BR112016013252B1

BR112016013252B1 - Sistema de evacuação de gás para biossensor nanofluídico e método para evacuação de gás de um sistema nanofluídico

Info

Publication number: BR112016013252B1
Application number: BR112016013252-1A
Authority: BR
Inventors: Nicolas Durand; Iwan Märki; Matthias Geiss-Bühler
Original assignee: Abionic Sa
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2014-11-17
Publication date: 2020-09-29
Also published as: ES2731693T3; JP2017505446A; CA2932577C; EP3080589A1; JP6502960B2; EP3080589B1; CA2932577A1; PT3080589T; AU2014363071B2; US20160339432A1; CN105874320A; US10166540B2; WO2015087178A1; CN105874320B; TR201908562T4; AU2014363071A1; BR112016013252A2

Abstract

sistema de evacuação de gás para biossensor nanofluídico. a presente invenção refere-se a um sistema biossensor nanofluídico (200) compreendendo um substrato de fundo (120) e um substrato de topo (110) entre os quais são definidas uma abertura de entrada lateral (210), uma nanofenda (230) que contém pelo menos uma área funcionalizada (231) e uma abertura de saída lateral (220) ou um reservatório interno (221), o dito sistema biossensor (200) sendo adaptado de modo a permitir que uma solução contendo biomoléculas (320) entre pela abertura de entrada lateral (210) e sucessivamente passe através da dita nanofenda (230) e da dita abertura de saída lateral (220) ou do reservatório interno (221); o dito sistema de biossensor (200) compreendendo ainda um subsistema de evacuação de gás (150 - 155) que se localiza entre a dita nanofenda (230) e o ambiente externo do biossensor.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a biossensores nanofluídicos dotados de pelo menos uma abertura lateral. Este tipo de biossensor pode ser vantajosamente utilizado para uma rápida e precisa quantificação de amostras biológicas ou biomédicas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Os biossensores nanofluídicos são definidos como sistemas fluídicos com confinamentos de dimensões nanométricas e/ou aberturas laterais. Suas aplicações incluem a quantificação da presença de biomoléculas em uma solução. A maior parte dos atuais desenvolvimentos relacionados a biossensores nanofluídicos se destina às aplicações de bioengenharia e de biotecnologia. No âmbito da aplicação da presente invenção, os biossensores são usados no sentido de quantificar a presença de biomoléculas em soluções para fins de aplicações de diagnóstico em laboratório.

[0003] O Pedido de Patente da Suíça N° CH 01824/09 apresenta biossensores com aberturas laterais para a detecção de interações biomoleculares; o Pedido PCT N° IB2010/050867 descreve a utilização de biossensores com sistemas ópticos simples, e o Pedido PCT N° IB2012/050527 apresenta o método para a diminuição do tempo de incubação e para o aumento da sensibilidade dos biossensores descri-tos. A difusão de biomoléculas nessas configurações é lenta e requer longos períodos de espera para atingir condições de medição estáveis, como também requer soluções altamente concentradas para a observação das interações biomoleculares.

[0004] Biomarcadores, também chamados marcadores biológicos, são substâncias usadas como indicadores específicos a fim de detectar a presença de biomoléculas. É uma característica que essa presença é objetivamente medida e avaliada como um indicador de processos biológicos, processos patogênicos, ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica.

[0005] As práticas atuais para a detecção de biomoléculas específicas podem ser divididas em duas categorias, distintamente: (a) em técnicas rotuladas, e (b) em técnicas não rotuladas.

[0006] Entre as técnicas rotuladas, as mais amplamente usadas são as de fluorescência, colorimetria, radioatividade, fosforescência, bioluminescência, e quimioluminescência. As esferas magnéticas fun- cionalizadas podem também ser consideradas como técnicas de rotulagem. As vantagens das técnicas de rotulagem vêm a ser a sensibilidade, em comparação com os métodos não rotulados, e o reconhecimento molecular devido à rotulagem específica.

