BR112017006531B1 - Uso de sacarose de ferro e de protoporfirina de estanho para proteger um órgão de danos com base em um insulto programado, para gerar citorresistência adquirida em um órgão e/ou para regular positivamente a expressão de proteínas de estresse protetoras em um órgão sem causar danos ao órgão - Google Patents

Abstract

“USO DE SACAROSE DE FERRO E DE PROTOPORFIRINA DE ESTANHO PARA PROTEGER UM ÓRGÃO DE DANOS COM BASE EM UM INSULTO PROGRAMADO, PARA GERAR CITORRESISTÊNCIA ADQUIRIDA EM UM ÓRGÃO E/OU PARA REGULAR POSITIVAMENTE A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE ESTRESSE PROTETORAS EM UM ÓRGÃO SEM CAUSAR DANOS AO ÓRGÃO” A presente divulgação fornece composições, kits e métodos para proteger órgãos através da indução da citorresistência adquirida sem causar danos ao órgão. As composições, kits e métodos utilizam proteínas heme, ferro e/ou vitamina B12 e, opcionalmente, agentes que impactam o metabolismo da proteína heme.

Description

DECLARAÇÃO CONCERNENTE A PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL

[001] Esta invenção foi feita com apoio do governo de acordo com a Conces-são DK38432 outorgada pelo National Institutes of Health. O governo tem certos di-reitos sobre a invenção.

REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS RELACIONADOS

[002] Este Pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório US N.° 62/057.047 depositado em 29 de setembro de 2014 e US Provisória Pedido de Patente 62/212.232 depositado em 31 de agosto de 2015, todo o conteúdo de ambos os quais são aqui incorporados por referência.

CAMPO DA DIVULGAÇÃO

[003] A presente divulgação fornece composições, kits e métodos para prote-ger os órgãos através da indução de citorresistência adquirida sem causar lesão ao órgão. As composições, kits e métodos podem utilizar proteínas heme e, opcional-mente, agentes que impactam o metabolismo de proteínas heme. Outros compostos que elevam as proteínas de estresse (por exemplo, ferro e vitamina B12) podem tam-bém ser usados.

FUNDAMENTOS DA DIVULGAÇÃO

[004] A lesão a um órgão corporal pode eliciar respostas protetoras pelo órgão de tal forma que ele é capaz de melhor proteger a si mesmo no caso de eventos prejudiciais (isto é, lesões) continuarem ou reocorrerem. Por exemplo, um ciclo de lesão renal pode evocar respostas de proteção que, após um tempo de atraso de 18 horas, proteger os rins contra as formas subsequentes, mais graves de danos nos rins. Esta proteção pode durar por um longo período de tempo (dias a semanas). Este fenômeno de proteção é conhecido na técnica como "pré-condicionamento isquêmico" ou "citorresistência adquirida".

[005] Um pensamento tem sido o de usar o fenômeno da citorresistência ad-quirida para proteger preventivamente órgãos, especialmente quando uma lesão co-nhecida é iminente. Por exemplo, o fenômeno pode ser induzido a proteger os órgãos antes de uma lesão, como a exposição à cirurgia, circulação extracorpórea, ou administrações de toxicidade radiocontrastes. Esta abordagem não foi implantada em uso clínico, contudo, porque não tem sido um mecanismo para induzir citorresistência adquirida de uma maneira controlada, sem causar uma lesão inaceitável para o órgão que está sendo protegido.

SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO

[006] A divulgação atual fornece composições, kits e métodos que permitem a indução de citorresistência adquirida sem causar lesão ao órgão. Porque citorresis- tência adquirida pode ser induzida sem causar lesão ao órgão, o fenômeno pode ser utilizado num cenário clínico para proteger preventivamente órgãos, especialmente quando sabe-se que uma lesão conhecida se aproxima.

[007] Sem estar limitado pela teoria, as composições, kits e métodos induzem por citorresistência adquirida por elevação da expressão de proteínas do estresse protetoras. Modalidades particulares induzem citorresistência adquirida através de administração de proteínas heme a um nível, ou com uma abordagem, de tal modo que as proteínas heme não causam lesão ao órgão que está sendo protegido. Indução de citorresistência adquirida também pode ser alcançada através da administração de outros compostos, tais como ferro e/ou vitamina B12.

[008] Abordagens que induzem citorresistência adquirida sem causar lesões incluem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína heme, ferro e/ou vitamina B12 (B12); aumentando a meia-vida biológica da proteína heme, ferro e/ou B12; potenciando a ação da proteína heme, ferro e/ou B12; e redu-zindo a toxicidade associada com a administração de proteína heme, ferro e/ou B12. Cada uma destas abordagens pode ser praticada sozinha ou em combinação.

[009] As abordagens descritas podem ser realizadas por um ou mais de: a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína heme, ferro e/ou B12; administração de proteína heme, ferro e/ou B12 em combinação com um inibidor da degradação de proteínas heme; a administração de uma proteína heme modificada, ferro e/ou B12; e/ou a escolha de uma composição de distribuição e via de administração adequada.

[010] Proteínas heme exemplificativas incluem proteínas heme de baixo peso molecular, proteínas heme rapidamente extraídas e mioglobina. Uma forma exempli- ficativa de ferro inclui sacarose de ferro. Inibidores da degradação de proteínas heme exemplificativos incluem protoporfirinas, protoporfirinas de metal, e hematina. Proteí-nas heme modificadas exemplificativas e inibidores da degradação de proteínas heme incluem proteínas heme PEGuiladas e inibidores da degradação de proteínas heme e proteínas heme com nitrito e inibidores da degradação de proteínas heme. Composições exemplificativas incluem depósitos de liberação lenta. Vias de administração exemplificativas incluem injeção intravenosa, subcutânea, ou intramuscular. Exemplos de métodos para reduzir a toxicidade incluem a administração, com manitol, gli- cina, e solução salina. Exemplos adicionais, modalidades, e combinações são fornecidas na descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[011] As FIGs. 1A e 1B mostram a expressão do mRNA heme oxigenase (FIG. 1A) e veículo (controle) seguinte a (FIG. 1B) expressão de proteína, mioglobina (Mgb) ou mioglobina em combinação com Sn-protoporfirina (SnPP; administração Mgb + SnPP) 18 horas antes de lesão com glicerol. Esta FIG. demonstra que a administração de mioglobina apenas induz a molécula heme 1 oxigenase citoprotetora representativa (HO-1), e que a combinação de HO-1 mais um inibidor transiente heme oxigenase (SnPP) aumenta dramaticamente a mioglobina induzida HO-1 mRNA e a aumentos de proteína.

[012] A FIG. 2 nos painéis da esquerda mostra danos celulares nos rins seguidos de insuficiência renal aguda induzida por glicerol. Considerando que lesões graves são vistas na ausência de pré-condicionamento (necrose extensa, superior esquerdo, formação de grave de cilíndros, canto inferior esquerdo), o pré-tratamento com mioglobina + SnPP 18 horas antes da injeção de glicerol resultou em histologia renal essencialmente normal (painéis da direita superior e inferior).

[013] A FIG. 3 mostra que N-Mgb + SnPP eleva o mRNA para a proteína de proteção de estresse, interleucina-10 (IL-10).

[014] A FIG. 4 mostra que N-Mgb + SnPP eleva o mRNA hatpoglobina (es-querda) e os níveis de proteína (direita).

[015] A FIG. 5 mostra avaliação do impacto da ligação de nitrito equimolar à mioglobina Fe sobre a expressão da toxicidade de mioglobina. Células HK-2 (uma linha de células do túbulo proximal derivada de rim humano normal) foram incubadas em meio isento de soro de queratinócitos quer sob (controle) condições normais ou na presença de 10 mg/mL de mioglobina do músculo esquelético de cavalo ou mio- globina com nitrito (produzido por adição equimolar de nitrito de Na a 10 mg/ml de mioglobina). Após incubações de 18 h, a gravidade da lesão celular (% de morte celular) foi avaliada por um ensaio MTT. Mioglobina induziu 40% de morte celular (diminuição de 40% na captação celular de MTT), em comparação com células de controle incubadas. Nitrito de ligação a mioglobina reduziu a morte celular em 75%. Assim, a ligação de nitrito é capaz de reduzir os efeitos citotóxicos da mioglobina.

[016] A FIG. 6 mostra a relação dose-resposta entre heme oxigenase plasma 1 (HO-1) e a dose administrada de N-mioglobina. Os camundongos normais foram injetados por via intramuscular (IM) ou com 0, 1, 2, ou 5 mg/kg de mioglobina com nitrito + SnPP (dose constante de 1 μmol). Dezoito horas mais tarde, os níveis plas- máticos de HO-1 foram avaliados por ELISA. Observou-se relação dose-resposta en-tre a N-mioglobina administrada e os níveis plasmáticos de HO-1 foram observados. Assim, ensaio HO-1 tem utilidade biomarcadora potencial para indução de HO-1 induzida por N-Mgb/SnPP.

[017] A FIG. 7 mostra m anutenção dos níveis normais de creatinina sérica sob uma variação de 25 vezes na dose de N-mioglobina. Os camundongos foram submetidos a uma infusão subcutânea de 2 horas de 1, 3, 6, 12, ou 25 mg/kg de mioglobina com nitrito (SnPP que prende a uma dose constante de 1 μmol). Dezoito horas mais tarde, lesão renal potencial foi avaliada medindo as concentrações de cre- atinina sérica. Não houve aumento significativo observado em qualquer das doses N- Mgb, indicando uma falta de toxicidade ao longo do (N, 2-4 camundongos/grupo).

[018] A FIG. 8 mostra a histologia renal 18 horas após a administração de N- Mgb-SnPP. Os 2 principais painéis são secções de rim PAS-manchada de um camundongo controle (C) e um camundongo 18 horas após o tratamento de N-Mgb-SnPP (Rx). O epitélio tubular de camundongos tratados mantém uma aparência histológica normal com uma borda em escova completamente intacta (coloração escura da membrana luminal). Os últimos 2 painéis retratam secções manchadas com hematoxilina eosina. Nenhuma lesão histológica é aparente com pré-tratamento de N-Mgb-SnPP.

[019] A FIG. 9 mostra a indução sinérgica de HO-1 com tratamento com N- MGB-SnPP de camundongos normais. O painel da esquerda mostra os níveis de mRNA de HO-1 4 horas após o tratamento. Considerando que N-Mgb apenas e SnPP apenas induziram aumentos modestos de mRNA, um aumento de 20 vezes de HO-1 mRNA é visto com a administração do agente combinado. Às 18 horas após a administração, observou-se um aumento de proteína HO-1 sinérgica (valores de P vs controles). GAPDH, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; HO-1, heme oxigenase 1; mRNA, RNA mensageiro; N-Mgb, mioglobina com nitrito; SnPP, protoporfirina de es-tanho.

[020] A FIG. 10 mostra a indução sinérgica de IL-10 com tratamento com N- Mgb-SnPP de camundongos normais. O painel da esquerda mostra os níveis de mRNA de IL-10 4 horas após o tratamento. N-Mgb apenas e SnPP apenas evocaram quer aumentos mínimos ou nenhum de IL-10 mRNA. No entanto, com a administração combinada, foi observado um aumento do mRNA de IL-10 de 10 vezes. Como mostrado no painel à direita, apenas o tratamento combinado induziu aumentos de proteína IL-10 conforme avaliado no ponto de tempo de 18 horas (valores de P vs controles).

[021] A FIG. 11 mostra mRNA haptoglobina e expressão da proteína após a administração de N-Mgb-SnPP para camundongos normais. N-Mgb 1 SnPP combinados evocaram aumentos de haptoglobina mRNA muito maiores em 4 horas após a injeção do que um ou outro agente apenas. No entanto, até 18 horas após a administração do agente, N-Mgb apenas e N-Mgb + SnPP induziu aumentos de proteína ha- ptoglobina comparáveis. Isto sugere que N-Mgb representou os aumentos de hapto- globina que foram produzidos pela administração combinada de N-Mgb + SnPP. (Valores de P vs controles).

[022] A FIG. 12 mostra graus de proteção induzida por agentes de teste no modelo de glicerol de AKI induzida por rabdomiólise. Os camundongos de controle (C) desenvolveram AKI notável como denotado por BUN e concentrações de creatinina. SnPP não conferiu nenhuma proteção significativa, enquanto que N-Mgb induziu um efeito protetor modesto. Por outro lado, a administração combinada N-MGB-SnPP conferiu proteção funcional completa como medida pelos níveis de uréia e creatinina normais em 18 horas após a administração de glicerol (níveis normais são representados pela linha horizontal sólida).

[023] A FIG. 13 mostra que tratamento combinado de N-Mgb 1 SnPP (Rx), confere proteção notável contra o modelo de maleato de AKI. Injeção maleato causou aumentos notáveis de BUN e creatinina. Tratamento (Rx) conferiu um efeito protetor quase completo (linhas horizontais representam as concentrações normais de BUN e creatinina). Valor P vs nenhum tratamento (sem Rx).

[024] A FIG. 14 mostra que cardiotoxicidade induzida por maleato é reduzida pelo pré-tratamento com N-Mgb + SnPP. Os camundongos foram tratados com 1 mg/kg de N-mioglobina + 1 μmol de SnPP ou injeção de veículo IV). Dezoito horas mais tarde, 800 mg/kg de maleato foi administrado IP. A extensão da lesão miocárdica foi determinada 18 horas após a injeção de maleato medindo concentrações de tro- ponina plasmática I (por ELISA). Injeção de maleato causou um aumento de 10 vezes nos níveis de troponina plasmática. Pré-tratamento com N-Mgb + SnPP reduziu o aumento de troponina induzida por maleato em 75%.

[025] A FIG. 15 mostra tratamento N-Mgb + SnPP (Rx) confere proteção con-tra por doença renal progressiva induzida por isquemia-reperfusão (I/R) unilateral. Os camundongos foram submetidos a 30 minutos de isquemia renal esquerda, com ou sem pré-tratamento de N-MGB-SnPP 18 horas mais cedo. Às 2 semanas pós-isque- mia, a I/R conduziu a uma redução de 38% da massa renal (medida por peso do rim). O pré-tratamento (Rx) conferiu proteção significativa conforme medido apenas por uma redução de 12% da massa renal. Proteção também foi implicada por reduções notáveis em mRNA NGAL e níveis de proteína nas 2 semanas pós rins esquerdos isquêmicos.

[026] A FIG. 16 mostra uma relação dose-resposta entre doses crescentes de N-Mgb (com uma dose fixa de SnPP, 1 umol) e os níveis de HO-1/proteína haptoglo- bina no córtex renal e plasma. Doses crescentes de N-Mgb, administradas por via intraperitoneal, levou ao aumento dos níveis de cada uma das proteínas no plasma e no córtex renal. Os coeficientes de correlação para plasma vs concentrações renais foram 0,57 e 0,82 para HO-1 e haptoglobina, respectivamente. As correlações entre os níveis de dose administrada e de proteínas plasmáticas foram r = 0,85 e r = 0,75 para HO-1 e haptoglobina, respectivamente.

[027] A FIG. 17 mostra uma relação dose-resposta entre a dose administrada IP de N-Mgb vs concentrações de BUN/creatinina em 18 horas após a administração do glicerol. Doses crescentes de N-Mgb (com uma dose fixa de SnPP; 1 umol) levou a aumento do grau de proteção contra lesão renal aguda induzida por glicerol. Quando analisados com os resultados apresentados na FIG. 16, fortes relações diretas entre concentrações de plasma e HO-1/haptoglobina renal cortical e graus de proteção contra a AKI induzida por glicerol são aparentes. As linhas horizontais indicam concentrações normais de uréia e creatinina. Como mostrado no painel à direita, as doses administradas foram bem toleradas pelos rins como evidenciado pela manutenção de concentrações de creatinina no plasma 18 horas normais ao longo do intervalo de dosagem ensaiado.

[028] A FIG. 18 mostra a regulação positiva de HO-1, haptoglobina (hapto), e IL-10, a expressão do gene no fígado e no coração combinada com tratamento com N-Mgb/SnPP. Os graus de aumento com o tratamento, expressos como um aumento de vezes sobre os valores de controle são apresentados. Cada um foi aumentado em ambos fígado (2 painéis superiores) e coração (2 painéis inferiores). Os valores indi-viduais são dados nas Tabelas 9 e 10.

[029] A FIG. 19 mostra que pré-condicionamento com N-MGB-SnPP mitiga a lesão hepática pós-isquêmica e lesão hepatotóxica. Graus de lesão hepática isque- mia-reperfusão (I/R) foram julgados por níveis de lactato desidrogenase plasma (LDH) e de alanina aminotransferase (ALT). Pré-tratamento com N-MGB-SnPP diminuiu significativamente ambas as concentrações de HDL e ALT (painéis esquerdo e do meio). Também diminuiu o grau de lesão hepatotóxica induzida por injeção intraperitoneal de glicerol (painel da direita).

[030] A FIG. 20 mostra a aparência bruta de secções de fígado obtidas em 18 horas pós-isquemia sem (topo) e com (inferior) pré-tratamento com N-MGB-SnPP. Is- quemia hepática evocou extensa necrose bruta conforme evidenciado pela aparência cinza esbranquiçada do fígado (superior). No entanto, com pré-tratamento com N- MGB-SnPP, o fígado manteve uma aparência quase normal (inferior).

[031] A FIG. 21 mostra que vitamina B12 e sacarose Fe induz cada aumentos de proteína HO-1 notáveis dentro de 4 horas e persiste por 18 horas de sua injeção IV.

[032] A FIG. 22 mostra que injeção de maleato causou grave AKI como indi-cado por aumentos notáveis de BUN e PCR sobre controles de maleato injetados (C). Nem SnPP apenas nem FeS apenas alteraram significativamente a gravidade da le-são renal. No entanto, FeS + SnPP combinados conferiram proteção notável, con-forme indicado por 75% de reduções em concentrações de BUN/PCR (as linhas hori-zontais representam as médias dos níveis de BUN/PCR em camundongos normais).

[033] A FIG. 23 mostra que dentro de 18 horas de indução IRI, resultaram em elevações de 4 vezes nas concentrações de uréia e PCR. Pré-tratamento com FeS + SNPP conferiram proteção significativa, redução dos níveis de BUN e PCR em 50%. As linhas horizontais representam os níveis médios BUN/PCR em camundongos normais.

[034] A FIG. 24 mostra que injeção de maleato induziu AKI grave. Pré-trata-mento com FeS + B12 notavelmente atenuou esta lesão, como denotado por reduções BUN/PCR. As linhas horizontais representam os níveis médios BUN/PCR em camundongos normais.

[035] A FIG. 25 mostra que insuficiência renal grave resultou num prazo de 18 horas após a injeção de glicerol. Pré-tratamento com FeS + B12 conferiu proteção funcional substancial, conforme indicado por uma redução notável em ambas as concentrações de 18 horas de BUN e de PCR. As linhas horizontais representam os níveis médios BUN/PCR para camundongos normais.

[036] A FIG. 26 mostra aumentos notáveis e significativos em HO-1 mRNA, conforme avaliado 4 horas após a injeção. Por 18 horas, os níveis de HO-1 mRNA voltou aos valores normais.

[037] A FIG. 27 mostra que os aumentos de mRNA em 4h estão correlaciona-dos com um aumento significativo nos níveis de proteína HO-1. Estes níveis perma-neceram elevados no ponto de tempo de 18 horas, em particular no caso de adminis-tração FeS.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[038] A lesão de um órgão corporal pode eliciar respostas protetoras pelo ór-gão de tal forma que ele é capaz de melhor proteger a si mesmo no caso de eventos prejudiciais (isto é, lesões) continuarem ou re-ocorrerem. Este fenômeno de proteção é conhecido na técnica como "pré-condicionamento isquêmico" ou "citorresistência adquirida".

[039] Um pensamento tem sido o de usar o fenômeno da citorresistência ad-quirida para proteger preventivamente órgãos, especialmente quando uma lesão co-nhecida é iminente. Por exemplo, o fenômeno pode ser induzido a proteger os órgãos antes de uma lesão, como a exposição a cirurgia, angioplastia de balão, lesão induzida por isquemia-reperfusão cardíaca ou cerebral, ou toxicidade por radiocontraste. Alternativamente ou adicionalmente, o fenômeno poderia ser induzido em dadores de órgãos (por exemplo, rim, fígado) para prevenir ou reduzir lesão por armazenamento a frio e/ou lesão de reimplantação isquemia-reperfusão. Estas abordagens não foram implantadas em uso clínico, contudo, porque, até à presente divulgação, não tinha havido um mecanismo para induzir com sucesso citorresistência adquirida de uma maneira controlada, sem causar uma lesão no próprio órgão que está sendo protegido.

[040] A divulgação atual fornece composições, kits e métodos que permitem a indução de citorresistência adquirida sem lesão ao órgão a ser proteção. Porque citorresistência adquirida pode ser induzida sem causar lesão ao órgão, o fenômeno pode ser utilizado num cenário clínico para proteger preventivamente órgãos, especi-almente quando sabe-se que uma lesão conhecida se aproxima.

[041] Sem estar limitado pela teoria, as composições, kits e métodos induzem por citorresistência adquirida por elevação da expressão de proteínas do estresse protetoras. Citorresistência adquirida pode ser induzida através de administração de proteínas heme a um nível, ou com uma abordagem, de tal modo que as proteínas heme não causam uma lesão ao órgão que está sendo protegido. Em modalidades particulares, a indução de citorresistência adquirida pode também ser conseguida através da administração de compostos que aumenta, as proteínas de estresse através das mesmas ou semelhantes vias biológicas utilizadas por proteínas heme. Tais compostos incluem, por exemplo, ferro e vitamina B12 e metabolitos associados.

[042] Uma "lesão" é uma ocorrência que é suscetível de causar lesão a um órgão. Lesões exemplificativas incluem choque (pressão arterial baixa), hipoperfusão renal, cirurgia, isquemia-reperfusão cardíaca ou cerebral induzida, bypass cardiopul- monar, angioplastia com balão, as administrações de toxicidade radiocontrastantes, quimioterapia, administração de medicamentos, administração de medicamentos ne- frotóxicos, trauma contundente, perfuração, veneno, tabagismo, etc.

[043] Um "dano" é um efeito prejudicial sobre um órgão evidenciado pela morte de células dentro do órgão, os danos celulares dentro do órgão, estrutura dani-ficada dentro do órgão e/ou diminuição da função do órgão em relação a um ou mais grupos de controle relevantes, condições ou níveis de referência.

[044] "Ausência de dano" a um órgão, "sem causar um dano" a um órgão, "não fere o órgão" e frases semelhantes significa que qualquer efeito sobre um órgão é, dentro do escopo do julgamento médico confiável, comensuráveis com uma razão benefício/risco razoável de administração. Em modalidades particulares, a ausência de um dano pode ser demonstrada por mostrar que a função de um órgão não é estatisticamente significativamente diferente de um grupo relevante de controle, con-dição, ou nível de referência de acordo com um teste conhecido da função do órgão no momento utilizando comparações estatísticas adequadas. Exemplos de ensaios de função do órgão incluem medição de marcadores associados com a função do órgão; medir a saída de um órgão; e medição de uma métrica de desempenho do órgão, em comparação com um ou mais grupos de controle relevantes, as condições ou os níveis de referência.

[045] Ao induzir citorresistência adquirida, as composições, kits e métodos aqui divulgados protegem os órgãos de lesão, como o dano induzido por lesão. "Pro-tegendo um órgão de lesão" e frases semelhantes incluem um ou mais dos seguintes: aumento da expressão de proteínas de proteção do estresse; preservar a função dos órgãos no todo ou em parte (por exemplo, a medição da saída de um órgão; medição de uma métrica de desempenho do órgão); redução da lesão de células de órgãos (em modalidades particulares, como manifestado pela fuga de diminuição de proteínas intracelulares para a circulação), e reduzir a morte celular dentro do órgão, em comparação com um ou mais grupos de controle relevantes, condições, ou os níveis de referência.

[046] Inúmeros ensaios que podem ser utilizados para avaliar a presença ou ausência de uma lesão e proteção associados são aqui divulgado e podem ser utili-zados em modelos humanos de função do órgão e animais. A ausência de lesões e/ou proteção de um órgão pode ser confirmada comparando uma medida relevante a partir de um sujeito com um nível de referência. Os níveis de referência podem incluir níveis "normais" ou "controle" ou valores, definidos de acordo com, por exemplo, limites de discriminação ou risco definindo os limiares, a fim de definir pontos de corte e/ou valores anormais para a função do órgão. O nível de referência pode ser um nível de indícios tipicamente encontrados num sujeito que não sofre de lesões de órgãos. Outros termos para "níveis de referência" incluem "índice", "base", "padrão", "saudável", "pré-lesão", etc. Tais níveis normais podem variar, com base em se um indício é utili-zado sozinho ou em uma formulação combinada com outros indícios para a saída de pontuação. Alternativamente, o nível de referência pode ser derivado a partir de um banco de dados de pontuações de sujeitos previamente testados que não desenvol-veram lesões de órgãos ao longo de um período de tempo clinicamente relevante. Os níveis de referência também podem ser derivados a partir, por exemplo, um sujeito de controle ou população cujo estado de lesões de órgão é conhecido. Em algumas mo-dalidades, o nível de referência pode ser derivado de um ou mais sujeitos que tenham sido expostos ao tratamento de uma lesão de órgãos, ou a partir de sujeitos que tenham mostrado melhorias na função de órgãos após uma lesão, como resultado de exposição ao tratamento. Em algumas modalidades o nível de referência pode ser derivado de um ou mais sujeitos com lesões de órgãos que não foram expostos ao tratamento. Um nível de referência também pode ser derivado a partir de algoritmos de gravidade da lesão ou índices calculados de estudos de população.

[047] Em modalidades particulares, um "nível de referência" pode referir-se a um valor normalizado para a função do órgão que representa um nível não associado a qualquer lesão; um nível associado com um tipo particular de lesão; um nível associado com uma gravidade da lesão; ou um nível associado a um assunto em particular no momento do diagnóstico, no início de um tratamento, ou a um ponto de tempo durante um tratamento. O nível de referência pode ser um nível de referência universal, que é útil em uma variedade de locais de teste ou pode ser um nível de referência específico para um local de teste e de ensaio específico utilizado para medir a função do órgão. Em certas modalidades, o nível de referência, é derivado a partir de (i) um sujeito que não tem lesões de órgãos ou lesões de órgãos de um tipo particular; ou (ii) um grupo de sujeitos que não têm lesões de órgãos ou lesões de órgãos de um tipo particular. Os níveis de referência para um objeto também pode estar relacionado com os pontos de tempo do sujeito em tratamento para monitorizar a progressão natural ou regressão de lesões de órgãos no sujeito.

[048] Em modalidades particulares, os níveis de referência podem ser deriva-dos a partir de um "conjunto de dados". Um conjunto de dados representa um conjunto de valores numéricos resultantes da avaliação de uma amostra (ou população de amostras), sob uma condição desejada. Os valores do conjunto de dados podem ser obtidos, por exemplo, através da obtenção de medidas experimentalmente a partir de uma amostra e a construção de um conjunto de dados a partir destas medições; ou, alternativamente, através da obtenção de um conjunto de dados a partir de um provedor de serviços, tais como um laboratório, ou a partir de um banco de dados ou um servidor no qual o conjunto de dados foi armazenado.

[049] Regulação positiva de proteínas de estresse protetoras. Sem estar limi-tado pela teoria, o aumento de um número de proteínas de estresse leva à indução de citorresistência adquirida. "Aumento" inclui um aumento na expressão de um gene ou uma molécula de ácido nucleico de interesse ou a atividade de uma proteína, por exemplo, um aumento na expressão do gene ou a atividade da proteína quando comparada com a expressão ou atividade de um gene ou proteína de outra forma idêntica ou semelhante que não tenha sido aumentada.

[050] A regulação positiva dos seguintes exemplos de proteínas de estresse pode conduzir à indução de citorresistência adquirida: heme oxigenase (HO), hapto- globina, hemopexina, hepcidina, alfa-1 antitripsina (AAT), interleucina-10 (IL-10), proteínas de choque térmico, a lipocalina associada à gelatinase neutrofílica (NGAL), e HMG-CoA redutase.

[051] A heme oxigenase (HO) é a enzima limitante da velocidade no catabo-lismo do heme. Existem três isozimas HO distintas: HO-1 (por exemplo,SEQ ID NO: 1), HO-2 (a isoforma A, por exemplo,SEQ ID NO: 2; isoforma B; por exemplo,SEQ ID NO. 3; isoforma C; por exemplo,SEQ ID NO:4), e HO-3 (por exemplo,SEQ ID NO: 5). HO-1 é uma isozima cuja expressão é aumentada seguindo diversas formas de estresse de tecido, tais como induzidas por proteínas heme, metais pesados, hipoxia, e várias vias sensitivas ao redox. Em contraste, HO-2 é uma isozima expressa cons-titutivamente. HO-3 é uma isozima recentemente identificada, cujas funções são atu-almente desconhecidas.

