BR112015020604B1

BR112015020604B1 - Vírus da leucemia bovina, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica e uso de um vírus da leucemia bovina

Info

Publication number: BR112015020604B1
Application number: BR112015020604-2A
Authority: BR
Inventors: Luc Willems; Karina Trono
Original assignee: Instituto Nacional De Tecnologia Agropecuaria; Université de Liège
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2014-02-27
Publication date: 2023-11-21
Also published as: AR094912A1; MX2015011064A; MX358118B; EP2961425A1; US10029006B2; CA2901508A1; US20160045593A1; EP2961425B1; US20190000963A1; BR112015020604A2; US11154611B2; WO2014131844A1

Abstract

VÍRUS DA LEUCEMIA BOVINA, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, ANIMAL, MÉTODO DE OBTENÇÃO DE MATERIAL DE ANIMAL, MATERIAIS DERIVADOS DE ANIMAL, USO DE UM VÍRUS DA LEUCEMIA BOVINA E MATÉRIA. A presente invenção refere-se a vírus da leucemia bovina recombinantes que possuem fenótipo atenuado e compreendem uma combinação de pelo menos duas mutações específicas. A presente invenção também fornece ácidos nucleicos recombinantes que codificam esses vírus, vetores que compreendem esses ácidos nucleicos e células hospedeiras que compreendem esses ácidos nucleicos ou vetores. Os vírus BLV atenuados recombinantes, ácidos nucleicos recombinantes, vetores e células hospedeiras permitem a preparação de vacinas aprimoradas, particularmente vacinas apropriadas para o tratamento profilático de doenças associadas a BLV em pacientes. A presente invenção fornece ainda métodos de tratamento de doenças associadas a BLV em pacientes e composições farmacêuticas apropriadas para uso nesses métodos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção encontra-se no campo médico, especialmente no campo veterinário e, particularmente, refere-se a vacinas, mais particularmente vacinas contra vírus da leucemia bovina. A presente invenção refere-se mais especificamente a vírus da leucemia bovina recombinantes que possuem fenótipo atenuado, ácidos nucleicos que codificam esses vírus, vetores que compreendem esses ácidos nucleicos, células hospedeiras que compreendem esses vetores ou ácidos nucleicos, aplicações desses agentes em medicamento, particularmente na forma de vacinas, animais não humanos vacinados com eles, materiais derivados desses animais não humanos e usos desses materiais ao longo do processo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Embora erradicado na Europa, o vírus da leucemia bovina (BLV) é responsável por importantes perdas econômicas em todo o mundo. Os animais infectados com BLV, em sua grande maioria, são portadores assintomáticos do vírus. Cerca de um terço dos bovinos infectados com BLV desenvolve proliferação policlonal benigna de células B denominada linfocitose persistente (PL), caracterizada por aumento do número absoluto de linfócitos B em circulação no sangue periférico associado a uma inversão da razão de linfócitos B/T. PL normalmente é estável por vários anos, mas pode também progredir para uma fase tumorosa.

[003] A manifestação clínica mais visível da infecção por BLV é o desenvolvimento de tumores linfoides. Linfoma fatal ou linfossarcoma (LS), caracterizado pela expansão mono ou oligoclonal de células B, ocorre em menos de 5-10% de animais infectados, predominantemente em gado bovino adulto com mais de 4-5 anos de idade. A proliferação sítio de células B, denominada linfossarcoma, pode ocorrer em diferentes órgãos e tecidos, gerando uma série de defeitos que, por fim, são incompatíveis com a sobrevivência do animal. Além disso, células B transformadas podem também incluir o crescimento de nódulos linfáticos e causar linfoma. Além do impacto sobre a sobrevivência, a infecção por BLV também prejudica o sistema imunológico, gerando infecções oportunistas.

[004] Foram conduzidas diversas tentativas de desenvolvimento de vacinas contra BLV, tais como vacinas com base em BLV quimicamente inativado, vacinas com base em lisatos, por exemplo, de células infectadas por BLV ou tumores de BLV e vacinas que compreendem subunidades de BLV, tais como a glicoproteína de envelope gp51. Outras tentativas utilizaram vírus de vaccinia como veículo e introduziram genes de BLV que codificam, por exemplo, proteínas do envelope de BLV no seu genoma (ou seja, vírus de vaccinia recombinantes ou RVV). Peptídeos curtos que imitam epítopos de células B e T de proteínas BLV foram também testados como imunogenes. Vacinas de DNA que compreendem genes BLV, tais como o gene env sob o controle do promotor citomegalovírus, também foram desenvolvidas. Estas possíveis vacinas “tradicionais” enfrentaram problemas, entre outros, de eficácia (ou seja, apenas uma fração inadequadamente baixa de animais vacinados foi protegida), persistência (ou seja, rápida redução da proteção imunológica nos animais vacinados), custo (por exemplo, alto custo de produção de proteínas purificadas) e/ou segurança (por exemplo, uso de vírus híbridos geneticamente modificados, tais como RVV).

[005] Em uma tentativa de abordar as desvantagens dessas abordagens anteriores, foram desenvolvidos numerosos mutantes de BLV atenuados, por exemplo, excluindo genes dispensáveis para infectividade, mas necessários para a reprodução eficiente do vírus (Willems et al, 1993, J. Virol. 67: 4078-4085). Dentre estes, um pró-vírus BLV atenuado, pBLV6073, foi obtido por meio da introdução de uma mutação em um motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora localizado na extremidade citoplasmática da glicoproteína de envelope de transmembranaa gp30 (Willems et al, 1995, J. Virol. 69: 4137-4141). Outro pró-vírus de BLV atenuado, pBLVDX, foi construído por meio de deleção das sequências R3 e G4 (Willems et al, 1993, J. Virol. 67: 4078-4085). Estes mutantes de BLV (pBLV6073 e pBLVDX) foram avaliados em Kerkhofs et al, 2000, J. Gen. Virol. 81: 957-963; Reichert et al, 2000, J. Gen. Virol. 81: 965-969; e Florins et al, 2007, J. Virol. 81: 1019510200.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[006] Os inventores do presente conduziram extensos estudos de pró-vírus de BLV atenuados existentes e confirmaram que esses pró-vírus de BLV, incluindo, entre outros, pBLV6073 e pBLVDX, realmente permanecem patogênicos em nível que pode evitar o seu uso disseminado como vacinas na prática veterinária. Observou-se patogenicidade, por exemplo, em um carneiro dentre vinte que foram infectados com o pró-vírus pBLVDX após período de latência de sete anos. Além disso, conforme resumido na Tabela 1 de Florins et al, 2007, acima, observou-se patogenicidade em um carneiro de oito que foram infectados com o pró-vírus pBLVDX após período de latência de 7,5 anos. Adicionalmente, o pró-vírus pBLV6073 induziu leucemia em um dentre quatro carneiros após 83 meses de latência (vide também a Tabela 1 de Florins et al, 2007, acima). Portanto, os pró-vírus de BLV atenuados previamente existentes ainda são ao menos fracamente patogênicos.

[007] Além disso, a proteção atingida por pró-vírus de BLV atenuados previamente existentes foi relatada como não suficientemente eficaz e comparativamente de curto prazo. Uma das duas vacas vacinadas utilizando o pró-vírus pBLVDX e avaliadas em Kerkhofs et al, 2000, acima, por exemplo, foi infectada por BLV do tipo selvagem doze meses após o desafio. Um de três carneiros vacinados utilizando o pró-vírus pBLVDX e avaliados em Reichert et al, 2000, acima, foi infectado por BLV a partir de uma vaca naturalmente infectada. De forma adicionalmente importante, conforme exibido no capítulo experimental, a vaca n° 269 vacinada utilizando o pró-vírus pBLV6073 e avaliada em Kerkhofs et al, 2000, acima, por exemplo, também foi infectada por BLV do tipo selvagem 24 meses após o desafio.

[008] A presente invenção aborda um ou mais desses problemas observados pelos inventores.

[009] Conforme confirmado pelo capítulo experimental, que ilustra certas realizações representativas da presente invenção, os inventores descobriram que, por meio da combinação de mutações específicas em um (pró)vírus de BLV, podem ser obtidas vacinas com grandes aprimoramentos. Os inventores elaboraram, portanto, pró-vírus de BLV recombinantes que foram infecciosos, mas que se reproduziram em níveis desejavelmente baixos em animais alvo, tais como, especificamente, vacas.

[0010] Pelo menos algumas realizações dos pró-vírus de BLV recombinantes do presente exibem uma ou mais vantagens adicionais, aprimorando o seu uso como vacinas. Esses pró-vírus de BLV recombinantes podem exibir, por exemplo, uma ou mais ou, preferencialmente, todas as vantagens a seguir: eles permitem forte reação imunológica anti-BLV comparável a uma reação imunológica a BLV do tipo selvagem; eles não se difundem para sentinelas não infectadas mantidas por períodos de tempo prolongados no mesmo rebanho (ou seja, biossegurança satisfatória como vacina); eles geram a produção de anticorpos que são transmitidos para os bezerros recém-nascidos por meio do colostro materno, em que a imunidade passiva antiviral persiste durante vários meses nos bezerros; eles não são transmitidos das vacas para os bezerros; e eles fazem com que os animais vacinados resistam a desafios por um pró-vírus BLV do tipo selvagem.

[0011] Particularmente, as vacinas fornecidas pelos pró-vírus de BLV recombinantes de acordo com aspectos e realizações da presente invenção são altamente eficazes, preferencialmente atingindo proteção a longo prazo (tal como proteção por pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses, pelo menos 36 meses ou pelo menos 48 meses após a vacinação) de virtualmente todos os animais testados (por exemplo, pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, tal como 98%, 99% ou até 100%), de maior preferência de gado bovino, contra infecções por BLV do tipo selvagem. Desta forma, ao contrário das vacinas existentes anteriormente, os pró-vírus de BLV recombinantes do presente são eficazes em bovídeos, tais como, mais particularmente, em vacas, tornando as presentes vacinas particularmente vantajosas para o controle de infecções por BLV em gado bovino.

[0012] Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece um vírus da leucemia bovina (BLV) atenuado recombinante, caracterizado porque o vírus compreende: (i) pelo menos uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em: - uma mutação na sequência de ácido nucleico que codifica o motivo de sinalização YXXL mais N-terminal do domínio citoplasmático da subunidade transmembrânica (TM) da proteína de envelope, em que a mencionada mutação interrompe a atividade de transdução de sinal do motivo; e - uma mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV, em que a mencionada mutação elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X; e (ii) pelo menos uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em: - uma mutação em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo; e - uma mutação em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo.

[0013] Aspectos adicionais presente invenção fornecem: - BLV atenuado recombinante codificado pelo plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8166 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2B); - BLV atenuado recombinante codificado pelo plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8167 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2C); - BLV atenuado recombinante codificado pelo plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8713 em 25 de outubro de 2013 (vide a Tabela 2D); - ácido nucleico recombinante que codifica o BLV atenuado recombinante conforme descrito no presente; - vetor que compreende o ácido nucleico recombinante que codifica o BLV atenuado recombinante conforme descrito no presente; - plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8166 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2B); - plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8167 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2C); - plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8713 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2D); - ácido nucleico recombinante que codifica um BLV atenuado recombinante, em que o ácido nucleico recombinante compreende, consiste essencialmente ou consiste do inserto do plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8166 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2B); - ácido nucleico recombinante que codifica um BLV atenuado recombinante, em que o ácido nucleico recombinante compreende, consiste essencialmente ou consiste do inserto do plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8167 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2C); - ácido nucleico recombinante que codifica um BLV atenuado recombinante, em que o ácido nucleico recombinante compreende, consiste essencialmente ou consiste do inserto do plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8713 em 25 de outubro de 2013 (vide a Tabela 2D); - vetor que compreende um ácido nucleico recombinante que codifica um BLV atenuado recombinante, em que o ácido nucleico recombinante compreende, consiste essencialmente ou consiste do inserto do plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8166 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2B); - vetor que compreende um ácido nucleico recombinante que codifica um BLV atenuado recombinante, em que o ácido nucleico recombinante compreende, consiste essencialmente ou consiste do inserto do plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8167 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2C); - vetor que compreende um ácido nucleico recombinante que codifica um BLV atenuado recombinante, em que o ácido nucleico recombinante compreende, consiste essencialmente ou consiste do inserto do plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8713 em 25 de outubro de 2013 (vide a Tabela 2D); - célula hospedeira que compreende o BLV atenuado recombinante, o ácido nucleico recombinante, o vetor ou o plasmídeo conforme descrito no presente; - composição farmacêutica que compreende o BLV atenuado recombinante, o ácido nucleico recombinante, o vetor, o plasmídeo ou a célula hospedeira conforme descrito no presente; - BLV atenuado recombinante, ácido nucleico recombinante, vetor, plasmídeo ou célula hospedeira conforme descrito no presente para uso em medicamento; - BLV atenuado recombinante, ácido nucleico recombinante, vetor, plasmídeo, célula hospedeira ou composição farmacêutica conforme descrito no presente, para uso como vacina, particularmente para uso como vacina contra doença associada a BLV, mais particularmente para uso como vacina profilática contra doença associada a BLV; - uso do BLV atenuado recombinante, ácido nucleico recombinante, vetor, plasmídeo, célula hospedeira ou composição farmacêutica conforme descrito no presente, para fabricação de vacina, particularmente para fabricação de vacina contra doença associada a BLV, mais particularmente para fabricação de vacina profilática contra doença associada a BLV; - método de vacinação de pacientes necessitados da mencionada vacinação, particularmente vacinação contra doença associada a BLV, mais particularmente vacinação profilática contra doença associada a BLV, que compreende a administração de quantidade imunologicamente eficaz, mais particularmente de quantidade profilaticamente eficaz, do BLV atenuado recombinante, do ácido nucleico recombinante, do vetor, do plasmídeo, da célula hospedeira ou da composição farmacêutica conforme descrito no presente ao paciente; - BLV atenuado recombinante, ácido nucleico recombinante, vetor, plasmídeo, célula hospedeira ou composição farmacêutica conforme descrito no presente, para uso em tratamento de doença associada a BLV, particularmente para uso em prevenção (ou seja, tratamento preventivo, tratamento profilático e profilaxia) de doença associada a BLV; - uso do BLV atenuado recombinante, ácido nucleico recombinante, vetor, plasmídeo, célula hospedeira ou composição farmacêutica conforme descrito no presente, para fabricação de medicamento para o tratamento de doença associada a BLV, particularmente para fabricação de medicamento para prevenção de doença associada a BLV; - método de tratamento de doença associada a BLV em pacientes necessitados do mencionado tratamento, particularmente método de prevenção de doença associada a BLV em pacientes necessitados do mencionado tratamento, que compreende a administração de quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz do BLV atenuado recombinante, do ácido nucleico recombinante, do vetor, do plasmídeo, da célula hospedeira ou da composição farmacêutica conforme descrito no presente ao paciente; - animal não humano, preferencialmente mamífero não humano, de maior preferência bovídeo, de preferência ainda maior bovino, tal como gado bovino, ao qual foram administrados o BLV atenuado recombinante, o ácido nucleico recombinante, o vetor, o plasmídeo, a célula hospedeira ou a composição farmacêutica conforme descrito no presente; - método de obtenção de material animal não humano que compreende a obtenção de material do mencionado animal não humano ao qual o BLV atenuado recombinante, o ácido nucleico recombinante, o vetor, o plasmídeo, a célula hospedeira ou a composição farmacêutica conforme descrito no presente foi administrado e, opcionalmente, processamento adicional do mencionado material em um produto derivado de animal não humano; - material derivado de animal não humano ou produto derivado de animal não humano que pode ser obtido ou obtido diretamente do mencionado animal não humano ou que pode ser obtido ou obtido diretamente por meio do mencionado método; - o mencionado material derivado de animal não humano ou o mencionado produto derivado de animal não humano para uso como vacina, particularmente para uso como vacina contra doença associada a BLV, mais especificamente para uso como vacina profilática contra doença associada a BLV; - uso do mencionado material derivado de animal não humano ou do mencionado produto derivado de animal não humano para fabricação de vacina, particularmente para fabricação de vacina contra doença associada a BLV, mais especificamente para fabricação de vacina profilática contra doença associada a BLV; - método de vacinação de pacientes necessitados da mencionada vacinação, particularmente vacinação contra doença associada a BLV, mais particularmente vacinação profilática contra doença associada a BLV, que compreende a administração de quantidade imunologicamente eficaz, mais particularmente de quantidade profilaticamente eficaz, do mencionado material derivado de animal não humano ou do mencionado produto derivado de animal não humano ao paciente; - o mencionado material derivado de animal não humano ou o mencionado produto derivado de animal não humano para uso em tratamento de doença associada a BLV, particularmente para uso na prevenção de doença associada a BLV; - uso do mencionado material derivado de animal não humano ou do mencionado produto derivado de animal não humano para fabricação de medicamento para tratamento de doença associada a BLV, particularmente para fabricação de medicamento para prevenção de doença associada a BLV; e - método de tratamento de doença associada a BLV em pacientes necessitados do mencionado tratamento, particularmente método de prevenção de doença associada a BLV em pacientes necessitados da mencionada prevenção, que compreende a administração de quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz do mencionado material derivado de animal não humano ou do mencionado produto derivado de animal não humano ao paciente.

[0014] Estes e outros aspectos e realizações preferidas da presente invenção são descritos nos capítulos a seguir e nas reivindicações anexas. O objeto das reivindicações anexas é especificamente incorporado ao presente relatório descritivo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0015] Fig. 1: representações esquemáticas de pró-vírus de BLV. (A) Pró-vírus de BLV do tipo selvagem é inserido no plasmídeo pSP64 (Promega Corp., Madison WI, Estados Unidos; cat. n° P1241, conta Genbank n° X65328.2), que compreende Ori e ampR para propagação e seleção, respectivamente, em uma célula hospedeira bacteriana. Ori: origem de reprodução; ampR: marcador de resistência à ampicilina; LTR: repetições de terminal longo. Sítios Xba1 nas posições 6614 e 6731 e sítio Kpn1 na posição 2111 são sítios de restrição. (B) Estrutura do pró-vírus BLV do tipo selvagem. O pró-vírus é ladeado por duas sequências de repetição com terminal longo (LTRs) idênticas e compreende as estruturas de leitura aberta (ORFs) correspondentes a gag, pol, env, R3, G4, Tax e Rex. O quadro “mRNA” ilustra splicing alternativa dos precursores pré-mRNA para gerar as moléculas de mRNA correspondentes, em que éxons são marcados como linhas horizontais retas e íntrons intervenientes entre os éxons e divididos de precursores pré- mRNA são indicados como linhas horizontais em forma de V. As caixas brancas indicam o sítio das sequências de codificação de proteínas presentes nas moléculas de mRNA correspondentes e da região que codifica miRNAs de BLV. O quadro “proteínas” ilustra as diversas proteínas traduzidas das moléculas de mRNA de BLV. (C) Representação esquemática da porção de genoma de pró-vírus BLV do tipo selvagem que inclui a estrutura de leitura aberta env (caixa “ENV”), a parte da estrutura de leitura aberta R3 contida no éxon 3 de R3 (caixa “R3”), a parte da estrutura de leitura aberta G4 contida no éxon 2 de G4 (caixa “G4”) e a parte de estruturas de leitura aberta Tax e Rev contida no éxon 3 de Tax e Rex (caixas “Tax” e “Rex”). Os exemplos de posições genômicas de BLV indicados nas figuras são baseados na numeração da sequência de BLV adotada por Rice et al, 1987 (Sequence Analysis of the Bovine Leukemia Virus Genome em A. Burney e M. Mammerickx (Ed.), Enzootic Bovine Leukosis and Bovine Leukemia Virus, Martinus Nijhof, Leiden, Países Baixos, págs. 115-144). Particularmente, o desenho indica de 5’ a 3’: o códon nas posições 6073-6075 que codifica o motivo de sinalização YXXL mais N-terminal do domínio citoplasmático da subunidade transmembrânica (TM) da proteína de envelope; o códon de parada env (TGA) nas posições 6160-6162; a região de microRNA (representada como QQQ) interposta entre o códon de parada env e o éxon 3 de R3; a sequência AAAG/GTCC (posições 6809-6816) que define o limite íntron 2 - éxon 3 de R3 e o primeiro nucleotídeo do éxon 3 de R3 na posição 6813; a sequência TTCC/AGCC (posições 6857-6864) que define o limite íntron 1 - éxon 2 de G4 e o primeiro nucleotídeo de éxon 2 de G4 na posição 6861; o códon de parada R3 (TAA) nas posições 6894-6896; a sequência TAAG/CAAG (posições 7038-7045) que define o limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex e o primeiro nucleotídeo do éxon 3 de Tax/Rex na posição 7042; e o códon de parada G4 (TGA) nas posições 7103-7105. (D) Exemplo de sequência genômica de BLV, da posição 5790 à posição 7409, conforme reproduzido de Rice et al 1987, acima (SEQ ID NO: 16). O códon TAT nas posições 6073-6075 encontra-se sublinhado. (E) Outra representação de uma estrutura esquemática de pró-vírus BLV do tipo selvagem. (F) Estrutura esquemática do pró-vírus “BLVDX”. O pró-vírus BLVDX compreende exclusões em ORFs de R3 e G4. (G) Estrutura esquemática do pró-vírus “BLV6073”. O pró-vírus BLV6073 compreende uma substituição na posição 6073 em um motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAM) localizado na proteína transmembrana gp30 do envelope. (H) Estrutura esquemática do pró- vírus “BLV6073DX”. O pró-vírus BLV6073DX compreende a mutação na posição 6073 de BLV6073 e as exclusões nos ORFs R3 e G4 de BLVDX. (I) Estrutura esquemática do pró-vírus “BLV6073GPDX”. O pró-vírus BLV6073DX compreende a mutação na posição 6073 de BLV6073 e deleção nos ORFs de miRNA, R3 e G4. (J) Representação esquemática das mutações específicas presentes em BLV6073DX exibidas na representação esquemática de um genoma de pró-vírus de BLV do tipo selvagem conforme exibido na Fig. 1C. As posições genômicas de BLV são baseadas na numeração da sequência de BLV adotada por Rice et al, 1987, acima. O pró-vírus BLV6073DX conduz uma substituição de nucleotídeo T na posição 6073 da sequência de ácido nucleico de BLV por um nucleotídeo G e compreende adicionalmente um segmento de oligonucleotídeos composto de dois oligonucleotídeos hibridizados com as sequências 5’-CTAGAAAGCTTG-3’ (SEQ ID NO: 1) e 5’-GATCCAAGCTTT-3’ (SEQ ID NO: 2), respectivamente, substituindo o segmento de ácidos nucleicos entre o sítio XbaI na posição 6614 e o sítio BamHI na posição 6997 da sequência de ácido nucleico de BLV.

[0016] Fig. 2: infectividade e reação imunológica contra pró-vírus BLV6073DX recombinante e pró-vírus BLV do tipo selvagem. Vacas foram infectadas com pró-vírus BLV6073DX recombinante (D) ou pró-vírus do tipo selvagem (WT) e mantidas em um rebanho de 74-82 animais, dentre os quais 15-30% foram naturalmente infectados com linhagem argentina de BLV do tipo selvagem. Cinética, expressa na forma de percentual de reatividade em soro (em comparação com controle negativo) em função do tempo (A), e títulos de anticorpos expressos na forma de títulos de anticorpos normalizados (B) da reação de anticorpos antivirais foram determinados por meio de teste ELISA competitivo (teste de bloqueio de soro de leucose bovina ELISA, Institut Pourquier). O teste mede a densidade óptica (OD) a 450 nm. A reação de anticorpo antiviral é expressa na forma de percentual da reatividade em soro em comparação com controle negativo e é calculada na forma de razão entre a OD da amostra de teste e a OD do controle negativo (100% indica que a razão entre OD da amostra e OD de controle negativo é 1). A amostra é considerada positiva desde que essa razão seja mais alta que o limite definido arbitrariamente em 40%. Títulos de anticorpos são expressos na forma de diluição invertida do soro que gera 50% da OD máxima e títulos de anticorpos normalizados são calculados como a razão entre a diluição invertida que gera 50% da OD máxima da amostra de teste e a diluição invertida que gera 50% da OD máxima de um controle positivo selecionado arbitrariamente.

[0017] Fig. 3: nível de reprodução de BLV6073DX recombinante contra pró-vírus do tipo selvagem. Vacas foram infectadas com pró-vírus BLV6073DX recombinante (D) ou pró-vírus do tipo selvagem (WT) e mantidas em um rebanho de 74-82 animais, dentre os quais 15-30% foram naturalmente infectados com linhagem argentina de BLV do tipo selvagem. Cargas pró-virais foram determinadas por meio de medição das cópias pró-virais em células mononucleares do sangue periférico (PBMC). A carga pró-viral é expressa na forma de número de cópias pró-virais por 100 PBMCs.

