BR112017023578B1 - Método para a preparação de vesículas de gradiente de ph transmembranar - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE VESÍCULAS DE GRADIENTE DE PH TRANSMEMBRANAR. A presente invenção refere-se a um método para a preparação de vesículas de gradiente de pH transmembranar. Esse método é caracterizado pelas etapas a seguir: a) preparar vesículas feitas a partir de pelo menos uma substância de matriz em meio aquoso, tendo uma osmolaridade não maior que 200 mOsm/L, em que a substância da matriz é escolhida do grupo consistindo em lipídios anfifílicos e copolímeros em bloco anfifílicos, b) transferir as vesículas para um tampão básico ou ácido com uma osmolaridade sendo pelo menos 200 mOsm/L maior do que a osmolaridade do meio aquoso da etapa a) para aplicar um choque osmótico às vesículas e obter vesículas preenchidas com tampão, e c) diluir uma mistura do meio aquoso e do tampão básico ou ácido contendo as vesículas preenchidas com tampão pela adição de uma solução neutralizante para obter vesículas de gradiente de pH transmembranares suspensas em um tampão de suspensão, em que o tampão de suspensão difere do tampão ácido ou básico em termos de valor de pH.

Description

Descrição

[0001] A presente invenção refere-se a um método para a preparação de vesículas de gradiente de pH transmembranar de acordo com o preâmbulo da reivindicação 1, a vesículas de gradiente de pH transmembranar de acordo com o preâmbulo da reivindicação 13 e ao uso de tais vesículas de gradiente de pH transmembranar de acordo com o preâmbulo da reivindicação 14.

[0002] A administração intravenosa (Forster em Al. Biomaterials 2012; 33:3578-3585) ou intraperitoneal (Forster et al. Sci Transl Med 2014; 6: 258ra141) das vesículas (por exemplo, lipossomas) com capacidade de carga remota (por exemplo, lipossomas de gradiente de pH transmembranar) recentemente foi descrita como uma abordagem interessante para o tratamento de overdose de drogas e intoxicações causadas por metabólitos endógenos (por exemplo, hiperamonemia). Esses lipossomas possuem um compartimento interno que contém agentes de tamponamento ácidos ou básicos e que permitem o sequestro dos compostos tóxicos em seus estados ionizados através da existência de um gradiente de pH entre o compartimento interno e o ambiente externo.

[0003] De acordo com a técnica anterior, os lipossomas de gradiente de pH transmembranar são geralmente preparados por hidratação em meio ácido ou básico, seguido por titulação (Nichols and Deamer Biochimica et Biophysica Acta 1976; 455:269-271), troca de meio por filtração em gel (Mayer et Al. Biochimica et Biophysica Acta 1985; 816:294- 302), ou diálise (Forster at al. Biomaterials 2012; 33:3578-3585) e, então, são rapidamente usados para encapsular fármacos.

[0004] A esterilização dessas vesículas é, de acordo com a técnica anterior, realizada na formulação final contendo o composto encapsulado. No entanto, esta abordagem não é adequada se um gradiente de pH transmembranar precisar ser mantido por um período de vezes prolongado, como no caso dos agentes de biodesintoxicação e/ou se os lipossomas forem esterilizados sob altas temperaturas. De fato, ao longo do tempo, o gradiente de pH transmembranar diminui devido à difusão de espécies químicas através da membrana lipossomal e/ou à degradação dos componentes lipídicos da bicamada lipídica (principalmente os fosfolipídios). Além disso, a degradação química dos componentes lipossomais (principalmente os fosfolípidos) pode ser acelerada em meios ácidos ou básicos, especialmente se o processo de esterilização envolve calor (por exemplo autoclave).

[0005] Uma solução para este problema descrita por Stevens e Lee (Stevens e Lee Anticancer Res. 2003; 23: 439-442) consiste na preparação de lipossomas liofilizados estéreis que são então suspensos em meio ácido ou básico, seguido pela neutralização para gerar o gradiente de pH transmembranar. Essa abordagem envolve uma etapa de liofilização que geralmente implica na preparação de lipossomas em condições assépticas, um processo que pode ser caro e difícil de controlar, especialmente quando grandes volumes devem ser liofilizados. Essa abordagem, portanto, não é ideal do ponto de vista industrial. Além disso, a rápida ressuspensão de lipossomas liofilizados de maneira reproduzível pode ser problemática se grandes quantidades de lipídios são utilizadas, como no caso de aplicações de biodesintoxicação (por exemplo, diálise peritoneal).

[0006] O documento U.S. 5.393.530 A descreve um método para carregar remotamente vesículas de lipossomas. Desse modo, o carregamento transmembranar é realizado pela mistura de uma solução lipossomal de baixa osmolaridade (concentração osmótica) com a substância a ser encapsulada. Em seguida, a mistura é aquecida até uma temperatura acima da temperatura de transição de lipídio da membrana (Tc) dos lipídeos que compõem a vesícula lipossomal para alcançar uma desestabilização da membrana e incorporar a substância na parte interior das vesículas.

[0007] Bertrand et al. (ACS nano 2010; 4: 7552-7558) descreve um método para a formação de lipossomas de gradiente de pH transmembranar em que um tampão ácido é encapsulado nos lipossomas, em uma primeira etapa. Em uma segunda etapa, um tampão externo ao redor os lipossomas é trocado de modo que um gradiente de pH transmembranar entre o interior e o exterior dos lipossomas formados é estabelecido.

