BR112015020174B1 - Anticorpo que liga gro-alfa, gro-beta, gro-gama, ena-78, gcp-2, nap-2 e il-8 humanos, seu uso e seu processo de produção, e molécula de dna - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTIQUIMIOCINA Pan-ELR+ CXC. Fornecem-se anticorpos que ligam especificamente sete quimiocinas ELR+ CXC humanas. Os anticorpos da invenção são úteis para tratar diversas doenças inflamatórias/autoimunes, como a doença inflamatória do intestino (IBD), a psoríase em placas e a pustulose palmo-plantar; e câncer, como câncer renal ou câncer ovariano.

Description

[001] A presente invenção refere-se a anticorpos antiquimiocinas ELR+ CXC, e o seu uso no tratamento de doenças onde a patogênese é mediada por quimiocinas ELR+ CXC.

[002] Quimiocinas ELR+ CXC (chamadas dessa forma pelo fato de que todos os membros da família de quimiocinas possuem um motivo de aminoácido E-L-R imediatamente adjacente aos seus motivos CXC) desempenham um papel importante em uma variedade de mecanismos patogênicos, que inclui a migração de neutrófilos para locais de inflamação e angiogênese. Neutrófilos contribuem para a patogênese de várias doenças inflamatórias/autoimunes agudas e crônicas, como doença inflamatória do intestino (IBD), psoríase em placas e pustulose palmo-plantar. Quimiocinas ELR+ CXC também desempenham um papel crítico na tumorigênese e metástase de tumor. Essas quimiocinas são altamente expressas em tumores. Dentro do ambiente tumoral, quimiocinas ELR+ CXC são envolvidas em diversas trajetórias, por exemplo, angiogênese, mobilização e invasão de células endoteliais e leucócitos em locais de tumor, proliferação e sobrevivência de células tumorais.

[003] Quimiocinas são agrupadas em quatro subfamílias: CXC, CC, (X) C, e CX3C. Nas quimiocinas CXC, um aminoácido separa as duas primeiras cisteínas ("o motivo CXC"). Quimiocinas ELR+ CXC são ligantes para CXCR1 e/ou receptores CXCR2 de quimiocina, que são sete receptores tipo domínio transmembrana acoplados à proteína G que ligam especificamente quimiocinas ELR+ CXC. As sete quimiocinas ELR+ CXC humanas são Gro-alfa humano (também conhecido como CXCL1), Gro-beta humano (também conhecido como CXCL2), Gro- gama humano (também conhecido como CXCL3), ENA-78 humana (também conhecido como CXCL5), GCP-2 humana (também conhecido como CXCL6), NAP-2 humana (também conhecido como CXCL7) e IL- 8 humana (também conhecido como CXCL8). Todas as quimiocinas ELR+ CXC ligam o receptor CXCR2; ademais, algumas quimiocinas ELR+ CXC ligam ambos CXCR1 e receptor CXCR2s (isto é, CXCL6 e CXCL8), todos os quais contribuem para redundância nas trajetórias de ativação.

[004] Anticorpos que se ligam a quimiocinas ELR+ CXC individuais foram descritos anteriormente. Dois anticorpos monoclonais anti- CXCL8 (IL-8) foram avaliados em testes clínicos iniciais com eficácia em doenças inflamatórias. (J Leuk Biol 66:401 a 410; J Immunol 181:669 a 679.) Além disso, o documento no WO 2008/130969 revela um anticorpo que se liga a IL-8 humana (CXCL8), Gro-alfa humano (CXCL1), Gro-beta humano (CXCL2), Gro-gama humano (CXCL3), e ENA-78 humana (CXCL5). Entretanto, a revelação não demonstra que o anticorpo se liga firmemente a GCP-2 (CXCL6), e é silencioso quanto à ligação com NAP-2 (CXCL7).

[005] Entretanto, um anticorpo que pode se ligar e neutralizar todas as sete quimiocinas ELR+ CXC humanas ainda não foi revelado. Ao almejar uma ou algumas quimiocinas ELR+ CXC humanas deixa aberta a oportunidade para outras quimiocinas ELR+ CXC para provocar múltiplas funções biológicas. Neutralizar todas as sete quimiocinas ELR+ CXC poderia impactar a habilidade das células de CXCR1+ ou CXCR2+ de migrar para locais de inflamação e poderia inibir a angiogênese. Devido à redundância significante nas trajetórias de ativação de CXCR1 e do receptor CXCR2, ainda há a necessidade para um anticorpo que liga todas as sete quimiocinas ELR+ CXC humanas com especificidade e com alta afinidade. Há a necessidade para um anticorpo que neutralize todas as sete quimiocinas ELR+ CXC humanas. Também há a necessidade por um anticorpo que é fisicamente estável. Portanto, é desejável fornecer um anticorpo específico de septo que pode ligar e neutralizar todas as sete quimiocinas ELR+ CXC humanas, que seja fisicamente estável.

[006] A presente invenção fornece um anticorpo que neutraliza Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gama, ENA-78, GCP-2, NAP-2 e IL-8 humanos. A presente invenção também fornece um anticorpo que neutraliza Gro- alfa, Gro-beta, Gro-gama, ENA-78, GCP-2, NAP-2 e IL-8 humanos, em que o anticorpo se liga a IL-8 (SEQ ID NO: 27) nos seguintes aminoácidos: Arg 6, Ile 10, Arg 35 e Ile 40. A presente invenção fornece adicionalmente um anticorpo que neutraliza Gro-alfa, Gro-beta, Gro- gama, ENA-78, GCP-2, NAP-2 e IL-8 humanos, em que o anticorpo se liga a IL-8 (SEQ ID NO: 27) nos seguintes aminoácidos: Arg 6, Ile 10, Ala 35, Ile 40 e Leu 49.

[007] A presente invenção fornece um anticorpo que compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (LCVR) e a cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada (HCVR), em que a LCVR compreende LCDR1, LCDR2, LCDR3 e a HCVR compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, em que LCDR1 é RASQSISNNLH (SEQ ID NO: 7), LCDR2 é YTSRSVS (SEQ ID NO: 8), LCDR3 é GQNNEWPEV (SEQ ID NO: 9), HCDR1 é GYEFTSYWIH (SEQ ID NO: 10), HCDR2 é NISPNSGSANYNEKFKS (SEQ ID NO: 11), e HCDR3 é EGPYSYYPSRXaaYYGSDL (SEQ ID NO: 20) em que Xaa é E ou Q.

[008] A presente invenção fornece em outro aspecto um anticorpo em que a sequência de aminoácidos da HCVR é SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 14. A presente invenção fornece adicionalmente um anticorpo em que a sequência de aminoácidos da LCVR é SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 16.

