BR112019014652A2 - anticorpos monovalentes antiproperdina e fragmentos de anticorpo - Google Patents
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Abstract
São descritos aqui, neste pedido de patente anticorpos monovalentes isolados ou fragmentos de anticorpo do mesmo que se ligam à properdina humana. Esses anticorpos são uteis em métodos de tratamento para doenças mediadas pela desregulação alternativa da via do complemento.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ANTI-
[0001] O sistema do complemento desempenha um papel central na depuração de complexos imunes e nas respostas imunes a agentes infecciosos, antígenos estranhos, células infectadas por vírus e células de tumor. A ativação do complemento ocorre principalmente através de três vias: a via clássica, a via da lectina e a via alternativa. A ativa- ção descontrolada ou regulação insuficiente da via alternativa do com- plemento pode levar à inflamação sistêmica, lesão celular e dano de tecido. A via alternativa do complemento tem sido implicada na pato- gênese de um número crescente de diversas doenças. A properdina regula positivamente a ativação de vias alternativas do complemento através da ligação e estabilização dos complexos C3 e C5 da conver- tase (C3bBb e C3bnBb). A inibição ou modulação da atividade da pro- perdina é uma importante estratégia terapêutica para mitigar os sinto- mas e retardar a progressão de doenças associadas à desregulação da via alternativa do complemento. Continua a existir uma necessida- de não satisfeita de regular eficazmente a atividade da properdina.
[0002] São descritos aqui, neste pedido de patente, anticorpos iso- lados monovalentes e os fragmentos de anticorpo dos mesmos que especificamente ou substancialmente se ligam especificamente a pro- perdina e bloqueiam seletivamente a ativação alternativa da via do complemento. Através da inibição da atividade funcional da properdi- na, o anticorpo monovalente descrito aqui, neste pedido de patente inibe a montagem alternativa induzida através da via do complemento do complexo de ataque à membrana. Além disso, a objetivação seleti- va de uma única molécula de properdina com um anticorpo monova-
lente pode reduzir complexos imunes indesejáveis, resultantes da agregação. Dessa forma, o direcionamento seletivo de um único mo- nômero ou multímero de properdina pode, por sua vez, melhorar os benefícios clínicos para pacientes com doença mediada por desregu- lação da via alternativa do complemento.
[0003] Em uma modalidade, a descrição é a dirigida a um anticor- po monovalente isolado ou a um fragmento de anticorpo do mesmo, em que o anticorpo ou o seu fragmento de anticorpo se liga a proper- dina humana. Em uma modalidade específica, o anticorpo ou fragmen- to é um anticorpo camelídeo. Em uma modalidade específica, o anti- corpo ou fragmento é um anticorpo de domínio único. Em uma modali- dade específica, o anticorpo ou fragmento está ligado a TSRO e /ou TSR1 de properdina humana. Em uma modalidade específica, o anti- corpo ou fragmento se liga a um epitomo na sequência de aminoáci- dos — LCOPCRSPRWSLWSTWAPCSVTCSEGSQLRYRRCVGWNGQ (SEQ ID NO: 8). Em uma modalidade específica, o anticorpo ou frag- mento se liga à properdina de camundongo com uma afinidade inferior a 50 nM. Em uma modalidade específica, o anticorpo ou fragmento compreende pelo menos uma ou todas as três CDR selecionadas de: a) uma CDR-H1 incluindo a sequência de aminoácidos GRIFEVNMMA (SEQ ID NO: 9); b) uma CDR-H2 incluindo a sequência de aminoáci- dos RVGTTX1YADSVKG (SEQ ID NO: 10), em que X1 é um aminoá- cido polar ou não polar; e c) uma CDR-H3 incluindo a sequência de aminoácidos LOYX2RYGGAEY (SEQ ID NO: 11), em que X2 é um aminoácido polar. Em uma modalidade específica, a CDR-H2 inclui a sequência de aminoácidos RVGTTVYADSVKG (SEQ |D NO: 12). Em uma modalidade específica, a CDR-H3 inclui a sequência de aminoá- cidos LOYDRYGGAEY (SEQ ID NO: 12). Em uma modalidade especí- fica, a CDR-H2 inclui a sequência de aminoácidos RVGTTTYADSVKG (SEQ ID NO: 15). Em uma modalidade específica, a CDR-H3 tem a sequência de aminoácidos LOYSRYGGAEY (SEQ ID NO: 14). Em uma modalidade específica, a CDR-H3 possui a sequência de amino- ácidos LOYDRYGGAEY (SEQ ID NO: 13). Em uma modalidade espe- cífica, a CDR-H3 possui a sequência de aminoácidos LOYDRYGGAEY (SEQ ID NO: 13). Em uma modalidade específica, a CDR-H3 tem a sequência de aminoácidos LQYSRYGGAEY (SEQ ID NO: 14). Em uma modalidade específica, o anticorpo ou fragmento inclui 3 CDRs com as seguintes sequências: a) uma CDR-H1 tendo a sequência de aminoácidos GRISSIIHMA (SEQ ID NO: 16); b) uma CDR-H2 tendo a sequência de aminoácidos RVGTTVYADSVKG (SEQ ID NO: 12); e c) uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoácidos LQOYEKHGGADY (SEQ ID NO: 17). Em uma modalidade específica, o anticorpo inclui 6 CDRs com as seguintes sequências: a) uma CDR-H1 tendo a sequên- cia de aminoácidos GYIFTNYPIH (SEQ ID NO: 18); b) uma CDR-H2 tendo a sequência de aminoácidos FIDPGGGYDEPDERFRD (SEQ ID NO: 19); c) uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoácidos RGGGYYLDY (SEQ ID NO: 20); d) uma CDR-L1 tendo a sequência de aminoácidos RASQDISFFLN (SEQ ID NO: 21); e) uma CDR-L2 tendo a sequência de aminoácidos YTSRYHS (SEQ ID NO: 22); e f) uma CDR-L3 tendo a sequência de aminoácidos QHGNTLPWT (SEQ ID NO: 23). Em uma modalidade específica, o anticorpo inclui 6 CDRs com as seguintes sequências: a) uma CDR-H1 possuindo a sequência de aminoácidos GFSLTTYGVH (SEQ ID NO: 24); b) uma CDR-H2 tendo a sequência de aminoácidos VIWSGGDTDYNASFIS (SEQ ID NO: 25); c) uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoácidos NKDYYTNYDFTMDY (SEQ ID NO: 26); d) uma CDR-L1 tendo a se- quência de aminoácidos KSSQSVLYSSNQKNFLA (SEQ ID NO: 27); e) uma CDR-L2 tendo a sequência de aminoácidos WASTRES (SEQ ID NO: 28); e f) uma CDR-L3 tendo a sequência de aminoácidos HQYLSSYT (SEQ ID NO: 29). Em uma modalidade específica, o anti-
corpo inclui 6 CDRs com as seguintes sequências: a) uma CDR-H1 tendo a sequência de aminoácidos GYTFIDYWIE (SEQ ID NO: 30); b) uma CDR-H2 tendo a sequência de aminoácidos EIFPGSGTINHNEK- FKD (SEQ ID NO: 31); c) uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoá- cidos EGLDY (SEQ ID NO: 32); d) uma CDR-L1 tendo a sequência de aminoácidos SASSSVSYIY (SEQ ID NO: 33); e) uma CDR-L?2 tendo a sequência de aminoácidos DTSTLAS (SEQ ID NO: 34); e f) uma CDR- L3 tendo a sequência de aminoácidos QQOWSRNPFT (SEQ ID NO: 35). Em uma modalidade específica, o anticorpo inclui 6 CDRs com as seguintes sequências: a) uma CDR-H1 tendo a sequência de aminoá- cidos GFSLTSYGVH (SEQ ID NO: 36); b) uma CDR-H2 tendo a se- quência de aminoácidos VIIWWSGGSTDYNAAFIS (SEQ ID NO: 37); c) uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoácidos NKDFYSNYDYTMDY (SEQ ID NO: 38); d) uma CDR-L1 tendo a se- quência de aminoácidos KSSQSVLYSSNQKNFLA (SEQ ID NO: 27); e) uma CDR-L2 tendo a sequência de aminoácidos WASTRES (SEQ ID NO: 28); e f) uma CDR-L3 tendo a sequência de aminoácidos HQYLSSYT (SEQ ID NO: 29). Em uma modalidade específica, o anti- corpo inclui 6 CDRs com as seguintes sequências: a) uma CDR-H1 tendo a sequência de aminoácidos GYTXTAYGIN (SEQ ID NO: 39); b) uma CDR-H2 tendo a sequência de aminoácidos YIYVIGNGYTDYNEK- FKG (SEQ ID NO: 40); c) uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoá- cidos SGWDEDYAMDEF (SEQ ID NO: 41); d) uma CDR-L1 tendo a se- quência de aminoácidos RASENIYSYLA (SEQ ID NO: 42); e) uma CDR-L2 tendo a sequência de aminoácidos HAKTLAE (SEQ ID NO: 43); e f)| uma CDRL3 tendo a sequência de aminoácidos QHHYYPPPT (SEQ ID NO: 44). Em uma modalidade específica, o an- ticorpo ou fragmento inibe uma atividade da properdina humana.
[0004] Em uma modalidade, a descrição é dirigida a utilização de um anticorpo monovalente isolado ou um fragmento de anticorpo do mesmo que se liga a properdina humana em um modo de tratamento de uma doença mediada por desregulação alternativa da via do com- plemento ou na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença mediada desregulação alternativa complementar da via.
[0005] Em uma modalidade, a descrição é dirigida a um método para o tratamento de uma doença mediada por uma desregulação da via alternativa do complemento. Os métodos incluem a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo de um anticorpo monovalente isolado ou um fragmento de anticorpo do mesmo, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga à properdina humana em um pacien- te que esteja necessitando da mesma. Em uma modalidade especiífi- ca, a doença é a purpura trombocitopica trombica autoimune (TTP), síndrome hemolico-úrico (HUS), síndrome hemolico-urico atico (aH- US), hemoglobinia paroxtica noturna (HPN), nefropatia IgA (doença de Berger), asma (por ex. asma), glomerulopatia C3 (C3G), doença de Gaucher, hidradentite supurativa, doença de Behçet, queimadura gra- ve, sepse precoce, dermatomiosite, meningite pneumocócica, doença de Alzheimer, metástase de câncer, síndrome do desconforto respira- tório agudo (SARA), lesão pulmonar aguda (ACI) lesão pulmonar rela- cionada à transfusão (TRALI), trombose induzida por hemodiálise, epi- dermólise bolhosa adquirida (EBA), uveite, doença de Parkinson, atre- sia biliar primária, vasculite por anticorpos citoplasmáticos antineutrófi- los (ANCA), degeneração da retina, ampla microangiopatia trombótica (TMA), ampla TMA ( APS), terapia com células-tronco hematopoiéticas (TCTH) TMA, degeneração macular relacionada à idade (DMRI), pré- eclâmpsia, hemólise, elevação das enzimas hepáticas e síndrome pla- quetária (HELLP), esclerose múltipla, síndrome antifosfolipídica (APS), policondrite recidivante, lesão isquêmica, acidente vascular cerebral, doença de enxerto versus hospedeiro (GvHD), doença pulmonar obs- trutiva crônica (DPOC), enfisema, aterosclerose, síndrome coronariana aguda, choque hemorrágico, artrite reumatoide, diálise (risco cardio- vascular), doença cardiovascular, malária placentária, síndrome anti- fosfolipídica (SAF), perda de gravidez, glomerulonefrite membrano pro- liferativa (MP), nefritite membranosa, encefalite, lesão cerebral, ence- falite por anticorpos do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA), crise hemolítica da malária, aneurisma da aorta abdominal (AAA) ou aneu- risma da aorta toracoabdominal (TAA).
[0006] Em uma modalidade, a descrição é dirigida para a um mé- todo de inibição da montagem de complexo de ataque de membrana de via complementar do complemento. O método inclui a administra- ção de uma quantidade eficaz de um anticorpo, derivado de anticorpo ou fragmento do mesmo a um paciente que esteja necessitando do mesmo. Em uma modalidade específica, o método inibe a hemodiálise dependente da via alternativa do complemento.
[0007] Em algumas modalidades o anticorpo ou o fragmento do mesmo inclui a sequência de: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFR- QAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLY- LQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAP-
KTQYDYDYWGQGTLVTIVSSECGGGSGCSGESGGEGESLEVALVESGG GLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAE- ISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYC- NALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 45).
[0008] Em algumas modalidades o anticorpo ou o fragmento do mesmo inclui a sequência de: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFR- QAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLY- LQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAP- KTQYDYDYWGQGTLVTIVSSSECGGGSGCGGGESGGGGSEVALLESGG- GLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFR-
7IT3 QAPGKERELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRD- NSKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHG- GADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 46).
[0009] Em algumas modalidades o anticorpo ou o fragmento do mesmo inclui a sequência de: EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFR- QAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLY- LQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAP- KTQYDYDYWGQAGTLVTIVSSSGGGDGGGGDGGGGEVALVESGG- GLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAE- ISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYC- NALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 47).
[0010] Em algumas modalidades o anticorpo ou o fragmento do mesmo inclui a sequência de: EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFR- QAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLY- LQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAP- KTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGEGGGGEGGGGEVQLVESGG- GLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAE- ISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYC- NALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 48).
[0011] Em algumas modalidades o anticorpo ou o fragmento do mesmo inclui a sequência de: EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFR- QAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLY- LQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAP- KTQYDYDYWGQGTLVTIVSSGGGGSGGGGSCGGGGSEVALVESGG- GLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWVR- QAPGKQRELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRD- NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNALQYEKHG-
GADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 49).
[0012] Em algumas modalidades o anticorpo ou o fragmento do mesmo inclui a sequência de: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFR- QAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLY- LQOMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAP- KTQYDYDYWGQGTLVTIVSSGGGGDGGGGDGGGGEVALLESGG- GLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFR- QAPGKERELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRD- NSKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHG- GADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 50).
[0013] Em algumas modalidades o anticorpo ou o fragmento do mesmo inclui a sequência de: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFR- QAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLY- LQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAP- KTQYDYDYWGQAGTLVTIVSSSCGGGEGGGGEGGGGEVQLLESGG- GLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFR- QAPGKERELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRD- NSKNTLYLOQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHG- GADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 51).
[0014] Em algumas modalidades o anticorpo ou o fragmento do mesmo inclui a sequência de: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFR- QAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLY- LQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAP- KTQYDYDYWGQAGTLVTIVSSGGGGDGGGGDGGGGEVALVESGG- GLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWVR- QAPGKQRELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRD- NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNALQYEKHG-
GADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 52).
[0015] Em algumas modalidades o anticorpo ou o fragmento do mesmo inclui a sequência de: LEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYR- QAPGKQRELVAE- ISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYC- NALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSSRKCCVECPPCPAPPVAG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY- VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCK- VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP- SQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN- NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM- HEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 53).
[0016] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento do mesmo é um anticorpo VHH monovalente antiproperdina LVPO58 liga- do a uma hG1 sem um domínio de ligação C1q e inclui a sequência de: LEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYR- QAPGKQRELVAE- ISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYC- NALQYEKHG- GADYWGQGTQVTVSSPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF- PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEK- TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI- AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS-
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 54).
[0017] Em modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo é um anticorpo VHH monovalente antiproperdina LVPO58 ligado a uma VHH anti-albumina por um ligante (G4S) 3 e inclui a sequência de: LEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYR- QAPGKQRELVAE- ISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYC- NALQYEKHG- GADYWGQGTAVTVSSSGGGGSCGGGSGGGGSEVALVESGG- GLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAIN- WQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAA- VFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 55). Definições
[0018] Na forma como utilizado aqui, neste pedido de patente, a frase "anticorpo monovalente ou o fragmento de anticorpo do mesmo" se refere a um anticorpo ou o fragmento do mesmo de ligação ao antí- geno compreendendo um único domínio de ligação, por exemplo, VH ou VHH, com relação a um antígeno, por exemplo, uma única molécu- la de properdina. Em uma modalidade a molécula de antígeno ligada faz parte de um multímero, por exemplo, um multímero trímero ou de ordem mais alta de multímeros de properdina. Os anticorpos que in- cluem geralmente anticorpos monovalentes ou seus fragmentos de anticorpo se ligam com um elevado grau de especificidade a um antí- geno específico.
