BR112016024384B1

BR112016024384B1 - Método de produção de iogurte

Info

Publication number: BR112016024384B1
Application number: BR112016024384-6A
Authority: BR
Inventors: Marco Luigi Federico Giuseppin; Robin Eric Jacobus Spelbrink; Catharina Maria Antoinette Mooij
Original assignee: Cooperatie Avebe U.A.
Priority date: 2014-05-09
Filing date: 2015-05-08
Publication date: 2022-05-31
Also published as: CN106455601B; EA036597B1; CA2944398C; EA036597B9; JP2017514527A; JP6514766B2; CA2944398A1; CN106455601A; US10602753B2; BR112016024384A2; EP3139754A1; EA201691699A1; US20170055541A1; ZA201606681B; WO2015170985A1

Abstract

PRODUÇÃO DE IOGURTE. A presente invenção é da área de fermentação, e refere-se a um método para preparo de iogurte por fermentação, compreendendo as etapas de prover uma cultura de partida de fermentação contendo um microorganismo selecionado em um meio de cultura adequado, adicionar um inibidor de protease de proteína de batata ao meio de cultura, cultivar o micro-organismo, e coletar o iogurte. Este método tem a vantagem de que o tempo de latência (lag time) da fermentação pode ser reduzido pela adição de montantes relativamente baixos de inibidor de protease de proteína de batata. Tem a vantagem adicional de que o inibidor de protease de proteína de batata permite a aplicação do presente método em uma ampla faixa de pH e ampla faixa de temperatura incluindo pasteurização, é esterilizável por filtro e que o inibidor de protease de batata é não alergênico.

Description

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao campo da produção de iogurte por fermentação. Fermentação é uma técnica bem conhecida para a produção de iogurte usando a atividade metabólica de microorganismos que liberam ácido.

[002] Micro-organismos que liberam ácido são bem conhecidos por serem usados em uma cultura alimentícia contendo leite, resultando em iogurte que tem prazo de validade mais longo que leite. Exemplos de micro-organismos liberadores de ácido bem conhecidos para uso na produção de iogurte são micro-organismos do gênero: Lactobacillus, Lactococcus e Streptococcus.

[003] Em um processo típico de fermentação de iogurte, podem ser distinguidas três fases. A primeira fase se inicia quando os micro-organismos são combinados com a alimentação da fermentação, usualmente uma alimentação de base láctea. Os micro-organismos se adaptam a seu novo ambiente, e começam a absorver nutrientes, como peptídeos, aminoácidos, vitaminas e minerais. Nesta fase, os micro-organismos produzem enzimas necessárias para divisão e crescimento celular, para consumo de energia, e para formar materiais de estocagem, blocos de construção ou nutrientes. Nesta fase, entretanto, quase não há crescimento de micro-organismos, ou qualquer outra indicação visual de que alguma coisa está acontecendo na fermentação. Por esta razão, esta fase é denominada fase de latência ou de adaptação ao meio (lag phase).

[004] A fase de latência (lag phase) é caracterizada pelo fato de a presença de certos nutrientes pode ser o fator limitante para crescimento. Um exemplo é um sistema em que o montante de peptídeos é insuficiente para permitir crescimento normal de micro-organismos ou uma taxa normal de crescimento de micro-organismos. Na medida em que a presença de peptídeos permanece insuficiente, o crescimento permanece limitado pela concentração de peptídeos. Mesmo que aparente que nada está acontecendo, esta fase é muito importante para o processo de fermentação porque a saúde da população de microorganismos determina a qualidade do iogurte resultante.

[005] Quando os micro-organismos se adaptam a seu ambiente, inicia-se a segunda fase. Esta fase, caracterizada por um crescimento de micro-organismos não limitado por substrato, é denominada fase exponencial. Durante a fase exponencial, os micro-organismos começam a crescer por divisão celular, e, assim, se multiplicam exponencialmente. Nesta fase, os micro-organismos em consequência de seu caráter metabólico produzem, entre outros, ácido láctico.

[006] No final da fase exponencial, o montante adequado de nu trientes frequentemente decresceu, de modo que o crescimento exponencial não pode mais ser sustentado pela mistura de leite fermentado. Assim, o crescimento se reduz e a fermentação entra na fase estacionária. Nesta fase, o crescimento não é mais exponencial, embora a divisão celular ainda ocorra, e a mistura de fermentação atinge lentamente um equilíbrio entre todos os compostos presentes. Se todas as circunstâncias são apropriadas, isto resulta em um produto iogurte de alta qualidade com sabor e odor bem balanceados.

[007] O tempo que estes estágios requerem é altamente variável e depende do tipo de micro-organismo(s) usado(s), do tipo de alimentação da fermentação, da temperatura e de muitos outros parâmetros. Dadas estas fases distintas, produção de iogurte é comumente um processo em batelada. Como é comum para processos em batelada, um fator importante no custo é o tempo necessário para o produto ficar pronto.

[008] Um fator importante no tempo de produção é a fase de la- tência. Durante esta fase, o processo real de fermentação é preparado. Além de criar as condições adequadas para o crescimento de micro-organismos, não há absolutamente nenhuma contribuição para a produção do produto de interesse, e assim, uma fase de adaptação (fase de latência) menor teria um grande impacto na economia do processo de fermentação. No entanto, a fase de latência é muito importante para determinar a saúde da população de micro-organismos, o que, por sua vez, é importante para a qualidade do iogurte. O tempo que é necessário para que a fase de latência passe e o processo de fermentação alcance a fase exponencial é referido como tempo de la- tência (lag time).

[009] Tentativas para reduzir o tempo de latência foram feitas an tes. Uma opção é usar um processo de fermentação semicontínuo, em que os micro-organismos são adaptados ao estágio de produção e permanecem na fase exponencial por um tempo prolongado. Isto, entretanto, frequentemente não é adequado, porque a fase estacionária é importante para determinar o gosto e/ou qualidade final do iogurte, e esta fase é contornada (bypassed) nesse processo semicontínuo.

[0010] Além disso, é possível adicionar uma mistura de micro organismos, denominada cultura de partida, que já tenha sido adaptada às condições do meio da fermentação. Isto, no entanto, cria diferentes problemas, porque em uma alimentação de pré-mistura de microorganismos em pequena escala, o ambiente do fermentador de larga escala é difícil de copiar. É possível usar um volume maior de pré- cultura (inóculo), mas isto traz um grande impacto para o processo de produção e os custos do estágio de pré-cultura. Assim, seria preferível reduzir o tempo de latência, possivelmente ainda mais do que é possível com esta técnica, de maneira confiável, com um montante limitado de cultura de partida.

