BR112016014298B1 - Composição antimicrobiana e uso de uma composição - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO ANTIMICROBIANA , USO DE UMA COMPOSIÇÃO E USO DE UM ÁCIDO CARBOXÍLICO. Uma composição antimicrobiana compreendendo um ramnolipídeo e um rompedor de membrana.

Description

[0001] A presente invenção se refere a uma composição bactericida aperfeiçoada compreendendo um ramnolipídeo.

[0002] US 2010/0272690 descreve o uso de Muscodor crispans e/ou seus sub-produtos voláteis, e composições biomiméticas compreendendo compostos alimentares e de sabor comuns, que exibem propriedades antimicrobianas. O documento revela exemplos específicos que incorporam ácido propiônico, ácido isobutírico e/ou ácido acético. O documento também revela a possibilidade de incorporar ramnolipídeo nas suas composições.

[0003] WO 2012/0104 descreve composições detergentes que compreendem ramnolipídeos e lipase.

[0004] EP 2410039 descreve composições de limpeza compreendendo razões específicas de ramnolipídeo mono e di-ramnolipídeo que pode, opcionalmente, incluir um construtor, tais como o ácido cítrico.

[0005] US 2007/191292 descreve uma composição que compreende, pelo menos, uma siringomicina, pelo menos, uma pseudo-micina e suas combinações; e um componente de veículo compreendendo um ramnolipídeo.

[0006] O documento WO 2007/095258 descreve uma composição que compreende um componente biocida selecionado de entre pelo menos uma nicina, pelo menos, um natamicina e combinações dos mesmos, e um componente veículo compreendendo um ramnolipídeo.

[0007] CN 103146496 revela composições detergentes que compreendem 5-15 partes em peso de extrato de ramnolipídeo, 1-10 partes em peso de éster de ácido graxo de sacarose, 0,01-0,05 partes em peso de 10000U/g de lipase biológica, e 0,5-1,5 partes em peso de ácido etilenodiaminotetracético dissódico.

[0008] O documento WO 2008/013899 divulga uma formulação de limpeza que compreende 0,01% a 99,9% de ramnolipídeo, sendo o restante um veículo. O ácido cítrico e o ácido esteárico são incluídos entre uma vasta gama de possíveis componentes veículo.

[0009] O documento WO 02/50225 revela composições de limpeza aquosas antimicrobiana compreendendo (i) pelo menos um surfactante, (ii) pelo menos um ácido, e (iii) uma mistura de solventes compreendendo (a) um derivado de N-alquilpirrolidona e (b) um co-solvente de fórmula geral R1-O- (EO)m-(PO)n-R2, em que R1 e R2 são independentemente C2-6 alquila ou hidrogénio, mas não ambos hidrogénio, m e n são independentemente 0-5, EO representa um grupo etilenoxi e PO representa um grupo propilenoxi.

[0010] Apesar da técnica anterior, ainda existe a necessidade de composições bactericidas de ramnolipídeo aperfeiçoadas.

[0011] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma composição bactericida compreendendo um ramnolipídeo e um rompedor de membrana celular.

[0012] Os mono-ramnolipídeos possuem um único anel de açúcar de ramnose. A denominação IUPAC é ácido 3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-tri- hidroxi-6-metiloxan-2-il]oxidecanoiloxi]decanóico.

[0013] Os di-ramnolipídeos possuem dois anéis de açúcar de ramnose. A denominação IUPAC é ácido 3-[3-[4,5-di-hidroxi-6-metil-3-(3,4,5-tri-hidroxi-6- metiloxan-2-il)oxioxan-2-il]oxidecanoiloxi]decanóico.

[0014] No caso dos ramnolipídeos, ao longo de toda esta especificação de patente, os prefixos mono- e di- são utilizados para indicar, respectivamente, os mono-ramnolipídeos (tendo um único anel de açúcar de ramnose) e os di-ramnolipídeos (tendo dois anéis de açúcar de ramnose). Se forem utilizadas abreviações, R1 é mono-ramnolipídeo e R2 é di-ramnolipídeo.

[0015] O mono-ramnolipídeo pode ser L-ramnosil-β-hidroxidecanoil-β- hidroxidecanoato (RhaCwCw com a fórmula C26H48O9) produzida por P. aeruginosa.

[0016] Um di-ramnolipídeo típico é L-ramnosil-L-ramnosil-β- hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato (Rha2C10C10 com a fórmula C32H58O13).