[052] Haptoglobina (por exemplo, SEQ ID NO: 6) é uma proteína do plasma sanguíneo com um peso molecular de 86.000 a 400.000 e desempenha um papel importante no metabolismo da hemoglobina liberada para a corrente sanguínea. Quando liberada no sangue excessivamente a hemoglobina é excretada na urina, através dos túbulos renais, resultando em não só uma perda de ferro, mas também distúrbios dos túbulos renais. Porque haptoglobina liga-se seletivamente e com fir-meza à hemoglobina in vivo e, assim, forma um complexo de hemoglobina-haptoglo- bina, tem funções importantes na recuperação do ferro e na prevenção de distúrbios renais.

[053] Hemopexina (HPX; por exemplo, SEQ ID NO: 7) é uma proteína de 60 kDa que se encontra presente no plasma em quantidades elevadas, sendo a segunda a albumina única, imuglobulinas, e as proteases de plasma. Hemopexina é também muitas vezes referida como beta-1b-glicoproteína. Hemopexina tem uma elevada afinidade para o heme (KD<10-12 M), e acredita-se que o papel biológico do HPX está relacionado com o transporte de heme evitando assim danos oxidativos induzidos por heme e perda de ferro ligada a heme. Hemopexina sequestra heme livre a partir do plasma, que induz uma mudança estrutural no qual os ganhos complexos heme-HPX aumentam afinidade para os receptores no fígado, onde é engolida por endocitose mediada pelo receptor e o heme é liberado a um pH baixo nos endossomas. Depois disso, HPX é retornado para a circulação e pode ser submetida a novas etapas de transporte.

[054] Hemopexina é dobrada em dois domínios homólogos, cada um dos 200 aminoácidos, unidos por um ligante de 20 resíduos de aminoácido. Há 25% de identidade de sequência entre os dois domínios. Duas histidinas coordenam o ferro heme, nomeadamente His213 do peptídeo ligante e His270 de um laço do domínio C- terminal, dando uma bis-histidil Fe(III) estável. A numeração é em relação à proteína madura. Clin. Chim. Acta, 312, 2001, 13-23 e DNA Cell Biol., 21, 2002, 297-304 fornecem revisões de química Hpx.

[055] Hepcidina (Prepropeptídeo; por exemplo, SEQ ID NO: 8) é o sinal chave de regulação da homeostase de ferro (Philpott, Hepatology 35:993 (2002); Nicolas et al,Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 99: 4396 (2002)). Altos níveis de hepcidina humana re-sultam em níveis de ferro reduzido, e vice-versa. As mutações no gene hepcidina que resultam em falta de atividade hepcidina estão associados com hemocromatose juvenil, uma doença grave de sobrecarga de ferro (Roetto et al. ,Nat. Genet. ,33: 21-22, 2003). Estudos em camundongos demonstraram um papel de hepcidina no controle da homeostase de ferro normal (Nicolas et al., Nat. Genet. ,34: 97-101,2003; Nicolas et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 99: 4596-4601,2002; Nicolas et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 98: 8780-8785, 2001).

[056] Além disso, os dados estão acumulando na implicação de hepcidina no sequestro de ferro durante a inflamação (Ver, por exemplo, Weinstein et al. ,Blood, 100: 3776-36781,2002; Kemna et al. ,Blood, 106: 1864-1866, 2005; Nicolas et al. ,J. Clin. Invest. ,110: 1037-1044, 2002; Nemeth et al. ,J. Clin. Invest. ,113: 1271-1276, 2004; Nemeth et al. ,Blood, 101: 2461-2463, 2003 e Rivera et al. ,Blood, 105: 1797-1802, 2005). A expressão do gene hepcidina foi observada como sendo robustamente aumentada após estímulos inflamatórios, tais como infecções, as quais induzem a resposta da fase aguda dos sistemas imune inatos de vertebrados. Em camundongos, a expressão genética hepcidina mostrou ser aumentada por lipopolissacarídeo (LPS), terebintina, adjuvante completo de Freund, e infecções por adenovírus. Expressão de Hepcidina é induzida pela citocina inflamatória IL-6. A forte correlação entre a expressão da hepcidina e anemia da inflamação também foi encontrada em pacientes com doenças inflamatórias crônicas, incluindo bactérias, fungos e infecções virais.

[057] Hepcidina humana, um peptídeo de 25 aminoácidos (por exemplo, SEQ ID NO: 9) com atividade anti-microbiana e de ferro-regulação, foi descoberta indepen-dentemente por dois grupos investigando peptídeos anti-microbianos novos. (Krause et al., FEBS Lett. 480: 147 (2000); Park et al. ,J. Biol. Chem. 276: 7806 (2001)). Também tem sido referido como LEAP-1 (peptídeo antimicrobiano expresso de fígado). Um cDNA de hepcidina que codifica um pre-propeptídeo de 83 aminoácidos em camundongos e um pre-propeptídeo de 84 aminoácidos de camundongo e humano foram subsequentemente identificados em busca de genes específicos do fígado que foram regulados por ferro (pombo et al. ,J. Biol. Chem. 276: 7811 (2001)). O peptídeo de sinal N-terminal de 24 resíduos é primeiro clivado para produzir pró- hepcidina, que é então ainda processado para produzir hepcidina madura, encontrada no sangue e na urina. Na urina humana, a forma predominante contém 25 aminoácidos, embora mais curtas 22 e 20 peptídeos de aminoácidos também estão presentes.

[058] O peptídeo maduro é notável por conter oito resíduos de cisteína ligados como quatro pontes dissulfeto. A estrutura de hepcidina foi estudada por Hunter et al. ,J. Biol. Chem., 277: 37597-37603 (2002), por NMR usando hepcidina quimicamente sintetizada com um tempo de retenção de HPLC idêntico ao da hepcidina nativa purificada a partir de urina. Hunter et al. relataram que a sua determinação de hepcidin dobrou dentro de uma estrutura em gancho contendo uma ligação dissulfureto vicinal (C1-C8, alcenil C2-C7, cicloalquil C3-C6, C4-C5).

[059] Alfa-1 antitripsina (AAT; por exemplo, SEQ ID NO: 10) é uma glicoproteína segregada pelos hepatócitos e normalmente presente no soro e na maioria dos tecidos em concentrações elevadas, onde atua como um inibidor de proteases de serina. A inibição da protease por AAT é um componente essencial da regulação da proteólise de tecido, e deficiência de AAT está implicada na patologia de várias doenças. Para além da sua atividade como uma antiprotease, a AAT poderia ter uma importante função biológica anti-inflamatória, porque ele tem uma capacidade inibidora proeminente relativamente a muitos mediadores da inflamação e no que respeita aos radicais oxidantes (Brantly M. Am J Respir Cell Mol. Biol. ,2002; 27:652654).

[060] Interleucina-10 (IL-10, por exemplo, SEQ ID NO. 11) é uma citocina pleiotrópica produzida por vários tipos de células tais como macrófagos, monócitos, do tipo Th2 e as células T reguladoras e células-B. IL-10 é uma citocina com imunossupressores e propriedades anti-inflamatórias; que regula uma série de atividades mieloides e linfoides celulares e diretamente inibem a produção de várias citocinas inflamatórias pelas células T e células Assassinas Naturais (NK). IL-10 é conhecido como um fator de proliferação de células B e é ativo na autoimunidade, a produção de anticorpos, tumorigênese e da tolerância de transplante. Eur. J. Immunogenet. 1997 24 (l):1-8. IL-10 também altera a resposta de macrófagos à infecção e ainda estimula os receptores de Fc nas mesmas células. Annals Allergy Asthma Immunol. 1997 79: 469-483; J. Immunol. 1993 151:1224-1234; e J. Immunol. 1992 149: 4048-4052.

[061] Proteínas de choque térmico foram originalmente observadas como sendo expressas em quantidades aumentadas em células de mamífero, que foram expostas a elevações bruscas de temperatura, enquanto que a expressão da maior parte das proteínas celulares é significativamente reduzida. Desde então, foi determinado que tais proteínas sejam produzidas em resposta a vários tipos de estresse, incluindo a privação de glicose.

[062] As proteínas de choque térmico tem a capacidade de ligar outras proteínas nos seus estados não nativos, e em particular se ligar a peptídeos nascentes emergentes de ribossomas ou extrudidos para o retículo endoplasmático. Hendrick e Hartl. ,Ann. Rev. Biochem. 62: 349-384 (1993); Hartl. , Nature 381: 571-580 (1996). Além disso, as proteínas de choque térmico demonstraram desempenhar um papel importante na dobragem correta e a montagem de proteínas no citosol, retículo endoplasmático, mitocôndria e; Tendo em vista esta função, eles são referidos como "acompanhantes moleculares". Frydman et al. , Nature 370:111-117 (1994); Hendrick e Hartl. ,Ann. Rev. Biochem. 62: 349-384 (1993); Hartl, Nature 381: 571-580 (1996).

[063] Exemplos de proteínas de choque térmico incluem BiP (também conhecida como grp78 (por exemplo,SEQ ID NO: 12)), hsp/hsc70 (por exemplo,SEQ ID NO: 13), gp96 (grp94) (por exemplo,SEQ ID NO: 14), hsp60 (por exemplo,SEQ ID NO: 15), hsp40 (por exemplo,SEQ ID NO: 16), hsp70/72 (por exemplo,SEQ ID NO: 17), e hsp90 (isoforma 1; por exemplo,SEQ ID NO: 18; isoforma 2; por exemplo,SEQ ID NO. 19).

[064] Lipocalinas são uma família de proteínas de ligação de ligandos extracelulares que é encontrada numa variedade de organismos desde bactérias a humanos. Lipocalinas possuem muitas funções diferentes, tais como a ligação e o transporte de pequenas moléculas hidrofóbicas, o transporte de nutrientes, regulação do crescimento celular, a modulação da resposta, inflamação, e a síntese das prostaglandinas imune.

[065] Lipocalina associada à gelatinase neutrofílica (NGAL; por exemplo,SEQ ID NO:20), que também é conhecido como lipocalina de neutrófilos humanos (LCF), a proteína de ligação a N-formil peptídeo, e de 25 kDa proteína relacionada com a2- microglobulina, é uma proteína de 24 kDa, a qual pode existir como um monômero, um homodímero ou um heterodímero com proteínas, tais como a gelatinase B ou a metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9). Uma forma trimérica de NGAL, também foi identificada. NGAL é secretada a partir de grânulos específicos de neutrófilos humanos ativados. Proteínas homólogas foram identificadas em camundongo (24p3/uterocalina) e rato (proteína relacionada a a2-microglobulina/lipocalina relacionada a neu). Dados estruturais confirmaram NGAL tem uma estrutura β-barril com oito cadeias, o que é característico de lipocalinas; no entanto, a NGAL tem uma invulgarmente grande cavidade alinhada com resíduos de aminoácidos mais polares e carregados positivamente do que os normalmente observados em lipocalinas. Acredita-se que NGAL se liga a pequenas substâncias lipofílicas, tais como lipopolissacarídeos de bactérias derivados e peptídeos formil, e pode funcionar como um modulador da inflamação.

[066] NGAL é um marcador precoce de lesão renal aguda ou doença. Além de ser segregada por grânulos específicos de neutrófilos humanos ativados, NGAL também é produzida por nefrônios em resposta ao dano epitelial tubular e é um marcador de lesão tubulointersticial (TI). Níveis de NGAL sobem em necrose tubular aguda (NTA) de isquemia ou nefrotoxicidade, mesmo após isquemia renal "subclínica" ligeira. Além disso, a NGAL é conhecida por ser expressa pelo rim em casos de doença renal crônica (IRC) e lesão renal aguda ((AKI); ver, por exemplo, Devarajan et al. ,Amer. J. Kidney Diseases 52(3); 395-399 (Setembro de 2008); e Bolignano et al. ,Amer. J. Kidney Diseases 52(3):595-605 (Setembro de 2008)). Níveis urinários elevados de NGAL têm sido sugeridos como preditivo de insuficiência renal progressiva. Foi previamente demonstrado que NGAL é notavelmente expressa pelos túbulos renais muito cedo após a lesão isquêmica ou nefrotóxica em ambos os modelos animais e humanos. NGAL é rapidamente excretada na urina, em que pode ser facilmente detectada e medida. NGAL é resistente a proteases, sugerindo que pode ser recuperada na urina, como um marcador fiel da expressão de NGAL nos túbulos renais.

[067] A enzima HMG-CoA-redutase desempenha um papel central na produção de colesterol e outros isoprenoides no fígado e outros tecidos através da via do mevalonato. A conversão de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) em mevalonato é catalisada por HMG-CoA redutase, e é uma etapa inicial e limitante da velocidade na via biossintética do colesterol no fígado e outros tecidos. Aumentos induzidos por estresse em HMG CoA redutase mediam a síntese de colesterol levando a um aumento do colesterol da membrana plasmática.

[068] Expressão de proteínas de estresse de proteção é aumentada através da administração de proteínas heme. Proteínas heme são metaloproteínas que contêm um grupo prostético heme (um anel da protoporfirina com um Fe central, um anel de protoporfirina inclui quatro anéis pirole ligados por pontes metino. Quatro metil, dois vinil e propionato de duas cadeias laterais também podem ser ligados). Em modalidades particulares, as proteínas heme são proteínas de baixo peso molecular heme. "Heme proteínas de baixo peso molecular" incluem aquelas com um peso molecular de 25 kDa ou menos; 24 kDa ou menos; 23 kDa ou menos; 22 kDa ou menos; 21 kDa ou menos; 20 kDa ou menos; 19 kDa ou menos; 18 kDa ou menos; 17 kDa ou menos; 16 kDa ou menos; 15 kDa ou menos; 14 kDa ou menos; 13 kDa ou menos; 12 kDa ou menos; 11 kDa ou menos; ou de 10 kDa ou menos. Numa outra modalidade, as proteínas heme são rapidamente eliminadas quando administradas por via intravenosa. "Rapidamente depurado" significa uma taxa de excreção urinária, que tem uma taxa de depuração na urina de> 50% da creatinina sérica ou ureia. Numa outra modalidade as proteínas heme são proteínas heme de peso molecular baixo que são rapidamente eliminadas quando administradas por via intravenosa. Mioglobina (por exemplo, SEQ ID NO: 21) é uma proteína heme que pode ser utilizada com as composições, kits e métodos aqui divulgados. As referências a proteínas heme incluem proteínas heme modificadas, proteínas heme variantes e proteínas heme analógicas D-substituídas. As referências a mioglobina incluem mioglobina, mioglobina variante e mioglobina analógica D-substituída modificada como descrito aqui noutro local.

[069] A mioglobina está presente no tecido do músculo esquelético e as funções de armazenar e fornecer oxigênio por uma ligação reversível de O2 no sítio de ligação aberta da mioglobina. Através desta ligação reversível, mioglobina cria uma fonte intracelular de oxigênio por mitocôndrias celulares. Ao contrário de hemoglobina, uma outra proteína heme, mioglobina, naturalmente, só existe como um monômero.

[070] Quando o tecido muscular é danificado, mioglobina é liberada na corrente sanguínea. Grandes quantidades de mioglobina no sangue podem causar lesão renal, provocando constrição dos vasos renais, formando cilindros obstrutores no lúmen dos túbulos renais, e iniciando a inflamação intersticial, tal como descrito em Zager, R. A., Ren. Fail., 14, 341-344 (1992). Além disso, Nath et al. declaram que proteínas heme, tais como a hemoglobina, quando liberadas para o espaço extracelular, podem instigar toxicidade dos tecidos e que mioglobina está diretamente implicada na patogênese da insuficiência renal em rabdomiólise. J. Clin. Invest., Julho 1992. (90)1:267-70. Por conseguinte, as proteínas heme e mioglobina, em particular, podem danificar o sistema renal.

[071] Com base nestes efeitos prejudiciais conhecidos de proteínas heme, incluindo mioglobina, não era esperado que as proteínas heme tais como mioglobina poderiam desempenhar um papel na indução de citorresistência adquirida sem causar uma lesão no órgão. Assim, um aspecto da descrição atual inclui composições de identificação, kits e métodos para administrar a mioglobina de uma maneira que induz citorresistência adquirida sem causar uma lesão no órgão que é administrado a proteger.

[072] Abordagens que permitem a administração da proteína heme para induzir citorresistência adquirida sem causar uma lesão no órgão incluem a seleção de uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína heme; aumentando a meia- vida biológica da proteína heme; potenciando a ação da proteína heme; e reduzindo a toxicidade associada com a administração da proteína heme.

[073] Uma modalidade aqui divulgada inclui a seleção de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína heme, tal como a mioglobina. Quantidadesterapeuticamente eficazes, os métodos para identificar quantidades terapeuticamente eficazes e quantidades terapeuticamente eficazes exemplificativas são descritas mais detalhadamente abaixo.

[074] A meia-vida biológica de uma proteína heme pode ser prolongada através da administração da proteína heme em combinação com um inibidor da degradação de proteínas heme. Em modalidades particulares, os inibidores da degradação de proteínas heme podem reduzir ou eliminar a clivagem do anel porforina da proteína heme por HO, reduzindo ou eliminando liberação de teor de Fe tóxico da proteína heme. Em modalidades particulares, a administração de um inibidor da degradação de proteínas heme, em combinação com uma proteína heme pode permitir a administração de doses mais baixas de proteína heme.

[075] Em modalidades particulares, qualquer composto que bloqueia ligação de heme HO pode funcionar como um inibidor da degradação de proteínas heme. Por exemplo, um número de análogos sintéticos de ferro protoporfirina IX são conhecidos. Estes compostos estão comercialmente disponíveis e/ou podem ser facilmente sintetizados por métodos conhecidos. Eles incluem, por exemplo, platina, zinco, níquel, cobalto, cobre, prata, manganês, crômio, e estanho protoporfirina IX. Por conveniência, estes compostos podem ser referidos genericamente como Me- protoporfirina ou PPMO, onde Me significa metal, e, especificamente, utilizando o símbolo químico do metal, tais como Cr-protoporfirina (CRPP), Sn-protoporfirina (SnPP), Zn-protoporfirina (ZnPP) para os compostos de protoporfirina de cromo, estanho e zinco respectivamente.

[076] Hemina e/ou hematina também podem ser utilizadas como inibidores competitivos de HO-1. Em alguns casos, hemina e hematina são utilizadas indiferentemente e referem-se a protoporfirina IX contendo um íon de ferro férrico ligado a um ligante de cloreto. Outros distinguem hemina e hematina, referindo-se à forma ligante Cl como hemina e referindo-se a hematina como o mesmo composto com hidróxido ligado ao íon de ferro em vez de cloreto. Ambos podem ser utilizados como inibidores competitivos de HO-1 dentro dos ensinamentos da presente divulgação. Com efeito, e como foi dito, qualquer composto que bloqueia ligação de heme HO pode funcionar como um inibidor da degradação de proteínas heme.

[077] Esse bloqueio da ação de HO poderia vantajosamente ajudar na indução de citorresistência adquirida sem causar uma lesão era inesperado. Por exemplo, Nath et al. , mostraram que a retirada do gene HO-1 em camundongos piorou lesão renal no modelo de glicerol de toxicidade da proteína heme. Os autores afirmaram que HO-1 é um protetor crítico contra a toxicidade aguda in vivo induzida pela proteína heme. Am. J. de Path. ,Maio de 2000 156 (5):1527-1535.

[078] Além disso, que Me-protoporfirina poderia ser utilizada em combinação com uma proteína para induzir a heme citorresistência adquirida sem causar uma lesão era inesperado. Isto é porque Me-protoporfirinas são geralmente pensadas como afetando adversamente órgãos em vários modelos de lesão de órgão. Por exemplo, Agarwal et al. descobriram que o pré-tratamento com Sn-protoporfirina exacerbou lesão renal em um modelo baseado em HO in vivo de lesão renal mediada por proteína heme. Particularmente, pré-tratamento com Sn-protoporfirina levou a valores de creatinina sérica mais elevados nos dias 3 a 5 e menores folgas de inulina no dia 5. Hemodinâmica renal estudadas no dia 2 após a cisplatina demonstrou taxas de fluxo sanguíneo renal reduzido, aumento da resistência vascular renal e aumento da excreção fracionada de sódio em ratos tratados com Sn-protoporfirina. Kidney Int. Outubro de 1995. 48(4):1298-307. No modelo de glicerol rabdomiólise, Nath et al. , descobriram que o rim responde a quantidades elevadas de proteínas heme através da indução de HO e que o bloqueio da ação da HO com um inibidor competitivo (aqui, Sn-protoporfirina) exacerbou disfunção renal. J. Clin. Invest. Julho de 1992:90(1):267- 70. Ferenbach et al. , e Goodman et al. , demonstraram que a inibição semelhante de HO usando Me-protoporfirinas agrava lesão renal. Ver Nephron. Exp. Nephrol. Abril de 2010.115(3): e33-7 e Kidney Int. Outubro de 2007.72(8):945-53 respectivamente. Com base nestes ensinamentos da técnica, um de conhecimento comum na técnica não teria esperado os efeitos benéficos da inibição de HO-1 atualmente divulgado.

[079] Sem estar limitado pela teoria, as proteínas heme ativam fatores de transcrição sensíveis redox, que conduzem ao aumento da regulação de proteínas sensíveis citoprotetoras redox. Esta via é iniciada pelo teor de ferro de Mgb. Assim, como aqui demonstrado abordagens alternativas para induzir sinalização de gene citoprotetor tubular renal mediadas por ferro são também eficazes. Estas abordagens alternativas incluem a administração de ferro e/ou vitamina B12. A base racional para B12 é que tanto cobalto e cianeto podem induzir, independentemente, HO-1. Assim, B12 representa um método seguro para administrar tanto cianeto quanto cobalto como um único agente, pois ambos são parte integrante da molécula de B12.

[080] Proteínas heme modificadas e inibidores da degradação de proteínas heme (por exemplo, protoporfirinas, hemina, hematina) podem incluir aqueles com (a) meia-vida de soro de proteína aumentada e/ou meia-vida funcional in vivo, (b) antigenicidade de proteína reduzida, (c) a estabilidade aumentada de armazenamento de proteína, (d) aumento da solubilidade da proteína, (e) tempo de circulação prolongado, e/ou (f) aumento da biodisponibilidade, por exemplo, aumento da área sob a curva (AUC).

[081] Em modalidades particulares, as proteínas heme modificadas e inibidores da degradação de proteínas heme ("modificações") incluem aqueles em que um ou mais aminoácidos foram substituídos com um componente de ácido não-amino, ou em que o aminoácido foi conjugado com um grupo funcional ou um grupo funcional foi de outro modo associado com um aminoácido. O aminoácido modificado pode ser, por exemplo, um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGuilado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conjugado com uma porção de lipídio, ou um aminoácido conjugado com um agente de derivatização orgânica. Aminoácido(s) pode(m) ser modificado(s), por exemplo, co- traducionalmente ou após a tradução, durante a produção recombinante (por exemplo, motivos de glicosilação em N-X-S/T N-ligados durante a expressão em células de mamífero) ou modificado(s) por meios sintéticos. O aminoácido pode ser modificado dentro da sequência ou na extremidade terminal de uma sequência. Modificações incluem proteínas heme com nitrito, tais como mioglobina com nitrito.

[082] No seu estado nativo, mioglobina é 17 kDa e, portanto, é rapidamente filtrada e excretada pelo rim. Ao aumentar o tamanho da mioglobina, a sua excreção pode ser abrandada, deste modo, permitindo um efeito de proteção mais prolongado e durável. Numa modalidade, a proteína modificada é uma proteína heme ou a degradação de proteínas heme inibidora PEGuilada.

[083] PEGuilação é um método que pode ser utilizado para aumentar o tamanho da mioglobina e outras proteínas de baixo peso molecular. PEGuilação é um processo pelo qual as cadeias de polímero de polietileno glicol (PEG) são covalentemente conjugadas com outras moléculas, tais como drogas ou proteínas. Vários métodos de proteínas de PEGuilação foram relatados na literatura. Por exemplo, N-hidroxissuccinimida (NHS) de PEG foi usada para PEGuilar os grupos amina livres de resíduos de lisina e N-terminal de proteínas; PEGs tendo grupos aldeído foram usados para PEGuilar os amino-terminais das proteínas na presença de um agente redutor; PEGs com grupos funcionais maleimida têm sido usados para seletivamente PEGuilar os grupos tiol livres de resíduos de cisteína nas proteínas; e PEGuilação específica do local de resíduos acetil-fenilalanina pode ser realizada.

[084] A ligação covalente de proteínas ou peptídeos a PEG tem provado ser um método útil para aumentar as meias-vidas circulantes de proteínas e peptídeos no corpo (Abuchowski, A. et al. , Cancer Biochem. Biophys, 1984, 7: 175-186; Hershfield, M. S. et al. , N. Engl. J. Medicine, 1987, 316: 589-596; e Meyers, F. J. et. al. , Clin. Pharmacol. Ther. , 1991,49: 307-313). A ligação do PEG a proteínas e peptídeos não só protege as moléculas contra a degradação enzimática, mas também reduz a sua taxa de depuração do organismo. O tamanho do PEG ligado a uma proteína tem um impacto significativo sobre a meia-vida em circulação da proteína. A capacidade de PEGuilação para diminuir a depuração não é geralmente uma função de quantos grupos PEG estão ligados à proteína, mas o peso molecular total da proteína alterada. PEGuilação diminui a taxa de depuração da corrente sanguínea, aumentando o peso molecular aparente da molécula. Até um certo tamanho, a taxa de filtração glomerular de proteínas é inversamente proporcional ao tamanho da proteína. Normalmente, quanto maior for o PEG, mais longa é a meia-vida in vivo meia-vida da proteína ligada. Além disso, a PEGuilação pode também diminuir a agregação de proteína (Suzuki et al. ,Biochem. Bioph. Acta vol. 788, pg. 248 (1984)), alteram a imunogenicidade da proteína (Abuchowski et al. ;J. Biol. Chem. vol. 252 pg. 3582 (1977)), e aumenta a solubilidade da proteína, tal como descrito, por exemplo, na Publicação PCT No. WO 92/16221).

[085] Vários tamanhos de PEG estão disponíveis comercialmente (Nektar Advanced PEGylation Catalog 2005-2006; and NOF DDS Catalogue Ver 7. 1), que são adequados para a produção de proteínas com meias-vidas circulantes direcionadas. Uma variedade de PEGs ativos têm sido utilizados, incluindo succinimidil succinato de mPEG, succinimidil carbonato de mPEG, e aldeídos de PEG, tais como MPEG-propionaldeído.

[086] Numa outra modalidade, a proteína modificada é uma proteína heme com nitrito ou inibidor de degradação de proteínas heme com nitrito. Nitrito está envolvido na regulação da produção de óxido nítrico (NO) a partir de vias independentes de óxido nítrico sintase (NOS). Nitrito inorgânico pode sofrer uma redução de um elétron de volta para NO através de vários mecanismos com proteínas de ligação de oxigênio heme (hemoglobina e mioglobina), desoxihemoglobina, desoximioglobina, xantina oxidoredutase, NOS endotelial, dismutação ácida, e os membros da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, por exemplo, proteínas heme mitocondriais sendo todos os potenciais doadores de elétrons.

[087] Nitrito de ligação a ferro heme, tal como na mioglobina, pode aumentar a capacidade da proteína heme para aumentar a expressão de proteínas de estresse, tais como, proteínas de choque térmico (por exemplo, HSP-72); HO-1; haptoglobina; hemopexina, hepcidina, IL-10, a AAT, a NGAL e/ou inibidores da HMG CoA redutase. Nitrito - Fe de ligação aqui divulgados podem também diminuir a toxicidade associada com a administração da proteína heme. Sem estar limitado pela teoria, a expressão aumentada de proteínas de estresse serve para promover citorresistência adquirida.

[088] Formas com nitrito de ingredientes ativos são usadas em modalidades particulares porque, sem estar limitado pela teoria, a divulgação atual sugere que, após a filtração glomerular, N-Mgb e SnPP submetidos a absorção túbulo proximal, onde ativam fatores de transcrição redox sensíveis, que conduz ao aumento da regulação de proteínas citoprotetoras sensíveis redox. Mais uma vez, sem ser limitado pela teoria, esta via é iniciada pelo teor em ferro (Fe) Mgb. Nitrito de ligação a Mgb Fe facilita a sinalização Fe, reduzindo a toxicidade potencial Fe. A administração concomitante de SnPP também facilita a sinalização Fe. Estes mesmos caminhos podem ser ativados nos órgãos extrarrenais através dos sítios de ligação de tecido SnPP/sinalização e absorção de Mgb via receptores depuradores.

[089] Referência a proteínas, incluindo proteínas heme, inibidores da degradação de proteínas heme, e as proteínas de estresse protetoras descritas aqui incluem variantes e análogos D substituídos dos mesmos.

[090] "Variantes" das proteínas aqui divulgadas incluem proteínas possuindo uma ou mais adições de aminoácidos, deleções, posições de parada, ou substituições, em comparação com uma proteína aqui descrita.

[091] Uma substituição de aminoácidos pode ser uma conservativa ou uma substituição não conservativa. As variantes de proteínas aqui divulgadas podem incluir aqueles que têm uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos. Uma "substituição conservadora" envolve uma substituição encontrada em um dos seguintes grupos de substituições conservativas: Grupo 1: alanina (Ala ou A), glicina (Gly ou G), Ser, Thr; Grupo 2:ácido aspártico (Asp ou D), Glu; Grupo 3:asparagina (Asn ou N), glutamina (Gln ou Q); Grupo 4:Arg, lisina (Lys ou K), histidina (His ou H); Grupo 5:Ile, leucina (Leu ou L), metionina (Met ou M), valina (Val ou V); e Grupo 6:Phe, Tyr, Trp.