[0011] Para reduzir o tempo de latência, é também possível adici- onar nutrientes extras facilmente transportáveis e benéficos em energia à pré-mistura, como por exemplo, extra peptídeos. No entanto, isto cria custos e problemas adicionais como, por exemplo, gosto e cor fora do padrão.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0012] A presente invenção refere-se a um método para preparo de iogurte por fermentação, compreendendo as etapas de prover uma cultura de partida de fermentação contendo um micro-organismo selecionado em um meio de cultura adequado, adicionar um inibidor de protease de proteína de planta ao meio de cultura, preferivelmente um inibidor de protease de proteína de batata, cultivar o micro-organismo no meio de cultura, e coletar o iogurte.

[0013] Foi verificado que a adição de inibidor de protease de prote ína de batata à alimentação de fermentação reduz significativamente o tempo de latência da fermentação. O montante necessário de proteína de batata é suficientemente baixo para não afetar o gosto do iogurte, e a redução do tempo de latência ocorre tanto no processo de batelada como no processo semicontínuo.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0014] Figura 1 mostra um esquema de fluxo para produção de iogurte.

[0015] Figura 2 mostra umaredução de pH dependente do tempo durante fabricação de iogurte em concentração variada de PPII; uma concentração mais alta de PPII resulta em redução mais rápida do pH.

[0016] Figura 3 mostra fotografias de produtos de iogurte.

[0017] Figura 4 mostra uma redução do tempo para atingir pH 5 durante fabricação de iogurte usando cultura padrão e 3,5% de proteína de leite, em concentrações variadas de PPII, com e sem um tratamento térmico pré-fermentação.

[0018] Figura 5 mostra um gráfico de curva de crescimento de tempo de fermentação para pH 5,0, 5,3 e 4,7 de iogurte feito usando cultura padrão e variando a concentração de PPII, adicionada a 3,5% de proteína de leite durante fabricação de iogurte.

[0019] Figura 6 mostra uma redução do tempo para atingir o alvo de pH 5,0 para fermentações na presença de concentrações variadas de PPII com e sem tratamento térmico pré-fermentação em diferentes temperaturas, usando cultura padrão adicionada a 3,5% de proteína de leite.

[0020] Figura 7 mostra uma inibição de protease por proteína So- lanic PPII em fração seca por congelamento de produção de Artho- myces ramous Peroxidase (ArP) por Aspergillus awamori modificado.

[0021] Figura 8amostra umaredução de tempo dependente de do se no tempo de produção de iogurte por isolador de inibidor de protease de batata, inibidores de protease de soja e inibidores de protease de ervilha.

[0022] Figura 8b mostra uma redução de tempo dependente de dose para atingir pH 5 durante fabricação de iogurte usando cultura padrão de partida e usando PPII, proteína de ervilha, e farinha de soja com e sem tratamento térmico pré-fermentação (80°C, 30 minutos).

[0023] Figura 9 mostra uma redução de tempo dependente de do se na fabricação de iogurte para pH 5 usando seis diferentes culturas de partida de iogurte.

[0024] Figura 10amostra ocrescimento de micro-organismos no tempo, observado através de OD600, em concentrações crescentes de peptídeos. Uma vantagem clara no crescimento é observada quando peptídeos são adicionados ao meio. Este meio mostra não ser mais limitado por peptídeos, nesta situação específica, com esta cultura de partida, em concentrações de peptídeos acima de 75% de peptídeos.

[0025] Figura 10bmostra uma redução do tempo dependente de dose por avaliação do OD600nm para diferentes concentrações de peptídeos com a adição de PPII. Neste exemplo específico, em meios com concentrações de peptídeos acima de 75% de extrato de levedura e peptona de caseína, nenhuma redução no tempo de latência pode ser observada para PPII. Redução no tempo dependente de dose para esta fermentação por PPII é mostrada em meios com concentrações de peptídeos abaixo de 75 % YE e CP.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0026] A presente invenção refere-se a um método para preparo de iogurte, compreendendo as etapas de fornecer uma cultura de partida para fermentação compreendendo um micro-organismo selecionado em um meio de cultura adequado, adicionar um inibidor de protease de proteína de planta ao meio de cultura, preferivelmente um inibidor de protease de proteína de batata, cultivar o micro-organismo no meio de cultura e coletar o iogurte.

[0027] Foi verificado que a adição de pequenas quantidades de inibidor de protease de proteína de batata, como isolado de inibidor de protease de batata (potato protease inhibitor isolate (“PPII”)), a uma alimentação de fermentação reduz significativamente o tempo de la- tência da fermentação, que tem benefícios econômicos na produção de iogurte. O montante necessário de proteína de batata é suficientemente baixo para não afetar o gosto do iogurte, e a redução do tempo de latência ocorre tanto no processo de batelada como no semicontí- nuo. Redução do tempo de latência, no contexto da presente invenção, pode também ser denominada “atividade estimulante” (“stimulating activity” (SA)).

[0028] Além disso, a presente invenção pode ser aplicada em uma ampla faixa de pH e temperatura.

[0029] O presente método refere-se a processos de fermentação para a produção de iogurte. Preferivelmente, a presente invenção se aplica a um processo de fermentação em que o crescimento do micro- organismo é limitado por peptídeo. Peptídeos, para o escopo da presente invenção, são pequenos fragmentos de proteína, consistindo de 5-30 aminoácidos; esses fragmentos também sendo denominados “peptídeos nutritivos”.

[0030] Uma fermentação limitada por peptídeos é uma fermenta ção onde a concentração de peptídeos nutritivos livres é limitada, mas onde outros nutrientes necessários, como minerais (traço), carboidratos e proteínas, são livremente disponíveis. Esta limitação de peptí- deos ocorre quando a taxa de degradação de peptídeos nutritivos por proteases/peptidases em aminoácidos é superior à taxa de formação de peptídeos nutritivos a partir de proteína. Pode ser testado se uma fermentação é limitada por peptídeo observando o efeito de adição de pequenas quantidades de peptídeos no tempo de crescimento e de latência (lag). Quando a adição de peptídeos nutritivos não resulta em uma fermentação substancialmente mais rápida, a fermentação não é, então, limitada por peptídeo. Quando a adição de peptídeos nutritivos resulta em uma fermentação mais rápida, a fermentação pode, então, ser denominada limitada por peptídeo.

[0031] Isto significa que a taxa de fermentação é dependente da concentração de peptídeos nutritivos disponíveis. No caso de uma fermentação limitada por peptídeo, há peptídeos nutritivos insuficientes para sustentar ou para se adaptar ao crescimento exponencial do micro-organismo. Isto leva a um aumento no tempo de latência.