[0007] Entre as técnicas não rotuladas, as mais amplamente usadas são as dos biossensores eletroquímicos, com referência aos sensores amperométricos, capacitivos, condutométricos ou impedimétri- cos, cujos sensores têm a vantagem de serem rápidos e baratos. Os mesmos medem a alteração nas propriedades elétricas das estruturas de eletrodo, uma vez que as biomoléculas ficam presas ou imobilizadas sobre ou próximo ao eletrodo, contudo todos esses conceitos carecem de um contraste molecular específico, além de sensibilidade e confiabilidade.

[0008] O ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) é uma técnica bioquímica importante principalmente usada no sentido de detectar a presença de biomoléculas solúveis no soro e, por conseguinte, é amplamente utilizada como uma ferramenta diagnóstica em medicina e na verificação de controle de qualidade em várias indústrias. A análise do ensaio ELISA é, por outro lado, cara, requer grandes quantida- des de solução e é demorada.

[0009] As outras tecnologias importantes para o diagnóstico bio- molecular são os métodos chamados Western e Northern blots, a eletroforese de proteínas e a reação em cadeia da polimerase (PCR). No entanto, esses métodos requerem uma alta concentração de analitos e não permitem a análise de amostras de alto rendimento.

OBJETIVOS

[0010] Vem a ser um objeto da presente invenção aumentar a variabilidade dos biossensores nanofluídicos rápidos, que não necessitam de manipulações complexas.

[0011] Ainda um outro objeto da presente invenção é criar galerias de passagem transversal que permitem a evacuação do gás que pode ficar preso dentro do biossensor durante o seu enchimento com a solução para análise.

[0012] Ainda um outro objeto da presente invenção é aumentar a sensibilidade da detecção ao forçar o fluxo de um maior volume de solução através da entrada do biossensor (nanofenda).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0013] A presente invenção se baseia na descoberta de que várias bolhas de ar podem aparecer em um biossensor nanofluídico quando a frente do enchimento não é perfeitamente homogênea. A fim de evacuar o ar preso, foi inventado um subsistema de evacuação de gás que permite a saída do ar pelo biossensor.

[0014] A presente invenção também se baseia na descoberta de que a remoção das bolhas de ar melhora fortemente a variabilidade entre os biossensores, bem como a sua sensibilidade.

[0015] Este subsistema de evacuação de gás, de acordo com a presente invenção, pode ser feito de um material poroso.

[0016] Além disso, a presente invenção aumenta a possibilidade de se estruturar localmente um ou ambos os substratos dos biossen- sores de modo a definir um subsistema de evacuação de gás.

[0017] No presente documento, o termo "subsistema de evacuação de gás" deve ser entendido como qualquer sistema que pode ser usado para a finalidade pretendida. Por exemplo, o mesmo pode ser feito de poros, furos de passagens transversais ou fendas.

[0018] No âmbito de aplicação da presente invenção, substâncias nanofluídicas são usadas por motivo de sua elevada razão superfície para volume, o que significa que as superfícies incluídas no volume de detecção maximizam a probabilidade das interações entre as biomoléculas e os biomarcadores imobilizados sobre as superfícies. A presente invenção também reduz fortemente o sinal de fundo da solução devido à pequena porção do substrato que fica dentro do volume de de-tecção.

[0019] A presente invenção se refere, portanto, a um biossensor, tal como definido nas reivindicações.

[0020] A presente invenção se refere ainda a uma montagem e a um método com o dito biossensor. Alguns exemplos não limitantes da presente invenção são apresentados nos capítulos a seguir, alguns desses exemplos sendo ilustrados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0021] A Figura 1a é uma vista em perspectiva de um sistema biossensor nanofluídico dotado de um substrato de fundo 120, uma camada de espaçador 130, e um substrato de topo 110 contendo poros de passagem estruturados e não estruturados, e uma abertura lateral 210. Uma solução 300 contendo biomoléculas rotuladas por fluorescência é depositada por meio de um sistema de pipetas 400 de uma maneira que a solução entre no biossensor a partir da abertura lateral 210. Um sistema óptico 500 com base em um feixe de laser 510 é tipicamente usado para a medição.

