BR112018009195B1

BR112018009195B1 - Fermentação

Info

Publication number: BR112018009195B1
Application number: BR112018009195-2A
Authority: BR
Inventors: Marco Luigi Federico Giuseppin; Catharina Maria Antoinette Mooij; Robin Eric Jacobus Spelbrink
Original assignee: Coöperatie Avebe U.A.
Priority date: 2015-11-06
Filing date: 2016-11-04
Publication date: 2022-01-04
Also published as: ES2747912T3; WO2017078530A1; EA201890716A1; JP2019501665A; JP6771037B2; CA3001548C; US20180305646A1; DK3371293T3; BR112018009195A8; EA038009B1; US10640740B2; MX2018004507A; BR112018009195A2; CN108350403B; EP3371293A1; CA3001548A1; EP3371293B1; CN108350403A

Abstract

fermentação. a presente invenção é dirigida a um método para diminuir o tempo de latência em uma fermentação de um meio de cultura para preparar uma substância alvo, em que a substância alvo não é iogurte e em que a fermentação resulta na formação de ácido ou etanol, cujo método compreende as etapas de fornecer, a um meio de cultura adequado, uma cultura de partida de fermentação compreendendo um microrganismo que libera ácido ou etanol, adicionar um inibidor de protease de proteína de batata ao meio de cultura, cultivar o microrganismo e obter a substância alvo. verificou-se que a adição de inibidor de protease de proteína de batata a uma alimentação de fermentação reduz significativamente o tempo de latência da fermentação. a invenção se refere ainda a um produto alimentar fermentado que não é iogurte, compreendendo um inibidor de protease de proteína de batata.

Description

[001] A invenção está no campo da fermentação. A fermentação é uma técnica bem conhecida para a produção de substâncias utilizando a atividade metabólica dos microrganismos. A fermentação tem sido usada desde os tempos antigos para aumentar o tempo de vida útil de produtos alimentares. Isto pode ser conseguido por seleção de microrganismos que se alimentam de tais produtos, e que os compostos de liberação químicas que tornam o ambiente menos atraente para outros microrganismos. Para esta finalidade, uma alimentação de fermentação compreende tipicamente compostos em carbono e nitrogênio, assim como outros nutrientes suficientes para os microorganismos para viver e procriar. Depois de adicionar o microrganismo (s) e dado algum tempo, a alimentação de fermentação se tornou enriquecida com os compostos divulgados pelo microrganismo, altura em que se tornou um produto alimentar, tal como iogurte, queijo, vinho, cerveja ou salsicha.

[002] Microorganismos que liberam álcool têm sido usado para repelir outros microorganismos e manter a qualidade de alimentos, e / ou para fazer bebidas alcoólicas. Assim, o material vegetal, tais como grãos, arroz, ou bagas (entre os quais uvas é importante) foi convertido por um processo de fermentação em, por exemplo, cerveja, whisky ou vinho. Vários tipos de leveduras, tais como, por exemplo, leveduras do gênero Saccharomyces ou Cândida, são bem conhecidos para esta finalidade.

[003] Além disso, os processos de fermentação têm sido utilizados com o objetivo de isolar o composto produzido pelo microrganismo, em vez de obter um produto alimentar, como tal. Nesse caso, o produto alvo não é a fermentação completa transformada alimentar sob a forma de, por exemplo, cerveja, queijo ou salsichas, mas o composto que é liberado pelo microrganismo. Para esta finalidade, o composto tem de ser isolado a partir da mistura após a fermentação, o qual compreende ainda compostos em carbono e nitrogênio, microorganismos e muitos outros componentes. Este processo tem sido aplicado eficazmente na produção de, por exemplo, etanol, onde o material vegetal é utilizado para alimentar os microrganismos produtores de etanol, após o que o etanol produzido é isolado a partir da alimentação. Microrganismos típicos para utilização neste processo são as leveduras do gero Saccharomyces, tais como, mas também espécies Zymomonas e Schizosaccharomycessão bem conhecidos para esta finalidade.

[004] Microorganismos que liberam ácido são também bem conhecido para ser usado em um leite compreendendo a cultura de alimentação, resultando em, por exemplo, queijo que tem uma meia-vida mais longa do que o leite. Do mesmo modo, os microorganismos para liberar o ácido permitem aumentar o período de vida útil de carne ou de vegetais por formação de, por exemplo, salsicha, chucrute ou picles. Exemplos de microrganismos que ácido bem conhecido para utilização na produção de alimentos são os microorganismos do gênero Aspergillus, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus e Acetobacter.

[005] Num processo típico de fermentação, três fases podem ser distinguidas. A primeira fase inicia-se quando os microrganismos são combinados com uma alimentação de fermentação. Os microrganismos se adaptar ao seu novo ambiente, e começar a absorver nutrientes, tais como peptídeos, aminoácidos, vitaminas e minerais. Nesta fase, os microorganismos produzem enzimas necessárias para a divisão celular e crescimento, para a energia gastos, e para fazer materiais de armazenamento, blocos de construção ou de nutrientes, para se adaptar ao seu novo ambiente. Nesta fase, no entanto, não é apenas o crescimento, ou qualquer outra indicação visual de que alguma coisa está acontecendo na fermentação. Por esta razão, esta fase é chamada a fase lag.

[006] Mesmo que parece que nada está acontecendo, a fase lag é muito importante para o processo de fermentação porque os microorganismos se adaptam ao seu ambiente, nesta fase, que é importante para sua saúde. A saúde da população de microorganismos determina a qualidade do produto resultante.

[007] Quando os microrganismos se adaptam ao seu ambiente, a segunda fase inicia. Esta fase, caracterizada por um crescimento não-substrato, é denominado a fase exponencial. Durante a fase exponencial, os microorganismos começam a crescer por divisão celular, e, por conseguinte, multiplicar exponencialmente. Nesta fase, os microorganismos, como consequência do seu carácter metabólica produzem tipicamente produtos de transbordo entre os quais, por exemplo, ácidos e / ou álcool.

[008] No final da fase exponencial, a quantidade de nutrientes adequados frequentemente diminuiu, de tal modo que o crescimento exponencial já não pode ser sustentado pela mistura de fermentação. Assim, o crescimento abranda e a fermentação entra na fase estacionária. Nesta fase, o crescimento exponencial não é mais, apesar da divisão celular ainda ocorre, e a mistura de fermentação atinge lentamente um equilíbrio entre todos os compostos presentes. Se todas as circunstâncias, são adequadas, isto resulta em um produto alimentar de alta qualidade, com sabor bem equilibrado e cheiro, ou em uma mistura, que é altamente enriquecida no composto de interesse.

[009] O tempo que estas etapas requerem é altamente variável, e depende do tipo de microrganismo (s) utilizado, do tipo de alimentação de fermentação, da temperatura e muitos outros parâmetros. Dadas estas fases distintas, a produção de substâncias alvo, entre os quais produtos alimentares (excluindo iogurte) e compostos químicos, tais como o etanol, é geralmente um processo em descontínuo. Como é comum para os processos em batelada, um fator importante no custo é o tempo necessário para o produto a ser preparado.

[0010] Um fator importante no tempo de produção é a fase lag. Durante esta fase, o processo de fermentação é preparado real. Além de criar as condições meio adequada para o crescimento de microorganismos, não há nenhuma contribuição em tudo para a produção do produto de interesse e, como tal, um intervalo de tempo mais curto teria um enorme impacto sobre a economia dos processos de fermentação. No entanto, a fase de latência é muito importante para determinar a saúde da população de microorganismos, que por sua vez é importante para a qualidade do produto imaginado. O tempo que é necessário para a fase de latência e para passar o processo de fermentação para atingir a fase exponencial é referido como o tempo de retardação.

[0011] As tentativas de reduzir o tempo de atraso ter sido feito antes. Uma opção é usar um processo de fermentação semi-contínua, em que os microorganismos estão adaptados para a fase de produção e permanecer na fase exponencial durante um tempo prolongado. Isto, no entanto, não é adequado para muitos processos, devido à fase estacionária é importante para a determinação do gosto final e / ou qualidade do produto, e esta fase é ignorada em um processo tal semi-contínua.

[0012] Além disso, é possível adicionar uma mistura de microrganismos, chamado de uma cultura de partida, que já foram adaptadas para as condições de meio de fermentação. Isso, no entanto, cria problemas diferentes, porque em um feed premix microorganismo em pequena escala, o ambiente do fermentador de larga escala é difícil de copiar. É possível usar um volume maior da pré-cultura (inóculo), mas isso tem um grande impacto sobre o processo de produção e custos do estágio pré-cultura. Portanto, seria preferível para reduzir o tempo de atraso, possivelmente, ainda mais do que possível com esta técnica, de forma confiável, com uma quantidade limitada de cultura inicial.