[092] Além disso, os aminoácidos podem ser agrupados em grupos de substituição conservativa por função semelhante, estrutura química, ou da composição (por exemplo, ácido, básico, alifático, aromático, -contendo enxofre). Por exemplo, um agrupamento alifático pode incluir, para fins de substituição, Gly, Ala, Vai, Leu e Ile. Outros grupos que contêm aminoácidos que são considerados substituições conservativas um para o outro incluem: que contém enxofre: Met e Cys; ácidos: Asp, Glu, Asn, e Gln; alifático pequeno, resíduos não polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro e Gly; polares, resíduos com carga negativa e suas amidas: Asp, Asn, Glu, e Gln; polares, resíduos carregados positivamente: His, Arg e Lys; grande alifático, resíduos não polares:Met, Leu, Ile, Val, e Cys; e resíduos aromáticos grandes: Phe, Tyr e Trp. Informações adicionais são encontradas em Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company.

[093] Variantes das proteínas aqui divulgadas incluem sequências com pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência, pelo menos, 85 sequência%, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, pelo menos 96% de identidade de sequência, pelo menos 97% de identidade de sequência, pelo menos 98% de identidade de sequência, ou pelo menos 99% de identidade de sequência a uma proteína aqui divulgada. Mais particularmente, as variantes das proteínas aqui divulgadas incluem proteínas que compartilham: 70% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 80% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 81% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 82% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 83% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 84% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 85% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 86% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 87% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 88% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 89% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 90% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 91% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 92% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 93% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 94% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 95% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 96% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 97% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 98% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29; 99% de identidade de sequência com qualquer de, por exemplo, SEQ ID NO: 1-29.

[094] Variantes de mioglobina podem incluir proteínas de mioglobina que compartilham: 70% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 80% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 81% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 82% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 83% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 84% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 85% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 86% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 87% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 88% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 89% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 90% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 91% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 92% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 93% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 94% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO:1; 95% de identidade de sequência com por exemplo, SEQ ID NO: 21; 96% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 97% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; 98% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO: 21; ou 99% de identidade de sequência com, por exemplo, SEQ ID NO:21.

[095] "% de identidade de sequência" refere-se a uma relação entre duas ou mais sequências, tal como determinado por comparação das sequências. Na técnica, "identidade" também significa o grau de relação das sequências entre as sequências de proteínas como determinado pela correspondência entre cadeias de tais sequências. "Identidade" (muitas vezes referida como "similaridade") pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo aqueles descritos em:Computational Molecular Biology (Lesk, A. M. , ed. )Oxford University Press, Nova Iorque (1988); Biocomputing:Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W. , ed. )Academic Press, Nova Iorque (1994);Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M. , e Griffin, H. G. , eds. )Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (Von Heijne, G. , ed. )Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J. , eds. )Oxford University Press, NY (1992). Os métodos preferenciais para determinar a identidade de sequência são concebidos para dar a maior correspondência entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade de sequência e semelhança estão codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Os alinhamentos de sequências e cálculos da porcentagem de identidade podem ser realizados utilizando o programa Megalign de LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin). O alinhamento múltiplo das sequências pode também ser realizado utilizando o método Clustal de alinhamento (Higgins e Sharp CABIOS, 5, 151-153 (1989) com os parâmetros por defeito (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 10). Programas relevantes também incluem o conjunto de programas GCG (Wisconsin Package Versão 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin); BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul, et al. ,J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); DNASTAR (DNASTAR, Inc. ,Madison, Wisconsin); e o programa FASTA incorporando o algoritmo de Smith-Waterman (Pearson, Comput. Methods Genome Res. ,[Proc. Int. Symp. ](1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor (s):Suhai, Sandor. Editor:Plenum, Nova Iorque, Nova Iorque. Dentro do contexto da divulgação deve entender-se que, quando o software de análise de sequência é usado para a análise, os resultados da análise são com base nos "valores por defeito" do programa referenciado. "Valores padrão", significa conjunto de valores ou parâmetros que originalmente carregam com o software quando inicializado pela primeira vez.

[096] "Análogos D-substituídos" incluem proteína aqui descrita possuindo um ou mais aminoácidos L substituídos com um ou mais aminoácidos D. O aminoácido D pode ser o mesmo tipo de aminoácidos tal como a encontrada na sequência de referência ou pode ser um aminoácido diferente. Assim sendo, análogos D também podem ser variantes.

[097] Embora sequências exemplificativas sejam aqui fornecidas, informação da sequência fornecida por bases de dados públicas podem ser usadas para identificar sequências de proteínas relacionadas e relevantes adicionais e sequências de ácidos nucleicos que codificam tais proteínas associadas.

[098] Ferro. Referência ao ferro pode incluir moléculas de ferro ou ferro em um complexo que contém ferro. "Complexos que contem ferro" ou "complexos de ferro" são compostos que contêm ferro na (II) ou (III) estado de oxidação, complexados com um composto orgânico. Complexos de ferro incluem complexos de polímero de ferro, complexos de carboidratos de ferro, e complexos aminoglicosídeo de ferro. Estes complexos encontram-se comercialmente disponíveis e/ou podem ser sintetizados por métodos conhecidos na técnica.

[099] Exemplos de complexos de carboidrato de ferro incluem complexos de sacarídeos de ferro simples, complexos de oligossacarídeos de ferro simples e de complexos de polissacarídeos de ferro, tais como: carboximaltose de ferro, sacarose de ferro, poliisomaltose de ferro (ferro-dextrano), polimaltose de ferro (dextrina de ferro), gluconato de ferro, sorbitol de ferro, ferro hidrogenado de dextrano, que podem ser adicionalmente complexados com outros compostos, tais como sorbitol, ácido cítrico e ácido glucônico (por dextrina exemplo ferro-sorbitol-cítrico complexo de ácido e complexos de ácido sacarose-glucônico de ferro), e misturas dos mesmos.

[0100] Exemplos de complexos de ferro de aminoglicosídeos incluem sulfato de ferro de condroitina, sulfato de dermatina de ferro, sulfato de queratano de ferro, os quais podem ser adicionalmente complexados com outros compostos e misturas dos mesmos.

[0101] Exemplos de complexos de polímero de ferro incluem complexo de ácido hialurônico, os complexos de proteína de ferro, e misturas dos mesmos. Complexos de proteínas de ferro incluem ferritina, transferritina, assim como ferritina ou transferritina com substituições de aminoácidos, e misturas dos mesmos.

[0102] Modalidades particulares utilizam complexos de ferro de baixo peso molecular (por exemplo, complexos de baixo peso molecular de sacarose de ferro). O peso molecular do complexo pode ser inferior a 25.000 e não polimérico. Em modalidades adicionais, o peso molecular do complexo pode ser inferior a 12.000 ou menos do que 5000 ou menos do que 2500. É para ser entendido que quanto menor o peso molecular do complexo de ferro e, correspondentemente, menor o complexo de ferro, o mais rápido o complexo de ferro pode ser incorporados no sangue de um paciente.

[0103] Em modalidades particulares, o ferro nas reivindicações e modalidades exemplificativas refere-se a ferro sacarose.

[0104] Vitamina B12 & Metabolitos. A vitamina B12 é única entre as vitaminas na medida em que contém um íon de metal, cobalto. Modalidades particulares incluem a cianocobalamina solúvel em água que é um composto organometálico com um íon trivalente de cobalto ligado dentro de um anel de corrina. A metilcobalamina e cobalamina 5-desoxiadenosil são as formas de vitamina B12 utilizadas principalmente pelo corpo humano. Formas adicionais incluem cobalamina adenosil e cobalamina hidroxil. A vitamina B12 pode ser obtida a partir de qualquer fonte natural ou sintética adequada, e todos os análogos, derivados, sais, e pró-drogas, bem como misturas dos mesmos.

[0105] Em modalidades, um derivado de vitamina B12 que pode ser utilizado é produzido por clivagem de, pelo menos, uma porção de PO4- grupo de vitamina B12. Por exemplo, o grupo PO4 de vitamina B12 pode ser clivado utilizando uma nuclease, ou removido com uma nuclease em combinação com uma fosfatase. Um derivado da vitamina B12 pode ter uma estrutura

em que R1 pode ser 5'-desoxiadenosil, CH3, OH, ou CN; R2 pode ser OH ou H; e R3 pode ser OH ou H.

[0106] Em modalidades, a vitamina B12 pode ser acoplada com um complexo de metal-sacarídeo. Além disso, um derivado de vitamina B12 pode ser acoplado com um complexo de metal-sacarídeo. Em algumas modalidades, um complexo de metal- sacarídeo pode ser derivado de um dissacarídeo. Por exemplo, um complexo de metal-sacarídeo pode ser derivado a partir de sacarose. Em outros exemplos, um complexo de metal-sacarídeo pode ser derivado a partir de lactose. Em exemplos ilustrativos, o complexo de metal-sacarídeo pode ser sacarose de ferro. Ao acoplar a vitamina B12, com a sacarose de ferro, ferro e vitamina B12 podem ser distribuídas a um órgão usando uma única estrutura.

[0107] A ligação entre um complexo de metal-sacarídeo e vitamina B12 ou um derivado de vitamina B12 pode ser formado usando um ligante de hidrazina ácido- lábil. Além disso, a ligação entre um complexo de metal-sacarídeo e vitamina B12 ou um derivado de vitamina B12 pode ser formado usando um ligante de hidrazona lábil ácida. Exemplos de um agente de ligação de hidrazona utilizado em conjunto com a vitamina B12 é discutido em Bagnato JD, AL Eilers, Horton RA, Grisson CB:Synthesis and characterization of a cobalamin-colchicine conjugate as a novel tumor-targeted cytotoxid. J. Org. Chem. 2004:69, 8987-8996. Em outras modalidades, a ligação entre um complexo de metal-sacarídeo e vitamina B12 ou um derivado de vitamina B12 pode ser formado usando um poliéter. Para ilustrar, o polietileno-glicol pode ser usado para ligar um complexo de metal-sacarídeo para a vitamina B12 ou um derivado de vitamina B12. Em modalidades adicionais, a ligação entre um complexo de metal- sacarídeo e vitamina B12 ou um derivado de vitamina B12 pode ser formada utilizando um agente de ligação peptídico. Em exemplos ilustrativos, um ligante de poli-glicina- serina pode ser usado para acoplar um complexo de metal-sacarídeo para a vitamina B12 ou um derivado de vitamina B12. Em outras modalidades, a ligação entre um complexo de metal-sacarídeo e vitamina B12 ou um derivado de vitamina B12 pode ser formado usando em um ou mais peptídeos. Em outros exemplos ilustrativos, uma poliamida pode ser usada para ligar um complexo de metal-sacarídeo com a vitamina B12 ou um derivado de vitamina B12. Em exemplos ilustrativos particulares, uma poliamida resistente a protease pode ser usada para ligar um complexo de metal- sacarídeo com a vitamina B12 ou um derivado de vitamina B12.

[0108] Em alguns casos, a ligação entre um complexo de metal-sacarídeo e vitamina B12 ou um derivado de vitamina B12 pode ser formado em múltiplos locais do complexo de metal-sacarídeo. Por exemplo, a ligação entre um complexo de metal- sacarídeo e vitamina B12 ou um derivado de vitamina B12 pode estar em múltiplos sítios de hidroxil do complexo de metal-sacarídeo. Em outras modalidades, a ligação entre um complexo de metal-sacarídeo e vitamina B12 ou um derivado de vitamina B12 pode ser num único sítio do complexo de metal-sacarídeo. Para ilustrar, a ligação entre um complexo de metal-sacarídeo e vitamina B12 ou um derivado de vitamina B12 pode ser feita em um único sítio de hidroxil do complexo de metal-sacarídeo. Além disso, a ligação entre um complexo de metal-sacarídeo e a vitamina B12 pode ser com o grupo fosfato de vitamina B12 e um grupo hidroxil do complexo de metal- sacarídeo. Além disso, a ligação entre um complexo de metal-sacarídeo e um derivado da vitamina B12 pode situar-se entre um grupo hidroxil do complexo de metal- sacarídeo e um sítio resultante da clivagem do grupo de fosfato de vitamina B12.

[0109] Estruturas exemplo, tendo uma ligação entre um complexo de metal- sacarídeo e vitamina B12 pode ter a seguinte forma

onde R1 pode ser 5'-desoxiadenosil, CH3, OH, ou CN; A é um grupo fosfato, L representa um ligante, B é uma estrutura baseada em sacarídeo, e M é um metal complexado com a estrutura baseada em sacarídeo. Em modalidades ilustrativas, A pode ser PO4, G pode ser um agente de ligação de hidrazona, B pode ser uma estrutura baseada em sacarídeo, e M pode ser Fe. Em modalidades, B pode incluir 10-16 átomos de carbono, 9-15 átomos de oxigênio, e 16-28 átomos de hidrogênio. Em modalidades particulares, B pode ser derivado a partir de sacarose.

[0110] Estruturas exemplo, tendo uma ligação entre um complexo de metal- sacarídeo e um derivado de vitamina B12 pode ter a seguinte forma:

onde R1 pode ser 5'-desoxiadenosil, CH3, OH, ou CN; R2 pode ser OH ou H; L é um ligante, B é uma estrutura baseada em sacarídeo, e M é um metal complexado com a estrutura baseada em sacarídeo. Em modalidades ilustrativas, L pode ser um agente de ligação de hidrazona e M pode ser Fe. Em modalidades, B pode incluir 10- 16 átomos de carbono, 9-15 átomos de oxigênio, e 16-28 átomos de hidrogênio. Em modalidades particulares, B pode ser derivado a partir de sacarose.

[0111] Estruturas exemplo adicionais, tendo uma ligação entre um complexo de metal-sacarídeo e um derivado de vitamina B12 podem ter a seguinte forma

onde R1 pode ser 5'-desoxiadenosil, CH3, OH, ou CN; R3 pode ser OH ou H; L é um ligante, B é uma estrutura baseada em sacarídeo, e M é um metal complexado com a estrutura baseada em sacarídeo. Em modalidades ilustrativas, L pode ser um agente de ligação de hidrazona e M pode ser Fe. Em modalidades, B pode incluir 10-16 átomos de carbono, 9-15 átomos de oxigênio, e 16-28 átomos de hidrogênio. Em modalidades particulares, B pode ser derivado a partir de sacarose.

[0112] Outras estruturas exemplo, tendo uma ligação entre um complexo de metal-sacarídeo e um derivado de vitamina B12 pode ter a seguinte forma:

onde R1 pode ser 5'-desoxiadenosil, CH3, OH, ou CN; L é um ligante, B é uma estrutura baseada em sacarídeo, e M é um metal complexado com a estrutura baseada em sacarídeo. Em modalidades ilustrativas, L pode ser um agente de ligação de hidrazona e M pode ser Fe. Em modalidades, B pode incluir 10-16 átomos de carbono, 9-15 átomos de oxigênio, e 16-28 átomos de hidrogênio. Em modalidades particulares, B pode ser derivado a partir de sacarose.

[0113] Estruturas exemplo, tendo uma ligação entre múltiplos complexos de metal-sacarídeo e um derivado de vitamina B12 podem ter a seguinte forma

onde R1 pode ser 5'-desoxiadenosil, CH3, OH, ou CN; L1 é um primeiro ligante, L2 é um segundo ligante, B1 é uma primeira estrutura baseada em sacarídeo, B2 é uma segunda estrutura baseada em sacarídeo, M1 é um primeiro metal, e M2 é um segundo metal complexado com a estrutura baseada em sacarídeo. Em modalidades ilustrativas, L1 e L2 podem ser ligantes de hidrazona e M1 and M2 podem ser Fe. Em modalidades, B1 and B2 incluir 10-16 átomos de carbono, 9-15 átomos de oxigênio, e 16-28 átomos de hidrogênio. Em modalidades particulares, B1 and B2 podem ser derivados a partir de sacarose.

[0114] Em modalidades, um complexo de metal-sacarídeo pode ser derivado de um dissacarídeo. Por exemplo, um complexo de metal-sacarídeo pode ser derivado a partir de sacarose. Em outros exemplos, um complexo de metal-sacarídeo pode ser derivado a partir de lactose. Estruturas exemplo de um complexo de metal-sacarídeo podem ter a seguinte forma:

deve ser entendido que, embora a estrutura acima indique um único átomo de Fe complexado com um composto derivado de sacarose, um ou mais átomos de Fe pode ser complexado com uma ou mais unidades de repetição do composto derivado de sacarose para equilibrar as cargas dos grupos conforme necessário.

[0115] Composições. Proteínas heme (incluindo modificações, variantes e análogos D-substituídos dos mesmos), inibidores da degradação de proteína heme (por exemplo, Inibidores HO-1, protoporfirinas, hemina e/ou hematina), ferro e vitamina B12 (individualmente e coletivamente, "ingredientes ativos") podem ser fornecidos individualmente ou em combinação dentro de uma composição. Em modalidades particulares, a composição inclui, pelo menos, uma proteína heme e/ou pelo menos um inibidor da degradação de proteínas heme e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável. Sais e/ou pró-drogas de ingredientes ativos também pode ser usados.

[0116] Um sal farmaceuticamente aceitável inclui qualquer sal que retenha a atividade do ingrediente ativo e é aceitável para uso farmacêutico. Um sal farmaceuticamente aceitável refere-se também a qualquer sal que pode formar in vivo como um resultado da administração de um ácido, num outro sal, ou um pró-droga que é convertido num ácido ou sal.

[0117] Sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis adequados podem ser preparados a partir de um ácido inorgânico ou um ácido orgânico. Exemplos desses ácidos inorgânicos são ácido clorídrico, hidrobrômico, iodídrico, nítrico, carbônico, sulfúrico e fosfórico. Ácidos orgânicos apropriados podem ser selecionados em alifáticos, cicloalifáticos, aromáticos, arilalifáticos, heterocíclicos, carbonatos e sulfônico classes de ácidos orgânicos.

[0118] Sais de adição de base farmaceuticamente aceitávis adequados incluem sais metálicos feitos de alumínio, cálcio, lítio, magnésio, potássio, sódio e zinco ou sais orgânicos feitos de N, N' - dibenziletileno-diamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, N-metilglucamina, lisina, arginina e procaína.

[0119] Uma pró-droga inclui um ingrediente ativo que é convertido para um composto terapeuticamente ativo depois da administração, tais como por clivagem de uma proteína ou por hidrólise de um grupo biologicamente lábil.

[0120] Em algumas modalidades, as composições incluem ingredientes ativos de, pelo menos, 0,1% p/v da composição; pelo menos 1% p/v da composição; pelo menos 10% p/v da composição; pelo menos 20% p/v da composição; pelo menos 30% p/v da composição; pelo menos 40% p/v da composição; pelo menos 50% p/v da composição; pelo menos 60% p/v da composição; pelo menos 70% p/v da composição; pelo menos 80% p/v da composição; pelo menos 90% p/v da composição; pelo menos 95% p/v da composição; ou, pelo menos, 99% p/v da composição.

[0121] Em outras modalidades, ingredientes ativos podem ser fornecidos como parte de uma composição que inclui, por exemplo, pelo menos de 0,1% p/p de composição; pelo menos 1% p/p de composição; pelo menos 10% p/p de composição; pelo menos 20% p/p de composição; pelo menos 30% p/p de composição; pelo menos 40% p/p de composição; pelo menos 50% p/p de composição; pelo menos 60% p/p de composição; pelo menos 70% p/p de composição; pelo menos 80% p/p de composição; pelo menos 90% p/p de composição; pelo menos 95% p/p de composição; ou pelo menos 99% p/p de composição.

[0122] Modalidades particulares incluem um inibidor de degradação de proteína heme com nitrito com uma proteína heme com nitrito. Modalidades particulares incluem uma protoporfirina com nitrito com uma proteína heme com nitrito. Modalidades particulares incluem uma protoporfirina de metal com nitrito com uma proteína heme com nitrito. Modalidades particulares incluem um SnPP com nitrito com uma proteína heme que está com nitrito. Modalidades particulares incluem uma hemina com nitrito com uma proteína heme com nitrito. Modalidades particulares incluem uma hematina com nitrito com uma proteína heme com nitrito. Em formas particulares destas modalidades exemplificativas, a proteína heme com nitrito é mioglobina. Modalidades particulares também incluem mais de um inibidor de degradação de proteína heme com nitrito (por exemplo, uma protoporfirina com nitrito, hemina com nitrito e/ou hematina com nitrito) com uma proteína heme (por exemplo, mioglobina ou mioglobina com nitrito). Em outras modalidades particulares, uma combinação de inibidor da degradação de proteínas heme é fornecida em que não todos os componentes da combinação são com nitrito.

[0123] Modalidades particulares incluem ferro, opcionalmente, em combinação com um metal protoporfirina, SnPP e/ou vitamina B12. O ferro pode ser sacarose de ferro. Estas modalidades além disso podem incluir proteínas heme (por exemplo, mioglobina ou mioglobina com nitrito) e/ou inibidor de degradação de proteína heme (por exemplo, protoporfirinas, hemina hematina e/ou suas formas com nitrito). Quando modalidades utilizam ferro em combinação com a vitamina B12, ferro e B12 podem ser complexados ou reticulados em uma única unidade.

[0124] Veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplificativos geralmente usados incluem toda e quaisquer agentes retardadores de absorção, antioxidantes, ligantes, agentes de tamponamento, agentes de volume ou enchimentos, agentes quelantes, revestimentos, agentes de desintegração, meios de dispersão, géis, agentes isotônicos, lubrificantes, conservantes, sais, solventes ou co-solventes, estabilizadores, surfactantes, e/ou veículos de distribuição.

[0125] Antioxidantes exemplificativos incluem ácido ascórbico, metionina e vitamina E.

[0126] Agentes de tamponamento exemplificativos incluem tampões de citrato, tampões de succinato, tampões tartarato, fumarato, tampões de gluconato, tampões de oxalato, tampões lactato, tampões de acetato, tampões de fosfato, tampões de histidina e/ou sais de trimetilamina.

[0127] Um exemplo de agente quelante é EDTA.

[0128] Agentes isotônicos exemplificativos incluem álcoois de açúcar poli- hídricos, incluindo álcoois de açúcar tri-hídricos ou superiores, tais como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol ou manitol.

[0129] Conservantes exemplares incluem fenol, álcool benzílico, meta-cresol, metilparabeno, propilparabeno, cloreto de amônia octadecildimetilbenzil, halogenetos de benzalcônio, cloreto de hexametônio, alquilparabenos tais como metil ou propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclo-hexanol, e 3-pentanol.

[0130] Estabilizantes se referem a uma categoria ampla de excipientes que pode variar em função de um agente espessante para um aditivo que solubiliza o ingrediente ativo ou ajuda a prevenir a desnaturação ou aderência à parede do recipiente. Estabilizantes típicos podem incluir ser álcoois de açúcar poli-hídricos; aminoácidos, tais como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutâmico e treonina, açúcares orgânicos ou álcoois de açúcar, tais como lactose, trealose, estaquiose, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol e ciclitóis, tais como inusitol; PEG; polímeros de aminoácidos; enxofre que contém agentes redutores, tais como ureia, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, ct-monotioglicerol e sulfato de sódio tio; polipéptidos de baixo peso molecular (isto é,<10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro humano, albumina de soro bovino, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como por exemplo, monossacáridos de polivinilpirrolidona, tais como xilose, manose, frutose e glicose; dissacarídeos tais como lactose, maltose e sacarose; trissacarídeos tais como rafinose, e polissacarídeos tais como dextrano. Estabilizantes estão normalmente presentes na faixa de 0,1 a 10.000 partes em peso com base no peso do ingrediente ativo.

[0131] As composições aqui divulgadas podem ser formuladas para administração através de, por exemplo, injeção, inalação, infusão, perfusão, lavagem, ou ingestão. As composições aqui descritas podem ainda ser formuladas para administração intravenosa, intradérmica, intra-arterial, intranodal, intralinfática, intraperitoneal, intralesional, intraprostática, intravaginal, intra-retal, tópica, intratecal, intratumoral, intramuscular, intravesicular, oral e/ou subcutânea e, mais particularmente, por administração intravenosa, intradérmica, intra-arterial, intranodal, intralinfática, intraperitoneal, intralesional, intraprostática, intravaginal, intra-retal, intratecal, intratumoral, intramuscular, intravesicular, e/ou injeção subcutânea.

[0132] Para injeção, as composições podem ser formuladas como soluções aquosas, tais como tampões, incluindo solução de Hank, solução de Ringer, ou solução salina fisiológica. A solução aquosa pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, a formulação pode estar na forma liofilizada e/ou pó para reconstituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril isenta de pirogênios, antes do uso. Modalidades particulares são formuladas para administração intravenosa.

[0133] Para administração oral, as composições podem ser formuladas como comprimidos, comprimidos, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, lamas, suspensões e afins. Para formulações sólidas orais como, por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos, excipientes adequados incluem ligantes (goma tragacanth, acácia, amido de milho, gelatina), enchimentos tais como açúcares, por exemplo, lactose, sacarose, manitol e sorbitol; fosfato bicálcico, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio; preparações de celulose, tais como o amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, fécula de batata, gelatina, goma tragacanth, celulose metílica, hidroxipropilmetil-celulose, carboxi-metilcelulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona (PVP); agentes de granulação; e agentes de ligação. Se desejado, agentes de desintegração podem ser adicionados, tais como o amido de milho, fécula de batata, ácido algínico, polivinilpirrolidona reticulada, ágar, ou ácido algínico ou sal dos mesmos como alginato de sódio. Se desejado, formas farmacêuticas sólidas podem ser revestidas de açúcar ou de revestimento entérico usando as técnicas padrão. Aromatizantes, tais como hortelã-pimenta, óleo de gualtéria, aroma de cereja, aroma de laranja, etc. também podem ser usados.

[0134] Composições podem ser formuladas como um aerossol. Numa modalidade o aerossol é fornecido como parte de um inalador de pó anidro, líquido ou seco. Aerossóis de pacotes pressurizados ou nebulizadores também podem ser usados com um propulsor apropriado, por exemplo, diclorodifluorometano, tricloromonofluormetano, dichlorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, uma unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo uma válvula para administrar uma quantidade doseada. Cápsulas e cartuchos de gelatina para uso em um inalador ou insuflador podem também ser formulados contendo uma mistura de pó da proteína heme e uma base de pó adequada, tal como a lactose ou o amido.

[0135] Composições também podem ser formuladas como preparações de depósito. Preparações de depósito podem ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados moderadamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.

[0136] Além disso, as composições podem ser formuladas como sistemas de liberação sustentada utilizando matrizes de polímeros sólidos semipermeáveis contendo pelo menos um ingrediente ativo. Vários materiais de liberação sustentada foram estabelecidos e são conhecidos por aqueles versados na técnica. Sistemas de liberação sustentada podem, dependendo da sua natureza química, liberar ingredientes ativos após a administração por algumas semanas a até mais de 100 dias. As preparações de depósito podem ser administradas por injeção; injeção parentérica; instilação; ou a implantação em tecidos moles, uma cavidade do corpo, ou, ocasionalmente, em um vaso sanguíneo com injeção através de agulhas finas.

[0137] Formulações de depósito podem incluir uma variedade de polímeros bioreabsorvíveis, incluindo poli(láctico), poli(glicólico), poli(caprolactona) e poli(láctico)-co(glicólico) (PLG) de proporções láctico:glicólico desejáveis, massas moleculares médias, polidispersões e químicas grupo terminal. Tipos diferentes de polímero em proporções diferentes, utilizando vários tipos de mistura, podem resultar em características que emprestam de cada um dos polímeros contribuintes.

[0138] O uso de diferentes solventes (por exemplo, diclorometano, clorofórmio, acetato de etila, triacetina, N-metil pirrolidona, tetrahidrofurano, fenol ou combinações dos mesmos) pode alterar tamanho microparticulado e estrutura a fim de modular as características de liberação. Outros solventes úteis incluem água, etanol, dimetilsulfóxido (DMSO), N-metil-2-pirrolidona (NMP), acetona, metanol, álcool isopropílico (IPA), benzoato de etila e benzoato de benzil.

[0139] Modificadores de liberação exemplificativos podem incluir agentes surfactantes, detergentes, melhoradores de viscosidade da fase interna, agentes complexantes, moléculas surfactantes, co-solventes, agentes quelantes, estabilizantes, derivados de celulose, (hidroxipropil) metil celulose (HPMC), acetato de HPMC, acetato de celulose, pluronics (por exemplo, F68/F127), polissorbatos, Span® (Croda Americas, Wilmington, Delaware), poli(álcool vinil) (PVA), Brij® (Croda Americas, Wilmington, Delaware), isobutirato de acetato de sacarose (SAIB), sais e tampões.

[0140] Excipientes que particionam para o limite da fase externa de micropartículas como surfactantes incluindo polissorbatos, dioctilsulfosuccinatos, poloxâmeros, PVA, podem também alterar propriedades incluindo taxas de estabilidade e de erosão de partícula, estrutura de hidratação e canal, transporte interfacial e cinética de forma favorável.