[0018] Fig. 4: representação esquemática da amplificação de PCR utilizada para identificar animais vacinados. (A) Foram projetados primers que ladeiam a deleção em ORFs de R3 e G4 de pró-vírus BLV6073DX. (B) Dependendo da presença da deleção, podem ser observados diferentes amplicons após a eletroforese de gel dos produtos de amplificação de PCR. A presença dos amplicons grandes e pequenos identifica animais vacinados (b) e infectados do tipo selvagem (a), respectivamente. Detecção dos dois amplicons revela que um animal vacinado é infeccionado com um BLV do tipo selvagem (c). A ausência de amplicons indica que o animal não foi vacinado nem infectado com BLV do tipo selvagem (d).

[0019] Fig. 5: efeito de vacinação com pró-vírus BLV6073DX recombinante sobre a infecção por BLV do tipo selvagem em condições de rebanho. Vacas foram infectadas com pró-vírus BLV6073DX recombinante (D) ou pró-vírus do tipo selvagem (WT) e mantidas em um rebanho de 74-82 animais, dentre os quais 15-30% foram naturalmente infectados com linhagem argentina de BLV do tipo selvagem (ArgWT). Bezerros (C84 e C87) nasceram de vacas infectadas com pró-vírus BLV6073DX recombinante. Amplificação por PCR na ausência de DNA (água) foi realizada na forma de controle (C). Realizou-se amplificação por meio de PCR utilizando primers que ladeiam a deleção em ORFs R3 e G4 de pró-vírus BLV6073DX e são exibidos os amplicons.

[0020] Fig. 6: efeito de vacinação com pró-vírus BLV6073DX recombinante mediante desafio por BLV do tipo selvagem. Animais infectados com pró-vírus BLV6073DX recombinante (n° 322, n° 357 e n° 360) ou animais não infectados (n° 77, n° 83 e n° 85) foram desafiados com pró-vírus de BLV do tipo selvagem por meio de injeção de células HeLa transfectadas com plasmídeo de pró-vírus de BLV do tipo selvagem. Infecção com BLV do tipo selvagem foi determinada por meio de PCR abrigado utilizando primers de BLV (A). Primers de actina foram utilizados como controle (B). São exibidos amplicons.

[0021] Fig. 7: infectividade de pró-vírus BLVGPX recombinante in vivo. Vacas (A) ou carneiros (B) foram infectados com pró-vírus BLVGPX recombinante (GPX) ou pró-vírus do tipo selvagem (WT). Cargas pró-virais foram determinadas por meio de medição das cópias pró-virais em células mononucleares do sangue periférico (PBMC). A carga pró-viral é expressa na forma de número de cópias pró-virais por 100 PBMCs.

[0022] Fig. 8: infecção de BLV do tipo selvagem em vaca n° 269 inoculada por BLV6073. Representação esquemática da posição de pares de primers 6073S+7049R (1), 5719S+7049R (2) e 5719S+7000R (3) em sequências do tipo selvagem (“WT”) e pBLV6073 (“Mutante 6073”) (A). Produtos de amplificação obtidos por meio de PCR utilizando os pares de primers 6073S+7049R (linha 1), 5719S+7049R (linha 2) e 5719S+7000R (linha 3) sobre ácidos nucleicos isolados do sangue da vaca n° 269 vacinada com pBLV6073 (Kerkhofs et al, 2000, acima) em 18 meses (quadro esquerdo) e 24 meses (quadro direito) após o desafio com BLV do tipo selvagem (B).

[0023] Fig. 9: infecção de BLV do tipo selvagem na vaca n° 269 inoculada por BLV6073. Leituras de sequências das posições 6064 a 6084 da sequência de BLV sobre ácidos nucleicos isolados do sangue da vaca n° 269 vacinada com pBLV6073 (Kerkhofs et al, 2000, acima) em 18 meses (quadro superior) e 24 meses (quadro intermediário) após o desafio com BLV do tipo selvagem e sobre gene env controle de um vírus BLV do tipo selvagem (quadro inferior). As setas indicam o nucleotídeo na posição de nucleotídeo 6073.

[0024] Fig. 10: representação esquemática da introdução de pBLV6073GPDX em Bacillus subtilis. Sequências amyEb, lysA e amyEF foram introduzidas em pBLV6073GPDX e a construção resultante foi recombinada em sítio amyE de linhagem 168 de Bacillus subtilis (amyE+ lysA-), resultando em fenótipo amyE- lysA+.

[0025] Fig. 11: sequência genômica completa A-H de pró-vírus BLV 344 de pBLV344H (SEQ ID NO: 39). As posições 3159-11879 na sequência exibida na Fig. 11 correspondem à sequência do pró-vírus (incluindo neste ponto os 211 nucleotídeos com extremidade 5’ da região U3 5’ do sítio de início da transcrição). O códon TAT nas posições 6073-6075 do pró-vírus (posições 9442-9444 na sequência exibida na Fig. 11) é sublinhado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0026] Da forma utilizada no presente, as formas no singular “um”, “uma” e “o/a” incluem referências no singular e no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0027] As expressões “que compreende”, “compreende” e “composto de”, da forma utilizada no presente, são sinônimas de “que inclui”, “inclui”, “que contém” ou “contém” e são inclusivas ou com significado aberto, sem excluir membros, elementos ou etapas de método adicionais não indicadas. As expressões também englobam “que consiste em” e “que consiste essencialmente de”, que possuem significados bem estabelecidos na terminologia de patentes.

[0028] A indicação de faixas numéricas pelas suas extremidades inclui todos os números e frações somadas dentro das faixas correspondentes, bem como as extremidades indicadas.

[0029] As expressões “cerca de” ou “aproximadamente”, da forma utilizada no presente e com referência a um valor mensurável tal como um parâmetro, quantidade, duração temporal e similares, destinam-se a englobar variações do valor especificado, tais como variações de +/- 10% ou menos, preferencialmente +/- 5% ou menos, de maior preferência +/- 1% ou menos e, de preferência ainda maior, +/- 0,1% ou menos do valor especificado, desde que essas variações sejam apropriadas para realização na presente invenção. Deve-se compreender que o valor a que se refere a expressão “cerca de” também é específica e preferencialmente descrito.

[0030] Embora as expressões “um ou mais” ou “pelo menos um”, tal como um ou mais membros ou pelo menos um membro de um grupo de membros, sejam intrinsecamente claras, por meio de exemplificação adicional, as expressões englobam, entre outros, referência a qualquer um dos mencionados membros ou a quaisquer dois ou mais dos mencionados membros, tais como, por exemplo, quaisquer >3, >4, >5, >6 ou >7 etc. dos mencionados membros e até todos os mencionados membros. Em outro exemplo, “um ou mais” ou “pelo menos um” pode indicar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais.

[0031] A discussão dos antecedentes da presente invenção é incluída para explicar o contexto da presente invenção. Isso não deve ser considerado admissão de que qualquer parte do material indicado foi publicada, conhecida ou parte do conhecimento geral comum em qualquer país na data de prioridade de qualquer uma das reivindicações.

[0032] Ao longo de todo o presente relatório descritivo, diversas publicações, patentes e relatórios descritivos de patentes publicados são indicados por uma citação de identificação. Todos os documentos mencionados no presente relatório descritivo são integralmente incorporados ao presente como referência. Particularmente, os ensinamentos ou seções desses documentos indicados especificamente são incorporados como referência.

[0033] A menos que definido em contrário, todos os termos utilizados na descrição da presente invenção, incluindo termos técnicos e científicos, possuem o significado compreendido comumente pelos técnicos comuns no assunto ao qual pertence a presente invenção. Por meio de orientação adicional, definições de termos são incluídas para melhor apreciação do ensinamento da presente invenção. Quando termos específicos forem definidos com relação a um aspecto específico da presente invenção ou uma realização específica da presente invenção, essa conotação destina-se a ser aplicada ao longo de todo o presente relatório descritivo, ou seja, também no contexto de outros aspectos ou realizações da presente invenção, a menos que definido em contrário.

[0034] Nas passagens a seguir, diferentes aspectos ou realizações da presente invenção são definidos com mais detalhes. Cada aspecto ou realização definido desta forma pode ser combinado com qual(is)quer outro(s) aspecto(s) ou realização(ões), a menos que indicado claramente em contrário. Particularmente, qualquer característica indicada como sendo preferida ou vantajosa pode ser combinada com qual(is)quer outra(s) característica(s) indicada(s) como sendo preferida(s) ou vantajosa(s).

[0035] Ao longo de todo o presente relatório descritivo, referência a “uma realização” ou “realização” indica que uma característica, estrutura ou função específica descrita com relação à realização é incluída em pelo menos uma realização da presente invenção. Desta forma, inclusões das expressões “em uma realização” ou “na realização” em vários pontos ao longo de todo o presente relatório descritivo podem referir-se, mas não necessariamente todas se referem, à mesma realização. Além disso, as características, estruturas ou funções específicas podem ser combinadas de qualquer forma adequada, como será evidente para os técnicos no assunto a partir do presente relatório descritivo, em uma ou mais realizações. Além disso, embora algumas realizações descritas no presente incluam algumas mas não outras características incluídas em outras realizações, combinações de características de diferentes realizações destinam-se a encontrar-se dentro do escopo da presente invenção e formam diferentes realizações, como seria compreendido pelos técnicos no assunto. Nas reivindicações anexas, por exemplo, qualquer uma das realizações reivindicadas pode ser utilizada em qualquer combinação.

[0036] Da forma indicada, os inventores concluíram que, combinando certas mutações no genoma de BLV, pode-se obter um BLV atenuado útil para a produção de vacinas grandemente aprimoradas. Esses BLVs atenuados são infecciosos, de forma a facilitar a sua introdução nos pacientes a serem vacinados, mas reproduzem-se em níveis desejavelmente baixos nos pacientes vacinados.

[0037] Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece um vírus da leucemia bovina (BLV) atenuado recombinante, caracterizado porque o vírus compreende: - pelo menos uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em: - uma mutação na sequência de ácido nucleico que codifica o motivo de sinalização YXXL mais N-terminal do domínio citoplasmático da subunidade transmembrânica (TM) da proteína de envelope, em que a mencionada mutação interrompe a atividade de transdução de sinal do motivo; e - uma mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV, em que a mencionada mutação elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X; e - pelo menos uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em: - uma mutação em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo; e - uma mutação em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo.

[0038] Inesperadamente, as combinações das mutações no BLV recombinante resultante, em vez de serem prejudiciais para o BLV recombinante (por exemplo, destruindo completamente a sua infectividade em animais, particularmente em gado bovino), preserva níveis satisfatórios de infectividade do BLV recombinante e reduz ou elimina a sua patogenicidade, de forma a atingir vacinas atenuadas grandemente aprimoradas em animais, particularmente em gado bovino.

[0039] Em certas realizações preferidas, o BLV atenuado recombinante pode compreender: - pelo menos uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em: - a mutação na sequência de ácido nucleico que codifica o motivo de sinalização YXXL mais N-terminal do domínio citoplasmático da subunidade transmembrânica (TM) da proteína de envelope, em que a mencionada mutação interrompe a atividade de transdução de sinal do motivo; e - a mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV, em que a mencionada mutação elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X; e - as duas mutações a seguir: - a mutação em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo; e - a mutação em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo.

[0040] Em certas realizações preferidas adicionais, o BLV atenuado recombinante pode compreender: - as duas mutações a seguir: - a mutação na sequência de ácido nucleico que codifica o motivo de sinalização YXXL mais N-terminal do domínio citoplasmático da subunidade transmembrânica (TM) da proteína de envelope, em que a mencionada mutação interrompe a atividade de transdução de sinal do motivo; e - a mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV, em que a mencionada mutação elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X; e - pelo menos uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em: - a mutação em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo; e - a mutação em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo.

[0041] Em certas realizações particularmente preferidas, o BLV atenuado recombinante pode compreender: a mutação na sequência de ácido nucleico que codifica o motivo de sinalização YXXL mais N-terminal do domínio citoplasmático da subunidade transmembrânica (TM) da proteína de envelope, em que a mencionada mutação interrompe a atividade de transdução de sinal do motivo, a mutação de G4 restringe a propagação do BLV in vivo e a mutação de R3 restringe a propagação do BLV in vivo. Inesperadamente, embora a proteção atingida pelos pró-vírus de BLV atenuados existentes anteriormente pBLVDX e pBLV6073 tenha sido relatada como não suficientemente eficaz e comparativamente de curto prazo, o BLV atenuado recombinante de acordo com essas realizações, que combina mutações do motivo de sinalização YXXL N-terminal do domínio citoplasmático de TM da proteína de envelope, em G4 e em R3, tal como BLV6073DX descrito em outros pontos do presente relatório descritivo, é altamente eficaz e fornece proteção a longo prazo. Surpreendentemente, a combinação das mutações, em vez de ser prejudicial para o BLV recombinante (por exemplo, destruindo completamente a sua infectividade em animais, tal como a infectividade de BLV6073DX em animais, particularmente em gado bovino), preserva níveis satisfatórios de infectividade do BLV recombinante e reduz ou elimina a sua patogenicidade, de forma a atingir vacinas atenuadas grandemente aprimoradas em animais, particularmente em gado bovino.

[0042] Em certas realizações particularmente preferidas, o BLV atenuado recombinante pode compreender: a mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV, em que a mencionada mutação elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X, a mutação em G4 restringe a propagação do BLV in vivo e a mutação em R3 restringe a propagação do BLV in vivo.

[0043] Em certas realizações preferidas adicionais, o BLV atenuado recombinante pode compreender: a mutação na sequência de ácido nucleico que codifica o motivo de sinalização YXXL mais N-terminal do domínio citoplasmático da subunidade transmembrânica (TM) da proteína de envelope, em que a mencionada mutação interrompe a atividade de transdução de sinal do motivo, a mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV, a mencionada mutação elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X e a mutação de G4 restringe a propagação do BLV in vivo.

[0044] Em certas realizações preferidas adicionais, o BLV atenuado recombinante pode compreender: a mutação na sequência de ácido nucleico que codifica o motivo de sinalização YXXL mais N-terminal do domínio citoplasmático da subunidade transmembrânica (TM) da proteína de envelope, em que a mencionada mutação interrompe a atividade de transdução de sinal do motivo, a mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV, a mencionada mutação elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X e a mutação de R3 restringe a propagação do BLV in vivo.

[0045] Em ainda outras realizações particularmente preferidas, o BLV atenuado recombinante pode compreender: a mutação na sequência de ácido nucleico que codifica o motivo de sinalização YXXL mais N-terminal do domínio citoplasmático da subunidade transmembrânica (TM) da proteína de envelope, em que a mencionada mutação interrompe a atividade de transdução de sinal do motivo, a mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV, a mencionada mutação elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X, a mutação em G4 restringe a propagação do BLV in vivo e a mutação em R3 restringe a propagação do BLV in vivo.

[0046] Em várias realizações, o BLV atenuado recombinante pode compreender combinações de mutações conforme individualizado na Tabela 1.TABELA 1

[0047] Projeto de certas realizações de pró-vírus BLV atenuados recombinantes conforme ensinado no presente:Numeração consecutiva unicamente para os propósitos da Tabela 1.

[0048] Para os propósitos da Tabela 1, “mut TM” indica a mutação na sequência de ácido nucleico que codifica o motivo de sinalização YXXL mais N-terminal do domínio citoplasmático da subunidade transmembrânica (TM) da proteína de envelope, em que a mencionada mutação interrompe a atividade de transdução de sinal do motivo; “mut G4” indica a mutação em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo; “mut R3” indica a mutação em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo; e “mut microRNA” indica a mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV, em que a mencionada mutação elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X.

[0049] Realizações preferidas dos individualizados na Tabela 1 podem ser as realizações n° 3 e n° 6 a n° 9, de maior preferência n° 3, n° 6 e n° 9, de preferência ainda maior n° 3 e n° 9.

[0050] A expressão “vírus da leucemia bovina” ou “BLV” indica um retrovírus B-linfotrópico oncogênico de ocorrência natural que infecta principalmente gado bovino, preferencialmente gado bovino doméstico. Ele é membro da subfamília Oncovirinae e pertence ao gênero Deltarretrovírus, que também inclui os vírus da leucemia de células T humanas tipos 1 e 2 (HTLV-1 e 2). A expressão engloba BLV de toda e qualquer origem geográfica, tal como, sem limitações, BLV originário de (por exemplo, isolado ou que pode ser isolado de gado bovino em) Argentina, Bélgica, Brasil, Costa Rica, França, Irã, Japão, Rússia, Ucrânia ou Estados Unidos. A expressão engloba ainda toda e qualquer variante, clone, linhagem, isolado e genótipo de BLV. Uma análise útil, mas não limitadora, de genótipos e isolados de BLV previamente identificados, que podem ser úteis na realização da presente invenção, é encontrada, entre outros, em Rodriguez et al 2009, (J. Gen. Virol. 90: 2788-97) e referências ali mencionadas.

[0051] Mediante infecção de células hospedeiras, preferencialmente linfócitos B, o genoma de +mRNA viral sofre transcrição reversa em DNA e é integrado na forma de pró-vírus ao genoma da célula hospedeira infectada com BLV. O pró-vírus pode persistir integrado ao genoma da célula hospedeira, de forma a induzir infecção persistente ou latente com resultados diversos, que variam de linfose assintomática a persistente, linfossarcoma e linfoma. BLV pode ser transmitido por meio da transferência de células infectadas com BLV (tais como, por exemplo, linfócitos B e monócitos/macrófagos) presentes, por exemplo, em sangue ou leite. As vias de transmissão podem incluir procedimentos de administração de gado bovino que envolvem a transferência de sangue infectado, tais como a retirada de chifres, marcação das orelhas, palpação retal ou o uso de agulhas infectadas.

[0052] Um exemplo não limitador de BLV é o clone de BLV 344 isolado na forma de pró-virus de um tumor induzido por BLV (Van den Broeke et al, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85: 9263-9267). O pró-vírus BLV 344 é disponível, entre outros, clonado no plasmídeo pSP64, de forma a gerar o plasmídeo pBLV344H conforme descrito em Willems et al, 1993 (J. Virol. 67: 4078-4085). O plasmídeo pBLV344H foi depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8165 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2A). A sequência completa do pró-vírus BVL 344, conforme sequenciado a partir do plasmídeo pBLV344H, é exibida na Fig. 11 A-H. Outro exemplo não limitador de BLV é conforme descrito por Sagata et al, 1985 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82: 677-681). Um exemplo não limitador adicional de BLV é conforme sequenciado por Rice et al, 1987 (Sequence Analysis of the Bovine Leukemia Virus Genome em A. Burney e M. Mammerickx (Ed.), Enzootic Bovine Leukosis and Bovine Leukemia Virus, Martinus Nijhof, Leiden, Países Baixos, págs. 115-144). Exemplo não limitador adicional de BLV inclui o BLV depositado com o número de acesso da Coleção Norte-Americana de Cultivo de Tipos ATCC® VR-1315.

[0053] Em certas realizações, o BLV para conduzir os aspectos e realizações da presente invenção pode ser o isolado de BLV 344 conforme descrito por Van den Broeke et al, 1988, acima. Da forma mencionada, o pró- vírus BLV344 foi depositado no plasmídeo pBLV344H com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8165 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2A).

[0054] Em algumas outras realizações, o BLV para realização da presente invenção pode ser o isolado de BLV LS2 (sequência genômica pró- viral completa indicada com a conta GenBank n° HE967302.1); isolado de BLV LS3 (sequência genômica pró-viral completa indicada com a conta GenBank n° HE967303.1); isolado de BLV LS1 (sequência genômica pró-viral completa indicada com a conta GenBank n° HE967301.1); isolado de BLV cuja sequência genômica completa é indicada com a conta GenBank n° NC_001414.1; isolado de BLV cuja sequência de genes gag e pol é indicada com a conta GenBank n° M10987.1; isolado de BLV cuja sequência de região de gene env e pós-env é indicada com a conta GenBank n° K02251.1; isolado de BLV cuja sequência genômica completa é indicada com a conta GenBank n° AF033818.1); linhagem de BLV Arg41 (sequência genômica completa indicada com a conta GenBank n° FJ914764.1); isolado de BLV cuja sequência genômica completa é indicada com a conta GenBank n° AF257515.1; isolado de BLV cuja sequência genômica completa é indicada com a conta GenBank n° K02120.1; isolado de BLV cuja sequência genômica completa é indicada com a conta GenBank n° D00647.1); ou isolado de BLV pBLV913 (sequência genômica pró-viral completa indicada com a conta GenBank n° EF600696.1).

[0055] O termo “recombinante” é geralmente utilizado para indicar que o material (por exemplo, um vírus, ácido nucleico, construção genética ou proteína) foi alterado por meios técnicos (ou seja, não naturais) por meio de intervenção humana. A expressão “ácido nucleico recombinante” pode designar comumente ácidos nucleicos compostos de segmentos unidos entre si utilizando tecnologia de DNA recombinante. Da forma utilizada no presente, o termo pode indicar preferencialmente material (tal como um vírus, ácido nucleico, construção genética ou proteína) que tenha sido alterado por meios técnicos de mutagênese.

[0056] O termo “atenuado” é bem conhecido no campo de vacinação e, quando utilizado em combinação com vírus, preferencialmente vírus da leucemia bovina, indica uma variante ou mutante de vírus que exibe grau substancialmente mais baixo de virulência em comparação com vírus do tipo selvagem, preferencialmente uma variante ou mutante de vírus que exibe propagação reduzida no hospedeiro (ou seja, in vivo), por exemplo, devido à menor velocidade de crescimento e/ou nível reduzido de reprodução em comparação com um vírus do tipo selvagem. A propagação de vírus atenuado no hospedeiro (ou seja, in vivo) pode ser de pelo menos cerca de dez vezes, tal como pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, preferencialmente pelo menos cerca de 100 vezes menos que um vírus do tipo selvagem.

[0057] Métodos apropriados de medição da propagação de vírus, particularmente BLV atenuado ou BLV do tipo selvagem, no hospedeiro incluem, sem limitações, a determinação das cargas pró-virais no hospedeiro desafiado. A quantidade de cópias pró-virais de BLV pode ser determinada, por exemplo, utilizando metodologia apropriada, tal como PCR quantitativa, por um dado número, por exemplo 100, de células mononucleares do sangue periférico em um ou mais momentos dados, ou seja, em função do tempo, após o desafio do hospedeiro, particularmente gado bovino tal como vaca, com o vírus. Vide o Exemplo 3 em busca de aplicação não limitadora específica desta abordagem.

[0058] Tipicamente, esse vírus atenuado não induzirá sintomas de infecção viral ou induzirá apenas sintomas suaves mediante infecção, preferencialmente por meio de vacinação de um paciente, mas tipicamente não ocorrerão sintomas severos de infecção viral no paciente infectado, preferencialmente vacinado.

[0059] Os termos “mutação”, “mutagênese” e similares designam geralmente alterações das sequências de ácidos nucleicos. Essas alterações podem ocorrer naturalmente, por exemplo, devido a erros que ocorrem durante a reprodução de ácidos nucleicos, mitose ou meiose, ou devido à inserção de transpossons ou sequências virais. Elas podem também ser introduzidas artificialmente (ou seja, de forma não natural) por meios técnicos por intervenção humana, tal como por substâncias químicas, irradiação ou tecnologia de DNA recombinante. Da forma utilizada no presente, os termos preferencialmente designam essas mutações “artificiais”.

[0060] As mutações em geral podem não ter efeito (por exemplo, ser mutações silenciosas) ou podem ter efeito sobre um dado produto de transcrição e/ou produto de tradução; elas podem resultar, por exemplo, na ausência de geração de produto de tradução e/ou transcrição ou podem resultar na elaboração de um produto de transcrição e/ou tradução que substancialmente não funciona ou não funciona adequadamente (ou seja, não como o produto do tipo selvagem).

[0061] No presente relatório descritivo, o termo “mutação” pode particularmente indicar uma alteração de sequências no ácido nucleico de um BLV (ou seja, BLV que sofreu mutação, mutante de BLV) em comparação com o ácido nucleico de um BLV que não tenha sofrido mutação dessa forma, tal como, preferencialmente, em comparação com o ácido nucleico de um BLV do tipo selvagem. BLV “do tipo selvagem”, da forma utilizada no presente, pode designar adequadamente BLV patogênico de ocorrência natural encontrado ou isolado de hospedeiros infectados com BLV. A expressão também inclui pró- vírus de BLV do tipo selvagem, suas formas isoladas e construções genéticas que os contêm.

[0062] Opcionalmente, um BLV que conduz a(s) mutação(ões) ensinada(s) pela presente invenção pode também compreender uma ou mais mutações diferentes não especificadas no presente, tais como uma ou mais mutações diferentes em comparação com BLV do tipo selvagem. Essas uma ou mais mutações diferentes podem apresentar-se em qualquer um dos genes BLV, tal como em um ou mais dentre os genes gag, pol, env, microRNA, R3, G4, Tax e Rex. Preferencialmente, essas uma ou mais mutações diferentes não interferem com a reprodução do BLV; particularmente, essas uma ou mais mutações diferentes não restringem a propagação do BLV in vivo.

[0063] Mutações que afetam um dado polipeptídeo BLV (tais como o nível de produção e/ou a sequência de aminoácidos do polipeptídeo) podem residir em sequência(s) de ácidos nucleicos compreendida(s) na codificação de estrutura de leitura aberta (ORF) para o mencionado polipeptídeo e/ou essas mutações podem residir em sequência(s) de ácidos nucleicos compreendida(s) nas partes sem codificação (regiões não traduzidas) do RNA mensageiro (mRNA) que codifica o mencionado polipeptídeo e/ou essas mutações podem residir em sequência(s) de ácidos nucleicos compreendida(s) em RNA precursor (pré-mRNA) que codifica o mencionado polipeptídeo, mas removida(s) (dividida(s)) do mRNA maduro que codifica o mencionado polipeptídeo.