[0032] No método da presente invenção, verifica-se que a adição de uma quantidade relativamente pequena de inibidor de protease de proteína de batata reduz o tempo de latência, em particular para fermentações limitadas por peptídeo, e, em particular, onde proteínas suficientes estão disponíveis.

[0033] É inesperado que em métodos envolvendo uma fermenta ção limitada por peptídeo, em particular, o tempo de latência seja re- duzido. É bem conhecido que um fator importante na determinação do tempo de latência de uma fermentação seja a degradação de proteínas no meio a pequenos peptídeos nutritivos de 5 a 30 aminoácidos. Esta conversão é efetuada por uma ampla variedade de proteases. Uma função bem conhecida de inibidores de protease é inibir proteases, inibindo efetivamente as proteases que são responsáveis pela degradação de proteínas a peptídeos nutritivos. Assim, seria esperado que a adição de inibidores de protease, de qualquer fonte, resultasse em um tempo de latência aumentado devido à degradação enzimática mais lenta de proteínas e uma formação mais lenta associada de pep- tídeos nutritivos. No entanto, foi agora descoberto que, de fato, ocorre o oposto, e a adição de inibidores de protease de proteína de batata resulta em um tempo de latência reduzido, ao invés de aumentado.

[0034] O tempo de latência, no presente contexto, é definido como o período de tempo necessário para que o micro-organismo se adapte ao novo ambiente, o meio de cultura. É o período de tempo necessário para a fase de latência.

[0035] Um processo de fermentação de iogurte pode ser monito rado via vários parâmetros de produção metabólica adequados. Por exemplo, o pH poderia ser um parâmetro de produção metabólica adequado. Alternativamente, a densidade óptica (OD a 600 nm, OD600) poderia prover um parâmetro de produção adequado, prover uma quantificação do montante de micro-organismos presentes. No entanto, o especialista pode chegar a numerosas maneiras de determinar a progressão de uma fermentação, e determinar o tempo necessário para a fase de latência na produção de iogurte.

[0036] Fermentação geralmente progride através de uma curva S em parâmetros de produção (saída) como densidade óptica ou pH, como é bem conhecido na técnica. Na presente invenção, o tempo para atingir o ponto a meio caminho da curva exponencial é encontrado calculando o ponto de inflexão na curva S suavizada a partir de sua segunda derivada. Alternativamente, quando se usa pH como um indicador de progresso metabólico, toma-se um valor de pH a meio caminho da curva exponencial e registra-se o tempo até que este pH seja alcançado. Na produção de iogurte qualquer pH entre pH 5,0 e pH 5,5 pode ser usado, desde que este valor seja aplicado consistentemente para permitir comparação apropriada. A redução no tempo de latência pode ser determinada comparando-se o tempo de latência de uma fermentação sem adição de inibidor de protease de proteína de batata com a mesma fermentação em que uma quantidade apropriada de inibidor de protease de proteína de batata é adicionada. A redução absoluta do tempo de latência é geralmente quantificada como horas de redução, embora a redução relativa do tempo de latência seja quantificada como “%”.

[0037] Pode-se tentar dividir proteínas nativas de batata em três classes (i) a família patatina, de glicoproteínas ácidas altamente homólogas de 43 kDa (40 a 50% em peso das proteínas de batata), (ii) inibidores básicos de protease com 5-25 kDa (inibidores de protease de proteína da batata), que, quando isolados, são designados como isolado de inibidor de protease de batata ou "PPII"; 30 a 40% em peso das proteínas da batata e (iii) outras proteínas, na sua maioria proteínas de elevado peso molecular (10 a 20% em peso das proteínas da batata) (Pots et al., J. Sci. Food. Agric. 1999, 79, 1557-1564).

[0038] PPII pode ser dividido entre diferentes grupos com base em seu peso molecular. Os diferentes grupos de inibidores de protease são identificados como inibidor de protease I (peso molecular de cerca de 39 kDa), inibidor de carboxipeptidase (peso molecular de cerca de 4 100 Da), inibidores de protease IIa e IIb (peso molecular de cerca de 20,7 kDa), e inibidor de protease A5 (peso molecular de cerca de 26 kDa). A razão destes diferentes grupos de inibidores de protease com o total de proteína de batata depende da variedade de batata.

[0039] Para o escopo da presente invenção, um inibidor de pro tease de proteína de batata inclui qualquer inibidor de protease de proteína de batata, ou qualquer mistura de diferentes proteínas de batata, que inclui um ou mais inibidores de protease de proteína de batata, ou grupos de inibidores, como definido acima. Um isolado de inibidor de protease de batata (PPII) é um isolado contendo um inibidor de protease de proteína de batata. PPII pode ser obtido de qualquer maneira conhecida, como, por exemplo, por precipitação, por fracionamento térmico a 60-80 °C, por separação por membrana, precipitação com sulfato de amônio ou ácidos graxos saturados ou outros componentes, por técnicas de filtração como ultra filtração ou filtração com gel.

[0040] Preferivelmente, PPII é usado na presente invenção. Este pode ser obtido como descrito em WO2008/069650, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência, onde uma descrição elaborada do isolamento de inibidores de protease do suco do fruto da batata (potato fruit juice (PFJ)) ou água do fruto da batata (potato fruit water (PFW)) é descrito.

[0041] Esse processo implica submeter suco do fruto da batata a uma floculação por um cátion de metal divalente a um pH de 7 a 9, e centrifugar o suco de fruto da batata floculada, formando assim um so- brenadante. Subsequentemente, o sobrenadante é submetido à cro- matografia de adsorção de leito expandido operada a um pH inferior a 11, e uma temperatura de 5 a 35 ° C usando um adsorvente capaz de se ligar à proteína da batata, e assim adsorver a proteína de batata nativa no adsorvente. Materiais de coluna que se ligam a determinadas quantidades de proteínas nativas de batata incluem adsorventes de modo misto, como por exemplo, Amersham Streamline™ Direct CST I (GE Healthcare), adsorventes Fastline (Upfront Chromatography A / S), adsorventes macroporosos como Amberlite™ XAD7HP (Rohm & Haas Company) e adsorventes de troca iônica. Alternativamente, absorventes contendo ligantes como os divulgados no pedido de patente europeia 12175944.3 são altamente preferidos para isolar PPII adequado para uso na presente invenção.

[0042] Finalmente, pelo menos um isolado de proteína nativa de batata é eluído do adsorvente com um eluente. Este método resulta entre outros em PPII isolado de alta pureza, com um mínimo de proteína desnaturada presente e caracterizado por uma solubilidade estável. Como resultado, este método fornece PPII nativo. PPII nativo é geralmente preferido no método da presente invenção.