[009] A presente invenção fornece um anticorpo em que a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é SEQ ID NO: 1 ou 13 A presente invenção também fornece um anticorpo em que a sequência de aminoácidos da cadeia leve é SEQ ID NO: 3 ou 15

[0010] A presente invenção também fornece uma molécula de DNA que compreende a primeira sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 13; e compreende uma segunda sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou 15.

[0011] A presente invenção fornece uma célula de mamífero que compreende as moléculas de DNA conforme descritas acima, em que a célula tem a capacidade para expressar um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 13 e uma cadeia leve que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou 15. Células hospedeiras de mamífero conhecidas por ter a capacidade para expressar imunoglobulinas funcionais incluem células do ovário do hamster chinês, células COS e células NS0. Células hospedeiras preferidas para uso na invenção são células NS0.

[0012] A presente invenção fornece adicionalmente um processo para produzir um anticorpo que compreende uma cadeia leve cuja sequência de aminoácidos é SEQ ID NO: 3 ou 15 e a cadeia pesada cuja sequência de aminoácidos é SEQ ID NO: 1 ou 13, que compreende cultivar uma célula de mamífero conforme descrita acima sob condições para que o anticorpo seja expresso, e recuperar o anticorpo expresso.

[0013] A presente invenção fornece um método de tratamento de colite ulcerativa, câncer renal, ou câncer ovariano, que compreende administrar a um paciente que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da presente invenção.

[0014] A presente invenção fornece adicionalmente um anticorpo da presente invenção para uso em terapia. Adicionalmente, a presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção para uso no tratamento de colite ulcerativa, câncer renal ou câncer ovariano. Adicionalmente, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo da presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de colite ulcerativa, câncer renal ou câncer ovariano.

[0015] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo da presente invenção e um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitos, diluentes ou excipientes.

[0016] Conforme usado no presente documento, o termo "quimiocinas ELR+ CXC humanas" destina-se a se referir às sete quimiocinas CXC conhecidas que têm um motivo E-L-R e que se ligam a CXCR1 e/ou ao receptor CXCR2. As quimiocinas ELR+ CXC humanas são Gro-alfa humano (também conhecido como CXCL1) (SEQ ID NO: 21), Gro-beta humano (também conhecido como CXCL2) (SEQ ID NO: 22), Gro-gama humano (também conhecido como CXCL3) (SEQ ID NO: 23), ENA-78 humana (também conhecido como CXCL5) (SEQ ID NO: 24), GCP-2 humana (também conhecido como CXCL6) (SEQ ID NO: 25), NAP-2 humana (também conhecido como CXCL7) (SEQ ID NO: 26), e IL-8 humana (também conhecido como CXCL8) (SEQ ID NO: 27). Coletivamente, todas as sete quimiocinas ELR+ CXC humanas são chamadas de "quimiocinas pan-ELR+ CXC humanas" no presente documento.

[0017] O termo "anticorpo", conforme usado no presente documento, destina-se a se referir moléculas de imunoglobulina monoclonal que compreendem quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada (HCVR) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável da cadeia leve (LCVR) e uma região constante da cadeia leve, CL. As regiões HCVR e LCVR podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas como regiões de arcabouço (FR). Cada HCVR e LCVR é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir de amino-terminal a carbóxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões CDR na HCVR são denominadas HCDR1, HCDR2 e HCDR3. As regiões CDR na LCVR são denominadas LCDR1, LCDR2 e LCDR3. As CDRs contêm a maior parte dos resíduos que formam interações específicas com o antígeno. Existem atualmente três sistemas de sistemas de atribuições de CDR para anticorpos que são usados para delineação de sequência. A definição de CDR de Kabat (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) tem como base variabilidade de sequência de anticorpos. A definição de CDR de Chothia (Chothia et al., "Canonical structures for the hypervariable regiões of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901 a 917 (1987); Al-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structures of imunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927 a 948 (1997)) tem base em estruturas tridimensionais de anticorpos e topologias dos laços de CDR. As definições de CDR de Chothia são idênticas à definição de CDR de Kabats com a exceção de HCDR1 e HCDR2. Para os propósitos da presente invenção, um híbrido das definições de Kabat e Chothia é usado para definir CDRs. O sistema de atribuições de aminoácidos nas regiões HCVR e LCVR está em concordância com a convenção de numeração de Kabat. É entendido adicionalmente que o termo "anticorpo" abrange quaisquer modificações celulares pós-traducionais ao anticorpo que incluem, mas não são limitados a acilação e glicosilação.

[0018] Conforme usado no presente documento, o termo "anticorpo neutralizante" destina-se a se referir a um anticorpo cuja ligação a uma quimiocina ELR+ CXC resulta na inibição de uma atividade biológica induzida por aquela quimiocina. Essa inibição de uma atividade biológica induzida por quimiocina ELR+ pode ser avaliada por um ou mais de vários ensaios in vitro padrão conhecidos na técnica (ver Exemplos). É entendido adicionalmente que os termos "inibir" ou "neutralizar" conforme usados no presente documento em relação a uma atividade de um anticorpo da invenção significa a habilidade para antagonizar, reduzir ou interromper a progressão, intensidade, ou gravidade de uma atividade biológica induzida por uma ou mais quimiocinas ELR+ CXC.

[0019] Conforme usado no presente documento, o termo "anticorpo específico de septo" destina-se a abranger um anticorpo que liga todas as sete quimiocinas ELR+ CXC humanas com alta afinidade (por exemplo, com afinidade de ligação (KD) na faixa a partir de cerca de 5 x 10-11 M até cerca de 1 x 10-9 M).

[0020] Conforme usado no presente documento, um "paciente" se refere a um mamífero, de preferência, um humano com uma doença, desordem ou condição que se beneficiaria com um nível reduzido de quimiocinas ELR+ CXC humanas ou bioatividade reduzida induzida por quimiocinas humanas ELR+ CXC.

[0021] Conforme usado no presente documento, "tratamento" ou "tratar" destina-se a se referir a todos os processos em que pode haver uma redução, controle ou parada da progressão das desordens reveladas no presente documento, mão não necessariamente indica uma eliminação total de todos os sintomas da desordem. O tratamento inclui a administração de um anticorpo da presente invenção para tratamento de uma doença ou condição em um paciente, particularmente em um humano.

[0022] Os anticorpos da presente invenção se ligam às quimiocinas pan-ELR+ CXC humanas com alta afinidade. Por exemplo, os presentes anticorpos que se ligam com todas as sete quimiocinas ELR+ CXC humanas com uma afinidade de ligação (KD) a partir de cerca de 5 x 1011 M até cerca de 1 x 10-9 M, por exemplo, a partir de cerca de 1.0 x 1010 M até cerca de 8,6 x 10-10 M, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície, quando expresso como um anticorpo IgG4 de comprimento total. Os anticorpos da presente invenção são caracterizados adicionalmente em que quando os mesmos se ligam às quimiocinas CXC pan-ELR+ humanas com especificidade, os anticorpos não especificamente se ligam a outras quimiocinas CXC, por exemplo, fator 1 derivado de células estromais alfa (SDF-1a, também conhecido como CXCL12).