[0008] É um objeto da presente invenção fornecer um processo de fabricação pelos quais as vesículas de gradiente de pH transmembranares estáveis podem ser produzidas de forma simples, sem as limitações anteriormente mencionadas da técnica anterior. Em particular, uma aplicação industrial do processo de fabricação deve ser possível.

[0009] Esse objeto é alcançado por um método para a preparação das vesículas de gradiente de pH transmembranares com as características da reivindicação 1.

[0010] Tal método compreende as etapas explicadas a seguir. Em uma primeira etapa, as vesículas feitas de pelo menos uma substância matriz são preparadas em meio aquoso, tendo uma osmolaridade de não mais de 200 mOsm/L. Em uma modalidade, a osmolaridade do meio aquoso é igual ou menor que 150 mOsm/l, em particular, igual ou menor que 100 mOsm/L, em particular igual ou menor que 75 mOsm/L, em particular igual ou menor que 50 mOsm/L, em particular igual ou menor que 25 mOsm/L, em particular igual ou menor que 10 mOsm/L, em particular igual ou menor que 5 mOsm/L ou em particular igual ou menor que 1 mOsm/L. Em uma modalidade, a osmolaridade está na faixa de 1 mOsm/L a 200 mOsm/L, ou na faixa construída a partir de qualquer uma das osmolaridades acima mencionadas (como 10 mOsm/L a 150 mOsm/L, etc.).

[0011] Em uma segunda etapa, as vesículas são misturadas com um tampão básico ou ácido com uma osmolaridade sendo pelo menos 200 mOsm/L maior do que a osmolaridade do meio aquoso da etapa a) para aplicar um choque osmótico às vesículas e obter vesículas preenchidas com tampão. Em uma modalidade, a osmolaridade do tampão ácido ou básico é pelo menos 220 mOsm/L maior do que a osmolaridade do meio aquoso da etapa a), em particular, pelo menos 250 mOsm/L maior, em particular pelo menos 300 mOsm/L maior, em particular pelo menos 350 mOsm/L superior , em particular pelo menos 400 mOsm/L maior, em particular pelo menos 450 mOsm/L maior, em particular pelo menos 500 mOsm/L maior e, em particular, pelo menos 550 mOsm/L maior. Em uma modalidade, a osmolaridade do tampão ácido ou básico está em uma faixa de 200 mOsm/L a 550 mOsm/L maior do que a osmolaridade do meio aquoso da etapa a) ou em uma faixa formada a partir de qualquer uma das osmolaridades anteriormente mencionadas (por exemplo, 220 mOsm/L a 500 mOsm/L, etc.).

[0012] Assim, o tampão ácido ou básico é um tampão hiperosmótico em relação ao meio aquoso utilizado na primeira etapa. Ao fazer isso, um choque osmótico é extemporaneamente aplicado às vesículas. Este choque osmótico resulta na incorporação do tampão ácido ou básico dentro das vesículas. Assim, o choque osmótico serve para uma desestabilização de curto prazo das vesículas para permitir a incorporação de tampão nas vesículas. Com isso, se formam vesículas preenchidas com tampão. Em uma modalidade, o tampão hiperosmótico também pode conter eletrólitos que são usados para modular a osmolaridade ou têm uma função fisiológica.

[0013] Deve-se notar que uma quantidade suficiente de tampão ácido ou básico deve ser adicionada às vesículas suspensas no meio aquoso pois, de outro modo, nenhum choque osmótico será obtido. Uma quantidade suficiente pode ser - dependendo da diferença entre a osmolaridade do meio aquoso e a osmolaridade do tampão ácido ou básico - um volume que corresponde a pelo menos 0,1 vez o volume do meio aquoso utilizado na primeira etapa, em particular pelo menos 0,3 vez, em particular, pelo menos 0,5 vez, em particular, pelo menos 0,8 vez, em particular, pelo menos 1,5 vez, em particular, pelo menos 2 vezes, em particular, pelo menos 2,5 vezes, em particular, pelo menos 3 vezes e, em particular, pelo menos 5 vezes. Em uma modalidade, o tampão básico ou ácido pode ser adicionado em um volume que iguala ao volume do meio aquoso. Em uma modalidade, o volume do tampão ácido ou básico a ser adicionado pode ser 0.1 vez a 5 vezes o volume da suspensão aquosa vesical ou qualquer outra faixa que pode ser formada a partir dos valores anteriormente mencionados (por exemplo, 0,3 vez a 3 vezes, etc.).

[0014] Em uma modalidade, o valor de pH do tampão hiperosmótico está em uma faixa de pH 1 a pH 6,9, em especial, de pH 1,5 a pH 6,5, em particular, de pH 2,0 a pH 6,0, em particular, de pH 2,5 a pH 5,5, em particular, de pH 3,0 a pH 5,0, em particular, de pH 3,5 a pH 4,5 e, em particular, de pH 3,0 a pH 3,5.

[0015] Em uma modalidade, o valor de pH do tampão hiperosmótico está em uma faixa de pH 7,1 a pH 14, em particular, de pH 7,5 a pH 13,5, em particular, de pH 8,0 a pH 13,0, em particular, de pH 8,5 a pH 12,5, em particular, de pH 9,0 a pH 12,0, em particular, de pH 9,5 a pH 1 1,5, em particular, de pH 10,0 a pH 11,0 e, em particular, de pH 10,5 a pH 11,0,

[0016] Em uma modalidade, o tampão hiperosmótico pode conter agentes químicos adicionais, como um agente complexante ou um agente quelante.