[0043] A quantidade de inibidores de protease de proteína de bata ta pode ser determinada medindo-se o efeito inibitório contra tripsina de acordo com o método descrito em Spelbrink et al., The Open Food Science Journal 2011 (5) p42-46 “Quantitative Determination Trypsin Inhibitory Activity in Complex Matrices” (Determinação quantitativa de atividade inibitória de tripsina em matrizes complexas) ou em ISO 14902:2001E “Animal Feed Stuffs - Determination of soya products” (Alimentos para Animais - Determinação de produtos de soja).

[0044] Como uma alternativa ao uso de inibidor de protease de proteína de batata, como em PPII, é possível usar uma fração adicional de proteína purificada isolada de PPII. Uma fração preferida de proteína.

[0045] É solúvel em pH 8

[0046] Tem um pKa < 8

[0047] Tem tanto atividade TIA como CTIA, mas nenhuma das ati vidades sobrevive a tratamento térmico a 800C por 30 minutos. No entanto, a capacidade de redução do tempo de latência permanece intacta até pelo menos 900C.

[0048] Tem um peso molecular entre 17,5 e 18,2 kDa.

[0049] Atividade TIA é determinada medindo-se o efeito inibitório da proteína contra tripsina de acordo com o método descrito em Spel- brink et al The Open Food Science Journal 2011 (5) p42-46 “Quantitative Determination Trypsin Inhibitory Activity in Complex Matrices” (Determinação quantitativa de atividade inibitória de tripsina em matrizes complexas) ou em ISO 14902:2001E “Animal Feed Stuffs - Determination of soya products” (Alimentos para Animais - Determinação de produtos de soja).

[0050] Atividade CTIA é determinada medindo-se o efeito inibitório da proteína contra quimiotripsina. O método a ser usado é essencialmente o mesmo método descrito para TIA, mas doses mais altas de enzima são necessárias para compensar a atividade específica menor de quimiotripsina.

[0051] Uma vantagem de usar um inibidor de protease de proteína de batata é que a maioria é muito estável no calor. A fração ativa do isolado de inibidor de protease de proteína de batata que é responsável pela redução do tempo de latência mantém seu estado nativo até temperaturas de 60°C, preferivelmente 70°C, mais preferivelmente 80°C, e no máximo da preferência 90°C por um período de pelo menos 15 min, preferivelmente pelo menos 90 minutos. Isto permite a adição de inibidor de protease de proteína de batata em diferentes pontos do processo de fermentação. Ele pode ser adicionado ao meio antes, após ou durante a adição da cultura de partida, ou pode ser adicionado à própria cultura de partida.

[0052] Além disso, pode também ser adicionado a uma alimenta ção de fermentação em processos em que a alimentação de fermentação é aquecida antes da fermentação. Este é o caso, por exemplo, dos processos que exigem pasteurização ou esterilização antes da fermentação, que é comum em muitos processos de produção de iogurte.

[0053] É uma vantagem adicional da presente invenção que o ini bidor de protease de proteína de batata seja funcional em processos de fermentação descritos em concentrações muito baixas. Em particular, adição de menos de 1 g/l, preferivelmente menos de 0,5 g/l, mais preferivelmente menos de 0,1 g/l, ainda mais preferivelmente menos de 0,05 g/l de inibidor de protease de proteína de batata é suficiente para reduzir o tempo de latência em processos de fermentação de acordo com a invenção. Um montante mínimo de pelo menos 0,01 g/l, preferivelmente 0,005 g/l, mais preferivelmente 0,001 g/l de inibidor de protease de proteína de batata é necessário para reduzir o tempo de latência de fermentações de acordo com a presente invenção.

[0054] Concentrações preferidas de inibidor de protease de proteí na de batata ficam entre, por exemplo, 5 g/l e 0,001 g/l, preferivelmente entre 5 g/l e 0,05 g/l, mais preferivelmente entre 5 g/l e 0,01 g/l, como entre 1 g/l e 0,01 g/l. A concentração de inibidor de protease de proteína de batata neste contexto é expresso como g de inibidor de protease de proteína de batata por litro de meio de cultura.

[0055] Nestas concentrações, inibidor de protease de proteína de batata não confere nenhum gosto ao iogurte, o que é uma vantagem adicional. Além disso, estas baixas concentrações de inibidor de protease de proteína de batata não possuem nenhum impacto detectável nas características sensoriais do iogurte. Entretanto, concentração mais alta de inibidor de protease de proteína de batata de mais de 0,5 até 2% melhora a estrutura e característica sensorial, por exemplo, a suavidade do produto iogurte final.

[0056] É também uma vantagem da presente invenção que o inibi dor de protease de proteína de batata seja funcional em processos de fermentação em uma ampla faixa de pH. Em particular, o pH do meio de cultura pode ser de até 6,7, preferivelmente 8,0, mais preferivelmente até 10,0. Além disso, o pH pode ser tão abaixo quanto 4, preferivelmente tão abaixo quanto 3, mais preferivelmente tão baixo quanto 2. A estabilidade do inibidor de protease de proteína de batata em uma ampla faixa de pH é vantajosa porque permite que os meios de cultura de vários pH’s sejam processados por fermentação. Além disso, permite que a fermentação do iogurte se beneficie da adição de inibidor de protease de proteína de batata durante a fermentação.

[0057] Além disso, é uma vantagem distinta da presente invenção que o inibidor de protease de proteína de batata seja não alergênico. Isto significa que ele pode ser usado em processos de fermentação de iogurte operados por pessoas alérgicas a outras proteínas. Além disso, isto significa que ele pode ser usado para fermentação de iogurte em que o iogurte pode ser consumido por pessoas que sofrem de alergias, sem risco de choque alérgico.

[0058] Além disso, é uma vantagem do inibidor de protease de proteína de batata que uma solução desta proteína, preferivelmente uma solução aquosa, seja clara, ou pelo menos substancialmente não túrbida, até concentrações de pelo menos 10 g/L, preferivelmente 50 g/L, mais preferivelmente 250 g/L. Estas concentrações são preferivelmente obtidas em uma solução de pH de 2 a 5, preferivelmente 2 a 4, mais preferivelmente 2,5 a 3,5. Soluções claras ou substancialmente não túrbidas de inibidor de protease de proteína de batata permitem esterilização por filtro conveniente e aparência atraente do iogurte.

[0059] Em uma comparação de inibidores de protease de proteína de batata com inibidores de protease de outras fontes, foi verificado que inibidores de protease de proteína de ovo não apresentaram a redução do tempo de latência em dosagem comparável, em contraste com inibidores de protease de proteína de batata. Além disso, isolados de proteína de soro de leite (whey protein isolates (WPI)) e inibidores de carboxil peptidase (carboxy peptidase inhibitors (CPI)) não apresentaram uma redução no tempo de latência em dosagens comparáveis.