[0013] Para reduzir o tempo de atraso, também é possível adicionar extras nutrientes benéficos facilmente transportáveis e de energia à pré-mistura, como por peptídeos extras instância. No entanto, isso cria custos e problemas com, por exemplo, adicionais off-sabor e coloração.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] A presente invenção está relacionada com um método para diminuir o tempo de desfasamento em uma fermentação de um meio de cultura para preparar uma substância alvo, em que a substância alvo não é iogurte e em que os resultados de fermentação na formação de ácido ou etanol, o qual método compreende as etapas de fornecer, a um meio de cultura adequado, uma cultura iniciadora de fermentação compreendendo um microorganismo que libera ácido ou etanol, a adição de um inibidor de proteinase de proteína de batata para o meio de cultura, cultivar o microrganismo e a obtenção da substância alvo.

[0015] Verificou-se que a adição do inibidor de proteinase de proteína de batata para um alimento para animais de fermentação reduz significativamente o tempo de latência da fermentação. A quantidade necessária de proteína de batata é suficientemente baixa para não afetar o sabor da substância alvo, e a redução do tempo de desfasamento ocorre tanto em batelada e em processos semi- contínuo. A invenção refere-se ainda a um produto alimentar fermentado que não é o iogurte, contendo inibidor de proteinase de proteína de batata.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0016] A Figura 1 mostra o tempo necessário para atingir a redução OD0.4 por adição de 0,1% de LMW do crescimento de Saccharomyces cerevisiae em YPD20 e YPD100. Cada barra representa pelo menos 3 culturas diferentes. As barras de erro são o desvio padrão.

[0017] A Figura 2 mostra a inibição da tripsina por proteína Solanic IP.

[0018] Exemplo curvas de crescimento de S. cerevisiae com e sem 0,1% de inibidor de proteinase de proteína de batata, que mostram um tempo de atraso diminuiu com a adição de inibidor de proteinase de proteína de batata: Figura 3a & b. O intervalo de tempo foi determinado por análise de parcelas logarítmica dos dados. Esta análise não é mostrada no gráfico. No meio de crescimento rico em peptídeo, o efeito é reduzido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0019] A presente invenção se refere a um método para diminuir o tempo de desfasamento em uma fermentação de um meio de cultura para preparar uma substância alvo, em que a substância alvo não é iogurte e, em que os resultados de fermentação na formação de ácido ou etanol, o qual método compreende as etapas de fornecer, a um meio de cultura adequado, uma cultura de fermentação de iniciação que compreende um microrganismo que libera ácido ou etanol, a adição de um inibidor de proteinase de proteína de batata para o meio de cultura, a cultura de microrganismo, e a obtenção da substância alvo. Verificou-se que a adição de pequenas quantidades de inibidor de proteinase de proteína de batata, tais como um isolado de inibidor de proteinase da batata ("PPπ"), para uma alimentação de fermentação reduz significativamente o tempo de latência da fermentação, o que tem vantagens econômicas na produção de produtos de fermentação. A quantidade necessária de proteína de batata é suficientemente baixa para não afetar o sabor da substância alvo, e a redução do tempo de desfasamento ocorre tanto em batelada e em processos semi- contínuos. A redução do tempo de atraso, no contexto da presente invenção, pode também ser chamado "Atividade estimuladora" (SA). A presente invenção pode ser aplicado em uma ampla faixa de pH e temperatura.

[0020] O presente método é dirigido a um método para diminuir o tempo de desfasamento em um fermentação de um meio de cultura para preparar uma substância alvo, em que a substância alvo não é iogurte. No abaixo, o termo "produto alimentar" ou "substância alvo"é sempre entendido como excluir iogurte, se é ou não é explicitamente mencionado.

[0021] Iogurte, neste contexto, pode ser definido como um produto lácteo branco, viscoso, mas escoável acídico obtido por fermentação de leite, tal como, por exemplo leite de vaca, leite de cabra, leite de ovelha, leite Yak, leite de égua, leite rena, leite de alce, leite de búfalo , leite de burro e / ou leite de camelo, preferencialmente, leite de vaca, que foi submetido a fermentação, utilizando uma cultura de partida compreendendo os organismos presentes na Kefir, tais como as bactérias do ácido láctico e leveduras, bem como Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium breve, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc mesenteroides, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, por exemplo, misturas de Lactococcus diacetylactis e Leuconostoc cremoris. Em iogurte, a viscosidade geralmente surge a partir da presença de exopolissacarídeos, e não, como em outros produtos lácteos fermentados, de precipitação de proteína. Tempos e as condições para a obtenção de iogurte de leite de cultura são bem conhecidos, e dependem, entre outros do tipo de microorganismo utilizado e do tipo de iogurte. Outros tipos de produtos lácteos fermentados existem que não são iogurte, como para o queijo, exemplo, creme de leite, creme fraiche, quark e soro de leite fermentado.

[0022] Esses componentes no meio de cultura que o microorganismos alimentam são o substrato para a fermentação. Esta é a chamada alimentação de fermentação, o caldo de fermentação ou, como um todo, o meio de cultura. O meio de cultura em geral, compreende ainda outros compostos, que podem ajudar na fermentação ou o processamento, entre os quais os sais. O meio de cultura é geralmente aquoso. O meio de cultura pode ser uma substância alimentar, caso em que o substrato é composto no meio de cultura. Este é o caso, por exemplo, na fermentação de produtos alimentares, em que o meio de cultura pode ser, por exemplo, creme ou coalhada. Em alternativa, o meio de cultura pode ser um meio aquoso para que vários componentes foram adicionados como substrato. Tais componentes podem incluir uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo e uma fonte de carbono como substrato. A fonte de nitrogênio pode, preferencialmente, compreender amoníaco, sais de nitrato, aminoácidos, peptídeos e / ou proteínas. A fonte de carbono é, de preferência, um triglicerídeo ou um carboidrato, tal como um açúcar, um álcool de açúcar, um amido e / ou celulose. A fonte de fósforo é, preferencialmente, um mono-inorgânico, piro- ou polifosfato, um fosfocarbohidrato, um fosfolipídio ou um nucleotídeo.

[0023] Na presente invenção, a substância alvo pode ser a forma total resultante depois da fermentação do meio de cultura. Este é frequentemente verdade para os casos em que a substância alvo é um produto alimentar. Em alternativa, a substância alvo pode ser um componente compreendido no meio resultante total após fermentação do meio de cultura. Neste último caso, prefere-se que a substância alvo é subsequentemente isolada a partir do meio resultante. Este é frequentemente verdade nos casos em que a substância alvo é um composto químico, tal como o etanol ou um ácido.

[0024] Isto é, a presente invenção é dirigida a um método para diminuir o tempo de desfasamento em uma fermentação de um meio de cultura para preparar uma substância alvo, em que a substância alvo não é iogurte e, em que os resultados de fermentação na formação de ácido ou etanol. Formação de ácido ou etanol por microrganismos é conhecida no estado da técnica, e é bem conhecido como aplicar tal formação, a fim de se obter uma substância alvo pela fermentação.

[0025] De preferência, a substância alvo é um produto alimentar, mais preferencialmente, um produto alimentar produzido usando uma fermentação que resulta na formação de etanol. Alternativamente, a invenção é dirigida para fermentações que resultam na formação de ácido de ácido, de preferência, ácido láctico e / ou ácido acético. Em concretizações preferidas, tais fermentações resultam em produtos alimentares que compreende o referido ácido. Em concretizações alternativas, a substância alvo é o ácido, preferencialmente, ácido láctico ou ácido acético, como a substância alvo.

[0026] De um modo preferido, a presente invenção é aplicada num processo de fermentação no qual o crescimento do microorganismo é peptídeo-limitado.

[0027] Peptídeos, para o escopo da presente invenção, são pequenos fragmentos proteicos, que consistem de 5-30 aminoácidos; tais fragmentos também são chamados de "peptídeos"nutritivos. Esses peptídeos ocorrem livre em solução, de modo que eles podem também ser chamados "peptídeos nutritivos livres".

[0028] Uma fermentação peptídeo-limitado é um de fermentação em que a concentração de peptídeos nutritivos livres é limitado, mas em que outros nutrientes necessários, como minerais (TRACE), carboidratos e proteínas, estão livremente disponíveis. Assim, uma fermentação peptídeo-limitada é uma fermentação, na qual a quantidade de nutritivos peptídeos livres presentes no caldo de fermentação limita o crescimento do microrganismo. Esta limitação de peptídeos ocorre quando a taxa de degradação de peptídeos nutritivos por proteinases / peptidases no sentido de aminoácidos é maior do que a taxa de formação de peptídeos nutritivas de proteína. Pode ser testado se uma fermentação é observando o efeito da adição de pequenas quantidades de peptídeos em crescimento e atraso de tempo limitado no peptídeo. Quando a adição de peptídeos nutritivos não resultam em uma fermentação substancialmente mais rápido, em seguida, a fermentação é não-peptídeo limitado. Quando a adição de peptídeos não nutritivos resulta em uma fermentação mais rápida, em seguida, a fermentação pode ser chamada peptídeo-limitado.