[0022] A Figura 1 b é uma vista em perspectiva de um sistema bi- ossensor nanofluídico dotado de um substrato de fundo 120, uma camada de espaçador 130, e um substrato de topo 111 contendo poros de passagem estruturados e não estruturados em uma posição definida 150, e uma abertura lateral 210. Uma solução 300 contendo biomoléculas rotuladas por fluorescência é depositada por meio de um sistema de pipetas 400 de uma maneira que a solução entre no biossensor a partir da abertura lateral 210. Um sistema óptico 500 com base em um feixe de laser 510 é tipicamente usado para a medição.

[0023] A Figura 2a mostra uma seção transversal de uma vista de topo do substrato 111 dotado de um biossensor nanofluídico. Uma abertura de entrada lateral 210, uma nanofenda 230, e uma abertura de saída 220 compõem o sistema fluídico. A área de medição 231 é definida dentro da nanofenda. Assim que o sistema atinge o seu equilíbrio, a solução poderá ser encontrada na abertura de entrada lateral 301, na nanofenda 302 e na abertura de saída lateral 303. Uma bolha de gás 350 poderá ser formada quando o fluxo da solução atuado de maneira frontal pelo componente de condução de líquido 140 não é perfeitamente uniforme.

[0024] A Figura 2b mostra uma seção transversal da vista de topo do substrato 111 dotado de um biossensor nanofluídico. Uma abertura de entrada lateral 210, uma nanofenda 230, e uma abertura de saída 220 compõem o sistema fluídico. A área de medição 231 é definida dentro da nanofenda 230, e os poros de passagem transversais de substrato 150 são definidos diretamente dentro da abertura de saída lateral 220. Um componente de condução de líquido 140 também se encontra presente dentro da abertura de saída lateral 220. Assim que o sistema atinge o seu equilíbrio, a solução poderá ser encontrada na abertura de entrada lateral 301, na entrada de biossensor (nanofenda) 302, e na abertura de saída lateral 303. Bolhas de gás não se encontram presentes, uma vez que o gás consegue vazar pelo sistema de poros 150.

[0025] A Figura 3a mostra uma seção transversal lateral do biossensor nanofluídico definida por dois substratos 110 e 120, e composta por uma abertura de entrada lateral 210 e uma abertura de saída lateral 220, ambas ligadas entre si por uma nanofenda 230. A abertura de saída lateral 220 pode conter um sistema de condução de líquido 140. O substrato 110 é totalmente poroso com poros de passagem transversais.

[0026] A Figura 3b mostra uma seção transversal lateral do biossensor nanofluídico definida por dois substratos 111 e 120, e dotado de uma abertura de entrada lateral 210 e uma abertura de saída lateral 220, ambas ligadas entre si por uma nanofenda 230. A abertura de saída lateral 220 pode conter um sistema de condução de líquido 140. O substrato 111 pode ser estruturado de modo a ficar localmente poroso com os poros de passagem transversais 150.

[0027] A Figura 3c mostra uma seção transversal lateral do biossensor nanofluídico definido por dois substratos 111 e 120, e dotado de uma abertura de entrada lateral 210 e um reservatório interno 221, ambos ligados entre si por uma nanofenda 230. O reservatório interno 221 pode conter um sistema de condução de líquido 140. O substrato 111 pode ser estruturado de modo a ficar localmente poroso com os poros de passagem transversais 150.

[0028] A Figura 3d mostra uma seção transversal lateral do biossensor nanofluídico definido por dois substratos 111 e 120, e dotado de uma abertura de entrada lateral 210 e uma abertura de saída lateral 220, ambas ligadas entre si por uma nanofenda 230. A abertura de saída lateral 220 pode conter um sistema de condução de líquido 140. O substrato 111 pode ser localmente estruturado com furos ou fendas de passagem transversais 151.