[0017] Na prática, diversos outros componentes secundários com diferentes combinações de comprimento de cadeia de alquila, dependendo da fonte de carbono e da linhagem bacteriana, existem em combinação com os ramnolipídeos acima mais comuns. A razão entre mono-ramnolipídeo e di- ramnolipídeo pode ser controlada pelo método de produção. Algumas bactérias produzem somente mono-ramnolipídeo, vide US5767090: Exemplo 1, algumas enzimas podem converter mono-ramnolipídeo em di-ramnolipídeo.

[0018] Os seguintes ramnolipídeos são fontes de mono- e di- ramnolipídeos abrangidos na invenção (C12:1, C14:1 indicam as cadeias de acila graxa com ligações duplas): - Ramnolipídeos produzidos por P. aeruginosa (mono-ramnolipídeos): Rha-C8-C10, Rha-C10-C8, Rha-C10-C10, Rha-C10-C12, Rha-C10-C12:1, Rha-C12-C10, Rha-C12:1-C10 - Ramnolipídeos produzidos por P. chlororaphis (somente mono- ramnolipídeos): Rha-C10-C8, Rha-C10-C10, Rha-C12-C10, Rha-C12:1-C10, Rha-C12- C12, Rha-C12:1-C12, Rha-C14-C10, Rha-C14:1-C10. - Os mono-ramnolipídeos também podem ser produzidos a partir de P.putida pela introdução de genes rhlA e rhlB de Psuedomonas aeruginosa [Cha et al. in Bioresour Technol. 2008. 99(7):2192-9] - Ramnolipídeos produzidos por P. aeruginosa (di-ramnolipídeos): Rha- Rha-C8-C10, Rha-Rha-C8-C12:1, Rha-Rha-C10-C8, Rha-Rha-C10-C10, Rha-Rha- C10-C12:1, Rha-Rha-C10-C12, Rha-Rha-C12-C10, Rha-Rha-C12:1-C12, Rha-Rha- C10-C14:1 - Ramnolipídeos produzidos por Burkholdera pseudomallei (somente di- ramnolipídeos): Rha-Rha-C14-C14. - Ramnolipídeos produzidos por Burkholdera (Pseudomonas) plantarii (somente di-ramnolipídeos): Rha-Rha-Ci4-Ci4. - Ramnolipídeos produzidos por P. aeruginosa que são inicialmente não identificados como mono- ou como di-ramnolipídeos: C8-C8, C8-C10, C10-C8, C8— C12:1, CI2:1-C8, CIO-CIO, C12-C10, CI2:1-CI0, C12-C12, CI2:1-CI2, C14-C10, CI4:1-CI0, C14-C14.

[0019] Preferencialmente, o ramnolipídeo compreende pelo menos 20% em peso de di-ramnolipídeo, preferencialmente 50% em peso de di- ramnolipídeo, mais preferencialmente 60% em peso, ainda mais preferencialmente 75% em peso e mais preferencialmente pelo menos 90% em peso de di-ramnolipídeo.

[0020] A composição de acordo com a invenção pode ser utilizada como matéria-prima bactericida, de modo que o usuário, ou seja, o consumidor, dilua em outra composição ou de modo que a composição possa ser um produto do consumidor cuja aplicação se destina a prover efeito bactericida a um substrato ou mesmo como um preservante dentro da composição do consumidor.

[0021] Preferencialmente, o rompedor de membrana celular compreende um ácido, mais preferencialmente um ácido orgânico.

[0022] Os ácidos orgânicos preferidos para uso na presente invenção incluem ácidos carboxílicos e misturas destes.

[0023] Os ácidos carboxílicos preferidos incluem ácidos mono-, di-, tri- policarboxílicos alifáticos, cicloalifáticos ou aromáticos ou combinações/misturas destes. Os ácidos policarboxílicos preferencialmente contêm 2 a 10 átomos de carbono, mais preferencialmente 3 a 6 átomos de carbono na molécula. Os ácidos hidroxicarboxílicos também podem ser utilizados.

[0024] O ácido orgânico pode ser um ácido graxo.

[0025] Os ácidos carboxílicos preferidos incluem ácido caprílico, ácido propiônico, ácido azeláico, ácido capróico, ácido hidroxibenzóico, ácido salicílico, ácido málico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido adípico, ácido cítrico, ácido tartárico e misturas destes.