[0029] Isto significa que a taxa de fermentação é dependente da concentração de peptídeos nutritivos disponíveis. No caso de uma fermentação peptídeo-limitado, há insuficientes peptídeos nutritivos para manter ou adaptar para o crescimento exponencial do microrganismo. Isto leva a um aumento no tempo lag.

[0030] No método da presente invenção, a adição de uma quantidade relativamente pequena de inibidor de proteinase da proteína da batata é encontrada para reduzir o tempo de latência, em particular, para as fermentações limitados-peptídicos, e, em particular, onde as proteínas são suficientes disponíveis.

[0031] É inesperado que, em particular, em métodos que envolvem uma fermentação peptídeo-limitado o tempo de atraso é reduzido. É bem conhecido que um fator importante na determinação do tempo de retardamento de uma fermentação é a degradação de proteínas na forma de pequenos peptídeos nutritivos de 5-30 aminoácidos. Esta conversão é efetuada por uma grande variedade de proteinases. Uma função bem conhecida de inibidores de proteinase é para inibir proteinases, inibindo eficazmente as proteinases que são responsáveis pela degradação das proteínas para os peptídeos nutritivos. Como tal, seria de esperar que a adição de inibidores de proteinase, de qualquer fonte, resultaria num aumento do tempo de latência devido à degradação enzimática mais lenta de proteínas e uma formação mais lenta associada de peptídeos nutritivos. No entanto, encontra-se agora que, de fato, ocorre o inverso, e a adição de inibidores da proteinase de proteína de batata resulta em uma redução, em vez de um aumento do tempo de latência.

[0032] O intervalo de tempo, no presente contexto, é definido como a duração de tempo necessária para o microorganismo adaptar-se ao novo ambiente, o meio de cultura. É o tempo de duração necessário para a fase lag.

[0033] Um processo de fermentação pode ser monitorado através de vários métodos, utilizando indicadores metabólicos ou indicadores em que a formação de biomassa seja controlada. Por exemplo, a produção de gás (tal como CO2 ou metano) pode ser um metabohc adequado para parâmetro em caso de uma fermentação, que está associada com a formação de gás. Em alternativa, a densidade ótica (OD a 600 nm, a OD600) pode fornecer um parâmetro de saída adequado, para proporcionar uma quantificao da quantidade de microrganismos presentes. Além disso, a densidade do meio de cultura pode ser adequada, em casos em que um produto significativo da fermentação, tal como, por exemplo, a substância-alvo, tem uma densidade diferente da do meio de cultura. Isto é verdade, por exemplo, em fermentações que resultam na formação de álcool. No caso de uma fermentação que resulta na formação de ácido, o pH pode proporcionar um parâmetro de saída adequado. O perito pode vir até com inúmeras maneiras de determinar a progressão de uma fermentação, e determinar o tempo necessário para a fase lag.

[0034] A fermentação progride geralmente através de uma curva em forma de S em parâmetros de produção, tais como a densidade ótica, a formação de gás, a densidade do meio de cultura ou o pH, como é bem conhecido na arte. Na presente invenção, o tempo para atingir o ponto a meio caminho na fase de crescimento exponencial é encontrada por meio do cálculo do ponto de inflexão na curva S alisado a partir da sua segunda derivada. Alternativamente, quando se utiliza o pH como indicador do progresso metabólica, ter um meio caminho valor de pH da curva exponencial e registar o tempo até que este valor de pH seja alcançado. A redução do tempo de atraso pode ser determinada por comparação do tempo de latência de uma fermentação sem batata adicionado inibidor de proteinase de proteína com a mesma fermentação em que é adicionada uma quantidade apropriada de inibidor de proteinase de proteína de batata. A redução do tempo de atraso absoluto é geralmente quantificada como horas de redução, enquanto que a redução do tempo de atraso relativo é quantificada como "%".

[0035] A proteína de batata nativa podem ser provisoriamente dividida em três classes (i) a família patatina, um elevado grau de homologia ácida 43 kDa de glicoproteínas (40-50% em peso das proteínas da batata), (ii) 5-25 kDa de inibidores de proteinases básicas (inibidores de proteinase de proteína de batata), o qual, quando isolados, são designadas por isolado de inibidor de proteinase da batata ou "PPπ"; 30-40 % em peso das proteínas da batata) e (iii) outros proteínas principalmente proteínas de elevado peso molecular (10-20 wt.% Das proteínas da batata) (POTS et ai, J. Sei. Food. Agric. 1999, 79 , 1.557-1.564).

[0036] PPII podem ser divididos em diferentes grupos com base no seu peso molecular. Os diferentes grupos de inibidores da proteinase são identificados como inibidor da proteinase I (peso molecular de cerca de 39 kDa), inibidor de carboxipeptidase (peso molecular de cerca de 4 100 Da), os inibidores da proteinase IIa e IIb (Peso molecular de cerca de 20,7 kDa), e o inibidor da proteinase A5 (peso molecular de cerca de 26 kDa). A proporção destes diferentes grupos de inibidores da proteinase no total de proteína de batata depende da variedade de batata.

[0037] Para o escopo da presente invenção, um inibidor de proteinase de proteína de batata compreende qualquer inibidor de proteinase de proteína de batata, ou qualquer mistura de proteínas de batata diferentes, que inclui um ou mais inibidores de proteinase de proteína de batata, ou grupos de inibidores, como definido acima. Um isolado inibidor de proteinase da batata (PPII) é um isolado que compreende um inibidor da proteinase de proteína de batata. Um inibidor de proteinase de proteína de batata de acordo com a presente invenção é, preferivelmente, essencialmente nativa.

[0038] PPII pode ser obtida de qualquer maneira conhecida, tal como, por exemplo, precipitação, absorção, fracionamento térmico a 60 - 80° C durante, no máximo, meia hora, de separação por membrana, precipitação com sulfato de amônio ou ácidos graxos saturados ou outros componentes, tais técnicas de filtração como ultrafiltração ou filtração em gel. O fracionamento térmico resulta em inibidor de proteinase da batata nativa isolado, pois o calor desnatura a maior parte das outras proteínas presentes no sumo de batata, mas os inibidores de proteinase de proteína de batata são relativamente estáveis ao calor, de modo que sobrevivem a tratamento térmico e podem ser isolados.

[0039] De um modo preferido, PPII é usado na presente invenção. Isto pode, preferencialmente, ser obtidos como descrito no Documento WO 2008/069650, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência, onde uma descrição elaborada do isolamento de inibidores de proteinases a partir de sumo da fruta ou (PFJ) ou água da batata (PFW) é descrita.

[0040] Esse processo implica sujeitar sumo de batata para um floculação por um cátion de metal bivalente a um pH de 7 - 9, e centrifugação do sumo de batata floculada, formando, assim, um sobrenadante. Subsequentemente, o sobrenadante é submetido à cromatografia de adsorção de leito expandido operada a um pH de menos do que 11, e uma temperatura de 5 - 35° C, utilizando um adsorvente capaz de se ligar a proteína da batata, adsorver, assim, a proteína da batata nativa para o adsorvente. Os materiais para colunas que se ligam a determinadas quantidades de proteínas de batata nativa incluem de modo misto adsorbentia, tais como, por exemplo, Amersham Streamline ™ directa CST I (GE Healthcare), Fastline adsorbentia (Upfront Chromatography A / S), e íons adsorbentia adsorventes macroporosas de câmbio. Alternativamente, ligantes absorbentia que compreendem tais como descritos no pedido de patente Europeia 12175944,3 são altamente preferidos para isolar PPII adequado para utilização na presente invenção.

[0041] Finalmente, pelo menos um isolado de proteína de batata nativa elui a partir do adsorvente com um eluente. Este método resulta, entre outros em PPII isolado de elevada pureza, que é nativo com um mínimo de proteína desnaturada presente e caracteriza-se por uma solubilidade estel.

[0042] A quantidade de inibidores de proteinase de proteína de batata pode ser determinado medindo o inibidor de tripsina de acordo com o método descrito no Spelbrink et al., The Open Food Science Journal 2011 (5) p42-46 "Determinação Quantitativa Tripsina Actividade Inibitória em matrizes complexas" ou na ISO 14902: 200 IE "animal Feed Stuffs -Determinação de produtos de soja".