[0141] O processamento adicional das formulações de depósito de liberação controlada divulgado pode usar excipientes estabilizadores incluindo manitol, sacarose, trealose e glicina com outros componentes, tais como polissorbatos, PVAs, e dioctilsulfosuccinatos em tampões tais como Tris, citrato, ou histidina. Um ciclo de liofilização também pode ser usado para produzir pós de umidade muito baixa que reconstituem com características semelhantes de tamanho e o desempenho da suspensão original.

[0142] Qualquer composição aqui revelada pode vantajosamente incluir outros veículos farmaceuticamente aceitáveis os quais incluem aqueles que não produzem reações adversas significativamente, alérgicas, ou outros inconvenientes que superam o benefício da administração. Formulações e veículos farmaceuticamente aceitáveis são divulgados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Ed. Mack Printing Company, 1990. Além disso, formulações podem ser preparadas para atender a esterilidade, pirogênicos, gerais de segurança e normas de pureza conforme exigido pelos U.S. FDA Office of Biological Standards e/ou outras agências reguladoras estrangeiras relevantes.

[0143] Kits. Também são aqui divulgados kits incluindo um ou mais recipientes incluindo um ou mais dos ingredientes ativos e/ou composições aqui descritas. Em várias modalidades, os kits podem incluir um ou mais recipientes contendo um ou mais ingredientes ativos e/ou composições para ser usado em combinação com os ingredientes ativos e/ou composições aqui descritas. Associado com tal(is) recipientes(s) pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação pela agência da fabricação, uso ou venda para administração em seres humanos.

[0144] Opcionalmente, os kits aqui descritos ainda incluem instruções para usar o kit nos métodos divulgados aqui. Em várias modalidades, o kit pode incluir instruções sobre a preparação, os ingredientes ativos e/ou composições para administração; administração dos ingredientes ativos e/ou composições; níveis de referência apropriados para interpretar os resultados associados ao uso do kit; destinação adequada dos resíduos relacionados; e semelhantes. As instruções podem estar na forma de instruções impressas fornecidas no kit ou as instruções podem ser impressas sobre uma parte do kit em si. As instruções podem ser na forma de uma folha, panfleto, folheto, CD-Rom ou dispositivo de leitura por computador, ou pode fornecer indicações para instruções em um local remoto, como um website. As instruções podem estar em inglês e/ou em qualquer língua nacional ou regional. Em várias modalidades, os possíveis efeitos secundários e contraindicações para utilização posterior dos componentes do kit com base nos sintomas de um sujeito podem ser incluídos. Os kits e instruções também podem ser adaptados de acordo com o tipo de órgão a ser protegido e o tipo de lesão, que o órgão pode encontrar.

[0145] Em várias modalidades, a embalagem, ingredientes ativos e/ou composições e instruções são combinados em um kit pequeno, compacto, com instruções impressas para uso de cada um dos ingredientes ativos e/ou composições. Em várias modalidades nas quais se prevê mais do que um ingrediente e/ou composição ativa, a sequenciação de utilização dos ingredientes e/ou composições ativas podem ser marcadas com o kit.

[0146] Em várias modalidades, os kits aqui descritos incluem alguns ou todos os medicamentos necessários para usar o kit de forma eficaz, eliminando a necessidade de localizar e recolher tais suprimentos médicos. Tais medicamentos podem incluir seringas, ampolas, tubos, máscara, um dispositivo de transferência de fluidos autoinjeções, uma tampa de injeção, esponjas, tiras de adesivo estéril, Chloraprep, luvas e semelhantes. Variações no teor de qualquer um dos kits descritos aqui podem ser feitas. Kits particulares fornecem materiais para administrar composições através da administração intravenosa.

[0147] Métodos de Uso. Como afirmado, as composições, kits e métodos divulgados aqui podem ser usados para proteger os órgãos de uma lesão por indução de citorresistência adquirida na ausência de uma lesão. Existem numerosos usos potenciais para as composições, kits e métodos, alguns dos quais estão aqui descritos.

[0148] Métodos divulgados aqui incluem tratamento de órgãos com ingredientes ativos divulgados aqui, incluindo sais e pró-drogas dos mesmos. Tratamento de órgãos inclui administração de quantidades terapeuticamente eficazes. As quantidades terapeuticamente eficazes incluem aquelas que fornecem quantidades eficazes, os tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos.

[0149] Um órgão é uma parte de um sujeito que é tipicamente autossuficiente e tem uma função vital específica. Exemplos de órgãos são o coração, fígado, rins, baço, pâncreas, cérebro, pulmões, intestinos, estômago, etc. Em modalidades particulares, quantidades terapeuticamente eficazes podem ser administradas diretamente para os órgãos.

[0150] As quantidades terapeuticamente eficazes podem também ser administradas a órgãos através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz para o sujeito em que o órgão reside. Sujeitos incluem os humanos, animais veterinários (cães, gatos, répteis, aves, etc. ), animais (cavalos, gado, cabras, porcos, galinhas, etc. ) e animais de pesquisa (macacos, ratos, camundongos, peixes, etc. ). Tratamento de sujeitos inclui administração de quantidades terapeuticamente eficazes. Assim, salvo indicação em contrário, a administração de um órgão pode ser pela administração a um sujeito, resultando em distribuição fisiológica ao órgão ou pode ser pela administração diretamente ao órgão.

[0151] Uma "quantidade eficaz" é a quantidade de um ingrediente ativo ou composição necessária para resultar numa alteração fisiológica desejada em um órgão ou sujeito. Quantidades eficazes são muitas vezes administradas para fins de pesquisa. As quantidades eficazes aqui descritas protegem os órgãos de lesões através da indução de citorresistência adquirida na ausência de uma lesão.

[0152] Um "tratamento profilático" inclui um tratamento administrado a um órgão que não exibe sinais ou sintomas de lesão de órgão ou exibe apenas os primeiros sinais ou sintomas de lesão de órgão, tal que o tratamento é administrado com a finalidade de diminuir, impedindo ou diminuindo o risco de desenvolver ainda mais a lesão de órgão. Assim, um tratamento profilático funciona como um tratamento preventivo contra a lesão de órgão.

[0153] Um "tratamento terapêutico" inclui um tratamento administrado a um órgão que apresenta sintomas ou sinais de lesão de órgão e é administrado ao órgão com a finalidade de reduzir o agravamento da lesão de órgão.

[0154] A quantidade de dose efetiva administrada a um determinado órgão (ou sujeito) pode ser determinada por um médico, veterinário, ou pesquisador tomando em consideração parâmetros tais como fatores físicos e fisiológicos, incluindo alvo; peso corporal; a gravidade da condição; próximo insulto, quando conhecido; tipo de órgão que necessita de proteção; intervenções terapêuticas anteriormente ou em simultâneo; idiopatia do sujeito; e a via de administração.

[0155] A quantidade e a concentração de ingrediente ativo numa composição, bem como a quantidade da composição administrada, podem ser selecionadoas com base em fatores clinicamente relevantes, a solubilidade do ingrediente ativo na composição, a potência e atividade do ingrediente ativo, e o modo de administração da composição, bem como se o ingrediente ativo é modificado (por exemplo, nitrado, PEGuilado) ou administrado em combinação com um inibidor da degradação de proteínas heme (por exemplo, um inibidor de HO-1), entre outras considerações.

[0156] Uma composição incluindo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ingrediente(s) ativo aqui divulgado pode ser administrada por via intravenosa a um sujeito para a proteção de órgãos de uma forma clinicamente segura e eficaz, incluindo uma ou mais administrações separadas da composição. Por exemplo, de 0,05 mg/kg a 5,0 mg/kg podem ser administradas a um sujeito por dia em uma ou mais doses (por exemplo, doses de 0,05 mg/kg QD, 0,10 mg/kg QD, 0,50 mg/kg QD, 1,0 mg/kg QD, 1,5 mg/kg QD, 2,0 mg/kg QD, 2,5 mg/kg QD, 3,0 mg/kg QD, 0,75 mg/kg BID, 1,5 mg/kg BID, ou 2,0 mg/kg BID). Para determinados órgãos e indicações, a dose diária total de um ingrediente ativo pode ser de 0,05 mg/kg a 3,0 mg/kg administrados por via intravenosa a um sujeito de uma a três vezes por dia, incluindo a administração de doses diárias totais de 0,05-3,0, 0,1- 3,0, 0,5-3,0, 1,0-3,0, 1,5-3,0, 2,0-3,0, 2,5-3,0 e 0,5-3,0 mg/kg/dia de composição utilizando 60 minutos de dosagem de infusão intravenosa QD, BID ou TID. Num exemplo particular, as composições podem ser administradas por via intravenosa QD ou BID a um sujeito com, por exemplo, doses diárias totais de 1,5 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg de uma composição com um máximo de 92-98% em peso/peso de uma proteína heme.

[0157] Doses úteis adicionais podem frequentemente variar de 0,1 a 5 μg/kg ou 0,5-1 μg/kg. Em outros exemplos, uma dose pode incluir 1 μg /kg, 5 μg /kg, 10 μg /kg, 15 μg /kg, 20 μg /kg, 25 μg /kg, 30 μg /kg, 35 μg/kg, 40 μg/kg, 45 μg/kg, 50 μg/kg, 55 μg/kg, 60 μg/kg, 65 μg/kg, 70 μg/kg, 75 μg/kg, 80 μg/kg, 85 μg/kg, 90 μg/kg, 95 μg/kg, 100 μg/kg, 150 μg/kg, 200 μg/kg, 250 μg/kg, 350 μg/kg, 400 μg/kg, 450 μg/kg, 500 μg/kg, 550 μg/kg, 600 μg/kg, 650 μg/kg, 700 μg/kg, 750 μg/kg, 800 μg/kg, 850 μg/kg, 900 μg/kg, 950 μg/kg, 1000 μg/kg, 0,1 a 5 mg/kg, ou de 0,5 a 1 mg/kg. Em outros exemplos, uma dose pode incluir 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 55 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 150 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg, ou mais.

[0158] Cada uma das doses descritas de ingredientes ativos pode ser uma proteína heme por si só, proteínas heme em combinação, um inibidor da degradação de proteínas heme sozinho, inibidores da degradação de proteínas heme em combinação, ou uma combinação de uma ou mais proteínas heme e um ou mais inibidores da degradação de proteínas heme, ferro e/ou vitamina B12. Em modalidades particulares, quando incluídos em combinações para produzir uma dose, tal como uma dose neste documento, os substituintes na combinação podem ser proporcionados em proporções exemplificativas, tais como: 1:1; 1:1,25; 1:1,5; 1:1,75; 1:8; 1:1,2; 1:1,25; 1:1,3; 1:1,35; 1:1,4; 1:1,5; 1:1,75; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6:1:7; 1:8; 1:9; 1:10; 1:15; 1:20; 1:30; 1:40; 1:50; 1:60; 1:70; 1:80; 1:90; 1:100; 1:200; 1:300; 1:400; 1:500; 1:600; 1:700; 1:800; 1:900; 1:1000; 1:1:1; 1:2:1; 1:3:1; 1:4:1; 1:5;1; 1:10:1; 1:2:2; 1:2:3; 1:3:4; 1:4:2; 1:5;3; 1:10:20; 1:2:1:2; 1:4:1:3; 1:100:1:1000; 1:25:30:10; 1:4:16:3; 1:1000:5:15; 1:2:3:10; 1:5:15:45; 1:50:90:135; 1:1,5:1,8:2,3; 1:10:100:1000 ou razões adicionais benéficas, dependendo do número e identidade dos substituintes em combinação para alcançar a dosagem indicada. Os substituintes de uma combinação podem ser fornecidos dentro da mesma composição ou em composições diferentes.

[0159] As quantidades terapeuticamente eficazes podem ser alcançadas através da administração de doses únicas ou múltiplas, durante o decurso de um regime de tratamento (por exemplo, QID, TID, BID, diariamente, em dias alternados, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada 6 dias, semanalmente, a cada 2 semanas, a cada 3 semanas, mensalmente, a cada 2 meses, a cada 3 meses, a cada 4 meses, a cada 5 meses, a cada 6 meses, a cada 7 meses, a cada 8 meses, a cada 9 meses, a cada 10 meses, a cada 11 meses ou anualmente).

[0160] Em modalidades particulares, as composições são administradas dentro de 48 horas de uma próxima lesão, no prazo de 46 horas de uma próxima lesão, no prazo de 44 horas de uma próxima lesão, no prazo de 42 horas de uma próxima lesão, no prazo de 40 horas de uma próxima lesão, no prazo de 38 horas de uma próxima lesão, dentro de 36 horas de uma próxima lesão, no prazo de 34 horas de uma próxima lesão, no prazo de 32 horas de uma próxima lesão, dentro de 30 horas de uma próxima lesão, dentro de 28 horas de uma próxima lesão, dentro de 26 horas de uma próxima lesão, no prazo de 24 horas de uma próxima lesão, no prazo de 22 horas de uma próxima lesão, no prazo de 20 horas de uma próxima lesão, no prazo de 18 horas de uma próxima lesão, no prazo de 16 horas de uma próxima lesão, no prazo de 14 horas de uma próxima lesão, no prazo de 12 horas de uma próxima lesão, no prazo de 10 horas de uma próxima lesão, no prazo de 8 horas de uma próxima lesão, no prazo de 6 horas de uma próxima lesão, no prazo de 4 horas de uma próxima lesão, ou no prazo de 2 horas de uma próxima lesão. Em uma modalidade particular, as composições são administradas dentro de 18 horas de uma próxima lesão.

[0161] Em modalidades particulares adicionais, as composições são administradas, pelo menos, 48 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos, 46 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos, 44 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos, 42 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos, 40 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos, 38 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos 36 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos 34 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos 32 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos 30 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos, 28 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos 26 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos 24 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos 22 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos 20 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos 18 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos, 16 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos 14 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos, 12 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos 10 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos 8 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos 6 horas antes de uma próxima lesão, pelo menos 4 horas antes de uma próxima lesão, ou pelo menos 2 horas antes de uma próxima lesão. Em uma modalidade particular, as composições são administradas, pelo menos, 18 horas antes de uma próxima lesão.

[0162] Proteção de Transplante. Em modalidades particulares, os órgãos são protegidos de danos durante a transplantação. As composições podem ser administradas (i) um doador de órgãos, antes do isolamento do órgão do doador; (ii) para o órgão isolado antes do transplante, e/ou (iii) para o receptor de transplante de órgão. Este modo de utilização pode ser aplicado a qualquer órgão suscetível de transplante a partir de um sujeito individual para um segundo sujeito individual. Em modalidades particulares, quantidades terapeuticamente eficazes podem ser entregues diretamente a um órgão após a remoção de um sujeito, ou antes da implantação em um segundo sujeito.

[0163] Proteção do sistema renal. Até a divulgação atual, não havia agentes capazes de prevenir ou mitigar a ocorrência de AKI em pacientes de alto risco, tais como sujeitos submetidos à cirurgia, circulação extracorpórea, ou toxicidade de radiocontraste. É digno de nota que a insuficiência renal aguda é um fator de risco para morbidade e mortalidade, bem como a necessidade de diálise renal em longo prazo. A última custa bilhões de dólares do Governo Federal em seu programa de estágio final da doença renal/Medicare. Assim, a prevenção de insuficiência renal aguda/AKI apresentou uma necessidade clínica crítica e completamente insatisfeita.

[0164] "Lesão renal aguda", (AKI), também conhecido como "insuficiência renal aguda" (ARF) ou "insuficiência aguda do rim", refere-se a uma doença ou condição em que uma rápida perda de função renal ocorre devido a danos nos rins, resultando em retenção de nitrogenados (ureia e creatinina) e resíduos de produtos não nitrogenados que são normalmente excretados pelo rim. Dependendo da gravidade e da duração da disfunção renal, esta acumulação é acompanhada por distúrbios metabólicos, tais como a acidose metabólica (acidificação do sangue) e hipercalemia (níveis elevados de potássio), alterações no equilíbrio de fluidos do corpo, efeitos em muitos outros sistemas de órgãos/falência de órgãos do sistema, sobrecarga de volume intravascular, coma e morte. Pode ser caracterizada por oligúria ou anúria (diminuição ou a cessação da produção de urina), embora possam ocorrer ARF não oligúrica. AKI é uma complicação grave em hospitais, resultando em uma hospitalização prolongada e elevada mortalidade. Doença cardíaca e cirurgia cardíaca são duas causas comuns de AKI. Uma vez que os pacientes têm de AKI, a mortalidade daí derivada é alta.

[0165] AKI pode ser uma consequência de várias causas, incluindo a) pré- renais (causas no fornecimento de sangue), que inclui, hipovolemia ou diminuição do volume sanguíneo, geralmente de choque ou desidratação e perda de fluidos ou o uso de diuréticos excessivo; síndrome hepato-renal, em que a perfusão renal é comprometida devido à insuficiência hepática; problemas vasculares, tais como doença ateroembólica e trombose da veia renal, que pode ocorrer como uma complicação da síndrome nefrótica; infecção, geralmente sepse e inflamação sistêmica devido à infecção; queimaduras graves; sequestro devido à pericardite e pancreatite; e hipotensão devido ao anti-hipertensivos e vasodilatadores; b) dano renal intrínseco, que inclui isquemia renal (reduções de fluxo sanguíneo transitório ou interrupção), toxinas ou medicamentos (por exemplo, alguns AINEs, os antibióticos aminoglicosídeos, contraste iodado, lítio, nefropatia devido ao preparo intestinal para colonoscopia com fosfatos de sódio); rabdomiólise ou degradação do tecido muscular, onde a liberação resultante de mioglobina no sangue afeta o rim, o que também pode ser causado por uma lesão (especialmente lesão por esmagamento ou trauma extenso), estatinas, estimulantes e algumas outras drogas; hemólise ou destruição das células vermelhas do sangue, que pode ser causada por várias condições tais como a doença de células falciformes, e lúpus eritematoso sistêmico; mieloma múltiplo, quer devido à hipercalcemia ou "nefropatia por cilindros"; glomerulonefrite aguda que pode ser devido a uma variedade de causas, tais como a síndrome da membrana basal anti-glomerular/doença de Goodpasture, granulomatose de Wegener, ou nefrite lúpica aguda com lúpus eritematoso sistêmico; e c) causas pós- renais (causas obstrutiva do trato urinário), que incluem medicação interferir com o esvaziamento normal da bexiga (por exemplo, anticolinérgicos); hipertrofia prostática benigna ou câncer da próstata; pedras nos rins; malignidade abdominal (por exemplo, câncer de ovário, câncer colorretal); cateter urinário obstruído; ou drogas que podem causar Cristalúria e drogas que podem levar a mioglobinúria & cistite.

[0166] Os métodos da divulgação atual incluem proteger o rim através da indução de citorresistência adquirida. Tal como referido, as quantidades terapeuticamente eficazes apropriadas podem ser determinadas utilizando inicialmente modelos animais para identificar os intervalos de dosagem. Quantidades específicas exemplares terapeuticamente eficazes de ingrediente ativo incluem 10 mg/kg; 20 mg/kg; 30 mg/kg; 40 mg/kg; 50 mg/kg; 60 mg/kg; 70 mg/kg; 80 mg/kg; 90 mg/kg, e 100 mg/kg.

[0167] Exemplos de modelos animais de lesão renal incluem: insuficiência renal induzida pelo glicerol (imita a rabdomiólise); ARF induzida por reperfusão de isquemia (simula as alterações induzidas pelo fluxo sanguíneo renal reduzido, resultando em isquemia tecidual e morte celular de células do túbulo); modelos induzidos por drogas tais como a gentamicina, cisplatina, AINE, ARF induzida por ifosfamida (imita a insuficiência renal devido à administração clínica dos respectivos medicamentos); urânio, ARF induzida por potássio dicromato (imita o risco ocupacional); ARF induzida por S-(1,2-diclorovinil)-L-cisteína (simula disfunção renal induzida por água contaminada); ARF induzida por sepse (imita a insuficiência renal induzida por infecção); e ARF induzida por radiocontraste (imita insuficiência renal em pacientes durante o uso de meios de radiocontraste no momento do cateterismo cardíaco). Para mais informações sobre esses modelos, consulte Singh et al. , Pharmacol. Rep. 2012, 64(1):31-44.

[0168] Testes conhecidos da função renal incluem ultrassons; tomografia computadorizada; e medir lactato desidrogenase (LDH), ureia (BUN), creatinina, depuração de creatinina, depuração de iotalamato, taxa de filtração glomerular e depuração de inulina.

[0169] Proteção Hepática. Exemplos de modelos animais de lesão do fígado incluem: lesão de reperfusão isquêmica; fibrose quimicamente induzida do fígado usando hepatotoxinas (tetracloreto de carbono, tioacetamida, dimetil, dietil ou nitrosamina); ligadura de ducto biliar; modelo de esquistossomose; modelo da hepatite Concanavalina A; camundongos transgênicos HCV induzíveis; vários modelos genéticos; o modelo de infusão de etanol Enteral (modelo Tsukamoto-French); e o modelo de deficiência de colina e metionina.

[0170] Além disso, uma série de compostos hepatotóxicos, incluindo certas terapêuticas, induzem citotoxicidade. Compostos hepatotóxicos pode produzir citotoxicidade de fígado por ataque químico direto ou através da produção de um metabolito tóxico. Citotoxicidade pode ser induzida pelo ataque químico direto, usando os seguintes medicamentos: Anestésicos, tais como, enflurano, fluroxeno, halotano e metoxiflurano; neuropsicotrópicos, tais como, cocaína, hidrazidas, metilfenidato, e tricíclicos; anticonvulsivantes, tais como feniloína e ácido valpróico; analgésicos, tais como, acetaminofeno, clorzoxazona, dantroleno, diclofenac, ibuprofeno, indometacina, salicilatos, tolmetina, e zoxazolamina; hormônios, tais como, aceto, carbutamida, glipizida, metahexamida, Propiltiouracil, tamoxifeno, Dietilstilbestrol; agentes antimicrobianos, tais como a anfotericina B, a clindamicina, o cetoconazol, mebendazol, metronidazol, oxacilina, ácido paraaminosalicílico, a penicilina, a rifampicina, sulfonamidas, tetraciclinas, e zidovudina; drogas cardiovasculares, tais como a amiodarona, dilitiazem, a-metildopa, mexiletino, hidrazalina, ácido nicotínico, papaverina, perexilina, procainamida, quinidina, e tocainamida; e imunossupressores e antineoplásicos, tais como asparaginase, cisplatina, ciclofosfamida, dacarbazina, doxorrubicina, fluorouracil, metotrexato, mitramicina, 6-MP, nitrosoureias, tamoxifeno, tioguanina, e vincristina; e drogas diversas, tais como, dissulfiram, íon de iodeto, oxifenisatina, vitamina A, e ácido paraaminobenzoico.

[0171] Compostos hepatotóxicos induzindo colestase, uma prisão no fluxo da bile, podem assumir várias formas. Colestase centribular é acompanhada por alterações inflamatórias do portal. Alterações do ducto biliar foram relatadas com algumas drogas, como a eritromicina, enquanto colestase canalicular pura é característica de outras drogas como os esteroides anabolizantes. Colestase crônica tem sido associada a drogas como estradiol e metiltestosterona. Doença colestática pode ser induzida usando compostos hepatotóxicos incluindo os seguintes: contraceptivos esteroides androgênicos, anabolizantes esteroides, ácido acetilsalicílico, azatioprina, benzodiazepínicos, ácido quenodesoxicólico, clordiazepóxido, eritromicina estolato, flufenazina, Furosemida, griseofulvina, Haloperidol, imipramina, 6-mercaptopurina, metimazol, metotrexato, metildopa, metilenodiamina, metiltestosterona, naproxeno, nitrofurantoína, penicilamina, perfenazina, proclorperazina, promazina, tiobendazol, tioridazina, tolbutamida, trimetoprimsulfametoxazol, arsênico, cobre e paraquat.

[0172] Algumas drogas, embora principalmente colestáticas, também podem produzir hepatotoxicidade, e, portanto, a lesão hepática que provocam é mista. Drogas causando lesão hepática mista incluem, por exemplo, as seguintes: Clorpromazina, fenilbutazona, halotano, clordiazepóxido, diazepam, alopurinol, fenobarbital, naproxeno, propiltiouracil, cloranfenicol, trimetoprimsulfametoxazol, aminona, disopiramida, azatioprina, cimetidina e ranitidina.

[0173] Detecção de uma ou mais enzimas do ciclo de arginina/ureia/NO, enzimas de sulfuração, e/ou produtos relacionados com quebra de espectrina é diagnóstico de lesão hepática. Exemplos destes marcadores incluem: argininosuccinato sintetase (ASS) e argininosuccinato liase (ASL), sulfuração (estrogênio sulfotransferase (EST)), esqualeno sintase (SQS), fosforilase de glicogênio do fígado (GP), sintetase de carbamoil-fosfato (CPS-1), a-enolase 1, proteína glicose-regulada (GRP) e produtos de degradação de espectrina.

[0174] Em outras modalidades, a detecção de marcadores biológicos como um diagnóstico de lesão do fígado, tais como lesões devido a isquemia, pode ser correlacionada com os testes existentes. Estes podem incluir: fosfatase alcalina (AP); 5'-nucleotidase (5'-ND); a-glutamil-transpeptidase (G-GT); leucina aminopeptidase (LAP); aspartato-transaminase (AST); alanina-transaminase (ALT); frutose-1,6- difosfato aldolase (ALD); LDH; isocitrato desidrogenase (ICDH); ornitina- carbamoiltransferase (OCT); sorbitol desidrogenase (SDH) arginase; guanase; creatinafosfoquinase (CPK); colinesterase (ChE); níveis de peptídeo procolágeno tipo III (PIIIP); níveis sanguíneos de amoníaco em hepatoencefalopatias; ligante em níveis de necrose e de hepatoma; níveis de hialuronato devido a danos nas células endoteliais hepática; a-1-fetoproteína (AFP) para detectar os níveis de hepatoma; antigênio carcinoembrionário (CEA) para detectar os níveis de metástases de câncer para o fígado; elevações de anticorpos contra uma variedade de componentes celulares, tais como proteína de membrana de fígado específica e mitocondrial e nuclear; e a detecção de proteínas, tais como albumina, globina, aminoácidos, colesterol, e outros lipídios. Além disso, análise bioquímica de uma variedade de minerais, metabólitos e enzimas obtidas de biópsias hepáticas pode ser útil na identificação de mais biomarcadores em distúrbios hepáticos herdados, adquiridos e experimentalmente induzidos.

[0175] Em outras modalidades, a quantidade de biomarcadores detectados pode ser correlacionada com testes de função hepática para avaliar lesão hepática. Como é entendido por aqueles versados na técnica, testes de função hepática incluem o seguinte: avaliação da liberação hepática de ânions orgânicos, tais como bilirrubina, indocianina verde (ICG), sulfobromoftaleína (BSP) e ácidos biliares; avaliação do fluxo sanguíneo hepático através de medições de galactose e depuração de ICG; e avaliação da função hepática microsomal, através do uso do teste respiratório com aminopirina e teste de depuração de cafeína. Por exemplo, bilirrubina de soro pode ser medida para confirmar a presença e gravidade de icterícia e para determinar a extensão de hiperbilirrubinemia, como visto em doenças hepáticas parenquimatosas. Elevações de aminotransferase (transaminase) refletem a severidade do dano hepatocelular ativo, enquanto elevações de fosfatase alcalina encontram-se com infiltrados hepáticos e colestase (Isselbacher, K. e Podolsky, D. em Hartison's Principles of Internal Medicine, 12a. edição. Wilson et al. eds. ,2:1301-1308 (1991)).

[0176] Sistemas de Pontuação adicionais e parâmetros utilizados para avaliar a função hepática incluem o sistema de Pontuação Child-Pugh como segue:

[0177] Teste de depuração de plasma de indocianina usando um sensor de luz de ponta dos dedos pode ser usado como uma sistema de pontuação da função hepática pós-operatória desenvolvido por Schindl et al. (Schindl M et al. 2005, Archives of Surgery 140(2):183-189). Este sistema classifica disfunção hepática de acordo com os níveis de ácido láctico, bilirrubina total, INR e encefalopatia no período pós-operatório. As pontuações totais de 0, 1-2, 3-4, ou> 4 são usadas para classificar disfunção hepática em ausente, leve, moderada ou grave, respectivamente. Além disso, a razão de sais biliares a fosfolipídios pode ser avaliada.

[0178] Proteção Cardíaca. Exemplos de modelos animais de lesão cardíaca incluem: modelos de infarto do miocárdio (IM), modelos de remodelação pós-IM, modelos de terapia do gene, modelos de terapia celular, modelos de constrição da aorta transversa (TAC), modelos de AVC isquêmico agudo, modelos de isquemia do membro e renal, o modelo de perfusão de Langendorff e o modelo de cardiomiopatia induzida por doxorrubicina. Ver também, por exemplo, modelos animais de lesão cardíaca praticados pelo Cardiovascular Research Laboratory, Baltimore, MD.