[0017] Em uma terceira etapa, uma mistura do meio aquoso e do tampão básico ou ácido contendo as vesículas preenchidas com tampão é diluída pela adição de uma solução aquosa neutralizante. A mistura do tampão básico ou ácido e da solução de neutralização compõe um tampão de suspensão. Assim, após a diluição, vesículas de gradiente de pH transmembranares suspensas no tampão de suspensão se formam. Desse modo, o pH do tampão de suspensão difere do tampão básico ou ácido contido nas vesículas preenchidas com tampão. A diferença de pH é, em uma modalidade, igual a pelo menos 1 unidade de pH, em particular pelo menos igual a 1,5 unidade de pH, em particular pelo menos igual a 2 unidades de pH, em particular pelo menos igual a 2,5 unidades de pH, em particular pelo menos igual a 3 unidades de pH, em particular pelo menos igual a 3,5 unidades de pH, em particular pelo menos igual a 4 unidades de pH, em particular pelo menos igual a 4,5 unidades de pH, em particular pelo menos igual a 5 unidades de pH, em particular pelo menos igual a 5,5 unidades de pH, em particular pelo menos igual a 6 unidades de pH, em particular pelo menos igual a 6,5 unidades de pH e, em particular, pelo menos igual a 7 unidades de pH.

[0018] Em uma modalidade, o valor de pH da solução neutralizante está em uma faixa de pH 7,1 a pH 14, em particular, de pH 7,5 a pH 13,5, em particular, de pH 8,0 a pH 13,0, em particular, de pH 8,5 a pH 12,5, em particular, de pH 9,0 a pH 12,0, em particular, de pH 9,5 a pH 11,5, em particular, de pH 10,0 a pH 11,0 e, em particular, de pH 10,5 a pH 11,0.

[0019] Em uma modalidade, o valor de pH da solução neutralizante está em uma faixa de pH 1 a pH 6,9, em particular, de pH 1,5 a pH 6,5, em particular, de pH 2,0 a pH 6,0, em particular, de pH 2,5 a pH 5,5, em particular, de pH 3,0 a pH 5,0, em particular, de pH 3,5 a pH 4,5 e, em particular, de pH 3,0 a pH 3,5.

[0020] Devido às diferenças do tampão de suspensão e do tampão básico ou ácido, um gradiente de pH transmembranar entre a parte interna das vesículas e o tampão de suspensão circundante é obtido.

[0021] Em uma modalidade, as vesículas preparadas na primeira etapa são esterilizadas de modo a obter vesículas esterilizadas ou uma solução líquida contendo vesículas esterilizadas. Em seguida, essas vesículas esterilizadas são utilizadas ao realizar a segunda etapa do processo de fabricação explicado acima. Nessa segunda etapa, um tampão básico ou ácido esterilizado é usado em uma modalidade. Ao fazer isso, vesículas preenchidas com tampão totalmente estéreis, ou uma solução totalmente estéril contendo vesículas preenchidas com tampão pode ser preparada. A esterilização pode ser realizada, por exemplo, por filtração estéril ou autoclavagem.

[0022] Em outra modalidade, as vesículas são armazenadas por um primeiro período de tempo antes de realizar a etapa de misturar as vesículas (ou a solução contendo as vesículas) com o tampão básico ou ácido. Esse armazenamento pode ser feito de uma maneira muito adequada, se as vesículas são esterilizadas após a primeira etapa de preparação porque, dessa forma, pouco ou nenhum processo de degradação ocorrerá na suspensão das vesículas esterilizadas. O primeiro período de tempo pode ser de um dia, alguns dias, uma semana, várias semanas, um mês ou até mesmo vários meses. Deve-se notar que as vesículas esterilizadas contidas em meio aquoso são entidades estáveis. Como elas não contêm qualquer tampão ácido ou básico específico, como mais tarde, ao usar as vesículas, nenhuma perda de tampão devido à degradação da vesícula ou vazamento das vesículas deve ser temido. Isso também é verdadeiro se as vesículas, em uma modalidade, contêm pequenas quantidades de moléculas de eletrólitos, uma vez que uma osmolaridade adequada dentro das vesículas estaria, portanto, em uma faixa entre 1 mOsm/L e 200 mOsm/L. Além disso, como as vesículas são mantidas em meio aquoso durante o armazenamento, não há desvantagens, como no caso em que ocorre a liofilização das vesículas.

[0023] Com a incorporação do tampão ácido ou básico é alcançada por um forte choque osmótico, nenhuma desestabilização da vesículas através de uma temperatura maior é necessária. Em particular, não é necessário aquecer as vesículas em uma temperatura acima da temperatura de transição da substância matriz usada para preparar as vesículas. Foi bastante surpreendente descobrir que a etapa de incorporação de tampão nas vesículas não precisa ser realizada acima da temperatura de transição de fase lipídica da membrana, se os lipídios são utilizados como substância matriz.

[0024] Portanto, em uma modalidade, a segunda etapa do método é realizada a uma temperatura que é abaixo de uma temperatura de transição de fase da substância matriz. Tal temperatura de transição de fase pode ser a temperatura de transição de lipídio da membrana se um lipídio for utilizado como substância matriz.