[0043] Como uma alternativa ao uso de inibidor de proteinase de proteína de batata, tal como PPII, é possível utilizar uma fração de proteína purificada isolada a partir de mais PPII. Uma fração de proteína preferida

[0044] - é solúvel a um pH de 8,

[0045] - tem um pKa <8,

[0046] - tem atividade tanto TIA e CTIA, mas nem atividade sobrevive tratamento térmico a 80 ° C durante 30 minutos. No entanto, o tempo de retardamento a redução da capacidade permanece intacta até pelo menos 90 ° C, e possui um peso molecular compreendido entre 17,5 e 18,2 kDa.

[0047] Atividade TIA é determinada através da medição do efeito inibidor da proteína contra a tripsina de acordo com o método descrito no Spelbrink et al, The Open Food Science Journal 2011 (5) p42-46 "Quantitative Determinação Tripsina Actividade Inibitória em matrizes complexas" ou na ISO 14902: 200 IE 'Stuffs alimentação animal - Determinação de produtos de soja'.

[0048] Atividade CTIA é determinada através da medição do efeito inibidor da proteína contra a quimotripsina. O método a ser utilizado é essencialmente o mesmo que o método descrito para a TIA, mas as doses mais elevadas de enzimas são necessárias para compensar a menor atividade específica da quimotripsina.

[0049] Uma vantagem de utilizar um inibidor de proteinase de proteína de batata é que a maioria é muito estável ao calor. A fração ativa no isolado inibidor de proteinase da proteína da batata, que representa a redução do tempo de latência retém o seu estado nativo até temperaturas de 60° C, de preferência, 70° C, mais preferivelmente 80° C, e, mais preferivelmente, 90° C para um período de pelo menos 15 min, de um modo preferido, pelo menos, 90 min. Isto permite que a adição de inibidor de proteinase de proteína de batata em diferentes pontos no processo de fermentação.

[0050] O inibidor proteinase de proteína de batata de pode ser adicionado ao meio de cultura antes, depois ou durante a adição da cultura de iniciação, ou pode ser adicionado ao meio de cultura indiretamente, por exemplo, por adição à cultura de partida ou a outro componente que é para ser adicionada para o meio de cultura. Além disso, pode ser adicionado a um alimento para animais de fermentação que será mais tarde tornar-se ou tornar-se parte do meio de cultura em processos em que a alimentação de fermentação é aquecido antes da fermentação. Este é o caso, por exemplo, em processos que requerem pasteurização ou esterilização antes da fermentação, o que é comum em muitos processos de fermentação de produtos alimentares, tal como definido acima.

[0051] É uma outra vantagem do presente invenção que inibidor da proteinase de proteína de batata é funcional nos processos de fermentação, como descrito, em concentrações muito baixas. Em particular, a adição de menos do que 1 g / 1, de preferência, inferior a 0,5 g / l, mais preferencialmente inferior a 0,1 g / l, ainda mais preferencialmente menos do que 0,05 g / 1 de inibidor da proteinase de proteínas de batata é suficiente para reduzir o tempo de atraso em processos de fermentação de acordo com a invenção. Uma quantidade mínima de pelo menos 0,01 g / 1, de preferência de 0,005 g / 1, mais preferivelmente, de 0,001 g / um inibidor da proteinase de proteína de batata é necessária para reduzir o tempo de atraso de fermentações de acordo com a presente invenção.

[0052] As concentrações preferidas de inibidores de proteinase de proteína de batata são entre, por exemplo, 5 g / 1 e 0,001 g / 1, de preferência, entre 5 g / 1 e 0,05 g / 1, mais de preferência entre 5 g / 1 e 0,01 g / 1, tal como entre 1 g / 1 e 0,01 g / 1. A concentração de inibidor de proteinase de proteína de batata, neste contexto, é expressa como inibidor de proteinase de proteína de batata g por litro de meio de cultura.

[0053] A estas concentrações, o inibidor da proteinase de proteína de batata não confere qualquer sabor à substância-alvo, o que é uma vantagem adicional, em particular, quando a substância alvo é um produto alimentar. Além disso, adicionalmente, essas baixas concentrações de inibidor de proteinase de proteína de batata não têm impacto detectável nas características sensoriais da substância alvo.

[0054] É também uma vantagem da presente invenção que inibidores de proteinase de proteína de batata é funcional nos processos de fermentação em uma ampla gama de pH. Em particular, o pH no meio de cultura pode ser de até 6,7, preferencialmente 8,0, mais preferivelmente até 10,0. Além disso, o pH pode ser tão baixo quanto 4, de preferência, tão baixo como três, mais de preferência, tão baixo quanto 2. A estabilidade do inibidor de proteinase de proteína de batata em uma larga gama de pH é vantajoso porque permite que os meios de cultura de vários pH de ser processado por fermentação. Dentro

[0055] Adicionalmente, permite que as fermentações em que o ácido é liberado a beneficiar da adição de inibidor da proteinase de proteína de batata ao longo da fermentação.

[0056] Além disso, é uma vantagem distinta do presente invento que o inibidor de proteinase de proteína de batata é não-alérgicos. Isto significa que ele pode ser usado em processos de fermentação operados por pessoas alérgicas a outras proteínas. Além disso, isto significa que ele pode ser usado em processos de fermentação em que a substância alvo é um produto alimentar, onde o produto alimentar pode ser consumida por pessoas que sofrem de alergias, sem um risco de choque alérgico.

[0057] Além disso, é uma vantagem do inibidor de proteinase de proteína de batata que uma solução dessa proteína, de preferência uma solução aquosa, é claro, ou pelo menos substancialmente não turva, até concentrações de pelo menos 10 g / L, de preferência 50 g / L, mais preferencialmente 250 g / L. Estas concentrações são preferencialmente realizados a um pH da solução de 2 a 5, de preferência, 2 - 4, mais de um modo preferido, 2,5 - 3,5. As soluções límpidas ou substancialmente não turvas de inibidor de proteinase de proteína de batata permitir a esterilização de filtro conveniente e aparência atraente da substância alvo, em particular, quando a substância alvo seja um produto alimentar.

[0058] Uma cultura de fermentação de partida, no contexto da presente invenção, é uma cultura que compreende um ou mais microorganismos, tal como definido acima, de uma composição apropriada para obter um determinado tipo de fermentação.

[0059] A cultura de partida pode compreender um único tipo de microrganismo, ou pode compreender dois ou mais microorganismos.

[0060] Microorganismos presentes na cultura iniciadora de fermentação para a preparação de uma substância alvo por fermentação são aquelas que liberam ácido ou etanol. Tais microorganismos são bem conhecidos. Geralmente, o microrganismo ser escolhido entre o grupo de bactérias, leveduras, fungos e algas, de preferência bactérias, leveduras ou fungos.

[0061] Por exemplo, as bactérias adequadas podem ser da ordem de Lactobacillales, que são as bactérias gram- positivas que compreendem as bactérias de ácido láctico que compreende o gênero Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Carnobacterium, Leuconostoc e Pediococcus, ou a partir da ordem de Bifidobacteriales. No entanto, uma bactéria da presente invenção não está limitada a estes exemplos.

[0062] Os fungos adequados, por exemplo, aqueles classificados como leveduras, são, por exemplo, da ordem de Saccharomycetales, e incluem espécies dos gêneros Saccharomyces, Brettanomyces, Kloeckera e Candida. No entanto, a levedura da presente invenção não está limitada a estes exemplos.

[0063] As leveduras preferidas incluem leveduras dos gêneros Saccharomyces, tais como, Saccharomyces cerevisiae.

[0064] Outros fungos incluem, por exemplo, tais como, por exemplo, espécies dos gêneros Penicillium, Mortierella, Aspergillus, Fusarium (Fusarium venenatum fi), Rhizopus e Agaricus. No entanto, os fungos da presente invenção não estão limitados a estes exemplos.

[0065] Geralmente, os microrganismos apropriados para utilização no método da presente invenção são escolhidos a partir da classe de Bacilos, Actinobactérias ou Saccharomycetes. De um modo preferido, os microrganismos adequados são escolhidos da ordem de Lactobacillales, Bifidobacteriales e Saccharomycetales, mais preferivelmente, a partir dos gêneros de Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium e Saccharomyces, Rhizopus, Aspergillus, Mucor, Amylomyces, Endomycopsis, Saccharomyces, Hansenula anomala, Lactobacillus, e Acetobactersão preferidos.