[0019] Na forma como utilizada aqui, neste pedido de patente a frase "anticorpo de domínio único" define moléculas onde o sítio de ligação ao antígeno está presente e é formado por um único domínio de imunoglobulina. Geralmente, o local de ligação ao antígeno de um único domínio variável de imunoglobulina é formado por não mais de três CDRs. O domínio variável único pode, por exemplo, incluir uma sequência de domínio variável de cadeia leve (uma sequência VL) ou um fragmento adequado da mesma; ou uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (por exemplo, uma sequência VH ou se-
quência VHH) ou um fragmento adequado da mesma; desde que seja capaz de formar uma única unidade de ligação ao antígeno (isto é, uma unidade funcional de ligação ao antígeno que essencialmente é o único domínio variável, de tal forma que o único domínio de ligação ao antígeno não precise interagir com outro domínio variável para formar um antígeno funcional unidade de encadernação).
[0020] Na forma como utilizada aqui, neste pedido de patente, a expressão "anticorpo camelídeo" se refere a um anticorpo derivado de uma espécie de camelídeo, por exemplo, em um camelo, dromedário, lama, alpaca ou guanaco. Os anticorpos camelídeos diferem dos da maioria dos outros mamíferos por não possuírem uma cadeia leve e, portanto, incluem apenas cadeias pesadas com capacidades comple- tas e diversas de ligação ao antígeno (Hamers Casterman, C. et al, Nature, 363: 446 8, 1993).
[0021] Na forma como utilizada aqui, neste pedido de patente, o termo "Vu" se refere a um único anticorpo de domínio variável de ca- deia pesada desprovido de cadeias leves. As cadeias VHn, por exem- plo, podem ser do tipo que podem ser encontradas em peixes Cameli- dae ou cartilaginosos que são naturalmente desprovidos de cadeias leves ou em um Vu sintético e não imunizado que pode ser construído de acordo com isso. Cada cadeia pesada inclui uma região variável codificada pelos exons V, D e J. Um Vu pode ser um anticorpo VrHr natural, por exemplo, um anticorpo camelídeo, ou uma proteína re- combinante incluindo um domínio variável de cadeia pesada.
[0022] Na forma como utilizada aqui, neste pedido de patente, a expressão um “anticorpo isolado” se refere a um anticorpo que é subs- tancialmente isento de outros anticorpos com diferentes especificida- des antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga a pro- perdina é substancialmente isento de contaminantes, por exemplo, an- ticorpos que não se ligam à properdina). Além disso, um anticorpo
“isolado” é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Componentes contaminan- tes do seu ambiente natural são materiais que podem interferir com usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteiná- ceos.
[0023] Na forma como utilizada aqui, neste pedido de patente, a expressão “ligação específica" de um anticorpo ou seu fragmento, po- lipeptídeo ou peptidomimético é ligado a uma molécula alvo que é mensurávelmente diferente a partir da ligação a moléculas que não sejam moléculas alvo. Como utilizado aqui, neste pedido de patente, ligação específica se refere a uma preferência superior a 95% com re- lação á ligação de um antígeno específico versus ligação de fundo (“não específico”). Ligação "substancialmente específica" se refere a uma preferência superior a cerca de 80% de ligação de um antígeno em relação ao fundo. A ligação pode ser medida com a utilização de uma variedade de métodos incluindo, mas não limitados a Western blot, immunoblot, ensaio imuno absorvente ligado à enzima ("ELISA"), radioimunoensaio ("RIA"), imuno precipitação, ressonância plasmônica de superfície, interferometria de bio-camada, luminescência química, polarização fluorescente, fosforescência, análise imuno histoquímica, espectrometria de massa de dessorção a laser/ionização por tempo de voo (“MALDI TOF”), microcitometria, microarray, microscopia, classifi- cação de células ativadas por fluorescência (“FACS”) e citometria de fluxo.
[0024] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, a expressão “properdina humana” se refere a uma glicoproteína solúvel de 469 aminoácidos encontrada no plasma que tem sete repetições de trom- bospondina do tipo | (TSR) com o domínio do terminal N, sendo o TSRO um domínio truncado. A properdina humana, uma proteína de
53 kDa, inclui um peptídeo de sinal (aminoácidos 1 - 28) e seis TSR não idênticas repete cerca de 60 aminoácidos cada, como se segue: aminoácidos 80 - 134 (TSR1), aminoácidos 139 - 191 (TSR2), aminoá- cidos 196 - 255 (TSR3), aminoácidos 260 - 313 (TSR4), aminoácidos 318 - 377 (TSR5) e aminoácidos 382 - 462 (TSR6). A properdina é formada por oligomerização de um monômero semelhante a bastão em dímeros, trímeros e tetrâmeros cíclicos. A sequência de aminoáci- dos da properdina humana se encontra na base de dados GenBank com os seguintes números de acesso: para a properdina humana, ver, por exemplo, os números de acesso GenBank AAA3S6489, NP-002612, AAH15756, AAP43692, S29126 e CAA40914. A properdina é um regu- lador positivo da cascata alternativa de ativação do complemento. Os ligantes de ligação conhecidos para a properdina incluem C3b, C3bB e C3bBb (Blatt, A. et al., Inmunol. Rev., 274: 172 90, 2016).
[0025] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, a expressão “properdina de camundongo” se refere uma glicoproteína solúvel de 457 aminoácidos encontrada no plasma que tem sete TSRs com o domínio do terminal N, TSRO, sendo truncado. A properdina de ca- mundongo, uma proteína de 50 kDa, inclui um peptídeo de sinal (ami- noácidos 1 - 24) e seis TSR não idênticas de cerca de 60 aminoácidos cada, como se segue: aminoácidos 73 - 130 (TSR1), aminoácidos 132 - 187 (TSR2), aminoácidos 189 - 251 (TSR3), aminoácidos 253 - 309 (TSR4), aminoácidos 311 - 372 (TSR5) e aminoácidos 374 - 457 (TSR6). A properdina de camundongo é formada pela oligomerização de um monômero semelhante a bastão em dímeros, trímeros e tetrâ- meros cíclicos. A sequência de aminoácidos da properdina de camun- dongo encontra-se, por exemplo, na base de dados do GenBank (GenBank Accession Nos. P11680 e S05478).
[0026] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, a expressão “domínio TSRO” se refere ao domínio truncado da properdina que pre-
cede do domínio TSR1 da properdina. Por exemplo, o domínio TSRO s properdina humana inclui os aminoácidos 28 — 76.
[0027] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, a expressão “domínio TSRO"” se refere ao domínio da properdina adjacente ao do- mínio TRSO da properdina, Por exemplo, o domínio TRSO da properdi- na humana inclui os aminoácidos 77 — 134.
[0028] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, a expressão “uma atividade de properdina” refere-se à atividade biológica da pro- perdina incluindo, mas não se limitando a, interações de ligação que levam à estabilidade da convertase C3/C5. A properdina se liga com maior avidez ao C3b, Bb - a via alternativa C3/C5 convertase, porém também se liga ao C3b; C3b, B e C3b, Bb. Uma função é para estabili- zar o complexo C3b, Bb permitindo um aumento da ativação da via alternativa (Pangburn, M., Methods Enzymol., 162: 639 53, 1988; No- lan, K. & Reid, K., Methods Enzymol., 223: 35- 46, 1993). A properdina aumenta a formação da via alternativa C3 convertase através do au- mento da ligação do fator B aos complexos P, C3b. Desse modo, a properdina é um acelerador (regulador positivo) da ativação do com- plemento. A properdina também foi implicada no início da ativação da via alternativa através da ligação à superfície alvo e iniciando a forma- ção de convertase C3/C5 (Kemper C. & Hourcade, D., Mol. Immunol., 45: 4048 56, 2008).
[0029] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, a expressão “via alternativa do complemento” se refere a uma das três vias de ati- vação do complemento (sendo as outras a via clássica e a via da lecti- na). A via alternativa do complemento é tipicamente ativada através de bactérias, parasitas, vírus ou fungos, embora o IgA Abs e determina- das cadeias de IgL também tenham sido relatadas para ativar esta via.
[0030] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, a expressão "desregulação da via alternativa do complemento" se refere a qualquer aberração na capacidade da via alternativa do complemento de forne- cer defesa do hospedeiro contra patógenos e liberar complexos imu- nes e células danificadas e para imuno rregulação. A desregulação da via alternativa do complemento pode ocorrer tanto na fase fluida quan- to na superfície celular e pode levar à ativação excessiva do comple- mento ou regulação insuficiente, ambos causando lesão no tecido.
[0031] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, a expressão “uma doença mediada através de uma desregulação da via alternativa do complemento” se refere a uma interrupção, cessação ou distúrbio das funções, sistemas ou órgãos do corpo causada por uma desregu- lação da via alternativa do complemento. Tais doenças se beneficiari- am do tratamento com uma composição ou formulação descrita aqui, neste pedido de patente. Em algumas modalidades a doença é causa- da por qualquer aberração na capacidade da via alternativa do com- plemento para prover defesa do hospedeiro contra agentes patogêni- cos e complexos imunes claros e células danificadas, e para imunor- regulação. Também são abrangidas aqui, neste pedido de patente, doenças direta ou indiretamente, mediadas através da desregulação de um ou mais componentes da via alternativa do complemento, ou um produto gerado pela via alternativa do complemento.
[0032] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, a expressão “conjunto complexo de ataque de membrana dependente do comple- mento alternativo” se refere a um complexo terminal formado como resultado da ativação alternativa da via do complemento e inclui os componentes C5, C6, C7, C8 e C9 do complemento. A montagem do complexo de ataque à membrana (MAC) leva à lise da célula.
[0033] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, a expressão “hemólise dependente da via alternativa do complemento” se refere à lise dos glóbulos vermelhos mediada pelo aumento do conjunto alter- nativo de vias dependentes do complemento e/ou deposição nos gló-
bulos vermelhos.
[0034] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, o termo "li- gante" se refere a uma ligação entre dois elementos, por exemplo, domínios de proteína. Um ligante pode ser uma ligação covalente ou um espaçador. O termo “ligação” se refere a uma ligação química, por exemplo, uma ligação amida ou uma ligação dissulfeto, ou qualquer tipo de ligação criada a partir de uma reação química, por exemplo, conjugação química. Um ligante pode se referir a uma parte (por exemplo, um polímero de polietileno glicol (PEG)) ou uma sequência de aminoácidos (por exemplo, uma sequência de 3 - 200 aminoácidos, 3-150 aminoácidos ou 3-100 aminoácidos) que ocorre entre dois poli- peptídeos ou domínios de polipeptídeos para proporcionar espaço e/ou flexibilidade entre os dois polipeptídeos ou domínios de polipeptí- deos. Um espaçador de aminoácido pode fazer parte da sequência primária de um polipeptídeo (por exemplo, ligado aos polipeptídeos ou domínios de polipeptídeos espaçados através do esqueleto de polipep- tídeo). Um ligante pode compreender um ou mais resíduos de glicina e serina.
[0035] A Fig. 1 descreve dados de interferometria de bio-camada obtidos com a utilização de um biossensor Octet"y com um sistema modelo em que anticorpos antiproperdina selecionados ligam especifi- camente properdina humana. O gráfico mostra a dissociação de equi- líbrio ao longo do tempo.
[0036] A Fig. 2 descreve dados de interferometria de bio-camada obtidos com a utilização de um biossensor Octet'y com um sistema modelo em que anticorpos antiproperdina selecionados ligam especifi- camente properdina de camundongo. O gráfico mostra a dissociação de equilíbrio ao longo do tempo.
[0037] A Fig. 3 descreve dados de interferometria de bio-camada obtidos utilizando um biossensor Octet"" com um sistema modelo em que anticorpos antiproperdina selecionados mostraram ligação especi- fica, mas fraca, com a properdina de cynomolgus. O gráfico mostra a dissociação de equilíbrio ao longo do tempo.
[0038] A Fig. 4 mostra que os anticorpos antiproperdina seleciona- dos inibem a atividade da properdina humana em um ensaio de hemó- lise da via alternativa do complemento.
[0039] As FIG. 5A a FIG. 5C mostram a caracterização de anti- corpos antiproperdina selecionados por espectrometria de massa.
[0040] As FIG. 6A e FIG. 6B mostra a afinidade de ligação de anti- corpos antiproperdina selecionados com relação à properdina biotini- lada com a utilização de um método de captura de properdina.
[0041] A FIG. 7 mostra a afinidade de ligação de anticorpos bi es- pecíficos de antiproperdina selecionados com relação à properdina biotinilada com a utilização de um modo de captura de properdina.
[0042] AS FIG. 8A e FIG. 8B mostram anticorpos bi específicos antiproperdina selecionados que inibem a atividade da properdina hu- mana e de cynomolgus em um ensaio de hemólise da via alternativa do complemento. Um anticorpo antiproperdina foi usado como contro- le.
[0043] As FIG. 9A e FIG. 9B mostram anticorpos bi específicos antiproperdina selecionados que inibem a atividade da properdina hu- mana e de cynomolgus em um ensaio de hemólise da via alternativa do complemento.
[0044] As FIG. 10A e FIG. 10B apresentam a afinidade de ligação de anticorpos bi específicos antiproperdina selecionados à properdina biotinilada utilizando um modo de captura de properdina.
[0045] FIG. 11A e FIG. 11B mostra a afinidade de ligação de anti- corpos bi específicos antiproperdina selecionados à properdina biotini- lada com a utilização de um método de captura de properdina.
[0046] FIG. 12A e FIG. 12B mostram a afinidade de ligação de an- ticorpos bi específicos antiproperdina selecionados à properdina bioti- nilada com a utilização de um método de captura de properdina.
[0047] A properdina é um regulador positivo da via alternativa do complemento. São descritos aqui, neste pedido de patente, novos an- ticorpos monovalentes que se ligam a uma única molécula de proper- dina e são úteis para o tratamento de doenças mediadas por desregu- lação da via alternativa do complemento. É descrita aqui, neste pedido de patente, a descoberta de que os complexos imunes resultantes de anticorpos bivalentes que se ligam a mais do que um multímero de properdina exibem toxicidade como agentes terapêuticos para inibir a ativação aberrante da via alternativa do complemento. Os anticorpos monovalentes descritos aqui, neste pedido de patente têm uma pro- porção de ligação de 1: 1 com relação à properdina e, por concepção, não podem formar agregados anticorpo/properdina que contenham mais do que um multímero de properdina, proporcionando uma vanta- gem sobre os anticorpos bivalentes e multivalentes.
[0048] As seções que se seguem fornecem uma descrição de anti- corpos monovalentes ou de fragmentos de anticorpos que podem ser administrados a um paciente com uma doença mediada por desregu- lação da via alternativa do complemento. Anticorpos antiproperdina
[0049] São descritos aqui, neste pedido de patente, anticorpos an- tiproperdina monovalentes, derivados de anticorpos (por exemplo, an- ticorpos modificados, anticorpos humanos, anticorpos quiméricos, an- ticorpos substituídos, anticorpos humanizados, etc.) e seus fragmentos de anticorpos que inibem a properdina, um regulador positivo da via alternativa do complemento, e desestabilizam em seguida o C3- e os complexos enzimáticos da C5 convertase. Os anticorpos descritos aqui, neste pedido de patente podem inibir, por exemplo, a ligação da properdina a C3b, C3Bb e C3bBb. A inibição da properdina leva à re- dução da ativação do complemento da via alternativa, indicando um benefício terapêutico para pacientes afligidos por uma doença de des- regulação da via alternativa, em que a via alternativa é hiperativada.
[0050] Os anticorpos antiproperdina descritos aqui, neste pedido de patente, podem ser produzidos com a utilização da properdina de comprimento total, polipeptídeos de properdina e/ou utilizando peptí- deos contendo epitopos de properdina antigênicos, por exemplo, um fragmento do polipeptídeo de properdina. Os peptídeos e polipeptí- deos de properdina podem ser isolados e utilizados para gerar anticor- pos como polipeptídeos naturais, polipeptídeos recombinantes ou sin- téticos recombinantes. Todos os antígenos úteis para a produção de anticorpos antiproperdina podem ser utilizados para a geração de anti- corpos monovalentes. Formatos de anticorpos monovalentes adequa- dos, e métodos para os mesmos, são conhecidos na técnica (por exemplo, nas WO 2007/048037 e WO 2007/059782, cujo conteúdo total é incorporado aqui, neste pedido de patente por referência).
[0051] O anticorpo antiproperdina pode ser um anticorpo monoclio- nal ou derivado de um anticorpo monoclonal. Anticorpos monoclonais adequados para antígenos selecionados podem ser preparados atra- vés de técnicas conhecidas ("Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", Zola (CRC Press, 1988); "Monoclonal Hybridoma Antibo- dies", Techniques and Applications”, Hurrell (CRC Press, 1982), o con- teúdo total dos quais é incorporado aqui, nreste pedido de patente, por referência).