[0179] Vários métodos de detecção de lesão cardíaca podem ser utilizados, incluindo imagiologia não invasiva, como a Ressonância Magnética (RM), ultrassom, Tomografia Computadorizada (CT) de raio-X, tomografia computadorizada de emissão de fóton único (SPECT) e/ou tomografia de emissão de pósitrons (PET). Medidas adicionais podem incluir o ecocardiograma, eletrocardiograma, Mikro-ponta do cateter de pressão, telemetria, imuno-histoquímica, e os estudos de biologia molecular. Pedido U. S. Patente n° 2002/0115936 descreve um método e aparelho para avaliação da função cardíaca por monitoramento da movimentação da traqueia.

[0180] Conhecidos testes de função cardíaca incluem medição de níveis de PDH, níveis de lactato de plasma e/ou oxidação de carboidrato cardíaca. Marcadores associados a lesão não-isquêmica do coração incluem: precursor de alfa-2-HS- glicoproteína (por exemplo, SEQ ID NO:22); Asporina; subunidade delta de sintase de ATP (mitocondrial); substância epicárdica de vaso sanguíneo (por exemplo, SEQ ID NO:23); C6ORF142; Anidrase carbônica 1; Anidrase carbônica 3; Ceruloplasmina; Fator de coagulação IX; Cadeia de alfa-3(VI) de colágeno; Dermatopontina; proteína 1 da matriz extracelular de tipo fibulina contendo EGF; Cadeia de gama de fibrinogênio; Fibulina-1; Fibulina-2; proteína de choque de calor HSP 90-beta (por exemplo, SEQ ID NO:24); subunidade alfa de hemoglobina; subunidade beta de hemoglobina; Região C da cadeia alfa-1 de Ig; Região C da cadeia alfa-2 de Ig; Região C da cadeia gama-2 de Ig; Regiões C da cadeia lambda de Ig; Região C de cadeia mu de IG; Proteína 2 de ligação β do fator de crescimento latente-transformante; Glicoproteína associada a Microfibril 4; Miosina-2; proteína A do soro amiloide; e proteína 2 contendo domínio de SH3 e Sorbina (por exemplo, SEQ ID NO:25); e proteína 2 contendo domínio de SH3 e Sorbina (por exemplo, SEQ ID NO:26).

[0181] Marcadores associados a lesão isquêmica do coração incluem: precursor de alfa-2-HS-glicoproteína (por exemplo, SEQ ID NO:22); Alfa-2- macroglobulina; anidrase carbônica 1; subunidade alfa de hemoglobina; subunidade beta da hemoglobina; região C da cadeia alfa-1 de lg; região C da cadeia alfa-2de lg; região C da cadeia mu de lg; Leiomodina-1 (por exemplo, SEQ ID NO:27); MRLC2 de cadeia leve reguladora de miosina (por exemplo, SEQ ID NO:28); Nexilina (por exemplo, SEQ ID NO:29); subunidade α de componente E1 de piruvato desidrogenase; proteína de amiloide A de soro; e forma somática.

[0182] Proteção Pulmonar. Modelos animais de lesão pulmonar, incluindo lesão pulmonar aguda, incluem indução de lesão por instilação intratraqueal de endotoxinas (LPS), ventilação mecânica, hipoxemia, bactérias vivas (Escherichia coli), hiperóxia, bleomicina, ácido oleico, ligadura cecal e punção e aspiração de ácido. Para obter mais informações sobre modelos de lesão pulmonar, ver Assay Depot, descrito como World’s Largest On-Line Marketplace for Pharmaceutical Research Services (O Maior Mercado Online do Mundo Para Serviços de Pesquisa Farmacêutico).

[0183] Os sintomas de lesão pulmonar incluem trabalharam, respiração rápida, pressão arterial baixa, e falta de ar. Qualquer tipo de teste de função pulmonar pode ser usado. Teste de função pulmonar geralmente pode ser dividido em três áreas principais. O primeiro tipo de teste pulmonar é geralmente referido como espirometria que fornece medidas em termos de volume e taxas respiratórias de diferentes esforços expiratórios e inspiratórios de paciente. Além disso, várias taxas de fluxo em várias fases de um teste são também o tipo de dados gerados a partir de testes de espirometria. Uma segunda área de teste pulmonar é um conjunto de procedimentos concebidos para determinar a uniformidade da distribuição de ar inspirado ao longo dos pulmões de um paciente. Em virtude de tais testes, insuficiência pulmonar pode ser determinada, mesmo que o a ventilação alveolar do paciente seja normal. Um terceiro tipo de testes pulmonares concerne a capacidade dos pulmões para difundir o ar inspirado através das membranas alveolares e tais testes fornecem uma indicação da capacidade do pulmão de arterializar sangue venoso através da troca de oxigênio por dióxido de carbono.

[0184] Volume de respiração pode ser avaliado usando um dispositivo sensor de fluxo de volume ligado à via aérea de um sujeito (por exemplo, por uso de um espirômetro ou taquímetro) ou por medição das excursões mecânicas do peito e as paredes abdominais. Técnicas que dependem de gravações de peito e movimentos da parede abdominal que são de ou baseadas em calibre de tensão (gravação de mudanças no comprimento de circunferência do corpo) ou com base em loops de condutor elétrico indutivo elástico dispostos ao redor do peito e abdômen do paciente também podem ser usadas. Gravações da indutância dos loops podem ser usadas para estimar a magnitude das variações de área transversal e compartimentos abdominais. Pedido de Pat. N.° 4.308.872 é um exemplo desta tecnologia de estimativa do loop de autoindutância. Tais métodos podem ser usados para a medição quantitativa de volumes respiratórios após um procedimento de calibração.

[0185] Em incorporações particulares, testes de função pulmonar incluem medir o volume de respiração, gases de sangue arterial, e/ou o gradiente de O2 A-a.

[0186] Proteção Contra a Sepse. Sepse, ou Síndrome de Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS), caracteriza-se por um estado inflamatório do corpo inteiro com a presença de infecção. Sepse pode levar à febre, respiração rápida e baixa pressão arterial e pode causar danos a todos os órgãos, incluindo os órgãos do sistema cardiovascular, o sistema imunológico e o sistema endócrino.

[0187] Modelos animais de sepse incluem ligadura cecal e sepse induzida por perfuração (CLP) sozinhas ou em combinação com a instilação de bactérias (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa ou Streptococcus pneumoniae). Modelos animais de sepse também incluem a administração intravenosa ou intraperitoneal de um agente de receptor do tipo toll (TLR) tais como lipopolissacarídeo (LPS ou endotoxina) ou zimosana. Outros modelos de sepse incluem modelos imunoestimulatórios de estágio final e peritonite de stent de cólon ascendente. Para obter mais informações sobre modelos de sepse, ver Assay Depot, descrito como World’s Largest On-Line Marketplace for Pharmaceutical Research Services (O Maior Mercado Online do Mundo Para Serviços de Pesquisa Farmacêutico).

[0188] Proteção contra sepse pode ser confirmada pela medição da pressão arterial, gases do sangue, medições de citocinas e função de órgãos secundárias conforme descrito em outro lugar neste documento (por exemplo, função de pulmão, fígado, coração, rins).

[0189] Os Exemplos abaixo são incluídos para demonstrar modalidades específicas da divulgação. Aqueles versados na técnica devem reconhecer, à luz da presente divulgação, que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas divulgadas neste documento e ainda obter um resultado igual ou similar sem se afastar do espírito e escopo da divulgação.

[0190] Modalidades Exemplares 1. Um kit para proteger órgão(s) de um sujeito da lesão, o kit, incluindo uma quantidade terapeuticamente eficaz de mioglobina, ferro, e/ou vitamina B12 em que administração da quantidade terapeuticamente eficaz de mioglobina, ferro, e/ou vitamina B12 para o sujeito protege órgão(s) do sujeito da lesão sem causar lesão de órgão. 2. Um kit para proteger órgão(s) de um sujeito da lesão, o kit incluindo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína heme, ferro, e/ou vitamina B12 em que administração da quantidade terapeuticamente eficaz de proteína heme, ferro, e/ou vitamina B12 para o sujeito protege órgão(s) do sujeito da lesão sem causar lesão de órgão. 3. Um kit de modalidade 2 onde a proteína heme, ferro, e/ou vitamina B12 é formulado dentro de uma composição. 4. Um kit de acordo com as modalidades 2 ou 3, em que a proteína heme é uma variante da proteína heme, um análogo d-substituído da proteína heme, uma modificação da proteína heme, ou uma combinação dos mesmos. 5. Um kit de qualquer uma das modalidades 2-4, em que a proteína heme é uma proteína heme modificada. 6. Um kit de acordo com a modalidade 5, em que a proteína heme modificada é uma proteína heme com nitrito ou uma proteína heme PEGuilada. 7. Um kit de qualquer uma das modalidades 2-6, onde a proteína heme é mioglobina. 8. Um kit de qualquer uma das modalidades 2-7, em que a proteína heme é uma variante de mioglobina e/ou uma modificação de mioglobina. 9. Um kit da modalidade 8, em que a mioglobina modificada é uma mioglobina nitrada ou uma mioglobina PEGuilada. 10. Um kit de qualquer uma das modalidades 2-9, incluindo ainda um inibidor da degradação de proteínas heme, opcionalmente, um inibidor da degradação de proteínas heme nitradas. 11. Um kit da modalidade 10 em que o inibidor da degradação da proteína heme é formulado dentro de uma composição. 12. Um kit de qualquer uma das modalidades 10 ou 11 no qual o inibidor da degradação de proteínas heme e a proteína heme, ferro, e/ou vitamina B12 são formulados dentro da mesma composição. 13. Um kit de qualquer uma das modalidades de 10-12 em que o inibidor da degradação de proteínas heme é um inibidor de heme oxigenase. 14. Um kit de modalidade 13 no qual o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina, hemina e hematina, opcionalmente, uma protoporfirina nitrada, hemina e/ou hematina. 15. Um kit de qualquer uma das modalidades 13 ou 14 anos, no qual o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina de metal, opcionalmente, uma protoporfirina de metal nitrada. 16. Um kit de modalidade 15 no qual a protoporfirina de metal é Sn- protoporfirina. 17. Um kit de qualquer uma das modalidades 2-16 ainda incluindo instruções de administração. 18. Um kit de qualquer uma das modalidades 2-17, em que a ausência de lesões de órgãos causadas pela administração é confirmada por comparação com um nível de referência. 19. Um kit de qualquer uma das modalidades 2-18, onde a proteção é evidenciada em comparação a um nível de referência. 20. Um kit de qualquer uma das modalidades 18 ou 19 em que o nível de referência é fornecido dentro do kit. 21. Um kit de qualquer uma das modalidades 2-20, em que o órgão está protegido de uma lesão com base em um insulto. 22. Um kit de modalidade 21 onde o insulto é programado. 23. Um kit da modalidade 22 em que que a administração ocorre pelo menos 8 horas antes da lesão programada. 24. Um kit de qualquer uma das modalidades 22 ou 23, em que o insulto programado é a cirurgia, reperfusão isquêmica induzida cardíaca/cerebral, cirurgia cardiovascular, angioplastia com balão, quimioterapia, administração de drogas nefrotóxicas, e/ou toxicidade de contraste radiológico. 25. Um kit da modalidade 24 em que a cirurgia é uma cirurgia de transplante de órgão. 26. Um kit de modalidade 21 onde o insulto é sepse. 27. Um kit de qualquer uma das modalidades 2-26, no qual o órgão é um órgão transplantado. 28. Um kit de qualquer uma das modalidades 2-27, no qual o órgão é um coração, rim, fígado ou pulmão. 29. Um kit de qualquer uma das modalidades 2-28, em que o órgão é um coração e proteção é evidenciada pela melhoria da função cardíaca, e/ou a redução na liberação de enzimas cardíacas. 30. Um kit de modalidade 29, em que a enzima cardíaca é a troponina. 31. Um kit de qualquer uma das modalidades 2-30, no qual o órgão é um rim e proteção é evidenciada pela prevenção ou diminuição do nitrogênio de ureia do sangue (BUN) ou aumentos de creatinina sérica. 32. Um kit de qualquer uma das modalidades 2-31, no qual o órgão é um fígado e proteção é evidenciada pela prevenção ou redução de aumentos de enzimas do fígado. 33. Um kit de qualquer uma das modalidades 2-32, no qual o órgão é um pulmão e proteção é evidenciado pela redução da deterioração de gás do sangue, redução na necessidade de oxigênio suplementar, e/ou requisitos de ventilador reduzidos. 34. Um kit para gerar citorresistência adquirida em órgão(s) de um sujeito, o kit incluindo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína heme, ferro, e/ou vitamina B12 em que a administração da quantidade terapeuticamente eficaz de proteína heme, ferro, e/ou vitamina B12 para o sujeito gera citorresistência adquirida em órgão(s) do sujeito sem causar lesão de órgão. 35. Um kit de modalidade 34 onde a proteína heme, ferro, e/ou vitamina B12 é formulado dentro de uma composição. 36. Um kit de acordo com as modalidades 34 ou 35, em que a proteína heme é uma variante da proteína heme, um análogo d-substituído da proteína heme, uma modificação da proteína heme, ou uma combinação dos mesmos. 37. Um kit de qualquer uma das modalidades 34-36, em que a proteína heme é uma proteína heme modificada. 38. Um kit de acordo com a modalidade 37, em que a proteína heme modificada é uma proteína heme com nitrito ou uma proteína heme PEGuilada. 39. Um kit de qualquer uma das modalidades 34-38, onde a proteína heme é mioglobina. 40. Um kit de modalidade 34-39, em que a proteína heme é uma variante de mioglobina e/ou uma modificação de mioglobina. 41. Um kit da modalidade 40, em que a mioglobina modificada é uma mioglobina nitrada ou uma mioglobina PEGuilada. 42. Um kit de qualquer uma das modalidades 34-41, incluindo ainda um inibidor da degradação de proteínas heme, opcionalmente, um inibidor da degradação de proteínas heme nitradas. 43. Um kit da modalidade 42 em que o inibidor da degradação da proteína heme é formulado dentro de uma composição. 44. Um kit de qualquer uma das modalidades de 42 ou 43, no qual o inibidor da degradação de proteínas heme e a proteína heme são formulados dentro da mesma composição. 45. Um kit de qualquer uma das modalidades de 42-44 em que o inibidor da degradação de proteínas heme é um inibidor de heme oxigenase. 46. Um kit de modalidade 45 no qual o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina, hemina e hematina, opcionalmente, uma protoporfirina nitrada, hemina e/ou hematina. 47. Um kit de qualquer uma das modalidades 45 ou 46, no qual o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina de metal. 48. Um kit de modalidade 47 no qual a protoporfirina de metal é Sn- protoporfirina. 49. Um kit de qualquer uma das modalidades 34-48 ainda incluindo instruções de administração. 50. Um kit de qualquer uma das modalidades 34-49, em que a ausência de lesões de órgãos causadas pela administração é confirmada por comparação com um nível de referência. 51. Um kit de qualquer uma das modalidades 34-50, em que a citorresistência adquirida protege o órgão de uma lesão. 52. Um kit de modalidade 51 em que a proteção é evidenciada pela comparação a um nível de referência. 53. Um kit de qualquer uma das modalidades 50 ou 52 em que o nível de referência é fornecido dentro do kit. 54. Um kit de qualquer uma das modalidades 51-53, em que o órgão está protegido de uma lesão com base em um insulto. 55. Um kit de modalidade 54 onde o insulto é programado. 56. Um kit da modalidade 55 em que 57. Um kit de qualquer uma das modalidades 55 ou 56, em que o insulto programado é a cirurgia, a quimioterapia, ou toxicidade de radiocontraste. 58. Um kit da modalidade 57 em que a cirurgia é uma cirurgia de transplante de órgão. 59. Um kit de modalidade 54 onde o insulto é sepse. 60. Um kit de qualquer uma das modalidades 34-59, no qual o órgão é um órgão transplantado. 61. Um kit de qualquer uma das modalidades 34-60, no qual o órgão é um coração, rim, fígado ou pulmão. 62. Um kit de qualquer uma das modalidades 51-61, em que o órgão é um coração e proteção é evidenciada pela melhoria da função cardíaca, e/ou a redução na liberação de enzimas cardíacas. 63. Um kit de modalidade 62, em que a enzima cardíaca é a troponina. 64. Um kit de qualquer uma das modalidades 51-63, no qual o órgão é um rim e proteção é evidenciada pela prevenção ou diminuição de BUN ou aumentos de creatinina sérica. 65. Um kit de qualquer uma das modalidades 51-64, no qual o órgão é um fígado e proteção é evidenciada pela prevenção ou redução de aumentos de enzimas do fígado. 66. Um kit de qualquer uma das modalidades 51-65, no qual o órgão é um pulmão e proteção é evidenciado pela redução da deterioração de gás do sangue, redução na necessidade de oxigênio suplementar, e/ou requisitos de ventilador reduzidos. 67. Um kit para regular positivamente expressão de proteínas de estresse protetivas em órgão(s) de um sujeito, o kit incluindo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína heme, ferro, e/ou vitamina B12 em que a administração da quantidade terapeuticamente eficaz de proteína heme, ferro, e/ou vitamina B12 para o sujeito regula positivamente expressão de proteínas de estresse protetivas em órgão(s) do sujeito sem causar lesão de órgão. 68. Um kit de modalidade 67 onde a proteína heme, ferro, e/ou vitamina B12 é formulado dentro de uma composição. 69. Um kit de acordo com as modalidades 67 ou 68, em que a proteína heme é uma variante da proteína heme, um análogo d-substituído da proteína heme, uma modificação da proteína heme, ou uma combinação dos mesmos. 70. Um kit de qualquer uma das modalidades 67-69, em que a proteína heme é uma proteína heme modificada. 71. Um kit de acordo com a modalidade 70, em que a proteína heme modificada é uma proteína heme com nitrito ou uma proteína heme PEGuilada. 72. Um kit de qualquer uma das modalidades 67-71, onde a proteína heme é mioglobina. 73. Um kit de qualquer uma das modalidades 67-72, em que a proteína heme é uma variante de mioglobina e/ou uma modificação de mioglobina. 74. Um kit da modalidade 73, em que a mioglobina modificada é uma mioglobina nitrada ou uma mioglobina PEGuilada. 75. Um kit de qualquer uma das modalidades 67-74 em que as proteínas de estresse protetoras são selecionadas dentre heme oxigenase, haptoglobina, hemopexina, hepcidina, alfa-1 antitripsina, interleucina-10, proteínas de choque térmico, lipocalina associada à neutrófilo gelatinase e HMG CoA redutase. 76. Um kit de qualquer uma das modalidades 67-75, incluindo ainda um inibidor da degradação de proteínas heme, opcionalmente, um inibidor da degradação de proteínas heme nitradas. 77. Um kit da modalidade 76 em que o inibidor da degradação da proteína heme é formulado dentro de uma composição. 78. Um kit de qualquer uma das modalidades de 76 ou 77, no qual o inibidor da degradação de proteínas heme e a proteína heme são formulados dentro da mesma composição. 79. Um kit de qualquer uma das modalidades de 76-78 em que o inibidor da degradação de proteínas heme é um inibidor de heme oxigenase. 80. Um kit de modalidade 79 no qual o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina, hemina e hematina, opcionalmente, uma protoporfirina nitrada, hemina e/ou hematina. 81. Um kit de qualquer uma das modalidades 79 ou 80, no qual o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina de metal. 82. Um kit de modalidade 81 no qual a protoporfirina de metal é Sn- protoporfirina. 83. Um kit de qualquer uma das modalidades 67-82 ainda incluindo instruções de administração. 84. Um kit de qualquer uma das modalidades 67-83, em que a ausência de lesões de órgãos causadas pela administração é confirmada por comparação com um nível de referência. 85. Um kit de qualquer uma das modalidades 67-84 em que a regulação positiva das proteínas de estresse protetoras protege o órgão contra danos. 86. Um kit de modalidade 85 em que a proteção é evidenciada pela comparação a um nível de referência. 87. Um kit de qualquer uma das modalidades 84 ou 86 em que o nível de referência é fornecido dentro do kit. 88. Um kit de qualquer uma das modalidades 85-87, em que o órgão está protegido de uma lesão com base em um insulto. 89. Um kit de modalidade 88 onde o insulto é programado. 90. Um kit de modalidade 89 em que a administração ocorre pelo menos 8 horas antes do insulto agendado. 91. Um kit de qualquer uma das modalidades 89 ou 90, em que o insulto programado é a cirurgia, a quimioterapia, ou toxicidade de radiocontraste. 92. Um kit da modalidade 91 em que a cirurgia é uma cirurgia de transplante de órgão. 93. Um kit de modalidade 88 onde o insulto é sepse. 94. Um kit de qualquer uma das modalidades 67-93, no qual o órgão é um órgão transplantado. 95. Um kit de qualquer uma das modalidades 67-94, no qual o órgão é um coração, rim, fígado ou pulmão. 96. Um kit de qualquer uma das modalidades 85-95, em que o órgão é um coração e proteção é evidenciada pela melhoria da função cardíaca, e/ou a redução na liberação de enzimas cardíacas. 97. Um kit de modalidade 96, em que a enzima cardíaca é a troponina. 98. Um kit de qualquer uma das modalidades 85-97, no qual o órgão é um rim e proteção é evidenciada pela prevenção ou diminuição de BUN ou aumentos de creatinina sérica. 99. Um kit de qualquer uma das modalidades 85-98, no qual o órgão é um fígado e proteção é evidenciada pela prevenção ou redução de aumentos de enzimas do fígado. 100. Um kit de qualquer uma das modalidades 85-99, no qual o órgão é um pulmão e proteção é evidenciado pela redução da deterioração de gás do sangue, redução na necessidade de oxigênio suplementar, e/ou requisitos de ventilador reduzidos. 101. Uma composição incluindo mioglobina, uma variante de mioglobina, um análogo d-substituído de mioglobina, uma modificação de mioglobina ou uma combinação dos mesmos, opcionalmente ferro e/ou vitamina B12. 102. Uma composição de modalidade 101 onde a mioglobina é uma mioglobina modificada. 103. Uma composição da modalidade 102, em que a mioglobina modificada é uma mioglobina nitrada ou uma mioglobina PEGuilada. 104. Uma composição de qualquer uma das modalidades 101-103, em que a mioglobina é uma variante de mioglobina. 105. Uma composição de qualquer uma das modalidades 101-104, incluindo ainda um inibidor da degradação de proteínas heme, opcionalmente, um inibidor da degradação de proteínas heme nitradas. 106. Uma composição da modalidade 105 em que o inibidor da degradação da proteína heme é um inibidor da heme oxigenase. 107. Uma composição da modalidade 106 em que o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina, hemina e hematina, opcionalmente, uma protoporfirina nitrada, hemina e/ou hematina. 108. Uma composição da modalidade 106 ou 107 em que o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina de metal. 109. Uma composição da modalidade 108 na qual a protoporfirina de metal é Sn-protoporfirina. 110. Uma composição incluindo uma proteína heme e um inibidor de degradação de proteína heme, opcionalmente ferro e/ou vitamina B12. 111. Uma composição de modalidade 110 onde a proteína heme é uma proteína heme modificada. 112. Uma composição da modalidade 111 na qual a proteína heme modificada é uma proteína heme com nitrito ou uma proteína heme PEGuilada. 113. Uma composição de qualquer uma das modalidades 110-112, em que a proteína heme é a mioglobina. 114. Uma composição de qualquer uma das modalidades 110-113 em que a proteína heme é uma variante de mioglobina e/ou uma modificação de mioglobina. 115. Uma composição da modalidade 114, em que a mioglobina modificada é uma mioglobina nitrada ou uma mioglobina PEGuilada. 116. Uma composição de qualquer modalidade 110-115 em que o inibidor da degradação de proteínas heme é um inibidor de heme oxigenase. 117. Uma composição da modalidade 116 em que o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina, hemina e hematina, opcionalmente, uma protoporfirina nitrada, hemina e/ou hematina. 118. Uma composição da modalidade 116 ou 117 em que o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina de metal. 119. Uma composição da modalidade 118 na qual a protoporfirina de metal é Sn-protoporfirina. 120. Um método de proteger órgão(s) de um sujeito da lesão, incluindo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição incluindo uma proteína heme, ferro e/ou vitamina B12, antes da lesão ao órgão ocorre, em que a administração protege órgão(s) do sujeito da lesão sem causar lesão de órgão. 121. Um método de incorporação 120 onde a composição inclui uma proteína heme modificada. 122. Um método da modalidade 121 no qual a proteína heme modificada é uma proteína heme com nitrito ou uma proteína heme PEGuilada. 123. Um método de qualquer uma das modalidades 120-122, em que a proteína heme é mioglobina. 124. Um método de qualquer uma das modalidades 120-123, em que a proteína heme é uma variante de mioglobina e/ou uma modificação de mioglobina. 125. Um método da modalidade 124, em que a mioglobina modificada é uma mioglobina nitrada ou uma mioglobina PEGuilada. 126. Um método de qualquer uma das modalidades 120-125, onde a composição ainda inclui um inibidor de degradação de proteína heme, opcionalmente um inibidor de degradação de proteína heme nitrado. 127. Um método de qualquer uma das modalidades 120-126 ainda incluindo a administração ao sujeito de uma segunda composição incluindo um inibidor da degradação de proteínas heme, facultativamente um inibidor da degradação de proteínas heme nitrado. 128. Um método de qualquer uma das modalidades 126 ou 127, em que o inibidor da degradação de proteínas heme é um inibidor de heme-oxigenase. 129. Um método de modalidade 128 no qual o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina, hemina e hematina, opcionalmente, uma protoporfirina nitrada, hemina e/ou hematina. 130. Um método de qualquer uma das modalidades 128 ou 129, no qual o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina de metal. 131. Um método de modalidade 130 no qual a protoporfirina de metal é Sn- protoporfirina. 132. Um método de qualquer uma das modalidades 120-131, em que a ausência de lesões de órgãos causadas pela administração é confirmada por comparação com um nível de referência. 133. Um método de qualquer uma das modalidades 120-132, onde a proteção é evidenciada em comparação a um nível de referência. 134. Um método de qualquer uma das modalidades 120-133, onde a lesão é uma lesão com base em um insulto. 135. Um método da modalidade 134, em que o insulto está programado. 136. Um método de modalidade 135 em que a administração ocorre pelo menos 8 horas antes do insulto agendado. 137. Um método de qualquer uma das modalidades 135 ou 136, em que o insulto programado é a cirurgia, a quimioterapia, ou toxicidade de radiocontraste. 138. Um método da modalidade 137 em que a cirurgia é uma cirurgia de transplante de órgão. 139. Um método da modalidade 134, em que o insulto é sepse. 140. Um método de qualquer uma das modalidades de 120-139, no qual o órgão é um órgão transplantado. 141. Um método de qualquer uma das modalidades 120-140, no qual o órgão é um coração, rim, fígado ou pulmão. 142. Um método de qualquer uma das modalidades 120-141, em que o órgão é um coração e proteção é evidenciada pela melhoria da função cardíaca, e/ou a redução na liberação de enzimas cardíacas. 143. Um método de modalidade 142, em que a enzima cardíaca é a troponina. 144. Um método de qualquer uma das modalidades 120-143, no qual o órgão é um rim e proteção é evidenciada pela prevenção ou diminuição de BUN ou aumentos de creatinina sérica. 145. Um método de qualquer uma das modalidades 120-144, no qual o órgão é um fígado e proteção é evidenciada pela prevenção ou redução de aumentos de enzimas do fígado. 146. Um método de qualquer uma das modalidades 120-145, no qual o órgão é um pulmão e proteção é evidenciado pela redução da deterioração de gás do sangue, redução na necessidade de oxigênio suplementar, e/ou requisitos de ventilador reduzidos. 147. Um método de gerar citorresistência adquirida em órgão(s) de um sujeito, incluindo administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição incluindo uma proteína heme, ferro, e/ou vitamina B12, em que a administração gera citorresistência adquirida sem causar lesão de órgão(s) de um sujeito. 148. Um método de incorporação 147 onde a composição inclui uma proteína heme modificada. 149. Um método da modalidade 148 no qual a proteína heme modificada é uma proteína heme com nitrito ou uma proteína heme PEGuilada. 150. Um método de qualquer uma das modalidades 147-149, em que a proteína heme é mioglobina. 151. Um método de qualquer uma das modalidades 147-150, em que a proteína heme é uma variante de mioglobina e/ou uma modificação de mioglobina. 152. Um método da modalidade 151, em que a mioglobina modificada é uma mioglobina nitrada ou uma mioglobina PEGuilada. 153. Um método de qualquer uma das modalidades 147-152 em que a composição ainda inclui um inibidor da degradação de proteínas heme. 154. Um método de qualquer uma das modalidades 147-153 ainda incluindo a administração ao sujeito de uma segunda composição incluindo um inibidor da degradação de proteínas heme, facultativamente um inibidor da degradação de proteínas heme nitrado. 155. Um método de qualquer uma das modalidades 153 ou 154, em que o inibidor da degradação de proteínas heme é um inibidor de heme-oxigenase. 156. Um método de modalidade 155 no qual o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina, hemina e/ou hematina, opcionalmente protoporfirina nitrada, hemina e/ou hematina. 157. Um método de qualquer uma das modalidades 155 ou 156, no qual o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina de metal. 158. Um método de modalidade 157 no qual a protoporfirina de metal é Sn- protoporfirina. 159. Um método de qualquer uma das modalidades 147-158, em que a ausência de lesões de órgãos causadas pela administração é confirmada por comparação com um nível de referência. 160. Um método de qualquer uma das modalidades 147-159 em que a citorresistência adquirida protege um órgão de lesão. 161. Um método de modalidade 160 em que a proteção é evidenciada pela comparação a um nível de referência. 162. Um método de qualquer uma das modalidades 160 ou 161, onde a lesão é lesão com base em um insulto. 163. Um método da modalidade 162, em que o insulto está programado. 164. Um método de modalidade 163 em que a administração ocorre pelo menos 8 horas antes do insulto agendado. 165. Um método de qualquer uma das modalidades 163 ou 164, em que o insulto programado é a cirurgia, a quimioterapia, ou toxicidade de radiocontraste. 166. Um método da modalidade 165 em que a cirurgia é uma cirurgia de transplante de órgão. 167. Um método da modalidade 162, em que o insulto é sepse. 168. Um método de qualquer uma das modalidades de 147-167, no qual o órgão é um órgão transplantado. 169. Um método de qualquer uma das modalidades 147-168, no qual o órgão é um coração, rim, fígado ou pulmão. 170. Um método de qualquer uma das modalidades 160-169, em que o órgão é um coração e proteção é evidenciada pela melhoria da função cardíaca, e/ou a redução na liberação de enzimas cardíacas. 171. Um método de modalidade 170, em que a enzima cardíaca é a troponina. 172. Um método de qualquer uma das modalidades 160-171, no qual o órgão é um rim e proteção é evidenciada pela prevenção ou diminuição de BUN ou aumentos de creatinina sérica. 173. Um método de qualquer uma das modalidades 160-172, no qual o órgão é um fígado e proteção é evidenciada pela prevenção ou redução de aumentos de enzimas do fígado. 174. Um método de qualquer uma das modalidades 160-173, no qual o órgão é um pulmão e proteção é evidenciado pela redução da deterioração de gás do sangue, redução na necessidade de oxigênio suplementar, e/ou requisitos de ventilador reduzidos. 175. Um método de regular positivamente a expressão de proteínas de estresse de proteção no órgão(s) de um sujeito incluindo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição incluindo uma proteína heme, ferro e/ou vitamina B12 em que a administração regula positivamente a expressão de proteínas de estresse de proteção em órgãos do sujeito sem causar lesões de órgãos. 176. Um método da modalidade 175, em que as proteínas de estresse protetoras são selecionadas dentre heme oxigenase, haptoglobina, hemopexina, hepcidina, alfa-1 antitripsina, interleucina-10, proteínas de choque térmico, lipocalina associada à neutrófilo gelatinase e/ou HMG CoA redutase. 177. Um método de qualquer uma das modalidades 175 ou 176 onde a composição inclui uma proteína heme modificada. 178. Um método da modalidade 177 no qual a proteína heme modificada é uma proteína heme com nitrito ou uma proteína heme PEGuilada. 179. Um método de qualquer uma das modalidades 175-178, em que a proteína heme é mioglobina. 180. Um método de qualquer uma das modalidades 175-179, em que a proteína heme é uma variante de mioglobina e/ou uma modificação de mioglobina. 181. Um método de qualquer uma das modalidades 180 em que a mioglobina modificada é uma mioglobina nitrada ou uma mioglobina PEGuilada 182. Um método de qualquer uma das modalidades 175-181, onde a composição ainda inclui um inibidor de degradação de proteína heme, opcionalmente um inibidor de degradação de proteína heme nitrado. 183. Um método de qualquer uma das modalidades 175-182 ainda incluindo a administração ao sujeito de uma segunda composição incluindo um inibidor da degradação de proteínas heme, facultativamente um inibidor da degradação de proteínas heme nitrado. 184. Um método de qualquer uma das modalidades 182 ou 183, em que o inibidor da degradação de proteínas heme é um inibidor de heme-oxigenase. 185. Um método de modalidade 184 no qual o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina, hemina e hematina, opcionalmente, uma protoporfirina nitrada, hemina e/ou hematina. 186. Um método de qualquer uma das modalidades 184 ou 185, no qual o inibidor de heme oxigenase é uma protoporfirina de metal. 187. Um método de modalidade 186 no qual a protoporfirina de metal é Sn- protoporfirina. 188. Um método de qualquer uma das modalidades 175-187, em que a ausência de lesões de órgãos causadas pela administração é confirmada por comparação com um nível de referência. 189. Um método de qualquer uma das modalidades 175-188, em que a expressão de regulação positiva de proteínas de estresse de proteção protege um órgão de lesão. 190. Um método de modalidade 189 em que a proteção é evidenciada pela comparação a um nível de referência. 191. Um método de qualquer uma das modalidades 189 ou 190, onde a lesão é uma lesão com base em um insulto. 192. Um método da modalidade 191, em que o insulto está programado. 193. Um método de modalidade 192 em que a administração ocorre pelo menos 8 horas antes do insulto agendado. 194. Um método de qualquer uma das modalidades 192 ou 193, em que o insulto programado é a cirurgia, a quimioterapia, ou toxicidade de radiocontraste. 195. Um método da modalidade 194 em que a cirurgia é uma cirurgia de transplante de órgão. 196. Um método da modalidade 191, em que o insulto é sepse. 197. Um método de qualquer uma das modalidades de 175-196, no qual o órgão é um órgão transplantado. 198. Um método de qualquer uma das modalidades 175-197, no qual o órgão é um coração, rim, fígado ou pulmão. 199. Um método de qualquer uma das modalidades 189-198, em que o órgão é um coração e proteção é evidenciada pela melhoria da função cardíaca, e/ou a redução na liberação de enzimas cardíacas. 200. Um método de modalidade 199, em que a enzima cardíaca é a troponina. 201. Um método de qualquer uma das modalidades 189-200, no qual o órgão é um rim e proteção é evidenciada pela prevenção ou diminuição de BUN ou aumentos de creatinina sérica. 202. Um método de qualquer uma das modalidades 189-201, no qual o órgão é um fígado e proteção é evidenciada pela prevenção ou redução de aumentos de enzimas do fígado. 203. Um método de qualquer uma das modalidades 189-202, no qual o órgão é um pulmão e proteção é evidenciado pela redução da deterioração de gás do sangue, redução na necessidade de oxigênio suplementar, e/ou requisitos de ventilador reduzidos. 204. Uma modalidade de qualquer uma das modalidades 1-203, em que a composição é formulada para entrega por via venosa, entrega oral, entrega subcutânea ou entrega intramuscular. 205. Uma modalidade de qualquer uma das modalidades 1-204, em que a composição é formulada dentro de um depósito de liberação lenta. 206. Uma composição de matéria compreendendo a estrutura