[0064] “Estrutura de leitura aberta” ou “ORF”, da forma utilizada no presente, designa uma sucessão de trios de nucleotídeos de codificação (códons) a partir de um códon de início de tradução até um códon de término de tradução intrinsecamente conhecido, sem conter nenhum códon de término de tradução em quadro interno e potencialmente capaz de codificar uma proteína ou polipeptídeo. Referência ao “nível” de um polipeptídeo BLV engloba a quantidade e/ou a disponibilidade (tal como a disponibilidade de realização da sua função biológica) do polipeptídeo BLV, por exemplo, em uma célula, tecido, órgão ou organismo.

[0065] Por meio de um exemplo e sem limitações, uma mutação em G4 conforme pretendido no presente, que pode também ser indicada como mutação no gene G4, que afeta o polipeptídeo G4 (por exemplo, o nível de produção e/ou a sequência de aminoácidos do polipeptídeo G4) pode residir em sequência(s) de ácidos nucleicos compreendida(s) na ORF que codifica o polipeptídeo G4 e/ou essa mutação pode residir em sequência(s) de ácidos nucleicos compreendida(s) nas partes sem codificação do mRNA que codifica o polipeptídeo G4 e/ou essa mutação pode residir em sequência(s) de ácidos nucleicos compreendida(s) em pré-mRNA que codifica o polipeptídeo G4, mas removida(s) (dividida(s)) do mRNA maduro que codifica o polipeptídeo G4. Desta forma, “mutação em G4” que pode ser indicada como “mutação no gene G4” pode também ser indicada como mutação na sequência de ácido nucleico que codifica G4, pois a mutação pode ser a sequência de ácido nucleico que codifica pré-mRNA de G4, mRNA de G4 e/ou ORF de G4.

[0066] De forma similar, por meio de um exemplo e sem limitações, uma mutação em R3 conforme pretendido no presente, que pode também ser indicada como mutação no gene R3, que afeta o polipeptídeo R3 (por exemplo, o nível de produção e/ou a sequência de aminoácidos do polipeptídeo R3) pode residir em sequência(s) de ácidos nucleicos compreendida(s) na ORF que codifica o polipeptídeo R3 e/ou essa mutação pode residir em sequência(s) de ácidos nucleicos compreendida(s) nas partes sem codificação do mRNA que codifica o polipeptídeo R3 e/ou essa mutação pode residir em sequência(s) de ácidos nucleicos compreendida(s) em pré- mRNA que codifica o polipeptídeo R3, mas removida(s) (dividida(s)) do mRNA maduro que codifica o polipeptídeo R3. Desta forma, “mutação em R3”, que pode ser indicada como “mutação no gene R3”, pode também ser indicada como mutação na sequência de ácido nucleico que codifica R3, pois a mutação pode ser a sequência de ácido nucleico que codifica pré-mRNA de R3, mRNA de R3 e/ou ORF de R3.

[0067] Qualquer tipo de mutação que atinge os efeitos pretendidos, tais como afetar um dado polipeptídeo de BLV (por exemplo, o nível de produção e/ou a sequência de aminoácidos do polipeptídeo), é contemplado no presente. Mutações apropriadas podem incluir, por exemplo, exclusões, inserções e/ou substituições. O termo “deleção” indica uma mutação na qual um ou mais nucleotídeos, tipicamente nucleotídeos consecutivos, de um ácido nucleico são removidos, ou seja, excluídos do ácido nucleico. O termo “inserção” indica uma mutação na qual um ou mais nucleotídeos, tipicamente nucleotídeos consecutivos, são adicionados, ou seja inseridos, em um ácido nucleico. O termo “substituição” designa uma mutação na qual cada um dentre um ou mais nucleotídeos de um ácido nucleico é independentemente substituído por outro nucleotídeo.

[0068] Em certas realizações, uma mutação pode introduzir um códon de parada prematura dentro do quadro na codificação de ORF para um dado polipeptídeo de BLV. Esse códon de parada prematura pode gerar a produção de uma forma truncada C terminal do mencionado polipeptídeo (isso pode preferencialmente afetar, tal como reduzir ou eliminar, algumas ou todas as funções biológicas do polipeptídeo) ou, especialmente quando o códon de parada é introduzido perto (por exemplo, a cerca de vinte ou menos ou cerca de dez ou menos aminoácidos a jusante) do códon de início de tradução da ORF, o códon de parada pode eliminar efetivamente a produção do polipeptídeo. Várias formas de introdução de um códon de parada prematura dentro do quadro na ORF que codifica o polipeptídeo BLV são evidentes para os técnicos no assunto. Por exemplo, mas sem limitações, uma inserção, deleção ou substituição apropriada de um ou mais nucleotídeos no ORF podem introduzir o códon de parada prematura dentro do quadro.

[0069] Em outras realizações, uma mutação pode introduzir uma alteração de quadro (por exemplo, uma alteração de +1 ou +2 quadros) na ORF que codifica um dado polipeptídeo de BLV. Tipicamente, essa alteração de quadro pode gerar um códon de parada anteriormente fora de quadro a jusante da mutação que se torna um códon de parada dentro do quadro. Desta forma, essa alteração de quadro pode gerar a produção de uma forma do polipeptídeo que possui uma parte truncada C terminal alternativa (isso pode preferencialmente afetar, tal como reduzir ou eliminar, algumas ou todas as funções biológicas do polipeptídeo) ou, especialmente quando a mutação é introduzida perto (por exemplo, a cerca de vinte ou menos ou cerca de dez ou menos aminoácidos a jusante) do códon de início de tradução da ORF, a alteração de quadro pode eliminar efetivamente a produção do polipeptídeo. Várias formas de introdução de uma alteração de quadro na ORF que codifica o polipeptídeo de BLV são evidentes para os técnicos no assunto. Por exemplo mas sem limitações, uma inserção ou deleção apropriada de um ou mais (não múltiplo de três) nucleotídeos na ORF pode gerar alteração de quadro.

[0070] Em realizações adicionais, uma mutação pode excluir pelo menos uma parte da codificação de ORF para um dado polipeptídeo de BLV. Essa deleção pode gerar a produção de uma forma truncada N-terminal, uma forma truncada C terminal e/ou uma forma internamente excluída do mencionado polipeptídeo (isso pode preferencialmente afetar, tal como reduzir ou eliminar, algumas ou todas as funções biológicas do polipeptídeo). Preferencialmente, a deleção pode remover cerca de 20% ou mais ou cerca de 50% ou mais dos nucleotídeos da ORF. Especialmente quando a deleção remover uma porção dimensionável da ORF (por exemplo, cerca de 50% ou mais, preferencialmente cerca de 60% ou mais, de maior preferência cerca de 70% ou mais, de preferência ainda maior cerca de 80% ou mais ou, de preferência superior, cerca de 90% ou mais dos nucleotídeos da ORF) ou, quando a deleção remover a ORF completa, a deleção pode efetivamente eliminar a produção do polipeptídeo. Os técnicos no assunto podem introduzir facilmente essas exclusões.

[0071] Em algumas outras realizações, uma mutação pode ser uma substituição de um ou mais nucleotídeos na ORF que codifica um dado polipeptídeo de BLV, resultando na substituição de um ou mais aminoácidos do mencionado polipeptídeo de BLV. Essa mutação pode tipicamente preservar a produção do polipeptídeo e pode preferencialmente afetar, tal como reduzir ou eliminar, algumas ou todas as funções biológicas do polipeptídeo. Os técnicos no assunto podem introduzir facilmente essas substituições.

[0072] Em certas realizações preferidas, uma mutação pode eliminar o splicing nativa de um pré-mRNA que codifica um dado polipeptídeo de BLV. Na ausência de splicing nativa, o pré-mRNA pode ser degradado ou o pré-mRNA pode ser alternativamente dividido, gerando mRNA(s) que codifica(m) outro(s) polipeptídeo(s) de BLV ou o pré-mRNA pode ser dividido inadequadamente, empregando sítio(is) de splicing latente(s), se disponível(is). Desta forma, essa mutação pode tipicamente eliminar efetivamente a produção do mRNA do polipeptídeo e, portanto, a produção do polipeptídeo. Várias formas de interferência com o splicing apropriada são disponíveis para os técnicos no assunto, tais como, por exemplo mas sem limitações, mutações que alteram a sequência de um ou mais elementos de sequência necessários para splicing a fim de torná-los inoperáveis ou mutações que compreendem ou consistem da deleção de um ou mais elementos de sequência necessários para o splicing.

[0073] As expressões “splicing”, “splicing de genes”, “splicing de pré-mRNA” e similares, da forma utilizada no presente, são sinônimas e possuem seu significado estabelecido na técnica. Por meio de explicação adicional, o splicing indica o processo e meios de remoção de sequências intervenientes (íntrons) de pré-mRNA no processo de produção de mRNA maduro. A referência o splicing destina-se particularmente o splicing nativa, tal como ocorre sob condições fisiológicas normais. Os termos “pré-mRNA” e “transcrito” são utilizados no presente para indicar espécies de RNA que precedem mRNA maduro, tais como, particularmente, um transcrito de RNA primário e qualquer de suas formas parcialmente processadas. Elementos de sequência necessários para o splicing designam particularmente elementos cis na sequência de pré-mRNA que dirigem a maquinaria de splicing celular (spliceossoma) rumo à remoção correta e precisa de íntrons do pré-mRNA. Elementos de sequência envolvidos no splicing geralmente são intrinsecamente conhecidos e podem ser adicionalmente determinados por meio de métodos conhecidos, incluindo, entre outros, análise de deleção ou mutação. Por meio de explicação adicional, “sítio doador de splicing” ou “sítio de splicing 5’” designam, de forma geral, uma sequência conservada imediatamente adjacente a um limite entre éxons e íntrons na extremidade 5’ de um íntron. Comumente, um sítio doador de splicing pode conter um dinucleotídeo GU e pode envolver uma sequência de consenso de cerca de oito bases perto das posições +2 a -6. “Sítio receptor de splice” ou “sítio de splicing 3’” designam, de forma geral, uma sequência conservada imediatamente adjacente a um limite entre éxons e íntrons na extremidade 3’ de um íntron. Comumente, um sítio receptor de splice pode conter um dinucleotídeo AG e pode envolver uma sequência de consenso de cerca de dezesseis bases perto das posições -14 a +2.

[0074] Referência no presente a uma mutação que elimina o splicing de um dado gene, tal como particularmente o splicing em um dado limite éxon-íntron ou íntron-éxon, pode particularmente englobar uma mutação que envolve o sítio doador de splicing correspondente ou uma mutação que envolve o sítio receptor de splice correspondente, em que o splicing no mencionado sítio doador de splicing ou sítio receptor de splice é eliminada devido à mencionada mutação.

[0075] Uma mutação que envolve um sítio doador de splicing, por exemplo, pode compreender ou consistir em uma deleção, inserção e/ou substituição de um ou mais nucleotídeos, de forma a alterar a sequência do sítio doador de splicing. A alteração da sequência do sítio doador de splicing pode envolver mudança de qualquer um ou mais nucleotídeos que constituem a sequência de consenso de doador de splicing e, de maior preferência, pode envolver alteração de qualquer um ou ambos os nucleotídeos mais 5’ de um íntron. Deleção de um dado sítio doador de splicing pode referir-se, por exemplo, à deleção de qualquer um ou ambos os nucleotídeos mais 5’ de um íntron, tais como deleção de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou pelo menos dez nucleotídeos mais 5’ de um íntron e, opcionalmente, deleção adicional de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou pelo menos dez nucleotídeos mais 3’ do éxon a montante.

[0076] Uma mutação que envolve um sítio doador de splicing, por exemplo, pode compreender ou consistir em uma deleção, inserção e/ou substituição de um ou mais nucleotídeos, de forma a alterar a sequência do sítio receptor de splice. A alteração da sequência do sítio receptor de splice pode envolver mudança de qualquer um ou mais nucleotídeos que constituem a sequência de consenso de receptor de splicing e, de maior preferência, pode envolver alteração de qualquer um ou ambos os nucleotídeos mais 3’ de um íntron. Deleção de um dado sítio receptor de splice pode referir-se, por exemplo, à deleção de qualquer um ou ambos os nucleotídeos mais 3’ de um íntron, tais como deleção de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou pelo menos dez nucleotídeos mais 3’ de um íntron e, opcionalmente, deleção adicional de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou pelo menos dez nucleotídeos mais 5’ do éxon a montante.

[0077] Os técnicos no assunto apreciarão que diversas combinações desses exemplos de tipos de mutações mencionados acima são previstas no presente.

[0078] O BLV atenuado recombinante e aspectos relacionados descritos no presente compreendem certas mutações conforme especificado no presente. As mutações são configuradas de forma a não afetar nem prejudicar os polipeptídeos de BLV (por exemplo, o nível de produção e/ou a sequência de aminoácidos desses polipeptídeos de BLV) ou outros produtos, tais como miRNA (por exemplo, o nível de produção e/ou a sequência de ácido nucleico desse miRNA), cuja mutação não é especificada.

[0079] Desta forma, por exemplo, mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV, em que a mencionada mutação elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X, pode ser configurada de forma a não afetar nem prejudicar polipeptídeos de BLV codificados por gag, pol, env, R3, G4, Tax e Rex. Pode-se necessitar tomar cuidado específico ao introduzir-se uma mutação na região de miRNA de BLV, para não afetar nem prejudicar polipeptídeos de BLV codificados por env e R3, que são adjacentes à região de miRNA de BLV. Em outro exemplo, uma mutação em GH4 que restringe a propagação do BLV in vivo pode ser configurada de forma a não afetar nem prejudicar polipeptídeos de BLV codificados por gag, pol, env, R3, Tax e Rex e miRNAs de BLV. Pode-se necessitar tomar cuidado específico ao introduzir-se uma mutação em G4 para não afetar nem prejudicar polipeptídeos de BLV codificados por R3, Tax e Rex, que são adjacentes/sobrepostos a G4. Em outro exemplo, uma mutação em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo pode ser configurada de forma a não afetar nem prejudicar polipeptídeos de BLV codificados por gag, pol, env, G4, Tax e Rex e miRNAs de BLV. Pode-se necessitar tomar cuidado específico ao introduzir-se uma mutação em R3 para não afetar nem prejudicar polipeptídeos de BLV codificados por G4, Tax e Rex, que são adjacentes/sobrepostos a R3.

[0080] Dever-se-á compreender, entretanto, que, quando são especificadas mutações em dois ou mais dentre a região de miRNA, R3 e G4, tais como mutações em R3 e G4, ou mutações na região de miRNA e R3, ou mutações na região de miRNA, R3 e G4, uma única mutação (tal como uma única deleção) pode afetar adequadamente (cobrir) ambos ou todos os três genes ou regiões especificados desta forma.

[0081] Os técnicos no assunto sabem bem como a(s) mutação(ões) pretendida(s) no presente pode(m) ser configurada(s) de forma a não afetar nem prejudicar polipeptídeos de BLV ou outros produtos, tais como miRNA, cuja mutação não é especificada. Preferencialmente, a(s) mutação(ões) pode(m) ser posicionada(s) de forma a não modificar a transcrição, splicing, tradução e sequência de aminoácidos desses polipeptídeos de BLV sem mutação, nem modificar a transcrição e a sequência de ácido nucleico do miRNA sem mutação. A fim de não modificar a sequência de aminoácidos dos polipeptídeos de BLV sem mutação, por exemplo, a(s) mutação(ões) pode(m) ser posicionada(s) de forma a evitar que as ORFs dos polipeptídeos de BLV sem mutação ou, quando presente(s) nas ORFs, seja(m) inerte(s), ou seja, não produza(m) nenhuma alteração de aminoácido nos polipeptídeos de BLV sem mutação. A fim de não modificar o splicing do pré- mRNA que codifica os polipeptídeos de BLV sem mutação, por exemplo, a(s) mutação(ões) pode(m) estar localizada(s) de forma a evitar elementos de sequências necessários para splicing do pré-mRNA que codifica os polipeptídeos de BLV sem mutação. A fim de não modificar a sequência de ácido nucleico dos miRNAs que não sofreram mutação, por exemplo, a(s) mutação(ões) pode(m) ser posicionada(s) de forma a evitar a(s) sequência(s) que codifica(m) os miRNAs sem mutação.

[0082] Métodos de introdução de mutações em ácidos nucleicos são bem conhecidos dos técnicos no assunto e incluem, por exemplo, mas sem limitações, mutagênese dirigida a sítio por meio de PCR, recombinação homóloga, digestão e ligação de enzimas de restrição etc. Trabalhos de referência padrão que definem os princípios gerais da tecnologia de DNA recombinante incluem Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, vol. 1-3, Ed. Sambrook et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel et al, Greene Publishing & Wiley-Interscience, Nova Iorque, 1992 (com atualizações periódicas) (“Ausubel et al, 1992”); Innis et al, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press: San Diego, 1990).

[0083] O genoma de BLV compreende repetições de terminais longos (LTRs) em volta do genoma no seu terminal 5’ e no seu terminal 3’ (Fig. 1B). O genoma de BLV compreende adicionalmente os genes gag, prt, pol e env estruturais necessários para a síntese da partícula viral. Além disso, o genoma de BLV contém uma região entre a extremidade 3’ e o gene env e 3’ LTR, denominada região X, que compreende de 5’ a 3’ uma região que codifica microRNAs e quadros de leitura aberta que codificam as proteínas acessórias R3 e G4, Tax e Rex (Fig. 1B e 1C).

[0084] O termo “envelope”, da forma utilizada no presente, designa o envelope de BLV codificado pelo gene env do genoma de BLV. O envelope de BLV é um complexo multimérico que compreende uma subunidade extracelular gp51 (SU) associada a uma proteína transmembrana gp30 (TM) por meio de ligações de dissulfeto. As duas subunidades são polipeptídeos glicosilados (glicoproteínas). A sequência de nucleotídeos da porção de gene envelope que codifica a glicoproteína gp30 está localizada na posição 5518 à posição 6162 (códon de parada em 6160-6162, Fig. 1C).

[0085] Observe-se que, como ponto de referência apropriado, a numeração de nucleotídeos ou aminoácidos ao longo de todo o presente relatório descritivo está de acordo com a sequência descrita em Rice et al, 1987 (Sequence Analysis of the Bovine Leukemia Virus Genome em A. Burney e M. Mammerickx (Ed.), Enzootic Bovine Leukosis and Bovine Leukemia Virus, Martinus Nijhof, Leiden, Países Baixos, págs. 115-144): o nucleotídeo 1 é o primeiro na extremidade 5’ da região R da repetição terminal longa 5’ (LTR). Uma certa porção da sequência de “Rice” (nucleotídeos 5790 à posição 7409) que pode auxiliar particularmente no propósito da presente invenção é reproduzida na Fig. 1D. Além disso, a sequência genômica completa de pró- vírus BLV 344 e pBLV344H é reproduzida na Fig. 11 A-H (SEQ ID NO: 39). Conforme descrito no capítulo experimental, pró-vírus de BLV de acordo com certas realizações da presente invenção foram derivados de pBLV344H.

[0086] De forma compreensível, devido à variação de sequência natural que ocorre entre várias linhagens de BLV, variantes, clones, isolados e genótipos, os elementos de sequência e características indicadas no presente podem estar localizados em diferentes posições nesses outros BLV diferentes da sequência de BLV publicada por Rice et al, 1987, acima. Desta forma, a numeração de “Rice” adotada no presente não se destina a ser limitadora, mas sim destina-se a auxiliar no objeto da presente invenção. Os técnicos no assunto podem determinar facilmente as posições reais dos elementos de sequência e características indicadas no presente nas sequências correspondentes dessas outras linhagens, variantes, clones, isolados e genótipos de BLV.

[0087] A expressão “ITAM” ou “motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora” indica, de forma geral, uma sequência YXXL conservada de aminoácidos, em que X representa um resíduo variável e está envolvido na transdução de sinais, particularmente a transdução de sinais em células imunes. Da forma utilizada no presente, a expressão designa especificamente os motivos YXXL presentes na extremidade citoplasmática da proteína de envelope transmembrana. A extremidade citoplasmática C terminal de gp30 contém três desses motivos de YXXL, que estão envolvidos na transdução de sinal (Willems et al, 1995, J. Virol. 69: 4137-4141). Na sequência de “Rice”, a sequência de nucleotídeos que codifica o motivo YXXL mais N- terminal de gp30 está localizada na posição 6073 à posição 6084 (Fig. 1C).

[0088] A expressão “polipeptídeo R3” designa no presente a proteína acessória R3 que poderá ter função reguladora da expressão viral, particularmente inibindo o regulador pós-transcrição de expressão viral Rex (Alexandersen et al, 1993, J. Virol. 67: 39-52). O gene R3 e pré-mRNA R3 contêm 3 éxons (numerados consecutivamente no presente a partir de 5' como éxon 1, 2 e 3) que estão presentes em mRNA R3 e dois íntrons intervenientes (numerados consecutivamente no presente a partir de 5’ como íntron 1 e 2), que são divididos de mRNA R3 (Fig. 1B). Os dois primeiros éxons de R3 são comuns com o mRNA de Tax/Rex. O ORF de R3 começa em éxon 2 e continua para o éxon 3 (Fig. 1B). Portanto, o polipeptídeo R3 com 44 aminoácidos é composto de uma região N-terminal com 17 aminoácidos codificada pelo segundo éxon, em que essa região é idêntica à do polipeptíeo Rex e 27 aminoácidos foram codificados pelo éxon 3. Na sequência de “Rice”, a sequência AAAG/GTCC (posições 6809-6816) define o limite íntron 2 - éxon 3 de R3 e o primeiro nucleotídeo de éxon 3 de R3 na posição 6813 (Fig. 1C).

[0089] A expressão “polipeptídeo G4” designa no presente a proteína acessória G4 que possui potencial oncogênico (Lefèbvre et al, 2002, J. Virol. 76: 1400-1414). O gene G4 e o pré-mRNA G4 contêm 2 éxons (numerados consecutivamente no presente a partir de 5' como éxon 1 e 2) que estão presentes em mRNA G4 e um íntron interveniente (numerado no presente como íntron 1), que é dividido de mRNA G4 (Fig. 1B). A ORF G4 começa no primeiro éxon da reigão R de 5’ LTR e continua para o segundo éxon (Fig. 1B), gerando uma proteína com 105 aminoácidos. Na sequência de “Rice”, a sequência TTCC/AGCC (posições 6857-6864) define o limite íntron 1 - éxon 2 de G4 e o primeiro nucleotídeo de éxon 2 de G4 na posição 6861 (Fig. 1C).

[0090] Os termos “microRNA” ou “miRNA” designam, de forma geral, moléculas de RNA curto, em média com 22 nucleotídeos. Eles são geralmente envolvidos na regulagem pós-transcrição da expressão genética por meio de ligação a sequências complementares sobre transcritos de RNA mensageiro alvo, que normalmente resultam na repressão da tradução ou degradação de alvos e silenciamento genético. Eles são frequentemente relacionados a estados doentios, incluindo câncer. Da forma utilizada no presente, o termo se refere especificamente aos miRNAs codificados pelo genoma de BLV. A região de codificação de miRNA está localizada na região X do genoma BLV (conforme indicado anteriormente, a região X define a região entre a extremidade 3’ do gene env e 3’ LTR), particularmente entre a extremidade 3’ do gene env e o início da região ORF R3 localizada na região X (Cullen, 2012, PNAS 109: 2695-2696). Na sequência de “Rice”, a região de codificação de miRNA pode ser considerada posicionada de 6163 à posição 6812.

[0091] Por meio de orientação adicional, Kincaid et al, 2012 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8): 3077-82) mapeou recentemente oito sequências de miRNA codificadas por BLV (indicadas como BLV-mir-B1-3p, BLV-mir-B2-5p, BLV-mir-B2-3p, BLV-mir-B3-5p, BLV-mir-B3-3p, BLV-mir-B4- 3p, BLV-mir-B5-5p, BLV-mir-B5-3p) para a região de codificação de miRNA mencionada acima da sequência de ácido nucleico de BLV. Kincaid et al, 2012 propôs as sequências de consenso a seguir para esses miRNAs: BLV-mir-B1-3p: TCAGTGTACCATCACAAGCCTCT (SEQ ID NO: 20); BLV-mir-B2-5p: ATGACTGAGTGTAGCGCAGAGA (SEQ ID NO: 21); BLV-mir-B2-3p: TGCGTGTCRCTCAGTCATTTT (SEQ ID NO: 22); BLV-mir-B3-5p: ATCCCCCTGCCAGCGTTGGTC (SEQ ID NO: 23); BLV-mir-B3-3p: TAACGCTGACGGGGGCGATTTCT (SEQ ID NO: 24); BLV-mir-B4-3p: TAGCACCAYVGTCTCTGCGCCTTT (SEQ ID NO: 25); BLV-mir-B5-5p: AGGARGGTTGTGGCTCAGAGGT (SEQ ID NO: 26); e BLV-mir-B5-3p: CTCGRRCCGCAACCTCCCTTTCT (SEQ ID NO: 27).