[0052] Em outras modalidades, o anticorpo pode ser um anticorpo de domínio único, tal como um VH. Tais anticorpos existem natural- mente em camelídeos e tubarões (Saerens, D. et al., Curr. Opin. Pharmacol., 8: 600 8, 2008). Os anticorpos camelídeos são descritos,
por exemplo, nas Pat. U.S. Nos. 5.559.808; 5.800.988; 5.840.526;
5.874.541; 6.005,079; e 6.015.695, todo o conteúdo de cada uma das quais é i incorporado aqui, neste pedido de patente, por referência. O domínio VHn clonado e isolado é um polipeptídeo estável que apresen- ta a capacidade de ligação total ao antígeno do anticorpo de cadeia pesada original. Os domínios VHn, com suas propriedades estruturais e funcionais únicas, combinam as vantagens dos anticorpos convencio- nais (alta especificidade de alvo, alta afinidade ao alvo e baixa toxici- dade inerente) com características importantes de fármacos de molé- culas pequenas (a capacidade de inibir enzimas e de acessar fendas receptoras). Além disso, eles são estáveis, têm o potencial para serem administrados por outros meios que não a injeção, são mais fáceis de serem fabricados e podem ser humanizados (Patente US No.
5.840.526; Patente U. S. No. 5.874.541; Patente U. S. No. 6,005,079, Patente U. S.. No. 6.765.087; EP 1589107; WO 97/34103; WO 97/49805; Patente U.S. 5.800.988; Patente U.S. 5.874.541 e Patente U.S. 6.015.695, das quais conteúdo total das mesmas é incorporado aqui, neste pedido de patente, por referência).
[0053] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALVESGGGLVQOAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFR- QAPGKEREFVAAIGWNGEGIYYADSVKGRFTISRDNAK-
NTGYLQMNSLKPEDTAVYYCAADSEGVVPGFPIAYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO: 71)
[0054] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPLNSYAIGWFR- QAPGKEREGVSCISVSDDSTYYTDSVKGRFTISRDNAK-
NTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAVDSAPLYGDYVCKPLEN- EYDFWGQGTOQVTVSG (SEQ |D NO: 72).
[0055] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVQALVESGGGLVQOAGGSLXLSCAASGSDRRING- MGWYRHPPGKQRELVAAITSGGSTNYADSVKGRFTIST- NNANNMMYLQMNSLKPEDTAVYYCAIDE- FGTGWLDYCGQGTAVTVSG (SEQ ID NO: 73).
[0056] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRPFSSYAMGWFR- QAPGKEREIVAGLSWSGGNVYYADSVKGRFTISRDNAK-
NTGDLQMNSLKPEDTAVYYCAIGPKLTTGPTAYRYWGQGTQOVTVSS (SEQ ID NO: 74)
[0057] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGGTFSSYAMGWFR- QAPGKEREFVAAITWNGSNRYYADSVKGRFTISRD- NAKSTVYLQMNSLK-
PEDTAVYYCAAEHSTRYSGFYYYTRGETYHYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO: 75)
[0058] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALVESGGGLVQOAGGSLRLSCAASGRTFSTLGMGWFR- QAPGKERQFVAAINWSGSSTYYANSVKGRFTISRD- NAQSTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAA-
DLDSRYSAYYYYSDESQYDYWGQGTLVTVSG (SEQ ID NO: 76)
[0059] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVQAVVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGRTFSSYAMGWFR- QAPGKEREFVAAITWDGANIYYADSVKGRFTLSRD- NAENTVWLOQLNSLKPEDTAVYYCAAAESGRYSGRDYYSAPGVYLY- WGQGTLVTVSG (SEQ ID NO: 77)
[0060] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALVESGGGLVQOAGGSLRLSCAASGSIFDINAMGWYR- QAPGKQRELVADITSSGSTNYADSVKGRFTISRDNAK- NTVYLQMNSLKPEDTAVYTCAAESIRESQNRHQLGYMG- PLYDYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO: 78)
[0061] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALIESGGGLVQAGDSLRLSCAASEGTFSRFAMGWFR- QAPGKEREFVAAINWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAK- NTVYLQMNSLKPEDTADYYCAAETTTRYSGYYYYED- NKSYDYWGQGTLVTVSG (SEQ ID NO: 79)
[0062] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVAVVESGGGLRQTGGSLRLSCTASGRIFEVNMMAWYR- QAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDSAK-
NTVTLOMNSLKSEDTAVYYCNALQYDRYGGAEYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 58)
[0063] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVLLEESGGGLERTGGSLRLSCAASGSIFSVNSMTWYRQAPGKR- REFLGTITEEGRTNYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLK- PEDTAVYYCYANLISSEDRTFGVWGQGTAQVTVSS (SEQ ID NO: 80)
[0064] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVHLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGGTVGDYAVGWFR- QAPGKERELIGVVSRLGART- GYADSVLGRFTISRDDVKNTVFLQMDSVKPEDTAVYYCAARRDYS- FEVVPYDYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO: 81)
[0065] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVAMVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTNRIRIMGWYR- QAPGKLRELVATITNDGSTHYADSVKGRFTISTDNAK- NTVFLQMNSLKPEDTAVYICNVGENWGPAYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO: 82)
[0066] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPLNSYAIGWFR- QAPGKEREGVSCISVSDDSTYYTDSVKGRFTISRDNAK- NTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAVDSAPLYGDYVCKPLEN- EYDFWGQGTOQVTVSG (SEQ |D NO: 72)
[0067] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVRLTESGGGLVQYGTNLT-
LTCVASGLISTRNKMGWFRRRSGGQREFVASSTVLSDDVIQDDI- AETVKGRFAVARNDYKNILYLQMTAVKPEDTGFYWCASGTSLF- GASRREDDFNAWGVGTOQVTVSA (SEQ ID NO: 83)
[0068] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVQAQLAESGGGLVQAGDSLKLSCTASGRIFEVNMMAWYR- QAPGKDRELVAEISRVGTTTYADSVKGRFTISRDSAK-
NTVTLOMNSLKSEDTAVYYCNALQYSRYGGAEYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO: 59)
[0069] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSADMSWVR- QAPGKGPEWVSAINSNGGSTYYAASVKGRFTISRDNAK-
NTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAQGNWYTEEYHYWGQGTLVTVSG (SEQ ID NO: 84)
[0070] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVRLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTLSSYAMGWFR- QAPGKEREFVAATTWRDTSTYYADSVKGRFTISRDNAK- NTVYLQMNSLK-
PEDTAAYYCAAEEPSKYSGRDYYMMGDSYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 85)
[0071] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSADMSWVR- QAPGKGPEWVSAINSNGGSTYYAASVKGRFTISRDNAK-
NTLYLOQMNSLKPEDTAVYYCAQGNWYTEEYHYWGQGTQAVTVSG (SEQ ID NO: 86)
[0072] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVQALVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMAWFR- QAPGKEREFVASISGSGDSRYYADSVKGRFTISRDNAK- NTVYLOTNSPKPEDTAVYYCAAVLP- TRYSGFYYYSDGTQYHYWGQGTQOVTVSS (SEQ ID NO: 87)
[0073] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVNLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASENINVINDMGWYR- QAPGKQRELVAVITGHDNINYADSATGRFTISTYTWN-
TENLQMNMLKPEDTAVYYCNADITYANGRFNDWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 88)
[0074] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVHLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRT- FSSYAMGWFRQPPGKEREFVAAITWSGSSIYYADSVKGRFTISRD- NAKNTVYLQMNSLK-
PEDTAVYYCAAEETSKYSGSYYYMMGDSYDYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO: 89)
[0075] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFR- QAPGKEREFVAAVPWTYGSKY- YADSVKGRFTISRDDAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYYCA-
ADSSAGYYSGFDYYSAATPYDLWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO: 90)
[0076] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDYYAIGWFR- QAPGKEREGVSCMSRTDGSTYYADSVKDRFTISRDYAK- NTVYLQMNSLKPEDTAVYYCGLDRSYPTGGISCLFGDFG- SWGQGTAVTVSG (SEQ ID NO: 91)
[0077] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGRTFSSYN- MGWFROQRHGNEREFVATISWSGRSTYYADSVKGRFAISRD- NANTTVYLQMNSLKPEDSAVYYCAASTRGWYGTQED- DYNFWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO: 92)
[0078] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALVESGGGLVAQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYR- QAPGKQRELVAE- ISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYC- NALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO: 60)
[0079] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALVESGGGLVQOAGGSLRLSCAASGGTFSSYSMGWFR- QAPGKEREFVAAITWNGVSTYYADSVKGRFTISRDNAK- NTVYLQMNSLKPTDTAVYYCAAEITTRYSGFYYYED- NKSYDYWGQGTQVTVSS (SEQ |D NO: 93)
[0080] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVQAQLVESGGGLRQTGESLRLSCTASGRIFEVNMMAWYR- QAPGKQRELVAEISRVGTTTYADSVKGRFTISRDSAK-
NTVTLOQMNSLKSEDTAVYYCNALQYDRYGGAEYWGQGTQOVTVSG (SEQ ID NO: 61)
[0081] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFR- QAPGKEREGVSCISRTDGSTYYADSVKGRFTISRDNAK- NTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAVDDSYPTGGISCLFGHFG- SWGQGTAVTVSS (SEQ ID NO: 94)
[0082] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGFTFSSYAMGWFR- QAPGKEREFVAAITWSGVSTYYADSVKGRFTISRDNAK- NRVYLQMNSLKPEDTAVYSCAADGSGRYSGMEYYNRD- WVYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 95)
[0083] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVHMVESGGGLVQAGGSLRFSCAASGNIFTISTLDWYR- QAPGEQRELVATLTPDGITDYAGSVKGRFTISRDNAK- NTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAWRYSDDYR- GRVDYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO: 96)
[0084] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada:
QVQLIESGGGLVQEGASLRLSCAGSGPMFSRLAVGWFR- QAPGKEREFVAVINWSGSADFYTNSVKGRFTISRDNAK- NTVYLEMNTLKPEDSAVYYCAADQNPLTLRTGVRDVGRQWGQG- TEVTVSS (SEQ |D NO: 97)
[0085] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFR- QAPGKEREFVAAITWRGASTYYADPVKGRFTISRDNAK- NTVYLOQMSSLKPEDTAVYYCAAEEP- SYYSGSYYYMMGDSYNYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO: 98)
[0086] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue como o domínio variável da sua cadeia pesada: QVALVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGRTFSNYAMGWFR- QAPGKEREFLAAISRSGESTNYATFVKGRFTIARDNAK- NTVSLQMNSLKPEDTAVYFCAAK- VAVLVSTTYNSQYDYWGQGTQVTVSS (SEQ |D NO: 99).
[0087] Anticorpos adicionais antiproperdina, derivados de anticor- pos e seus fragmentos descritos aqui, neste pedido de patente incluem aqueles que possuem uma ou mais, ou todas, as seguintes CDRs: a. uma CDR-H1 tendo a sequência de aminoácidos GRIFEVNMMA (SEQ ID NO: 9); b. uma CDR-H2 que tenham a sequência de aminoácidos RVG- TTVYADSVKG (SEQ ID NO: 12);e c. uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoácidos LQOYSRYGGAEY (SEQ ID NO: 113).
[0088] Anticorpos adicionais antiproperdina, derivados de anticor- pos e seus fragmentos divulgados aqui, neste pedido e patente inclu- em aqueles que possuem uma ou mais, ou todas, as seguintes CDRs:
a. uma CDR-H1 que tenha a sequência de aminoácidos GRIFEVNM- MA (SEQ ID NO: 9); b. uma CDR-H2 que tenha a sequência de aminoácidos RVG- TTTYADSVKG (SEQ |D NO: 15); e c. uma CDR-H3 que tenha a sequência de aminoácidos LQYSRYG- GAEY (SEQ ID NO: 14).
[0089] Anticorpos adicionais antiproperdina, derivados de anticor- pos e seus fragmentos divulgados aqui, neste pedido e patente inclu- em aqueles que possuem uma ou mais, ou todas, as seguintes CDRs: a. uma CDR-H1 que tenha a sequência de aminoácidos GRIFEVNM- MA (SEQ ID NO: 9); b. uma CDR-H2 que tenha a sequência de aminoácidos RVG- TTTYADSVKG (SEQ |D NO: 15); e c. uma CDR-H3 que tenha a sequência de aminoácidos LQYDRYG- GAEY (SEQ ID NO: 13).
[0090] Anticorpos adicionais antiproperdina, derivados de anticor- pos e seus fragmentos divulgados aqui, neste pedido e patente inclu- em aqueles que possuem uma ou mais, ou todas, as seguintes CDRs: a. uma CDR-H1 que tenha a sequência de aminoácidos GRISSIIHMA (SEQ ID NO: 16); b. uma CDR-H2 que tenha a sequência de aminoácidos RVG- TTVYADSVKG (SEQ ID NO: 12); e c. uma CDR-H3 que tenha a sequência de aminoácidos LOYEKHG- GADY (SEQ ID NO: 17).
[0091] Os polipeptídeos VHH camelídeos humanizados são ensi- nados, por exemplo na WO 04/041862, cujos ensinamentos são incor- porados aqui, neste pedido de patente na sua totalidade. Será enten- dido por um versado na técnica que os polipeptídeos de domínio vari- ável único de anticorpo camelídeo que ocorrem na natureza podem ser modificados (por exemplo, por substituições de aminoácidos nas posições 45 e 103 (WO 04/041862)) para gerar polipeptídeos VHn ca- melídeos humanizados. Também estão incluídos aqui, neste pedido de patente polipeptídeos únicos de domínio variável de anticorpo que são de tubarão enfermeira Vnn (Greenberg, A. et al., Nature, 374: 168 73, 1995; Publicação de Patente U.S. No. 20050043519).
[0092] Anticorpos antiproperdina adicionais, derivados de anticor- pos e seus fragmentos descritos aqui, neste pedido de patente, inclu- em aqueles que possuem um ou mais, ou todas (como por exemplo, para criar um scFv ou dAb), das seguintes CDRs: a) uma CDR-H1 que tenha a sequência de aminoácidos GYIFTNYPIH (SEQ ID NO: 18); b) uma CDR-H2 que tenha a sequência de aminoácidos FID- PGGGYDEPDERFRD (SEQ |D NO: 19); c) uma CDR-H3 que tenha a sequência de aminoácidos RGGGYYLDY (SEQ ID NO: 20); d) uma CDR-L1 que tenha a sequência de aminoácidos RASQDIS- FFLN (SEQ ID NO: 21); e) uma CDR-L2 que tenha a sequência de aminoácidos YTSRYHS (SEQ ID NO: 22); e f) uma CDR-L3 que tenha a sequência de aminoácidos QHGNTLPWT (SEQ ID NO: 23).
[0093] Anticorpos antiproperdina adicionais, derivados de anticor- pos e seus fragmentos descritos aqui, neste pedido de patente, inclu- em aqueles que possuem um ou mais, ou todas (como por exemplo, para criar um scFv), das seguintes CDRs: a) uma CDR-H1 que tenha a sequência de aminoácidos GFS- LTTYGVH (SEQ ID NO: 24); b) uma CDR-H2 que tenha a sequência de aminoácidos VI- WSGGDTDYNASFIS (SEQ ID NO: 25); Cc) uma CDR-H3 que tenha a sequência de aminoácidos
NKDYYTNYDFTMDY (SEQ ID NO: 26); d) uma CDR-L1 que tenha a sequência de aminoácidos KSSQSVLYSSNQKNFLA (SEQ ID NO: 27); e) uma CDR-L2 que tenha a sequência de aminoácidos WAS- TRES (SEQ |D NO: 28); e f) uma CDR-L3 que tenha a sequência de aminoácidos HQYLSSYT (SEQ ID NO: 29).
[0094] Anticorpos antiproperdina adicionais, derivados de anticor- pos e seus fragmentos descritos aqui, neste pedido de patente, inclu- em aqueles que possuem um ou mais, ou todas (como por exemplo, para criar um scFv), das seguintes CDRs: a) uma CDR-H1 que tenha a sequência de aminoácidos GYT- FIDYWIE (SEQ ID NO: 30); b) uma CDR-H2 que tenha a sequência de aminoácidos EIFPGSGTINHNEKFKD (SEQ ID NO: 31); c) uma CDR-H3 que tenha a sequência de aminoácidos EGLDY (SEQ ID NO: 32); d) uma CDR-L1 que tenha a sequência de aminoácidos SAS- SSVSYIY (SEQ ID NO: 33); e) uma CDR-L2 que tenha a sequência de aminoácidos DTSTLAS (SEQ ID NO: 34); e f) uma CDR-L3 que tenha a sequência de aminoácidos QQWSRNPFT (SEQ ID NO: 35).