[0025] Em uma modalidade, a segunda etapa do método é realizada a uma temperatura igual a 35 °C ou menos, em particular, de 30 °C ou menos, em particular, de 25 °C ou menos, em particular, de 20 °C ou menos, em particular, de 15 °C ou menos e, em particular, de 10 °C ou menos. Para dar um exemplo, uma faixa de temperatura adequada para realizar a segunda etapa é de 15 a 35 °C. Além disso, outras faixas de temperatura usando as temperaturas anteriormente mencionadas podem ser construídos acima, como desejado e necessário (por exemplo, de 10 a 30 °C, etc.). Em outra modalidade, o método de fabricação como um todo é realizado nas temperaturas ou nas faixas de temperatura acima mencionadas (em algumas modalidades, excluindo o processo de esterilização, ou seja, em particular, se o processo de esterilização é realizado como esterilização em autoclave).

[0026] Em uma modalidade, a solução neutralizante tem uma osmolaridade entre 250 mOsm/L e 550 mOsm/L, em particular, entre 270 e 520 mOsm/L, em particular, entre 290 e 500 mOsm/L, em particular, entre 300 e 480 mOsm/L, em particular, entre 320 e 450 mOsm/L, em particular, entre 420 e 330 mOsm/L e, em particular, entre 350 e 400 mOsm/L.

[0027] Em uma modalidade, a solução neutralizante tem uma osmolaridade que é menor que 200 mOsm/L mais alta ou mais baixa do que a osmolaridade da mistura contendo as vesículas contendo tampão (ou seja, a solução das vesículas contendo tampão), em particular, menor que 150 mOsm/L mais alta ou mais baixa, em particular, menor que 100 mOsm/L mais alta ou mais baixa, em particular, menor que 50 mOsm/L mais alta ou mais baixa, em particular, menor que 20 mOsm/L mais alta ou mais baixa e, em particular, menor que 10 mOsm/L mais alta ou mais baixa. Em uma modalidade, a diferença de osmolaridade entre a solução neutralizante e a mistura contendo as vesículas contendo tampão é entre 1 mOsm/L a 200 mOsm/L, em particular, entre 10 mOsm/L a 150 mOsm/L, em particular, entre 20 mOsm/L a 100 mOsm/L, em particular, entre 30 mOsm/L a 80 mOsm/L e, em particular, entre 40 mOsm/L a 60 mOsm/L.

[0028] Em uma modalidade, a osmolaridade do tampão hiperosmóticos é igual ou superior a 250 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 300 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 350 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 400 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 450 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 500 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 550 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 600 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 700 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 800 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 900 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 1000 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 1100 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 1200 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 1300 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 1400 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 1500 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 1600 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 1700 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 1800 mOsm/L, em particular, igual ou superior a 1900 mOsm/L e, em particular, igual ou superior a 2000 mOsm/L. Em uma modalidade, a osmolaridade está na faixa de 250 mOsm/L a 2000 mOsm/L, ou na faixa formada a partir de qualquer uma das osmolaridades acima mencionadas (como 300 mOsm/L a 1400 mOsm/L, etc.)..

[0029] Em uma modalidade, a mistura do meio aquoso e do tampão básico ou ácido, em que as vesículas preenchidas com tampão são suspensas no final da etapa b), possui uma osmolaridade de pelo menos 200 mOsm/L, em particular, de pelo menos 220 mOsm/L, em particular, de ao menos 250 mOsm/L, em particular, de ao menos 300 mOsm/L, em particular, de ao menos 350 mOsm/L, em particular, de ao menos 400 mOsm/L, em particular, de ao menos 450 mOsm/L, em particular, de ao menos 500 mOsm/L e, em particular, de ao menos 550 mOsm/L. Em uma modalidade, a osmolaridade está na faixa de 200 mOsm/L a 550 mOsm/L, ou na faixa formada a partir de qualquer uma das osmolaridades acima mencionadas (como 220 mOsm/L a 500 mOsm/L, etc.).

[0030] Em uma modalidade, a solução neutralizante tem uma composição que serve para não romper as vesículas preenchidas com tampão de modo a não desestabilizar essas vesículas. Ela pode conter espécies neutralizantes (básicas ou ácidas, como bases fracas ou ácidos fracos), mas também agentes químicos usados para ajustar a osmolaridade e/ou fornecer uma função fisiológica. Verificou-se que a adição de glicerol e tris((hidroximetil)aminometano) (TRIS) à solução neutralizante é particularmente interessante, pois permite a inclusão de altas concentrações de sais de cálcio. Os sais de cálcio podem ser adicionados no processo de preparação para neutralizar os efeitos anticoagulantes de alguns ácidos fracos (por exemplo, ácido cítrico). Isso é particularmente importante, pois as vesículas devem ser usadas em aplicações in vivo. Também podem ser usados como ingredientes da solução neutralizante o hidróxido de sódio, sais de sódio (como o NaCl), sais de magnésio, sais de lactato, glicerol, icodextrina, glicose, sorbitol, frutose, aminoácidos ou xilitol.

[0031] Em uma modalidade, o valor de pH do tampão de suspensão contendo as vesículas de gradiente de pH transmembranares está na faixa de 5,5 a 8,5, em particular, de 6,0 a 8,00, em particular, de 6,5 a 7,7, em particular, de 6,8 a 7,5 e, em particular, de 7,0 a 7,4. Assim, o tampão de suspensão pode ter um valor de pH fisiológico.

[0032] Em uma modalidade, o meio aquoso não é nem um ácido ou uma base, mas tem um valor de pH de cerca de 7, por exemplo, na faixa de 6,0 a 7,5, em particular, de 6,1 a 7,4, em particular, de 6,2 a 7,3, em particular, de 6,3 a 7,2, em particular, de 6,4 a 7,1 , em particular, de 6,5 a 7,3, em particular, de 6,6 a 7,3, em particular, de 6,7 a 7,3, em particular, de 6,8 a 7,3, em particular, de 6,9 a 7,1 , em particular, de 6,95 a 7,01 e, em particular, um valor de pH 7,0. Assim, o meio aquoso também pode ser referido como um meio aquoso neutro.