[0092] Rosewick et al, 2013 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., PMID: 23345446) confirmou essas descobertas e identificou ainda BLV-mir-B1-5p e BLV-mir-B4-5p, com as sequências de consenso a seguir: BLV-mir-B1-5p: AGGCTGTGGTGGBGCRCTGGCT (SEQ ID NO: 28); e BLV-mir-B4-5p: AAGCGRGAGGCTCTGGTGCTGG (SEQ ID NO: 29).

[0093] Rosewick et al, 2013 determinou ainda que os miRNAs de BLV resultaram da transcrição de cinco unidades de transcrição independentes que codificam cinco estruturas de grampo de cabelo na região de codificação de miRNA de BLV.

[0094] As expressões “polipeptídeo Tax” e “polipeptídeo Rex” designam no presente as proteínas reguladoras Tax e Rex. Tax, a proteína de transativação, estimula a repetição terminal longa 5' para promover a transcrição viral e pode ser envolvida em tumorigênese. Rex é envolvida na transição do início da expressão de proteínas reguladoras até a expressão posterior de proteínas estruturais virais. O gene Tax/Rex e pré-mRNA Tax/Rex contêm 3 éxons (numerados consecutivamente no presente a partir de 5' como éxon 1, 2 e 3) que estão presentes em mRNA Tax/Rex e dois íntrons intervenientes (numerados consecutivamente no presente a partir de 5’ como íntron 1 e 2), que são divididos de mRNA Tax/Rex (Fig. 1B). A ORF de Tax e a ORF de Rex começam ambas em éxon 2 e continuam para o éxon 3 (Fig. 1B), mas empregam códons de início de tradução distintos, códons de parada distintos e codificam proteínas distintas de aminoácidos 309 (Tax) e 156 (Rex). Na sequência de “Rice”, a sequência TAAG/CAAG (posições 7038-7045) define o limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex e o primeiro nucleotídeo de éxon 3 de Tax/Rex na posição 7042 (Fig. 1C).

[0095] Conforme indicado, o BLV atenuado recombinante e aspectos relacionados descritos no presente podem compreender uma mutação na sequência de ácido nucleico que codifica o motivo de sinalização YXXL mais N-terminal do domínio citoplasmático da subunidade transmembrânica (TM) da proteína de envelope, em que a mencionada mutação interrompe a atividade de transdução de sinal do motivo.

[0096] Para determinar a atividade de transdução de sinal do motivo YXXL, reações de cálcio e produção de citoquinas podem ser analisadas em uma linhagem de células linfoides, tal como linhagem de células B ou T, que foi transfectada de forma estável com uma molécula quimérica que compreende as partes extracelular e transmembrana de CD8 fundidas à extremidade citoplasmática de TM, em resposta a um anticorpo anti-CD8 conforme descrito em Beaufils et al, (1993, EMBO J. 12: 5105-5112).

[0097] Em realizações preferidas, a mutação no motivo de sinalização YXXL mais N-terminal do domínio citoplasmático da subunidade transmembrânica (TM) da proteína de envelope que prejudica a atividade de transdução de sinal do motivo é uma substituição do resíduo de tirosina do motivo, ou seja, do resíduo de tirosina na posição 186 da proteína TM BLV. O resíduo de tirosina pode ser substituído por qualquer outro resíduo de aminoácido, preferencialmente por qualquer outro resíduo de aminoácido de ocorrência natural, de maior preferência em que esse resíduo não compreende uma porção hidroxila. Substituições particularmente apropriadas do resíduo de tirosina incluem substituições do resíduo de tirosina por alanina ou resíduos de ácido aspártico, preferencialmente por resíduo de ácido aspártico (ou seja Y186D, que resulta no motivo DXXL).

[0098] Consequentemente, em realizações preferidas, a mutação no motivo de sinalização YXXL mais N-terminal do domínio citoplasmático da subunidade transmembrânica (TM) da proteína de envelope da forma pretendida no presente é uma mutação do códon TAT nas posições 6073-6075 do ácido nucleico que codifica BLV em um códon que codifica um resíduo de aminoácido diferente de tirosina, ou seja, um códon diferente de TAT e TAC, preferencialmente em um códon que codifica resíduos de alanina (GCT, GCC, GCA ou GCG) ou ácido aspártico (GAT ou GAC), preferencialmente em um códon que codifica resíduo de ácido aspártico (GAT ou GAC). Em certas realizações, a mutação pode ser uma mutação pontual sem sentido (ou seja, uma mutação de um único nucleotídeo que altera a codificação de aminoácido pelo códon), em um exemplo particularmente preferido uma mutação pontual do nucleotídeo T na posição 6073 do ácido nucleico que codifica BLV, preferencialmente pró-vírus BLV, para um nucleotídeo G (ou seja, TAT^GAT, que resulta em Tyr^Asp).

[0099] Conforme indicado, o BLV atenuado recombinante e aspectos relacionados conforme descrito no presente podem compreender uma mutação em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo.

[00100] Conforme também indicado, o BLV atenuado recombinante e aspectos relacionados conforme descrito no presente podem compreender uma mutação em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo.

[00101] Nestes contextos, a expressão “que restringe a propagação de BLV in vivo” indica que um vírus de BLV que conduz a mutação em G4 ou em R3, ou em ambos, G4 e R3, exibe propagação reduzida em hospedeiro, ou seja, in vivo, em comparação com um vírus BLV de referência que, de outra forma, é idêntico, mas não compreende a mutação em G4 ou R3 ou em ambos, G4 e R3, respectivamente, preferencialmente em comparação com um vírus BLV de referência que, de outra forma, é idêntico, mas compreende G4 ou R3 do tipo selvagem ou ambos, G4 e R3, respectivamente. O hospedeiro pode ser conforme definido em outros pontos do presente relatório descritivo, tal como particularmente gado bovino, mais especificamente uma vaca. A propagação do vírus no hospedeiro pode ser de pelo menos cerca de duas vezes, tal como pelo menos cerca de cinco vezes, preferencialmente pelo menos cerca de dez vezes, tal como pelo menos cerca de vinte vezes ou, de maior preferência, pelo menos cerca de cinquenta vezes, tal como pelo menos cerca de cem vezes ou menos que o vírus de referência. Métodos apropriados de medição da propagação de vírus, particularmente, no hospedeiro incluem, sem limitações, a determinação das cargas pró-virais no hospedeiro desafiado. A quantidade de cópias pró-virais de BLV pode ser determinada, por exemplo, utilizando metodologia apropriada, tal como PCR quantitativa, por um dado número, por exemplo 100, de células mononucleares do sangue periférico em um ou mais momentos dados, ou seja, em função do tempo, após o desafio do hospedeiro. Vide o Exemplo 3 em busca de aplicação não limitadora específica desta abordagem.

[00102] Em certas realizações, a mutação em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo pode eliminar a produção de polipeptídeo G4.

[00103] Em algumas outras realizações, a mutação em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo pode resultar na produção de um polipeptídeo G4 truncado de forma C terminal que não contém pelo menos vinte aminoácidos C-terminais do polipeptídeo G4 (por exemplo, >21, >22, >23, >24, >25, >26, >27, >28, >29) ou pode resultar na produção de um polipeptídeo G4 truncado C terminal que não contém pelo menos trinta aminoácidos C- terminais de polipeptídeo G4 (por exemplo, >31, >32, >33, >34, >35, >36, >37, >38, >39), como pode resultar na produção de um polipeptídeo G4 truncado C terminal que não contém cerca de trinta a cerca de quarenta, tal como cerca de 33 a cerca de 47, por exemplo cerca de 35 aminoácidos C-terminais de polipeptídeo G4.

[00104] Em algumas outras realizações, a mutação em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo pode inativar o polipeptídeo G4, de forma a pelo menos eliminar o potencial oncogênico de polipeptídeo G4. O potencial oncogênico de G4 pode ser determinado por meio de testes do seu potencial de transformação in vitro. A formação de tumores, por exemplo, pode ser examinada em camundongos imunocomprometidos, tais como camundongos brutos sem timo, injetados com células embriônicas, tais como fibroblastos embriônicos de ratos, que tenham sido cotransfectados com ácido nucleico que codifica BLV G4 e um vetor de expressão que compreende um oncogene, preferencialmente Ha-ras (Kerkhofs et al, 1998. J. Virol. 72: 25542559).

[00105] Pode-se necessitar tomar cuidado ao introduzir uma mutação em G4 para não afetar nem prejudicar R3 (em que a mutação de R3, da forma ensinada no presente, não é especificada), Tax e Rex, conforme explicado em outros pontos do presente relatório descritivo. Portanto, a mutação é compatível com a produção de proteínas Tax e Rex funcionais.

[00106] Mutação apropriada em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo pode estar localizada em qualquer éxon (por exemplo, éxon 1 ou 2) e/ou íntron 1 de G4. A mutação pode estar localizada, por exemplo, em qualquer éxon (por exemplo, éxon 1 ou 2) de G4. Em um exemplo adicional, a mutação pode estar localizada em ORF G4, tal como na porção de ORF G4 presente em éxon 1 ou na porção de ORF G4 presente em éxon 2.

[00107] Sem limitações, uma mutação apropriada em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo pode estar localizada no éxon 1 de G4, preferencialmente na porção de ORF G4 presente em éxon 1. Um códon de parada prematura dentro do quadro ou uma mutação de comutação de quadros introduzida na porção de ORF G4 presente em éxon 1 eliminaria a produção de G4. Essa mutação não afeta nem prejudica a função de LTR 5’ nem a produção de outros produtos ou polipeptídeos de BLV.

[00108] Também sem limitações, uma mutação apropriada em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo pode estar localizada no sítio doador de splicing de íntron 1 de G4 e pode eliminar o splicing nativa de pré- mRNA de G4 e, portanto, eliminar a produção de polipeptídeo G4, tal como uma deleção que compreende ou consiste em uma deleção do mencionado sítio doador de splicing de íntron 1 de G4.

[00109] Preferencialmente, a mutação em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo pode estar localizada na região X da sequência de ácido nucleico de BLV. Particularmente, as porções de G4 presentes na região X da sequência de ácido nucleico de BLV incluem uma porção 3’ de íntron 1 e éxon 2.

[00110] Sem limitações, uma mutação apropriada em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo pode estar localizada no sítio receptor de splice de íntron 1 de G4 e pode eliminar o splicing nativa de pré-mRNA de G4 e, portanto, eliminar a produção de polipeptídeo G4, tal como uma deleção que compreende ou consiste em uma deleção do mencionado sítio receptor de splice de íntron 1 de G4.

[00111] Também sem limitações, uma mutação apropriada em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo pode estar localizada no éxon 2 de G4, preferencialmente na porção de ORF G4 presente em éxon 2. Um códon de parada prematura dentro do quadro, uma mutação de comutação de quadros, uma deleção ou substituição introduzida na porção de ORF G4 presente em éxon 2 poderá, por exemplo, produzir polipeptídeo G4 ou polipeptídeo G4 truncado de forma terminal com sequência de aminoácidos alterada que possui função(ões) biológica(s) reduzida(s) ou eliminada(s), tal como potencial oncogênico pelo menos eliminado, ou poderá eliminar a produção de G4.

[00112] Pode ser necessário prestar atenção específica ao introduzir-se mutação em G4 na região X da sequência de ácido nucleico de BLV para não afetar nem prejudicar a região de miRNA (em que mutação de miRNA, da forma ensinada no presente, não é especificada), R3 (em que a mutação de R3, da forma ensinada no presente, não é especificada), Tax e Rex, da forma explicada em outros pontos do presente relatório descritivo. Portanto, a mutação é compatível com a produção de proteínas Tax e Rex funcionais.

[00113] De maior preferência, a mutação em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo pode estar localizada na região da sequência de ácido nucleico de BLV entre o códon de parada de R3 e o sítio receptor de splice de íntron 2 de Tax/Rex. Convenientemente, a mutação dessa parte de G4 pode garantir que nenhuma alteração prejudicial seja introduzida no R3 (em que a mutação de R3, da forma ensinada no presente, não é especificada), Tax e Rex. Esta região corresponde às posições 6897 a 7039 de acordo com a numeração de sequências “Rice”, a partir do primeiro nucleotídeo a jusante do códon de parada R3 localizado em 6894-6896 e que se estende ao nucleotídeo -3 do limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex na posição 7039, ou seja, excluindo os dois últimos nucleotídeos de íntron 2 de Tax/Rex nas posições 7040-7041.

[00114] Sem limitações, um códon de parada prematura dentro do quadro, uma mutação de comutação de quadros, uma deleção ou substituição introduzida na região da sequência de ácido nucleico de BLV entre o códon de parada de R3 e o sítio receptor de splice de íntron 2 de Tax/Rex poderá produzir polipeptídeo G4 ou polipeptídeo G4 truncado de forma C terminal com sequência de aminoácidos alterada que possui função(ões) biológica(s) reduzida(s) ou eliminada(s), tal como potencial oncogênico pelo menos eliminado, ou poderá eliminar a produção de G4.

[00115] Também sem limitações, deleção de G4 pode remover uma parte dimensionável da região da sequência de ácido nucleico de BLV entre o códon de parada de R3 e o sítio receptor de splice de íntron 2 de Tax/Rex, tal como, por exemplo, cerca de 50% ou mais, preferencialmente cerca de 60% ou mais, de maior preferência cerca de 70% ou mais, de preferência ainda maior cerca de 80% ou mais e, de preferência ainda maior, cerca de 90% ou mais dos nucleotídeos que constituem essa região. Sem limitações, portanto, deleção de G4 pode remover uma parte dimensionável da região da sequência de ácido nucleico de BLV entre o códon de parada de R3 e o sítio receptor de splice de íntron 2 de Tax/Rex, tal como, por exemplo, cerca de 70 nucleotídeos ou mais, preferencialmente cerca de 90 nucleotídeos ou mais, de maior preferência cerca de 110 nucleotídeos ou mais e, de preferência ainda maior, cerca de 130 nucleotídeos ou mais dos nucleotídeos que constituem essa região. Isso poderá produzir polipeptídeo G4 truncado de forma C terminal ou internamente excluído que possui função(ões) biológica(s) reduzida(s) ou eliminada(s), tal(is) como, por exemplo, potencial oncogênico pelo menos eliminado ou poderá eliminar a produção de G4.

[00116] Preferencialmente, a mutação em G4 que restringe a propagação de BLV in vivo pode compreender ou consistir em inserção de um códon de parada dentro do quadro no quadro de leitura aberta de G4. Isso pode produzir polipeptídeo G4 truncado de forma C terminal possui função(ões) biológica(s) reduzida(s) ou eliminada(s), tal(is) como, por exemplo, potencial oncogênico pelo menos eliminado ou pode eliminar a produção de G4.

[00117] De preferência específica, a mutação em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo pode compreender ou consistir em inserção de um códon de parada dentro do quadro no quadro de leitura aberta de G4 na região da sequência de ácido nucleico de BLV entre o códon de parada de R3 e o sítio receptor de splice de íntron 2 de Tax/Rex. Isso pode produzir polipeptídeo G4 truncado de forma C terminal que possui função(ões) biológica(s) reduzida(s) ou eliminada(s), tal(is) como, por exemplo, potencial oncogênico pelo menos eliminado ou pode eliminar a produção de G4.

[00118] Em exemplos de realizações não limitadoras, pode ser introduzido um códon de parada dentro do quadro, com referência à numeração de sequência de “Rice”, entre as posições 6947 e 7037, tal como entre as posições 6957 e 7037, tal como particularmente entre as posições 6967 e 7027, tal como, mais particularmente, entre as posições 6977 e 7017, tal como, ainda mais especificamente, entre as posições 6987 e 7007, tal como perto da posição 6997 da sequência de ácido nucleico de BLV.

[00119] Em certas realizações, a mutação em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo pode eliminar a produção de polipeptídeo R3.

[00120] Pode-se necessitar tomar cuidado ao introduzir uma mutação em R3 para não afetar nem prejudicar G4 (em que a mutação de G4, da forma ensinada no presente, não é especificada), Tax e Rex, conforme explicado em outros pontos do presente relatório descritivo. Portanto, a mutação é compatível com a produção de proteínas Tax e Rex funcionais.

[00121] Mutação apropriada em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo pode estar localizada em qualquer éxon (por exemplo, éxon 1, 2 ou 3) e/ou qualquer íntron (por exemplo, íntron 1 ou 2) de R3. A mutação pode estar localizada, por exemplo, em qualquer éxon (por exemplo, éxon 1, 2 ou 3) de R3. Em um exemplo adicional, a mutação pode estar localizada em ORF R3, tal como na porção de ORF R3 presente em éxon 2 ou na porção de ORF R3 presente em éxon 3.

[00122] Como éxon 1 e 2 de R3 são comuns com o mRNA de Tax/Rex e a porção de ORF R3 presente em éxon 2 de R3 é idêntica à de Rex, uma mutação apropriada em R3 que restringe a propagação do BLV pode ser convenientemente posicionada na porção 3’ de íntron 2 de R3 ou em éxon 3 de R3. Conforme já indicado, entretanto, mutações em éxon 1 ou 2 de R3 e em íntron 1 ou na porção 5' de íntron 2 de R3 que são compatíveis com a produção de proteínas Tax e Rex funcionais também são possíveis e contempladas no presente.

[00123] Preferencialmente, a mutação em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo pode estar localizada na região X da sequência de ácido nucleico de BLV. Particularmente, as porções de R3 presentes na região X da sequência de ácido nucleico de BLV incluem uma porção 3’ de íntron 2 e éxon 3.

[00124] Sem limitações, uma mutação apropriada em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo pode estar posicionada no sítio receptor de splice de íntron 2 de R3 e pode eliminar o splicing nativa de pré-mRNA de R3 e, portanto, eliminar a produção de polipeptídeo R3, tal como uma deleção que compreende ou consiste em uma deleção do mencionado sítio receptor de splice de íntron 2 de R3.

[00125] Também sem limitações, uma mutação apropriada em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo pode estar localizada no éxon 3 de R3, preferencialmente na porção de ORF R3 presente em éxon 3. Um códon de parada prematura dentro do quadro, uma mutação de comutação de quadros, uma deleção ou substituição introduzida na porção de ORF R3 presente em éxon 3 poderá, por exemplo, produzir polipeptídeo R3 ou polipeptídeo R3 truncado de forma C terminal com sequência de aminoácidos alterada que possui função(ões) biológica(s) reduzida(s) ou eliminada(s) ou poderá eliminar a produção de R3.

[00126] Pode ser necessário prestar atenção específica ao introduzir-se mutação em R3 na região X da sequência de ácido nucleico de BLV para não afetar nem prejudicar a região de miRNA (em que mutação de miRNA, da forma ensinada no presente, não é especificada), G4 (em que a mutação de G4, da forma ensinada no presente, não é especificada), Tax e Rex, da forma explicada em outros pontos do presente relatório descritivo. Portanto, a mutação é compatível com a produção de proteínas Tax e Rex funcionais.

[00127] A mutação em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo pode estar localizada na região da sequência de ácido nucleico de BLV entre a extremidade da região que codifica miRNA e o sítio receptor de splice de íntron 1 de G4, por exemplo, na região da sequência de ácido nucleico de BLV entre cerca de 250 nucleotídeos a montante do sítio receptor de splice de íntron 2 de R3 e o sítio receptor de splice 1 de G4). Convenientemente, a mutação dessa parte de R3 pode garantir que nenhuma alteração prejudicial seja introduzida na região de miRNA (em que a mutação de miRNA, da forma ensinada no presente, não é especificada), G4 (em que a mutação de G4 conforme ensinado no presente não é especificada), Tax e Rex.

[00128] Um códon de parada prematura dentro do quadro, uma mutação de comutação de quadros, deleção ou substituição introduzida na parte de ORF R3 presente em éxon 3 a montante do sítio receptor de splice de íntron 1 de G4 (ou seja, a região correspondente às posições 6813 a 6858 de acordo com a numeração de sequências de “Rice”, a partir do primeiro nucleotídeo de éxon 3 de códon de parada R3 localizado em 6813 que se estende até o nucleotídeo -3 do limite íntron 1 - éxon 2 de G4 em 6858, ou seja, excluindo os dois últimos nucleotídeos de íntron 1 de G4 nas posições 6859-6860) poderá produzir polipeptídeo R3 truncado de forma C terminal ou polipeptíeo R3 com sequência de aminoácidos alterada que possui função(ões) biológica(s) reduzida(s) ou eliminada(s) ou poderá eliminar a produção de R3.

[00129] Deleção em R3 pode, por exemplo, remover uma porção dimensionável da parte de ORF R3 presente em éxon 3 a montante do sítio receptor de splice de íntron 1 de G4, ou seja, a região correspondente às posições 6813 a 6858 de acordo com a numeração de sequências de “Rice”. Uma porção dimensionável dessa região pode ser, por exemplo, cerca de 50% ou mais, preferencialmente cerca de 60% ou mais, de maior preferência cerca de 70% ou mais, de preferência ainda maior cerca de 80% ou mais ou, de preferência ainda maior, cerca de 90% ou mais dos nucleotídeos que constituem essa região. Isso poderá produzir polipeptídeo R3 truncado de forma C terminal ou excluído internamente que possui função(ões) biológica(s) reduzida(s) ou eliminada(s) ou poderá eliminar a produção de R3.

[00130] Preferencialmente, a mutação em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo pode eliminar o splicing no limite íntron 2 - éxon 3 de RNA pré-mensageiro de R3. Desta forma, o splicing nativa de pré-mRNA de R3 e a produção de polipeptídeo R3 podem ser eliminadas. Qualquer mutação envolvendo o sítio receptor de splice de íntron 2 de R3 é contemplada no presente. Preferencialmente, a mutação pode compreender ou consistir em uma deleção no sítio receptor de splice de íntron 2 de R3.

[00131] De forma particularmente preferível, a mutação em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo pode ser uma deleção de pelo menos uma parte da região da sequência de ácido nucleico de BLV entre o final da região de codificação de miRNA e o sítio receptor de splice de íntron 1 de G4, mais particularmente entre cerca de 250 nuleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3 e o sítio receptor de splice de íntron 1 de G4, em que a mutação elimina o splicing no limite íntron 2 - éxon 3 de RNA pré- mensageiro de R3, conforme explicado acima. Convenientemente, a mutação dessa parte de R3 pode garantir que nenhuma alteração prejudicial seja introduzida na região de miRNA (em que a mutação de miRNA, da forma ensinada no presente, não é especificada), G4 (em que a mutação de G4 conforme ensinado no presente não é especificada), Tax e Rex.

[00132] Por exemplo, o limite 5’ da deleção pode estar localizado entre cerca de 250 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3 e no limite íntron 2 - éxon 3 de R3 ou entre cerca de 250 e cerca de 10 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3 ou entre cerca de 250 e cerca de 50 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3, ou entre cerca de 250 e cerca de 100 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3. Por exemplo, o limite 5’ da deleção pode estar localizado entre cerca de 249 e cerca de 149, entre cerca de 239 e cerca de 159, entre cerca de 229 e cerca de 169, entre cerca de 219 e cerca de 179, entre cerca de 209 e cerca de 189 ou a cerca de 199 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3.

[00133] Qualquer um desses exemplos de limites 5’ da deleção relacionada no parágrafo anterior pode ser combinado com um limite 3’ da deleção localizada entre cerca de 45 e cerca de 3 nucleotídeos a montante do limite íntron 1 - éxon 2 de G4, qualquer um desses exemplos de limites 5’ da deleção relacionada no parágrafo anterior pode ser combinado com um limite 3’ da deleção localizada entre cerca de 33 e cerca de 3 nucleotídeos a montante do limite íntron 1 - éxon 2 de G4, qualquer um desses exemplos de limites 5’ da deleção relacionada no parágrafo anterior pode ser combinado com um limite 3’ da deleção localizada entre cerca de 23 e cerca de 3 nucleotídeos a montante do limite íntron 1 - éxon 2 de G4 ou qualquer um desses exemplos de limites 5’ da deleção relacionada no parágrafo anterior pode ser combinado com um limite 3’ da deleção a cerca de 13 nucleotídeos a montante do limite íntron 1 - éxon 2 de G4.

[00134] Por exemplo, o limite 5’ da deleção pode estar localizado entre cerca de 249 e cerca de 149, preferencialmente entre cerca de 239 e cerca de 159, de maior preferência entre cerca de 229 e cerca de 169, de preferência ainda maior entre cerca de 219 e cerca de 179, de preferência ainda maior entre cerca de 209 e cerca de 189 ou, de preferência específica, a cerca de 199 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3 e o limite 3’ da deleção pode estar localizado entre cerca de 45 e cerca de 3, preferencialmente entre cerca de 33 e cerca de 3, de maior preferência entre cerca de 23 e cerca de 3 ou, de preferência ainda maior, a cerca de 13 nucleotídeos a montante do limite íntron 1 - éxon 2 de G4.

[00135] Em um exemplo específico, o limite 5’ da deleção pode estar localizado entre cerca de 209 e cerca de 189, tal como cerca de 209 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3 e o limite 3' da deleção pode estar localizado entre cerca de 23 e cerca de 3, tal como a cerca de 13 nucleotídeos a montante do limite íntron 1 - éxon 2 de G4.