[0095] Anticorpos antiproperdina adicionais, derivados de anticor- pos e seus fragmentos descritos aqui, neste pedido de patente, inclu- em aqueles que possuem um ou mais, ou todas (como por exemplo, para criar um scFv), das seguintes CDRs: a) uma CDR-H1 que tenha a sequência de aminoácidos GFS- LTSYGVH (SEQ ID NO: 36); b) uma CDR-H2 que tenha a sequência de aminoácidos VIl-
WSGGSTDYNAAFIS (SEQ ID NO: 37); c) uma CDRH3 que tenha a sequência de aminoácidos NKDFYSNYDYTMDY (SEQ ID NO: 38); d) uma CDR-LI que tenha a sequência de aminoácidos KSSQSVLYSSNQKNFLA (SEQ ID NO: 27); e) uma CDR-L2 que tenha a sequência de aminoácidos WASTRES (SEQ ID NO: 28); e f) uma CDR-L3 que tenha a sequência de aminoácidos HQYLSSYT (SEQ ID NO: 29).
[0096] Anticorpos antiproperdina adicionais, derivados de anticor- pos e seus fragmentos descritos aqui, neste pedido de patente, inclu- em aqueles que possuem um ou mais, ou todas (como por exemplo, para criar um scFv), das seguintes CDRs: a) uma CDR-H1 que tenha a sequência de aminoácidos GYTXTAYGIN (SEQ ID NO: 39); b) uma CDR-H2 que tenha a sequência de aminoácidos YIYIGNGYTDYNEKFKG (SEQ |D NO: 40); c) uma CDR-H3 que tenha a sequência de aminoácidos SGWDE- DYAMDEF (SEQ ID NO: 41); d) uma CDR-L1 que tenha a sequência de aminoácidos RASE- NIYSYLA (SEQ ID NO: 42); e) uma CDR-L2 que tenha a sequência de aminoácidos HAKTLAE (SEQ ID NO: 43); e f) uma CDR-L3 que tenha a sequência de aminoácidos QHHYGPPPT (SEQ ID NO: 44).
[0097] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue: LEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYR- QAPGKQRELVAE- ISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYC-
NALQYEKHGGADYWGQGTQAQVTVSSRKCCVECPPCPAPPVAG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY- VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCK- VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP- SQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN- NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM- HEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 53)
[0098] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue: LEVQLVESGGGLVAQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYR- QAPGKQRELVAE- ISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYC- NALQYEKHG- GADYWGQGTQVTVSSPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF- PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEK- TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI- AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS-
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 54)
[0099] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo, inclui aa sequências de cadeia leve e de cadeia pesada que se seguem: DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISFFLNWYQQK- PGKAPKLLIYYTSRYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS- LQPEDFATYYCQHGNTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS- DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE- QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR- GEC (SEQ ID NO: 56); e QVALVASGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTNYPIHWVR-
QAPGQGLEWMGFIDPGGGYDEPDERFRDRVTM- TRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGGGYYLDYWGQG- TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSL- GTQTYICNWNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSN- KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR- WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 57)
[00100] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue: LEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYR- QAPGKQRELVAE- ISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYC- NALQYEKHG- GADYWGQGTAVTVSSGGGGSGCGGGSGGGGSEVALVESGG- GLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAIN- WQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAA- VFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 55)
[00101] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo inclui a sequência que se segue: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKE- REFVSAINWQOKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAE- DTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQG- TLVTIVSSGGGGSGGGGSGGGGSLEVOALVESGGGLVQAGGSLRLS- CAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVG- TTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNAL- QYEKHGGADYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 45) Fragmentos e derivados de anticorpo antiproperdina
[00102] Alguns anticorpos que ocorrem na natureza incluem dois domínios de ligação ao antígeno e, por esse motivo, são divalentes. Um número de fragmentos menores de ligação ao antígeno de anti- corpos que ocorrem na natureza foram identificados depois da diges- tão com protease. Estes anticorpos incluem, por exemplo, o “fragmen- to Fab” (V1- C1i- CH1- VyH), fragmento Fab" (um Fab com a região de dobradiça da cadeia pesada), e fragmento F(ab')7” (um dímero de fra- gmentos Fab' unidos através da região de dobradiça da cadeia pesa- da). Métodos recombinantes têm sido utilizados para gerar esses fra- gmentos e gerar fragmentos de anticorpos ainda menores, por exem- plo, aqueles referidos como “cadeia única Fv” (fragmento variável) ou “scFv”, que consiste de V. e Vu unidos por um ligante de peptídeo sin- tético (V. — ligante -r Vx). Os fragmentos Fab, os fragmentos Fab' e os fragmentos scFv são monovalentes com relação á a ligação ao antí- geno, uma vez que cada um deles inclui apenas um domínio de liga- ção ao antígeno, incluindo um dímero VH/V.. Fragmentos de anticor- pos monovalentes ainda mais pequenos são os dAbs, que incluem apenas um único domínio variável de imunoglobulina, por exemplo, Vx ou Vi, que de forma isolada se liga especificamente ao antígeno, isto é, sem a necessidade de um domínio V. ou V+ complementar, respec- tivamente. Um dAb se liga ao antígeno independentemente de outros domínios V; no entanto, um dAb pode estar presente em um multímero homo ou hetero com outros domínios Vx ou Vi em que os outros do- mínios não são necessários para a ligação ao antígeno através do dAb, isto é, onde o dAb se liga ao antígeno independentemente dos domínios Vu ou V. adicionais.
Ligantes
[00103] Na presente invenção, um ligante é utilizado para descrever uma ligação ou ligação entre polipeptídeos ou domínios de proteína e/ ou partes de não proteína associadas. Em algumas modalidades, um ligante é uma ligação ou conexão entre pelo menos dois construtos de polipeptídeos, por exemplo, de tal forma que os dois construtos poli- peptídicos são unidos um ao outro em série em tandem (por exemplo, um anticorpo monovalente ligado a um segundo polipeptídeo ou anti- corpo monovalente). Um ligante pode ligar o terminal N ou o terminal C de um construto de anticorpo ao terminal N ou ao terminal C de um segundo construto de polipeptídeo.
[00104] Um ligante pode ser uma ligação covalente simples, por exemplo, uma ligação de peptídeo, um polímero sintético, por exem- plo, um polímero de polietileno glicol (PEG), ou qualquer tipo de liga- ção criada a partir de uma reação química, por exemplo, conjugação química. No caso de um ligante ser uma ligação de peptídeo, o grupo de ácido carboxílico no terminal C de um domínio de proteína pode reagir com o grupo amino no terminal N de outro domínio de proteína em uma reação de condensação para formar uma ligação de peptídeo. Especificamente, a ligação de peptídeo pode ser formada a partir de meios sintéticos através de uma reação química orgânica convencio- nal bem conhecida na técnica, ou através da produção natural de uma célula hospedeira, em que uma sequência de poli nucleotídeo codifica as sequências de DNA de ambas as proteínas, como por exemplo, dois construtos de anticorpos, em série em tandem pode ser transcrito diretamente e traduzido num polipeptídeo contíguo que codifica ambas as proteínas através das maquinarias moleculares necessárias, por exemplo, polimerase de DNA e ribossomo, na célula hospedeira.
[00105] No caso em que um ligante é um polímero sintético, por exemplo, um polímero de PEG, o polímero pode ser funcionalizado com grupos funcionais químicos reativos em cada extremidade para reagir com os aminoácidos terminais nas extremidades de ligação de duas proteínas.
[00106] No caso em que um ligante (exceto a ligação de peptídeo acima mencionada) é feito a partir de uma reação química, grupos funcionais químicos, por exemplo, amina, ácido carboxílico, éster, azi- da, ou outros grupos funcionais comumente utilizados na técnica, po- dem ser ligados sinteticamente a o terminal C de uma proteína e o terminal N de outra proteína, respectivamente. Os dois grupos funcio- nais podem em seguida reagir através de meios de química sintética para a formação de uma ligação química, ligando dessa forma as duas proteínas juntas. Esses procedimentos de conjugação química são de rotina para os versados na técnica.
[00107] Na presente invenção, um ligante entre dois construtos de peptídeo pode ser um ligante de aminoácido incluindo a partir de 1-200 (por exemplo, 1-4, 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 2-10, 2 -12, 2-16, 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200) aminoáci- dos. Os ligantes de peptídeo adequados são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ligantes de peptídeo que contenham resíduos de aminoácidos flexíveis, tais como glicina e serina. Em determinadas modalidades, um ligante pode conter motivos simples ou múltiplos, motivos repetitivos ou diferentes de GS, GGS, GGGGS (SEQ ID N 1), GGSG (SEQ ID N 2) ou SGGG (SEQ ID N 3). Os motivos exemplares têm as sequências de (G48) n, (G4D) n, (G4E) n, (G4A) n onde n=1, 2, 3, 4, 5 ou mais, e combinações dos mesmos. Outros ligantes inclu- em as sequências GGGGD (SEQ ID NO: 63), GGGGE (SEQ ID NO: 64) e GGGGA (SEQ ID NO: 100). Os ligantes podem ser projetados para combinar esses vários motivos. Esses ligantes incluem GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 4)) GGGGDGGGGDGGGGÇ (SEQ ID NO: 5), GGGGEGGGGEGGGG (SEQ ID NO: 6) e GGGGA- GGGGAGGGGS (SEQ ID NO: 101). Construtos biespecíficos
[00108] A invenção também apresenta construtos biespecíficos em que dois polipeptídeos de ligação ao antígeno estão ligados (por exemplo, através de um ligante, tal como o ligante de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-6, 63-64 e 100-101). Esses construtos biespecíficos podem incluir um polipeptídeo de ligação antiproperdina (por exemplo, um anticorpo monovalente) ligado através de um ligante a um segundo polipeptídeo (por exemplo, um segundo anticorpo monovalente). O se- gundo polipeptídeo pode aumentar a estabilidade in vivo do construto biespecífico. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é uma molécula de ligação à albumina, um peptídeo de ligação à albumina ou um anticorpo anti-albumina (por exemplo, um anticorpo monovalente), ou uma forma modificada do mesmo. Os polipeptídeos de ligação de albumina são conhecidos na técnica e estão descritos, por exemplo, na WO 2007/106120 (ver as Tabelas 1 a 9) e Dennis et al., 2002, J Biol. Chem. 277: 35035-35043, cujas descrições são incorporadas aqui, neste pedido de patente, por referência.
[00109] Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é um domínio Fc que aumenta in vivo a estabilidade do construto.
[00110] Os construtos biespecíficos de exemplo são exibidos baixo no Exemplo 5.
[00111] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado a um anticorpo anti-albulmina monovalente. O anticorpo anti-albulmina monovalente pode estar ligado através do seu terminal N- ou terminal C ao terminal N ou ao terminal C do anticorpo anti- albumina monovalente.
[00112] O anticorpo antiproperdina monovalente pode estar ligado pelo seu terminal N ou terminal C ao terminal N ou ao terminal C do anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-6, 63-64 e 100-
101.
[00113] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo-
novalente que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58 está ligado a um anticorpo anti-albumina monovalente. O anticorpo monovalente antiproperdina que inclui a sequência da SEQ ID NO: 58 pode estar ligado pelo seu terminal N ou terminal C ao terminal N ou ao terminal C do anticorpo anti-albumina monovalente através de um ligante que inclui a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-6, 63-64 e 100-101.
[00114] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59 está ligado a um anticorpo anti-albumina monovalente. O anticorpo antiproperdina monovalente que inclui a sequência da SEQ ID NO: 59 pode estar ligado pelo seu terminal N ou terminal C ao terminal N ou ao terminal C do anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante que inclui a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-6, 63-64 e 100-101.
[00115] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente incluindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 está ligado a um anticorpo anti-albumina monovalente. O anticorpo antiproperdina monovalente que inclui a sequência da SEQ ID NO: 60 pode estar ligado pelo seu terminal N ou terminal C ao terminal N ou ao terminal C do anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-6, 63-64 e 100-101.
[00116] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente incluindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61 está ligado a um anticorpo anti-albumina monovalente. O anticorpo monovalente antiproperdina incluindo a sequência da SEQ ID NO: 61 pode estar ligado através do seu terminal N ou terminal C ao terminal N ou ao terminal C do anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante que inclui a sequência de aminoácidos de qualquer uma das
SEQ ID NOs: 1-6, 63-64 e 100-101.
[00117] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente incluindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 está ligado no seu terminal N a um anticorpo anti-albumina monova- lente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 4.
[00118] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente incluindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 está ligado no seu terminal N a um anticorpo anti-albumina monova- lente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 5.
[00119] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente incluindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 está ligado no seu terminal N a um anticorpo anti-albumina monova- lente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 6.
[00120] Em algumas modalidades, o construto biespecífico inclui a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 45 a 55 e 62.
[00121] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal N a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 1.
[00122] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal N a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 2.
[00123] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal N a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 3.
[00124] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal N a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 4.
[00125] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal N a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 5.
[00126] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal N a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 6.
[00127] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal N a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 63.
[00128] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal N a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 64.
[00129] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal C a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 1.
[00130] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal C a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 2.
[00131] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal C a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 3.
[00132] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal C a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 4.
[00133] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal C a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 5.
[00134] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal C a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 6.
[00135] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal C a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 63.
[00136] Em algumas modalidades, um anticorpo antiproperdina mo- novalente está ligado no seu terminal C a um anticorpo anti-albumina monovalente com um ligante incluindo a sequência da SEQ ID NO: 64. Geração de anticorpos de domínio único.
[00137] Em uma modalidade, as composições e métodos utilizam um anticorpo de domínio único que é um domínio variável de cadeia pesada (Vn, por exemplo, VHH) ou um domínio de cadeia leve (V.). Desse modo, um meio de gerar anticorpos de domínio único monova- lentes, específicos para a properdina é amplificar e expressar as regi- ões VnH e V. das sequências de genes da cadeia pesada e da cadeia leve isoladas, por exemplo, a partir de um hibridoma (como por exem- plo, um hibridoma de camundongo) que expresse um anti anticorpo monoclonal antiproperdina. Os limites dos domínios Vx e V. são esta- belecidos, por exemplo, por Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). As informações com relação aos limites dos domínios Vx e V. dos genes das cadeias pesada e leve são usadas para projetar inicia- dores de PCR que amplificam o domínio V de um sequência de codifi- cação de cadeia pesada ou leve que codifica um anticorpo conhecido por se ligar a properdina Os domínios V amplificados são inseridos em um vetor de expressão adequado, como, por exemplo, pHEN 1 (Hoo- genboom, H. et al., Nucleic Acids Res., 19: 4133 7, 1991 ) e expressa- do, por exemplo, como uma fusão de Vx e V. em um scFv ou outro formato monovalente adequado, O polipeptídeo resultante pode então ser rastreado com relação à ligação monovalente de alta afinidade a properdina. O rastreio para ligação pode ser realizado através de mé- todos conhecidos na Os anticorpos de domínio individual podem ser gerados com a utilização de métodos conhecidos na técnica (WO 2005/118642; Ward, E. et al., Nature, 341: 544 6, 1989; Holt, L. et al,
Trends Biotechnol., 21: 484, 90, 2003). Cada domínio de cadeia leve pode ser tanto um dos subgrupos Kkapa ou lambda. Os métodos para o isolamento dos domínios Vx e VL foram descritos na técnica (EP 0368684).
[00138] Em uma modalidade, o anticorpo de domínio único é obtido a partir de um humano, roedor humanizado, camelídeo ou tubarão. Qualquer um desses anticorpos de domínio único pode ser opcional- mente humanizado. A humanização de anticorpos de domínio único de camelídeos requer a introdução e a mutagênese de um número limita- do de aminoácidos em uma única cadeia de polipeptídeo. Isto está em contraste com a humanização de scFv, Fab, (Fab ') 2 e IgG, que re- quer a introdução de alterações de aminoácidos em duas cadeias, a cadeia leve e a pesada e a preservação da montagem de ambas as cadeias. Em algumas modalidades, o anticorpo de domínio único inclui domínios VxH. Em algumas modalidades os domínios VHr correspon- dem aos domínios Vu de anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural dirigidos contra a properdina. Tais sequências Vu podem ser geradas, por exemplo, imunizando de forma adequada uma espécie de camelídeo com properdina (isto é, de tal forma a aumentar uma resposta imunitária e/ou de anticorpos de cadeia pesada direcionados contra a properdina), sendo obtida uma amostra biológica adequada do referido camelídeo (tal como uma amostra de sangue, amostra de soro ou amostra de células B) e gerando sequências Vu dirigidas con- tra properdina, a partir da referida amostra, com a utilização de qual- quer técnica adequada conhecida na técnica (por exemplo, o gene que codifica o anticorpo de domínio único pode ser clonado por PCR de célula única, ou célula (s) B que codificam o anticorpo de domínio úni- co pode ser imortalizadas através de transformação por EBV, ou por fusão a uma linha celular imortal).