[0060] Entretanto, inibidores de protease de proteína de soja e ini bidores de protease de proteína de ervilha podem apresentar uma re- dução no tempo de latência com a adição a um meio de cultura adequado, assim como um contendo leite. No entanto, dosagens mais altas de inibidores de proteína de soja ou de inibidores de protease de proteína de ervilha são necessárias, porque a redução do tempo de latência na mesma dose é significativamente mais baixa para proteína de ervilha e de soja do que para proteína de batata (ver figura 8a).

[0061] Todos os parâmetros presentemente descritos para o uso de inibidores de protease de proteína de batata em um método de fermentação com tempo de latência reduzido também valem para inibidores de protease de proteína de ervilha e de proteína de soja, e qualquer parâmetro, ou combinação de parâmetros, descritos para inibidores de protease de proteína de batata são também considerados válidos para inibidores de protease de proteína de ervilha e inibidores de protease de proteína de soja. Assim, inibidores de protease de proteína de planta, como aquelas derivadas de Angiospermas (plantas com flores) ou vegetais culinários, preferivelmente inibidores de protease de proteína de ervilha, de soja ou de batata, podem ser similarmente usados em um método de fermentação de iogurte com tempo de latência reduzido de acordo com a presente invenção.

[0062] Entretanto, nem todas as vantagens de inibidores de pro tease de proteína de batata se aplicam similarmente a outros inibidores de protease de proteína de planta. Em particular, farinha de soja não apresenta a estabilidade térmica de inibidores de protease de proteína de batata. Portanto, farinha de soja não pode ser usada para reduzir o tempo de latência em um método de fermentação em que esta é aquecida com o meio de cultura antes da fermentação, como em um método que inclui uma etapa de pasteurização ou esterilização (por filtro/calor) antes da fermentação. Esta é uma vantagem de inibidores de protease de proteína de batata sobre inibidores de protease de proteína de soja em farinha de soja.

[0063] Inibidores de protease de proteína de ervilha e de soja iso lados exibem estabilidade térmica. Ao realizar uma fermentação de acordo com a presente invenção com PPII, a redução do tempo de la- tência após uma etapa de tratamento térmico é mais ou menos a mesma que a redução de latência observada sem uma etapa de tratamento térmico prévio. Isto é semelhante para proteína de soja e ervilha isoladas, cuja atividade é mais ou menos a mesma com ou sem uma etapa de tratamento térmico prévio, embora a redução do tempo de latência de proteína de ervilha e de soja em termos absolutos seja mais baixa do que para a proteína de batata, como descrito acima.

[0064] Uma outra desvantagem do uso de proteína de ervilha ou de soja em relação ao uso de proteína de batata, é que a atividade mais baixa na redução do tempo de latência faz com que concentrações mais altas sejam necessárias. Isto leva a um risco aumentado de que a proteína adicionada transmita gosto ao iogurte, o que é uma desvantagem.

[0065] Além disso, tanto os inibidores de protease de proteína de ervilha quanto os de soja são proteínas alergênicas, que são problemáticas de se aplicar a processos de produção alimentícia em geral devido ao aumento do risco e regulação em relação à proteína de batata.

[0066] Portanto, inibidores de protease de proteína de batata são superiores em termos de estabilidade térmica, redução do tempo de latência e aplicabilidade industrial geral em fermentação em relação a inibidores de protease de outras fontes. No entanto, quaisquer inibidores de protease de proteína de planta, como aqueles derivados de An- giospermas (plantas com flores) ou vegetais culinários, preferivelmente inibidores de protease de proteína de ervilha, de soja, ou de batata, apresentam redução no tempo de latência com adição a uma alimentação de fermentação de iogurte.

[0067] Todas as vantagens acima de inibidor de protease de prote ína de batata também se aplicam a PPII, onde é usado como inibidor de protease de proteína de batata.

[0068] Em particular, no caso de PPII, é uma vantagem que PPII inclua um alto montante de fração estável em calor, que similarmente permite o uso de inibidor de protease de proteína de batata de acordo com a presente invenção em processos em que a alimentação de fermentação é aquecida antes da fermentação. PPII geralmente inclui entre 20 e 80% em peso, preferivelmente entre 40 e 60% em peso de inibidores de protease de proteína de batata estáveis em calor, de modo que a adição de somente pequenas quantidades de PPII resulta em um tempo de latência reduzido. Também neste caso, nenhum gosto é conferido ao produto final.

[0069] Alternativamente, a fração termoestável de PPII pode ser isolada de PPII antes da aplicação do inibidor de protease de proteína de batata em um processo de fermentação. Isto pode ser feito por precipitação térmica e subsequente filtração das proteínas não termoes- táveis do PPII, após o que a fração termoestável do PPII é isolada na forma de uma solução de inibidor de protease de proteína de batata termoestável, que pode opcionalmente ser isolado na forma de um pó, por exemplo, por secagem por congelamento. Alternativamente, inibidor de protease de proteína de batata termoestável pode ser obtido por fracionamento de PPII, como por cromatografia de troca iônica, eluindo em um pH correspondente à maioria dos inibidores de protease termoestáveis, e também por processos de adsorção, filtração por membrana, filtração por gel ou precipitação seletiva.

[0070] Micro-organismos para o método de preparo de iogurte por fermentação são aqueles que são adequados para produção de iogurte. Micro-organismos adequados incluem, por exemplo, microorganismos de Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconos- toc e Bifidobacterium.

[0071] Uma cultura de partida de fermentação, no contexto da pre sente invenção, é uma cultura contendo um ou mais micro-organismos apropriados para se obter iogurte. Uma cultura de partida pode conter um único tipo de micro-organismo, ou pode conter dois ou mais microorganismos. Culturas de partida adequadas incluem os organismos presentes em Kefir como ácido láctico de bactéria e leveduras, bem como Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium breve, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc mesenteroides, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, por exemplo, misturas de Lactococcus diace- tylactis com Leuconostoc cremoris.

[0072] O meio de cultura pode ser apropriado para fermentação de iogurte. Um meio de cultura adequado inclui leite, como, por exemplo, leite de vaca, leite de cabra, leite de ovelha, leite de iaque, leite de égua, leite de rena, leite de alce, leite de búfala, leite de burro e/ou leite de camelo, preferivelmente leite de vaca.

[0073] As condições de cultura durante a fermentação podem ser aquelas conhecidas para fermentação de iogurte. Condições de cultura podem ser aeróbicas ou anaeróbicas, e se aeróbicas, podem envolver, aeração baixa, regular ou alta. Cultivo pode ser em estado sólido ou estado líquido, e pode ser feito em qualquer escala, em métodos de processamento em batelada ou semicontínuo. Os níveis de oxigênio podem variar de ausente (fermentação anaeróbica) a presente (fermentação aeróbica). O processamento pode ser agitado ou estático.