[00136] Em realizações preferidas adicionais, o limite 5' da deleção pode estar localizado entre as posições 6564 e 6664, preferencialmente entre as posições 6574 e 6654, de maior preferência entre as posições 6584 e 6644, de preferência ainda maior entre as posições 6594 e 6634, de preferência ainda maior entre as posições 6604 e 6624 ou, de preferência específica, em cerca da posição 6614 da sequência de ácido nucleico de BLV de acordo com a numeração de sequências de "Rice" e o limite 3’ da deleção pode estar localizado entre as posições 6816 e 6858, preferencialmente entre as posições 6828 e 6858, de maior preferência entre as posições 6838 e 6858 ou, de preferência ainda maior, em cerca da posição 6828 da sequência de ácido nucleico de BLV de acordo com a numeração de sequências de “Rice”. Em um exemplo específico, o limite 5’ da deleção pode estar localizado entre as posições 6604 e 6624, por exemplo, cerca da posição 6614, da sequência de ácido nucleico de BLV e o limite 3’ da deleção pode estar localizado entre as posições 6838 e 6858, por exemplo, em cerca da posição 6848 da sequência de ácido nucleico de BLV.

[00137] Em certas realizações, o BLV recombinante pode compreender a mutação em G4 e R3, em que a mencionada mutação restringe a propagação do BLV in vivo.

[00138] Em realizações preferidas, a mutação em G4 e R3 pode eliminar a produção de polipeptídeos G4 e R3. Preferencialmente, a mutação pode estar localizada na região X da sequência de ácido nucleico de BLV.

[00139] Pode ser necessário prestar atenção específica ao introduzir-se mutação em G4 e R3, particularmente ao introduzir-se essa mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV, para não afetar nem prejudicar a região de miRNA (em que mutação de miRNA, da forma ensinada no presente, não é especificada), Tax e Rex, da forma explicada em outros pontos do presente relatório descritivo. Portanto, a mutação é compatível com a produção de proteínas Tax e Rex funcionais.

[00140] Em certas realizações, o BLV recombinante pode compreender a mutação em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo e a mutação em R3 que restringe a propagação do BLV in vivo, em que as mencionadas mutações eliminam o splicing no limite íntron 2 - éxon 3 de RNA pré-mensageiro de R3 e no limite íntron 1 - éxon 2 de RNA pré-mensageiro de G4. Desta forma, o splicing nativa de pré-mRNA de R3, a produção de polipeptídeo R3, o splicing nativa de pré-mRNA de G4 e a produção de polipeptídeo G4 podem ser eliminadas. Qualquer mutação que envolva o sítio receptor de splice de íntron 2 de R3 e qualquer mutação que envolva o sítio receptor de splice do íntron 1 de G4 é contemplada no presente. Preferencialmente, as mutações podem compreender ou consistir em uma deleção no sítio receptor de splice de íntron 2 de R3 e uma deleção do sítio receptor de splice de íntron 1 de G4.

[00141] De forma particularmente preferível, as mencionadas mutações em G4 e R3 que restringem a propagação do BLV in vivo podem ser uma deleção de pelo menos uma parte da região da sequência de ácido nucleico de BLV entre o final da região de codificação de miRNA e o sítio receptor de splice de íntron 2 de Tax/Rex, mais particularmente entre cerca de 250 nuleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3 e o sítio receptor de splice de íntron 2 de Tax/Rex, em que o sítio receptor de splice de íntron 2 de R3 e o sítio receptor de splice de íntron 1 de G4 são excluídos, de tal forma que as mutações eliminem o splicing no limite íntron 2 - éxon 3 de RNA pré- mensageiro de R3 e no limite íntron 1 - éxon 2 de RNA pré-mensageiro de G4, conforme explicado acima.

[00142] Por exemplo, o limite 5’ da deleção pode estar localizado entre cerca de 250 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3 e no limite íntron 2 - éxon 3 de R3 ou entre cerca de 250 e cerca de 10 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3 ou entre cerca de 250 e cerca de 50 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3, ou entre cerca de 250 e cerca de 100 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3. Por exemplo, o limite 5’ da deleção pode estar localizado entre cerca de 249 e cerca de 149, entre cerca de 239 e cerca de 159, entre cerca de 229 e cerca de 169, entre cerca de 219 e cerca de 179, entre cerca de 209 e cerca de 189 ou a cerca de 199 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3.

[00143] Qualquer um desses exemplos de limites 5’ da deleção relacionada no parágrafo anterior pode ser combinado com um limite 3’ da deleção localizada entre cerca de 178 e cerca de 3 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex, qualquer um desses exemplos de limites 5’ da deleção relacionada no parágrafo anterior pode ser combinado com um limite 3’ da deleção localizada entre cerca de 100 e cerca de 3 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex, qualquer um desses exemplos de limites 5’ da deleção relacionada no parágrafo anterior pode ser combinado com um limite 3’ da deleção localizada entre cerca de 55 e cerca de 35 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex ou qualquer um desses exemplos de limites 5’ da deleção relacionada no parágrafo anterior pode ser combinado com um limite 3’ da deleção a cerca de 45 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex.

[00144] Por exemplo, o limite 5’ da deleção pode estar localizado entre cerca de 249 e cerca de 149, preferencialmente entre cerca de 239 e cerca de 159, de maior preferência entre cerca de 229 e cerca de 169, de preferência ainda maior entre cerca de 219 e cerca de 179, de preferência ainda maior entre cerca de 209 e cerca de 189 ou, de preferência específica, a cerca de 199 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3 e o limite 3’ da deleção pode estar localizado entre cerca de 178 e cerca de 3, preferencialmente entre cerca de 100 e cerca de 3, de maior preferência entre cerca de 55 e cerca de 35 ou, de preferência ainda maior, a cerca de 45 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex.

[00145] Em um exemplo específico, o limite 5’ da deleção pode estar localizado entre cerca de 209 e cerca de 189, tal como cerca de 209 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3 e o limite 3' da deleção pode estar localizado entre cerca de 55 e cerca de 35, tal como a cerca de 45 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex.

[00146] Em realizações preferidas adicionais, o limite 5' da deleção pode estar localizado entre as posições 6564 e 6664, preferencialmente entre as posições 6574 e 6654, de maior preferência entre as posições 6584 e 6644, de preferência ainda maior entre as posições 6594 e 6634, de preferência ainda maior entre as posições 6604 e 6624 ou, de preferência específica, cerca da posição 6614 da sequência de ácido nucleico de BLV de acordo com a numeração de sequências de "Rice" e o limite 3’ da deleção pode estar localizado entre as posições 6957 e 7037, preferencialmente entre as posições 6967 e 7027, de maior preferência entre as posições 6977 e 7017, de preferência ainda maior entre as posições 6987 e 7007 ou, de preferência ainda maior, cerca da posição 6997 da sequência de ácido nucleico de BLV de acordo com a numeração de sequências de “Rice”. Em um exemplo específico, o limite 5’ da deleção pode estar localizado entre as posições 6604 e 6624, por exemplo, a cerca da posição 6614, da sequência de ácido nucleico de BLV e o limite 3’ da deleção pode estar localizado entre as posições 6987 e 7007, por exemplo, cerca da posição 6997 da sequência de ácido nucleico de BLV.

[00147] Conforme indicado, o BLV atenuado recombinante e aspectos relacionados descritos no presente podem compreender uma mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV, que elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X. Quaisquer mutações, incluindo exclusões, inserções e/ou substituições, que eliminam a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X, são contempladas no presente.

[00148] Como forma de exemplo e não de limitação, a mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV que elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X pode eliminar a produção, em ordem crescente de preferência, de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais ou todos os dez miRNAs codificados por BLV selecionados a partir do grupo que consiste em BLV-mir-B1-5p, BLV-mir-B1-3p, BLV-mir-B2-5p, BLV-mir-B2-3p, BLV-mir- B3-5p, BLV-mir-B3-3p, BLV-mir-B4-5p, BLV-mir-B4-3p, BLV-mir-B5-5p e BLV- mir-B5-3p, conforme definido em outros pontos do presente relatório descritivo.

[00149] Preferencialmente, a mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV que elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X pode ser deleção de pelo menos uma parte da região da sequência de ácido nucleico de BLV entre o códon de parada da subunidade transmembrânica (TM, glicoproteína gp30) da proteína de envelope e do sítio receptor de splice de íntron 2 de R3. Esta região contém o ácido nucleico que codifica os miRNAs e pode ser adequadamente indicada como região de miRNA ou região que codifica miRNA no presente.

[00150] A mutação na região X da sequência de ácido nucleico que elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X pode ser, por exemplo, a deleção de pelo menos uma parte da região da sequência de ácido nucleico de BLV entre o códon de parada de TM e cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 150 ou cerca de 200 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3.

[00151] Por exemplo, o limite 5’ da deleção pode estar localizado entre cerca de 1 e cerca de 50, preferencialmente entre cerca de 1 e cerca de 40, de maior preferência entre cerca de 1 e cerca de 30, de preferência ainda maior entre cerca de 1 e cerca de 20, de preferência ainda maior entre cerca de 1 e cerca de 11, tal como cerca de 7 nucleotídeos a jusante do códon de parada de TM e o limite 3’ da deleção pode estar localizado entre cerca de 200 e cerca de 3, preferencialmente entre cerca de 132 e cerca de 32, de maior preferência entre cerca de 122 e cerca de 42, de maior preferência entre cerca de 112 e cerca de 52, de preferência ainda maior entre cerca de 102 e cerca de 62 e, de preferência superior, entre cerca de 92 e cerca de 72 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3.

[00152] Em realizações preferidas adicionais, o limite 5' da deleção pode estar localizado entre as posições 6163 e 6213, preferencialmente entre as posições 6163 e 6203, de maior preferência entre as posições 6163 e 6193, de preferência ainda maior entre as posições 6163 e 6183, de preferência ainda maior entre as posições 6163 e 6173 ou, de preferência específica, cerca da posição 6169 da sequência de ácido nucleico de BLV de acordo com a numeração de sequências de "Rice" e o limite 3’ da deleção pode estar localizado entre as posições 6681 e 6781, preferencialmente entre as posições 6691 e 6771, de maior preferência entre as posições 6701 e 6761, de preferência ainda maior entre as posições 6711 e 6751, de preferência ainda maior entre as posições 6721 e 6741 ou, de preferência ainda maior, cerca da posição 6731 da sequência de ácido nucleico de BLV de acordo com a numeração de sequências de “Rice”. Em um exemplo específico, o limite 5’ da deleção pode estar localizado entre as posições 6163 e 6173, por exemplo, a cerca da posição 6169, da sequência de ácido nucleico de BLV e o limite 3’ da deleção pode estar localizado entre as posições 6721 e 6741, por exemplo, cerca da posição 6731 da sequência de ácido nucleico de BLV.

[00153] Em certas realizações, o BLV recombinante pode compreender uma mutação em G4 e R3, em que a mencionada mutação restringe a propagação do BLV in vivo e uma mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X. Em realizações preferidas, a mutação em G4 e R3 pode eliminar a produção dos polipeptídeos G4 e R3; preferencialmente, a mutação pode ser posicionada na região X da sequência de ácido nucleico de BLV. Em certas realizações, portanto, o BLV recombinante pode compreender uma mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV que elimina a produção de ambos, G4 e R3, e elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X.

[00154] Pode ser necessário prestar atenção ao introduzir-se mutação em miRNA, G4 e R3, particularmente quando a mutação em G4 e R3 encontrar-se na região X da sequência de ácido nucleico de BLV, para não afetar nem prejudicar Tax e Rex, conforme explicado em outros pontos do presente relatório descritivo. Portanto, a mutação é compatível com a produção de proteínas Tax e Rex funcionais.

[00155] Em certas realizações, o BLV atenuado recombinante pode compreender a mutação em G4 que restringe a propagação do BLV in vivo, a mutação em R3 restringe a propagação do BLV in vivo e a mutação na região X da sequência de ácido nucleico de BLV que elimina a produção de pelo menos um ou preferencialmente todos os microRNAs codificados pela mencionada região X, em que as mencionadas mutações são uma deleção de pelo menos uma parte da região da sequência de ácido nucleico de BLV entre o códon de parada de TM e o sítio receptor de splice de íntron 2 de Tax/Rex, em que o sítio receptor de splice de íntron 2 de R3 e o sítio receptor de splice de íntron 1 de G4 são excluídos. Em realizações adicionais, esse BLV atenuado recombinante pode compreender adicionalmente a mutação na sequência de ácido nucleico que codifica o motivo de sinalização YXXL mais N- terminal do domínio citoplasmático da subunidade transmembrânica (TM) da proteína de envelope, em que a mencionada mutação interrompe a atividade de transdução de sinal do motivo, conforme descrito no presente.

[00156] O limite 5’ da deleção pode estar localizado, por exemplo, entre cerca de 1 e cerca de 50, preferencialmente entre cerca de 1 e cerca de 40, de maior preferência entre cerca de 1 e cerca de 30, de preferência ainda maior entre cerca de 1 e cerca de 20, de preferência ainda maior entre cerca de 1 e cerca de 11, tal como cerca de 7 nucleotídeos a jusante do códon de parda de TM.

[00157] Qualquer um desses exemplos de limites 5’ da deleção relacionada no parágrafo anterior pode ser combinado com um limite 3’ da deleção localizada entre cerca de 178 e cerca de 3 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex, qualquer um desses exemplos de limites 5’ da deleção relacionada no parágrafo anterior pode ser combinado com um limite 3’ da deleção localizada entre cerca de 100 e cerca de 3 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex, qualquer um desses exemplos de limites 5’ da deleção relacionada no parágrafo anterior pode ser combinado com um limite 3’ da deleção localizada entre cerca de 55 e cerca de 35 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex ou qualquer um desses exemplos de limites 5’ da deleção relacionada no parágrafo anterior pode ser combinado com um limite 3’ da deleção a cerca de 45 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex.

[00158] O limite 5’ da deleção pode estar localizado, por exemplo, entre cerca de 1 e cerca de 50, preferencialmente entre cerca de 1 e cerca de 40, de maior preferência entre cerca de 1 e cerca de 30, de preferência ainda maior entre cerca de 1 e cerca de 20, de preferência ainda maior entre cerca de 1 e cerca de 11, tal como cerca de 7 nucleotídeos a jusante do códon de parada de TM e o limite 3’ da deleção pode estar localizado entre cerca de 178 e cerca de 3, preferencialmente entre cerca de 100 e cerca de 3, de maior preferência entre cerca de 55 e cerca de 35 ou, de preferência ainda maior, cerca de 45 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex.

[00159] Em um exemplo específico, o limite 5’ da deleção pode estar localizado entre cerca de 1 e cerca de 11, tal como cerca de 7 nucleotídeos a jusante do códon de parada de TM e o limite 3' da deleção pode estar localizado entre cerca de 55 e cerca de 35, tal como a cerca de 45 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex.

[00160] Em realizações preferidas adicionais, o limite 5’ da deleção pode estar localizado entre as posições 6163 e 6213, preferencialmente entre as posições 6163 e 6203, de maior preferência entre as posições 6163 e 6193, de preferência ainda maior entre as posições 6163 e 6183, de preferência ainda maior entre as posições 6163 e 6173 ou, de preferência específica, cerca da posição 6169 da sequência de ácido nucleico de BLV de acordo com a numeração de sequências de "Rice" e o limite 3’ da deleção pode estar localizado entre as posições 6957 e 7037, preferencialmente entre as posições 6967 e 7027, de maior preferência entre as posições 6977 e 7017, de preferência ainda maior entre as posições 6987 e 7007 ou, de preferência ainda maior, cerca da posição 6997 da sequência de ácido nucleico de BLV de acordo com a numeração de sequências de “Rice”.

[00161] Em um exemplo específico, o limite 5’ da deleção pode estar localizado entre as posições 6163 e 6173, por exemplo, a cerca da posição 6169, da sequência de ácido nucleico de BLV e o limite 3’ da deleção pode estar localizado entre as posições 6987 e 7007, por exemplo, cerca da posição 6997 da sequência de ácido nucleico de BLV.

[00162] Em certas realizações, a presente invenção fornece o BLV atenuado recombinante, conforme ensinado no presente, preferencialmente em que o BLV é isolado de BLV 344 e aplica-se um dos seguintes: - o BLV atenuado recombinante compreende uma substituição de um nucleotídeo T na posição 6073 da sequência de ácido nucleico de BLV por um nucleotídeo G e compreende adicionalmente uma deleção da sequência de ácido nucleico de BLV entre as posições 6614 e 6648; ou - o BLV atenuado recombinante compreende uma substituição de um nucleotídeo T na posição 6073 da sequência de ácido nucleico de BLV por um nucleotídeo G e compreende adicionalmente um segmento de oligonucleotídeo duplo que compreende um códon de parada inserido no sítio BamHI na posição 6997 da sequência de ácido nucleico de BLV, de tal forma que o mencionado códon de parada encontra-se dentro do quadro para o ORF G4, preferencialmente em que o segmento de oligonucleotídeo duplo é composto de dois oligonucleotídeos hibridizados, cada qual com a sequência 5’-GATCTAGGCTAGAATTCTAGCCTA-3’ (SEQ ID NO: 3), inserido no sítio BamHI na posição 6997 da sequência de ácido nucleico de BLV; ou - o BLV atenuado recombinante compreende uma substituição de um nucleotídeo T na posição 6073 da sequência de ácido nucleico de BLV por um nucleotídeo G e compreende adicionalmente um segmento de oligonucleotídeo duplo que substitui o segmento de ácido nucleico entre o sítio XbaI na posição 6614 e o sítio BamHI na posição 6997 da sequência de ácido nucleico de BLV, preferencialmente em que o segmento de oligonucleotídeo duplo é composto de dois oligonucleotídeos hibridizados, cada qual com a sequência 5’-CTAGAAAGCTTG-3’ (SEQ ID NO: 1) e 5’- GATCCAAGCTTT-3’ (SEQ ID NO: 2), respectivamente, substituindo o segmento de ácidos nucleicos entre o sítio XbaI na posição 6614 e o sítio BamHI na posição 6997 da sequência de ácido nucleico de BLV; ou - o BLV atenuado recombinante compreende uma deleção da sequência de ácido nucleico de BLV entre as posições 6169 e 6997 e, preferencialmente, o BLV atenuado recombinante compreende a sequência de ácido nucleico 5'-TCTAGAAAGCTT-3’ (SEQ ID NO: 4) que substitui a sequência de ácido nucleico da posição 6170 à posição 6996 da sequência de ácido nucleico de BLV; ou - o BLV atenuado recombinante compreende uma substituição de um nucleotídeo T na posição 6073 da sequência de ácido nucleico de BLV por um nucleotídeo G e compreende adicionalmente uma deleção da sequência de ácido nucleico de BLV entre as posições 6169 e 6997, preferencialmente o BLV atenuado recombinante compreende uma substituição de um nucleotídeo T na posição 6073 da sequência de ácido nucleico de BLV por um nucleotídeo G e compreende adicionalmente a sequência de ácido nucleico 5'-TCTAGAAAGCTT-3' (SEQ ID NO: 4) que substitui a sequência de ácido nucleico da posição 6170 à posição 6996 da sequência de ácido nucleico de BLV.

[00163] Conforme já indicado, um aspecto da presente invenção fornece o BLV atenuado recombinante codificado pelo plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8166 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2B). Isso codifica o pró-vírus BLV6073DX conforme descrito no capítulo experimental.

[00164] Também conforme já indicado, um aspecto da presente invenção fornece o BLV atenuado recombinante codificado pelo plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8167 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2C). Isso codifica o pró-vírus BLVGPDX conforme descrito no capítulo experimental.

[00165] Também conforme já indicado, um aspecto da presente invenção fornece o BLV atenuado recombinante codificado pelo plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8713 em 25 de outubro de 2013 (vide a Tabela 2D). Isso codifica o pró-vírus BLV6073GPDX conforme descrito no capítulo experimental.

[00166] Um aspecto adicional fornece um ácido nucleico recombinante que codifica o BLV atenuado recombinante conforme descrito no presente.

[00167] Por “ácido nucleico”, indica-se oligômeros e polímeros com qualquer comprimento composto essencialmente de nucleotídeos, tais como desoxirribonucleotídeos e/ou ribonucleotídeos. Ácidos nucleicos podem compreender bases de purina e/ou pirimidina e/ou outras bases de nucleotídeos naturais (por exemplo, xantina, inosina e hipoxantina), química ou bioquimicamente modificadas (por exemplo, metiladas), não naturais ou derivadas. A cadeia principal de ácidos nucleicos pode compreender açúcares e grupos de fosfato, como pode ser tipicamente encontrado em RNA ou DNA, e/ou um ou mais açúcares modificados ou substituídos e/ou um ou mais grupos fosfato modificados ou substituídos. Modificações de grupos de fosfato ou açúcares podem ser introduzidas para aumentar a estabilidade, a resistência à degradação enimática ou alguma outra propriedade útil. “Ácido nucleico” pode, por exemplo, ter fita dupla, fita parcialmente dupla ou fita simples. Com fita simples, o ácido nucleico pode ser a fita com sentido ou a fita sem sentido. Além disso, o ácido nucleico pode ser circular ou linear. A expressão “ácido nucleico”, da forma utilizada no presente, engloba preferencialmente DNA e RNA, incluindo especificamente RNA, RNA genômico, cDNA, DNA, pró-vírus, pré-mRNA e mRNA.

[00168] O termo “oligonucleotídeo”, da forma utilizada no presente, indica um polímero ou oligômero de ácido nucleico conforme definido no presente. Preferencialmente, um oligonucleotídeo possui (substancialmente) fita simples. Oligonucleotídeos, da forma pretendida no presente, podem ter preferencialmente cerca de 10 a cerca de 100 unidades de nucleosídeos (ou seja, nucleotídeos) de comprimento, preferencialmente cerca de 15 a cerca de 50, de maior preferência cerca de 15 a cerca de 40 e, também preferencialmente, cerca de 20 a cerca de 30.

[00169] Com o termo “pró-vírus”, indica-se no presente o genoma transcrito reverso de um vírus, particularmente um retrovírus, que é integrado ao genoma de DNA de uma célula hospedeira. O termo também inclui formas isoladas de pró-vírus e construções genéticas que as contêm.

[00170] Em realizações preferidas, o ácido nucleico recombinante que codifica o BLV atenuado recombinante conforme descrito no presente é DNA recombinante. Como forma de exemplo, o mencionado DNA pode compreender, consistir essencialmente ou consistir em pró-vírus isolado.

[00171] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um vetor que compreende o ácido nucleico recombinante descrito no presente.

[00172] O termo “vetor” engloba moléculas de ácido nucleico, tipicamente DNA, ao qual fragmentos de ácidos nucleicos, preferencialmente o ácido nucleico recombinante descrito no presente, podem ser inseridos e clonados, ou seja, propagado bovinos. Desta forma, o vetor conterá tipicamente um ou mais sítios de restrição exclusivos e pode ser capaz de reprodução autônoma em um organismo veículo ou hospedeiro definido, de tal forma que a sequência clonada seja reproduzível. O vetor pode também conter preferencialmente um marcador de seleção, tal como um gene de resistência a antibióticos, para permitir a seleção de células receptoras que contenham o vetor. Os vetores podem incluir, sem limitações, plasmídeos, fagomídeos, bacteriófagos, vetores derivados de bacteriófagos, PAC, BAC, ácidos nucleicos lineares, tal como DNA linear etc., conforme apropriado (vide, por exemplo, Sambrook et al, 1989; Ausubel, 1992).

[00173] Fatores de importância na seleção de um vetor específico incluem, entre outros: seleção de células hospedeiras receptoras, a facilidade com que as células receptoras que contêm o vetor podem ser reconhecidas e selecionadas a partir das células receptoras que não contêm o vetor; o número de cópias do vetor que são desejadas em células receptoras específicas; se é desejável que o vetor se integre ao cromossomo ou permaneça extracromossômico nas células receptoras; e se é desejável poder “comutar” o vetor entre células receptoras de diferentes espécies.

[00174] Os vetores preferidos compreendem um marcador de seleção. Preferencialmente, o marcador de seleção não é um gene de resistência à ampicilina, o que ajuda a evitar questões de sensibilidade do paciente a betalactamas. Um marcador de seleção apropriado pode incluir, por exemplo, mas sem limitações, um gene de resistência a canamicina. Outro marcador de seleção apropriado pode incluir um marcador de seleção auxotrófico para uso com células receptoras auxotróficas, como intrinsecamente conhecido. O sistema de seleção com base em crescimento auxotrófico é baseado na restauração do crescimento de células receptoras auxotróficas (ou seja, células receptoras que não possuem um gene essencial funcional para o crescimento) mediante a introdução de um plasmídeo que permita a expressão do produto genético funcional (ou seja, um plasmídeo que compreende um marcador de seleção auxotrófica). As células receptoras são modificadas em primeiro lugar, por exemplo, por meio da introdução de uma deleção ou mutação pontual sem sentido em um gene cromossômico essencial ou condicionalmente essencial, o que resulta em auxotrofia, e o plasmídeo compreende, por exemplo, o gene excluído ou codifica um tRNA supressor que permite tradução completa do produto genético truncado.