[00139] Alternativamente, tais domínios VHxi de ocorrência natural contra a properdina, podem ser obtidos a partir de bibliotecas naturais de sequências de Vxi camelídeas, por exemplo através de varredura de uma tal biblioteca com a utilização de properdina, ou pelo menos uma parte, fragmento, determinante antigênico ou epitopo do mesmo utilizando uma ou mais técnicas de varreduras conhecidas na técnica (WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 e WO 03/035694). AlI- ternativamente, podem ser utilizadas bibliotecas sintéticas ou semis- sintéticas melhoradas derivadas de bibliotecas VnH naturais, tais como bibliotecas VnH obtidas de bibliotecas Vrn naturais através de técnicas tais como mutagênese aleatória e/ou embaralhamento de CDR (WO 00/43507). Em uma determinada modalidade, uma biblioteca de Vnr é construída e expressa em fagos depois de infecção com fagos auxilia- res. Depois de várias rodadas de “bio panning”, anticorpos de domínio único contra a properdina humana podem ser isolados e eficientemen- te expressos.
[00140] Uma biblioteca de proteínas de fusão incluindo fragmentos VHH ou VHH pode ser exibida em um fago, fagemídeo, ribossomo ou microrganismo adequado (tal como a levedura), para facilitar a varre- dura. Métodos, técnicas e organismos hospedeiros adequados para a apresentação e varredura (um conjunto, coleção ou biblioteca de) pro- teínas de fusão que incluem fragmentos VHH ou VHH são conhecidos na técnica (WO 03/054016; Hoogenboom, H., Nat. Biotechnol., 23: 1105 16, 2005).
[00141] Em uma modalidade adicional, o método para a geração de proteínas de fusão incluindo as sequências de VHH ou de fragmentos de Vnn inclui, pelo menos, as etapas de: a) produzir uma coleção ou amostra de células derivadas a partir de uma espécie de camelídeo que expressa sequências de imunoglobulina; b) varredura da coleção ou amostra de células com relação às (i) células que expressam uma sequencia de imunoglobulina que se pode ligar e/ou ter afinidade com relação à properdina; e (ii) células que expressam anticorpos de ca- deia pesada, em que as subetapas (i) e (ii) podem ser executadas es- sencialmente como uma única etapa de varredura ou em qualquer or- dem adequada como duas etapas de varredura separadas, para pro- porcionar pelo menos uma célula que expresse um anticorpo de ca- deia pesada que pode se ligas a e/ou ter afinidade pela properdina; e c) tanto (i) isolar a partir da célula a sequência Vu presente no anti- corpo de cadeia pesada; ou (ii) isolar a partir da célula uma sequência de ácido nucleico que codifique a sequência Vnr presente no anticorpo de cadeia pesada, seguido da expressão do domínio Vnr.
[00142] O método para a geração de uma sequência de aminoáci- dos dirigida contra a properdina pode incluir pelo menos as etapas de: a) proporcionar um conjunto, coleção ou biblioteca de sequencias de ácido nucleico que codifique anticorpos de cadeia pesada ou sequên- cias Vu; b) rastrear o conjunto, coleção ou biblioteca de sequências de ácido nucleico com relação à sequências de ácido nucleico que co- dificam um anticorpo de cadeia pesada ou uma proteína de fusão in- cluindo a sequência VxH que pode se ligar a e/ou ter afinidade pela properdina; e c) isolamento da sequência de ácido nucleico, seguida da expressão da sequencia VHx presente no anticorpo de cadeia pe- sada ou expressando a proteína de fusão que inclui a sequência Vrr, respectivamente.
[00143] Outros métodos e técnicas adequados para obter os anti- corpos de domínio único e/ou ácidos nucleicos que os codificam, a partir de sequências Vu de ocorrência natural ou sequências VHH po- dem, por exemplo, incluir a combinação de uma ou mais partes de uma ou mais sequências VHn de ocorrência natural (tais como uma ou mais sequências (FR) e/ou sequências CDR), uma ou mais partes de uma ou mais sequências HH de ocorrência natural (tais como uma ou mais sequencias da região estrutural ou sequencias CDR), e/ou uma ou mais ou sequências semissintéticas, de um modo adequado, de modo a proporcionar um anticorpo de domínio único antiproperdina monovalente ou uma sequência de nucleotídeos ou ácido nucleico que codifique o mesmo. As sequências de nucleotídeos que codificam se- quências estruturais de VxH ou anticorpos de domínio único são co- nhecidas na técnica e podem ser alternativamente obtidas reações em cadeia da polimerase (PCR) a partir das sequências de nucleotídeos obtidas com a utilização dos métodos descritos aqui, neste pedido de patente. Tais composições podem ser adequadamente combinadas com sequências de nucleotídeos que codificam as CDRs desejadas (por exemplo, por montagem de PCR utilizando iniciadores sobrepos- tos), para proporcionar um anticorpo de domínio único ou fragmento de anticorpo fundido com um regulador da via alternativa do comple- mento ou um fragmento do mesmo. Geração de fragmentos de anticorpo
[00144] Os fragmentos de anticorpo que reconhecem o mesmo epi- topo como um anticorpo e origem podem ser gerados através de téc- nicas conhecidas. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser preparados através de hidrólise proteolítica de um anticorpo ou por expressão em E. coli do DNA que codifica para o fragmento. Os frag- mentos de anticorpo são partes de ligação ao antígeno de um anticor- po, tais como Fab, F(ab') 2, e scFV e podem ser obtidos pela digestão com pepsina ou papaína de anticorpos inteiros através de métodos convencionais ou através de técnicas de engenharia genética.
[00145] Um fragmento de anticorpo pode ser produzido através de clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para fornecer um fra- gmento de 100 kDa denominado F(ab') 2. Esse fragmento pode ser ainda clivado om a utilização de um agente redutor de tiol e, opcional- mente, um grupo bloqueador para os grupos sulfidrila resultantes da clivagem de ligações de dissulfeto, para produzir fragmentos monova-
lentes Fab' de 50 kDa. Alternativamente, uma clivagem enzimática com a utilização de papaína produz dois fragmentos Fab monovalen- tes e um fragmento Fc diretamente (Patentes U.S. Nos: 4.036.945 e
4.331.647; Nisonoff, A. et al., Arch. Biochem. Biophys., 89: 230 44, 1960; Porter R., Biochem, J., 73: 119 26, 1959, Edelman et al., em Methods in Enzymology Vol. |, pag. 422 (Academic Press 1967), e Co- ligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, páginas 2.8.1-
2.8.10 e 2.10.-2.10.4 (John Wiley & Sons 1991).
[00146] Outros métodos de clivagem de anticorpos, tais como a se- paração de cadeias pesadas para a formação de fragmentos de ca- deias leves pesadas monovalentes, clivagem adicional de fragmentos ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas também podem ser utilizadas, desde que os fragmentos se liguem ao antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.
[00147] Outra forma de um fragmento de anticorpo é um peptídeo que codifica para uma única região determinante de complementarida- de (CDR). Os peptídeos de CDR podem ser obtidos pela construção de genes que codificam o CDR de um anticorpo de interesse. Tais ge- nes são preparados, por exemplo, usando a reação em cadeia da po- limerase para sintetizar a região variável do RNA de células de produ- ção de anticorpos (Larrick, J & Fry, K. METHODS- a companion to Me- thods in Enzymology Volume: New Techniques in Antibody Genera- tion, 2:106-110, 1991); Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Mo- noclonal Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Production, Enginee- ring and Clinical Application, Ritter et a/. (eds.), pages 166-179 (Cam- bridge University Press 1995); and Ward et a/l., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Principles And Applications, Birch et a/., (eds.), pages 137-185 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).
[00148] Outros fragmentos de anticorpo, por exemplo, fragmentos de anticorpo de domínio único, são conhecidos na técnica e podem ser utilizados nos construtos reivindicados (Muyldermans, S. et al., Trends Biochem. Sci. 26: 230 5, 2001; Yau, K. et al., J. Imnmunol, Methods, 281: 161, 75, 2003; Maass, D. et al., J. Inmunol. Methods, 324: 13, 25, 2007). O VHn pode ter uma potente capacidade de ligação ao antígeno e pode interagir com novos epitopos que são inacessíveis aos pares Vn- VL convencionais. Os camelídeos podem ser imunizados com an- tígenos conhecidos, como a properdina, e os VxHs podem ser isolados que se ligam e neutralizam o antígeno alvo.
Varredura de anticorpos monovalentes para ligação ao antígeno
[00149] Os métodos de varredura de bibliotecas podem ser utiliza- dos para a identificação de anticorpos ou de fragmentos de ligação específica de properdina monovalentes. A tecnologia de exibição em fagos exibe uma abordagem para a seleção de anticorpos que se |i- gam a um alvo desejado (por exemplo, properdina humana) entre grandes e diversos repertórios de anticorpos (Smith, G., Science, 228: 1315 7, 1985; Scott, J. & Smith, G., Science, 249: 386 90, 1990, McCatfferty, J. et al., Nature, 348: 552, 4, 1990). Essas bibliotecas de anticorpos em fagos podem ser agrupadas em duas categorias: biblio- tecas naturais que utilizam genes V rearranjados colhidos a partir de células B humanas (Marks, J. et al., J. Mol. Biol., 222: 581 97, 1991; Vaughan, T. et al., Nat. Biotechnol., 14: 309 14, 1996) ou bibliotecas sintéticas em que os segmentos do gene V da linha germinativa ou outras sequências codificadoras do polipeptídeo do anticorpo são rear- ranjados in vitro (Hoogenboom, H. & Winter, G., J. Mol Biol., 227: 381 8, 1992; Nissim, A. et al., EMBO J., 13: 692 8, 1994; Griffiths, A. et al., EMBO J., 13: 3245 60, 1994; Kruif, J. et al., J. Mol. Biol., 248: 97 105, 1995) ou em que as CDR sintéticas são incorporadas em um único gene V rearranjado (Barbas, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 4457, 61, 1992). Os métodos que envolvem pacotes de exibição gené-
tica (por exemplo, exibição de fago, exibição de polissoma) são ade- quados para a seleção de construtos de anticorpos específicos de properdina monovalentes devido a que eles expressam geralmente apenas fragmentos monovalentes, em vez de anticorpos divalentes inteiros, nas embalagens de exibição. Os métodos para a preparação de bibliotecas de exibição em fagos que apresentam vários fragmentos de anticorpos são descritos nas referências precedentes e, por exem- plo, na Pat. U. S. No. 6.696.245, que é incorporada aqui, neste pedido de patente por referência na sua totalidade.
[00150] Depois da expressão de um repertório de anticorpos de domínio único na superfície do fago, a seleção é realizada através do contato do repertório do fago com o antígeno alvo imobilizado (por exemplo, properdina), lavagem para remover o fago não ligado e pro- pagação do fago ligado, todo o processo frequentemente referido co- mo “panning”. Este processo é aplicável à varredura de anticorpos de domínio único monovalentes e fragmentos de anticorpos que podem ser expressos em uma biblioteca de exibição (por exemplo, scFv, Fab, (Fab')2 e Vu; Harrison J. et al., Meth. Enzymol., 267: 83 109, 1996). Alternativamente, os fagos são pré-selecionados com relação á ex- pressão de variantes de membros corretamente dobrados, fazendo varredura contra um ligante genérico imobilizado (como por exemplo, proteína A ou proteína L) que está somente ligado por membros do- brados (WO 99/20749). Isto tem a vantagem de reduzir a proporção de membros não funcionais, aumentando por meio disso a proporção de membros susceptíveis de se ligarem a um antígeno alvo. A varredura de bibliotecas de anticorpos em fagos está geralmente descrita, por exemplo, por.
[00151] A varredura é geralmente realizada com a utilização de an- tígeno purificado imobilizado em um suporte sólido, por exemplo, tubos ou cavidades de plástico, ou em uma matriz de cromatografia, por exemplo Sepharose'Y (Pharmacia). A varredura ou a seleção também podem ser realizadas em antígenos complexos, tais como a superfície de células (Marks, J. et al., Biotechnology (NY), 11: 1145 9, 1993; de Kruif, J. et al., Proc. Natl Acad. Sei USA, 92: 3938 42, 1995). Outra al- ternativa envolve a seleção através de ligação ao antígeno biotinilado em solução, seguido por captura em esferas revestidas com estrepta- vidina. As sequências de codificação de VxH são conhecidas na técni- ca e podem ser utilizadas para construir bibliotecas de apresentação de fagos VHH de camelídeos, que podem ser utilizadas para o isola- mento de fragmentos de anticorpo por técnicas de processamento bio- lógico conhecidas na técnica.
Expressão de anticorpos antiproperdina
[00152] A manipulação dos ácidos nucleicos pode ser realizada em vetores recombinantes. Como utilizado aqui, neste pedido de patente, "vetor" se refere a um elemento separado que é utilizado para a intro- dução de DNA heterólogo dentro de células para a expressão e/ou a replicação do mesmo. Os métodos para selecionar ou construir e, em seguida, utilizar esses vetores são conhecidos de uma pessoa versada na técnica. Numerosos vetores estão disponíveis ao público, incluindo plasmídeos bacterianos, bacteriófagos, cromossomos artificiais e veto- res epissômicos. Tais vetores podem ser usados para clonagem sim- ples e mutagênese. Um vetor é selecionado para acomodar uma se- quência de codificação de polipeptídeo de um tamanho desejado. Uma célula hospedeira adequada é transformada com o vetor depois das manipulações de clonagem in vitro. Cada vetor contém vários compo- nentes funcionais, que geralmente incluem um sítio de clonagem (ou um sítio “polilinker”) e uma origem de replicação. Um vetor de expres- são pode ainda compreender um ou mais dos seguintes: elemento in- tensificador, promotor, terminação de transcrição e sequências de si- nal- cada um posicionado na proximidade do sítio de clonagem de tal modo que estejam operativamente ligadas ao gene que codifica o poli- peptídeo.
[00153] Ambos os vetores de clonagem e expressão geralmente contêm sequências de ácido nucleico que permitem que o vetor se re- plique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Tipicamen- te, os vetores de clonagem compreendem elementos de sequência que permitem que o vector se replique independentemente do DNA cromossômico do hospedeiro e inclui origens de replicação ou se- quencias que se replicam autonomamente. Essas sequências são co- nhecidas por uma variedade de bactérias, leveduras e vírus.
[00154] Para as bibliotecas rastreadas descritas aqui, neste pedido de patente, os vetores podem ser vetores de expressão que permitem a expressão de um membro da biblioteca de polipeptídeos. A seleção realizada através de propagação e expressão separadas de um único clone que expressa o membro da biblioteca de polipeptídeos ou atra- vés da utilização de qualquer sistema de visualização de seleção. Para exibição de bacteriófagos, vetores de fagos ou fagomídeos podem ser usados. Os vetores fagomídeos possuem uma origem de replicação de E. coli (para replicação de filamento duplo) e também uma origem de replicação em fago (para a produção de DNA de filamento simples). Purificação e concentração de anticorpos monovalentes.
[00155] Os anticorpos monovalentes secretados para o espaço pe- riplasmático ou para dentro do meio de bactérias são colhidos e purifi- cados de acordo com métodos conhecidos (Skerra, A. & Pluckthun, A., Science, 240: 1038 41, 1988; e Breitling, F. et al. ( Gene, 104: 147, 53, 1991) descrevem a colheita de polipeptídeos de anticorpo a partir do periplasma; Better, M. et al., (Science, 240: 1041, 1988) descrevem a colheita a partir do sobrenadante da cultura). Para alguns polipeptí- deos de anticorpo, a purificação também pode ser conseguida com a ligação a ligantes genéricos, tais como proteína A ou Proteína L. Alter-
nativamente, os domínios variáveis podem ser expressos com um marcador de peptídeo, por exemplo, as etiquetas Myc, HA ou 6 x His, o que facilita a purificação através de cromatografia por afinidade. Se necessário, os anticorpos antiproperdina monovalentes são concen- trados através de qualquer um dos vários métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ultra filtragem, diafiltragem e filtragem de fluxo tangencial. O processo de ultra filtragem utiliza membranas semipermeáveis e pressão para separar as espécies moleculares com base no tamanho e na forma. A pressão é fornecida pela pressão do gás ou por centrifugação. Por seleção de um corte de peso molecular mais pequeno do que o do anticorpo alvo (usualmente 7 até 1/6 do peso molecular do polipeptídeo alvo), o anticorpo antiproperdina é reti- do quando o solvente e solutos menores passam através da membra- na. Composições farmacêuticas, dosagem e administração.