[0074] A temperatura durante a fermentação pode variar de -10 °C a +60 °C, preferivelmente de 13 a 45 °C. Preferivelmente, a temperatura permanece constante. O pH pode variar de pH 2 a 10, preferivelmente 4 a 6,7. O tempo de cultivo é altamente variável e depende do tipo de cultura.O especialista está bem ciente dos tempos de cultura adequados para iogurte. Assim, os tempos de cultura podem variar entre 0,5 h e 10 anos ou mais, ou em qualquer tempo entre os dois.

[0075] Adição do inibidor de protease de proteína de batata pode ocorrer em qualquer tempo antes da fermentação. Essa adição pode ser feita combinando o inibidor de protease de proteína de batata com o meio de cultura como uma solução concentrada de proteína filtrada ou pasteurizada, e, então, adição da cultura de partida, ou alternativamente, combinando a cultura de partida com a proteína de batata nativa e combinando esta mistura com o meio de cultura. Alternativamente, todos os componentes podem ser adicionados separadamente, ou em combinação com constituintes adicionais do meio de cultura, conforme o caso. Esses constituintes adicionais do meio de cultura podem incluir, por exemplo, carboidratos, minerais traço, minerais em massa (bulk minerals), proteínas, peptídeos.

[0076] Em uma modalidade muito preferida, o inibidor de protease de proteína de batata pode ser adicionado ao meio de cultura antes de uma etapa de aquecimento. Isto é vantajoso quando o meio de cultura deve ser aquecido, como para pasteurização ou esterilização, antes da adição da cultura de partida. Devido à estabilidade térmica vantajosa do inibidor de protease de proteína de batata, esse mantém seu estado nativo mesmo após esse aquecimento, de modo que sua função bioquímica natural permanece e o tempo de latência da fermentação é reduzido mesmo após aquecimento.

[0077] Adição de inibidor de protease de proteína de batata, prefe rivelmente em estado nativo, tem o efeito de reduzir o tempo de latên- cia da fermentação. O tempo de latência é reduzido significativamente, dependendo da cultura e do meio, como por pelo menos 10%, preferivelmente pelo menos 25%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente ainda pelo menos 60%, e no máximo da preferência pelo menos 90%, em relação ao mesmo método de fermentação em que nenhum inibidor de protease de proteína de batata é adi- cionado.

[0078] A coleta do iogurte pode tomar qualquer forma conhecida na técnica para isolamento do iogurte após fermentação. Em particular, um iogurte pode ser obtido monitorando-se um parâmetro de produção (output parameter) metabólico adequado (como pH ou densidade óptica), determinando o ponto final da fermentação, e isolando o iogurte.

[0079] A invenção será agora elucidada pelos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: PRODUÇÃO DE IOGURTE

[0080] Isolado de PPI é um isolado de inibidor de protease de ba tata, e pode ser abreviado PPII. Isolado de PPI foi adicionado à mistura de fermentação em 2 diferentes pontos no processo, a saber 1) ao leite antes da pasteurização e 2) ao leite após pasteurização junto com a cultura de partida. Uma terceira opção é adicionar o PPII durante a produção da cultura de partida, mantendo em mente a concentração final do PPII no leite/iogurte.

[0081] O processo é dado esquematicamente na Figura 1. Iogurte fresco foi preparado por pasteurização do leite (a não ser que indicado o contrário, em 30 min, 80°C) e resfriamento a 40 a 42°C. As possíveis etapas de processo onde o isolado de PPI pode ser adicionado são mostradas na figura. Foi notado que quando PPII foi adicionado em dosagens maiores, o pH decresce. Assim, aconselha-se reajustar o pH a pH 6,7 com, por exemplo, NaOH, já que um pH menor poderia afetar a textura do iogurte.

[0082] Para preparar os iogurtes o leite foi inoculado com 2% (p/p) de iogurte comercial, ou com o montante de cultura de partida aconselhado da f.i. CSK Food Enrichment B.V. (1unidade/10L ~ 0,02% (m/m)) ou da DSM, Delvo-Yog® CY (5 unidades/1000L), e fermentado por 4 a 7 h para atingir um pH de 4,5. A cultura de iogurte padrão usada, CESKA®-Star Y200, contém as bactérias de ácido láctico Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus. Os experimentos foram feitos em pequena escala (25 a 50 mL) e, imediatamente após inoculação, as amostras foram incubadas em um banho de água a 40 a 42°C.

[0083] Todos os experimentos foram interrompidos tão logo o pH alcançava pH 4,5. O pH foi automaticamente registrado durante a fermentação em intervalos de 2 a 15 minutos (WTW, Alemanha).

[0084] Uma curva de acidificação durante fermentação com uma dosagem de 2% de iogurte como inóculos é mostrada na Figura 2. O iogurte de referência com 0% PPII atingiu pH 5,0 após 5:45 horas. O iogurte com 0,025% PPII atingiu pH 5,0 após 3 horas. O tempo de fermentação para os iogurtes feitos com PPII foi significativamente menor em comparação com o iogurte puro. A redução de tempo que pode ser alcançada depende em uma grande extensão da viabilidade e fase de crescimento dos inóculos. Quando as células dos inóculos estão na fase estacionária (f.i. quando 2% iogurte é usado como inócu- lo), o tempo de latência do iogurte puro/ de referência é muito grande e a possível redução do tempo é, portanto muito alta. EXEMPLO 2: DEPENDÊNCIA DE PPII DA REDUÇÃO DE TEMPO DE LATÊNCIA NA PRODUÇÃO DE IOGURTE.

[0085] Iogurtes foram preparados de acordo com o Exemplo 1, com diferentes dosagens de PPII, ficando na faixa de 0,005% a 0,025% (p/p). A redução de tempo alcançada por adição de PPII foi plotada contra a concentração dosada de PPII. O tempo que a fermentação necessitou para atingir pH 5,0 foi usado para comparar o efeito no tempo de latência de várias doses de PPII. Com montantes crescentes de isolado de inibidor de protease de proteína de batata o tempo de fermentação decresceu significativamente, como é mostrado na Figura 2.