[0029] A Figura 3e mostra uma seção transversal lateral do biossensor nanofluídico definido por dois substratos 111 e 120, e dotado de uma abertura de entrada lateral 210 e uma abertura de saída lateral 220, ambas ligadas entre si por uma nanofenda 230. A abertura de saída lateral 220 pode conter um sistema de condução de líquido 140. O substrato 121 pode ser estruturado de modo a ficar localmente poroso com poros de passagem transversais 150.

[0030] A Figura 4 mostra uma seção transversal lateral do biossensor nanofluídico definido por dois substratos 111 e 120, e dotado de uma abertura de entrada lateral 210 e uma abertura de saída lateral 220, ambas ligadas entre si por uma nanofenda 230. Apenas um dos substratos é localmente estruturado por uma área 231 que é funciona- lizada por biomarcadores 310 e outras áreas 203 que impedem essa funcionalização. Uma solução reagente 300 contendo biomoléculas entra na nanofenda 230 a partir da abertura de entrada lateral 210 para a abertura de saída lateral 220 e é atuada pelo componente de condução interno 140. Ao atingir a abertura de saída lateral 220, a solução 300 contendo as moléculas a serem detectadas 320 e outras moléculas 330 enche os poros de passagem transversais estruturados 152. A citada figura mostra os poros totalmente enchidos 153, os poros que estão sendo enchidos 154, e os poros a serem enchidos 155. O feixe de laser 510 monitora a concentração de biomoléculas imobilizadas 340 no volume de detecção 520.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0031] Tal como usado no presente documento, o termo "biomoléculas" se destina a ser um termo genérico que inclui, por exemplo, (mas não se limita a) proteínas, tais como anticorpos ou citocinas, pep- tídeos, ácidos nucleicos, moléculas lipídicas, polissacarídeos e vírus.

[0032] Tal como usado no presente documentos, o termo "nanofenda" se destina a ser um termo genérico, que significa uma estrutura microfabricada bem definida com pelo menos uma dimensão em escala nanométrica. A dimensão em escala nanométrica de uma nanofen- da é definida como sendo maior do que 2 nm tendo em vista a dimensão das menores biomoléculas a serem detectadas que têm de entrar na fenda e que são da mesma ordem de magnitude. A presente invenção se limita às nanofendas com uma altura menor do que alguns microns, uma vez que a faixa do volume de detecção do sistema óptico se encontra tipicamente na mesma ordem de magnitude.

[0033] Tal como usado no presente documento, o termo "abertura lateral" se destina a ser um termo genérico que inclui, por exemplo, (mas não se limita a) canais de entrada e de saída.

[0034] Tal como usado no presente documento, o termo "reservatório interno" tem a intenção de ser um termo genérico que inclui, por exemplo, (mas não se limita a) espaços que não têm um acesso direto a uma abertura lateral, mas que fica em contato com o sistema de evacuação de gás.

[0035] A presente invenção tem como objetivo aumentar o enchimento da abertura de saída de lateral 220 ou 221 do reservatório interno graças a um sistema de evacuação de gás que garante uma baixa variabilidade entre os biossensores na medição da concentração de biomoléculas. Tal como mostrado na Figura 1a e na Figura 1b, um biossensor nanofluídico dotado de um substrato 110 ou 111 e de um substrato 120 intercalado em conjunto com um espaçador 130, e que tem uma abertura de entrada lateral 210, fica imobilizado acima de uma unidade óptica 500. O substrato 110 pode ser poroso, e o substrato 111 pode ter poros de passagem transversais localmente estruturadas a fim de permitir a evacuação de gás durante o enchimento do biossensor nanofluídico. Uma solução de mistura 300 contendo as biomoléculas de interesse é disposta na abertura de entrada lateral 210 por meio de um sistema de pipeta 400. Por fim, uma unidade óptica 500 é usada com a finalidade de medir as interações biomoleculares dentro dos biossensores 200 por meio da concentração de um feixe de laser 510 no interior da nanofenda dos biossensores.