[0023] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção podem ter uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende regiões CDR com as seguintes sequências de aminoácidos: HCDR1 (SEQ ID NO: 10), HCDR2 (SEQ ID NO: 11) e HCDR3 (SEQ ID NO: 12); e em que a região variável da cadeia leve compreende regiões CDR com as seguintes sequências de aminoácidos: LCDR1 (SEQ ID NO: 7, LCDR2 (SEQ ID NO: 8) e LCDR3 (SEQ ID NO: 9).

[0024] Em outra modalidade, os anticorpos da invenção podem ter uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende regiões CDR com as seguintes sequências de aminoácidos: HCDR1 (SEQ ID NO: 10), HCDR2 (SEQ ID NO: 11) e HCDR3 (SEQ ID NO: 19); e em que a região variável da cadeia leve compreende regiões CDR com as seguintes sequências de aminoácidos: LCDR1 (SEQ ID NO: 7, LCDR2 (SEQ ID NO: 8) e LCDR3 (SEQ ID NO: 9).

[0025] Em uma modalidade adicional, os anticorpos da invenção podem compreender uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 14, e a região variável da cadeia leve tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 16.

[0026] Em ainda uma outra modalidade, os anticorpos da invenção podem compreender uma cadeia pesada que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 13, e uma cadeia leve que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou 15.

[0027] De preferência, os anticorpos compreendem duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. De preferência, a cadeia leve com a sequência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 3 é codificada por um ácido nucleico que compreende a sequência de polinucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 6. De preferência, a cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 1 é codificada por um ácido nucleico que compreende a sequência de polinucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 5. De preferência, a sequência de aminoácidos da cadeia leve como mostrada em SEQ ID NO: 15 é codificada por um ácido nucleico que compreende a sequência de polinucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 18. De preferência, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada como mostrada em SEQ ID NO: 13 é codificada por um ácido nucleico que compreende a sequência de polinucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 17.

[0028] A modalidade mais preferencial da invenção é um anticorpo que compreende duas cadeias pesadas idênticas que têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e duas cadeias leves idênticas que têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[0029] Anticorpos da presente invenção podem ser incorporados nas composições farmacêuticas adequadas para administração a um paciente. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um anticorpo da invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável. Como usado na presente invenção, "carreador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardo de absorção e isotônicos e similares que são fisiologicamente compatíveis. Carreadores farmaceuticamente aceitos podem compreender adicionalmente quantidades menores de substâncias auxiliares que melhoram a vida útil ou eficácia do anticorpo.

[0030] As composições dessa invenção podem estar em uma variedade de formas. A forma preferida depende do modo de administração tencionado e da aplicação terapêutica. Composições típicas preferidas vêm na forma de soluções injetáveis ou para infusão, como composições similares às usadas para imunização passiva de seres humanos. O modo de administração preferido é parenteral (por exemplo, intravenoso, subcutâneo, intraperitoneal ou intramuscular). Em uma modalidade, o anticorpo é administrado por injeção intraperitoneal ou subcutânea. Entretanto, como será entendido pelo versado na técnica, a via e/ou modo de administração vai variar dependendo dos resultados desejados.

[0031] Compostos ativos complementares também podem ser incorporados nas composições farmacêuticas. Em certas modalidades, um anticorpo da invenção é coformulado e/ou coadministrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais que são úteis para tratar desordens nas quais a atividade da quimiocina ELR+ CXC seja prejudicial. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser coformulado e/ou coadministrado com um ou mais agentes de quimioterapia (por exemplo, sunitinib ou cisplatina).

[0032] As composições farmacêuticas da invenção podem incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um anticorpo da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se uma quantidade eficaz, em dosagens e durante os intervalos de tempo necessários, para obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo pode variar de acordo com fatores, como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e da habilidade do anticorpo de induzir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

[0033] Os regimes de dosagem podem ser ajustados para oferecer a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada, conforme indicado pelas necessidades da situação terapêutica.

[0034] Valores de dosagens podem variar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada. É entendido adicionalmente que para qualquer sujeito em particular, regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições.

[0035] A ligação específica e a neutralização por um anticorpo da presente invenção para quimiocinas ELR+ CXC humanas permitem que o dito anticorpo seja usado como um terapêutico para doenças e desordens das quais se beneficiam pela inibição da bioatividade das quimiocinas ELR+ CXC humanas. Dada a habilidade para ligar e neutralizar todas as sete quimiocinas ELR+ CXC humanas, anticorpos da presente invenção oferecem vantagens sobre monoterapias que almejam quimiocinas ELR+ CXC humanas únicas e combinação de terapias que almejam múltiplas quimiocinas ELR+ CXC humanas.

[0036] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para tratar colite ulcerativa ou câncer, como câncer renal ou câncer ovariano. Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo para uso no tratamento de colite ulcerativa ou câncer, como câncer renal ou câncer ovariano.

[0037] A presente invenção é ilustrada com mais detalhes pelos seguintes exemplos não limitadores.

EXEMPLOS EXPRESSÃO E PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

[0038] Anticorpos da presente invenção podem ser expressos e purificados conforme o seguinte. Um vetor de expressão que contém a sequência de DNA de SEQ ID NO: 5 (que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 1) e SEQ ID NO: 6 (que codifica um polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 3) é usado para transfectar células NS0. Um anticorpo que resulta desse vetor de expressão é o "anticorpo 1".

[0039] Adicionalmente, um vetor de expressão que contém a sequência de DNA de SEQ ID NO: 17 (que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 13) e SEQ ID NO: 18 (que codifica um polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 15) é usado para transfectar células NS0. Um anticorpo que resulta desse vetor de expressão é o "anticorpo 2".

[0040] Para o anticorpo 1 ou o anticorpo 2, acervos transfectados são plaqueados à baixa densidade para permitir um supercrescimento próximo à clonagem de células de expressão estável. As cavidades principais são triadas para expressão de anticorpo e, então, ampliadas em culturas de suspensão isentas de soro para ser usadas para produção. O meio clarificado, no qual o anticorpo foi separado, é aplicado a uma coluna de Proteína A ou G que foi equilibrada com um tampão compatível, como solução salina tamponada com fosfato (pH = 7,4). A coluna é lavada para remover componentes de ligação não específica. O anticorpo ligado é eluído por gradiente de pH (como tampão fosfato de sódio 0,1 M de pH 6,8 para tampão citrato de sódio 0,1 M de pH 2,5). Frações de anticorpo são detectadas por SDS-PAGE e, então, são reunidas. Purificação adicional é opcional, de modo que se depende do uso pretendido. O anticorpo por ser concentrado e/ou esterilizado por filtração pelo uso de técnicas comuns. Agregados solúveis e multímeros podem ser removidos efetivamente por técnicas comuns, em que se inclui exclusão de tamanho, interação hidrofóbica, troca de íons ou cromatografia de hidróxiapatita. A pureza do anticorpo após essas etapas de cromatografia pode ser maior que 99%. O produto pode ser imediatamente congelado a -70 °C ou pode ser liofilizado.