onde R1 é 5’-desoxiadenosil, CH3, OH ou CN; R2 é OH ou H; e R3 é OH ou H. 207. Uma modalidade de qualquer uma das modalidades 1-205, em que a B12 tem uma estrutura

onde R1 é 5’-desoxiadenosil, CH3, OH ou CN; R2 é OH ou H; e R3 é OH ou H. 208. Uma modalidade de qualquer das incorporações seguintes em que ao invés de administração a um órgão através da administração a um sujeito, a administração é diretamente a um órgão. 209. Uma composição de matéria compreendendo a estrutura

onde R1 pode ser5 '-desoxiadenosil, CH3, OH ou CN; A é um grupo fosfato, L representa um ligante, B é uma estrutura baseada em sacarídeo, e M é um metal complexado com a estrutura baseada em sacarídeo. 210. Uma composição da matéria de modalidade 209, onde A é PO4, L é um ligante de hidrazona, B é uma estrutura baseada em sacarídeo, e M é Fe. 211. Uma composição da matéria de modalidade 209 ou 210, onde B tem 10- 16 átomos de carbono, 9-15 átomos de oxigênio e 16-28 átomos de hidrogênio. 212. Uma composição de matéria de modalidade 209, 210, ou 211, em que B é derivado da sacarose 213. Uma composição de matéria compreendendo a estrutura

onde R1 é5 '-desoxiadenosil, CH3, OH ou CN; R3 é OH ou H; L é um ligante, B é uma estrutura baseada em sacarídeo, e M é um metal complexado com a estrutura baseada em sacarídeo. 214. Uma composição da matéria de modalidade 213, onde L é um ligante de hidrazona e M é Fe. 215. Uma composição de matéria da modalidade 213, ou 214, em que B inclui 10-16 átomos de carbono, 9-15 átomos de oxigênio, e 16-28 átomos de hidrogênio. 216. Uma composição de matéria de modalidade, 213, 214 ou 215, em que B é derivado de sacarose. 217. Uma composição de matéria compreendendo a estrutura:

onde R1 é5 '-desoxiadenosil, CH3, OH ou CN; R3 é OH ou H; L é um ligante, B é uma estrutura baseada em sacarídeo, e M é um metal complexado com a estrutura baseada em sacarídeo. 218. Uma composição da matéria de modalidade 217, onde L é um ligante de hidrazona e M é Fe. 219. Uma composição da matéria de modalidade 217 ou 218, onde B inclui 10-16 átomos de carbono, 9-15 átomos de oxigênio e 16-28 átomos de hidrogênio. 220. Uma composição de matéria de modalidade 217, 218 ou 219, onde B é derivado de sacarose. 221. Uma composição de matéria compreendendo a estrutura:

onde R1 pode ser5 '-desoxiadenosil, CH3, OH ou CN; L é um ligante, B é uma estrutura baseada em sacarídeo, e M é um metal complexado com a estrutura baseada em sacarídeo. 222. Uma composição da matéria de modalidade 221, onde L é um ligante de hidrazona e M é Fe. 223. Uma composição da matéria de modalidade 221 ou 222, onde B tem 10- 16 átomos de carbono, 9-15 átomos de oxigênio e 16-28 átomos de hidrogênio. 224. Uma composição de matéria de modalidade 221, 222 ou 223, onde B é derivado de sacarose. 225. Uma composição de matéria compreendendo a estrutura:

onde R1 é 5'-desoxiadenosil, CH3, OH ou CN; L1 é um primeiro ligante, L2 é um segundo ligante, B1 é uma primeira estrutura baseada em sacarídeo, B2 é uma segunda estrutura baseada em sacarídeo, M1 é um primeiro metal, e M2 é um segundo metal complexado com a estrutura baseada em sacarídeo. 226. Uma composição da matéria de modalidade 225, onde L1 e L2 são cada um independentemente um ligante de hidrazona e M1 e M2 cada um independentemente são Fe. 227. Uma composição da matéria de modalidade 225 ou 226, onde B1 e B2 cada independente incluem 10-16 átomos de carbono, 9-15 átomos de oxigênio e 16 a 28 átomos de hidrogênio. 228. Uma composição de matéria de modalidade 225, 226 ou 227, onde B1 e B2 são cada um derivado independentemente de sacarose.

[0191] Exemplo 1. Proteção Renal. Os dados descritos em FIGs. 1-4 e tabelas 1-7 foram coletados usando os seguintes protocolos:

[0192] O Modelo de Glicerol de AKI. Este é um modelo amplamente utilizado de AKI induzida por rabdomiólise, que tem sido utilizado em todo o mundo por 50 anos. O modelo foi usado para testar se as intervenções profiláticas conferem proteção contra AKI. Basicamente, o protocolo é o seguinte: Foram estudados camundongos CD-1 masculinos (35-45 gramas), obtidos de Charles River Laboratories, Wilmington, MA. Camundongos foram mantidos em condições de viveiro padrão e geralmente alojados por 1-3 semanas antes do estudo. Os camundongos foram colocados em uma gaiola cilíndrica de restrição e em seguida receberam uma injeção de veia de cauda das substâncias de teste (veja abaixo) ou veículo de substância de teste. Os camundongos foram em seguida devolvidos às suas gaiolas. Dezoito horas mais tarde (horas), os camundongos foram brevemente anestesiados por inalação de isoflurano e dada uma injeção intramuscular de hipertônico (50%) de glicerol em uma dose de 9 ml/kg em peso corporal. A dose é dividida em duas, com metade injetada no músculo de cada um dos membros posteriores. Os camundongos foram em seguida devolvidos às suas gaiolas. Dezoito horas mais tarde, os camundongos foram profundamente anestesiados com pentobarbital (50-100 mg/Kg), a cavidade abdominal foi aberta através de uma incisão abdominal, obteve-se uma amostra de sangue da veia cava abdominal e os rins estavam ressecados. Uma secção transversal de rim foi obtida e fixada em formalina para posterior análise histológica. As amostras de sangue terminal foram analisadas para ureia e creatinina, usando kits de ensaio disponíveis comercialmente. O restante tecido renal foi submetido à dissecação cortical, e os tecidos corticais então foram extraídos por proteínas e RNA. As amostras da proteína foram salvas para análise dos níveis de HO-1, e as amostras de RNA foram sujeitas a RT-PCR para quantificar o mRNA de HO-1, bem como os níveis dos outros mRNAs de gene do estresse (por exemplo, NGAL, haptoglobina, hemopexina, hepicidina).

[0193] Preparação a ensaiar: Músculo esquelético de cavalo liofilizado (mioglobina) (Sigma Chemicals) foi usado como o agente de teste.

[0194] Mioglobina + SnPP: A 5 mg de mioglobina seca adicionou-se 0,9 ml de PBS + 0,1 ml de uma solução de estoque SnPP (50 umole/ml). As concentrações finais resultantes foram de 5 mg/mL de mioglobina + 5 umoles/ml de SnPP. A veia da cauda foi injetada com 200 ul desta solução, o que equivale a mioglobina 1 mg + 1 mole de SnPP.

[0195] Mioglobina nitrada: Nitrito de Na foi adicionado à mioglobina para se alcançar uma razão de 1-5 mole/mole para mioglobina (por exemplo,1-5 umole de nitrito/1 umole de mioglobina). As concentrações finais resultantes foram mioglobina a 5-10 mg/ml + 0,04-0,4 mg/ml de nitrito. A veia da cauda foi injetada com 200 ul desta solução.

[0196] Mioglobina + PEG: Para uma solução de estoque de 20 mg/ml Mgb em PBS foram adicionados 100 mg/ml de PEG-6000; 0, 250 ul. Isto foi administrado como uma injeção subcutânea no pescoço dorsal (injeção de 250 ul total). Para combinado de Mgb/PEG + SnPP, SnPP foi adicionado ao acima em uma concentração de 3 mg/ml.

[0197] Estes são os materiais de teste administrados aos camundongos para avaliar a proteção contra o modelo de AKI de glicerol, conforme mencionado acima.

[0198] Efeitos independentes de cada agente de teste: Para avaliar se a mioglobina + SnPP teve um efeito maior do que a mioglobina sozinha ou SnPP sozinho, as mesmas soluções como notado acima foram criadas como segue: mioglobina + SnPP; SnPP sozinho ou mioglobina sozinha. Estes foram usados no modelo de glicerol acima notado.

[0199] Experimentos de quatro hr após mioglobina vs mioglobina + SnPP vs SnPP sozinho. Para confirmar que a mioglobina + SnPP tem um efeito sinérgico na indução de mRNA HO-1 e os níveis de proteína HO-1, cada uma das combinações acima foram administradas sozinhas através da injeção de veia de cauda. Quatro horas mais tarde, os camundongos foram sacrificados como mencionado acima, e os rins foram colhidos para avaliação dos níveis de HO-1 mRNA e proteína. Para se obter informações adicionais sobre métodos, consulte Zager et al. , Am J Physiol Renal Physiol. 2014 Jul 30. Pii. Tabela 1. SnPP quadruplica a quantidade de indução de HO-1 mRNA a 4h pós-injeção vs mioglobina sozinha (HO-1/GAPDH mRNA)

[0200] Conforme mostrado na tabela 2, no ponto de tempo de 4h, há um aumento preferencial na expressão de proteína HO-1 (por ELISA). Dado que é apenas 4h após a injeção, os aumentos de mRNA são maiores do que os aumentos de proteína conforme síntese proteica deve seguir a indução de mRNA--que exige mais tempo. Tabela 2. Aumento preferencial na Expressão de Proteína HO-1 (por ELISA), no Ponto de Tempo de 4h (Cortex: HO-1 ng/mg de proteína)

[0201] A tabela 3 mostra indução de HO-1 mRNA cerca de 18h (durante a noite) pós-injeção vs mioglobina sozinha (HO-1/GAPDH mRNA) vs mioglobina em combinação com SnPP. Tabela 3. Indução de HO-1 mRNA durante a noite pós injeção com controle (PBS), mioglobina sozinha (HO-1/GAPDH mRNA) e mioglobina em combinação com SnPP.

[0202] A tabela 4 mostra indução de proteína HO-1 cerca de 18h (durante a noite) pós-injeção de controle vs mioglobina sozinha (HO-1/GAPDH mRNA) vs mioglobina em combinação com SnPP. Tabela 4. Indução de proteína HO-1 durante a noite pós injeção de controle, mioglobina sozinha (HO-1/GAPDH mRNA) e mioglobina em combinação com SnPP.

[0203] As FIGs. 1A e 1B mostram expressão de HO mRNA (FIG. 1A) e veículo (controle) seguinte a (FIG. 1B) expressão de proteína, mioglobina (Mgb) ou mioglobina em combinação com SnPP (SnPP; administração Mgb + SnPP) 18 horas antes de lesão com glicerol. Os dados indicam que há que uma potencialização de indução de HO-1 induzido por mioglobina com tratamento concomitante de SnPP.

[0204] A tabela 5 mostra a indução da expressão da proteína de haptoglobina após a exposição da mioglobina sozinha ou a mioglobina em combinação com PEG em comparação com o carreador de controle. Os dados demonstram que a mioglobina + PEG induzem aumentos muito maiores na expressão de haptoglobina citoprotetora que mioglobina sozinha. Tabela 5. Ponto de expressão da proteína de haptoglobina 4 horas depois da injeção SQ.

[0205] Tabela 6 mostra os níveis de LDH de plasma - um marcador sensível de lesão do fígado, rim, pulmão e do coração. A mioglobina + SnPP não causou um aumento de LDH no ponto de tempo de 4 horas. Tabela 6. Mioglobina + SnPP não causa um aumento LDH no ponto de tempo de 4h (Plasma: Absorvância U

[0206] A FIG. 2 nos painéis da esquerda mostra danos celulares nos rins seguinte a insulto de glicerol e a FIG. 2 nos painéis da direita mostra o efeito protetor do pré-tratamento com mioglobina em combinação com SnPP.

[0207] A FIG. 3 mostra que, preferencialmente, N-Mgb + SnPP eleva a proteína de estresse de proteção, interleucina-10 (IL-10).

[0208] A FIG. 4 mostra que N-Mgb + SnPP eleva a proteína de estresse de proteção, haptoglobina.

[0209] Exemplo 2. Proteção Hepática. Lesão hepatotóxica foi avaliada por níveis de plasma de LDH 24h após o insulto. Insulto de fígado incluiu injeção de glicerol de 9 ml/kg (este é o mesmo modelo que é usado para causar lesão renal). Lesão hepática elevou plasma LDH de 3,5 a 114 unidades/ml. Com pré-tratamento de mioglobina/SnPP, os níveis de LDH no plasma foram reduzidas em 75%. Tabela 7. Lesão hepatotóxica avaliada por níveis de plasma de LDH 24h após o insult

.

[0210] Os dados descritos nos exemplos 1 e 2 mostram que proteína heme, proteína heme modificada, e proteína heme em combinação com um inibidor da degradação de proteínas heme protegem o rim e o fígado de lesões devido ao insulto de glicerol. A proteção é evidenciada através de marcadores de lesão (LDH), função de órgão (BUN e creatinina) e indução de proteínas de estresse de proteção (HO-1 e haptoglobina).

[0211] Exemplo 3. A FIG. 5 mostra avaliação do impacto da ligação de nitrito equimolar à mioglobina Fe sobre a expressão da toxicidade de mioglobina. Células HK-2 (uma linha de células do túbulo proximal derivada de rim humano normal) foram incubadas em meio isento de soro de queratinócitos quer sob (controle) condições normais ou na presença de 10 mg/mL de mioglobina do músculo esquelético de cavalo ou mioglobina com nitrito (produzido por adição equimolar de nitrito de Na a 10 mg/ml de mioglobina). Após incubações de 18 h, a gravidade da lesão celular (% de morte celular) foi avaliada por um ensaio MTT. Mioglobina induziu 40% de morte celular (diminuição de 40% na captação celular de MTT), em comparação com células de controle incubadas. Nitrito de ligação a mioglobina reduziu a morte celular em 75%. Assim, a ligação de nitrito é capaz de reduzir os efeitos citotóxicos da mioglobina.

[0212] A FIG. 6 mostra a relação dose-resposta entre heme oxigenase plasma 1 (HO-1) e a dose administrada de N-mioglobina. Os camundongos normais foram injetados IM ou com 0, 1, 2, ou 5 mg/kg de mioglobina com nitrito + SnPP (dose constante de 1 μmol). Dezoito horas mais tarde, os níveis plasmáticos de HO-1 foram avaliados por ELISA. Observou-se relação dose-resposta entre a N-mioglobina administrada e os níveis plasmáticos de HO-1 foram observados. Assim, ensaio HO- 1 tem utilidade biomarcadora potencial para indução de HO-1 induzida por N- Mgb/SnPP.

[0213] A FIG. 7 mostra manutenção dos níveis normais de creatinina sérica sob uma variação de 25 vezes na dose de N-mioglobina. Os camundongos foram submetidos a uma infusão subcutânea de 2 horas de 1, 3, 6, 12, ou 25 mg/kg de mioglobina com nitrito (SnPP que prende a uma dose constante de 1 μmol). Dezoito horas mais tarde, lesão renal potencial foi avaliada medindo as concentrações de creatinina sérica. Não houve aumento significativo observado em qualquer das doses N-Mgb, indicando uma falta de toxicidade ao longo do (N, 2-4 camundongos/grupo).

[0214] Exemplo 4. Introdução. Lesão renal aguda (AKI) é um fator de risco bem reconhecido para morbidade e mortalidade, e o início da doença renal crônica (CKD; Ishani et al. J Am Soc Nephrol 2009;20:223-8; Xue et al. J Am Soc Nephrol 2006;17:1135-42; Liangos et al. Clin J Am Soc Nephrol 2006;1:43-51; Wald et al. JAMA 2009; 302:1179-85; Goldberg et al. Kidney Int 2009;76:900-6). No entanto, não há maneiras comprovadas para prevenir AKI no momento. Está bem estabelecido que após um surto inicial de lesão isquêmica ou tóxica, o rim desenvolve resistência marcada para danos subsequentes (por exemplo, Honda et al. Kidney Int 1987;31:1233-8; Zager et al. Kidney Int 1984;26:689-700; Zager et al. Lab Invest 1995;72:592-600; Zager, Kidney Int 1995;47:1336-45; Zager, Kidney Int 1995;47:628-37). Este fenômeno, que é mediado em parte por uma regulação positiva de proteínas de "estresse" anti-inflamatórias e citoprotetivas (por exemplo, heme oxigenase 1 (HO-1), ferritina, hemopexina, haptoglobina, alfa 1 antitripsina, interleucina 10 (IL-10) tem sido referido como 'pré-condicionamento isquêmico' ou o estado de “citorresistência adquirida”. Zager et al. J Am Soc Nephrol 2014;25:998- 1012; Deng et al. Kidney Int 2001;60:2118-28; Zarjou et al. J Clin Invest 2013;123:4423-34; Nath et al. J Clin Invest 1992;90:267-70; Zager et al. Am J Physiol 2012;303:F1460-72; Fink, J Leukoc Biol 2009;86:203-4 Arredouani et al. Immunology 2005;114:263-71; Blum et al. J Am Coll Cardiol 2007; 49:82-7; Galicia et al. Eur J Immunol 2009;39:3404-12; Zager et al. Am J Physiol 2012;303:F139-48; Zager et al. PLoS One 2014;9:e9838; Hunt & Tuder, Curr Mol Med 2012;12:827-35; Janciauskiene et al. J Biol Chem 2007;282:8573-82.

[0215] Dada a profunda natureza protetora da citorresistência adquirida, os investigadores procuraram maneiras de recapitulá-la com segurança em seres humanos. Notável a este respeito é o chamado "pré-condicionamento remoto", pelo qual episódios recorrentes de isquemia do membro superior e inferior são induzidos por recorrentemente inflar e desinflar algemas de pressão arterial. Yang et al. Am J Kidney Dis 2014;64:574-83; Mohd et al. J Surg Res 2014;186:207-16; Li et al. J Cardiothorac Surg 2013;8:43. O objetivo é liberar "fatores de condicionamento " de tecido desconhecidos para a circulação sistêmica que irá disparar respostas de tecido protetor (por exemplo, no cérebro, coração, fígado e rim). Apesar de seu apelo, esta abordagem teve apenas sucesso questionável, provavelmente por causa das seguintes razões:(1) os "fatores" liberados a partir de membros pós-isquêmicos que possam induzir "pré-condicionamento" e quanto da liberação do fator é necessário para induzir esse estado são desconhecidos; (2) as vias celulares pelas quais esses fatores impactam órgãos distantes para induzir citorresistência não foram definidas; e (3), é impossível julgar se o pré-condicionamento desejado de fato se desenvolve em qualquer dado sujeito.

[0216] Uma abordagem alternativa para induzir citorresistência adquirida foi procurada. Para este efeito, um regime farmacológico incluindo baixa dose de mioglobina nitrada (N-Mgb) + protoporfirina de estanho (SnPP), que marcadamente e sinergicamente regula positivamente um hospedeiro de citoprotetores de célula tubular renal (por exemplo, Ho-1, haptoglobina e IL-10) na ausência de toxicidade renal ou extrarrenal óbvia foi desenvolvido. Dentro de 18 horas após a administração do agente, impressionante resistência à AKI nefrotóxica, AKI induzida por depleção de trifosfato de adenosina (ATP) e progressão pós-AKI para Doença Hepática Crônica resultam. Além disso, proteção hepática contra ferimentos pós-isquêmicos e tóxicos é expressa. Por último, observou-se que a indução desse estado de citorresistência pode ser aferida de forma não invasiva usando HO-1 de plasma e os níveis de haptoglobina como "biomarcadores" de sua indução.

[0217] Métodos. Abordagem geral. Animais. Todos os experimentos foram conduzidos utilizando camundongos CD-1 do sexo masculino (35-45 g; Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts). Eles estavam alojados em condições de viveiro padrão com comida grátis e acesso a água todo o tempo. Os protocolos utilizados foram aprovados pelo cuidado do Institutional Animal Care and Utilization Committee (IACUC) da Instituição, de acordo com as orientações gerais do National Institutes of Health.

[0218] Reagentes indutores de citorresistência. Músculo esquelético do cavalo (#Mb0360; Sigma) foi usado como o principal agente indutor de citorresistência. No entanto, porque a mioglobina (Mgb) tem um potencial nefrotóxico inerente (particularmente em condições de depleção de volume e aciduria), duas abordagens foram usadas para mitigar os efeitos adversos potenciais de Mgb. Primeiro, a Mgb foi convertida em uma forma nitrada pela adição de uma quantidade equimolar de nitrito de sódio (Na). A este respeito, o nitrito é uma molécula ambidentada que se liga diretamente 1:1 a Fe de mioglobina quer através da sua componente de oxigênio ou de nitrogênio. Cotton et al. Advanced inorganic chemistry. Hobocken, NJ: Wiley-Interscience, 1999:1355; Silaghi-Dumitrescu et al. Nitric Oxide 2014; 42C:32-9. Notável é que o Fe é o mediador dominante de efeito citotóxico da Mgb, (Zager et al. J Clin Invest 1992; 89:989-95; Zager & Burkhart, Kidney Int 1997; 51:728-38) e esta toxicidade é substancialmente reduzida pela ligação prévia de nitrito. Rassaf et al. Circ Res 2014;114:1601-10; Totzeck et al. Circulation 2012;126:325-34 [J Clin Invest 1992;89:989-95]; Totzeck et al. PLoS One 2014;22:e105951; Hendgen-Cotta et al. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:10256-61.

[0219] Em adição à sua capacidade de diminuir a toxicidade mediada por Fe, nitrito tem sido implicado como um mediador de ''pré-condicionamento remoto'', possivelmente, através de geração de óxido nítrico (NO). Rassaf, supra. A este respeito, as proteínas heme reduzem diretamente nitrito, com a produção de NO resultante. Juncos et al. Am J Pathol 2006;169:21-31; Kellerman, J Clin Invest 1993;92:1940-9; Zager et al. Am J Physiol 2008;294:F187-97. Assim, por nitrito ligado diretamente a Mgb, injeção de Mgb com captação endocítica subsequente a túbulo proximal, resulta em nitrito de túbulo proximal direto e direcionamento a NO.

