doadores separados de cada grupo foram selecionados. Após uma semana de aclimatação, camundongos (6 semanas de idade, PN42, 4 a 5 camundongos por grupo) estavam em jejum por 4 h e foram alimentados por gavagem com a pasta fluida resultante (200 µL). Camundongos transplantados foram mantidos em gaiolas ventiladas individuais autoclavadas com cama estéril e alimentados com WSD estéril e água à vontade, durante 14 semanas. O peso corporal foi medido e a imagem por ressonância magnética (MRI) de todo o corpo foi realizada em PN 42, 43, 70 e 98.

[0074] No momento da transferência (PN42), não foram observadas diferenças no peso corporal, massa gorda e a massa magra entre os camundongos GF receptores. Após transferência de microbiota, nenhuma diferença significativa no peso corporal, massa gorda e massa magra foi observada entre grupos CTRL e SYN para interação dieta*tempo. Dessa forma, a microbiota alterada após a suplementação simbiótica não é suficiente para transferir o fenótipo benéfico de camundongos suplementados com simbióticos para receptores. Isto indica que é preferencialmente o processo real de modulação da microbiota no início da vida pela presença de oligossacarídeos GED - 4645039v2 não digeríveis e B. breve no início da vida no intestino que pode ser considerado necessário para induzir um efeito na saúde metabólica em longo prazo.

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Claims

Reivindicações

1. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, caracterizada pelo fato de compreender uma combinação de Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis para uso na prevenção e/ou redução do risco de ocorrência de doença hepática gordurosa, mais tarde na vida em um sujeito humano, por administração da composição nutricional para o sujeito humano no início da vida.

2. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, para uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser para uso na prevenção e/ou redução do risco de ocorrência de doença hepática gordurosa não alcoólica mais tarde na vida.

3. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de início da vida ser quando o sujeito humano tem idade de 0 a 36 meses, mais preferencialmente 0 a 12 meses.

4. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de tarde na vida ser quando o sujeito humano tem idade de 5 anos, mais preferencialmente acima de 18 anos.

5. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato do dito sujeito humano ser exposto ou criado em ambiente obesogênico e/ou consumir, após a infância, uma Dieta de Estilo Ocidental que é elevada em gordura e elevada em ácidos graxos saturados, com a gordura fornecendo mais que 35% do total de calorias da dieta, e com os ácidos graxos saturados fornecendo mais que 10% do total de calorias da dieta.

6. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato do dito sujeito humano ser um lactente em risco selecionado a partir do grupo que consiste em um lactente pré-termo, um lactente pequeno para a idade gestacional, um lactente grande para a idade gestacional, um lactente nascido de uma mãe com sobrepeso ou GED - 4645039v2 obesa, um lactente nascido de uma mãe que sofre de diabetes tipo 2 ou diabetes gestacional, um lactente nascido por cesariana e um lactente que é tratado ou foi tratado com antibióticos.

7. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato da Bifidobacterium breve ser Bifidobacterium breve M-16V.

8. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato dos oligossacarídeos não digeríveis serem selecionados a partir do grupo que consiste em fruto- oligossacarídeos, galacto-oligossacarídeos e uma combinação dos mesmos.

9. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato da composição nutricional ser uma fórmula infantil, fórmula de seguimento ou fórmula para criança de primeira infância, mais preferencialmente uma fórmula infantil ou fórmula de seguimento.

10. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato da composição nutricional compreender 104 a 1012 ufc de Bifidobacterium breve por grama de peso seco da composição nutricional e 0,25% a 20%, em peso, de oligossacarídeos não digeríveis com base no peso seco da composição nutricional.

11. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato da composição nutricional compreender 104 a 1012 ufc de Bifidobacterium breve por grama de peso seco da composição nutricional e 0,25% a 20%, em peso, de oligossacarídeos não digeríveis selecionados a partir do grupo que consiste em galacto- oligossacarídeos e fruto-oligossacarídeos e misturas dos mesmos, com base no peso seco da composição nutricional.

12. USO DE UMA COMBINAÇÃO DE BIFIDOBACTERIUM BREVE E OLIGOSSACARÍDEOS NÃO DIGERÍVEIS, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição nutricional para uso na prevenção e/ou redução GED - 4645039v2 do risco de ocorrência de doença hepática gordurosa, mais tarde na vida em um sujeito humano, por administração da composição nutricional para o sujeito humano no início da vida.

13. MÉTODO PARA PREVENIR E/OU REDUZIR O RISCO DE OCORRÊNCIA DE DOENÇA HEPÁTICA GORDUROSA, mais tarde na vida em um sujeito humano, caracterizado pelo fato de ser administrando uma composição nutricional que compreende uma combinação de Bifidobacterium breve e oligossacarídeos não digeríveis no início da vida.

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