[0036] A Figura 2a e a Figura 2b ilustram vistas de topo de uma metade de um biossensor nanofluídico dotado de um substrato 111 que contém uma abertura de entrada lateral 210 e uma abertura de saída lateral 220, ambas ligadas entre si por uma nanofenda 230. Na Figura 2a, a abertura de saída lateral 220 não é concebida com um sistema de evacuação de gás, ao passo que, na Figura 2b, a abertura de saída lateral 220 é estruturada com um sistema de evacuação de gás 150, o qual pode ser obtido com um processo de ataque químico seco ou úmido local a fim de se obter poros ou furos de passagem transversais. Quando uma solução contendo biomoléculas é depositada na abertura de entrada lateral 210, a solução irá encher, em primeiro lugar, a abertura de entrada lateral 301, encher a nanofenda 302 e, em seguida, finalmente, encher a abertura de saída lateral 303. Apesar de um excelente sistema de condução de líquido 140, o enchimento da abertura de saída lateral 220 raramente é uniforme. Tipicamente, a solução poderá atingir uniformemente a borda da abertura 220 e depois de parar, devido ao um equilíbrio das tensões de superfície, a solução poderá bloquear o gás no interior da abertura de saída lateral 220. Isto pode resultar no aparecimento de bolhas de gás 350 devido ao fato de que o gás não poderá se descarregar pela abertura lateral 210 ou 220. Tal como ilustrado na Figura 2b, o gás pode se descarregar do sistema por meio dos poros de passagens transversais 150, evitando o aparecimento de bolhas de gás e garantindo o enchimento total da abertura de saída lateral, e, deste modo, garantindo uma baixa variabilidade entre os biossensores.

[0037] As Figuras 3a, 3b, 3c, 3d e 3e ilustram diferentes configurações de biossensor nanofluídico com aberturas laterais e de sistema de evacuação de gás de acordo com a presente invenção. O sistema, apresentado como vistas transversais laterais, é constituído por uma nanofenda 230 que liga uma abertura de entrada lateral 210 tanto à abertura de saída lateral 220, como também a um reservatório interno 221. Um componente de condução 140 é estruturado próximo ou dentro da abertura de saída lateral 220. Na Figura 3a, o biossensor é dotado de um substrato 110 que é inteiramente poroso com galerias de passagem transversais. A Figura 3b apresenta uma alternativa na qual o substrato 111 é localmente estruturado com galerias de passagem transversais porosas 150. A Figura 3c ilustra o caso no qual não há nenhuma abertura de saída lateral, uma vez que o gás pode se descarregar através das áreas porosas 150 localmente estruturadas no substrato 111 à medida que a solução enche o sistema. A Figura 3d apresenta o caso no qual o substrato 111 é localmente estruturado com furos de passagem transversais 151 com dimensões nanométri- cas, micrométricas ou milimétricas. Por fim, a Figura 3e ilustra que o sistema de evacuação de gás 150 pode ser estruturado sobre o outro substrato 121, ou sobre ambos os substratos 112 e 121.