[00175] Os vetores preferidos são plasmídeos, de maior preferência plasmídeos bacterianos ou vetores impulsionadores de levedura.

[00176] Exemplos não limitadores de plasmídeos bacterianos apropriados são os capazes de reprodução em E. coli, tais como pSP64.

[00177] Com a expressão “vetor impulsionador de levedura”, indica-se no presente um plasmídeo capaz de clonagem em levedura, preferencialmente Saccharomyces cerevisiae, mas também capaz de reprodução em hospedeiros bacterianos, preferencialmente E. coli. Esses vetores impulsionadores compreendem tipicamente um elemento genético, preferencialmente uma origem de reprodução, que permite a propagação do plasmídeo em hospedeiros bacterianos, preferencialmente E. coli, um marcador selecionável para o hospedeiro bacteriano, um marcador selecionável para a levedura e um sítio de clonagem múltipla.

[00178] Os vetores impulsionadores de levedura preferidos são plasmídeos integrantes de leveduras, plasmídeos epissomais de leveduras ou plasmídeos centroméricos de leveduras.

[00179] Com a expressão “plasmídeo integrante de levedura”, indica-se no presente um plasmídeo de levedura que, por meio de integração homóloga, é integrado ao genoma hospedeiro. Um exemplo não limitador de plasmídeo integrante de levedura é pRS306.

[00180] Com “plasmídeos epissomais de leveduras”, indica-se no presente plasmídeos de leveduras que se mantêm como epissomos ho hospedeiro. Esses plasmídeos epissomais compreendem tipicamente parte da sequência de DNA de plasmídeo 2μ necessária para reprodução autônoma. Um exemplo não limitador de plasmídeo epissomal de levedura é pRS426.

[00181] A expressão “plasmídeo centromérico de levedura” indica um plasmídeo de levedura que se reproduz de forma autônoma e é controlado de forma que o número de cópias do plasmídeo autorreproduzido seja apenas um. Um plasmídeo centromérico de levedura pode compreender tipicamente uma origem de reprodução de levedura (sequência ARS) e uma sequência centromérica que garante a segregação mitótica estável. Um exemplo não limitador de plasmídeo centromérico de levedura é pRS316.

[00182] Em realizações preferidas, o vetor descrito no presente pode ser selecionado a partir do grupo que compreende ou consiste em: um plasmídeo bacteriano, um plasmídeo integrante de levedura, um plasmídeo epissomal de levedura e um plasmídeo centromérico de levedura.

[00183] Um aspecto adicional fornece o plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8166 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2B). O plasmídeo corresponde ao plasmídeo pBLV6073DX, conforme descrito no capítulo experimental.

[00184] Um aspecto adicional fornece o plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8167 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2C). O plasmídeo corresponde ao plasmídeo pBLVGPDX, conforme descrito no capítulo experimental.

[00185] Um aspecto adicional fornece o plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8713 em 25 de outubro de 2013 (vide a Tabela 2D). O plasmídeo corresponde ao plasmídeo pBLV6073GPDX, conforme descrito no capítulo experimental.

[00186] Aspectos adicionais fornecem um ácido nucleico recombinante que codifica um BLV atenuado recombinante, em que o ácido nucleico recombinante compreende, consiste essencialmente ou consiste do inserto do plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8166 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2B) e um vetor que compreende o ácido nucleico recombinante.

[00187] Aspectos adicionais fornecem um ácido nucleico recombinante que codifica um BLV atenuado recombinante, em que o ácido nucleico recombinante compreende, consiste essencialmente ou consiste do inserto do plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8167 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2C) e um vetor que compreende o ácido nucleico recombinante.

[00188] Aspectos adicionais fornecem um ácido nucleico recombinante que codifica um BLV atenuado recombinante, em que o ácido nucleico recombinante compreende, consiste essencialmente ou consiste do inserto do plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8713 em 25 de outubro de 2013 (vide a Tabela 2D) e um vetor que compreende o ácido nucleico recombinante.

[00189] A presente invenção fornece ainda uma célula hospedeira que compreende o BLV atenuado recombinante, o ácido nucleico recombinante, o vetor ou o plasmídeo conforme ensinado no presente. A expressão “célula hospedeira” pode adequadamente designar células que englobam células procarióticas, como bactérias, e células eucarióticas, tais como leveduras, fungos, protozoários, células animais e vegetais. Uma célula hospedeira pode particularmente designar uma célula hospedeira isolada, tal como uma célula hospedeira mantida e/ou propagada em condições de laboratório, tal como em cultivo microbiológico ou em cultivo de tecidos ou células.

[00190] Em realizações preferidas, a célula hospedeira pode ser uma célula bacteriana, célula de levedura, célula de animal ou célula de mamífero.

[00191] Exemplos não limitadores de células bacterianas apropriadas incluem Escherichia coli, tal como linhagem STBL2® de E. coli (Invitrogen; genótipo e fundo: [F-mcrA Δ(mcrBC-hsdRMSmrr) recA1 endA1 gyrA96 thi supE44 relAI A-Δ(lac-proAB)]) ou SURE (Stratagene; genótipo e fundo: e14-(McrA-) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F’ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]); Yersinia enterocolitica; ou Brucella sp., tal como linhagem S19 ou linhagem RB51 de Brucella abortus. Outros exemplos não limitadores de células bacterianas apropriadas incluem, por exemplo, Salmonella tymphimurium, Serratia marcescens ou Bacillus subtilis. Preferencialmente, essas bactérias, tais como E. coli podem conduzir pelo menos o recA, a fim de reduzir ou evitar a recombinação de repetições diretas no plasmídeo pró-vírus de BLV.

[00192] Um exemplo não limitador de uma célula de levedura apropriada inclui levedura do gênero Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Pichia, como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe ou Pichia pastoris.

[00193] Exemplos não limitadores de células de animais apropriadas podem incluir células de animais humanos e não humanos, tais como células de animais vertebrados, células de mamíferos, células de primatas, células humanas ou células de insetos.

[00194] Células de animais, tais como células de mamíferos, como células de mamíferos humanos ou não humanos, podem incluir células primárias, secundárias, terciárias etc., ou podem incluir linhagens celulares imortalizadas, incluindo linhagens de células clonais. Células de animais preferidas podem ser facilmente mantidas e transformadas em cultivo de tecidos.

[00195] Exemplos preferidos, mas não limitadores, de células humanas incluem a linhagem de células HeLa (câncer cervical) humanas. Outras linhagens de células humanas na prática de cultivo celular incluem, entre outras, DU145 (câncer da próstata), Lncap (câncer da próstata), MCF-7 (câncer de mama), MDA-MB-438 (câncer de mama), PC3 (câncer da próstata), T47D (câncer de mama), THP-1 (leucemia mieloide aguda), U87 (glioblastoma), SHSY5Y (neuroblastoma) ou células Saos-2 (câncer dos ossos).

[00196] Um exemplo não limitador de células de primatas são as células Vero (linhagem de células epiteliais de rim do macaco verde africano Chlorocebus).

[00197] Exemplos não limitadores de células de roedores são as linhagens celulares GH3 (tumor da pituitária) ou PC12 (feocromocitoma) de ratos ou a linhagem celular MC3T3 (calvário embriônico) de camundongo.

[00198] Exemplos não limitadores de células de insetos incluem células derivadas de Drosophila melanogaster, tais como células Schneider 2, linhagens celulares derivadas da lagarta do cartucho Spodoptera frugiperda, tais como células Sf9 e Sf21, ou células derivadas da traça do repolho Trichoplusia ni, tais como células High Five.

[00199] Métodos de introdução de ácidos nucleicos, incluindo vetores, em uma célula hospedeira (ou seja, transfecção ou transformação) são conhecidos dos técnicos no assunto e podem incluir coprecipitação de fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção, lipofecção, transfecção empregando reagentes de transfecção de poliamina, bombardeamento de células por microprojéteis de tungstênio revestidos com ácido nucleico etc.

[00200] As células hospedeiras ensinadas no presente podem ser vivas ou inativadas (ou seja, mortas) por meio de um procedimento de desativação celular apropriado, tal como por secagem por congelamento, sonicação ou irradiação.

[00201] O BLV atenuado recombinante, o ácido nucleico recombinante, o vetor, o plasmídeo ou a célula hospedeira, conforme ensinado no presente, podem ser formulados em uma composição farmacêutica com um excipiente farmaceuticamente aceitável, ou seja, um ou mais aditivos e/ou substâncias veículo farmaceuticamente aceitáveis, tais como tampões, veículos, excipientes, estabilizantes etc. A expressão “farmaceuticamente aceitável”, da forma utilizada no presente, é consistente com a técnica e os meios compatíveis com os demais ingredientes da composição farmacêutica e não prejudiciais para o paciente.

[00202] Consequentemente, em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende o BLV atenuado recombinante, o ácido nucleico recombinante, o vetor, o plasmídeo ou a célula hospedeira conforme descrito no presente.

[00203] Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece o BLV atenuado recombinante, o ácido nucleico recombinante, o vetor, o plasmídeo ou a célula hospedeira conforme descrito no presente para uso em medicamento.

[00204] Também é descrito no presente o uso do BLV atenuado recombinante, do ácido nucleico recombinante, do vetor, do plasmídeo ou da célula hospedeira conforme ensinado no presente para a produção de medicamentos.

[00205] Pode-se permitir, por exemplo, que células hospedeiras conforme descrito no presente produzam e, opcionalmente, realizem secreção de partículas de BLV atenuadas recombinantes, o que exige a expressão da sequência pró-viral, embalagem do genoma viral em uma cápsula, formação de complexo de partículas de envelope com membranas celulares e nascimento do virião similar a infecção natural. Opcionalmente, as partículas virais colhidas podem, após etapas de purificação e/ou processamento adicionais tais como liofilização, ser suspensas em meio apropriado para administração. As partículas de BLV atenuadas recombinantes podem ser liofilizadas na presença de excipientes comuns tais como lactose, outros açúcares, estearato, carbonato e/ou sulfato de metais alcalinos e/ou alcalino-terrosos (tais como estearato de magnésio, carbonato de sódio e sulfato de sódio), caulim, sílica, aromatizantes e aromas.

[00206] Em outro exemplo, pode-se permitir a propagação dos vetores descritos no presente, preferencialmente dos plasmídeos pró-virais descritos no presente (ou seja, plasmídeos que compreendem pró-vírus de BLV recombinante), para uma célula hospedeira apropriada, e, em seguida, os vetores purificados podem ser formulados com lipossomos catiônicos, tais como metilsulfato de N-(1-(2,3-dioleoilóxi)propil)-N,N,N-trimetilamônio (DOTAP), em meio apropriado para administração.

[00207] Em ainda outro exemplo, pode ser cultivada a célula hospedeira descrita no presente, mediante o quê as células colhidas, opcionalmente após etapas de purificação e/ou processamento adicionais, tais como secagem por congelamento, sonicação ou irradiação para desativá-las, podem ser utilizadas para preparar a formulação. Essas formulações incluem, mas sem limitações, células de bactérias leveduras ou mamíferos vivas ou inativadas (ou seja, mortas), por exemplo, por meio de secagem por congelamento, sonicação ou irradiação, tais como células HeLa, quen compreendem um epissomo ou plasmídeo de DNA pró-viral ou DNA pró-viral integrado ao seu genoma e um meio apropriado para administração.

[00208] Em realizações preferidas, a composição farmacêutica pode ser uma vacina.

[00209] Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece o BLV atenuado recombinante, o ácido nucleico recombinante, o vetor, o plasmídeo, a célula hospedeira ou a composição farmacêutica conforme descrito no presente, para uso como vacina, particularmente para uso como vacina contra doença associada a BLV, mais particularmente para uso como vacina profilática contra doença associada a BLV. Conforme discutido em outros pontos no presente relatório descritivo, essa vacina pode convenientemente destinar-se a proteção a longo prazo (por exemplo, proteção por pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses, pelo menos 36 meses ou pelo menos 48 meses após a vacinação) de animais, preferencialmente bovídeos, de maior preferência gado bovino, contra infecção por BLV do tipo selvagem (que pode ser heterólogo para a vacina). Essa vacina pode, portanto, proteger virtualmente todos os animais, preferencialmente bovídeos, de maior preferência gado bovino, tal como pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, tal como 98%, 99% ou até 100% dos animais vacinados.

[00210] Também é descrito no presente o uso do BLV atenuado recombinante, do ácido nucleico recombinante, do vetor, do plasmídeo ou da célula hospedeira conforme ensinado no presente para a produção dessa vacina.

[00211] Uma vacina pode tipicamente compreender uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição ou substância imunogênica.

[00212] A expressão “quantidade imunologicamente eficaz” designa uma quantidade de composição ou substância imunogênica eficaz para aprimorar a reação imunológica do paciente contra exposição subsequente ao imunogene. Os níveis de imunidade induzida podem ser determinados, por exemplo, medindo-se as quantidades de neutralização de anticorpos do soro e/ou de secreção, por exemplo, por meio de neutralização de placas, fixação de complementos, teste de microneutralização ou imunossorvente ligado por enzimas.

[00213] Como forma de exemplo, uma quantidade imunologicamente eficaz do ácido nucleico recombinante, do vetor ou do plasmídeo conforme ensinado no presente pode compreender pelo menos cerca de 25 ng de ácido nucleico, pelo menos cerca de 50 ng de ácido nucleico, pelo menos cerca de 100 ng de ácido nucleico, pelo menos cerca de 250 ng de ácido nucleico, pelo menos cerca de 500 ng de ácido nucleico, pelo menos cerca de 750 ng de ácido nucleico, pelo menos cerca de 1 μg de ácido nucleico, pelo menos cerca de 2 μg de ácido nucleico, pelo menos cerca de 5 μg de ácido nucleico, pelo menos cerca de 10 μg de ácido nucleico, pelo menos cerca de 50 μg de ácido nucleico ou pelo menos cerca de 100 μg de ácido nucleico, por exemplo, em dose isolada ou repetida. As dosagens do ácido nucleico para administração variarão dependendo de qualquer quantidade de fatores, incluindo o tipo de mutante de BLV, o paciente, a via de administração a ser utilizada, a prevalência da doença a ser tratada etc. Portanto, dosagens precisas não podem ser definidas para cada realização da presente invenção, mas serão facilmente evidentes para os técnicos no assunto de posse da presente invenção.

[00214] Como forma de exemplo, uma quantidade imunologicamente eficaz de uma vacina que compreende células hospedeiras, tais como bactérias, que compreendem plasmídeo pró-viral, podem compreender pelo menos 104 bactérias, pelo menos 105 bactérias, pelo menos 106 bactérias, pelo menos 107 bactérias, pelo menos 108 bactérias, pelo menos 109, pelo menos 1010, pelo menos 1011, pelo menos 1012, pelo menos 1013, pelo menos 1014, pelo menos 1015 ou mais bactérias, por exemplo, em uma ou mais doses. As dosagens de células hospedeiras para administração variarão dependendo de qualquer quantidade de fatores, incluindo o tipo de célula hospedeira, os níveis de expressão, a via de administração a ser utilizada, a prevalência da doença a ser tratada etc. Portanto, dosagens precisas não podem ser definidas para cada realização da presente invenção, mas serão facilmente evidentes para os técnicos no assunto de posse da presente invenção.

[00215] A vacina pode compreender adicionalmente um ou mais adjuvantes para aprimorar a reação imunológica. Adjuvantes apropriados incluem, por exemplo, mas sem limitações, saponina, géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias ativas na superfície tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões em óleo ou hidrocarbonetos, bacilos de Calmette-Guerin (BCG), Corynebacterium parvum e o adjuvante sintético QS-21.

[00216] Opcionalmente, a vacina pode compreender adicionalmente uma ou mais moléculas imunoestimulantes. Exemplos não limitadores de moléculas imunoestimulantes incluem várias citoquinas, linfoquinas e quemoquinas com atividades imunoestimulantes, imunopotenciadoras e pró-inflamatórias, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12 e IL-13); fatores de crescimento (por exemplo, fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos (GM) (CSF)); e outras moléculas imunoestimulantes, tais como fator inflamatório de macrófagos, ligante Flt3, B7.1, B7.2 etc.

[00217] Em realizações preferidas, a vacina conforme ensinado no presnete pode compreender uma ou mais composições ou substâncias imunogênicas adicionais.

[00218] Qualquer substância ou composição capaz de permitir reação imunológica pode ser adicionada à vacina. Como forma de exemplo, mas sem limitação, essa substância imunogênica pode ser um ácido nucleico recombinante, tal como um plasmídeo, que compreende sequências de codificação para epítopos ou antígenos; ou vírus atenuados vivos, por exemplo, na forma de plasmídeo pró-viral; ou bactérias atenuadas vivas. Vacinas que compreendem células hospedeiras, tais como bactérias, conforme descrito no presente, podem, por exemplo, compreender um plasmídeo pró-viral de BLV e um ou mais plasmídeos que compreendem sequências de codificação para antígenos ou epítopos.

[00219] Essas vacinas de combinação podem destinar-se a evitar diversas doenças ou uma doença causada por diferentes variantes do mesmo organismo que causa a doença.

[00220] Substâncias imunogênicas apropriadas para uso em combinação com a vacina descrita no presente são, sem limitações, vírus da herpes bovina atenuados vivos, tais como vírus da herpes bovina atenuado vivo do tipo I ou Clostridium sp atenuado vivo.

[00221] A presente invenção fornece ainda o BLV atenuado recombinante, ácido nucleico recombinante, vetor, plasmídeo, célula hospedeira ou composição farmacêutica conforme descrito no presente, para uso em tratamento de doença associada a BLV, particularmente para uso em prevenção (ou seja, tratamento preventivo, tratamento profilático e profilaxia) de doença associada a BLV.

[00222] A expressão “doença associada a BLV”, da forma pretendida no presente, engloba geralmente qualquer doença e distúrbio causado por infecção de BLV.

[00223] Doenças associadas a BLV incluem, entre outras, preferencialmente leucose bovina enzoótica, que pode incluir linfose persistente bovina, linfossarcoma bovina e linfoma bovina.

[00224] Da forma utilizada no presente, os termos “tratar” ou “tratamento” designam tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas. Os termos “tratamento”, “tratar” e similares, da forma utilizada no presente, incluem melhoria ou eliminação de condição ou doença desenvolvida após o seu estabelecimento ou alívio dos sintomas características dessa doença ou condição. Da forma utilizada no presente, esses termos englobam preferencialmente, dependendo da condição do paciente, evitar o início de uma doença ou condição ou de sintomas associados a uma doença ou condição, incluindo a redução da severidade da doença ou condição ou sintomas associados a ela antes da aflição com a mencionada doença ou condição. Essa prevenção ou redução antes da aflição designa a administração do composto ou composição de acordo com a presente invenção a um paciente que, no momento da administração, não está afligido com a doença ou condição. “Prevenção” também engloba a prevenção da recorrência ou prevenção de reincidência de uma doença ou condição ou de sintomas associados, por exemplo, após um período de melhoria.

[00225] Em realizações preferidas, o tratamento é tratamento profilático, tal como preferencialmente vacinação profilática, e, por meio disso, pode-se evitar a prevenção de (super)infecção com outro vírus BLV.

[00226] O BLV atenuado recombinante, o ácido nucleico recombinante, o vetor, o plasmídeo, a célula hospedeira ou a composição farmacêutica tal como vacina, conforme descrito no presente, pode, em certas realizações, beneficiar-se de mais de uma administração a pacientes. Nessas realizações, portanto, após uma administração inicial do BLV atenuado recombinante, o ácido nucleico recombinante, o vetor, o plasmídeo, a célula hospedeira ou a composição farmacêutica tal como vacina conforme descrito no presente a pacientes (essa administração inicial pode ser indicada como estímulo de antígeno primário ou “primer”), uma ou mais administrações subsequentes (essa(s) administração(ões) subsequente(s) pode(m) ser indicada(s) como “amplificação”) do BLV atenuado recombinante, o ácido nucleico recombinante, o vetor, o plasmídeo, a célula hospedeira ou a composição farmacêutica tal como vacina, conforme descrito no presente, ao paciente pode ser conveniente para sustentar ou, preferencialmente, aumentar a reação imunológica antiviral no paciente.

[00227] Em certas realizações, essa “amplificação” pode envolver administrações repetidas do BLV atenuado recombinante, do ácido nucleico recombinante, do vetor, do plasmídeo, da célula hospedeira ou da composição farmacêutica tal como vacina conforme descrito no presente em intervalos regulares após a administração inicial, tal como em intervalo regular de cerca de 0,5 ano, cerca de 1,0 ano, cerca de 1,5 ano, cerca de 2,0 anos, cerca de 2,5 anos, cerca de 3 anos, cerca de 4 anos ou cerca de 5 anos, preferencialmente em intervalo de cerca de 1,0 ano ou cerca de 2,0 anos e, de preferência ainda maior, em intervalo de cerca de 1,0 ano. Neste contexto, essas administrações “repetidas” podem indicar, por exemplo, duas ou mais administrações, três ou mais administrações, quatro ou mais administrações ou cinco ou mais administrações após a administração inicial. Em um exemplo, administrações “repetidas” podem indicar que essas administrações são repetidas ao longo de toda a vida do paciente.

[00228] O termo “paciente”, da forma utilizada no presente, designa particularmente animais, mais especificamente mamíferos, tais como mamíferos não humanos e, mais especificamente, bovídeos. Os bovídeos são mamíferos ruminantes biungulados pertencentes à família Bovidae. Os membros incluem, por exemplo, mas sem limitações, bisão, búfalo africano, búfalo d’água, antílopes, gazelas, carneiros, cabras, bois almiscarados e gado bovino doméstico. Os bovídeos preferidos são bovinos, tais como búfalos, zebus e gado bovino doméstico, particularmente animais pertencentes ao gênero Bos, mais especificamente Bos primigenius, incluindo gado bovino (vacas), de maior preferência gado bovino (vacas).

[00229] Portanto, em realizações preferidas, o paciente é um bovídeo, de maior preferência um bovino, de preferência ainda maior gado bovino, tal como vaca.

[00230] A presente invenção refere-se ainda um animal não humano, preferencialmente mamífero não humano, de maior preferência bovídeo, de preferência ainda maior bovino, tal como gado bovino, ao qual foi administrado o BLV atenuado recombinante, o ácido nucleico recombinante, o vetor, o plasmídeo, a célula hospedeira ou a composição farmacêutica conforme descrito no presente. Exemplos de animais não humanos úteis neste contexto incluem, sem limitações, vacas, porcos, burros, cavalos, coelhos, cabras, carneiros, cobaias, ratos, camundongos e similares.

[00231] Esse animal não humano pode abrigar, no genoma de pelo menos algumas das suas células, preferencialmente no genoma de pelo menos algumas das suas células mononucleares do sangue periférico (PBMC), um pró-vírus que codifica o vírus da leucemia bovina atenuado recombinante, conforme ensinado no presente.

[00232] A presente invenção também fornece, portanto, métodos de preparação de materiais derivados de animais não humanos, que compreendem a obtenção de material do animal não humano conforme ensinado acima (por exemplo, por meio de ordenha ou abate do animal) e, opcionalmente, processamento adicional do mencionado material em produtos derivados de animais não humanos (por exemplo, repartição, tratamento com conservantes, embalagem etc.).

[00233] A presente invenção fornece adicionalmente um material derivado de animal não humano ou produto derivado de animal não humano que pode ser obtido ou obtido diretamente do mencionado animal não humano ou que pode ser obtido ou obtido diretamente por meio do mencionado método.

[00234] Em realizações preferidas, o material derivado de animais não humanos ou o produto derivado de animais não humanos pode compreender, consistir ou ser isolado de secreção da glândula mamária do animal não humano ou uma de suas partes, particularmente em que o material ou produto compreende, consiste ou é isolado de leite ou colostro.

[00235] Em outras realizações preferidas, o material derivado de animais não humanos ou o produto derivado de animais não humanos pode compreender, consistir ou ser isolado de sangue integral do animal não humano, particularmente em que o material ou produto compreende, consiste ou é isolado de sangue integral ou fração de sangue integral, tal como plasma ou soro.

[00236] A presente invenção refere-se ainda ao mencionado material derivado de animal não humano ou ao mencionado produto derivado de animal não humano para uso como vacina, particularmente para uso como vacina contra doença associada a BLV, mais especificamente para uso como vacina profilática contra doença associada a BLV.

[00237] Dever-se-á apreciar que esse material derivado de animal não humano ou o mencionado produto derivado de animal não humano pode, portanto, conter o vírus BLV atenuado ou o pró-vírus BLV ou células que o contêm, ou pode conter anticorpos que tenham sido elevados contra o vírus BLV atenuado no paciente do qual é obtido o produto ou material (ou seja, imunização passiva).