[0066] O meio de cultura deve ser apropriado para o tipo de fermentação, a substância alvo e o tipo de microrganismo em causa. Assim, o meio de cultura pode ser líquido ou sólido, semi-sólido, em partículas, ou viscoso, e que deve incluir nutrientes adequados, entre os quais para proteínas e / ou carboidratos instância, como substrato. Os nutrientes adequados são bem conhecidos na arte, e pode ser qualquer componente exigido por um microorganismo a crescer, tais como proteínas, peptídeos, lipídeos, traços de compostos, elementos vestigiais, minerais e carboidrato, tais como amido, polissacarídeos e açúcares.

[0067] A cultura de microrganismos é realizada sob condições de cultura adequadas. As condições de cultura durante a fermentação podem ser aqueles conhecidos para culturas de fermentação adequados para a substância alvo de interesse.

[0068] As condições de cultura pode ser aeróbia ou anaeróbia, e se aeróbica, pode envolver, baixo, normal ou alta aeração. A cultura pode ser o estado líquido ou sólido cultura estado, e pode ser feito em qualquer escala, em descontínuo ou métodos de processamento semi-contínuos.

[0069] A temperatura durante a fermentação pode variar de -10 ° C a + 60 ° C, de preferência, 13 - 45 ° C. De preferência, a temperatura permanece constante. O pH pode variar a partir de pH 2-10, de preferência, 4 - 6,7. O tempo de cultura é altamente variável e depende do tipo de cultura e, em particular, a substância alvo. O perito na arte está bem ciente de tempos de cultura adequados para substâncias alvo específicas. Por conseguinte, os tempos de cultura podem variar de 0,5 horas a 10 anos ou mais.

[0070] Os níveis de oxigênio podem variar desde ausente (fermentação anaeróbica) para apresentar a (fermentação aeróbica). O processamento pode ser tanto agitado como bem como estático.

[0071] A adição do inibidor de proteinase de proteína de batata pode ocorrer em qualquer momento antes da fermentação. Essa adição pode ser feita através da combinação do inibidor de proteinase de proteína de batata com o meio de cultura como uma soluo de proteína concentrada filtrada ou pasteurizado, e, em seguida, adicionar a cultura de levedura, ou, alternativamente, através da combinação da cultura de partida com a proteína da batata nativa e combinar esta mistura com o meio de cultura.

[0072] Alternativamente, todos os componentes podem ser adicionados separadamente, ou em combinação com outros constituintes do meio de cultura, conforme o caso pode ser. Esses outros constituintes do meio de cultura pode incluir, por exemplo, carboidrato, minerais, minerais em massa, proteínas ou peptídeos.

[0073] Em uma concretização muito preferida, o inibidor de proteinase de proteína de batata pode ser adicionado ao meio de cultura antes de uma etapa de aquecimento. Isto é vantajoso quando o meio de cultura é para ser aquecido, como para a pasteurização ou esterilização, antes da adição da cultura iniciadora. Devido à estabilidade ao calor vantajosa do inibidor de proteinase de proteína de batata, inibidor de proteinase de proteína de batata retém o seu estado nativo, mesmo depois de um tal aquecimento, de modo que a sua função bioquímica natural permanece e o tempo de latência da fermentação reduzida, mesmo após aquecimento.

[0074] A adição de inibidores de proteinase de proteína de batata, de um modo preferido no estado nativo, tem o efeito de reduzir o tempo de latência da fermentação. O tempo de atraso é reduzido de forma significativa, dependendo da cultura e o meio, tal como por, pelo menos, 10%, de preferência pelo menos 25%, mais preferencialmente, pelo menos 50%, mais preferencialmente, pelo menos 60%, e mais preferencialmente, pelo menos 90%, em relação ao mesmo método de fermentação, em que nenhum inibidor de proteinase de proteína de batata é adicionado.

[0075] A obtenção de (ou "coleta") da substância alvo pode assumir qualquer forma conhecida na especialidade para o isolamento de substâncias alvo depois de fermentação. Em particular, um produto alimentar todo pode ser obtido por coleta do meio de cultura. O referido produto alimentar pode adequadamente todo ser submetido a um ou mais pós-tratamentos. Alternativamente, uma substância alvo pode ser isolada a partir da cultura de fermentação, tal como por meio de destilação, filtração, extração ou outros meios conhecidos no estado da técnica, e opcionalmente, purificado adicionalmente por qualquer meio conhecido. Desta forma, uma substância alvo pode ser obtida com pureza suficiente.

Fermentações resultando na formação de etanol.

[0076] Em uma concretização da invenção, os resultados de fermentação em formação de etanol (álcool). De um modo preferido, se o método de fermentação resultados na formação de etanol, a substância alvo é vinho ou vinho espumante, cerveja, whisky, de cidra, de mel, que causa ou bioetanol. As substâncias alvos preferida são vinho, cerveja e etanol, mais preferencialmente, cerveja. Em outras concretizações preferidas, a substância-alvo preferida é um produto alimentar.

[0077] Um microorganismo preferido nesta concretização é do gênero de Saccharomyce, Candida, Zygosaccharomyces, Dekkera ou Brettanomyces, de um modo preferido Saccharomyces. É do conhecimento geral que tipo de fermentação, usando-se que os microrganismos, resulta na formação de etanol.

[0078] Um meio de cultura preferido nesta concretização compreende material vegetal como substrato, tal como um grão de qualidade alimentar, arroz, feijão, mel, ou de fruta (preferencialmente baga, mais preferencialmente, de uva), de preferência grão ou baga em fermentações que resultam em etanol com base- produtos alimentícios. Em tanto concretizações preferidas, o meio de cultura que compreende material vegetal é um meio líquido.

[0079] A fermentação que resulta na formação de etanol pode geralmente ser alcançada como se segue. A fermentação compreende o fornecimento de uma cultura iniciadora de fermentação compreendendo um ou mais microorganismos do gênero Saccharomyce, Candida, Zygosaccharomyces, Dekkera ou Brettanomyces em um meio de cultura que compreendem material vegetal, de preferência, grão de qualidade alimentar, arroz, feijão, mel, ou fruta, que o material vegetal compreende carboidratos. O meio de cultura é combinado com um inibidor de proteinase de proteína de batata para reduzir o tempo de latência, e os microrganismos é cultivado no meio de cultura para se obter o produto alimentar.

[0080] De um modo preferido em uma concretização em que a fermentação é dirigida principalmente para a produção de etanol, a fermentação é anaeróbia. Este é o caso de, por exemplo, a fermentação de cereais, arroz, feijão, mel ou frutas para resultar em cerveja, uísque, amor, hidromel, vinho ou bioetanol.

[0081] Se a substância alvo é vinho ou vinho espumante (incluindo champanhe), culturas de partida adequadas incluem Saccharomyces. Neste caso, um meio de cultura adequado compreende bagas ou sumo de bagas, sumo de uva preferencialmente ou outros sumos de fruta como substrato. Os frutos podem ser esmagados, pressionados ou macerados para obter um sumo para servir como um meio de cultura.

[0082] Opcionalmente, o sumo pode ser tratado enzimaticamente para aumentar o teor de açúcar livre ou remover materiais indesejáveis.

[0083] Se a substância alvo é cerveja, culturas iniciadoras adequadas incluem Saccharomyces, tais como Saccharomyces carlsbergensis ou Saccharomyces pastorianus. Neste caso, um meio de cultura adequado compreende mosto ou outros extractos de cereais ricos em carboidratos como substrato. O mosto é preparado a partir de grãos por meio de trituração para converter os carboidratos complexos em açúcares.

[0084] De preferência, os grãos compreendem cevada como uma fonte de enzimas. Opcionalmente, enzimas de conversão de carboidratos podem ser adicionadas exogenamente. Lúpulo e / ou outras ervas e especiarias podem ser adicionadas ao mosto.

[0085] Se a substância alvo é uísque, leveduras adequadas compreendem Saccharomyces. Neste caso, um meio de cultura adequado compreende mosto ou outros extratos de cereais ricos em carboidratos como substrato. Um tratamento de pós-fermentação adequado compreende, por exemplo, destilação.

[0086] Se a substância alvo é cidra, fermentos adequados compreendem Saccharomyces. Neste caso, um meio de cultura adequado compreende maçãs ou sumo de maçã como substrato.

[0087] Se a substância alvo é hidromel, leveduras adequadas compreendem Saccharomyces. Neste caso, um meio de cultura adequado compreende mel como substrato.

[0088] Se a substância alvo é a causa, culturas iniciadoras adequadas compreendem Aspergillus, de preferência Aspergillus oryzae, e Saccharomyces. Neste caso, um meio de cultura adequado compreende arroz como substrato.