[00156] Os anticorpos descritos aqui, neste pedido de patente, po- dem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração a um sujeito. Tipicamente, a composição farmacêutica inclui um anticorpo antiproperdina monovalente, um derivado de anti- corpo ou um seu fragmento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Como utilizado aqui, neste pedido de patente, "veículo farmaceutica- mente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de disper- são, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção, e semelhantes que sejam fisiologicamente compatíveis. A expressão “veiculo farmaceuticamente aceitável” exclui o meio de cultura de tecidos incluindo soro bovino ou de cavalo. Os exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais de água, solução salina, solução salina tampona- da com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e os semelhantes, bem como combinações dos mesmos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poli álcoois tais como ma- nitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. As substâncias far- maceuticamente aceitáveis incluem quantidades menores de substân- cias auxiliares, tais como agentes de umidificação ou agentes emulsi- onantes, preservativos ou tampões, que aumentam a duração em ar- mazenamento ou a eficácia do anticorpo.
[00157] As composições como descritas aqui, neste pedido de pa- tente, podem estar em uma variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semissólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomos e supositórios. A forma final depende do modo pretendido de adminis- tração e aplicação terapêutica. As composições típicas estão na forma de soluções injetáveis ou infusíveis, tais como composições semelhan- tes às utilizadas para imunização passiva de humanos com outros an- ticorpos. As composições podem ser distribuídas, por exemplo, por injeção parentérica (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperito- neal, intramuscular).
[00158] As composições terapêuticas tipicamente devem ser esté- reis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, micro emulsão, dispersão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para uma concentração elevada de fármaco. As soluções injetáveis estéreis po- dem ser preparadas através da incorporação do antagonista antipro- perdina monovalente na quantidade requerida em um solvente apro- priado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados aci- ma, como requerido, seguido de esterilização por filtragem. Em geral, as dispersões são preparadas incorporando o antagonista antiproper- dina monovalente em um veículo estéril que contém um meio de dis- persão básico e os outros ingredientes requeridos dos enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetá- veis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem sob vácuo e liofiização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previ- amente esterilizada por filtração. A fluidez adequada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de surfatantes.
[00159] Os anticorpos descritos aqui, neste pedido de patente po- dem ser administrados através de uma variedade de métodos conhe- cidos na técnica, embora para muitas aplicações terapêuticas, o mo- do/via de aplicação de preferência seja a injeção intravenosa ou infu- são. O polipeptídeo também pode ser administrado através de injeção intramuscular ou subcutânea.
[00160] Como será apreciada pela pessoa versada na técnica, a via e/ou o modo de administração irá variar dependendo dos resultados desejados. Em determinadas modalidades, o anticorpo pode ser pre- parado com um veículo que irá proteger o anticorpo contra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de suprimento micro encapsulados. Os anticorpos monovalentes de domínio único são adequados para formulação como preparações de liberação controla- da devido, em parte, ao seu pequeno tamanho - o número de moles por dose pode ser significativamente mais alto do que a dosagem de, por exemplo, anticorpos de tamanho total. Os polímeros biocompatí- veis e biodegradáveis podem ser usados, tais como acetato de vinil etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliorto ésteres e ácido poli lático. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser obtida pela inclusão na composição de um agente que retar- de a absorção, por exemplo, sais de mono estearato e gelatina. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são conhecidos dos versados na técnica (por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978). Os métodos que podem ser aplicados à liberação contro- lada ou prolongada de anticorpos, tais como os anticorpos monovalen- tes de domínio único, descritos aqui neste pedido de patente, são co- nhecidos (Patentes U.S. Nos. 6.306.406 e 6.346.274; Pedidos de Pa- tente U.S. Nos: US 20020182254 e U.S. 20020051808, todos os ensi- namentos de cada um dos quais são incorporados aqui, neste pedido de patente por referência).
[00161] Em determinadas modalidades, um anticorpo antiproperdi- na monovalente, derivado de anticorpo ou um fragmento do mesmo pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou um veículo comestível assimilável. Para administrar uma composi- ção descrita aqui, neste pedido de patente por um modo diferente da administração parenteral, pode ser necessário o revestimento do com- posto com, ou coadministrar o composto com um material para preve- nir a sua inativação.
[00162] “Compostos ativos adicionais também podem ser incorpora- dos nas composições. Em determinadas modalidades, um anticorpo monovalente antiproperdina, um derivado de anticorpo ou um fragmen- to do mesmo é formulado com e/ou é coadministrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Por exemplo, um anticorpo monova- lente antiproperdina, um derivado de anticorpo ou fragmento deste po- de ser formulado e/ou coadministrado com um ou mais anticorpos adi- cionais que se ligam a outros alvos (por exemplo, anticorpos que se ligam a reguladores da via alternativa do complemento). Tais terapias de combinação podem utilizar dosagens mais baixas dos agentes te- rapêuticos administrados, evitando assim possíveis toxicidades ou complicações associadas às várias mono terapias. Além disso, as composições descritas aqui, neste pedido de patente, podem ser co- formuladas ou coadministradas com outros agentes terapêuticos para melhorar os efeitos colaterais da administração das composições des- critas aqui, neste pedido de patente (por exemplo, agentes terapêuti- cos que minimizam o risco de infecção em um ambiente imunocom- prometido, por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos e agentes antivirais).
[00163] As composições farmacêuticas podem incluir uma “quanti- dade terapeuticamente eficaz" ou uma “quantidade profilaticamente eficaz” de um antagonista antiproperdina monovalente (por exemplo, um anticorpo ou derivado ou seu fragmento). Uma “quantidade tera- peuticamente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado tera- pêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticor- po pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do antagonista anti- properdina monovalente para induzir uma resposta desejada no indiví- duo. Uma “quantidade profilaticamente eficaz” se refere a uma quanti- dade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Em algumas modalidades, uma dose profilática é utilizada em sujeitos antes ou em um estágio anterior da doença, em que a quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[00164] Os regimes de dosagem podem ser ajustados para propor- cionar a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêu- tica ou profilática). Por exemplo, um único bolus pode ser administra- do, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É vantajoso formu- lar composições parenterais na forma de unidade de dosagem para a facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem, tal como utilizada aqui neste pedido de patente, se refere a unidades fisicamente separadas adequadas como dosa- gens unitárias para os sujeitos mamíferos a serem tratados; cada uni- dade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. Deve ser observado que os va- lores de dosagem podem variar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada. Também é entendido que, para qualquer sujeito específi- CO, Os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento pro- fissional do médico que o administra.
[00165] Uma faixa não limitativa com relação á uma quantidade te- rapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpo antiproper- dina monovalente, derivado de anticorpo ou de um fragmento do mesmo é de 0,1 20 mg/kg, de mais preferência de 1 - 10 mg/kg. Deve ser observado que os valores de dosagem podem variar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada. É entendido ainda que, para qualquer paciente específico, os regimes de dosagem específicos de- vem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional do médico que o administra.
[00166] A eficácia do tratamento com um anticorpo monovalente antiproperdina, derivado de anticorpo ou um fragmento do mesmo co- mo descrito aqui neste pedido de patente, é avaliado pelo médico es- pecialista com base na melhoria em um ou mais sintomas ou indicado- res do estado de doença ou de distúrbio a ser tratado. Uma melhoria de pelo menos 10% (aumento ou diminuição, dependendo do indica- dor medido) em um ou mais indicadores clínicos é considerada “trata- mento efetivo”, embora maiores melhorias sejam preferidas, tais como 20%, 30%, 40%, 50 %, 75%, 90% ou mesmo 100%, ou, dependendo do indicador que está sendo medido, mais de 100% (por exemplo, du- plo, triplo, dez vezes, etc., até e incluindo a obtenção de um estado livre de doença).
Uso se anticorpos monovalentes antiproperdina.
[00167] As composições descritas aqui, neste pedido de patente, podem ser utilizadas em métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por disfunção alternativa da via do complemento em um paciente que esteja necessitando do mesmo tratamento, o método incluindo a administração ao paciente de uma quantidade terapeuti- camente eficaz de uma composição que inclua um anticorpo monova- lente antiproperdina, um derivado de anticorpo ou um fragmento do mesmo, de preferência uma composição incluindo um único domínio variável de imunoglobulina humana que se liga a properdina humana. Em uma modalidade, os anticorpos antiproperdina monovalentes, deri- vados de anticorpo ou os fragmentos do mesmo, descritos aqui neste pedido de patente são úteis para o tratamento de doenças mediadas pela desregulação da via alternativa do complemento que inibe a ati- vação alternativa da via do complemento em um mamífero (como por exemplo um ser humano). Tais doenças incluem, sem limitação, lupus eritematoso sistêmico e nefrite lúpica, artrite reumatoide, síndrome do anticorpo antifosfolipidico (aPL), glomerulonefrite, síndrome de hemo- globinia paroxistica noturna (HPN), inflamação, transplante de órgãos, lesão renal e intestinal de I/R, asma (por exemplo asma grave), sín- drome hemolítica-urêmica atípica (SHUa), perda fetal espontânea, DDD, degeneração macular, PTT, nefropatia por IgA (doença de Ber- ger), glomerulopatia C3 (C3G), doença de Gaucher, hidradentite supu- rativa, doença de Behçet, dermatomiosite queimadura, sepse precoce, meningite pneumocócica, doença de Alzheimer, metástase de câncer, síndrome do desconforto respiratório agudo (SARA), lesão pulmonar aguda (IAC), lesão pulmonar relacionada à transfusão (TRALI), trom-
bose induzida por hemodiálise, epidermólise bolhosa adquirida (EBA), uveite , Doença de Parkinson, atresia biliar primária, vasculite por anti- corpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), degeneração da retina, microangiopatia trombótica larga (TMA), TMA ampla (APS), terapia com células-tronco hematopoiéticas(TCTH) TMA, degeneração macu- lar relacionada à idade (AMD), pré-eclâmpsia, hemólise, enzimas he- páticas elevadas e síndrome plaquetária baixa (HELLP), esclerose múltipla, síndrome antifosfolipídica (APS), policondrite recidivante, le- são isquêmica, acidente vascular cerebral, doença do enxerto versus hospedeiro (GvHD), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), enfi- sema, aterosclerose, síndrome coronariana aguda, choque hemorrági- co, diálise (risco cardiovascular), doença cardiovascular, malária pla- centária, perda de gravidez APS, glomerulonefrite membrano prolifera- tiva (MP), nefritite membranosa, encefalite, lesão cerebral, encefalite por anticorpos do receptor NMDA, crise hemolítica da malária, aneu- risma da aorta abdominal (AAA) e aneurisma da aorta torácica abdo- minal(TAA).
[00168] Os exemplos que se seguem são mostrados de tal forma como provendo aquelas pessoas versados na técnica com uma divul- gação e descrição de como os métodos e compostos reivindicados aqui, neste pedido de patente são formados e feitos. Eles estão desti- nados a ser puramente a título de exemplo e não estão destinados a limitar o escopo da descrição. Exemplo1- Geração do vetor de clonagem Vun-His em Fusão
[00169] O vetor pBNJ391 foi digerido com as enzimas de restrição BstEll e EcoRI| para a remoção da dobradiça e Fc. O vetor foi purifica- do em gel, o que produziu um produto de libertação de 1000 pb. Os oligos UDEC6629/ 6630 recozidos foram clonados no vetor pBNJ391 com BstEll/EcoRlI. Os oligos recozidos continham as seguintes se-
quências: UDEC 6629 iniciador para frente i: GTCACCGTGTCGAGCCATCAT- CACCATCATCACTGATGAG (SEQ ID NO: 65) Iniciador reverso UDEC 6630: AATTCTCATCATTTGTCATCAT- CATCCTTATAGTCGCTCGACACG (SEQ ID NO: 66) O vetor final continha um local BstEll-6 x His-EcoRI.
[00170] Em seguida, o vetor phGH0320 foi digerido com Xhol/ BstEll (produzindo um produto de liberação de 13 pb) e purificado em coluna. Em seguida, foi utilizado um modelo de clone de fago VHH pa- ra amplificar por PCR uma inserção. O iniciador direto UDEC 6438 (GTCCACTCCCTCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGG; SEQ ID NO: 67) e o iniciador reverso UDEC 6442 (GCTCGACACGGTGAC- CTGGGTCCCCTGGCCCCA; SEQ ID NO: 68) foram utilizados. Os produtos de PCR foram purificados e em seguida utilizados em um protocolo In-Fusion para clonagem.
[00171] O vetor pBNJ391 foi digerido com BstEll / EcoRI (50 ng/1). Ambos os oligonucleotídeos complementares foram ressuspensos na mesma concentração molar, com a utilização de Tampão TE. Volumes iguais de ambos os oligonucleotídeos complementares (em concentra- ção equimolar) foram misturados em um tubo de 1,5 ml. O tubo foi co- locado em um bloco de calor padrão a 90 - 95ºC por 35 minutos. O tubo foi removido do aparelho e deixado se resfriar até à temperatura ambiente (ou pelo menos abaixo dos 30ºC). O tubo foi armazenado em gelo ou a 4ºC até o uso posterior.
[00172] Uma mistura de 1 ul de DNA inserido (do nucleotídeo acima utilizado para ligação a pBNJ391), 2 ul de pBNJ391 (EcoRI / BstEI|, 100 ng), 1 ul de 10 x tampão de ligase (NEB B0202S Lote: 1091410), 1 ul de A DNA-ligase de T4 (NEB MO0202L Lote: 0671502) e 5 ul de água formaram a reação de ligação. A reação de ligação foi incubada por 30 minutos em temperatura ambiente. 1 ul da reação de ligação foi transformado em 30 ul de células competentes químicas DH10 (InVi- trogen 18297 Lote % 1552241) e foram adicionados 750 de SOC (NEBB9020S Lote tt 2971403). O tubo foi agitado por 1 hora a 37ºC e ul e 100 ul foram colocados em uma placa LB carb/glicose. As pla- cas foram incubadas por o final de semana em temperatura ambiente.
[00173] Colônias foram escolhidas para PCR para inserção do 6 x His em pnGHO0320. Oito colônias foram rastreadas e o pBNJ391 foi usado como controle negativo. 300 ul de cultura de TB / Carb/Glicose foram adicionados a colônias isoladas e cultivadas a 37ºC. Foram utili- zados o iniciador direto UDEC5276 (CATAATAGCTGACAGACTAA- CAGACTG; SEQ ID NO: 69) e o iniciador reverso UDEC1977 (CGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGT; SEQ ID NO: 70). Para uma reação de PCR de 20 ul, DNA de uma colônia única foi adiciona- do a 10 ul de mistura de PCR Go Taq Green, 0,2 ul de Iniciador direto (100), 0,2 ul de Iniciador Inverso (100) e 9,6 ul de H2O, totalizando 20 ul. As condições de PCR são como se segue: 95ºC por 3 minutos, 95ºC por 20 segundos, 50ºC por 20 segundos e 72ºC por 1 minuto e segundos. O ciclo foi repetido 30 vezes, seguido de incubação a 72ºC por 5 minutos e 4ºC até uso posterior. 5 ul do produto de PCR foram misturados com 15 ul de água e executados em um E-gel a 2%. Dois clones correspondiam ao tamanho previsto. A preparação do plasmídeo maxi foi realizada com a utilização de culturas de um dia para o outro com o kit de preparação Promega maxi.
[00174] Para clonar os anticorpos VHH antiproperdina no formato VHm His usando a ligação de VHH em fusão em pnNGH0320, foi utiliza- da a PCR para gerar a inserção Vu com UDEC 6438- Infusion For- ward Primer e UDEC 6442- Infusion Primer reverso para amplificação de fagemídeos Vx do Llama da biblioteca anti- properdina pLNJ com um sítio Xhol para clonagem em pnNGHO0317 por infusão. Para uma reação de PCR de 60 ul, 30 ul de mistura de PCR de 2 x fusão (NEB
MO531s Lote: 0211412), 1 ul de cultura bacteriana, 0,1 ul de iniciador direto UDEC 6438 (100 UM), 0,1 ul de iniciador reverso UDEC 6442 (100 uM) e 28,8 ul de H2O, totalizando 20 ul. As condições de PCR são as seguintes: 98ºC por 3 minutos, 98ºC por 10 segundos, 52ºC por segundos, 72ºC por 30 - 60 segundos, seguidos por 72ºC por 5 mi- nutos. O ciclo foi repetido 30 vezes e mantido a 4C até uso posterior. 5 ul do produto de PCR foram misturados com 15 ul de água e foram corridos em um gel E a 2%. Todos os clones corresponderam ao ta- manho previsto. Os clones foram reunidos em reações de oito e purifi- cados por coluna usando o Promega WizardO SV Gel e sistema de limpeza de PCR, de acordo com as instruções do fabricante. A prepa- ração do plasmídeo maxi foi realizada com a utilização de culturas de um dia para o outro com o kit preparativo Promega maxi.