[0026] As misturas comercialmente disponíveis compreendem 30-35% de ácido adípico, 45-50% de ácido glutárico e 10-18% de ácido succínico. Essa mistura está disponível como SOKALAN DCS ex BASF. Outra mistura adequada está disponível como RADIMIX ex Radici.

[0027] Preferencialmente, o rompedor de membrana celular está presente na faixa de 0,01 a 10% em peso da formulação. Mais preferencialmente, a membrana celular está presente na faixa de 5 a 10% em peso.

[0028] Preferencialmente, a composição é um produto de limpeza doméstica e de higiene pessoal.

[0029] Os produtos preferidos de limpeza doméstica incluem composições detergentes/limpeza para lavagem, composições condicionadoras de roupas e limpadores de superfícies rígidas, por exemplo, composições para lavagem de louça manual e em máquina, limpadores de cozinha e banheiro. Superfícies rígidas incluem superfícies de cozinha e banheiro, talheres, pratos etc.

[0030] As composições de higiene pessoal incluem xampus, condicionadores de cabelo, desodorantes, composições para limpeza de pele e produtos de higiene oral, tais como, cremes dentais e enxaguantes bucais.

[0031] Seguem realizações não limitativas da invenção, incluídos somente por meio de exemplos.

EXEMPLO 1

[0032] Os dados a seguir ilustram a eficácia bacteriostática de uma composição compreendendo um ramnolipídeo e um rompedor de membrana celular, e ácido caprílico.

Materiais e Métodos Micro-organismos e Condições da Cultura

[0033] P. aeruginosa ATCC 15442 e Staphylococcus aureus ATCC 9144 foram mantidos em caldo nutriente mais 20% de glicerol a -20 °C. O crescimento bacteriano a partir de um tubo inclinado de ágar nutriente incubado por 24 horas a 30 °C foi utilizado para obter uma suspensão bacteriana com uma densidade óptica em 570 nm ajustada para resultar em 108 ufc/mL.

Características do Ramnolipídeo

[0034] O ramnolipídeo contendo 10% (p/v) de mono-ramnolipídeo (C26H48O9, PM: 504, Concentração de Micela Crítica: 20 mg/L M em pH neutro) e 10% (p/v) de di-ramnolipídeo (C32H58O13, PM: 650, CMC: 1,5x10—4 30 mg/L em pH neutro) foi obtido separadamente de uma amostra obtida da Jeneil Biosurfactant Co. (Saukville, Wisconsin).

Rompedor de membrana celular: Ácido caprílico

[0035] Ácido caprílico (CAS RN 0124-07-2) foi obtido da Sigma Aldrich (Número no catálogo C2875) como pureza >99%.

[0036] O mono- e o di-ramnolipídeo foram separados da amostra obtida da Jeneil utilizando o protocolo abaixo e as frações individuais R1/ R2 obtidas foram utilizadas para produzir a solução de ramnolipídeo a 10% acima mencionada.

[0037] Uma quantidade quantificada de JBR425 foi acidificada até pH 3 utilizando HCl 12M e colocada em um refrigerador de um dia para o outro. O sobrenadante foi então extraído três vezes utilizando uma mistura 2:1 de clorofórmio e etanol. O solvente foi então removido por evaporação rotatória e a mistura de ramnolipídeo isolado foi então novamente dissolvida em metanol.

[0038] O processo de separação e caracterização da mistura foi realizado utilizando uma HPLC conectada a um Espectrômetro de Massa de Ionização por Eletrospray de Captura Iônica. O modo de ionização estava em modo negativo com uma faixa de varredura de 50-1200 Da. A coluna utilizada para separar foi uma coluna Phenomenex luna C18 250 x 4,6mm de 5 μm. Fase móvel:água (fase móvel A) e acetonitrila (fase móvel B) foram utilizadas para separação por meio de um gradiente de 60:40 (A:B) alterando para 30:70 (A:B) durante 30 minutos. O sistema foi então mantido por 5 minutos antes de retornar às condições iniciais a uma vazão de 0,5 ml/min. O volume de injeção era de 10 μl. Tabela 1 - Análise de JBR425 por HPLC/MS Crescimento de biofilme no dispositivo de passagem de fluxo BioFlux.