[0033] Em uma modalidade, o meio aquoso é escolhido dentre o grupo consistindo em água, soluções aquosas de sais orgânicos, soluções aquosas de sais inorgânicos, soluções aquosas de substâncias orgânicas e combinações dos mesmos.

[0034] Em uma modalidade, o meio aquoso é escolhido a partir do grupo consistindo em soluções aquosas de sais orgânicos com um valor de pH de cerca de 7, soluções aquosas de sais inorgânicos tendo um valor de pH de cerca de 7, soluções aquosas de substâncias orgânicas tendo um valor de pH de cerca de 7, água e combinações dos mesmos.

[0035] A água pode, por exemplo, ser água destilada, água deionizada, água ultrapura ou qualquer outro tipo de água purificada. Ao usar sais orgânicos ou inorgânicos, ou outros compostos orgânicos, estes sais ou compostos estão presentes em meio aquoso, em uma modalidade, em uma concentração baixa, a fim de manter uma diferença de osmolaridade entre o meio aquoso e o tampão hiperosmótico, provocando o choque osmótico cuja diferença é grande o suficiente para induzir a difusão do tampão hiperosmótico ácido ou básico no compartimento interno da vesícula.

[0036] O meio aquoso é um meio que se assemelha à água (em especial no que diz respeito ao pH), mas que pode conter uma baixa concentração de sais ou compostos, por exemplo, para tamponar o valor de pH em uma faixa neutra. Em uma modalidade, a osmolaridade do meio aquoso está em uma faixa entre 0 mOsm/L e 49 mOsm/L, em particular entre 5 mOsm/L e 45 mOsm/L, em particular entre 10 mOsm/L e 40 mOsm/L, em particular entre 15 mOsm/L e 35 mOsm/L, em particular entre 20 mOsm/L e 30 mOsm/L e, em particular, entre 25 mOsm/L e 28 mOsm/L.

[0037] Em uma modalidade, a substância da matriz é escolhida do grupo consistindo em lipídios anfifílicos e copolímeros em bloco anfifílicos. Se forem usados lipídios anfifílicos, os lipossomas são formados como vesículas. Lipossomas adequados são vesículas multilamelares (MLV), pequenas vesículas unilamelares (SUV) e grandes vesículas unilamelares (LUV).

[0038] Se forem usados copolímeros em bloco anfifílicos, os polimerossomos são formados como vesículas. Copolímeros em bloco anfifílicos adequados são copolímeros em dibloco ou tribloco lineares. Os copolímeros em bloco podem ter um bloco que é hidrofóbico e um ou dois outros blocos que são hidrofílicos. Copolímeros em forma de pente também são possíveis, onde um bloco de estrutura de tal copolímero em forma de pente pode ser hidrofílico, e os ramos do pente podem ser hidrofóbicos. Copolímeros em bloco dendronizados também são possíveis, em que uma porção de dendrímeros desses copolímeros pode ser hidrofílica. Em todos os casos, os blocos hidrofílicos podem ser compostos por poli(etilenoglicol) (PEG/PEO) ou poli(2-etiloxazolina). Além disso, blocos hidrofóbicos podem ser feitos em todos os casos de poli(dimetilsiloxano) (PDMS), poli(caprolactona) (PCL), poli(lactídeo) (PLA) ou poli(metacrilato de metila) (PMMA).

[0039] Em uma modalidade, a substância matriz é pelo menos um lipídeo anfifílico escolhido do grupo que consiste em dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), 1,2-diestearoil-sn- glicero-3-fosfoetanol-amino-N-[metóxi(PEG)-2000] (DSPE- PEG), colesterol e 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3- fosfocolina(POPC), e suas combinações.

[0040] Em um aspecto, a presente invenção reivindicada também se refere às vesículas de gradiente de pH transmembranares que podem ser obtidas por um método de acordo com as explicações dadas acima. Essas vesículas de gradiente de pH transmembranares diferem em suas estabilidades de vesículas conhecidas a partir da técnica anterior. Isso é devido às diferenças estruturais que resultam dos processo de fabricação específicos descritos acima. Assim, as vesículas feitas de acordo com o processo explicado acima ainda não são conhecidas na técnica anterior.

[0041] Em um aspecto, o uso dessas vesículas de gradiente de pH transmembranares como agente desintoxicante in vitro ou in vivo (em seres humanos ou animais, em particular mamíferos ou roedores) é reivindicado. Elas podem ser usadas para extrair e se ligar a substâncias indesejáveis, tais como a uma overdose de fármacos e venenos (ou seus metabolitos) ou a grandes quantidades de metabólitos endógenos, que pode resultar em intoxicações. São exemplos de substâncias que podem ser absorvidas pelas vesículas de gradiente de pH transmembranares amônia e ácido propiônico. A remoção de amônia e ácido propiônico de uma solução (in vivo ou in vitro) resulta na desintoxicação de tal solução de amônia e/ou de ácido propiônico.

[0042] Todas as modalidades divulgadas nesse documento podem ser combinadas de qualquer forma desejada. As modalidades do método descrito podem ser transferidas para as vesículas descritas e os usos descritos, e vice- versa.