[0220] Em segundo lugar, para Fe de heme induzir a maior parte de sua citotoxicidade, deve primeiro ser liberado de seu local de sequestro de dentro do anel de porfirina. Esta versão Fe é mediada através de clivagem do anel de porfirina via HO-1. Assim, para atenuar a potencial citotoxicidade de Mgb, foi administrada juntamente com um transiente de HO-1 inibidor, SnPP. A este respeito, anteriormente foi relatado que adição de SnPP a células de túbulo Mgb-expostas cultivadas proximais (HK-2) ou a segmentos de túbulo proximal de camundongo carregados de heme in vivo reduz toxicidade de Mgb por mais de 85%. Zager & Burkhart, Kidney Int 1997;51:728-38. Esta ação citoprotetora é ainda indicada por observações que SnPP pode atenuar insuficiência renal aguda pós-isquêmica (ARF). Juncos et al. Am J Pathol 2006;169:21-31; Kaizu et al. Kidney Int 2003;63:1393-403.

[0221] Impacto da Mgb, SnPP e Mgb 1 SnPP na sinalização de heme cortical renal. Foi postulado que (1) N-Mgb seria uma molécula de sinalização potente, levando à regulação positiva de elemento responsivo de heme e genes sensíveis redox, que evocam atividades citoprotetoras (por exemplo, Ho-1, haptoglobina, hemopexina e IL-10); (2) SnPP pode independentemente regular positivamente tais genes; e (3) quando administrados juntos, N-Mgb + SnPP em coadministração podem levar a sinalização de elemento responsivo de heme sinergística ou aditiva. O seguinte experimento testou essas hipóteses.

[0222] Trinta e dois camundongos foram divididos em 4 grupos iguais:(1) camundongos de controle; (2) camundongos tratados com 1 mg de injeção de N-Mgb (como bolus na veia da cauda); (3) camundongos tratados com 1 mmol de SnPP (através da veia da cauda); e (4) ratos tratados com combinado de N-Mgb 1 SnPP. Após cada 4 horas (n = 16) ou 18 horas (n = 16), os ratos foram profundamente anestesiados com pentobarbital (50 mg/kg), o abdômen foi aberto através de uma incisão abdominal e os rins foram removidos. Para determinar os potenciais efeitos sobre órgãos extrarrenais, um lóbulo do fígado e o coração também foram removidos. Os tecidos foram gelados e então extraídos para proteína e RNA (RNeasy Plus Mini; Qiagen, Valencia, Califórnia) e submetidos a ensaio da imunoabsorção ligada por enzima (ELISA) e reação em cadeia da polimerase de transcriptase reversa (RT-PCR) para HO-1, haptoglobina e proteína IL-10 e RNAs mensageiros (mRNAs). Zager et al. J Am Soc Nephrol 2014;25:998-1012; Zager et al. Am J Physiol 2012;303:F139-48. Como uma avaliação da função renal, camundongos de controle e camundongos tratados com N-Mgb + SnPP após 18 horas tiveram níveis de nitrogênio de ureia do sangue (BUN) e os níveis de creatinina plasmáticos medidos. Além disso, seções de rim fixas em formalina a 10% transversas (3 mM) foram cortadas e coradas com hematoxilina e eosina (H & E) e ácido periódico Schiff (PAS) para avaliar risco de lesão.

[0223] Avaliações de citorresistência. Modelo de glicerol de rabdomiólise induzida por AKI. Vinte camundongos foram divididos em 4 grupos (controles, camundongos tratados com N- Mgb, SnPP e os camundongos tratados com injeções na veia da cauda de N-Mgb + SnPP), como descrito anteriormente. 18 horas depois, os camundongos foram brevemente anestesiados com isoflurano e imediatamente injetados com 9 mL/kg de glicerol a 50%, administrado em doses divididas igualmente em cada membro posterior. Às 18 horas após a injeção de glicerol, os camundongos foram anestesiados com pentobarbital, foi aberto o abdômen, obteve-se uma amostra de sangue para avaliações de ureia e creatinina da veia cava e os rins foram ressecados. O grupo pós-glicerol controle e o grupo glicerol N-Mgb+SnPP pré-tratado tiveram secções de rim coradas com H & E.

[0224] Modelo de maleato de AKI. Quando injetado em roedores, maleato sofre absorção seletiva de túbulo proximal através de transportadores de ânion orgânico e induz depleção de ATP específica túbulo proximal, profunda. Kellerman, J Clin Invest 1993;92:1940-9; Zager et al. Am J Physiol 2008;294:F187-97. Isso culmina numa grave AKI. O seguinte experimento avaliou se pré-tratamento com N- Mgb + SnPP pode proteger contra esta forma de dano renal. Doze ratos foram divididos em 2 grupos iguais, que receberam injeção de N-Mgb - SnPP ou veículo. Dezoito horas depois, todos receberam uma injeção intraperitoneal (IP) de maleato de Na (600 mg/kg).Zager et al.Am J Physiol 2008;294:F187-97.18 horas depois, os camundongos foram anestesiados, e amostra de sangue terminais foram obtidas a partir da veia cava inferior para medições de BUN e creatinina.

[0225] Progressão de AKI pós-isquêmica para CKD.Após 30 minutos de isquemia renal unilateral, o rim danificado sofre uma transição para CKD, manifestada por falha tubular progressiva, a inflamação intersticial, e fibrose, culminando em uma perda de 40% da massa renal (peso do rim).Zager et al.Am J Physiol 2011;301:F1334-45; Zager et al.Kidney Int 2013;84:703-12.Para determinar se o tratamento com N-Mgb-SnPP poderia aliviar a progressão da doença pós-isquêmica, 6 camundongos foram pré-tratados com esses agentes e 18 horas depois, foram anestesiados com pentobarbital e submetidos a 30 minutos de oclusão do pedículo renal esquerdo realizada através de uma incisão abdominal na linha média em uma temperatura corporal de 37°C.

[0226] O rim direito foi deixado intocado. Após o período de isquemia renal, o grampo vascular foi removido e a reperfusão completa foi confirmada por perda de cianose renal.Os camundongos foram então suturados e deixados se recuperar da anestesia.Seis camundongos, submetidos ao mesmo protocolo de cirurgia, mas sem pré-tratamento com N-Mgb-SnPP, serviram como controles.Duas semanas depois, a incisão abdominal foi reaberta e os rins foram ressecados.O grau relativo de lesão renal entre os 2 grupos foi avaliado pela perda de massa renal esquerda (conforme determinado pelo peso líquido renal) vs o peso dos rins esquerdos de 6 camundongos normais.Os níveis de proteína e mRNA da lipocalina associada à neutrófilo gelatinase (NGAL) cortical renal também foram avaliados como marcadores adicionais de dano renal.

[0227] Relações de dose-resposta após injeções IP de N-Mgb-SnPP.Para avaliar se uma taxa de distribuição de N-Mgb-SnPP (vs através de injeção em bolus intravenosa [IV]) também induz uma regulação positiva de proteínas citoprotetoras e citorresistência renal, os camundongos foram injetados com 0, 1, 2,5, ou 5 mg de N- Mgb 1, a dose padrão de SnPP (1 mmol) (3 camundongos cada; 1 mL de veículo de salina).Dezoito horas depois, os camundongos foram anestesiados com pentobarbital, uma amostra de sangue foi obtida, e os rins foram ressecados para determinar os níveis de proteína e mRNA de HO-1 e haptoglobina.Para testar se os níveis plasmáticos de HO-1 e haptoglobina aumentaram e refletiram os graus de regulação positiva renal de HO-1 e haptoglobina, os níveis plasmáticos de HO-1 e haptoglobina também foram determinados.

[0228] Para avaliar se os níveis de HO-1 e haptoglobina plasmáticos e renais determinados anteriormente se correlacionavam com os graus de citorresistência, os camundongos adicionais foram injetados com 0, 2,5, ou 5 mg de N-Mgb 1 1 mmol de SnPP (n = 3 camundongos por grupo).Dezoito horas depois, todos os camundongos foram submetidos ao modelo de AKI glicerol, conforme descrito anteriormente.As gravidades de AKI foram determinadas 18 horas após a injeção de glicerol poe análises do BUN e creatinina plasmática.

[0229] Experimentos de isquemia hepática. Catorze camundongos foram submetidos ao modelo de isquemia hepática parcial publicado anteriormente, que é realizado pela oclusão do fluxo sanguíneo (na tríade portal) para 3 de 5 lobos hepáticos por 25 minutos.Zager et al.Am J Physiol Renal Physiol 2014;307:F856- 68.Metade dos camundongos foram pré-tratados 18 horas antes com 1 mg de N-Mgb + 1 mmol de SnPP, conforme descrito anteriormente.A reperfusão após o período isquêmico foi avaliada pela restauração da cor hepática normal nos 3 lobos hepáticos envolvidos.Dezoito horas depois, os camundongos foram anestesiados novamente, a cavidade abdominal foi reaberta, e uma amostra sanguínea terminal foi obtida para os níveis plasmáticos de alanina aminotransferase (ALT) e lactato desidrogenase (LDH) como marcadores de dano hepático pós-isquêmico.

[0230] Lesão hepatotóxica. Para avaliar se o N-Mgb-SnPP poderia proteger contra uma forma tóxica de lesão hepática, 12camundongos anestesiados receberam injeções de glicerol a 50%.O glicerol (8 mg/kg) foi dado através de uma injeção IP para favorecer a absorção hepatocelular através da circulação portal.Metade dos camundongos foi pré-tratado 18 horas antes com N-Mgb-SnPP (1 mg Mgb/1mmol SnPP), conforme descrito anteriormente.Quatro horas após a injeção IP de glicerol, quando os camundongos ainda estavam anestesiados, eles foram sacrificados por transecção da veia cava abdominal.O grau de lesão hepática aguda foi estimado pelas concentrações plasmáticas de ALT.

[0231] Cálculos e estatísticas. Todos os valores são dados como a média 6 erro padrão da média.As comparações estatísticas foram feitas pelo teste t de Student.Se múltiplas comparações fossem feitas, a correção de Bonferroni foi aplicada.A gravidade da lesão histológica renal no modelo AKI de glicerol foi classificada em uma escala de 11 a 41 (necrose tubular mínima para a mais grave e formação de agregados observada).Os resultados histológicos foram comparados pelo teste de soma da ordem de Wilcoxon.Significância estatística foi determinada como um P valor de < 0,05.

[0232] Resultados. Função e histologia renal após injeção IV de N-Mgb + SnPP.Nenhum aumento do BUN nem da creatinina plasmática foi observado em 18 horas após a injeção IV de 1 mg de N-Mgb + SnPP (BUN, 22 ± 3 vs 25 ± 3 mg/dL; creatinina, 0,32 ± 0,03 vs 0,30 ± 0,04 mg dL; controles vs tratamento com Mgb/SnPP, respectivamente).Além disso, não houve evidência de lesão morfológica renal conforme evidenciado pela coloração com PAS ou H&E.Em particular, nenhuma evidência de necrose tubular ou formação de agregados de heme estava evidente no grupo de tratamento (ver a FIG.8. A borda em escova tubular proximal, como respresentada pela coloração por PAS, permaneceu inteiramente intacta (2 painéis superiores).Nesse sentido, a formação de bolhas e o inchaço da borda em escova no espaço luminal tubular proximal são considerados como sendo marcadores microscópicos de dano tubular altamente sensíveis à luz.Venkatachalam et al.Kidney Int 1978;14:31-49; Donohoe et al.Kidney Int 1978;13:208-22. Assim, esses dados indicam que o tratamento IV com N-Mgb-SnPP foi bem tolerado pelos rins.

[0233] Impacto de N-Mgb IV e SnPP, sozinho e em combinação sobre as expressões de HO-1, IL-10 e haptoglobina.Avaliações de HO-1 renal.Como mostrado na FIG.9, painel esquerdo, N-Mgb sozinho e SnPP sozinho causaram apenas aumentos discretos nos níveis de mRNA de HO-1 em 4 horas.Em contraste, um aumento de 20 vezes no mRNA de HO-1 foi observado em 4 horas após a injeção combinada de N-Mgb + SnPP.Em 18 horas após o tratamento, esses aumentos de mRNA traduzido em proteína HO-1 marcada aumentam, sendo 7 vezes maior do que os valores controle.Em contraste, apenas aumentos da proteína HO-1 relativamente pequenos foram observados com N-Mgb sozinho ou SnPP sozinho no ponto de tempo de 18 horas.Para resumir, esse aumentos da proteína HO-1 em 18 horas e do mRNA em 4 horas indicam um efeito sinérgico de N-Mgb + SnPP sobre a expressão renal cortical do gene de HO-1.(Os dados da mRNA de HO-1 [4 horas] e de proteína [18 horas] são apresentados na Tabela 8). Tabela 8.Valores de mRNA e de proteína renal 4h (a) e 18h (b) após tratamento com Rx

Abreviações:HO-1, heme oxigenase 1; IL-10, interleucina 10; mRNA, RNA mensageiro; N-Mgb, mioglobina com nitrito; NS, não significante; Rx, tratamento; SnPP, estanho-protoporfirina. Os níveis de proteína e mRNA renal cortical individuais induzidos pelos agentes de teste administrados sozinhos ou em combinação em 4h (a) e 18h (b) após a injeção.

[0234] Avaliações de IL-10 renal. Como mostrado na FIG.10, painel esquerdo, N-Mgb sozinho e SnPP sozinho tiveram um impacto mínimo ou nenhum impacto sobre os níveis de mRNA de IL-10 no ponto de tempo de 4 horas.Em contraste, o N-Mgb + SnPP combinado causou mRNA de IL-10 de 10 vezes em 4 horas após a injeção.Correspondente a esses resultados foi a ausência de aumentos da proteína IL-10 em 18 horas após a injeção de N-Mgb sozinho ou de SnPP sozinho.Por outro lado, um aumento de >2 vezes na proteína IL-10 foi visto em 18 horas após a injeção combinada de N-Mgb-SnPP.(Os dados da mRNA de IL-10 [4 horas] e de proteína [18 horas] são apresentados na Tabela 8).

[0235] Avaliações de haptoglobina cortical renal. Assim como com HO-1 e IL- 10, a combinação de N-Mgb + SnPP induziu os maiores aumentos de mRNA de haptoglobina em 4 horas após a injeção do agente (FIG.11).Em 18 horas após as injeções, um aumento maciço (20 vezes) nos níveis de proteína de haptoglobina cortical renal foi observado em resposta à injeção de N-Mgb-SnPP.No entanto, os níveis da proteína haptoglobina foram comparativamente aumentados com N-Mgb sozinho no ponto de tempo de 18 horas.Isto implica que este era o componente N- Mgb da terapia combinada que conduziu os aumentos da proteína haptoglobina em 18 horas.(Tendo em conta este aumento maciço, é concebível que nenhum aumento adicional poderia ser induzido pela terapia de combinação).Os dados adicionais de mRNA de haptoglobina (18 horas) e de proteína (4 horas) são apresentados na Tabela 8.

[0236] Impacto de IV N-Mgb sozinho, SnPP sozinho e N-Mgb + SnPP sobre a gravidade do modelo AKI de glicerol.Como mostrado na FIG.12, o pré-tratamento com SnPP sozinho não teve praticamente nenhum efeito sobre a gravidade do AKI induzido por glicerol.O N-Mgb sozinho induziu uma modesta proteção, como julgado pelos níveis de BUN/creatinina.No entanto, quando N-Mgb + SnPP foram usados juntos, uma proteção funcional completa foi observada (níveis de BUN/creatinina permaneceram nos valores normais).Uma proteção histológica coincidente também foi observada (pontuações histológicas de 3,5 ± 0,25 vs 1,25 ± 0,25 para o glicerol vs o grupo tratado com N-Mgb + SnPP; P < 0,05).Nesse sentido, o grupo de glicerol não tratado manifestou necrose tubular generalizada e formação de agregados, conforme representado anteriormente.Zager et al.Am J Physiol Renal Physiol 2014;307:F856- 68.Essas alterações estavam praticamente ausentes no grupo de pré-tratamento com N-Mgb + SnPP.

[0237] Modelo de AKI por Maleato. Como ilustrado na Fig.13, a injeção de maleato causou lesão grave, como denotado pelos aumentos marcados de BUN/creatinina.O pré-tratamento com N-Mgb + SnPP conferiu quase proteção completa contra esta lesão, como denotado pelos níveis quase normais de BUN/creatinina.

[0238] A FIG.14 mostra que a cardiotoxicidade induzida por maleato é reduzida pelo pré-tratamento com N-Mgb + SnPP.Os camundongos foram tratados com 1 mg/kg de N-mioglobina + 1 μmol de SnPP ou injeção de veículo IV).Dezoito horas depois, 800 mg/kg de maleato foram administrados IP.A extensão da lesão miocárdica foi determinada 18 horas após a injeção de maleato, medindo concentrações plasmáticas de troponina I (por ELISA).A injeção de maleato causou um aumento de 10 vezes nos níveis plasmáticos de troponina.O pré-tratamento com N-Mgb + SnPP reduziu o aumento de troponina induzida por maleato em 75%.

[0239] Modelo de AKI pós-isquêmico.Em 2 semanas pós-isquemia, uma redução de 38% da massa renal esquerda pós-isquêmica foi observada nos camundongos com isquemia unilateral controle (FIG.15).Em contraste, apenas uma redução de 12% foi vista nos camundongos que receberam tratamento profilático com N-Mgb + SnPP (P < 0,005).Esta redução na lesão renal também foi denotada pelas reduções marcadas nos níveis de proteína e de mRNA de NGAL no grupo de pré- tratamento com N-Mgb- SnPP (FIG.15).

[0240] Relações de dose-resposta entre os níveis de HO-1/haptoglobina corticais renais e plasmáticos e graus de proteção contra AKI induzida por glicerol. Como mostrado na FIG.16, aumentos progressivos nas dosagens IP de N-Mgb em camundongos normais produziram aumentos progressivos nos níveis de HO-1 e haptoglobina corticais renais e plasmáticos.As correlações significativas entre os níveis plasmáticos e corticais renais de HO-1 e haptoglobina foram observados (por exemplo, r = 0,82 entre os níveis corticais renais e plasmáticos de haptoglobina).Além disso, essa doses crescentes de N-Mgb foram associadas à proteção progressiva (50%; 100%) contra o modelo de AKI por glicerol (FIG.17).Assim, esses dados implicam que o grau de aumentos plasmáticos de HO-1 ou haptoglobina pode servir como biomarcadores de indução gênica renal induzido por N-Mgb-SnPP e os graus de resistência para ARF subsequente.Apesar da administração de 5 mg de N-Mgb (+ dose padrão de SnPP), nenhuma evidência de lesão renal (BUN normal, creatinina; ver a FIG.17, painel direito) foi observada.

[0241] Avaliações hepáticas. Expressões hepáticas de HO-1, IL-10 e haptoglobina no fígado em resposta às injeções de N-Mgb/SnPP.O tamanho do crescimento sobre os valores controle para os níveis de mRNAs de HO-1, IL-10 e haptoglobina (4 horas) e de proteína (18 horas) são representados na FIG.18, painéis superiores.Foram observados aumentos marcados em cada um.Os valores individuais para cada agente sozinho ou em combinação são dados na Tabela 9. Níveis de mRNA e proteína no fígado 4h (a) e 18h (b) após o tratamento com Rx

. Abreviações:HO-1, heme oxigenase 1; IL-10, interleucina 10; mRNA, RNA mensageiro; N-Mgb, mioglobina com nitrito; NS, não significante; Rx, tratamento; SnPP, estanho-protoporfirina. SnPP, estanho-protoporfirina Níveis de proteína e mRNA hepático individuais induzidos pelos agentes de teste administrados sozinhos ou em combinação em 4h (a) e 18h (b) após a injeção.

[0242] Em 4 horas após a injeção, os níveis hepáticos de mRNA de HO-1, IL- 10 e haptoglobina estavam significativamente mais altos com a injeção combinada de N-Mgb + SnPP vs cada agente sozinho (Tabela 9).Isto se traduziu em maiores aumentos de proteína HO-1, IL-10 e haptoglobina hepáticos, como avaliado no ponto de tempo de 18 horas (P < 0,001 para cada proteína vs tecidos controles).

[0243] Modelo de isquemia hepática. A isquemia hepática induziu aumentos marcados nas concentrações plasmáticas de ALT e LDH (ver a FIG.19).Os aumentos de LDH e ALT foram reduzidos em 75% e 50%, respectivamente, com o pré- tratamento com N-Mgb + SnPP (correspondendo aos aumentos hepáticos das proteínas HO-1, haptoglobin e IL-10 protein; Tabela 9).Como mostrado na FIG.20 (superior), necrose generalizada foi observada em seções inteiras de fígado pós- isquêmico.O pré-tratamento com N-Mgb + SnPP levou a uma aparência hepática inteira muito mais normal (FIG.20 (inferior)).

[0244] Lesão hepatotóxica. Como mostrado no painel direito da FIG.19, o tratamento com N-Mgb + SnPP também reduziu o grau de lesão hepática induzida por glicerol IP, conforme avaliado pelos níveis plasmáticos de ALT.

[0245] Níveis cardíacos de proteína e mRNA de HO-1, IL-10 e haptoglobina.Conforme mostrado na parte inferior da FIG.18, o N-Mgb + SnPP combinado induziu aumentos de 3 a 4 vezes nos mRNAs de HO-1, haptoglobina e IL- 10 em 4 horas, e aumentos de até 3 a 15 vezes em seus níveis de proteína no ponto de tempo de 18 horas.Os valores individuais são dados na Tabela 10. Tabela 10. Níveis de mRNA e proteína no coração 4h (a) e 18h (b) após o tratamento com Rx

Abreviações:HO-1, heme oxigenase 1; IL-10, interleucina 10; mRNA, RNA mensageiro; N-Mgb, mioglobina com nitrito; NS, não significante; Rx, tratamento; SnPP, estanho-protoporfirina. Os níveis de proteína e mRNA cardíacos individuais induzidos pelos agentes de teste administrados sozinhos ou em combinação em 4h (a) e 18h (b) após a injeção. Em geral, aumentos muito maiores de mRNA e proteína foram observados com a administração do agente combinado vs cada agente sozinho.

[0246] Discussão. Em 1992, Nath et al.(J Clin Invest 90:267-70) demonstraram que a administração de hemoglobina em ratos pode induzir proteção marcada contra ARF induzido por rabdomiólise mediada por glicerol (24 horas depois).Esta resposta protetora foi atribuída à regulação positiva de HO-1 mediada por heme com base em 2 observações fundamentais:(1) o pré-tratamento com heme aumentou marcadamente os níveis de mRNA e de proteína HO-1 renal, bem como a atividade enzimática de HO-1, e (2) o modelo de glicerol agravou-se marcadamente pela administração do potente inibidor de HO-1, SnPP, no momento (e após) a injeção de glicerol.A partir do momento dessas observações seminais, o papel de HO-1 como uma potente molécula antioxidante e anti-inflamatória foi bem estabelecido em vários modelos de AKI (por exemplo, cisplatina, isquemia renal, endotoxemia; revisto em Nath, Curr Opin Nephrol Hypertens 2014;23:17-24).Além disso, seus efeitos protetores foram extensivamente descritos em diversas formas de dano tecidual extrarrenal (por exemplo, cérebro, fígado, coração, transplante de órgãos)Kusmic et al.J Transl Med 2014;12:89; Czibik et al.Basic Res Cardiol 2014;109:450; Sharp et al.Transl Stroke Res 2013;6:685-92; Le et al.CNS Neurosci Ther 2013;12:963-8; Huang et al.World J Gastroenterol 2013;21:2937-48; Liu et al.Crit Care Med 2014; 42:e762-71; Wszola et al.Prog Transplant 2014;1:19-26.No entanto, menos certo que a existência das ações protetoras de HO é o mecanismo exato pelo qual essa proteção é realizada.Devido ao fato de que a clivagem de HO-1 do anel de porfirina liberar Fe catalítico altamente tóxico (que exerce efeitos adversos diretos; Zager & Burkhart, Kidney Int 1997;51:728-38), acredita-se agora que consequências secundárias da atividade aumentada de HO-1 estejam envolvidas.Estas incluem a geração dos antioxidantes biliverdina e bilirrubina, produção de monóxido de carbono citoprotetor, e níveis aumentados de ferritina tecidual (H), com sua maior capacidade para a ligação ao Fe catalítico. Zarjou et al.J Clin Invest 2013;123:4423-34; Nath, Curr Opin Nephrol Hypertens 2014;23:17-24.Complexidades adicionais na interpretação do envolvimento de HO-1 na citoproteção provem do fato de que os indutores de HO-1 (por exemplo, heme) também regulam positivamente uma série de vias citoprotetoras, por exemplo, haptoglobina (Zager et al.Am J Physiol 2012;303:F139-48), hemopexina (Zager et al.Am J Physiol 2012;303:F1460-72) alfa 1 antitripsina (Zager et al.PLoS One 2014;9:e9838) e IL-10 (como mostrado na presente divulgação).Isto complica a interpretação dos efeitos de HO-1 sobre a lesão tecidual dada a presença de várias proteínas protetoras teciduais reguladas positivamente.

[0247] A interação entre SnPP e HO-1 também é complexa.Primeiramente, como um inibidor competitivo de HO-1, a administração de SnPP pode aumentar secundariamente os níveis de mRNA e de proteína HO-1 tanto por "inibição de feedback" da enzima quanto pela indução de um estado pró-oxidante leve com a produção contrabalanceante de HO-1 (por exemplo,Kaizu et al.Kidney Int 2003;63:1393-403).Em segundo lugar, a fração Sn de SnPP pode, independentemente, regular positivamente o HO-1 através de efeitos pró-oxidantes diretos.Barrera-Oviedo et al.Ren Fail 2013;35:132-7.Em terceiro lugar, ao considerar os efeitos de SnPP, é importante reconhecer que a indução de HO-1 secundária poderia ser potencialmente deslocada pela inibição de HO-1 induzida por SnPP.No entanto, vale ressaltar que o SnPP tem uma meia-vida relativamente curta (2-4 horas; Berglund et al.Hepatology 1988;8:625-31).Assim, os aumentos retardados de HO-1 (por exemplo,18 horas após a administração de glicerol ou tratamento com N-Mgb- SnPP) devem ser livres para exercer seus efeitos biológicos devido à eliminação anterior de SnPP.Este conceito é apoiado pelas observações de que em 24 horas após a administração de SnPP, o HO-1 regulado positivamente foi capaz de exercer um efeito citoprotetor (por exemplo, contra ARF isquêmico; Juncos et al.Am J Pathol 2006;169:21-31; Kaizu et al.Kidney Int 2003;63:1393-403).

[0248] À luz das considerações mencionadas anteriormente, criou-se a hipótese de que uma combinação de N-Mgb + SnPP poderia induzir aumentos aditivos ou sinérgicos em HO-1 e em outras proteínas citoprotetoras sensíveis à redox (por exemplo, haptoglobina e IL-10).Esta hipótese foi testada pela medição dos níveis de proteína e mRNA de HO-1, haptoglobina e IL-10 em 4 e 18 horas após a injeção de N-Mgb, SnPP ou de N-Mgb + SnPP.Conforme mostrado nas FIGs.7-9, a terapia combinada induziu, de forma geral, respostas sinérgicas ou aditivas.Por exemplo, em 4 horas após a injeção, um aumento de 20 vezes no mRNA de HO-1 foi observado, mais que o dobro dos aumentos vistos com N-Mgb ou SnPP sozinhos.Em 18 horas, este aumento precoce de mRNA se traduziu em aumentos de 7 vezes da proteína HO-1.Resultados qualitativamente semelhantes foram observados com a IL- 10.Particularmente notável foi o aumento maciço (20 vezes) da proteína haptoglobina em 18 horas após a administração de N-Mgb-SnPP.No entanto, neste caso, pareceu que foi uma interação de N-Mgb, em vez de N-Mgb-SnPP, que foi a grande responsável, dado que o N-Mgb sozinho vs N-Mgb + SnPP induziu aumentos da haptoglobina renal comparáveis.Claramente, proteínas sensível à redox citoprotetoras adicionais, diferentes de HO-1, IL-10 e haptoglobina, também podem ter sido induzidas pelo protocolo de N-Mgb-SnPP (por exemplo, a1 antitripsina, hemopexina, hepcidina).Assim, parece lógico que várias proteínas citoprotetoras poderiam agir juntas para aliviar as respostas de lesão celular.

[0249] Tendo observado aumentos corticais renais dramáticos nas proteínas citoprotetoras após a administração de N-Mgb-SnPP, foi testada a eficácia da última na proteção contra as 3 formas de AKI.A FIG.12 retrata os resultados no modelo de glicerol.Como mostrado, a administração de SnPP sozinho não induziu nenhuma redução significativa nos níveis de BUN ou creatinina.Quando N-Mgb sozinho foi administrado, observou-se um efeito protetor modesto.No entanto, quando administrados juntos, o pré-tratamento de N-Mgb + SnPP evocado essencialmente completa a proteção funcional conforme indicado por concentrações normais de creatinina de plasma e de BUN a 18 horas após a injeção de glicerol.Além disso, histologia renal próxima ao normal foi observada.Assim, estes resultados sublinham o princípio de que os aumentos sinérgicos em proteínas citoprotetoras podem se traduzir em proteção sinérgica contra o IRA.