AFINIDADE DE LIGAÇÃO A QUIMIOCINAS ELR+ CXC HUMANAS

[0041] O instrumento Biacore 2000 e Biacore 2000 Evaluation Software versão 4.1 são usados para análise de ressonância plasmônica de superfície. Um chip de CM5 é preparado para usar o método de acoplamento de amina EDC/NHS. Brevemente, as superfícies de todas as quatro células de fluxo são ativadas pela injeção de uma mistura 1:1 de EDC/NHS durante 7 minutos em 10 µl/min. A Proteína A é diluída a 100 µg/ml em acetato 10 mM, tampão pH 4,5 e imobilizada para alcançar aproximadamente 10,000 RU em todas as 4 células de fluxo por uma injeção de 7 minutos injeção em uma taxa de fluxo de 10 µl/minuto. Sítios não reagidos são bloqueados com uma injeção de 7 minutos de etanolamina em 10 µl/minuto. Duas injeções de glicina (pH 1.5) durante 30 segundos em 10 µl/minuto são usadas para remover qualquer proteína não covalentemente associada. O tampão de reação é HBS-EP+.

[0042] O anticorpo 1 ou o anticorpo 2 é diluído a 2 µg/ml no tampão de reação, e aproximadamente 400 a 600 RU é capturado na célula de fluxo (Fc). Os ligantes são diluídos de 100 µg/ml para 50 nM no tampão de reação e, então, diluídos duas vezes serialmente no tampão de reação para 3,125 nM. Injeções em duplicata de cada concentração de ligante são injetadas em 100 µl/min durante 150 segundos seguidas por uma fase de dissociação. A fase de dissociação tem 1.800 segundos de duração para todos os ligantes. A regeneração é realizada pela injeção de glicina 10 mM (pH 1,5) durante 60 segundos em 50 µl/min sobre todas as células de fluxo. Dados subtraídos da referência são coletados como Fc2-Fc1, Fc3-Fc1 e Fc4-Fc1. As medições são obtidas em 25 °C. A taxa de associação (kon) e a taxa de dissociação (koff) para cada ligante são avaliadas pelo uso de um modelo de ligação "Ligação 1:1 (transferência de massa)". A afinidade (KD) é calculada a partir da cinética de ligação de acordo com a relação: KD = koff/kon.

[0043] As quimiocinas ELR+ CXC humanas produzem uma resposta de ligação dependente de concentração com o Anticorpo 1 e o Anticorpo 2. As Tabelas 1 e 2 resumem os valores de kon, koff, e KD para o Anticorpo 1 e o Anticorpo 2. Esses resultados demonstram que o Anticorpo 1 e o Anticorpo 2 ligam todas as sete quimiocinas ELR+ CXC humanas com alta afinidade. TABELA 1 AFINIDADES DE LIGAÇÃO IN VITRO A QUIMIOCINAS ELR+ CXC HUMANAS PARA ANTICORPO 1 TABELA 2 AFINIDADES DE LIGAÇÃO IN VITRO A QUIMIOCINAS ELR+ CXC HUMANAS PARA ANTICORPO 2

AVALIAÇÃO DE ESTABILIDADE FÍSICA

[0044] Agregação de Proteína e autoassociação é uma propriedade indesejável em anticorpos uma vez que uma vez que pode exacerbar potencialmente efeitos indesejáveis, como desencadear uma reposta imune. Desse modo, manter o anticorpo em um estado monomérico é altamente desejável. O agregado de porcentagem de alto peso molecular (% em HMW) é um indicador de agregação de proteína e autoassociação. Um agregado de % em HMW maior indica agregação de proteína/autoassociação aumentada e instabilidade física aumentada. A estabilidade física do Anticorpo 1 e do Anticorpo 2 são determinadas conforme o seguinte.

[0045] O anticorpo é dialisado de um dia para outro a 4°C em 10 mM de citrato, pH 6 +/- 150 mM de NaCl. Na manhã seguinte, as amostras são concentradas a 50 mg/ml, filtradas através de filtros de 0,2 mícrons e, então, Tween-80 é adicionado a uma concentração final de 0,02%. Cada amostra é incubada a 25 °C para os tempos especificados. A formação de agregado solúvel é seguida de SEC analítica que usa uma TSK3000SWXL, coluna de 5 mícrons com dimensões de 30 cm x 0,78 cm. A fase móvel é 50 mM de fosfato de sódio, pH 7, 175 mM de NaCl, em uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. As amostras são aplicadas como injeções de 1 µl e monitoradas a 280 nm para determinar o aumento de agregado de % em HMW (Tabela 3).

[0046] As formulações com 50 mg/ml são incubadas durante 1 e 4 semanas a 25 °C para avaliar a estabilidade a longo prazo sob condições de estresse. O agregado de % em HMW delta é determinado pela subtração entre agregado de % em HMW no tempo zero (designado como ‘Inicial’ na Tabela 3) e a % em HMW no ponto de tempo de 1 semana ou 4 semanas. Após 1 e 4 semanas, o Anticorpo 1 e o Anticorpo 2 demonstraram % em HMW delta menor que 1% e desse modo demonstrou boa estabilidade física. TABELA 3 AGREGADO EM % DE ALTO PESO MOLECULAR

MAPEAMENTO DO EPITOPO DO ANTICORPO PARA ANTICORPO 1

[0047] Múltiplas abordagens são empreendidas para caracterizar o epitopo para Anticorpo 1, que inclui análise de Western Blot, co- cristalização do anticorpo com várias quimiocinas ELR+ CXC e análise mutacional para ligação e neutralização.

ANÁLISE DE WESTERN BLOT

[0048] Para determinar se o Anticorpo 1 pode se ligar a um epitopo linear ou conformacional, a análise de Western Blot é realizada pelo uso de condições de redução e de não redução. A eletroforese das proteínas é realizada pelo uso de géis pré-moldados NuPAGE® 4-12% Bis-Tris. O tampão de reação NuPAGE® MES SDS é adicionado às câmaras interna (200 ml) e externa (pelo menos 600 ml) das mini-células. Várias diluições de CXCL8 humano (400 ng, 100 ng ou 25 ng por linha) são feitas no tampão de amostra NuPAGE® LDS 4X com ou sem o agente redutor de amostra NuPAGE® 10X. As amostras são aquecidas a 95 °C durante 2 minutos. Volumes de carga são de 10 µl por linha para as amostras e 5 µl por linha para o marcador SeeBlue Plus2 Prestained Standard. Os géis são operados em 200V durante 35 minutos à temperatura ambiente.