[0039] Para analisar a formação de biofilme sob condições de fluxo, foi utilizado o sistema BioFlux 200 (Fluxion Biosciences Inc., South San Francisco, CA) que permite a aquisição automatizada de imagem dentro de placas de especializadas de múltiplos poços. Para o crescimento dos biofilmes, os canais microfluídicos (profundidade de 75 μm; largura de 350 μm) foram lavados com TSB (50%) a 10,0 dyn/cm2. Os canais foram semeados com 107 UFC a partir de uma cultura de um dia para o outro de P. aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 9144 e uma cultura misturada de ambas. A placa foi então incubada a 30 °C por 48 horas para permitir que as células aderissem. Depois que os biofilmes foram formados, células planctônicas foram retiradas, e PBS 1X (como controle) e diferentes tratamentos foram adicionados aos poços de entrada a uma vazão de 279 μL/h por 30 minutos. Os resultados foram registrados com um microscópio Evon (10X) (17% de luz)

RESULTADOS Interrupção do biofilme de Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 9144 e uma cultura misturada utilizando ramnolipídeos e ácido caprílico.

[0040] O efeito de ramnolipídeo com ácido caprílico em biofilmes pré- formados por Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 9144 e uma cultura misturada foi determinado sob condições de fluxo de passagem Bioflux. A interrupção produzida pela combinação de ácido caprílico com ramnolipídeos foi confirmada. Todos os isolados desenvolveram biofilmes em 48 horas. No entanto, houve considerável variabilidade em todos os casos em termos de espalhamento em torno do canal microfluídico. Os biofilmes de Pseudomonas aeruginosa e a cultura misturada foram bem formados (Fig. 1A, 1E e 1G) sob condições de fluxo; no entanto, os biofilmes formados por Staphylococcus aureus ATCC 9144 (Figura 1C) não foram tão espessos, porém bons o suficiente para serem considerados uma comunidade multicelular que representou um estado fisiológico fundamentalmente diferente se comparado a bactérias planctônicas selvagens.

[0041] Após 48 horas, todas as placas foram enxaguadas com PBS 1X e os tratamentos com a combinação de ramnolipídeos (0,04% v/v) e ácido caprílico (0,01% v/v) foram aplicados por 30 minutos. Após esse tempo, mais que 90% dos biofilmes foram rompidos. É interessante observar que houve variação na forma que os micro-organismos Gram-positivos e Gram-Negativos respondem à combinação entre ramnolipídeos e ácido caprílico, sugerindo uma possível sinergia entre eles em comparação aos resultados quando os componentes são aplicados individualmente (dados não mostrados).

[0042] Os resultados são ilustrados na Figura 1 que mostra a formação e a interrupção de biofilme em um canal BioFlux. As imagens são imagens de contraste de fase e mostram biofilmes totalmente formados 48 horas após a incubação a 30 °C, e as imagens foram registradas com um microscópio Evon (10X) (17% de luz) como segue: (A) Biofilme de P. aeruginosa ATCC 15442 antes do tratamento. (B) P. aeruginosa ATCC 15442 (A) após o tratamento com Ramnolipídeo (0,04%) e Ácido Caprílico (0,01%). (C) S. aureus ATCC 9144 antes do tratamento. (D) S. aureus ATCC 9144 (C) após o tratamento com Ramnolipídeo (0,04%) e Ácido Caprílico (0,01%). (E) Cultura Misturada (P. aeruginosa ATCC 15442/S. aureus ATCC 9144) antes do tratamento. (F) Cultura Misturada (E) após o tratamento com Ramnolipídeo (0,04%) e Ácido Caprílico (0,01%). (G) P. aeruginosa ATCC 15442 antes do tratamento. (H) P. aeruginosa ATCC 15442 (G) após o tratamento com PBS 1X.

Claims (7)

1. Composição antimicrobiana, caracterizada por compreender um ramnolipídeo e um rompedor de membrana celular, em que o rompedor de membrana compreende um ácido caprílico.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por incluir tensoativo adicional compreendendo um tensoativo sintético.

3. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo ramnolipídeo estar presente em 1% em peso a 95% em peso do tensoativo total, preferencialmente de 10% a 70% em peso.

4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por ser uma composição de limpeza doméstica ou de higiene pessoal.

5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por ser uma composição de higiene pessoal preferencialmente selecionada dentre um xampu, condicionador, desodorante, composição para limpeza de pele, antitranspirante.

6. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por ser uma composição de limpeza doméstica preferencialmente selecionada dentre uma composição para lavagem de roupas e um limpador de superfícies duras.

7. Uso de uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por ser para a prevenção antimicrobiana ou interrupção do crescimento microbiano.