[0250] Para explorar ainda mais o âmbito de proteção mediada por N-MGB- SnPP, foi utilizado o modelo de maleato de IRA tubular proximal ATP mediada por depleção. Novamente, a proteção dramática ou quase completa foi observada (FIG.13).Porque é bem reconhecido agora que AKI pode iniciar o aparecimento da doença renal crônica progressiva, se o pré-tratamento de N-Mgb - SnPP puder revogar este processo em um modelo publicado anteriormente de lesão renal pós isquêmica unilateral (Zager et al.Kidney Int 2013; 84:703-12; Zager et al.Am J Physiol Renal Physiol 2014; 307:F856-68) em que uma perda de 40% da massa renal normalmente resulta em 2 semanas foi avaliada.Como mostrado na FIG.15, a lesão pós isquêmica foi atenuada de modo perceptível com pré-tratamento de N-Mgb - SnPP, como evidenciado por uma redução na perda de massa renal de 38% para 12% e reduções perceptíveis nos níveis de mRNA e de proteína NGAL.Assim, em cada um dos 3 modelos AKI heterogêneos, observou-se proteção dramática.Embora o rim tenha a maior exposição a 2 agentes de teste (por exemplo, através de filtração rápida, endocitose de Mgb), virtualmente todas as células são expostas transitoriamente a eles após sua injeção IV.Além disso, protoporfirinas podem se ligar a, e serem absorvidas por uma variedade de células.Anderson et al.J Pharmacol Exp Ther 1984; 228:327 - 33.Portanto, foi questionado se o regime N-MGB-SnPP divulgado pode também regular para cima as respostas protetoras em órgãos extra-renais.Com efeito, este foi o caso, dado que os tecidos hepáticos e cardíacos manifestaram HO-1, IL-10 e o mRNA de haptoglobina e a proteína aumentaram em 4 e 18 horas após a injeção de N-Mgb - SnPP (como apresentado nas Tabelas 9 e 10).O fato de N-Mgb sozinha poder induzir uma resposta nos tecidos extrarrenais foi surpreendente, dado que endocitose mediada por megalina-cubilina é considerada um caminho específico renal.Isto também sugere a absorção extrarrenal potencial, possivelmente através de receptores de sequestrante, (Canton et al.Nat Rev 2013; 13:621-34) ou que quando presentes na microcirculação, N-Mgb e SnPP são capazes de ativar genes citoprotetores intracelulares. Para testar se a proteção extrarrenal pode ser um resultado, o impacto do pré-tratamento de N-Mgb + SnPP sobre a extensão da lesão hepática pós isquêmica foi avaliado.Como apresentado na FIG.18, observaram-se reduções marcadas em concentrações plasmáticas de ambos LDH e ALT.Além disso, a proteção óbvia foi indicada pelo aparecimento bruto de tecidos hepáticos pós isquêmicos (FIG.19).Para testar ainda mais a resistência à lesão hepática, os camundongos foram submetidos a uma injecção IP de glicerol, o que, ao atingir o fígado através da circulação de portal, induz danos hepáticos modestos.Dentro de 4 horas após a injeção de glicerol IP, aumentos no ALT plasmático foram resultados, os quais foram em grande parte revogados por injeção prévia de N-Mgb - SnPP.

[0251] Anteriormente foi demonstrado que os níveis plasmáticos de haptoglobina ou HO-1 podem servir como biomarcadores de haptoglobina cortical renal e incrementos de HO-1 no contexto de ARF.Z Zager et al.Am J Physiol 2012;303:F139-48; Zager et al.J Am Soc Nephrol 2012; 23: 1048-2057.Portanto, foi questionado se haptoglobina plasmática e HO-1 podem também servir como biomarcadores para a indução destas proteínas no rim após a administração de N- MGB-SnPP e para o surgimento do estado citorresistência.Este, de fato, foi o caso.Como mostrado na FIG.16, as doses crescentes dos aumentos dependentes da dose induzidos por N-Mgb-SnPP nos níveis de haptoglobina e HO-1 plasmáticos, e esses aumentos se correlacionam diretamente com o teor de haptoglobina e HO-1 corticais renais.Além disso, atingir relações inversas entre os aumentos de HO-1 plasmático induzidos por N-Mgb-SnPP e haptoglobina plasmática e as concentrações de BUN pós-glicerol foram observadas (r, -0,79/r, -0,71 para níveis de BUN vs HO-1 e haptoglobina plasmática, respectivamente).Assim, os aumentos de HO- 1/haptoglobina plasmáticos confirmariam a atividade biológica de N-Mgb-SnPP em ensaios clínicos, e os graus de aumento de HO-1 e haptoglobina plasmática também seriam preditivos dos graus de resistência à AKI subsequente.

[0252] Uma preocupação óbvia da aplicação desta estratégia profilática ao paciente são as possíveis toxicidades renal e/ou extrarrenal. No entanto, neste sentido, vale ressaltar que o SnPP já foi mostrado como sendo bem tolerado em humanos (por exemplo,Berglund et al.Hepatology 1988;8:625-31; Kappas et al.Pediatrics 1988;81:485-97; Reddy et al.J Perinatol 2003;23:507-12).Além disso, foi previamente documentado em um sistema de cultura de células que a adição de nitrito reduz marcadamente os efeitos citotóxicos da mioglobina em 75% (dados não publicados, 2014).Para avaliar a margem in vivo potencial da segurança para N-Mgb + SnPP (ver FIGs. complementares), foi testada a quantidade máxima de N-Mgb que poderia ser dada aos camundongos antes da nefrotoxicidade ser observada.Até 25 vezes a dose de N-Mgb empregada (com uma dose de SnPP constante) poderia ser administrado (durante 2 horas) sem a indução de nefrotoxicidade (BUN e creatinina normais, 18 horas depois).Finalmente, nem a dosagem padrão de N-Mgb-SnPP (1 mg N-Mgb/1 mmol SnPP) nem 5 mg IP de N-Mgb (FIG.17) induziram lesão renal evidente (18 horas de BUN/creatinina, ou histologia), nem aumentou os níveis de ALT hepática e de troponina cardíaca.Em conjunto, estes dados indicam a utilidade na aplicação clínica.

[0253] Conclusões. A administração de N-Mgb, juntamente com um inibidor de sua degradação (SnPP), leva a aumentos dramáticos em uma série de proteínas citoprotetoras no rim.A potência desta resposta é indicada pelas observações de que os aumentos da proteína HO-1 renal documentados foram 15 vezes maiores que aqueles atingidos com metil bardoxolona, um reconhecido indutor de HO-1 mediado por Nrf-2.Wu et al.Am J Physiol 2011;300:F1180-92.Dentro de 18 horas de sua administração, N-Mgb + SnPP provocou proteção significativa contra 3 modelos diversos de AKI:rabdomiólise induzida por glicerol, depleção de ATP no túbulo proximal induzida por maleato e progressão pós-isquêmica de AKI para CKD.Surpreendentemente, a administração de N-Mgb + SnPP também induziu aumentos sinérgicos nas proteínas citoprotetoras no fígado, levando a uma proteção significativa contra lesão de reperfusão-isquemia hepática e hepatotoxicidade.Finalmente, N-Mgb + SnPP pode regular positivamente as proteínas citoprotetoras no coração, sugerindo proteção cardíaca e, assim, uma ampla variedade de efeitos citoprotetores.Digno de nota, cada uma dessas respostas foi induzida na ausência de toxicidade renal, hepática ou cardíaca discernível.Assim, esses dados sugerem que a coadministração de N-Mgb + SnPP pode fornecer uma estratégia profilática clínica para a proteção contra lesões renais e extrarrenais, tais como podem resultar durante o desvio (bypass) cardiopulmonar, reparo de aneurisma aórtico, ou outras cirurgias complexas de alto risco.Assim, esta estratégia poderia atender potencialmente a uma série de necessidades clínicas não atendidas significativas.

[0254] Exemplo 5. Dois cães mestiços, um macho, uma fêmea, tiveram o sangue para base de referência retirado para medição dos níveis de heme oxigenase 1 plasmática (HO-1; ELISA canino) BUN, creatinina plasmática e lactato desidrogenase.Uma amostra de urina pronta de base de referência também foi obtida para o ensaio de HO-1.O cão 1 recebeu então uma infusão de 50 ml/50 min de salina normal/40mM de NaHCO3 contendo 5 mg/Kg de mioglobina canina com nitrito + 3,75 mg/Kg de SnPP.O cão 2 recebeu 2,5 mg/Kg de N-mioglobina canina + 7,5 mg/Kg de SnPP.Quatro e 26 horas depois, foram obtidas amostras de sangue repetidas.Uma segunda amostra de urina foi coletada em 26 horas após a infusão.Como mostrado na Tabela 11, a infusão provocou aumentos maciços nas concentrações de HO-1 plasmática e urinária na ausência de lesão renal (com base nos níveis de BUN e creatinina plasmática).Os valores de LDH permaneceram inalterados, implicando na ausência de lesão tecidual renal/extrarrenal óbvia. Tabela 11.Indução de HO-1 em Cães

[0255] Exemplo 6. Efeitos de sacarose de Fe e cianocobalamina (Vitamina B12) sobre a indução de heme oxigenase 1 nos rins.A regulação positiva da heme oxigenase-1 (HO-1) é um mediador crítico da atividade citoprotetora de N- mioglobina/SnPP nos rins e órgãos extrarrenais.Portanto, buscaram-se agentes adicionais que possam induzir a regulação positiva de HO-1 e, assim, contribuir para o aparecimento de proteção tecidual contra formas de lesão tóxicas e isquêmicas.Devido ao fato de o Fe ser o mediador crítico da atividade de N-Mgb, foi avaliado o impacto de um polímero de Fe-carboidrato (sacarose de Fe; peso molecular variando de 34-61 kDa) sobre os níveis de HO-1.

[0256] Como uma estratégia alternativa/complementar, foi estudado o impacto da cianocobalamina (vitamina B12) sobre a indução de HO-1 nos rins.A base racional para os testes com B12 é que o cobalto e a cianida podem induzir independentemente a HO-1.Assim, a B12 representaria um método seguro para administrar a cianida e o cobalto, e como um agente único, uma vez que ambos são partes integrantes da molécula de B12.

[0257] Metódos. Camundongos CD-1 machos (25-40 gramas) Charles River, Wilmington, MA) foram usados para todos os experimentos.Eles foram alojados sob condições de viveiro padrão com acesso livre à água e alimentos.Todos os experimentos foram aprovados pelo Fred Hutchinson Cancer Research Center IACUC de acordo com as diretrizes do NIH.

[0258] Efeitos da sacarose de Fe (FeS)/estanho-protoporfirina (SnPP) sobre a gravidade de AKI.Modelo de maleato de AKI.Quando injetado em roedores, o maleato sofre absorção de célula de túbulo proximal relativamente seletiva através de transportadores de ânion orgânico.Uma vez que a acumulação intracelular ocorre, o maleato é um substrato preferido para succinil-CoA:3- oxoácido CoA transferase.Isso resulta na formação de malonil coenzima A.Com a conversão subsequente de malonil CoA em um tioéter estável, é resultada uma depleção da coenzima A (CoA) grave.Amplos níveis de CoA são essenciais para a "ativação" do ácido graxo, permitindo o seu subsequente metabolismo através do ciclo de Krebs, produzindo ATP.Na ausência desse processo, a depleção de ATP de túbulo proximal e lesão celular são resultados.Além disso, o maleato conjuga o grupo sulfidrila de glutationa (GSH), culminando na depleção de GSH e tensão tubular de potencial oxidante.

[0259] O seguinte experimento tesou se FeS, SnPP ou FeS + SnPP cominados podem atenuar esta forma de insuficiência renal aguda (AKI).Vinte e sete camundongos foram submetidos a 200 μ injeções na cauda L IV de um dos seguintes:1) veículo (solução salina tamponada de fosfato, PBS; n, 10); 2) 1mg FeS (American Regent (Shirley, NY; n, 3); 3) 1μmol de SnPP (Frontier Scientific, Logan, UT; n 7) ou FeS + SnPP, n, 7).Dezoito horas mais tarde, todos os camundongos receberam uma injeção IP de maleato de Na (800 mg/Kg; em 500 ul de PBS).Dezoito horas mais tarde, os camundongos foram profundamente anestesiados com pentobarbital (50 mg/kg IP), as cavidades abdominais foram abertas e as amostras de sangue foram obtidas a partir da veia cava abdominal.A gravidade da lesão renal foi avaliada por meio da determinação de concentrações de nitrogênio uréico no sangue (BUN) e de creatinina plasmática (PCr).

[0260] Modelo de lesão de isquemia-reperfusão renal (IRI) de AKI.O experimento seguinte avaliou se a combinação FeS + SnPP pode atenuar o modelo de oclusão da artéria renal de AKI.Os camundongos receberam 200 μl injeções na veia da cauda tanto de PBS (n, 9) quanto de FeS + SnPP (n, 8), conforme mencionado acima.Dezoito horas mais tarde, os camundongos foram profundamente anestesiados com pentobarbital (40-50 mg/Kg IP), as cavidades abdominais foram abertas, foram identificados os pedículos renais e ambos foram ocluídos com grampos microvasculares.A temperatura corporal foi mantida a 36-37o C por todo o processo.Após 22 minutos de isquemia renal bilateral, os grampos foram removidos, a reperfusão uniforme foi visualmente confirmada pelo reaparecimento de uma cor renal normal (perda de cianose de tecido) e em seguida as cavidades abdominais foram fechadas em duas camadas com sutura de seda.Dezoito horas mais tarde, os camundongos foram reanestesiados as cavidades abdominais foram reinauguradas e obtiveram-se amostras de sangue terminal da veia cava.A gravidade da lesão renal foi determinada por concentrações de BUN e de PCr.

[0261] Os efeitos de FeS/B12 da gravidade de AKI.Modelo de glicerol de AKI.Os camundongos receberam injeções na veia de cauda tanto de veículo de PBS (n. 6) quanto de combinação de FeS + 1 μ mol B12 (n, 6; B12 da Alfa Aesar, Ward Hill, MA).Dezoito horas mais tarde, os camundongos foram levemente anestesiados com isoflurano, e então o modelo de glicerol de rabdomiólise de AKI foi induzido (9 ml/Kg 50% de glicerol, administrado em duas injeções de IM igualmente divididas nos membros superiores posteriores).Dezoito horas após a injeção de glicerol, os camundongos foram profundamente anestesiados com pentobarbital e amostras de sangue de veia cava terminal foram obtidas.A gravidade da lesão renal foi aferida pelas concentrações de BUN e de PCr terminais.

[0262] Modelo de maleato de AKI. Os camundongos receberam injeções na veia da cauda tanto da combinação de FeS + B12 ou do veículo (n, 6 por grupo).Dezoito horas mais tarde, receberam injeções IP de maleato, como notado acima.A gravidade de AKI foi determinada 18 horas após a injeção de maleato por avaliações de BUN e PCr terminais.

[0263] Efeitos da FeS, SnPP e B12 na indução cortical renal de oxigenase de heme 1 (HO-1).Os experimentos seguintes avaliaram os efeitos da FeS, SnPP e B12 sobre a possível indução da porteína citoprotetora HO-1.Para este fim, os camundongos foram injetados com cada um desses agentes, como notado acima.4 ou 18 horas mais tarde, eles foram anestesiados e os rins foram removidos através de uma incisão na linha média abdominal.Os córtices renais foram dissecados no gelo e então extraídos para proteínas e mRNA.As amostras foram então analisadas por proteína HO-1 por ELISA e HO-1 mRNA por RT-PCR, fatoradas por níveis de GAPDH.Cinco camundongos normais forneceram valores de controle.

[0264] Resultados. Efeitos de FeS/SnPP na gravidade de AKI.AKI induzido por Maleato:Como mostrado na FIG.22, a injeção de maleato causou grave AKI como indicado por aumentos significativos de BUN e PCR sobre controles de maleato injetados (C).Nem SnPP sozinho nem FeS sozinho alteraram significativamente a gravidade da lesão renal.No entanto, FeS + SnPP combinados conferiram proteção acentuada, conforme indicado por 75% de reduções em concentrações de BUN/PCR (as linhas horizontais representam as médias dos níveis de BUN/PCR em camundongos normais).

[0265] AKI induzido por Isquemia-Reperfusão Renal (IRI): Dentro de 18 horas de indução de IRI, elevações de 4 vezes de concentrações de BUN e de PCr foram resultadas (FIG. 23).Pré-tratamento com FeS + SNPP conferiu proteção significativa, redução dos níveis de BUN e PCR em 50%.As linhas horizontais representam os níveis médios de BUN/PCR em camundongos normais.

[0266] Efeitos de FeS/B12 na gravidade de AKI.AKI induzido por Maleato:Mais uma vez, a injeção de maleato induziu AKI grave (FIG.24).Pré-tratamento com FeS + B12 marcadamente atenuou esta lesão, como denotado por reduções BUN/PCR.As linhas horizontais representam os níveis médios de BUN/PCR em camundongos normais.

[0267] Modelo de glicerol de AKI: Insuficiência renal severa foi resultada dentro de 18 horas de injeção de glicerol (FIG.25).O Pre com FeS + B12 conferiu proteção funcional substancial, conforme indicado por uma redução considerável em ambas as concentrações de 18 horas de BUN e de PCR.As linhas horizontais representam os níveis médios BUN/PCR para camundongos normais.

[0268] HO-1 mRNA de corticol renal e níveis de proteína.Como mostrado na FIG.26, cada um dos agentes induziram aumentos marcados e significativos em HO- 1 mRNA, conforme avaliado 4 horas após injeção.Por 18 horas, os níveis de HO-1 mRNA voltou aos valores normais.Como mostrado na FIG.27, um correlato de aumentos de mRNA de 4 horas foi um aumento significativo nos níveis de proteína de HO-1.Estes níveis permaneceram elevados no ponto de tempo de 18 horas, em particular no caso de administração de FeS.

[0269] Exemplos Proféticos. Exemplo Profético 1.Se uma formulação de depósito confere citoproteção maior ou igual com menor potencial de toxicidade do que o tratamento com mioglobina intravenosa (IV)/SnPP e/ou Fe-S e/ou B12 será avaliada.Diferentes doses de mioglobina com SnPP e/ou Fe-S e/ou B12 serão adicionadas como uma suspensão de 100 mg/ml PEG (PEG-5000).Existem duas justificativas para a realização deste experimento.Primeiro, por meio de injeção tanto por via intramuscular (IM) quanto por via subcutânea (SQ), a mioglobina e SnPP e/ou Fe-S e/ou B12 será absorvida de modo relativamente lento (vs. exposição de mioglobina sistêmica instantânea/SnPP e/ou Fe-S e/ou B12 seguida de injeção de IV).Por meio de abrandamento da absorção de mioglobina e/ou Fe-S e/ou B12 com um depósito de injeção de PEG, uma exposição renal mais lenta e mais sustentada para mioglobina e/ou Fe-S e/ou B12 será resultada.Isto favorece o aumento da mioglobina e/ou absorção de Fe-S e/ou B12 e, ao mesmo tempo, diminui o potencial de nefrotoxicidade, como pode ocorrer devido à rápida mioglobina renal e/ou Fe-S e/ou carregamento de B12 (que resulta na formação de cilindro obstrutivo dentro do lúmen tubular).Em segundo lugar, a PEG é um agente osmótico e passará por excreção renal.Porque um aumento agudo na osmolalidade na urina pode induzir proteínas citoprotetoras por conta própria e também pode conferir proteção por meio de provocação de aumento de taxas de fluxo urinário, um aditivo ou efeito benéfico sinérgico podem ser observados.

[0270] Exemplo Profético 2. A hematina irá inibir o HO e SnPP semelhantes, podendo também induzir um aumento na produção de HO (através de inibição de realimentação de enzima).Portanto, a hematina deve recapitular os efeitos benéficos do tratamento de SnPP. De modo relevante, a hematina tem sido aprovada pela Administração de Alimentos e Medicamentos norte-americana para o tratamento da doença clínica porfiria.Portanto, se a hematina é tão eficaz quanto o SnPP, a hematina pode ser selecionada para um estudo e desenvolvimento clínico.

[0271] Exemplo Profético 3. Está bem documentado que HO protege contra sepse experimental e endotoxemia. O HO-1 será regulado de acordo com as composições, kits e métodos divulgados neste documento e, então, 18 horas depois, os camundongos serão inoculados com endotoxina. Em 2 e 24 horas depois, a severidade da sepse é aferida por níveis de citocina inflamatória (TNF, MCP-1) no plasma e nos rins.Além disso, porque a endotoxemia provoca lesão renal, a gravidade da disfunção renal por BUN e creatinina será testada. Os resultados serão comparados aos camundongos não expostos sujeitos à injeção de Fendotoxin. Quando bem sucedido, isto irá expandir de forma grandiosa a utilidade das estratégias de proteção divulgadas para pacientes de alto risco de sepse (por exemplo, Pacientes de UTI).

[0272] Exemplo Profético 4: Estudos em curso irão demonstrar a eficácia de ferro e/ou vitamina B12 na proteção de vários sistemas de órgãos contra lesão.

[0273] As composições, kits e métodos divulgados neste documento são distintos de "precondicionamento remoto" em que um causa isquemia nas pernas (por exemplo, inflando braçadeiras de pressão sanguínea) para precondicionar outros órgãos, o que teve um sucesso muito limitado.Em modalidades específicas, as composições, kits e métodos divulgados neste documento podem ser referidos como "precondicionamento farmacológico remoto" (RPR).

[0274] Tal como será entendido por aqueles versados na técnica, cada modalidade divulgada neste documento pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em seu indicado elemento em particular, etapa, ingrediente ou componente. Portanto, os termos "incluem" ou "incluindo" devem ser interpretados para recitar: "compreende", "que consiste em" ou "que consiste essencialmente em". O termo de transição "compreendem" ou "compreende" significa que inclui, mas não se limita a e permite a inclusão de elementos, etapas, componentes ou componentes não especificados, mesmo em grandes quantidades. A frase de transição "que consiste em" exclui qualquer elemento, etapa, ingrediente ou componente não especificado. A frase de transição "consistindo essencialmente em" limita o escopo da modalidade aos elementos, etapas, ingredientes ou componentes especificados e àqueles que não afetam significativamente a modalidade. Um efeito material causaria uma redução estatisticamente significativa na capacidade de uma composição, kit ou método divulgado para proteger um órgão de uma lesão programada.

[0275] A menos que indicado em contrário, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, propriedades, tais como peso molecular, condições reacionais e assim por diante, usados no relatório descritivo e reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Por conseguinte, a menos que indicado em contrário, os parâmetros numéricos estabelecidos no seguinte relatório descritivo e nas reivindicações anexas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que tentaram ser obtidas pela presente invenção.Pelo menos, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve, pelo menos, ser interpretado à luz do número de dígitos significativos relatados e aplicando-se as técnicas de arredondamento comuns.Quando uma maior clareza é necessária, o termo "cerca de" tem o significado que lhe é razoavelmente atribuído por um indivíduo versado na técnica, quando usado em conjunto com um valor numérico ou intervalo declarado, isto é, denotando um pouco mais ou um pouco menos do que o valor ou intervalo indicado, para dentro de um intervalo de ± 20% do valor indicado; ± 19% do valor indicado; ± 18% do valor indicado; ± 17% do valor indicado; ± 16% do valor indicado; ± 15% do valor indicado; ± 14% do valor indicado; ± 13% do valor indicado; ± 12% do valor indicado; ± 11% do valor indicado; ± 10% do valor indicado; ± 9% do valor indicado; ± 8% do valor indicado; ± 7% do valor indicado; ± 6% do valor indicado; ± 5% do valor indicado; ± 4% do valor indicado; ± 3% do valor indicado; ± 2% do valor indicado; ou ± 1% do valor indicado.

[0276] Embora os intervalos numéricos e parâmetros que estabelecem o amplo escopo da invenção sejam aproximações, os valores numéricos estabelecidos nos exemplos específicos são relatados tão precisamente quanto possível. Qualquer valor numérico, no entanto, contém inerentemente certos erros que resultam necessariamente do desvio padrão encontrado em suas respectivas medições de teste.

[0277] Os termos "um", "uma", "o(a)" e referentes similares usados no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das seguintes reivindicações) devem ser interpretados no sentido de abranger tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado em contrário neste documento ou claramente contradito pelo contexto.A citação de intervalos de valores neste documento destina- se apenas a servir como um método de taquigrafia referindo-se individualmente a cada valor separado que está dentro do intervalo.A menos que indicado em contrário, cada valor individual está incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente citado neste documento.Todos os métodos descritos neste documento podem ser realizados em qualquer ordem apropriada, salvo indicação em contrário neste documento ou em caso de contradição clara pelo contexto.O uso de todo e qualquer exemplo, linguagem exemplar (por exemplo,"tal como") fornecida neste documento destina-se meramente a esclarecer melhor a invenção e não constitui uma limitação ao escopo da invenção de outra forma reivindicada.Nenhuma linguagem usada no relatório descritivo deve ser interpretada como indicativa de qualquer elemento não reivindicado essencial à prática da invenção.

[0278] Agrupamentos de elementos alternativos ou modalidades da invenção divulgados neste documento não devem ser interpretados como limitações. Cada membro do grupo pode ser referido e reivindicado individualmente ou em qualquer combinação com outros membros do grupo ou outros elementos encontrados neste documento.Está previsto que um ou mais membros de um grupo podem ser incluídos em, ou excluídos de, um grupo por razões de conveniência e/ou patenteabilidade.Quando qualquer inclusão ou exclusão ocorre, o relatório descritivo é considerado como contendo o grupo como modificado, assim, cumprindo a descrição de todos os grupos de Markush usados nas reivindicações anexas.

[0279] Certas modalidades da presente invenção estão descritas neste documento, incluindo o melhor modo conhecido aos inventores para realizar a invenção. Certamente, variações destas modalidades descritas tornar-se-ão evidentes àqueles versados na técnica ao lerem a descrição acima.O inventor espera que os versados na técnica empreguem tais variações conforme apropriado e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outra forma além daquela especificamente descrita neste documento.Nesse sentido, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do objeto citado nas reivindicações aqui anexas, conforme permitido pela lei aplicável.Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas suas variações possíveis está englobada pela invenção, a menos que indicado em contrário neste documento ou contradito claramente pelo contexto.

[0280] Além disso, inúmeras referências foram feitas a patentes, publicações impressas, artigos de periódicos e outros textos publicados por todo este relatório descritivo (materiais referidos neste documento).Cada um dos materiais referidos estão individualmente incorporados neste documento integralmente por referência para seu ensinamento referenciado.

[0281] As particularidades mostradas neste documento são apenas a título de exemplo e para fins de discussão ilustrativa das modalidades preferenciais da presente invenção e são apresentadas para fornecer o que é acreditado como sendo a descrição mais útil e facilmente compreendida dos princípios e aspectos conceituais das diversas modalidades da invenção. A este respeito, não é feita qualquer tentativa de mostrar detalhes estruturais da invenção com mais detalhes do que necessário para uma compreensão fundamental da invenção, a descrição, juntamente com as figuras e/ou exemplos, torna evidente para os versados na técnica como as diversas formas da invenção podem ser incorporadas na prática.

[0282] Definições e explicações utilizadas na presente divulgação destinam- se a controlar, em qualquer construção futura, a menos que modificadas claramente e sem ambiguidade nos exemplos seguintes ou quando a aplicação do significado tornar qualquer construção sem sentido ou essencialmente sem sentido.Nos casos em que a construção do termo o tornaria sem sentido ou essencialmente sem sentido, a definição deve ser feita a partir do Webster's Dictionary, 3 a Edição ou de um dicionário conhecido pelos versados na técnica, tal como o Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Ed.Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004).

[0283] Por fim, deve-se entender que as modalidades da invenção divulgadas neste documento são ilustrativas dos princípios da presente invenção. Outras modificações que podem ser empregadas estão dentro do escopo da invenção. Desse modo, a título de exemplo, mas não de limitação, configurações alternativas de presente invenção podem ser utilizadas em conformidade com os ensinamentos deste documento. Por conseguinte, a presente invenção não está precisamente limitada àquilo mostrado e descrito.

Claims (9)

1. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de (i) sacarose de ferro e (ii) protoporfirina de estanho, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de uma composição para proteger um órgão de danos com base em um insulto programado sem causar danos ao órgão; em que a quantidade terapeuticamente eficaz é formulada para ser administrada antes do insulto programado ao órgão ocorrer; para gerar citorresistência adquirida em um órgão na ausência de provocações de danos ao órgão; e/ou para regular positivamente a expressão de proteínas de estresse protetoras em um órgão sem causar danos ao órgão.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dano é um dano a base de um insulto.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é formulada para ser administrada pelo menos 8 horas antes de um insulto programado.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o insulto programado é cirurgia, quimioterapia ou toxicidade de contraste radioló- gico.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a cirurgia é uma cirurgia de transplante de órgão.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o órgão é um órgão transplantado.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o órgão é um rim e a proteção é evidenciada pela prevenção ou redução de BUN ou pelos aumentos da creatinina sérica em comparação com um nível de referência.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição inclui uma quantidade terapeuticamente eficaz de vitamina B12 ou um derivado de vitamina B12.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição inclui uma quantidade terapeuticamente eficaz de mioglobina ou uma mioglobina com nitrito.

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