[0049] Proteínas são transferidas a PVDF pelo uso do iBlot® Dry Blotting System com iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose, Mini. A membrana é bloqueada em uma solução de bloqueio (3% de leite desnatado em solução salina tamponada com fosfato) durante 1 hora à temperatura ambiente. O Anticorpo 1 é adicionado à solução de bloqueio a uma concentração final de 1 µg/ml e, então, é incubado durante 2 hours à temperatura ambiente. Seguinte à incubação primária, o anticorpo/solução de bloqueio é removido e a membrana é lavada 3 vezes durante 15 minutos em tampão de lavagem (solução salina tamponada com fosfato + Tween 20 0,05%). A membrana é, então, incubada com o HRP conjugado com anticorpo secundário IgG específico Fc anti-humano de burro (0,1 µg/ml em solução de bloqueio) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a remoção do anticorpo secundário, a membrana é lavada 4 vezes durante 10 minutos com o tampão de lavagem. A membrana é, então, incubada com solução funcional da Solução de Peróxido Estável e da Solução Acentuadora/Luminol (Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate) durante 5 minutos. A membrana é colocada em um protetor de membrana plástica em um cassete de filme para raio-X com Filme CL-X Posure™ durante 30 segundos. O filme é desenvolvido pelo uso de um sistema Konica SRX-101.

[0050] Sob condições de não redução, em uma concentração de CXCL8 de 400 ng, duas bandas apareceram em torno de 17 kDa e em torno de 10 kDa. Em uma concentração de CXCL8 de 100 ng, uma banda apareceu em torno de 10 kDa. Em uma concentração de CXCL8 de 25 ng, nenhuma banda apareceu. Sob condições de redução, nenhuma banda apareceu em qualquer uma das concentrações testadas.

[0051] Os resultados demonstraram que o Anticorpo 1 pode ligar CXCL8 humano desnaturado não reduzido, mas não pode ligar CXCL8 humano desnaturado reduzido. Portanto, as duas ligações de dissulfeto em CXCL8 são necessárias para manter o epitopo do anticorpo. Esses resultados demonstram um epitopo conformacional para o Anticorpo 1.

ANÁLISE DA ESTRUTURA CRISTALINA

[0052] Estruturas cristalinas dos Fab/complexos de antígeno para CXCL8 humano e CXCL2, CXCL3, e CXCL7 de macaco cinomolgo são obtidos para determinar a superfície de ligação completa do anticorpo 1. CXCL8 humano truncado tipo selvagem 1-66, mutantes de ponto CXCL8 humano, e CXCL7 macaco cinomolgo são todos expressos em E. coli com etiquetas His-SUMO N-terminais. Essas proteínas são redobradas; as etiquetas são clivadas; e as proteínas são purificadas por técnicas de purificação padrão. CXCL2 de macaco cinomolgo e CXCL3 de macaco cinomolgo são expressos em células HEK293 EBNA e são purificados por técnicas de purificação padrão. A formação de ligações de dissulfeto é confirmada pela digestão tríptica e análise de impressão digital de massa e a atividade é confirmada por ensaio de quimiotaxia neutrófila. Um Fab do Anticorpo 1 é expresso em células HEK293 EBNA e é purificado por técnicas de purificação padrão. Fab/complexos de antígeno são formados pela adição de pequeno excesso molar de antígeno ao Fab, seguido pela purificação de cromatografia de exclusão de tamanho para remover antígeno livre em excesso. Os complexos são cristalizados e as estruturas cristalinas são dissolvidas por substituição molecular com o uso de Buster 2.9.5 (Global Phasing Ltd.).

[0053] Essas estruturas cristalinas confirmam que o epitopo para Anticorpo 1 incluído no N-terminal das quimiocinas ELR+ CXC, mas as mesmas também mostraram contatos entre o Fab e o laço ßl- ß2 e os filamentos ß2 e ß3 das quimiocinas ELR+ CXC. As estruturas cristalinas também demonstram que o anticorpo especificamente reconhece a dobra das quimiocinas ELR+ CXC, já que as estruturas cristalinas foram sobrepostas. Interações numerosas por ligações de hidrogênio e Van der Waals também foram observadas. Mais notavelmente, a cadeia lateral R6 conservada do motivo ELR que permanece em uma bolsa de ligação profunda formada pela cadeia pesada do Fab nos resíduos W33, Y102 e Y110 e pela cadeia leve do Fab no resíduo W94. A quimiocina CXCL8 humana truncada tipo selvagem também forma ligações de hidrogênio com a cadeia pesada do Fab no resíduo E99 e com a cadeia leve do Fab na carbonila da cadeia principal N91. Outras ligações de hidrogênio observadas foram entre a carbonila da cadeia principal L5 da quimiocina CXCL8 humana truncada tipo selvagem e a amida da cadeia principal W94 da cadeia leve do Fab; a carbonila da cadeia principal I10 da quimiocina CXCL8 humana truncada tipo selvagem e a cadeia lateral S52 da cadeia pesada do Fab; a cadeia lateral K11 da quimiocina CXCL8 humana truncada tipo selvagem e as cadeias laterais T30 e S31 da cadeia pesada do Fab; a cadeia lateral H33 da quimiocina CXCL8 humana truncada tipo selvagem e a carbonila da cadeia principal W94 da cadeia leve do Fab ; a amida da cadeia principal A35 e a cadeia lateral N59 da cadeia pesada do Fab N59; e amida da cadeia principal C50 da quimiocina CXCL8 humana truncada tipo selvagem e a carbonila da cadeia principal Y104 da cadeia pesada do Fab. Adicionalmente, os resíduos N-terminais 5 até 13 da quimiocina CXCL8 humana truncada tipo selvagem fez contatos numerosos com o Fab à medida que o N- terminal repousou em uma ranhura entre os CDR2 e CDR3 da cadeia pesada do Fab. Adicionalmente, o laço CDR3 da cadeia pesada do Fab se estendeu para longe dessa ranhura e interagiu com o resíduo não N- terminal I40 no filamento ß2, e os resíduos Glu48, Leu49, e Cys50 no filamento ß3 da quimiocina CXCL8 humana truncada tipo selvagem. Finalmente, os resíduos 33 a 36 do laço ß1-ß2 na quimiocina CXCL8 humana truncada tipo selvagem se compacta contra o CDR2 da cadeia pesada do Fab.