EXEMPLO 3: ESTABILIDADE TÉRMICA DE ISOLADO DE INIBIDOR DE PROTEASE DE PROTEÍNA DE BATATA

[0086] Adição de PPII antes ou após pasteurização resultou em curvas de redução de tempo dependente de dose comparáveis (Figuras 4 e 6). Iogurtes foram preparados usando uma cultura de partida predefinida, como descrito nos dois exemplos anteriores. O PPII foi adicionado ao leite antes da pasteurização. A pré-mistura leite-PPII não foi pasteurizada (temperatura ambiente - room temperature, RT), ou foi pasteurizada por 30 minutos em 3 diferentes temperaturas, 80°C, 85°C e 90°C. As reduções de tempo obtidas (absoluta e relativa) para todas as amostras foram dependentes da dosagem de PPII e nenhuma diferença significativa foi observada entre os diferentes tratamentos térmicos. Foi verificado que a dosagem ótima de PPII neste experimento era de 0,1% PPII e isto resultou em uma redução de tempo relativa significativa (~20%).

EXEMPLO 4: INIBIDORES DE PROTEASE DE PROTEÍNA DE BATATA PARA USO NA PRESENTE INVENÇÃO PODEM SER NATIVOS

[0087] Uma solução de estoque de azocaseína (SigmaAldrich, A2765) a 30g/L foi preparada por dissolução da proteína em tampão citrato 100 mM pH 5,0 contendo 5 mM de CaCl2 (SigmaAldrich, C3881) a 500C e resfriar de volta a 370C. Lisados fúngicos liofilizados com atividade de protease foram dissolvidos em solução 1 mM de HCl. PPII foi dissolvido em solução de acetato de pH 3,0.

[0088] A partir de uma solução de PPII uma série de diluições foi preparada de tal forma que causasse uma perda de sinal de ~50% na incubação para a concentração de amostra mais alta. De cada diluição, 125 μL foram misturados com 25 μL de solução de protease fúngica em um copo de eppendorf, ou com 25 μL de água desmineralizada como controle. Controles positivos e negativos para a reação pro- teolítica usaram 125 μL de água desmineralizada ao invés de material de amostra. A estas misturas foram adicionados 225 μL de azocaseína quente, seguindo-se incubação por 30 minutos a 37,0°C. A reação foi, então, extinta com a adição de 150 μL de solução a 15% p:v de TCA. A ordem de adição de azocaseína foi a mesma ordem de adição de TCA para assegurar tempos de incubação iguais para todas as amostras. (ver Figura 7)

[0089] Azocaseína não hidrolisada e outros insolúveis foram re movidos por centrifugação a 15.000g a 40C por 10 minutos em uma Heraeus Multifuge 1S-R usando um rotor Thermo Scientific. 100 μL dos sobrenadantes foram transferidos para uma placa de microtítulo por pipetação cuidadosa e suplementados com 100 μL de solução 1,5 M de NaOH. A placa foi, então, analisada quanto à absorbância a 450 nm em um leitor de microplacas BioRad Modelo 680.

[0090] As absorbâncias foram plotadas contra o montante de ma terial de amostra na placa. A inclinação da linha resultante foi obtida via regressão linear usando o método dos mínimos quadrados e indica a quantidade de absorbância perdida por quantidade de material de amostra. O controle positivo, na ausência de amostra, indica a absor- bância máxima causada pela quantidade conhecida de solução de protease. Assim, dividindo a inclinação da curva pela absorbância dos controles positivos, foi obtida a atividade inibitória de tripsina expressa como o montante de protease inibida por quantidade de material de amostra.

[0091] Daí resulta que o PPII usado nos presentes experimentos pode ser nativo.

EXEMPLO 5: COMPARAÇÃO COM PROTEÍNAS INIBIDORAS DE PROTEASE DE OUTRAS FONTES QUE NÃO A BATATA

[0092] Inibidores de protease de duas fontes de plantas, ervilha e soja, foram testados quanto a sua capacidade de reduzir o tempo de latência na fermentação de iogurte porque estas proteínas são mais prontamente disponíveis para processamento em grande escala comercial. Além disso, proteína de ovo foi testada já que esta representa uma fonte importante de inibidores de protease de dieta derivada de animal.

[0093] Dois tipos de proteína de ervilha foram testados, Pisane® C9 e Pisane® F9 de Cosucra. Além disso, farinha de soja bruta (Sig- maAldrich) e proteína de soja (Profam, ADM), bem como proteína de ovo e PPII foram usados. A Figura 8a mostra as reduções de tempo dependentes de dose tanto para proteína de soja quanto para proteína de ervilha, em fermentações usando CESKA®-Star Y200 de CSK Food Enrichment B.V., onde as proteínas não sofrem um tratamento térmico antes da fermentação. Proteína de ovo mostrou apenas pequena redução no tempo de latência (não mostrado). Farinha de soja bruta mostrou uma redução do tempo de latência maior que proteína de ervilha, mas a dosagem foi feita na concentração final de proteína, o que significa que dosagens muito altas de farinha de soja foram necessárias. A redução do tempo de latência usando proteína de soja é, no entanto, distintivamente menor do que a redução do tempo de latência usando inibidor de protease de proteína de batata, como exemplificado pelo uso de PPII.

[0094] Para proteína de ervilha, tanto Pisane® C9 quanto Pisane® F9 foram usados. Os dois tipos forneceram a mesma redução do tempo de latência, que é muito menor do que a redução do tempo de la- tência observada para inibidor de protease de proteína de batata, exemplificado pelo uso de PPII.

[0095] PPII mostra ter a mais alta redução de tempo de latência, e é superior tanto à proteína de ervilha quanto à de soja para fermentação de iogurte, resultando em um tempo de fermentação menor, como pode ser visto da Figura 8a.

[0096] Proteína de batata, proteína de soja isolada e proteína de ervilha isolada mostraram ser termorresistentes. Nenhuma alteração significativa na redução do tempo de latência dependente de dose do iogurte foi observada para estas proteínas no período intermediário de antes e após o tratamento térmico (80°C por 30 minutos). A redução do tempo de latência de farinha de soja bruta, no entanto, certamente não sobrevive a um tratamento térmico (Figura 8b).

EXEMPLO 6: REDUÇÃO DO TEMPO DE LATÊNCIA EM VÁRIOS SISTEMAS DE FERMENTAÇÃO, PRIMEIRO EXEMPLO

[0097] Para validar a redução do tempo de latência de PPII em diferentes sistemas de iogurte, diferentes culturas de partida comerciais foram testadas. As culturas de partida foram escolhidas de modo que variação máxima em ordens de viscosidade e pós-acidificação do iogurte final puderam ser avaliadas. As culturas de partida testadas foram culturas de iogurte Ceska®-star Y200, Y700, Y900, Y104 e Y508 (várias misturas de St. thermophilus e Lb. delbrueckii subsp. bul- garicus), e B193 (mistura de St. thermophilus, Lb. Delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. acidophilus e Bifidobacteria), de CSK Food Enrichment B.V.