[0043] Mais aspectos e detalhes da presente invenção serão explicados em relação às figuras e aos exemplos a seguir. Nas figuras:

[0044] A figura 1 mostra traços do detector de aerossol com carga-HPLC de uma modalidade de uma suspensão aquosa lipossomal antes da esterilização a vapor (painel superior) e após a esterilização a vapor (painel inferior); e

[0045] A figura 2 mostra a concentração de lipídios relativa de uma modalidade dos lipossomas antes e após a esterilização a vapor.

EXEMPLO 1

[0046] Formulação dos lipossomas. Os lipossomas compostos por dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC, lipoide), colesterol (Sigma-Aldrich) e 1,2-diestearoil-sn-glicero-3- fosfoetanol-amino-N-[metóxi(PEG)-2000] (DSPE-PEG, lipoide) em 85:14:1% em mol foram preparados pelo método de hidratação de filme. 1685 mg de DPPC, 146 mg de colesterol e 75 mg de DSPE-PEG foram codissolvidos em 10 mL de diclorometano:metanol 95:5% v/v. O solvente orgânico foi posteriormente removido por rotaevaporação e o filme lipídico foi mantido sob vácuo de um dia para o outro. O filme seco foi hidratado com 27 mL de água ultrapura (concentração de lipídios = 100 mM) sob aquecimento e misturação lenta durante 45 min a 56 °C e, finalmente, ele foi esterilizado em frascos vedados por autoclavagem 20 min a 121 °C.

[0047] Estabilidade. Os lipossomas foram submetidos à esterilização a vapor em uma autoclave para avaliar sua degradação pelo calor aplicado. Sabe-se que os lipossomas preenchidos com um ácido ou uma base estão sujeitos à hidrólise ácida ou básica, respectivamente. Os lipossomas instantaneamente formados não degradam de modo algum devido à esterilização a vapor.

[0048] Como mostrado na figura 1, vestígios de detector de aerossol com carga-HPLC (CAD) de suspensão aquosa lipossomal antes da esterilização a vapor (painel superior da figura 1) e após a esterilização a vapor (painel inferior da figura 1) se sobrepõem.

[0049] Esses resultados são confirmados por uma avaliação da concentração de lipídios relativa dos lipossomas. Como pode ser notado na figura 2, a concentração de lipídios relativa manteve-se estável após a esterilização a vapor em comparação com a concentração de lipídios relativa antes da esterilização a vapor. Se a hidrólise fosse observada, a concentração de lipídios teria diminuído.

[0050] Choque osmótico. Os lipossomas assim obtidos foram incubados 30 min com 27 mL de tampão citrato 400 mM (pH 2, 700 mOsm/L) contendo ácido cítrico (ácido cítrico mono-hidratado) 290 mM, citrato de cálcio (citrato de cálcio tribásico tetra-hidratado) 55 mM e HCl 80 mM. A incubação foi realizada sob agitação orbital, em temperatura ambiente.

[0051] Geração de gradiente. O gradiente de pH transmembranar foi gerado pela neutralização do meio ácido externo com 106 mL de solução de neutralização (pH = 10,6, 410 mOsm/L) feita por Tris (tris(hidroximetil)aminometano, Panreac Applichem) 280 mM e cloreto de cálcio (cloreto de cálcio desidratado, Merck Millipore) 50 mM. A formulação de lipossomas resultante 16,9 mM, pH 7,4, 312 mOsm/L foi usada para estudos de absorção de amônia in vitro.

[0052] Absorção de amônia in vitro. As células de difusão lado a lado (PermGear) mantidas a 37 °C foram usadas para monitorar a absorção de amônia em solução salina tamponada com HEPES (20 mM, 300 mOsm/L). Os lipossomas foram isolados fisicamente em um lado do sistema de câmara dupla por uma membrana de policarbonato (tamanho de poro = 100 nm, Steriltech). As concentrações de lipossomas e de amônia no interior das células de difusão foram 4,2 e 1,5 mM, respectivamente. No tempo alocado, alíquotas de 50 μL foram amostradas do compartimento livre de lipossomas e a concentração de amônia foi avaliada por ensaio enzimático (kit enzimático de amônia, Sigma-Aldrich). A absorção de amônia foi quantificada por meio das seguintes equações (Eq. 1 e 2):

[0053] Após 5 h de incubação, a absorção de amônia, calculada conforme a Eq. 2, foi 82 ± 5%.

EXEMPLO 2

[0054] Formulação dos lipossomas. Os lipossomas compostos por DPPC, colesterol e DSPE-PEG foram preparados e esterilizados conforme acima descrito (Exemplo 1).

[0055] Choque osmótico. Os lipossomas assim obtidos foram incubados 30 min com 13,5 mL de tampão citrato 600 mM (pH 2, 1040 mOsm/L) contendo ácido cítrico 490 mM, citrato de cálcio 55 mM, cloreto de sódio (Fischer Scientific) 125 mM e HCl 135 mM. A incubação foi realizada sob agitação orbital, em temperatura ambiente.

[0056] Geração de gradiente. O gradiente de pH transmembranar foi gerado diluindo os lipossomas com 119,5 mL de solução de neutralização (pH 10,6, 440 mOsm/L) feita de Tris 160 mM, cloreto de cálcio 35 mM e cloreto de sódio 100 mM. A formulação de lipossomas final com 16,9 mM, pH 7,5 foi usada para estudos de absorção de amônia in vitro.