ANÁLISE MUTACIONAL

[0054] Diversos contatos chave entre o Fab do Anticorpo 1 e CXCL8 humano tipo selvagem são observados na estrutura cristalina e são testados adicionlamente através de estudos de cinética de ligação e da neutralização pelo leitor de placas fluorométrica de imagem U937- huCXCR2 (FLIPR) de mutantes de ponto de CXCL8 humano. Para o estudo desses contatos chave, diversos mutantes de ponto (R6A, I10A, A35P, I40A e L49A) são feitos com base na sequência do CXCL8 humano (SEQ ID NO: 27). Os mutantes de ponto do CXCL8 humano tipo selvagem R6A, I10A, A35P, I40A, e L49A são expressos, redobrados e purificados de acordo com técnicas padrão. A formação de ligações de dissulfeto é confirmada pela digestão tríptica e análise de impressão digital de massa e a atividade é confirmada por ensaio de quimiotaxia neutrófila.

[0055] Cinéticas de ligação são testadas em um instrumento Biacore 2000 com Biacore 2000 Evaluation Software Versão 4.1 conforme descrito acima. CXCL8 humano tipo selvagem e mutante são testados para atividade biológica e para neutralização pelo Anticorpo 1 pelo uso do ensaio U937-huCXCR2. U937-huCXCR2 é uma linha celular monocítica transduzida com retrovírus para a expressão de CXCR2 humano.

[0056] Mutantes de CXCL8 são diluídos serialmente no tampão para testes que contém 0,2% de BSA nas placas de polipropileno de 96 cavidades de fundo em V. Concentrações de ligantes são o triplo da concentração de ensaio final (concentrações de ensaio final estão na faixa de 300 a 0,0051 nM). Uma placa de célula e uma placa de ligante são carregadas em um Leitor de Placas Fluorométrica de Imagem (Fluorescent Imaging Plate Reader, FLIPR-3, Molecular Devices) programado para transferir 50 µl de ligante para cavidades da placa de célula. A fluorescência é registrada em intervalos de 1 segundo durante 90 segundos. A mudança na fluorescência [unidades de fluorescência relativa delta (DRFU), Max RFU-Min RFU] é calculada nas imagens 10 a 90. DRFU em função de log (concentração de ligante) está plotado e os valores de EC50 são determinados por regressão não linear pelo uso de Graph Pad Prism. Os ensaios são realizados em triplicada em três placas de ensaio.

[0057] O Anticorpo 1 é diluído em série no tampão para testes que contém 0,2% de BSA. As concentrações do anticorpo são o triplo da concentração de ensaio final (concentrações finais estão na faixa de 10 a 0,0195 µg/ml). As soluções de estoque de CXCL8 humano tipo selvagem e mutantes de CXCL8 são preparadas no tampão para testes + 0,2% de BSA em 240 nM (30x a concentração de ensaio final de 8nM). 20 µl de ligante é misturado com 180 µl de Anticorpo 1 nas cavidades das placas de polipropileno de 96 cavidades de fundo em v. O ligante e o anticorpo são incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos. Uma placa de célula e uma placa de anticorpo-ligante são carregadas em um Leitor de Placas Fluorométrica de Imagem (Fluorescent Imaging Plate Reader, FLIPR-3, Molecular Devices) programado para transferir 50 µl de anticorpo-ligante para cavidades da placa de célula. A fluorescência é registrada em intervalos de 1 segundo durante 90 segundos. A mudança na fluorescência (DRFU) é calculada nas imagens 10 a 90. DRFU em função de log (concentração de ligante) está plotado e os valores de IC50 são determinados por regressão não linear pelo uso de Graph Pad Prism. Os ensaios são realizados em triplicada em três placas de ensaio.

[0058] Os resultados de cinética de ligação, atividade biológica e neutralização são resumidos na Tabela 4. As medições são obtidas em 25 °C. A taxa de associação (kon) e a taxa de dissociação (koff) para cada ligante são avaliadas pelo uso de um modelo de ligação "Ligação 1:1 (transferência de massa)". A afinidade (KD) é calculada a partir da cinética de ligação de acordo com a relação: KD = koff/kon.

[0059] Diversas das mutações se inativaram ao receptor (EC50) e, portanto, não puderam ser testados para neutralização. É observado que a mutação A35P aboliu completamente a atividade de neutralização apesar de ter atividade completa ao receptor. Esses resultados ressaltam os contatos chave (R6, I10, A35, I40 e L49) dentro da interface da ligação do antígeno CXCL8 que são importantes para a ligação do anticorpo. TABELA 4. CINÉTICA DE LIGAÇÃO, ATIVIDADE U937 FLIPR (EC50) E NEUTRALIZAÇÃO U937 FLIPR (IC50) DE CXCR8 HUMANO TIPO SELVAGEM E MUTANTES.

[0060] De modo geral, a análise de mapeamento do epitopo para o Anticorpo 1 demonstrou que a interface da ligação do antígeno inclui o N-terminal das quimiocinas ELR+ CXC (aminoácidos 5 a 13), o laço ß1- ß2 (aminoácidos 33 a 36), e os filamentos ß2 e ß3 (aminoácidos 40 e 48 a 50). Os contatos chave dentro dessa interface que são importantes para a ligação do anticorpo incluem os aminoácidos R6, I10, A35, I40 e L49 em CXCL8 (SEQ ID NO: 27).

ENSAIOS DE NEUTRALIZAÇÃO NEUTRALIZAÇÃO IN VITRO DE QUIMIOCINAS ELR+ CXC HUMANAS COM O USO DE CÉLULAS HMEC HUMANAS TRANSFECTADAS-CXCR2

[0061] Já que todas as quimiocinas ELR+CXC podem ligar o receptor CXCR2, as células que expressam CXCR2 foram selecionadas para estudos in vitro. HMEC-huCXCR2 é uma linha celular endotelial humana imortalizada transduzida com retrovírus para a expressão de receptor CXCR2 humano. Células HMEC que expressam CXCR2 humano podem induzir influxo intracelular de Ca2+ em resposta a quimiocinas ELR+CXC humanas, macaco cinomolgo, rato e camundongo. O influxo intracelular de Ca2+ pode ser detectado por um Leitor de Placas Fluorométrica de Imagem (Fluorescent Imagine Plate Reader, FLIPR). A neutralização de quimiocina, portanto, deve neutralizar também o influxo intracelular Ca2+ induzido por essas quimiocinas.