DEPÓSITOS DE MATERIAL BIOLÓGICO:

[00238] As Tabelas 2A, 2B, 2C e 2D a seguir resumem as indicações necessárias com relação a micro-organismos depositados ou outro material biológico indicado ao longo de todo o presente relatório descritivo.TABELA 2A

[00239] Indicações relativas ao plasmídeo depositado pBLV344H: TABELA 2B

[00240] Indicações relativas ao plasmídeo depositado pBLV6073DX: TABELA 2C

[00241] Indicações relativas ao plasmídeo depositado pBLVGPDX: TABELA 2D

[00242] Indicações relativas ao plasmídeo depositado pBLV6073GPDX:

EXEMPLOS EXEMPLO 1 PROJETO E CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEOS DE PRÓ-VÍRUS BLV MUTANTES E DO TIPO SELVAGEM:

[00243] O pró-vírus do vírus da leucemia bovina (BLV) recombinante plasmídeo pBLV6073DX é derivado do plasmídeo pBLV344H descrito em Willems et al, 1993 (J. Virol. 67: 4078-4085), incorporado especificamente ao presente como referência. pBLV344H compreende pró- vírus BLV do tipo selvagem completo derivado de tecidos infectados do animal carneiro 344 infectado experimentalmente com uma variante belga de BLV, conforme descrito por Van den Broeke et al, 1988 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85: 9263-9267), incorporado especificamente ao presente como referência. O plasmídeo pBLV344H foi depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8165 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2A).

[00244] O plasmídeo de pró-vírus BLV recombinante pBLV6073DX foi construído utilizando métodos de clonagem molecular padrão. Esquematicamente, o fragmento KpnI-XbaI de pBLV6073 (posições 2111-6614; tamanho de 4,5 kbp) foi ligado ao fragmento XbaI-KpnI de pBLVDX (posição 6997-2111 (o sítio Xba1 adjacente à posição 6997 em pBLVDX foi introduzido por meio da clonagem, vide abaixo); tamanho de 4,7 kbp). As posições de nucleotídeos de pró-vírus BLV são numeradas no presente relatório descritivo de acordo com a sequência descrita em Rice et al, 1987, acima, e uma certa porção dela é reproduzida na Fig. 1D. O nucleotídeo 1 é o primeiro na extremidade 5’ da região R da repetição terminal longa 5’ (LTR).

[00245] pBLV6073DX (Fig. 1H) conduz a mutação na posição 6073 de pBLV6073 e as exclusões nas ORFs de R3 e G4 de pBLVDX. Mais especificamente, pBVL6073DX conduz uma substituição de nucleotídeo T na posição 6073 da sequência de ácido nucleico de BLV por um nucleotídeo G e compreende adicionalmente um segmento de oligonucleotídeos composto de dois oligonucleotídeos hibridizados com as sequências 5’-CTAGAAAGCTTG-3’ (SEQ ID NO: 1) e 5’-GATCCAAGCTTT-3’ (SEQ ID NO: 2), respectivamente, substituindo o segmento de ácidos nucleicos entre o sítio XbaI na posição 6614 e o sítio BamHI na posição 6997 da sequência de ácido nucleico de BLV (Fig. 1J).

[00246] O plasmídeo de pró-vírus BLV recombinante pBLV6073 é derivado do plasmídeo pBLV344H utilizando procedimento de mutagênese dirigido a sítio com base em PCR conforme descrito em Willems et al, 1995 (J. Virol. 69: 4137-4141), especificamente incorporado ao presente como referência. pBLV6073 conduz uma substituição de um resíduo T por um resíduo G na posição 6073 em um motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAM) localizado na proteína transmembrana gp30 do envelope (Fig. 1G).

[00247] O plasmídeo de pró-vírus BLV recombinante pBLVDX é derivado do plasmídeo pBLV344H por meio de clonagem de um segmento de oligonucleotideo duplo composto de dois oligonucleotídeos hibridizados com as sequências 5’-CTAGAAAGCTTG-3’ (SEQ ID NO: 1) e 5’-GATCCAAGCTTT-3’ (SEQ ID NO: 2) nos sítios de restrição XbaI e BamHI (posições 6614 e 6997) de pBLV344H, conforme descrito em Willems et al, 1993 (J. Virol. 67: 40784085), especificamente incorporado ao presente como referência. pBLVDX conduz exclusões nos quadros de leitura aberta (ORFs) de R3 e G4 (Fig. 1F).

[00248] pBLV6073DX foi depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8166 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2B).

EXEMPLO 2 CONFIGURAÇÃO DE SISTEMA DE FORNECIMENTO:

[00249] Foi desenvolvido um protocolo com base na transfecção transitória de células HeLa com plasmídeos pró-virais e injeção subcutânea ou intradérmica subsequente. Particularmente, duas placas de Petri de 150 cm2 de monocamadas de células HeLa subconfluentes foram transfectadas com pBLV6073DX (35 μg por placa) em complexo (razão 1:5) com reagente de transfecção (TransIT®, Mirus Bio LCC ou FuGENE®, Roche). Após dois dias de cultivo (37 °C em atmosfera umidificada com 95%-5% de ar-CO2) em Meio Eagle Modificado da Dulbecco completo (ou seja, suplementado com 10% de soro de feto de bezerro (FCS), 2 mM de L-glutamina, 100 U de penicilina e 100 μg de estreptomicina por ml) (DMEM, Invitrogen), células transfectadas foram tripsinizadas, lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e injetadas por via subcutânea.

[00250] Este protocolo de fornecimento fornece uma alternativa para protocolos mais familiares, tais como infecção por BLV ou injeção de DNA pró-viral purificado, e oferece certas vantagens sobre esses protocolos. Infecção por BLV, por exemplo, necessita de expressão do genoma de RNA viral, sua embalagem em capsídeos, formação de complexo de proteínas de envelope com membranas celulares e nascimento do virião. Nessa forma extracelular, entretanto, a partícula viral é comparativamente instável. Isso pode ser evitado, por exemplo, por meio da infecção de animais por meio de injeção de DNA pró-viral purificado. A embalagem de DNA pró-viral em lipossomos catiônicos e injeção intradérmica, por exemplo, permite infecção viral. Esta técnica requer, entretanto, a produção e purificação de grandes quantidades de DNA de plasmídeo (100-500 microgramas por animal) e a infecção por meio de injeção de DNA direta tende a ser comparativamente menos eficiente, potencialmente necessitando de uma segunda injeção e/ou estendendo o período de latência antes da soroconversão.

[00251] Também desenvolvemos outra estratégia com base na injeção intradérmica da linhagem STBL2® de E. coli ([F-mcrA Δ(mcrBC- hsdRMSmrr) recAI endAI gyrA96 thi supE44 relAI A-Δ(lac-proAB)]; Trinh et al (1994, FOCUS 16: 78)); disponível por meio da Invitrogen, que conduz o plasmídeo pró-viral. Células STBL2® transformadas com pBLV6073DX foram cultivadas por uma noite em 5 ml de meio de caldo Luria-Bertani (LB) (Invitrogen) contendo 50 μg/ml de ampicilina a 28 °C. As bactérias foram centrifugadas em seguida, lavadas, novamente suspensas em 2 ml de PBS e injetadas por via subcutânea ou intradérmica.

[00252] Este método direto e eficaz para seu custo de injeção de células STBL2® que conduzem o plasmídeo pró-viral transmitiram a infecção de forma muito reproduzível para hospedeiros nativos após uma única injeção. Nenhum efeito tóxico ou colateral da injeção de células STBL2® foi registrado, de acordo com a sua folha de dados de segurança. Convenientemente, o uso de células bacterianas no lugar de células de mamíferos tais como as células de HeLa humanas evita o risco de introdução inadvertida de outros patógenos, tais como HPV, e reduz a complexidade de formulações de vacina com base em células (células bacterianas não necessitam, por exemplo, ser preservadas em nitrogênio líquido durante o transporte).

[00253] Os experimentos detalhados abaixo foram realizados utilizando injeção subcutânea de células HeLa que conduzem os plasmídeos pró-virais. São obtidos resultados comparáveis utilizando injeção subcutânea de linhagem STBL2(R) de E. coli que conduz os plasmídeos pró-virais.

EXEMPLO 3

[00254] O pró-vírus BLV6073DX recombinante é infeccioso e causa forte reação imunológica antiviral, mas reproduz-se em níveis reduzidos.

[00255] Um teste preliminar realizado sob condições restritas demonstrou que o pró-vírus BLV6073DX recombinante é seguro devido à: (i) ausência de patologia ou toxicidade em vacas vacinadas e no modelo experimental ovino com alta susceptibilidade; (ii) falta de transmissão do pró- vírus BLV6073DX recombinante para sentinelas não infectadas ao longo de um período de três anos; e (iii) ausência de níveis detectáveis de DNA de plasmídeo (incluindo o gene β-lactamase), conforme revelado por meio de PCR abrigada (dados não exibidos).

[00256] Foi projetado um ambiente experimental em larga escala. Dez vacas foram infectadas com pró-vírus BLV6073DX recombinante (ou seja, vacinadas) e cinco outras foram infectadas com pró-vírus BLV do tipo selvagem (WT). Todas as vacas foram mantidas em um rebanho de 74-82 animais (dependendo do ano), dentre as quais cerca de 15-30% foram infectadas naturalmente com linhagem de BLV argentino (ArgWT). Além da eficácia da vacina, este projeto também permite avaliação de segurança sob condições reais de plantio (ou seja, transmissão da vaca para o bezerro e infecção de sentinelas).

[00257] Conforme revelado por um teste de ELISA competitivo (teste de bloqueio de soro de leucose bovina ELISA, Institut Pourquier), a injeção de pBLV6073DX causou reação de anticorpo antiviral com cinética similar a infecções do tipo selvagem (Fig. 2A). De forma importante, os títulos de anticorpo não foram estatisticamente diferentes entre animais infectados vacinados e do tipo selvagem (Fig. 2B).

[00258] Cargas pró-virais foram medidas por meio de qPCR. Resumidamente, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas por meio de centrifugação de gradiente de densidade de Percoll (GE Healthcare) e lavadas por duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS)/0,075% de EDTA e pelo menos três vezes com PBS isolado. DNA foi isolado utilizando o kit de tecido e sangue DNeasy (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Cem nanogramas de DNA genômico foram utilizados para amplificação por PCR em tempo real de sequências pró-virais de BLV. Um segmento correspondente ao gene pol foi amplificado utilizando os primers 5’-GAAACTCCAGAGCAATGGCATAA-3’ (SEQ ID NO: 5) e 5’- GGTTCGGCCATCGAGACA-3’ (SEQ ID NO: 6) e Mistura Master de mPCR MESA GREEN (Eurogentec) em um ciclizador de luz (Roche), de acordo com as instruções do fabricante. Foi gerada uma curva padrão após a amplificação de números de cópias pró-virais definidos (de 102 a 106 do plasmídeo pBLV344) diluídas em 100 ng de DNA genômico controle. Para corrigir diferenças das concentrações de DNA, o DNA de actina foi quantificado em paralelo, utilizando os primers 5’-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3’ (SEQ ID NO: 7) e 5’-GGCAGACTTAGCCTCCAGTG-3’ (SEQ ID NO: 8). Condições térmicas: 95 °C, cinco minutos; (95 °C, 15 segundos; 60 °C, 20 segundos; 72 °C, 40 segundos, 45 vezes). A carga pró-viral foi calculada a partir do número de cópias pró-virais dividido pela metade do número de cópias de actina, expressa como o número de cópias pró-virais por 100 de PBMCs.

[00259] As cargas pró-virais (PVL) foram significativamente reduzidas em animais vacinados (Fig. 3). De fato, os números de cópias pró- virais por cem células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram tipicamente de menos de 2 em vacas infectadas com o BLV6073DX recombinante. Em vacas infectadas do tipo selvagem, as PVLs foram até cem vezes mais altas.

[00260] De forma importante, não se observou patogenicidade de BLV6073DX em nenhuma das dez vacas vacinadas em um período de quase 3,5 anos após a inoculação (vacinação em 21 de outubro de 2010). De forma similar, nenhuma das três vacas utilizadas no teste preliminar exibiu patogenicidade de BLV6073DX em um período de quase 5,5 anos após a inoculação (vacinação em 10 de outubro de 2008). Além disso, dois carneiros utilizados em estudos de teste anteriores e vacinados com BLV6073DX não exibiram patogenicidade de BLV6073DX em um período de cerca de quatro e cinco anos após a inoculação. A ausência de patogenicidade detectdável nesses experimentos confirma a adequação de BLV6073DX como vacina segura, enfatizando sua superioridade sobre BLV6073, que causou a patogenicidade em um dentre quatro carneiros, e BLVDX, que causou a patogenicidade em um dentre oito carneiros (Florins et al, 2007, acima).

[00261] Além disso, estudos de sequenciamento realizados sobre os animais vacinados confirmaram que BLV6073DX não estava sujeito a mutações nos animais inoculados, de forma a corroborar adicionalmente a estabilidade e a segurança da vacina.

[00262] Experimentos preliminares também sustentaram a conclusão de que BLV6073DX induz convenientemente reação imunológica citotóxica em vacas vacinadas.

EXEMPLO 4

[00263] Animais vacinados com pró-vírus BLV6073DX não são infectados com vírus do tipo selvagem em condições de rebanho.

[00264] Para rastreabilidade, foi projetado um protocolo para identificar animais vacinados com base em PCR abrigada utilizando primers que ladeiam a deleção em ORFs R3 e G4 de pBLV6073DX (Fig. 4). Resumidamente, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas do sangue utilizando Ficoll® de acordo com as instruções do fabricante (Sigma Aldrich). DNA foi isolado utilizando o kit de tecido e sangue DNeasy (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Duzentos e cinquenta nanogramas de DNA foram utilizados para a primeira rodada de reação de PCR (PCR1) utilizando polimerase de DNA de alta fidelidade Phusion Hot Start II no tampão de alta fidelidade (Thermoscientific). Um microlitro de PCR1 diluído dez vezes foi utilizado como modelo para a segunda rodada de PCR (PCR abrigado) utilizando a mesma polimerase de DNA e condição de tampão. Protocolo térmico para PCR1: 98 °C, 30 segundos (98 °C, 5 seg; 64 °C, 10 seg; 72 °C, 30 seg, 35 vezes); 72 °C, 2 minutos. Protocolo térmico para PCR abrigado: 98 °C, 30 segundos; (98 °C, 5 segundos; 70 °C, 10 segundos; 72 °C, 30 segundos, 35 vezes); 72 °C, 2 minutos. Sequências de primer para PCR1: Frontal, 5’-CTCACTTCTGCTTCACCATCC-3’ (SEQ ID NO: 9); Reverso, 5’-GGCAGGCATGTAGAGAGTGG-3’ (SEQ ID NO: 10). Sequências de primer para PCR abrigado: nFrontal, 5’- TGGAAAGAACTAACGCTGACGG-3’ (SEQ ID NO: 11); nReverso, 5’- CCCCAACCAACAACACTTGCTT-3’ (SEQ ID NO: 12). Realizou-se uma terceira reação de PCR utilizando 250 ng de DNA para amplificar um fragmento do gene actina como controle utilizando as mesmas condições. Protocolo térmico para PCR de actina controle: 98 °C, 30 segundos; (98 °C, 5 segundos; 64 °C, 10 segundos; 72 °C, 30 segundos, 35 vezes); 72 °C, 2 minutos. Sequências de primer para PCR de actina controle: Frontal, 5’- TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3’ (SEQ ID NO: 7); Reverso, 5’- GGCAGACTTAGCCTCCAGTG-3’ (SEQ ID NO: 8).

[00265] O protocolo identificou efetivamente as dez vacas vacinadas, ou seja, as vacas infectadas com o pró-vírus BLV6073DX recombinante, conforme demonstrado pela amplificação do fragmento pequeno (Fig. 5). Um fragmento grande foi amplificado nos animais infectados com BLV do tipo selvagem (Fig. 5). Como controle, não ocorreu amplificação em dois bezerros não infectados e na ausência de DNA (água) (Fig. 5). Os dados demonstram, portanto, que as dez vacas vacinadas mantidas em um rebanho infectado com BLV do tipo selvagem conduziram sequências genéticas correspondentes ao pró-vírus BLV6073DX recombinante, mas não ao pró-vírus BLV do tipo selvagem. Este tipo de perfil foi preservado desde 19 de outubro de 2010.

[00266] Como todos os animais foram mantidos no mesmo rebanho, estes dados também demonstram que o pró-vírus do tipo selvagem não é transmitido para vacas vacinadas, o que sugere que o pró-vírus BLV6073DX recombinante protege eficientemente contra superinfecções. Merece observação que o plasmídeo pBLV6073DX origina-se da linhagem de BLV do tipo selvagem 344, que é diferente das variantes de BLV argentinas. Esta observação indica, portanto, que infecções com pró-vírus BLV6073DX recombinante (ou seja, vacinação) protegem contra a infecção de vírus BLV heterólogos.

[00267] A observação de que todas as dez vacas vacinadas permaneceram livres de vírus BLV do tipo selvagem por quase 3,5 anos após a vacinação confirma as vantagens de BLV6073DX como vacina com efeito protetor comparativamente de longo prazo, tal como efeito protetor de pelo menos 18 meses, preferencialmente pelo menos 24 meses, de maior preferência pelo menos 36 meses, de preferência ainda maior pelo menos 48 meses ou até mais após a vacinação em animais, especialmente em gado bovino. Por outro lado, uma das duas vacas vacinadas utilizando o pró-vírus pBLVDX previamente existente infectou-se com BLV do tipo selvagem doze meses após o desafio (Kerkhofs et al, 2000, acima) e uma vaca (n° 269) vacinada utilizando o pró-vírus pBLV6073 previamente existente infectou-se com BLV do tipo selvagem 24 meses após o desafio (Kerkhofs et al, 2000, acima, e Exemplo 10).

EXEMPLO 5

[00268] O pró-vírus BLV6073DX recombinante protege contra desafio de BLV do tipo selvagem.

[00269] Projetamos um teste para avaliar a capacidade de animais vacinados (ou seja, infectados com pró-vírus BLV6073DX recombinante) para resistir ao desafio com pró-vírus BLV do tipo selvagem. Resumidamente, 60 μg de DNA de plasmídeo pBLV do tipo selvagem (correspondentes a 6x1012 cópias pró-virais do tipo selvagem) foram transfecados para células HeLa (duas placas de Petri subconfluentes com 15 cm de diâmetro) e, após 48 horas, as células HeLa transfectadas foram injetadas por via subcutânea nas costas de três animais vacinados e três controles não infectados.

[00270] A infecção com pró-vírus BLV do tipo selvagem foi determinada por meio de ELISA competitivo para determinar a soropositividade e os títulos de anticorpo anti-BLV conforme descrito no Exemplo 3 e PCR abrigado de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 4 para detectar a presença de pró-vírus BLV do tipo selvagem.

[00271] Dois meses após a injeção, os três controles (n° 77, n° 83 e n° 85) foram infectados com o pró-vírus do tipo selvagem, conforme demonstrado por PCR abrigado e ELISA (Tabela 3, Fig. 6). Por outro lado, sequências de BLV do tipo selvagem foram ausentes em animais vacinados (n° 322, n° 357 e n° 360), conforme demonstrado por meio de PCR abrigado (Tabela 3, Fig. 6). TABELA 3

[00272] Infecção com pró-vírus BLV do tipo selvagem em animais vacinados ou não infectados após desafio com pró-vírus BLV do tipo selvagem. Uma amostra é considerada soropositiva se a razão entre OD da amostra e OD controle negativo for de pelo menos 40%. O título de anticorpo é expresso como a diluição invertida da amostra que gera 50% de OD máximo da amostra de teste (sem normalização em controle positivo).

[00273] Os dados demonstram claramente que animais vacinados resistem ao desafio por BLV do tipo selvagem.

EXEMPLO 6

[00274] Vacas vacinadas transmitem imunidade passiva, mas não infecção, para os seus bezerros.

[00275] A transmissão do pró-vírus BLV6073DX recombinante das vacas para os seus bezerros foi analisada por meio da inseminação de animais e análise da infecção nos bezerros utilizando PCR abrigada conforme descrito no Exemplo 4.

[00276] Dentre quatro bezerros de vacas infectadas do tipo selvagem, uma (n° 100) foi infectada (Tabela 4). Este padrão é consistente com observações anteriores que descrevem transmissão intrauterina ou perinatal de infecção por BLV.

[00277] Por outro lado, sequências pró-virais não puderam ser identificadas em nenhum dos seis bezerros nascidos de vacas vacinadas, o que indica que o plasmídeo de pró-vírus pBLV6073DX não foi transmitido (Tabela 4). De forma importante, estes bezerros continham anticorpos anti-BLV no seu soro, o que revela imunidade passiva. Os títulos de anticorpo persistiram por alguns meses e, em seguida, foram lentamente reduzidos com o tempo, sustentando adicionalmente a falta de infecção de prole de vacas vacinadas. Dever-se-á também mencionar que não observamos sinais de aborto em vacas vacinadas nem efeitos colaterais nos seus bezerros (por exemplo, peso, anormalidades, doenças,...).TABELA 4

[00278] Transmissão de infecções de vacas infectadas para bezerros (não inf. = não infectadas):

[00279] Em resumo, as vacas vacinadas com pBLV6073DX transmitem imunidade passiva anti-BLV, mas não infecção viral, para os seus bezerros.

[00280] Os Exemplos 1 a 6 descritos acima demonstram que, por meio da combinação de mutação no resíduo 6073 e deleção dos genes R3/G4 em uma realizçaão da presente invenção, foi obtida uma linhagem de BLV que (i) é infecciosa em vacas, mas não é transmitida a sua prole nem para sentinelas; (ii) reproduz-se em níveis baixos em comparação com o tipo selvagem, mas não apresenta patogenicidade; (iii) oferece forte reação imunológica e protege contra desafio do tipo selvagem; e (iv) é facilmente rastreável por meio de PCR. Esta linhagem atenuada pode, portanto, ser utilizada como vacina protetora contra infecção por BLV.

EXEMPLO 7

[00281] Infectividade de pró-vírus BLVGPX recombinante in vivo.

[00282] Um plasmídeo de pró-vírus BLV recombinante pBLVGPX que conduz deleção dos ORFs de microRNAs, particularmente que abrigam deleção entre as posições 6169 e 6731 (numeração conforme descrito em Rice et al, 1987, acima) na região X entre o gene env e as sequências Tax/Rex foi descrito por Willems et al (2000, AIDS Res. Hum. Retroviruses, 16: 1787-95), especificamente incorporadas ao presente como referência.

[00283] pBLVGPX foi derivado do plasmídeo pBLV344H (vide o Exemplo 1). Esquematicamente, sequências pró-virais 5' foram amplificadas por PCR utilizando o primer a montante 5’-TGACAACATATAACCAAGA-3’ (SEQ ID NO: 17) (posições de Rice 4751-4769) e o primer a jusante 5’- TCTAGAGGGGGTGTCAAGGGCAGGGT-3’ (SEQ ID NO: 13). Os nucleotídeos 7-26 deste primer a jusante são complementares às posições de BLV 6169-6150 e os nucleotídeos 1-6 do primer introduzem um sítio de restrição XbaI (sublinhado) na extremidade 3’ do produto de PCR resultante. Condições térmicas para PCR: 95 °C, 5 minutos; (95 °C, 30 segundos; 57 °C, 30 segundos; 72 °C, 60 segundos, 36 vezes); 72 °C, 5 minutos. O amplicon foi clonado em plasmídeo pCRII (Invitrogen), gerando pCREA. Para construir pBLVGPX, quatro fragmentos foram ligados: um fragmento de BglII-XbaI de 68 bp de pCREA (BglII nas posições 6101-6106 de BLV) e três fragmentos de pBLV344H (XbaI-KpnI, 8 kb; KpnI-NcoI, 2,8 kb; e NcoI-BglII, 1,2 kb). pBLV344H foi descrito em Willems et al, 1993 (J. Virol. 67: 40784085).

[00284] Cargas pró-virais foram medidas por meio de qPCR, conforme descrito no Exemplo 3. O pró-vírus BLVGPX recombinante é infeccioso in vivo em vacas (Fig. 7A) e em carneiros (Fig. 7B). De forma interessante, entretanto, embora a infectividade (cargas pró-virais) de BLVGPX em carneiros seja virtualmente a mesma infectividade de BLV do tipo selvagem (Fig. 7B), a infectividade (cargas pró-virais) de BLVGPX em vacas tende a ser inferior à infectividade de BLV do tipo selvagem (Fig. 7A). Inesperadamente, portanto, a combinação da mutação em BLVGPX com a mutação em BLVDX (que resulta em BLVGPDX) ou com as mutações em BLV6073DX (que resultam em BLV6073GPDX), em vez de ser prejudicial para o BLV recombinante (por exemplo, destruindo completamente a infectividade de BLVGPDX ou BLV6073GPDX em animais, tais como particularmente gado bovino), preserva níveis satisfatórios de infectividade do BLV recombinante e reduz ou elimina a sua patogenicidade, de forma a obter vacinas atenuadas grandemente aprimoradas em animais, particularmente em gado bovino.

EXEMPLO 8

[00285] Projeto e construção de pró-vírus BLVGPDX e BLV6073GPDX.

[00286] Os plasmídeos de pró-vírus BLV recombinante pBLVGPDX e pBLV6073GPDX são construídos utilizando métodos de clonagem molecular padrão.