[0057] Absorção de amônia in vitro. A absorção de amônia in vitro foi estudada por meio de células de difusão lado a lado, como descrito acima (exemplo 1). Após 5 h de incubação, a absorção média de amônia dentro os lipossomas foi 92 ± 8%.

EXEMPLO 3

[0058] Formulação dos lipossomas. Os lipossomas compostos por DPPC, colesterol e DSPE-PEG foram preparados e esterilizados conforme acima descrito (Exemplo 1).

[0059] Choque osmótico. O choque osmótico foi realizado incubando os lipossomas, conforme descrito no exemplo 2.

[0060] Geração de gradiente. O gradiente de pH transmembranar foi gerado diluindo os lipossomas com 119,5 mL de solução de neutralização (pH = 12,7, 480 mOsm/L) de hidróxido de sódio 155 mM, glicerol 210 mM, cloreto de cálcio 20 mM e Tris 20 mM. A formulação de lipossomas resultante 16,9 mM tinha pH 6 e 341 mOsm/L.

[0061] Absorção de amônia in vitro. A absorção de amônia in vitro foi estudada por meio de células de difusão lado a lado, como descrito acima (exemplo 1). A absorção de amônia média após 5 h de incubação foi 96 ± 3%.

EXEMPLO 4

[0062] Formulação dos lipossomas. Os lipídeos compostos de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC, lipoide), colesterol e DSPE-PEG 54:45:1 % em mol foram preparados pelo método de hidratação de filme. 1108 mg de POPC, 469 mg de colesterol e 75 mg de DSPE-PEG foram codissolvidos em 10 mL de diclorometano:metanol 95:5% v/v. O solvente orgânico foi posteriormente removido por rotaevaporação e o filme lipídico foi mantido sob vácuo de um dia para o outro. O filme seco foi hidratado com 27 mL de água ultrapura (concentração de lipídios = 100 mM) sob aquecimento e misturação lenta durante 30 min a 56 °C e, finalmente, ele foi esterilizado em frascos vedados por autoclavagem 20 min a 121 °C.

[0063] Choque osmótico. O choque osmótico foi realizado incubando os lipossomas, conforme descrito no exemplo 2.

[0064] Geração de gradiente. O gradiente de pH transmembranar foi gerado diluindo os lipossomas com 119,5 mL de solução de neutralização (pH = 12,7, 480 mOsm/L) de hidróxido de sódio 150 mM, glicerol 220 mM, cloreto de cálcio 10 mM e Tris 20 mM. A formulação de lipossomas resultante 16,9 mM tinha pH 7,4 e 350 mOsm/L.

[0065] Absorção de amônia in vitro. A absorção de amônia in vitro foi estudada por meio de células de difusão lado a lado, como descrito acima (exemplo 1). Após 5 h de incubação, a absorção de amônia foi 53,5 ± 8,7%.

EXEMPLO 5

[0066] Formulação dos lipossomas. Os lipossomas compostos por DPPC, colesterol e DSPE-PEG foram preparados e esterilizados conforme acima descrito (Exemplo 1).

[0067] Choque osmótico. Os lipossomas foram incubados com 13,5 mL. de tampão acetato de cálcio (pH 10, 1050 mOsm/L) durante 30 min, sob agitação orbital, em temperatura ambiente. O tampão continha acetato de cálcio 350 mM e hidróxido de sódio 0,75 mM.

[0068] Geração de gradiente. Os lipossomas foram diluídos com 33 mL de uma solução (pH = 6,7, 380 mOsm/L) contendo glicerol 230 mM, cloreto de sódio 50 mM, Tris 20 mM e ácido acético 20 mM. A formulação de lipossomas resultante 30 mM, pH 7, 335 mOsm/L foi usada para estudos de absorção de ácido propiônico in vitro.

[0069] Absorção in vitro de ácido propiônico. As células de difusão lado a lado, mantidas a 37 °C, foram usadas para monitorar a absorção in vitro de uma solução de ácido propiônico marcada com 1% de ácido propiônico [1-14C] (50 mCi/mmol, BIOTREND Chemikalien). Os lipossomas foram isolados fisicamente em um lado do sistema de câmara dupla por uma membrana de policarbonato (tamanho de poro = 100 nm). As concentrações de lipossomas e de ácido propiônico nas células de difusão foram 4,2 e 1,5 mM, respectivamente, após diluição com solução salina tamponada com HEPES (20 mM, 300 mOsm/L). Nos intervalos de tempo previstos (6-30 min, 12-3-4-5h), alíquotas de 50 μL foram amostradas do compartimento isento de lipossomas, misturado com 3 mL de coquetel Ultima Gold (Elmer Perking) e a radioatividade (decaimento beta) em cada amostra foi avaliada por contagem de cintilação (Contador de cintilação LS 6500, Beckman). A concentração de metabólito foi determinada comparando o decaimento com uma curva de calibração, cuja linearidade foi verificada na faixa de 31 μM a 2 mM. A absorção de ácido propiônico (PA) foi quantificada por meio das seguintes equações (Eq. 3 e 4):

[0070] Após 5 h de incubação, a absorção de ácido propiônico, calculada conforme a eq. 4, foi 25 ± 3%.

EXEMPLO 6

[0071] Formulação dos lipossomas. Os lipossomas compostos por DPPC, colesterol e DSPE-PEG foram preparados e esterilizados conforme acima descrito (Exemplo 1).