[0089] Se a substância alvo é bioetanol, o meio de cultura compreende, de preferência, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo e uma fonte de carbono como substrato. A fonte de nitrogênio pode preferencialmente compreender amoníaco, sais de nitrato, amino ácidos, peptídeos e / ou proteínas. A fonte de carbono é, de preferência, um triglicerídeo ou um carboidrato, tal como um açúcar, um álcool de açúcar, um amido e / ou celulose. A fonte de fósforo é, preferencialmente, um mono-, piro- ou polifosfato inorgânico, um fosfocarbohidrato, um fosfolipídeo ou um nucleotídeo.

[0090] No caso de etanol, o qual, por exemplo, pode ser usado como um biocombustível (etanol), os microorganismos adequados incluem Saccharomyces, Schizosaccharomyces e Zymomonas. O meio de cultura, neste caso, compreende, de preferência, material vegetal como substrato, o qual pode ser de qualquer tipo, tais como, por exemplo, caules de milho, palha de trigo, cana-de-açúcar, batata, mandioca e milho.

[0091] O etanol pode ser isolado a partir do meio resultante total após fermentação do meio de cultura por meio de destilação ou osmose, filtração por membrana ou reverter congelar concentração, de preferência destilação. O etanol é mais preferencialmente purificado por métodos conhecidos, a fim de obter etanol tão puro quanto possível. Fermentações, resultando na formação de ácido

[0092] Em outra concretização da invenção, as fermentações resultam para a formação de ácido. Os ácidos preferidos incluem ácido láctico e ácido acético. De um modo preferido, se o método de fermentação resulta na formação de ácido, a substância alvo é queijo, creme de nata, creme de leite, salsicha, chucrute, picles ou vinagre. Em concretizações preferidas, a substância alvo de uma fermentação que resulta na formação de ácido é um produto alimentar. Em concretizações alternativas não alimentares, a substância alvo é o ácido, preferencialmente ácido láctico ou ácido acético, como compostos químicos. Nesta concretização, o ácido é, de preferência, isolado após a fermentação.

[0093] Se a substância alvo é queijo, culturas de partida adequadas compreendem misturas diferentes bactérias do ácido láctico, que estão disponíveis comercialmente. Um exemplo é uma mistura de Lactococcus lactis e Lactococcus cremoris. Outros exemplos são as bactérias do gênero Lactobacillus, Streptococcus ou Propionibacter.

[0094] Neste caso, um meio de cultura adequado compreende vários tipos de produtos lácteos, tais como creme, coalhada ou soro de leite como substrato, tais como, por exemplo, produtos lácteos derivados de leite de vaca, leite de cabra, leite de ovelha, leite de Yak, leite de égua, leite rena, leite alce, leite de búfalo, leite de burro e / ou leite de camelo, preferencialmente de leite de vaca, ou, alternativamente, de leite de soja e / ou leite de amêndoa e / ou outros extractos de plantas ricas em proteínas.

[0095] Se a substância alvo é Chantilly, a cultura compreende, preferencialmente, Lactococcus e / ou de Lactobacillus, de preferência, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, e / ou Lactococcus lactis biovar. Diacetylactis. Alternativamente, podem ser utilizados enzimas creme-endógeno. Um meio de cultura adequado compreende nata, e, de preferência, o meio de cultura consiste de creme. Creme, neste caso é um produto lácteo tal como definido acima, de um modo preferido derivada do leite de vaca.

[0096] Se a substância alvo é creme de leite, a cultura compreende espécies do tipo Lactococcus ou Lactobacillus, enquanto que o meio de cultura compreende creme como substrato, e, de preferência, consiste de creme. Creme, neste caso é um produto lácteo, tal como definido acima, de um modo preferido derivada do leite de vaca.

[0097] Se a substância alvo é salsicha, culturas iniciadoras adequadas compreendem Lactobacillus (fi Lb plantarum, Lb sakei, Lb farmicis, Lbcurvatus), Micrococcus, Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus (S. xylosus e S.carnosus), Kocuria, Leuconostoc e Pediococcus (fi P. acidilacti e P. pentosaceus) ou leveduras como fi Debaryomyces spp. As espécies de leveduras envolvidas na maturação e utilizados para inoculação incluem Penicillium Camemberti, P. rocquefortii e P. nalgiovense e obtido a partir de, por exemplo, Chr. Hansen (Bactoferm ™). Neste caso, um adequado compreende meio de cultura (triturada) como substrato de carne, de preferência (triturada) da carne, carne de veado, cavalo, búfalo, porco, aves ou peixe, sal e açúcar opcionalmente, GDL (Glucono-delta- lactona), ácido cítrico, alho e ervas e especiarias.

[0098] Se a substância alvo é chucrute, culturas iniciadoras adequadas compreendem Leuconostoc, Lactobacillus e Pediococcus. Neste caso, um meio de cultura adequado compreende repolho picado, sal e alcaravia, opcionalmente, aipo e sementes de aneto ou outras ervas e especiarias.

[0099] Se a substância alvo é pickles, leveduras adequadas incluem Lactobacillus e / ou Lactococcus. Neste caso, um meio de cultura adequado compreende pedaços vegetais, bem como fatias, ou vegetais intactas. Os tipos adequados de vegetais incluem repolho, beterraba, pepino, azeitonas e feijão.

[00100] Se a substância alvo é vinagre, culturas iniciadoras adequadas compreendem as espécies Acetobacter. Neste caso, um meio de cultura adequado compreende vinho, cidra ou Mead.

Produtos alimentares como substância alvo

[00101] Em métodos de fermentação, de acordo com a invenção, os resultados de fermentação na formação de ácido ou etanol. No caso da substância alvo é um produto alimentar, o meio de cultura compreende, de preferência, apenas componentes de qualidade alimentar. Ainda mais preferencialmente, se a substância alvo é um produto alimentar, o meio de cultura compreende, como substrato, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo e uma fonte de carbono, que as fontes são de preferência proporcionados por produtos lácteos de qualidade alimentar, carne, vegetais e / ou alcoólica líquido.

[00102] No caso da substância alvo é um produto alimentar, o produto alimentar é geralmente obtido como a mistura completa após a fermentação. No entanto, os produtos alimentares que são para ser isolado a partir da mistura de fermentação não devem ser excluídos, entre os quais chucrute, picles, vinagre, whisky, brandy, conhaque e outras bebidas alcoólicas destiladas.

[00103] No caso da substância alvo é um produto alimentar, a cultura de partida pode compreender um único microorganismo, ou pode compreender dois ou mais microrganismos diferentes, como é conhecido por um produto alimentar em particular. O técnico versado no assunto está bem ciente de leveduras compreendendo vários microrganismos, que após a adição a um meio de cultura com a composição resultados apropriados em um produto alimentar pré-determinado.

[00104] Opcionalmente, o produto alimentar pode ser submetido a um tratamento, após após a fermentação, tal como a adição de aditivos, corantes, intensificadores de sabor, ou mais ingredientes, ou tais como o tratamento térmico adicional, tais como o cozimento, a destilação, a esterilização ou pasteurização, ou dimensionamento apropriado, entre as quais o corte e / ou de moldagem, e adaptação viscosidade apropriada.

[00105] A invenção se refere igualmente a um produto alimentar fermentado como definido acima, em que o produto alimentar não é iogurte, que compreende um inibidor da proteinase de proteína de batata. O inibidor de proteinase de proteína de batata nesta concretização pode ser nativa ou desnaturada. Os produtos alimentares particularmente preferidos são vinho, cerveja, massa de pão, pão, cidra, Mead, queijo, nata, creme de leite fresco, salsicha, chucrute ou picles, de preferência, vinho, cerveja, massa de pão, cidra, Mead, queijo, nata, creme de leite fresco, salsicha, chucrute ou picles, mais de preferência, de queijo, massa de pão, creme de leite, creme de leite fresco, salsicha ou chucrute.

[00106] Para efeitos de clareza e de forma concisa características descrição são aqui descritos como parte da mesma ou separada concretizações, no entanto, será apreciado que o escopo da presente invenção podem incluir concretizações tendo combinações de todas ou algumas das características descritas.

[00107] A invenção será agora ilustrada pelos exemplos seguintes, não limitativos.

Exemplo 1: Redução do tempo de desfasamento em um modelo geral de fermentação

[00108] Um modelo de fermentação geral foi criado em que diferentes microorganismos foram testados pela redução do tempo de retardação através da adição de PPII. Este modelo compreende dois meios diferentes, MRS -Bouillon (MrsB, disponível comercialmente meio padrão) e o chamado MRSC, que é um meio com praticamente os mesmos ingredientes que MrsB mas em vez de peptídeos de caseína, mate (C) é adicionado à médio. Os peptídeos em MrsB consistem geralmente de 5-30 aminoácidos. Dependendo das necessidades de microrganismos, a forma MrsB pode ser um peptídeo ou um sistema limitado hmited não peptídico. As culturas iniciais testadas composta quer culturas de capa única de microrganismos (culturas ATCC) ou culturas com mais do que um tipo de microrganismo.