[00175] Para ligação do inserto, 2 ul de pré-mistura enzimática 5x In-Fusion HD (Clontech 639650 Lote: 1501713A), 2,5 ul de Vetor PNGHO0320 (Xhol / BstEll) 39,1 noa/ul (100 ng), 1 ul de fragmento de PCR purificado (10-200 ng) e 4,5 ul de água formaram a reação de ligação. A reação de ligação foi incubada por 15 minutos a 50ºC.
[00176] Para transformação, as células competentes StellarTv (Clontech) foram descongeladas em um banho de gelo imediatamente antes da utilização. Depois do descongelamento, as células foram mis- turadas suavemente para assegurar distribuição uniforme, e então 50 ul de células competentes foram movidos para um tubo de fundo re- dondo de 14 ml (tubo falcon). Foi adicionado 1 ul (menos de 5 ng de DNA) às células. O tubo foi colocado no gelo por 30 min. Em seguida, as células foram submetidas a choque térmico por exatamente 45 se- gundos a 42ºC. Os tubos foram em seguida colocados no gelo por 1-2 min. O meio SOC foi adicionado para levar o volume final a 500 ul (o meio SOC foi aquecido para 37ºC antes de ser utilizado). O tubo foi incubado com agitação (160 - 225 rpm) por 1 hora a 37ºC. 10 ul da solução foram em seguida colocados em uma placa LB que continha carbenicilina. A placa foi incubada de um dia para o outro a 37C.
[00177] Uma telade PCR de colônia foi realizada para inserção das 24 colônias de VHn para cada conjunto. Um total de 48 clones foram escolhidos para cada conjunto. O vetor phnNGHO0320.1 foi usado como controle positivo. O iniciador direto UDEC5276 e o iniciador reverso UDEC1977 foram usados. Para uma reação de PCR de 20 ul, o DNA de uma única colônia foi adicionado a 10 ul da mistura de PCR Go Taq Green, 0,2 ul de iniciador direto (100 UM), 0,2 ul de iniciador reverso (100 UM) e 9,6 ul de H2O, totalizando 20 ul. As condições de PCR são as seguintes: 95ºC por 3 minutos, 95ºC por 20 segundos, 50ºC por 20 segundos e 72ºC por 1 minuto e 15 segundos. Repetida por 30 ciclos, seguidos por 72ºC por 5 minutos e mantida a 4ºC até uso posterior. 5 ul dos produtos de PCR foram misturados com 15 ul de água e foram executados em um E-gel a 2%. A análise da sequência foi realizada em todos os 48 clones.
[00178] A varredura preliminar de uma biblioteca de exibição de fa- go Va de llama com influência na imunização resultou na identificação de 192 Vrxs que foram positivas para ELISA com relação à ligação de properdina. 57 VHHs foram clonados e expressos com um marcador 6 x histidina. Entre estes, 34 Vuns foram positivos para Octet para ligação de properdina. Um resumo é mostrado abaixo na Tabela 1. Tabela 1. Sumário da análise de varredura Varredura em H-fP Varredura reativa cruzada | Varredura reativa cruzada em fP de camundongo e | em fP de macaco e humano humano Procedimento NGS Procedimento NGS Procedimento NGS posa O ie O e O FREE, a gg Sequências únicas (> 3 diferente a.a. 72 NA 134 NA EM NA Clonado e expresso (com marcador | 57 NA NA NA NA NA [anemia O Positivo para hemólise (pela utiliza- | 4 NA NA NA NA NA
[00179] Quatro VHS funcionais foram encontrados para inibir de forma efetiva a hemólise alternativa do complemento mediada pela via e estão mostrados na Tabela 2. Tabela 2. Sequências Vn antiproperdina BE Ae ABOO05 QVQOVWESGGGLROTGGSLRLSCTASGRIFEVNMMAWYRQAPGKQRELVAEISRVG- TTVYADSVKGRFTISRDSAKNTVTLQMNSLKSEDTAVYYCNALQYDRYGGAEYWGQGTQVTVSS (SEQ 1D NO: 58) ABOO06 QVQLAESGGGLVOAGDSLKLSCTASGRIFEVNMMAWYRQAPGKDRELVAEISRVG- TTTYADSVKGRFTISRDSAKNTVTLOMNSLKSEDTAVYYCNALQOYSRYGGAEYWGQGTQOVTVSG (SEQ ID NO: 59) ABOO07 QVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVG- TTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLOMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQOVTVSG (SEQ 1D NO: 60) ABOO08 QVALVESGGGLRQTGESLRLSCTASGRIFEVNMMAWYRQAPGKQRELVAEISRVG- TTTYADSVKGRFTISRDSAKNTVTLOQMNSLKSEDTAVYYCNALQOYDRYGGAEYWGQOGTQOVTVSG (SEQ 1D NO: 61) Exemplo 2 — Ligação de anticorpos VnHn antiproperdina à properdina humana
[00180] AFIG.1 mostra que as medições de ligação cinética podem ser realizadas em um instrumento Octet (FortéBio Inc.). Todas as la- vagens, diluições e medições são executadas em tampão cinético (FortéBio cat 185032) com a placa sendo agitada a 1000 rpm. Os bi- ossensores de estreptavidina (Forte Bio Cat: lote 18-5019: 1405301) foram equilibrados em tampão cinético por 10 min e depois carregados com 50 nm de properdina humana biotinilada. Para a fase de associa- ção, foram adicionados 10 ug/ml de anticorpo antiproperdina ou tam- pão cinético selecionado aos biossensores pré-carregados com pro- perdina humana biotinilada, respectivamente. Os resultados mostram a ligação de ABOOS5, ABOO6, ABOO7 e ABOO8 à properdina humana.
[00181] AFIG.2 mostra que as medições de ligação cinética podem ser realizadas em um instrumento Octet (FortéBio Inc). Todas as lava- gens, diluições e medições são executadas em tampão Cinético (For- téBio cat 185032) com a placa sendo agitada à 1000 rpm. Os biossen- sores de estreptavidina (Forte Bio Cat: 18-5019 lote: 1405301) foram equilibrados em tampão cinético por 10 min e em seguida carregados com 50 nm de properdina de camundongo biotinilada. Para a fase de associação, foram adicionados 10 pg/ml de anticorpo antiproperdina ou tampão cinético selecionado aos biossensores pré-carregados com properdina humana biotinilada, respectivamente. Os resultados mos- tram fraca ou nenhuma ligação de ABOOS5, ABOO6, ABOO7 e ABOO8.
[00182] AFIG.3 mostra que as medições de ligação cinética podem ser realizadas num instrumento Octet (FortéBio Inc.). Todas as lava- gens, diluições e medições são realizadas em tampão Cinético (Forté- Bio cat 185032) com a placa sendo agitada á 1000 rpm. Os biossenso- res de estreptavidina (Forte Bio Cat: lote 18-5019: 1405301) foram equilibrados em tampão Cinético por 10 min e em seguida carregados com 50 nm de properdina de macaco cynomolgus biotinilada. Para a fase de associação, foram adicionados 10 pg/ml de anticorpo antipro- perdina selecionado ou tampão Cinético em branco aos biossensores pré-carregados com properdina humana biotinilada, respectivamente. Os resultados mostram fraca ligação de ABOOS5, ABOO6, ABOO7 e ABOO8 à properdina de macaco cynomolgus. Exemplo 3. Ensaio de hemólise do complemento alternativo
[00183] A FIG.4 mostra um ensaio de hemólise mediada pela via alternativa do complemento com base na formação de um complexo terminal complementar na superfície do glóbulo vermelho do coelho (rRBC). Como resultado da formação deste complexo, os rRBCs são lisados. São esperados que agentes que inibem a formação de com- plexos do complemento inibam a lise celular. Vários fragmentos de |li- gação ao antígeno antiproperdina foram testados para avaliar o efeito na lise celular mediada pela ativação alternativa do complemento. Uma “placa de ensaio” foi preparada pela diluição de 40% de soro normal humano com tampão veronal de gelatina (GVB) suplementado com 10 mM de EGTA e 10 mM de MgCl2 (por exemplo, 1600 ul de so-
ro humano normal em 2400 uIGVB suplementado com 10 mM de EG- TA e 10 mM de MgCl2). 50 ul dessa solução foram distribuídos em ca- da cavidade da placa de ensaio (poliestireno). Em seguida, foi prepa- rada a placa de diluição (polipropileno) adicionando 50 ul/ cavidade de 2 x mAbs (por exemplo, antiproperdina Fab) em GVB suplementado com 10 mM de EGTA e 10 mM de MgCl2 em uma concentração vari- ando de O - 100 nM para cavidades apropriadas. Como controle positi- vo, os glóbulos vermelhos de coelho foram incubados em água desti- lada (100% de lise de células) e para o controle negativo os glóbulos vermelhos foram incubados em GVB com 10 mM EDTA e 10 mM MgCl2, respectivamente (0% de lise de células).
[00184] 50 ul/ cavidade foram transferidos a partir da placa de dilui- ção o para a placa de ensaio. A placa de ensaio foi deixada em tempe- ratura ambiente enquanto prosseguia para a próxima etapa. 400 ul de RBC foram lavados 4 vezes, cada um com 1 ml de GVB suplementado com 10 mM de EGTA e 10 mM de MgCl2. Os rRBCs foram centrifuga- dos a 2600 rpm por 1 minuto depois de cada lavagem. Depois da la- vagem final, os rRBCs foram ressuspensos para um volume de 400 ul através da adição de 300 ul de GVB suplementado com 10 mM de EGTA e 10 mM de MgCl2. 50 ul de rBCbs lavados foram ressuspensos para 1 ml! com GVB suplementado com 10 mM de EGTA e 10 mM de MgCl2. Foram adicionados 30 ul dessa solução diluída para 100 ul da amostra preparada na placa de ensaio, originando 1,5 x 10º célu- las/cavidade. A placa foi incubada por 30 minutos a 37ºC. A placa foi em seguida centrifugada a 1000 x g por 5 min e 85 ul do sobrenadante foram transferidos para uma placa de 96 cavidades de fundo plano. À hemólise foi determinada medindo a DO a 415 nm. Uma diminuição progressiva na dispersão da luz (devido à lise das células intactas) foi medida a 415 nm em função da concentração. Para o cálculo, a inibi- ção total foi calculada em cada concentração da antiproperdina Vxr e os resultados foram expressos como uma percentagem de controles não relacionados. Exemplo 4. Cinética de ligação de anticorpos antiproperdina VHH mo- novalentes à properdina
[00185] Na Fig. 6, os anticorpos antiproperdina VHH ABOO7 e ABOO8, respectivamente, foram executados em concentrações conhe- cidas sobre uma superfície de sensor imobilizada. O nível de resposta (RU) foi plotado em função do tempo nos sensores.
[00186] As afinidades de ligação dos anticorpos VHx antiproperdina foram determinadas. Os resultados estão resumidos na Tabela 3 abai- xo. Tabela 3. Cinética de ligações. (1NMs) (1s) (M) (1/Ms) (1s) (M) humana humana Exemplo 5. Cinética de ligação de anticorpos biespecíficos antipro- perdina ao ensaio de hemólise de properdina e complemento alternati- vo.
[00187] Constructos biespecíficos foram criados com base nos construtos de antiproperdina descritas acima ligadas a um ligante para um construto anti-albumina. A ligação à properdina e hemólise do complemento alternativo foi medida em ensaios semelhantes como descrito acima. As sequências dos construtos são mostradas na Tabe- la 4 abaixo.
Tabela 4. Sequências de construtos antiproperdina. [Es sei seem TPP-2225 Ligante antialbumina EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKERE- LVPOS8 (G4S); FVSAINWOKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAA- VFRVVAPKTOYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGEGESGGGGSLEVOLVES- GGGLVOAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQORELVAEISRVG- TTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQOYEKHGGA- DYWGQGTOVTVSS (SEQ ID NO: 45) TPP-2951 Ligante antialbulmina EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKERE- humanizado LVPOS8 FVSAINWOKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAA- (GAS); (7-retromutações) VFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGESGEGESCGEGESEVALLES- GGGLVOPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFRQOAPGKERELVSEISRVG- TTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGA- DYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 46) TPP-3071 Ligante anti albumina EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKERE- LVPOS8S FVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAA- (G4D)> (G4) VFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGEDGEGEDGEGGGEVALVES- GGGLVOAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVG- TTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGA- DYWGQGTOVTVSS (SEQ ID NO: 47) TPP-3072 Ligante anti- albumina EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKERE- LVPOSS FVSAINWOKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAA- (G4E)2 (G4) VFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGEGGGGEGGGGEVALVES- GGGLVOAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQORELVAEISRVG- TTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGA- DYWGQGTAQVTVSS (SEQ ID NO: 48) TPP-3261 Ligante antialbumina EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKERE- Humanizado LVPOS8 FVSAINWOKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAA- (GAS); (3-retromutações) VFRVVAPKTOYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVALVES- GGGLVAPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWVRQAPGKQRELVSEISRVG- TTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNALQYEKHGGA- DYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 49) TPP-3341 Ligante antialbumina EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKERE- Humanizado LVPOS8 FVSAINWOKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAA- (G4D)2 (G4) (7-retro VFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGDGGGGPGGGGEVALLES- mutações) GGGLVAPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFRQAPGKERELVSEISRVG- TTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGA- DYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 50) TPP-3342 Ligante antialbuimina EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKERE- humanizado LVPOS8 FVSAINWOKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAA- (G4E)2 (G4) VFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGEGGGGEGGGGEVALLES- (7-retro mutações) GGGLVAPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFRQAPGKERELVSEISRVG- TTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGA- DYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 51) TPP-3343 Ligante antialbulmina EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKERE- humanizado LVPOSS FVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAA- (G4D)2 (G4) VFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGDGGGGDGGGGEVALVES- (3-retro mutações) GGGLVAPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWVRQAPGKQRELVSEISRVG- TTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNALQYEKHGGA- DYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 52)
TPP-3344 Ligante antialbulmina EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKERE- humanizado -LVPOSS FVSAINWOKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAA- (G4E); (G4) VFRVVAPKTOYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGEGGGGEGGGGEVAOLVES- (3-retro mutações) GEGGLVAPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWVROAPGKQRELVSEISRVG- TTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNALQOYEKHGGA- DYWGOQOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 62) TP-2221 LVPOS8 hG2-G4 - Va em LEVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQORELVAEISRVG- Fc humano silente TTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLOMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGA- DYWGQOGTAOVTVSSRKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSQEDPEVOFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS- TYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL- PPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS- FFLYSRLTVDKSRWQOEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 53) TP-2222 LVPOS8 hG1 noCcig- LEVQLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKORELVAEISRVG- Vi em Fc humano sem TTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGA- ligação C1q DYWGQGTAQVTVSSPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS- REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS- KLTVDKSRWQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 54) TPP-2224 LVPOS8 (G4S); -anti-Alb - LEVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKORELVAEISRVG- Vnn tandem TTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGA- DYWGQGTAVTVSSGGGESCEGESCEGEESEVALVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS- GRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNS- LYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 55) TPP-2223 Anticorpo de controle Sequência da cadeia leve: DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISFFLNWYQQK- antiproperdina sem domí- PGKAPKLLIYYTSRYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQHGNTLPW- nio de ligação C1q TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVD- NALOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT- KSFNRGEC (SEQ ID NO: 56) Sequência da cadeia pesada: QVOLVAOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTNYPIHWVRQAPGQGLEWMGFID- PGGGYDEPDERFRDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR- RGGGYYLDYWGQOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN- VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS- REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS- KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 57)
[00188] A FIG.7 mostra medições de ligação cinética realizadas num instrumento Octet (FortéBio Inc.). Todas as lavagens, diluições e medições foram realizadas em tampão Cinético (FortéBio cat 185032) com a placa sendo agitada à 1000 rpm. Os biossensores de estrepta- vidina (Forte Bio Cat: lote 18-5019: 1405301) foram equilibrados em tampão Cinético por 10 min e depois carregados com 50 nm de pro- perdina humana biotinilada. Para a fase de associação, foram adicio-
nados 10 pg/ml de anticorpo antiproperdina selecionado ou tampão Cinético em branco aos biossensores pré-carregados com properdina humana biotinilada, respectivamente. Os resultados mostram a ligação de TPP-2225, TPP-2591, TPP-3071, TPP-3072, TPP-3261 à properdi- na humana. Os resultados mostram forte ligação de todas os constru- tos à properdina humana.