[0072] Choque osmótico. Os lipossomas assim obtidos foram incubados 30 min com 13,5 mL de tampão citrato 600 mM (pH 2, 1050 mOsm/L) contendo ácido cítrico 490 mM, citrato de cálcio 15 mM, citrato de sódio (Sigma-Aldrich) 74 mM, citrato de magnésio (Applichem Panreac) 6 mM, cloreto de sódio 35 mM e HCl 178 mM. A incubação foi realizada sob agitação orbital, em temperatura ambiente.

[0073] Geração de gradiente. O gradiente de pH transmembranar foi gerado diluindo os lipossomas com 279,5 mL. de solução de neutralização (pH = 12,6, 360 mOsm/L) feito com hidróxido de sódio 43 mM, xilitol (ABCR Gmbh) 260 mM, cloreto de cálcio 1 mM, Tris 20 mM e cloreto de sódio 15 mM. A formulação de lipossomas resultante 8,4 mM, pH 6,4, 350 mOsm/L foi usada para estudos de absorção de amônia in vivo.

[0074] Absorção de amônia in vivo. Seis ratos Sprague-Dawley machos adultos (pesando cerca de 300 g; Charles River Laboratories) foram aclimatados durante 5 dias ao ambiente; eles tiveram acesso à comida e água ad libitum, e seguiram um ciclo de claro/escuro de 12h. No dia do experimento, a solução de diálise recém-preparada 16,7 mM foi pré-aquecida até 37° C e lentamente infundida (60 mL/Kg) na cavidade peritoneal de ratos mantidos sob anestesia com isoflurano (2,5% no fluxo de oxigênio de 0,8 mL/min). A instilação foi realizada com uma agulha hipodérmica de calibre 20. No tempo previsto, os ratos foram rapidamente anestesiados (utilizando inalação de isoflurano, em condições similares), e cerca de 400 μL de dialisado foi retirado através de uma punção abdominal estéril com um cateter de silicone perfurado de calibre 22 (Venflon; Becton Dickinson). As alíquotas foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e mantidas a -80 °C para determinar o conteúdo de amônia adicional por ensaio enzimático (ensaio enzimático de amônia, Sigma-Aldrich). Antes de realizar o ensaio, 100 μL de cada amostra foram diluídos com 50 μL de Triton X-100 (3%) e submetidas a ultrassom, em um banho de ultrassom durante 5 min. O experimento com animais foi realizado de acordo com os procedimentos e protocolos aprovados pelas autoridades veterinárias cantonais (Kantonales Veterinaramt Zurique). No final do experimento, os animais foram sacrificados por asfixia com dióxido de carbono, seguido de toracotomia. A concentração de amônia média encontrada nas amostras do dialisado após 4 h de tratamento foi 1,25 ± 0,2 mM.

Claims (15)

1. Método para a preparação de vesículas de gradiente de pH transmembranar, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) preparar vesículas feitas a partir de pelo menos uma substância de matriz em meio aquoso, tendo uma osmolaridade não maior que 200 mOsm/L, em que a substância da matriz é escolhida do grupo consistindo em lipídios anfifílicos e copolímeros em bloco anfifílicos, b) misturar as vesículas com um tampão básico ou ácido com uma osmolaridade sendo pelo menos 200 mOsm/L maior do que a osmolaridade do meio aquoso da etapa a) para aplicar um choque osmótico às vesículas e obter vesículas preenchidas com tampão, e c) diluir uma mistura do meio aquoso e do tampão básico ou ácido contendo as vesículas preenchidas com tampão pela adição de uma solução neutralizante para obter vesículas de gradiente de pH transmembranares suspensas em um tampão de suspensão, em que o tampão de suspensão difere do tampão ácido ou básico em termos de valor de pH.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as vesículas preparadas na etapa a) são esterilizadas para obter vesículas esterilizadas antes de realizar a etapa b) com essas vesículas esterilizadas.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as vesículas preparadas na etapa a) são esterilizadas por autoclave.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as vesículas são armazenadas por um primeiro período de tempo antes da realização da etapa b).

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a etapa b) é realizada a uma temperatura que é abaixo de uma temperatura de transição de fase da substância matriz.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapa b) é realizada a uma temperatura não superior a 35 °C.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a osmolaridade do tampão ácido ou básico é igual a pelo menos 250 mOsm/L.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o meio aquoso da etapa a) apresenta um pH na faixa de 6,0 a 7,5.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o meio aquoso da etapa a) apresenta uma osmolaridade igual ou inferior a 50 mOsm / l.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a mistura do meio aquoso e do tampão básico ou ácido, em que as vesículas preenchidas com tampão estão suspensas no final da etapa b), possui uma osmolaridade de pelo menos 200 mOsm/L.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a solução neutralizante tem uma osmolaridade de entre 250 mOsm/L e 550 mOsm/L.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a solução neutralizante compreende pelo menos uma substância escolhida do grupo consistindo em glicerol, xilitol, TRIS, glicose, sais de magnésio, hidróxido de sódio, sais de sódio e sais de cálcio.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o valor de pH do tampão de suspensão contendo as vesículas de gradiente de pH transmembranares está em uma faixa de 5,5 a 8,5.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o meio aquoso é escolhido a partir do grupo consistindo em água, soluções aquosas de sais orgânicos, soluções aquosas de sais inorgânicos, soluções aquosas de substâncias orgânicas e combinações dos mesmos.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a substância matriz é escolhida a partir do grupo que consiste em dipalmitoilfosfatidilcolina, 1,2-diestearoil- sn-glicero-3-fosfoetanol-amino-N-[metóxi(PEG)-2000], colesterol e 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina e suas combinações.