[00109] MrsB meio foi preparado por dissolução dos seguintes componentes em 850 mL de água desmineralizada e ajustando o pH para 6,5. lOg caseína peptona ( "PB"), digestão tríptica (Fluka 70172) de extracto de lOg de carne (Fluka 70164) de extracto de 5g de levedura (( "YE", Fluka 92144) Glicose 20 g (Merck 1,08342) lg de Tween-80 (Merck 822187) 2 g K2HP04 (Merck 1,05104) 5 g de acetato de Na (Merck 1,06267) 2 g de (NH4) 2 citrato (Sigma-Aldrich 09833) 0,2 g MgS04-7H20 (Sigma-Aldrich M5921) 0,05 g MnS04- H20 (Sigma-Aldrich M7634).

[00110] Na forma MRSC, a peptona de caseína foi substituída por 10 g de caseinato (Fonterra 385). Após dissolução dos componentes, o volume total foi levado a 1000 mL, o pH foi ajustado e o líquido resultante foi esterilizada por autoclave.

[00111] Na forma MRSC, parte dos peptídeos (nutritivos) é substituído com proteína integral sob a forma de caseinato. Isto é feito para demonstrar que a actividade de inibição da proteinase da PPII não inibir as proteinases que os microrganismos necessitam de ser capaz de degradar o caseinato direção peptídeos nutritivos. Quando o PPII iria inibir proteinases dos microorganismos um intervalo de tempo prolongado seria esperado. proteinases os microrganismos são principalmente ligada à membrana e os ptidos feitas neste passo são transportados directamente para a célula de microorganismo. Espera-se, portanto, que peptidases no meio não terá um impacto tão grande quanto na MrsB médio. Espera-se que o meio MRSC é menos pep maré-limitada do que é a forma MrsB.

[00112] Para algumas culturas, o meio YPD foi usado como uma alternativa para MrsB. YPD foi preparado por dissolução de 20 g de caseína peptona ("PB"), digestão tríptica (Fluka 70172) de extracto de lOg de levedura (( "YE", Fluka 92144) Glicose 20 g (Merck 1,08342) em um volume total de 1 L, e o líquido resultante foi esterilizado por autoclave.

[00113] As culturas de cepa única (culturas ATCC) foram testados em MrsB e MRSC meio ou meio YPD. Ver Tabela 1 para uma visão geral de todos as culturas ATCC testadas. A Tabela 2 apresenta uma visão geral das culturas testadas em meio MrsB, MRSC e YPD e a redução do tempo observada.

[00114] As culturas foram desenvolvidas a partir de culturas durante a noite diluídas estacionárias a 30 ° C em uma placa de mictrotiter selado de película em 100 uL de volume total que foi colocada num leitor de placas Multiskan ThermoScientific Ir, agitando periodicamente Tabela 1: Várias culturas de fermentação partida

[00115] Todas as culturas testadas exibiram redução do tempo de atraso com a adição de PPII em MrsB ou meio YPD. A dosagem ótima foi na maior parte dos casos, uma concentração final de 0,50 % em peso de proteína PPII, mas um claro efeito já é mostrado em dosagens muito baixas de 0,05% ou mesmo a proteína PPII 0,01% na formulação final. Na forma MRSC, nenhum tempo de fermentação de alongamento foi observado nestas experiências. Isto confirma a hipótese de que PPII não inibe proteinases dos microorganismos. Em está previsto, no entanto, que a redução do tempo de retardamento pode também ocorrer em sistemas não-limitados- peptídicos. Em meio MrsB todas as culturas apresentaram redução tempo de atraso com a adição de PPII.

[00116] A Tabela 2 também mostra a redução de ganho

[00117] de tempo em horas (h.), bem como em percentagens (% *).

[00118] Estes dados apoiam a ideia de que PPII tem uma actividade estimulante sobre o crescimento microbiano, reduzindo o tempo de latência, por inibição das actividades de peptidase dos microrganismos. Todos os sistemas limitados-peptídicos (MrsB e meio YPD) exibem redução do tempo considerável. O meio mais rico MRSC mostrou um menor efeito estimulante. Todosos experimentos MrsB e MRSC descritos foram executadas no coletor (n> 4).

Exemplo 2: Determinação de se um sistema de fermentação é peptídico-limitado

[00119] O crescimento de Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763) foi analisada em meios com duas concentrações diferentes de peptídeos (YPDIOO (contendo 10 g de extrato de levedura (YE), 20 g de caseína peptona (CP) e 20 g de glucose por litro) e YPD20 (contendo 2 g YE, 4 g CP e 20 g de glucose por litro)) para ver se a actividade estimuladora de LMW é mais forte quando menos peptídeos estão presentes. Isto indica que o crescimento é limitado peptídeo. As culturas foram desenvolvidas a partir de culturas durante a noite diluídas estacionárias a 30 ° C em uma placa de mictrotiter selado de película em 100 uL de volume total que foi colocada num leitor de placas Multiskan ThermoScientific Ir, agitando periodicamente durante 10 segundos cada hora. O crescimento foi analisado medindo a OD600, e redução do tempo para atingir 0,4 OD é uma medida da actividade estimulante de LMW. De facto, um efeito estimulante da adição de 0,1% de LMW para a forma é observada para o crescimento de S. cerevisiae, e este efeito é maior no meio com menos peptídeos.

[00120] Na figura 1, a redução do tempo necessário para atingir OD 0,4, em comparação com as culturas sem LMW, está representada graficamente. Uma redução no tempo 2h ~ (a partir de aproximadamente 9h 7h) é visto quando 0,1% de LMW é adicionado ao meio de peptídeo de baixo, enquanto que com mais peptídeos presente (YPDIOO) o efeito é menor (cerca de lh, a partir de 5 a 4 horas). As reduções de tempo medidos são significativas, tal como determinado por um teste t de Student (p <0,05). No apêndice é mostrada uma curva de crescimento de exemplo para cada condição. Então LMW tem um efeito estimulante sobre o crescimento de S. cerevisiae em meio YPD, e o efeito é mais forte em condições limitadas-peptídicos.

Exemplo 3: Purificação e caracterização do agente estimulador

[00121] Para descobrir que sub-fração de proteína de batata LMW é responsável pela redução do tempo de atraso, um concentrado de proteína de batata foi fraccionado essencialmente de acordo com o método de Pouvreau (L. Pouvreau, H. Gruppen, SR Piersma, LAM van den Broek, GA van Koningsveld, AGJ Voragen J. Agric. Food Chem 2001, 49, p. 2864-2874 "abundância relativa e distribuição Inibitório de Inibidores da Proteinase em sumo de batata do cv. Elkana").

[00122] O concentrado PPII (AVEBE) foi diluído com água desmineralizada para com soluo de proteína a 1% e o pH foi ajustado para 8,0. Os insolúveis foram removidos por centrifugação a 5000 g durante 10 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi carregado em uma coluna de 15 por 2,6 centímetros contendo resina Source 30Q (GE Healthcare) e eluo utilizando um gradiente de NaCl 0 a 0,6 M linear. Isto resultou em frações de 8 discretas de proteína que foram marcados como Fl até F8.

[00123] Frações AH foram testadas quanto atividade estimuladora de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Isto revelou que as frações Fl e F6 exibir uma redução do tempo de desfasamento forte, indicando que o ingrediente activo é nestas frações. As frações F2, F3, F4, F7 e F8 exibir menos redução do tempo de atraso de acordo com estas experiências e F5 não mostra nenhuma redução do tempo de desfasamento em todos. Por isso, o ingrediente activo não está presente em F5. O facto do agente estimulador da ligase à coluna sob as condições experimentais revela que é solúvel em água a um pH de 8,0 e tem um ponto isoeléctrico de 8,0 ou inferior.

[00124] Os pesos moleculares das frações foram determinados com um sistema automatizado Experion electroforese (BioRad) de acordo com as instruções do fabricante sob desnaturação, reduzindo condições. As frações Fl e F6 que contêm um forte estimulante partes actividade várias bandas de MW, mas apenas uma delas está ausente no F5 fração que contém nenhuma atividade estimulante qualquer: a banda ocorre entre 17,5 e 18,2 kDa (Quadro 4). Assim, segue-se que a presença desta banda é indicativa de actividade estimulante forte. Tabela 3: inibidor da proteinase da Proteína de batata fracionada em frações de 8 F1-F8, e o tempo de latência efeito redutor de cada fração.