[00189] As FIG. 8A- FIG. 8B mostram resultados de ensaios de hemólise mediada por via alternativa do complemento baseados na formação de um complexo terminal complementar na superfície do glóbulo vermelho do coelho (rRBC). Como resultado da formação des- se complexo, os rRBCs são lisados. É esperado que agentes que ini- bem a formação de complexos do complemento inibam a lise celular. Vários construtos de ligação ao antígeno biespecífico antiproperdina foram testadas para avaliar o efeito na lise celular mediada por ativa- ção alternativa do complemento. Uma “placa de ensaio” foi preparada pela diluição de 40% de soro normal humano com tampão veronal de gelatina (GVB) suplementado com 10 mM de EGTA e 10 mM de MgCl2 (por exemplo, 1600 ul de soro humano normal em 2400 ulGVB suple- mentado com 10 mM de EGTA e 10 mM de MgCl2). 50 ul dessa solu- ção foram distribuídos em cada cavidade da placa de ensaio (poliesti- reno). Em seguida, foi preparada a placa de diluição (polipropileno) adicionando 50 ul/cavidade de 2 x mAbs (por exemplo, antiproperdina Fab) em GVB suplementado com 10 mM de EGTA e 10 mM de MgCl2 em uma concentração variando de O a 100 nM à cavidades apropria- das. Como controle positivo, os glóbulos vermelhos de coelho foram incubados em água destilada (100% de lise de células) e para o con- trole negativo os glóbulos vermelhos foram incubados em GVB com 10 mM EDTA e 10 mM MgCl2, respectivamente (0% de lise de células).
[00190] —50ul/ cavidade foram transferidos da placa de diluição para a placa de ensaio. A placa de ensaio foi deixada em temperatura am-
7UT3 biente enquanto prosseguia para a próxima etapa. 400 ul de RBC fo- ram lavados 4 vezes, cada um com 1 ml de GVB suplementado com MM de EGTA e 10 mM de MgCl2. Os rRBCs foram centrifugados a 2600 rpm por 1 minuto depois de cada lavagem. Depois da lavagem final, os rRBCs foram ressuspensos para um volume de 400 ul através da adição de 300 ul de GVB suplementado com 10 mM de EGTA e 10 mM de MgCl2. 50 ul de rBCbs lavados foram ressuspensos para 1 ml com GVB suplementado com 10 mM de EGTA e 10 mM de MgCl2. Fo- ram adicionados 30 ul dessa solução diluída a 100 da amostra prepa- rada na placa de ensaio, originando 1,5 x 10º células/ cavidade. A pla- ca foi incubada por 30 minutos a 37ºC. A placa foi em seguida centri- fugada a 1000 x g por 5 min e 85 ul do sobrenadante foram transferi- dos para uma placa de 96 cavidades de fundo plano. A hemólise foi determinada medindo a DO a 415 nm. Uma diminuição progressiva na dispersão da luz (devido à lise das células intactas) foi medida a 415 nm em função da concentração. Para o cálculo, a inibição total foi cal- culada em cada concentração do construto de anticorpo antiproperdina e os resultados foram expressos como uma percentagem de controles não relacionados. As FIGs. 8A - FIG. 8B mostram hemólise mediada por TPP-2221, TP-2222, TP-2223, TP-2224 e TP-2225 em soro huma- no (FIG. 8A) e macaco cynomolgus (FIG. 8B). O anticorpo de controle é um anticorpo antiproperdina. As FIGs. 9A - FIG. 9B mostram hemóli- se mediada por TPP-2225, TPP-2951, TPP-3261, TPP-3071 e TPP- 3072 em soro humano (FIG. 9A) e macaco cynomolgus (FIG. 9B).
[00191] As FIGs.10A-FIG.10B, FIG. 11A - FIG. 11B e FIG. 12A - FIG. 12B mostram a cinética de ligação de TPP-3261, TPP-2951 e TPP-2225 à properdina humana e de macaco cynomolgus.
[00192] As afinidades de ligação e os valores de IC50 são mostra- dos com relação á cada construto nas Tabelas 5 a 9 que se seguem
Tabela 5. Cinética de ligação de construtos biespecíficos.
Controle antiproperdina 14,6-15,4 Antiproperdina TPP-2221 7,1-8,4 LVPO58 hG2-G4 TPP-2222 5,1-5,8 LVPO58 hG1 noCiq TPP-2223 8,4-13,4 Antiproperdina hG1 noC1q TPP-2224 13,9-15,8 LVPOS8-anti-Alb TPP-2225 11,6-12,9 anti-Alb-LVPO58 Tabela 6. Cinética de ligação de construtos biespecíficos.
Molécula Afinidade pH 7,4 1C50 humano (nM) 1C50 Descrição (nM) Cynomolgus (nM) TPP-2225 1,72E-10 20,04 a 64,49 11,192 12,3 Ligante Não humanizado (G4S)3 TPP-2951 3,01E-10 13,76 a 15,89 Humanizado (7 retromuta- ções) TPP-3261 4,85E-10 28,82 a 30,96 14,8 a 23,83 Humanizado (3 retromuta- ções) TPP-3071 22,28 a 29,36 10,66 a 14.58 Ligante Não humanizado (G4D)2 G4 TPP-3072 13,06 a 18,65 Ligante Não humanizado (G4E)2 G4 Tabela 7. Cinética de ligação de construtos biespecíficos.
Properdina Humana Properdina Cynomolgus | Albumina Humana | Albumina Cyno- molgus [onTA pesso [puTA | eH6o jeRTA JPHSO |pHTA |pH9SO | TPPRR22S [PR a aa [ppa asso aaa Tabela 8. Cinética de ligação de construtos biespecíficos.
Tipo de Properdina ka ka Chi? Comentários (Ms) (1s) [Fa Ts RG ane Tae on nano Tabela 9. Cinética de ligação de construtos biespecíficos.
Molécula Tipo de Properdi- | k. ka Chi? Comentários na (1/Ms) (1s)
Outras modalidades
[00193] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente men- cionados nesta especificação são incorporados aqui, neste pedido de patente por referência no mesmo grau como se cada publicação inde- pendente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmen- te indicado para ser incorporado por referência.
[00194] Será entendido que as composições e métodos descritos aqui, neste pedido de patente são capazes de modificações posterio- res, e esta descrição pretende incluir quaisquer variações, utilizações ou adaptações seguindo, em geral, os princípios aqui divulgados, in- cluindo tais desvios da presente que se enquadrem na prática conhe- cida ou habitual na técnica que pode ser aplicada às características essenciais aqui apresentadas anteriormente, e que se seguem no es- copo das reivindicações.
Claims (40)
1. Anticorpo monovalente isolado ou fragmento de anticor- po do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um frag- mento do anticorpo do mesmo se liga à properdina humana.
2. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmen- to é um anticorpo camelídeo.
3. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmen- to é um anticorpo de domínio único.
4. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmen- to se liga a TSRO e/ou a TSR1 da properdina humana.
5. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmen- to se liga a um epitopo dentro da sequência de aminoácidos LCAQPCRSPRWSLWSTWAPCSVTCSEGSQLRYRRCVGWNGQ (SEQ ID NO: 8).
6. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmen- to se liga à properdina de camundongo com uma afinidade de menos do que 50 nM.
7. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmen- to é humanizado.
8. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmen- to está ligado a um segundo anticorpo monovalente ou a um fragmen- to do anticorpo.
9. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei-
vindicação 8, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo mo- novalente ou o fragmento de anticorpo é humanizado.
10. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmen- to está ligado ao segundo anticorpo ou fragmento por um ligante.
11. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 10, caracterizado pelo fato de que o ligante é um ligante de poliglicina.
12. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 11, caracterizado pelo fato de que o ligante de poliglicina compreende uma sequência GGGGD (SEQ ID NO: 63), GGGGS (SEQ ID NO: 1), GGGGA (SEQ ID NO: 100), ou uma sequência GGGGE (SEQ ID NO: 64).
13. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 8, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo mo- novalente ou o fragmento do anticorpo se liga especificamente à al- bumina.
14. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 8, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo mo- novalente ou o fragmento do mesmo está ligado ao terminal N do anti- corpo ou do fragmento de anticorpo que se liga à properdina humana.
15. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo está ligado a um peptídeo ligando a albumina.
16. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende 3 CDRs com as seguintes sequências: a) uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoá- cidos GRISSIIHMA (SEQ ID NO: 16); b) uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoá-
cidos RVGTTVYADSVKG (SEQ ID NO: 12); e c) uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoá- cidos LOYEKHGGADY (SEQ ID NO: 17).
17. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende pelo menos uma ou todas as três CDRs selecionadas a partir de: a) uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoá- cidos GRIFEVNMMA (SEQ ID NO: 9); b) uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoá- cidos RVGTTX:YADSVKG (SEQ ID NO: 10), na qual X: é um aminoá- cido polar ou um aminoácido não polar, e c) uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoá- cidos LOYX2RYGGAEY (SEQ ID NO: 11), na qual X> é um aminoácido polar.
18. Anticorpo de acordo com a reivindicação 17, caracteri- zado pelo fato de que a CDR-H2 compreende a sequência de aminoá- cidos RVGTTVYADSVKG (SEQ |D NO: 12).
19. Anticorpo de acordo com a reivindicação 18, caracteri- zado pelo fato de que a CDR-H3 compreende a sequência de aminoá- cidos LÁYDRYGGAEY (SEQ ID NO: 13)
20. Anticorpo de acordo com a reivindicação 17, caracteri- zado pelo fato de que a CDR-H2 compreende a sequência de aminoá- cidos RVGTTTYADSVKG (SEQ ID NO: 15).
21. Anticorpo de acordo com a reivindicação 20, caracteri- zado pelo fato de que a CDR-H3 compreende a sequência de aminoá- cidos LOYSRYGGAEY (SEQ ID NO: 14).
22. Anticorpo de acordo com a reivindicação 20, caracteri- zado pelo fato de que a CDR-H3 tem a sequência de aminoácidos LQYDRYGGAEY (SEQ |D NO: 13).
23. Anticorpo de acordo com a reivindicação 17, caracteri- zado pelo fato de que a CDR-H3 tem a sequência de aminoácidos LQYDRYGGAEY (SEQ ID NO: 13).
24. Anticorpo de acordo com a reivindicação 17, caracteri- zado pelo fato de que a CDR-H3 tem a sequência de aminoácidos LOYSRYGGAEY (SEQ ID NO: 14).
25. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende 6 CDRs com as sequências que se seguem: a) uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoá- cidos GYIFTNYPIH (SEQ ID NO: 18); b) uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoá- cidos FIDPGGGYDEPDERFRD (SEQ |D NO: 19); c) uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoá- cidos RGGGYYLDY (SEQ ID NO: 20); d) uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoáci- dos RASQDISFFLN (SEQ ID NO: 21); e) uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoáci- dos YTSRYHS (SEQ ID NO: 22); e f) uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoáci- dos QHGNTLPWT (SEQ ID NO: 23).
26. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende 6 CDRs com as sequências que se seguem: a) uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoá- cidos GFSLTTYGVH (SEQ ID NO: 24); b) uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoá- cidos VIWSGGDTDYNASFIS (SEQ ID NO: 25); c) uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoá-
cidos NKDYYTNYDFTMDY (SEQ ID NO: 26); d) uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoáci- dos KSSQSVLYSSNQKNFLA (SEQ ID NO: 27); e) uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoáci- dos WASTRES (SEQ ID NO: 28); e f) uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoáci- dos HQYLSSYT (SEQ ID NO: 29).
27. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende 6 CDRs com as sequências que se seguem: a) uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoá- cidos GYTFIDYWIE (SEQ ID NO: 30); b) uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoá- cidos EIFPGSGTINHNEKFKD (SEQ ID NO: 31); c) uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoá- cidos EGLDY (SEQ ID NO: 32); d) uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoáci- dos SASSSVSYIY (SEQ ID NO: 33); e) uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoáci- dos DTSTLAS (SEQ ID NO: 34); e f) uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoáci- dos QQWSRNPFT (SEQ ID NO:35).
28. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende 6 CDRs com as sequências que se seguem: a) uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoá- cidos GFSLTSYGVH (SEQ ID NO: 36); b) uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoá- cidos VIWSGGSTDYNAAFIS (SEQ ID NO: 37); c) uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoá-
cidos NKDFYSNYDYTMDY (SEQ ID NO: 38); d) uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoáci- dos KSSQSVLYSSNQKNFLA (SEQ ID NO: 27); e) uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoáci- dos WASTRES (SEQ ID NO: 28); e f) uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoáci- dos HQYLSSYT (SEQ ID NO: 29).
29. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende 6 CDRs com as sequências que se seguem: a) uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoá- cidos GYTXTAYGIN (SEQ ID NO: 39); b) uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoá- cidos YIYIGNGYTDYNEKFKG (SEQ ID NO: 40); c) uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoá- cidos SGWDEDYAMDF (SEQ ID NO: 41); d) uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoáci- dos RASENIYSYLA (SEQ ID NO: 42); e) uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoáci- dos HAKTLAE (SEQ |D NO: 43); e f) uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoáci- dos QHHYGPPPT (SEQ ID NO: 44).
30. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1 ou 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fra- gmento inibe uma atividade da properdina humana.
31. Método para o tratamento de uma doença mediada por desregulação da via alternativa do complemento, caracterizado pelo fato de compreender a administração de uma quantidade eficaz do an- ticorpo como definido na reivindicação 1 ou 8, a um paciente que este- ja necessitando do mesmo.
7I9
32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracteriza- do pelo fato de que a doença é uma púrpura trombocitopênica trombó- tica autoimune (TTP), síndrome hemolítico-urêmica (HUS), síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS) ou hemoglobinúria paroxística no- turna (PNH).
33. Método de inibição da montagem de complexo de ata- que à membrana da via do complemento alternativa, caracterizado pe- lo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo como definido na reivindicação 1 ou 8, a um paciente que esteja necessitando da mesma.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que o método inibe a via de complemento alternativa dependente de hemólise.
35. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou um fragmento do mesmo como defini- do nas reivindicação 1 ou 8, como ativo em gradiente, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
36. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a rei- vindicação 1 ou 8, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento.
37. Anticorpo ou fragmento do mesmo para uso de acordo com a reivindicação 1 ou 8, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de uma doença mediada pela desregulação da via de com- plemento alternativo.
38. Anticorpo ou fragmento do mesmo para uso, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a doença é púrpura trombocitopênica trombótica autoimune (TTP), síndrome he- molítico-urêmica (HUS), síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS), hemoglobinúria paroxística noturna (PNH), nefropatia por IgA (doença de Berger), glomerulopatia C3 (C3G), asma, doença de Gaucher, hi-
drodentite supurativa , Doença de Behcet, dermatomiosite, queimadu- ra grave, sepse precoce, meningite pneumocócica, doença de Alzhei- mer, metástase de câncer, síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS), lesão pulmonar aguda (ACI), lesão pulmonar relacionada à transfusão (TRALI), trombose induzida por hemodiálise, epidermólise bullosa acquisita (EBA), uveite, doença de Parkinson, atresia biliar primária, vasculite por anticorpos citoplasmáticos antineutrófilos (AN- CA), degeneração da retina, ampla microangiopatia trombótica (TMA), TMA ampla (APS), TMA de terapia com células-tronco hematopoiéti- cas (HSTC), degeneração macular relacionada à idade (AMD), pré- eclâmpsia, hemólise, enzimas hepáticas elevadas e síndrome plaque- tária baixa (HELLP), esclerose múltipla, síndrome de antifosfolípidio (APS), policondrite recidivante, lesão isquêmica, acidente vascular ce- rebral, doença do enxerto versus hospedeiro (GvHD), doença pulmo- nar obstrutiva crônica (COPD), enfisema, aterosclerose, síndrome co- ronariana aguda, choque hemorrágico, artrite reumatoide, diálise (risco cardiovascular), doença cardiovascular, malária placentária, perda de gravidez de síndrome antifosfolipídica (APS), glomerulonefrite mem- brano proliferativa (MP), nefritite membranosa, encefalite, lesão cere- bral, encefalite por anticorpos do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA), crise hemolítica da malária, aneurisma da aorta abdominal (AAA ), ou aneurisma toracoabdominal da aorta (TAA).
39. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo compreende a sequência que se se- gue: LEVOQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYR- QAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNS- LKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSSRK- CCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS-
TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 53).
40. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo compreende a sequência que se se- gue: LEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYR- QAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNS- LKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSSPKSCD- KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVYV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 54).
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