[0098] Das 6 culturas de partida testadas, todas 6 apresentaram uma redução significativa do tempo de latência com a adição de PPII a 0,05% a 0,20% de dosagem de PPII (Figure 9a), resultando em um tempo de produção de iogurte reduzido.

EXEMPLO 7: DETERMINAÇÃO DE SE UM SISTEMA DE FERMENTAÇÃO É LIMITADO POR PEPTÍDEO

[0099] Um teste de resposta à dose pode ser realizado para avali ar se um sistema é limitado por peptídeo. O princípio é aqui mostrado em um sistema modelo, em que a concentração de peptídeos disponíveis durante a fermentação é variada. Em um sistema de fermentação de iogurte, a concentração de peptídeo pode ser similarmente variada para determinar se a fermentação de iogurte é limitada por peptídeo.

[00100] Os meios usados neste teste são rotulados como meio A-H, e a cultura de partida está de acordo com o exemplo 1. O progresso da fermentação foi monitorado pela densidade óptica a 600 nm (OD600).

[00101] Todos os meios A-H foram preparados adicionando-se a 1000 ml de água, em pH 6,2 a 6,5: 20 g de glicose (Merck 1.08342), 1g de tween-80 (Merck 822187), 2 g K2HPO4 (Merck 1.05104), 5g de acetato de sódio (Merck 1.06267), 2g de citrato de amônio (SigmaAldrich 09833), 0,2g de MgSO4-7H2O (SigmaAldrich M5921), 0,05g MnSO4-H2O (SigmaAldrich M7634) e 10g de extrato de carne (Fluka 70164). Além disso, os meios continham quantidade de extrato de levedura (“YE”, Flu- ka 92144) e digesto tríptico de peptona de caseína (“CP”, uma fonte de peptídeo, Fluka 70172) como mostrado na tabela 1. TABELA 1 RECEITAS PARA MEIOS A-H

[00102] Figura 10a claramente mostra o efeito de montantes crescentes de peptídeos no desenvolvimento de uma cultura de partida de iogurte. As receitas “E”, “F”, “G” e “H” mostraram mais ou menos os mesmos resultados, indicando que nenhuma redução adicional de tempo de latência pôde ser obtida. Isto significa que a receita “E” (75% YE e CP) é o meio ótimo para esta cultura de partida. Uma vantagem clara no desenvolvimento, com relação ao meio mínimo “A”, é observada para “B”. O mesmo vale para os meios “C” e “D”. Isto significa que nestes casos os meios para esta cultura de partida foram limitados por peptídeo, levando a uma redução significativa do tempo de latência.

[00103] A Figura 10b mostra o efeito de adição de PPII aos meios com diferentes dosagens de peptídeos (YE e CP). Neste exemplo específico, nos meios com concentrações de peptídeo de até 75% de extrato de levedura e peptona de caseína, a redução do tempo de la- tência pôde ser observada para adição de PPII. Redução de tempo dependente de dose por PPII para esta fermentação é mostrada em meios com concentrações de peptídeo de 75% YE e CP, e abaixo.

EXEMPLO 8: PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO AGENTE ESTIMULANTE

[00104] Proteína de batata foi fracionada essencialmente de acordo com o método de Pouvreau (Pouvreau 2001).

[00105] Concentrado de proteína de batata (AVEBE) foi diluído com água desmineralizada (demi water) até solução a 1% de proteína e o pH foi ajustado para 8,0. Insolúveis foram removidos por centrifugação a 5000g por 10 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante foi carregado em uma coluna de 15 por 2,6 cm contendo resina Source 30Q (GE Healthcare) e eluído usando um gradiente linear de NaCl de 0 a 0,6M. Isto resultou em 8 frações discretas de proteína que foram rotuladas como F1 até F8.

[00106] Todas as frações foram testadas quanto à redução do tempo de latência de acordo com o método do exemplo 1. Isto revelou que as frações F1 e F6 apresentam uma forte redução do tempo de latên- cia, indicando que o ingrediente ativo, um inibidor de protease de proteína de batata, está presente nestas frações. Frações F2, F3, F4, F7 e F8 têm redução moderada do tempo de latência de acordo com estes experimentos e F5 não apresenta absolutamente nenhuma redução no tempo de latência. Assim, o ingrediente ativo, um inibidor de protease de proteína de batata, não está presente em F5. O fato de que o ingrediente ativo se liga à coluna nas condições experimentais revela que este é solúvel em água em pH 8,0 e tem um ponto isoelétri- co de 8,0 ou menos.

[00107] Pesos moleculares das frações foram determinados em um Sistema de eletroforese automatizado Experion (BioRad) de acordo com as instruções do fabricante em condições de desnaturação, redução. As frações F1 e F6 que apresentam uma forte redução do tempo de latência partilham várias bandas de MW, mas somente uma delas está ausente na fração F5: uma banda que ocorre entre 17,5 e 18,2 kDa (Tabela 2). Assim, segue-se que a presença desta banda é indicativa de forte redução no tempo de latência. TABELA 2

[00108] Determinação da atividade inibitória de protease de acordo com o método especificado revelou que as frações de proteína F1 e F6 contêm tanto a atividade inibitória de tripsina quanto a de quimio- tripsina, mas nenhuma atividade sobreviveu a um tratamento térmico a 800C por 30 minutos. No entanto, a redução do tempo de latência permanece intacta até pelo menos 900C como mostrado no Exemplo 3. Isto demonstra que nem TIA nem CTIA é uma exigência absoluta para a redução do tempo de latência.

Claims

1. Método de produção de iogurte, sendo que o tempo de latência da fermentação do iogurte é reduzido, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: prover uma cultura de partida de fermentação contendo um micro-organismo selecionado em um meio de cultura adequado, adicionar um inibidor de protease de proteína de planta ao meio de cultura, cultivar o micro-organismo no meio de cultura, e coletar o iogurte, em que o inibidor de protease de proteína de planta é um inibidor de protease de proteína de batata, e em que o inibidor de protease de proteína é adicionado antes da fermentação.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o cultivo do micro-organismo é limitado por peptídeo.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato que o micro-organismo é escolhido no grupo de bactérias e leveduras de ácido láctico.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato que o micro-organismo é escolhido no grupo de Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Carnobacterium, Leuconostoc e Pediococcus, ou da ordem de Bifidobacteriales.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato que o meio de cultura inclui leite.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato que o inibidor de protease de proteína de batata está presente no meio de cultura em um montante entre 5g/L e 0,001g/L.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato que o pH do meio de cultura fica entre 2 e 10.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato que a temperatura durante a fermentação fica entre -10°C e + 60°C.