[00125] Determinação da atividade inibidora de proteinase foi feito pelo método descrito no exemplo 4. Esta revelou que as frações de proteína F 1 e F6 contém ambas tripsinas e quimotripsina actividade inibidora (TIA e CTIA), mas nenhum sobreviveu actividade de um tratamento térmico a 80 ° C por 30 minutos.

Exemplo 4: inibidores de proteinase de proteína de batata para utilização na presente invenção pode ser nativa

[00126] Uma solução de estoque de 30 g / L de azocaseína (Sigma-Aldrich, A2765) foi preparada por dissolução da proteína em mM pH 5,0 Citrato-tampão 100 contendo 5 mM de CaC (Sigma-Aldrich, C3881) a 50 ° C e arrefecer de novo até 37 ° C. Os lisados fúngicos liofilizados que contêm a atividade de proteinase foram dissolvidos em solução 1 Nim HC1. PPII foi dissolvido em solução de acetato de pH 3,0.

[00127] A partir de uma solução PPII uma série de diluições foi preparada de um modo a provocar uma perda de -50% do sinal após a incubação para a concentração da amostra mais alta. De cada diluição, 125 pL foi misturada com 25 pL de solução de proteinase fúngica num copo de Eppendorf, ou com 25 pL de água desmineralizada como um controlo. Os controlos positivos e negativos para a reacção proteolítica utilizado 125 pL de água desmineralizada em vez de material de amostra. A estas misturas foram adicionados 225 pL de azocaseína quente, seguido por uma incubação de 30 minutos a 37,0 ° C. A reacção foi, em seguida, temperada por meio da adição de 150 pL de 15% p:v de solução de ácido tricloroacético ("TCA"). A ordem de adição de azocaseína foi a mesma que a ordem de adição de TCA para garantir tempos de incubação iguais para todas as amostras.

[00128] Azocaseina não hidrolisada e outros produtos insolúveis foram removidos por centrifugação a 15.000 g a 40C durante 10 minutos em um Heraeus Multifuge 1S-R utilizando um rotor Thermo Scientific. 100 pL dos sobrenadantes foram transferidos para uma placa de microtitulação por pipetagem cuidadosa e suplementado com 100 pL de uma solução 1,5 M de NaOH. A placa foi, em seguida, analisada por absorvância a 450 nm num leitor de microplacas BioRad Modelo 680.

[00129] As absorvâncias foram representadas graficamente contra a quantidade de material de amostra na placa. O declive da linha resultante foi obtido por meio de regressão linear, utilizando o método dos mínimos quadrados e indica a quantidade de absorvância perdido por quantidade de material de amostra. O controlo positivo, na ausência de amostra, indica o máximo de absorvância causada pela quantidade conhecida de solução de proteinase. Assim, ao dividir a inclinação pela absorvância dos controles positivos, foi obtida a atividade inibitória da tripsina expressa como a quantidade de protease inibida por quantidade de material de amostra (ver Figura 2).

[00130] Daqui resulta que o PPII utilizada nos presentes experimentos pode ser nativa.

Exemplo 5: Fermentação de malte por Saccharomyces cerevisiae, na presença de inibidores de proteinase da batata

[00131] Duas bateladas de cerveja foram preparadas a partir de extrato de malte e fermento de padeiro. Uma cor clara de extrato de malte extra foi escolhida para facilitar a análise espectroscópica. 150 g / L de Arsegan superior da qualidade de Extrato de Malte (5010012, Munton (Reino Unido)) foram adicionados à água corrente e agitou- se até se dissolver, para formar um mosto.

[00132] 10 mL da cultura durante a noite de Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763) foram adicionados a 4 L de mosto que foi pré-aquecido a 30° C. O mosto foi dividido em duas frações de dois litros. Um deles foi mantido como um controle, enquanto que o outro foi suplementado com 0,1 em peso. % de inibidores da proteinase de batata (Solanic 306P, Avebe). A fermentação foi monitorado por densidade de células (expresso como densidade óptica a 620 nm), a densidade do líquido, como medido por um densímetro, e para a produção de dióxido de carbono expresso em bolhas por minuto. Uma vez que a densidade de álcool é menor do que a da água, a densidade da solução é uma medida da evolução da reacção de fermentação. O volume de CO2 que é produzida é directamente relacionado com a taxa de produção de álcool e, portanto, fornece uma indicação da velocidade da reacção. Quando as densidades das células excederam um DO620 de 2, ahquots foram diluídos com água desmineralizada para permitir uma medição correta. Os valores apresentados foram corrigidos para esta diluição.

[00133] Tabela 4: As densidades celulares, densidades de solução e as taxas de produção de CO2 para a fermentação do mosto por S. cerevisiae na ausência e na presença de 0,1 em peso. % De inibidores da proteinase de batata.

[00134] A presença de inibidores de proteinase da batata resultou em densidades celulares mais elevadas, um decréscimo mais rápido na densidade da solução, e um aumento na taxa de produção de CO2. O aroma da cerveja que foi preparado com os inibidores de proteinase da batata foi caracterizado por uma nota de fruta claro, em contraste com a cerveja de referência que não tinham este atributo.

[00135] A partir destes resultados, pode-se observar que o processo global de fermentação é mais rápido, que é causada por uma diminuição no tempo de atraso. A diminuição do tempo de atraso sob estas condições é de aproximadamente 2 horas.

Exemplo 6: Fermentação chucrute com inibidores de proteinase da batata

[00136] Um repolho branco (adquirido localmente) foi ralado em fatias finas usando um processador de alimento de cozinha equipado com um disco ralador. As fatias de repolho assim obtidas foram tratadas com 15 gramas de sal de mesa por kg de repolho. Este tratamento provoca líquido para extrair das folhas através de um aumento da pressão osmótica, formando, assim, um meio de fermentação. Este líquido foi suplementado com uma quantidade igual de água para facilitar a medição do pH. O meio de fermentação, ainda contendo fatias de repolho foi dividida em duas partes iguais, foram um foi mantido como é, enquanto o outro foi suplementado com 1 g por litro de inibidores de proteinase da batata (Solanic 206P, Avebe). As duas bateladas foram incubadas lado-a-lado, enquanto o pH era medido a cada 15 minutos de registadores de pH calibrado. O tempo necessário para atingir um pH de 4,0 a partir de um pH inicial de 6,0 é mostrada na Tabela 5. Tabela 5: Tempo necessário para baixar o pH de 6,0 a 4,0 por microrganismos endógenos com inibidores de proteinase da batata.

complexa de reações, em que um conjunto de microrganismos cresce para fora em sequência, cada preparando-se, assim, o meio durante as próximos espécies. Desde várias espécies estão envolvidas em diferentes momentos, esta série é difícil de descrever em termos de tempo de atraso. No entanto, a presença de inibidores de proteinase da batata diminui o tempo necessário para atingir um pH de 4,0 por 7 horas, ou 20% do total.

Claims

1. Método para diminuir o tempo de latência em uma fermentação de um meio de cultura para preparar uma substância alvo, caracterizado pelo fato de que a substância alvo não é iogurte, e, em que o método compreende as etapas de primeiro, fornecer a um meio de cultura adequado, uma cultura de partida de fermentação compreendendo um microorganismo que libera ácido ou etanol, segundo, adicionar um inibidor da protease da proteína da batata ao meio de cultura; terceiro, cultivar o microorganismo; e quarto, obter a substância alvo, em que • se o microrganismo libera ácido, o meio de cultura é aquoso e / ou a substância alvo é um ácido ou um produto alimentício selecionado do grupo que consiste em queijo, crème fraiche, creme de leite, salsicha, chucrute, picles e vinagre; ou • se o microrganismo liberta etanol, o meio de cultura é um meio líquido que compreende material vegetal.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fermentação resulta na formação de etanol.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a cultura de partida de fermentação compreende um microrganismo do gênero Saccharomyces, Candida, Zygosaccharomyces, Dekkera ou Brettanomyces.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a substância alvo é selecionada do grupo consistindo em cerveja, vinho, champanhe, vinho espumante, cidra, hidromel, saquê ou bioetanol.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fermentação resulta na formação de ácido.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cultura de partida de fermentação compreende um microorganismo do gênero Acetobacter, Lactococcus, Lactobacillus, Micrococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Kocuria, Leuconostoc, Pediococcus, Debaryomyces, Penicillium ou Leuconostoc.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a substância alvo é ácido láctico ou ácido acético.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade de peptídeos nutritivos livres limita o crescimento do microorganismo.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de inibidor de protease de proteína de batata (gramas de inibidor por litro de meio de cultura) está entre 5 g / l e 0,001 g / l.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a substância alvo é um ácido ou um produto alimentício selecionado do grupo que consiste essencialmente em queijo, crème fraíche, creme de leite, salsicha, chucrute, picles e vinagre