[0038] A Figura 4 ilustra o princípio de detecção e a seção transversal de um biossensor com aberturas laterais, e o sistema de evacuação de gás, de acordo com a presente invenção. O sistema apresentado como uma vista transversal lateral é composto de uma nanofenda 230 que liga uma abertura de entrada lateral 210 a uma abertura de saída lateral 220. Um componente de condução de líquido 140 fica localizado próximo ou no interior da abertura de saída lateral 220. O sistema de evacuação de gás 152 também se encontra presente na abertura de saída lateral 220. Primeiramente, os biomarcadores 310 ficam imobilizados sobre as superfícies de nanofenda seletivamente funcio- nalizadas de um ou de ambos os substratos 111 e 120. As outras superfícies de nanofenda e as superfícies de abertura laterais podem ser protegidas pela deposição de uma camada não funcionalizada 203 a fim de evitar uma não especificidade. Uma vez que a solução 300 con tendo as biomoléculas específicas rotuladas por fluorescência 320 e as biomoléculas não específicas 330 é depositada na abertura de entrada lateral, a mesma poderá encher o sistema a partir da abertura de entrada lateral 210 para a abertura de saída lateral 220 através da nanofenda 230. Após o enchimento da nanofenda 230 e ao chegar no componente de condução de líquido 140, a solução 300 enche a abertura de saída lateral 220. Ao fluir através da nanofenda 230, e graças ao movimento browniano, biomoléculas específicas 320 interagem com os biomarcadores 310 imobilizados dentro da nanofenda 230 e formam complexos moleculares 340. As biomoléculas não específicas 330 também irão fluir através da nanofenda 230, mas não irão formar complexos moleculares com os biomarcadores imobilizados 310 e continuarão dentro da abertura de saída lateral 220. Quando a solução 300 fica em contato com o sistema de evacuação de gás 152, o líquido entra nos poros de passagem transversais 155, com um estado de enchimento transitório 154, até que o mesmo encha completamente os poros 153. Por fim, depois de ter atingido um estado de equilíbrio, os complexos emissores imobilizados por fluorescência 340 e as biomoléculas emissoras que se difundem por fluorescência 330 se difundem através do volume de detecção óptica são excitados pelo feixe de laser 510 e tanto os complexos como as biomoléculas são detectados pelo sistema óptico.

[0039] De acordo com a presente invenção, o dispositivo oferece grandes melhorias em termos de variabilidade e sensibilidade para a detecção, enumeração, identificação e caracterização de biomoléculas que interagem ou não com outras biomoléculas imobilizadas. As aplicações da presente invenção podem abranger a análise biomédica, a análise biológica ou a análise de alimentos, bem como estudos fundamentais em química analítica e bioanalítica.

Claims

1.Sistema biossensor nanofluídico (200), caracterizado pelo fato de compreender um substrato de fundo (120) e um substrato de topo (110) entre os quais são definidas uma abertura de entrada lateral (210), uma nanofenda (230) que contém pelo menos uma área funcionalizada (231) e uma abertura de saída lateral (220) ou um reservatório interno (221), o dito sistema biossensor (200) sendo adaptado de modo a permitir que uma solução contendo biomoléculas (320) entre pela abertura de entrada lateral (210) e sucessivamente passe através da dita nanofenda (230) e da dita abertura de saída lateral (220) ou do dito reservatório interno (221); o dito sistema biossensor (200) compreendendo ainda um subsistema de evacuação de gás (150 - 155) localizado entre a dita nanofenda (230) e o ambiente externo do biossensor; o dito subsistema de evacuação de gás compre-endendo vários furos/poros de passagem transversais (151, 153, 154, 155) que são adaptados para serem completamente preenchidos por líquido.

2.Sistema biossensor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda um subsistema de condução de líquido (140) localizada entre a dita nanofenda (230) e o dito subsistema de evacuação de gás (150 - 155).

3.Sistema biossensor, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito subsistema de evacuação de gás (150 - 155) fica contido dentro de um ou de ambos os ditos substratos (110, 120).

4.Biossensor (200), de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os substratos (110, 120) são feitos de um material selecionado a partir do grupo constituído por silício, vidro, plástico e compostos de óxido.

5.Biossensor (200), de acordo com qualquer das reivindi cações precedentes, caracterizado pelo fato de que as aberturas laterais (210, 220) têm uma área de 100 nm2 a 100 mm2, e a nanofenda (230) tem uma altura compreendida entre 2 nm e 1000 nm, uma largura entre 2 nm e 20 mm, e um comprimento entre 2 nm e 20 mm.

6.Método para evacuação de gás de um sistema nanofluí- dico, caracterizado pelo fato de compreender: a) pelo menos um biossensor (200), como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; b) um sistema óptico (500); c) a detecção de biomoléculas específicas (320) imobilizadas em biomarcadores (310) no interior da dita nanofenda (230) por meio da quantificação de fluoróforos ligados às biomoléculas (320).