[00287] pBLVGPDX foi derivado do plasmídeo pBLV344H (vide o Exemplo 1). Esquematicamente, sequências pró-virais 5' foram amplificadas por PCR utilizando o primer a montante 5’- TGACAACATATAACCAAGA-3’ (SEQ ID NO: 17) (posições de Rice 47514769) e o primer a jusante 5’-TCTAGAGGGGGTGTCAAGGGCAGGGT-3‘ (SEQ ID NO: 13). Os nucleotídeos 7-26 deste primer a jusante são complementares às posições de BLV 6169-6150 e os nucleotídeos 1-6 do primer introduzem um sítio de restrição XbaI (sublinhado) na extremidade 3’ do produto de PCR resultante. Condições térmicas para PCR: 95 °C, 5 minutos; (95 °C, 30 segundos; 57 °C, 30 segundos; 72 °C, 60 segundos, 36 vezes); 72 °C, 5 minutos. O amplicon foi clonado em plasmídeo pCRII (Invitrogen), gerando pCREA. Para construir pBLVGPDX, quatro fragmentos foram ligados: um fragmento de BglII-XbaI de 68 bp de pCREA (BglII nas posições 6101-6106 de BLV) e três fragmentos de pBLV344H (BamHI-KpnI, 8,3 kb; KpnI-NcoI, 2,8 kb; e NcoI-BglII, 1,2 kb). Um segmento ligante de oligonucleotídeo duplo composto de dois oligonucleotídeos hibridizados com as sequências 5’-CTAGAAAGCTTG-3’ (SEQ ID NO: 1) e 5’- GATCCAAGCTTT-3’ (SEQ ID NO: 2) foi utilizado para conectar as sobreposições XbaI e BamHI. Como resultado, a sequência de ácido nucleico 5’-TCTAGAAAGCTT-3’ (SEQ ID NO: 4) substitui a sequência de ácido nucleico entre a posição 6170 e a posição 6996 da sequência de ácido nucleico de BLV (numeração conforme descrito por Rice et al, 1987, acima). pBLVGPDX foi depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8167 em cinco de fevereiro de 2013 (vide a Tabela 2C).

[00288] Em seguida, realizou-se mutagênese dirigida a sítio com base em PCR com o Kit de Mutagênese Dirigida a Sítio QuikChange XL (Agilent), utilizando os primers 6073S: 5’-GATTCTGATGATCAGGCCT-3’ (SEQ ID NO: 14) e 6073C: 5’-AGGCCTGATCATCAGAATC-3’ (SEQ ID NO: 15) para introduzir a mutação 6073.

[00289] O pró-vírus BLV6073GPDX recombinante (Fig. 1I) conduz a mutação 6073, ou seja, uma substituição de um resíduo T por um resíduo G na posição 6073 em um ITAM localizado na proteína transmembrana gp30 do envelope e uma deleção entre a posição 6169 e a posição 6997 (numeração conforme descrito em Rice et al, 1987, acima). Desta forma, o pró-vírus BLV6073GPDX recombinante também conduz uma deleção nos miRNAs, ORFs R3 e G4.

[00290] pBLV6073GPDX foi depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8713 em 25 de outubro de 2013 (vide a Tabela 2D).

[00291] Espera-se que o pró-vírus BLVGPDX recombinante e o pró-vírus BLV6073GPDX recombinante forneçam uma linhagem de BLV particularmente vantajosa que exiba pelo menos algumas e, preferencialmente, todas as propriedades a seguir: (i) infecciosa em vacas, mas não é transmitida para a sua prole nem para sentinelas; (ii) reproduz-se em baixos níveis em comparação com o tipo selvagem, mas não possui patogenicidade; (iii) permite forte reação imunológica e protege contra desafio do tipo selvagem; e (iv) facilmente rastreável por meio de PCR. Esta linhagem atenuada pode, portanto, ser utilizada como vacina protetora contra infecção por BLV.

[00292] Um carneiro (n° 2187) foi infectado com pró-vírus pBLV6073GPDX utilizando o protocolo a seguir. Dois pratos com 15 cm de diâmetro contendo células Hela subconfluentes sofreram transfecção com dez microgramas de plasmídeo pBLV6073GPDX, foram recuperados em 5 ml de PBS no dia 3 e injetados por via subcutânea no carneiro 2187. Confirmou-se a infecção por meio de ELISA competitivo, que revela a presença de anticorpos anti-BLV, e por meio de sequenciamento de PCR, demonstra a presença das mutações. Não se observou patogenicidade no carneiro 2187 em quase seis meses (vacinação em 18 de setembro de 2013).

[00293] Em outro teste, 50 bezerros são vacinados com pBLV6073GPDX. pBLV6073GPDX exibirá proteção a longo prazo (por exemplo, pelo menos 18 meses, preferencialmente pelo menos 24 meses, de maior preferência pelo menos 36 meses, de preferência ainda maior pelo menos 48 meses após a vacinação) de virtualmente todos os bezerros (por exemplo, pelo menos 90% (45 bezerros ou mais), preferencialmente pelo menos 95% (48 bezerros ou mais), tal como 98% (49 bezerros), 99% ou até 100% (50 bezerros)) contra infecção por BLV do tipo selvagem. pBLV6073GPDX não causará patogenicidade nos bezerros por extensos períodos de tempo (por exemplo, três anos, quatro anos, cinco anos, seis anos, sete anos ou mais).

[00294] Cerca de 500 vacas são incluídas em outro teste de vacinação em larga escala em rebanhos leiteiros com prevalência de BLV de cerca de 80% na Argentina. Os bezerros (cerca de 40 nascimentos por mês) são vacinados com pBLV6073GPDX no dia 0 e no dia 60-90 após o nascimento. Novilhas vacinadas são acasaladas em cerca de 17 a 20 meses, com parto em cerca de 27 a 30 meses, e são acompanhadas até a idade de pelo menos 40 meses. BLV6073GPDX exibirá proteção a longo prazo (por exemplo, pelo menos 18 meses, preferencialmente pelo menos 24 meses, de maior preferência pelo menos 36 meses e, de preferência ainda maior, pelo menos 48 meses após a vacinação) de virtualmente todas as vacas (por exemplo, pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, tal como 98%, 99% ou até 100%) contra infecções por BLV do tipo selvagem. BLV6073GPDX não causará patogenicidade nas vacas ao longo do período do teste. BLV6073DX não será transmitido para a prole das vacas nem para sentinelas.

[00295] Em outro teste, 10 bezerros são vacinados com pBLVGPDX. pBLVGPDX exibirá proteção a longo prazo (por exemplo, pelo menos 18 meses, preferencialmente pelo menos 24 meses, de maior preferência pelo menos 36 meses, de preferência ainda maior pelo menos 48 meses após a vacinação) de virtualmente todos os bezerros (por exemplo, pelo menos 90% (9 bezerros), preferencialmente 100% (10 bezerros)) contra infecção por BLV do tipo selvagem. pBLVGPDX não causará patogenicidade nos bezerros por extensos períodos de tempo (por exemplo, três anos, quatro anos, cinco anos, seis anos, sete anos ou mais).

EXEMPLO 9

[00296] Projeto e construção de pró-vírus BLV recombinantes adicionais.

[00297] Combinando-se mutações específicas conforme descrito ao longo dos Exemplos 1 a 8, diversas realizações úteis de pró- vírus BLV recombinantes atenuados derivados de pBLV344H que ilustram a presente invenção são ou foram construídos utilizando métodos de clonagem molecular padrão, conforme relacionado na Tabela 5.TABELA 5

[00298] Projeto de exemplos de realizações de pró-vírus BLV recombinantes conforme ensinado no presente:Numeração consecutiva unicamente para os propósitos da Tabela 5.

[00299] Para os propósitos da Tabela 5: - “6073” indica uma substituição de um nucleotídeo T na posição 6073 da sequência de ácido nucleico de BLV por um nucleotídeo G, em que o códon 6073-6075 sofreu mutação para codificar Asp em vez de Tyr. - “ΔR3” indica uma deleção da sequência de ácido nucleico de BLV entre as posições 6614 e 6848, em que R3 foi excluído. Para construir ΔR3, um fragmento de BLV foi amplificado por PCR com dois primers: a montante 5’-TCTAGACAGAGACATTCCAGCCACATC-3‘ (SEQ ID NO: 18) (coordenadas “Rice” 6849-6869, a sequência sublinhada corresponde a um sítio XbaI) e a jusante 5’-CCTGCATGATCTTTCATACAAAT-3’ (SEQ ID NO: 19) (coordenadas “Rice” 7999-7977). Este inserto foi digerido com EcoRI e XbaI e inserido no vetor pGEM7 (Promega), gerando pGEMXR3. Para construir ΔR3, três fragmentos foram ligados: inserto XbaI-ClaI de 264 bp de pGEMXR3, inserto ClaI-HindIII de 2 kb de pBLV344H e inserto XbaI-HindIII de 10 kb de pBLV344H. “ΔG4” indica que um segmento de oligonucleotídeo duplo composto de dois oligonucleotídeos hibridizados, cada qual com a sequência 5’-GATCTAGGCTAGAATTCTAGCCTA-3’ (SEQ ID NO: 3), foi inserido no sítio BamHI na posição 6997 da sequência de ácido nucleico de BLV, em que um códon de parada prematura foi inserido e G4 foi truncado de forma C terminal. - “Δ(R3+G4)” indica que foi inserido um segmento de oligonucleotídeo duplo composto de dois oligonucleotídeos hibridizados, com as sequências 5’-CTAGAAAGCTTG-3’ (SEQ ID NO: 1) e 5’- GATCCAAGCTTT-3’ (SEQ ID NO: 2), respectivamente, substituindo o segmento de ácido nucleico entre o sítio XbaI na posição 6614 e o sítio BamHI na posição 6997 da sequência de ácido nucleico de BLV, em que R3 e G4 foram ambos excluídos. - “ΔmiRNA” indica uma deleção da sequência de ácido nucleico de BLV entre as posições 6169 e 6731, em que os ORFs de microRNAs foram excluídos, particularmente seguindo-se a estratégia de clonagem detalhada para pBLVGPX no Exemplo 7. - “Δ(miRNA+R3+G4)” indica deleção da sequência de ácido nucleico de BLV entre as posições 6169 e 6997, em que os ORFs de microRNAs R3 e G4 foram excluídos, particularmente seguindo-se a estratégia de clonagem detalhada para pBLVGPDX no Exemplo 8.

[00300] As vacas vacinadas em estudos de teste (incluindo, por exemplo, cerca de dez animais ou cerca de cinquenta animais) com pró- vírus BLV recombinantes atenuados exemplificados na Tabela 5 exibirão proteção a longo prazo (por exemplo, pelo menos 18 meses, preferencialmente pelo menos 24 meses, de maior preferência pelo menos 36 meses e, de preferência ainda maior, pelo menos 48 meses após a vacinação) de virtualmente todas as vacas (por exemplo, pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, tal como 98%, 99% ou até 100%) contra infecções por BLV do tipo selvagem. Os pró-vírus BLV recombinantes atenuados exemplificados na Tabela 5 não causarão patogenicidade nas vacas por extensos períodos de tempo (por exemplo, três anos, quatro anos, cinco anos, seis anos, sete anos ou mais).

EXEMPLO 10

[00301] Infecção de BLV do tipo selvagem na vaca n° 269 inoculada por BLV6073:

[00302] Conforme mencionado anteriormente, os inventores do presente demonstraram que a vaca n° 269 vacinada utilizando o pró-vírus pBLV6073 e avaliada em Kerkhofs et al, 2000, acima, de fato, foi infectada por BLV do tipo selvagem 24 meses após o desafio com BLV do tipo selvagem, o que comprova que BLV6073 fornece proteção apenas por prazo comparativamente curto.

[00303] Particularmente, sangue foi coletado por meio de venipunção na jugular 18 e 24 meses após o desafio da vaca vacinada com pBLV6073 n° 269 (Kerkhofs et al, 2000, acima). Após a extração de ácidos nucleicos, DNA foi amplificado por meio de PCR utilizando três pares de primers diferentes: 6073S+7049R (linha 1 na Fig. 8B), 5719S+7049R (linha 2 na Fig. 8B), 5719S+7000R (linha 3 na Fig. 8B). Os nomes de primers correspondem à sua posição sobre a sequência de BLV e as sequências de primers foram as seguintes: primer 5719S (5’-CGGGGGCTTGATTGGTTGTA- 3’; SEQ ID NO: 30), primer 6073S (5’-GATTCTGATGATCAGGCCT-3’; SEQ ID NO: 14), primer 7000R (5’-TTGTCGTTATCAGGTAATGGA-3’; SEQ ID NO: 31) e primer 7049R (5’-CCCCAACCAACAACACTTGCTT-3’; SEQ ID NO: 32). Estes pares de primers rodeiam uma pequena deleção que está presente em pBLV6073, mas não em BLV do tipo selvagem. A posição dos pares de primers em sequências do tipo selvagem (“WT") e pBLV6073 ("Mutante 6073") é exibida esquematicamente na Fig. 8A. Conforme exibido na Fig. 8B, fragmentos com tamanho maior foram amplificados após 24 meses, o que sugere infecção da vaca n° 269 por BLV do tipo selvagem.

[00304] O sequenciamento do vírus que infecta a vaca n° 269 confirmou infecção por BLV do tipo selvagem. Particularmente, sangue foi coletado por meio de venipunção na jugular 18 e 24 meses após o desafio da vaca vacinada com pBLV6073 n° 269 (Kerkhofs et al, 2000, acima). Após a extração de ácidos nucleicos, DNA foi amplificado por meio de PCR utilizando o par de primers 5719S+7000R. O produto de amplificação foi sequenciado utilizando o primer 5719S. Como controle, o mesmo experimento foi realizado com um gene env de um vírus BLV do tipo selvagem. Conforme exibido na Fig. 9, o BLV do tipo selvagem controle possui T na posição de nucleotídeo 6073 (Fig. 9, quadro inferior, seta). Dezoito meses após o desafio, a amostra de DNA da vaca n° 269 possui G na posição de nucleotídeo 6073, correspondente à mutação em pBLV6073 (Fig. 9, quadro superior, seta). Entretanto, 24 meses após o desafio, a amostra de DNA da vaca n° 269 possui G (pico inferior) e T (pico superior) na posição de nucleotídeo 6073, o que comprova que a vaca n° 269 foi infectada com vírus BLV do tipo selvagem (Fig. 9, quadro intermediário, seta).

EXEMPLO 11

[00305] Vetorização de BLV6073GPDX para expressão em Bacillus subtilis.

[00306] Para introduzir os genes AmyE e Lys-A de linhagem 168 de Bacillus subtilis no plasmídeo pBLV6073GPDX, utiliza-se estratégia de recombinação dupla (vide a Fig. 10). O fragmento genético AmyE-F, portanto, foi amplificado por meio de PCR a partir de 100 ng de DNA de Bacillus com polymerase HiFD Phusion utilizando os primers amyEF_PciI_UP e amyEF_PciI_RP e inserido no sítio Pci1 de pBLV6073GPDX. Outro fragmento, AmyEB, foi amplificado por meio de PCR utilizando os primers amyE_B_UP e amyE_B_SalI_RP. O gene LysA foi amplificado por meio de PCR utilizando os primers lysA_UP e lysA_RP. Estes dois últimos insertos, genes Amy EB e Lys- A, foram coamplificados com os primers LysA UP e amyEF_PciI_RP e inseridos no sítio Sal1 de pBLV6073GPDX. As condições de PCR para todas as amplificações foram: 98 °C, 30 segundos; (98 °C, 10 segundos; 55 °C, 15 segundos; 72 °C, 20 segundos, 25 vezes); 72 °C, 10 minutos. As sequências de primer foram as seguintes: amyEF_PciI_UP: 5’- CCTTTTGCTCACATGTAACAAAATTCTCCAGTCTTCACATCGG-3’ (SEQ ID NO: 33); amyEF_PciI_RP: 5’- GCAGGAAAGAACATGTCGATCAGACCAGTTTTTAATTTGTGTG-3’ (SEQ ID NO: 34); lysA_UP: 5’- GTTTTAAACCGTCGATCGCATTGAAACTGACTGAAGAGTATG-3’ (SEQ ID NO: 35); lysA_RP: 5’-ATGTCGAGAAAAGCGCCGAAAAATCG-3’ (SEQ ID NO: 36); 6’-amyE_B_UP: 5’- TTCGGCGCTTTTCTCGACATGGATGAGCGATGATG-3’ (SEQ ID NO: 37); e amyE_B_SalI_RP: 5’- GACGTTGACAGTCGACTCAATGGGGAAGAGAACCGC-3’ (SEQ ID NO: 38). [00307] A construção resultante é transformada em Bacillus subtilis 168 amyE+ lysA-. Seleção de amyE- lysA+ gera isolamento de Bacillus que integrou o pBLV6073GPDX por meio de recombinação homóloga.LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

Claims

1. VÍRUS DA LEUCEMIA BOVINA (BLV) atenuado recombinante, caracterizado por compreender: - uma mutação no códon TAT na sequência de ácido nucleico que codifica o motivo de sinalização YXXL mais N-terminal do domínio citoplasmático da subunidade transmembrânica (TM) da proteína de envelope em que o códon TAT corresponde ao códon TAT da sequência de ácido nucleico do BLV nas posições 284-286 conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16 e em que o códon TAT é mutado em um códon GCT, GCC, GCA ou GCG ou em um códon GAT ou GAC, que codifica respectivamente uma alanina ou um resíduo de ácido aspártico do motivo YXXL, e - a deleção de pelo menos uma parte da região da sequência de ácido nucleico de BLV entre a extremidade da região de microRNA codificado e o sítio receptor de splice do íntron 2 de Tax/Rex, pelo qual o sítio receptor de splice do íntron 2 de R3 e o sítio receptor de splice do íntron 1 de G4 são deletados, em que a extremidade da região de microRNA codificado corresponde à posição 1023 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16, e o sítio receptor de splice do íntron 2 de Tax/Rex corresponde à posição 1250 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16.

2. VÍRUS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo códon TAT ser mutado em um códon GAT ou GAC que codifica um resíduo de ácido aspártico no motivo YXXL.

3. VÍRUS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo códon TAT ser mutado em um códon GAT que codifica o resíduo de ácido aspártico do motivo YXXL.

4. VÍRUS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender uma deleção de uma parte da região da sequência de ácido nucleico de BLV entre 250 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3 e o sítio receptor de splice de íntron 2 de Tax/Rex, em que o limite íntron 2 - éxon 3 de R3 corresponde às posições 1020 a 1027 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16, e o sítio receptor de splice de íntron 2 de Tax/Rex corresponde à posição 1250 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16.

5. VÍRUS, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo limite 5’ da deleção estar localizado entre 209 e 189 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de R3 e o limite 3’ da deleção estar localizado entre 55 e 35 nucleotídeos a montante do sítio receptor de splice de íntron 2 de Tax/Rex, em que o limite íntron 2 - éxon 3 de R3 corresponde às posições 1020 a 1027 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16, e o receptor de splice de íntron 2 de Tax/Rex corresponde à posição 1250 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16.

6. VÍRUS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo limite 5’ da deleção estar localizado entre as posições da sequência de ácido nucleico de BLV que corresponde às posições 815 a 835 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16 e o limite 3’ da deleção estar localizado entre as posições da sequência de ácido nucleico de BLV que corresponde às posições 1198 a 1218 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16.

7. VÍRUS, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo limite 5’ da deleção estar localizado na posição da sequência de ácido nucleico de BLV que corresponde à posição 825 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16 e limite 3’ da deleção estar localizado na posição da sequência de ácido nucleico de BLV que corresponde à posição 1208 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16.

8. VÍRUS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma deleção de pelo menos uma parte da região da sequência de ácido nucleico de BLV entre o códon de parada de TM e o sítio receptor de splice do íntron 2 de Tax/Rex, pelo qual o sítio receptor de splice de íntron 2 de R3 e o sítio receptor de splice de íntron 1 de G4 são excluídos, e em que sequência de ácido nucleico que codifica todos os microRNA é deletada, em que o códon de parada de TM corresponde às posições 371-373 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16, e o sítio receptor de splice do íntron 2 de Tax/Rex corresponde à posição 1250 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16.

9. VÍRUS, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo limite 5’ da deleção estar localizado entre 1 e 11 nucleotídeos a jusante do códon de parada de TM e o limite 3’ da deleção estar localizado entre 55 e 35 nucleotídeos a montante do limite íntron 2 - éxon 3 de Tax/Rex, em que o códon de parada de TM corresponde às posições 371-373 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16, e o limite íntron 2 - éxon 3 de R3 corresponde às posições 1020 a 1027 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16.

10. VÍRUS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo limite 5’ da deleção estar localizado entre as posições do ácido nucleico de BLV que corresponde às posições 374 a 384 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16 e o limite 3’ da deleção estar localizado entre as posições da sequência de ácido nucleico de BLV que corresponde às posições 1198 a 1218 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16.

11. VÍRUS, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo limite 5’ da deleção estar localizado entre as posições do ácido nucleico de BLV que corresponde à posição 380 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16 e o limite 3’ da deleção estar localizado entre as posições da sequência de ácido nucleico de BLV que corresponde à posição 1208 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16.

12. VÍRUS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo BLV ser derivado do isolado de BLV 344 conforme codificado pelo plasmídeo depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8165 em 5 de fevereiro de 2013.

13. VÍRUS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo BLV ser derivado do isolado de BLV 344 conforme codificado pelo plasmídeo depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8165 em 5 de fevereiro de 2013, e em que: - o BLV atenuado recombinante compreende uma substituição de um nucleotídeo T na posição da sequência de ácido nucleico de BLV que corresponde à posição 284 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16 por um nucleotídeo G e compreende adicionalmente um segmento de oligonucleotídeo duplo que substitui o segmento de ácido nucleico entre o sítio XbaI na posição da sequência de ácido nucleico de BLV que corresponde a posição 825 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16, e sítio BamHI da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16, preferivelmente em que o segmento de oligonucleotídeo duplo é composto de dois oligonucleotídeos que são hibridizados com as sequências 5’- CTAGAAAGCTTG-3’ (SEQ ID NO: 1) e 5’-GATCCAAGCTTT-3’ (SEQ ID NO: 2), respectivamente, substituindo o segmento de ácido nucleico entre o sítio XbaI na posição 825 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16 e sítio BamHI na posição da sequência de ácido nucleico de BLV que corresponde à posição 1208 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16; ou - o BLV atenuado recombinante compreende uma deleção da sequência de ácido nucleico de BLV entre as posições da sequência de ácido nucleico de BLV que corresponde à posição 380 a 1208 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16, preferivelmente o BLV atenuado recombinante compreende a sequência de ácido nucleico 5'-TCTAGAAAGCTT-3’ (SEQ ID NO: 4) substituindo a sequência de ácido nucleico da posição da sequência de ácido nucleico de BLV que corresponde à posição 381 do ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16 a posição da sequência de ácido nucleico de BLV que corresponde à posição 1207 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16; ou - o BLV atenuado recombinante compreende uma substituição de um nucleotídeo T na posição da sequência de ácido nucleico de BLV que corresponde à posição 284 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16 por um nucleotídeo G e compreende adicionalmente uma deleção da sequência de ácido nucleico de BLV entre as posições da sequência de ácido nucleico de BLV que corresponde às posições 380 a 1208 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16, preferivelmente o BLV atenuado recombinante compreende uma substituição de um nucleotídeo T na posição da sequência de ácido nucleico de BLV que corresponde à posição 284 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16 por um nucleotídeo G e compreende adicionalmente a sequência de ácido nucleico 5'- TCTAGAAAGCTT-3' (SEQ ID NO: 4) substituindo a sequência de ácido nucleico da posição da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16 a posição da sequência de ácido nucleico que corresponde à posição 1207 da sequência de ácido nucleico de BLV conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16.

14. VÍRUS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo BLV ser codificado pelo plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de MicroOrganismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8166 em 5 de fevereiro de 2013; ou ser codificado pelo plasmídeo conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de aceso LMBP 8713 em 25 de outubro de 2013.

15. VETOR ou plasmídeo, caracterizado por: (i) o plasmídeo ser conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de acesso LMBP 8166 em 5 de fevereiro de 2013; ou (ii) o plasmídeo ser conforme depositado com base no Tratado de Budapeste junto às Coleções Coordenadas Belgas de Micro-Organismos BCCMTM/Coleção LMBP com número de aceso LMBP 8713 em 25 de outubro de 2013.

16. CÉLULA HOSPEDEIRA isolada, caracterizada por compreender o BLV atenuado recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou o vetor ou plasmídeo, conforme definido na reivindicação 15, em que a célula hospedeira é uma célula bacteriana.

17. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o BLV atenuado recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, o vetor ou plasmídeo, conforme definido na reivindicação 15, ou a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 16.

18. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por: (i) a composição farmacêutica ser uma vacina; ou (ii) a composição farmacêutica ser uma vacina e compreender uma ou mais composições ou substâncias imunogênicas adicionais.

19. USO DE UM VÍRUS DA LEUCEMIA BOVINA (BLV) atenuado recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, de um vetor ou plasmídeo, conforme definido na reivindicação 15, de uma célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 16, ou de uma composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 17 a 18, caracterizado por ser para a fabricação de uma vacina para prevenir uma infecção por BLV ou uma doença causada por infecção por BLV em um indivíduo.

20. USO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo indivíduo ser um bovino, mais preferivelmente ser um gado.