[0062] HMEC-huCXCR2 é mantido no meio MCDB 31 suplementado com soro fetal bovino 10%, 2x de GlutaMax, 1x de aminoácidos não essenciais, 1 µg/ml de hidrocortisona, 10 ng/ml de Fator de Crescimento Epidérmico Humano e 0,4 µg/ml de puromicina a 37 °C em 5% de CO2. As culturas são mantidas a densidades sub- confluentes (50 a 80% confluente). As células são cultivadas com TrypLE Express, a densidade da célula é ajustada para 3x105 células/ml em meio de cultura completo e 100 µl da suspensão de célula cultivadas nas cavidades de placas de ensaio pretas de fundo incolor. As placas de células são incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que células repousem no fundo das cavidades antes que as placas sejam incubadas de um dia para outro a 37 °C em 5% de CO2. Para cada placa de ensaio, os teores de um frasco de reagente Fluo- 4NW são suspensos em 10 ml de tampão para testes e 100 µl de probenecida para fazer 1x de reagente Fluo-4NW. Após a incubação, meio de cultura é aspirado e 100 µl do 1x da solução Fluo-4NW é adicionada a cada cavidade da placa de ensaio. As placas são incubadas durante 30 minutos a 37 °C, seguidas por 30 minutos adicionais à temperatura ambiente e protegidas da luz. O Anticorpo 1 é diluído em série no tampão para testes que contém 0,2% de BSA. As concentrações do anticorpo são 3x a concentração de ensaio final (concentrações finais estão na faixa de 10 a 0,0195 µg/ml). As soluções de estoque de ligantes são preparadas no tampão para testes + 0,2% de BSA em 300 nM (30x a concentração de ensaio final de 10 nM). 20 µl de ligante são misturados com 180 µl de anticorpo nas cavidades das placas de polipropileno de 96 cavidades de fundo em v. O ligante e o anticorpo são incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos. A placa de célula e a placa de anticorpo-ligante são carregadas em um Leitor de Placas Fluorométrica de Imagem (Fluorescent Imagine Plate Reader, FLIPR-3, Molecular Devices) programado para transferir 50 µl de anticorpo-ligante para cavidades da placa de célula. A fluorescência é registrada em cada segundo durante 90 segundos. A mudança na fluorescência (DRFU) é calculada nas imagens 10 a 90. DRFU em função de log (concentração de ligante) está plotado e os valores de IC50 são determinados por regressão não linear pelo uso de Graph Pad Prism. Os ensaios são realizados em triplicada em três placas de ensaio. Os dados são expressão como a média de replicatas.

[0063] Os resultados estão resumidos na Tabela 5. Esses resultados demonstram que o Anticorpo 1 pôde neutralizar todas as sete quimiocinas ELR+ CXC humanas. Os valores de IC50 são expressos em µg/ml de anticorpo (desvios padrão estão em parênteses). As formas 72 e 77 de aminoácido de CXCL8 foram usadas. Os dados são uma média de 2 a 5 replicatas. TABELA 5 ESTUDO COM FLIPR IN VITRO COM O USO DE CÉLULAS HMEC QUE EXPRESSAM CXCR2 HUMANO

NEUTRALIZAÇÃO IN VITRO DE CXCL8 HUMANO OU QUIMIOTAXIA INDUZIDA POR CXCL1 COM O USO DE NEUTRÓFILOS HUMANOS PRIMÁRIOS

[0064] A quimiotaxia ensaio com o uso de neutrófilos humanos foi escolhida para determinar a atividade de neutralização do Anticorpo 1 nas células que expressam naturalmente CXCR1 e CXCR2. O sangue periférico de voluntários saudáveis é transferido para dois 10 ml tubos de heparina de sódio. Para isolar neutrófilos, 5 ml de sangue são postos em camadas sobre 5 ml de Polymorphprep em quatro tubos de 15 ml. Os tubos são centrifugados durante 30 minutos a 470xg, 18 °C. As bandas de células de plasma e de topo (célulares mononucleares) são removidas e descartadas. A segunda banda (neutrófilos) é agrupada a partir dos 4 tubos e um volume igual de PBS é adicionado. O tubo é centrifugado durante 10 minutos a 400xg, 18 °C. Os péletes são lavados com 12 ml de PBS, centrifugado conforme definido anteriormente e os péletes são resuspensos com 11 ml de HBSS/BSA (7,5 mg/ml de BSA, HBSS). 60x106 de células são suspensas em 12 ml de HBSS/BSA e 5 µM de CMFDA e incubadas durante 30 min a 37 °C. Após a incubação, o tubo é centrifugado para peletizar as células, lavado uma vez com 12 ml de HBSS/BSA, e, então, as células são resuspensas em 12 ml de HBSS/BSA (5x106 células/ml).

[0065] O anticorpo 1 e controle isotípico (anticorpo IgG4 humano) são diluídos para 1495 nM com o uso de HBSS/BSA (Diluição 1) e, então, diluídos em série 1:5 com HBSS/BSA. CXCL8 é diluído para 20 nM com HBSS/BSA. CXCL1 é diluído para 10,1 nM com HBSS/BSA.

[0066] 70 µl do Anticorpo 1 ou HBSS/BSA são misturados com 70 µl de uma das soluções de CXCL8 ou CXCL1 e incubados à temperatura ambiente durante ~30 minutos. 30 µl da mistura são dispensados nas cavidades de câmara inferior de uma placa ChemoTx em triplicata. As cavidades que contém apenas HBSS/BSA (sem quimiocina ou anticorpo) mostrarão o sinal de fundo. O filtro ChemoTx é colocado sobre a câmara inferior e 50 µl (250,000 células) são dispensadas sobre cada cavidade. A placa ChemoTx é incubada durante 3 hours a 37 °C, 5% de CO2. Após a incubação, as células são enxaguadas da superfície de topo com PBS e o filtro ChemoTx é removido. A fluorescência é lida (contador Wallac Victor3 1420) 485/535 apenas com o uso do detector do fundo. A média de fluorescência das cavidades de fundo (apenas HBSS/BSA) é subtraída da fluorescência de cavidade de teste e a média e os desvios padrão são calculados no Excel.

[0067] Em uma concentração de CXCL8 de 5 nM, o IC50para o Anticorpo 1 (MW 150.000 kDa) foi 26,4 (±0,236) nM. Em uma concentração de CXCL8 de 10 nM, o IC50 para o Anticorpo 1 foi de 43,7 (±0,086) nM. Na concentração de CXCL1 de 5 nM, o IC50 para o Anticorpo 1 foi de 18,5 (±0,158) nM. Na concentração de CXCL1 de 20 nM, o IC50 para o Anticorpo 1 foi de 40,3 (±0,112) nM. Em todas as concentrações testadas de CXCL1 e CXCL8, o anticorpo de controle isotípico não afetou a quimiotaxia. Os dados mostraram que o Anticorpo 1 pode bloquear a atividade quimiotática de CXCL8 ou CXCL1 humano em uma maneira dependente de dose enquanto a atividade quimiotática não foi afetada pelo anticorpo de controle isotípico.

MODELO DE COLITE DSS AGUDA IN VIVO EM CAMUNDONGOS

[0068] Sulfato de dextrano sódico (DSS) é o modelo mais comumente usado de colite ulcerativa (UC). Nesse modelo, DSS é um agente de irritação químico que é adicionado a água potável para induzir a doença aguda que lembra UC. A fase aguda de colite DSS é caracterizada pelo recrutamento de neutrófilos para a mucosa e submucosa e pela expressão aumentada de quimiocinas ELR+ CXC. Entretanto, exposição crônica a DSS causa danos severos ao intestino e perda significante de peso, que não é adequado em um modelo de colite. Para acomodar a natureza aguda desse modelo, o Anticorpo 1 foi usado em uma maneira profilática para testar sua habilidade para inibir o recrutamento de neutrófilos e o desenvolvimento de colite. Para nota desse modelo, a proteína CXCL5 camundongo (LIX) é aumentada de modo significante no tecido de cólon (Kwon 2005); entretanto, o Anticorpo 1 não neutraliza essa quimiocina de camundongo.

[0069] Camundongos C57BL/6, 8 a 10 semanas de idade, com o peso de 18 a 22 g são obtidos. O sangue é coletado por punção cardíaca e analisado para estabelecer uma linha de base. Para induzir colite, os camundongos recebem 2,5% de DSS (MW=36.000 a 50.000) na água potável durante 5 dias (Dias 1 a 5) seguido de 6 dias sem água DSS (o que reflete inflamação aguda). Camundongos saudáveis de controle recebem apenas água (grupo "sem DSS"). Os camundongos que recebem DSS são dosados por injeção subcutânea nos Dias 0, 2, 4 e 8 com anticorpo de controle IgG4 humano (25 mg/kg) ou Anticorpo 1 (25 mg/kg). O peso corporal é registrado diariamente. O número de camundongos usado para cada tratamento é 9 (exceto os 5 camundongos saudáveis que são usados no grupo saudável "sem DSS") O estudo é realizado em quadruplicata.

[0070] Conforme mostrado na Tabela 6, os camundongos DSS que receberam o anticorpo de controle IgG4 humano perderam peso de modo drástico entre os Dias 5 e 8. Os camundongos DSS que receberam o Anticorpo 1 antes da indução da colite e durante a fase aguda da doença exibiram menor perda de peso entre os Dias 5 e 8 que os camundongos DSS tratados com o anticorpo de controle IgG4 humano (94,0% do peso corporal inicial para o Anticorpo 1 contra 85,3% do peso corporal inicial para o controle IgG4 no Dia 8). Esses resultados demonstram que a administração simétrica do Anticorpo 1 atenuou efetivamente a perda de peso na colite induzida por DSS, o que sustenta a conclusão de que o Anticorpo 1 neutraliza a atividade de determinadas quimiocinas ELR+ CXC de camundongo e diminui o recrutamento de neutrófilos ao cólon. TABELA 6

NEUTRALIZAÇÃO IN VIVO NO MODELO DE XENOENXERTO DE CÉLULA RENAL DE CÉLULA CLARA 786-O

[0071] Células de carcinoma de células renais (RCC) 786-O são misturadas 1:1 com matrigel e implantadas de modo subcutâneo no flanco posterior direito de camundongos fêmeas nude atímicos a 3.0 x 106 células por injeção. Camundongos portadores de xenoenxertos 786- O que têm volumes de tumor que alcançaram 100 mm3 foram engordados oralmente com 10 mg/kg de sunitinib duas vezes por dia sob um regime de dosagem contínua até que os camundongos começaram a progredir com o crescimento de tumor mesmo sob tratamento de sunitinib como camundongos com tratamento controlado (IgG4 e veículo 10%). Camundongos que estavam progredindo com o crescimento de tumor sob terapia de sunitinib foram divididas aleatoriamente em 2 grupos. Um grupo recebeu sunitinib em 10 mg/kg duas vezes por dia com anticorpo IgG4 de controle em 20 mg/kg uma vez na semana. O outro grupo recebeu suninitib em 10 mg/kg duas vezes por dia com o Anticorpo 1 em 20 mg/kg uma vez na semana. Volumes médios de tumor (erro padrão em parênteses) são mostrados na Tabela 7. A adição de Anticorpo 1 ao tratamento de sunitinib reduziu o crescimento de tumor de maneira significante através do tempo (p<0,0001) e foi indicado que o Anticorpo 1 ressensibilizou os tumores RCC de célula clara para o tratamento de sunitinib. TABELA 7

NEUTRALIZAÇÃO IN VIVO NO MODELO DE XENOENXERTO DE CÂNCER OVARIANO SKOV3-LUC

[0072] SKOV3-Luc é uma linha celular de câncer ovariano humano que expressa o gene da luciferase de vagalume. Células de SKOV3-Luc são usadas frequentemente in vivo para estabelecer o crescimento de tumor de adenocarcinoma de ovário humano.

[0073] Células de câncer ovariano SKOV3-Luc foram misturadas 1:1 com matrigel e implantadas de modo subcutâneo no flanco posterior direito de camundongos fêmeas nude atímicos a 3.0 x 106 células por injeção. Camundongos foram divididos de modo aleatório em 4 grupos em uma linha de base de acordo com o volume de tumor após os xenoenxertos crescerem para um volume médio de 200 mm3. Os camundongos receberam o anticorpo IgG4 de controle (2,5 mg/kg uma vez na semana), cisplatina (2,5 mg/kg uma vez na semana), Anticorpo 1 (20 mg/kg uma vez na semana) ou uma combinação de cisplatina (2,5 mg.kg uma vez na semana) e Anticorpo 1 (20 mg/kg uma vez na semana) por injeção intraperitoneal. O crescimento de tumor é mostrado na Tabela 8. A monoterapia de cisplatina não mostrou uma inibição de crescimento de tumor estatisticamente significativa se comparada com o controle isotípico. Entretanto, a combinação de cisplatina com Anticorpo 1 mostrou uma inibição de crescimento de tumor estatisticamente significativa (p<0,001) se comparada com o controle isotípico e com a monoterapia de cisplatina, o que indicou que o anticorpo 1 aumenta de modo sinérgico a quimioterapia no modelo de xenoenxerto de câncer ovariano SKOV3-Luc. TABELA 8

SEQUÊNCIAS SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA CADEIA PESADA DO ANTICORPO 1: SEQ ID NO: 1

[0074] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYEFTSYWIHWVR QAPGQGLEWMGNISPNSGSANYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELS SLRSEDTAVYYCAREGPYSYYPSREYYGSDLWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA PESADA DO ANTICORPO 1: SEQ ID NO: 2

[0075] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYEFTSYWIHWVR QAPGQGLEWMGNISPNSGSANYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELS SLRSEDTAVYYCAREGPYSYYPSREYYGSDLWGQGTLVTVSS

SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA CADEIA LEVE DO ANTICORPO 1: SEQ ID NO: 3

[0076] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNNLHWYQQKP GQAPRLLIYYTSRSVSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC GQNNEWPEVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA LEVE DO ANTICORPO 1: SEQ ID NO: 4

[0077] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNNLHWYQQKP GQAPRLLIYYTSRSVSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC GQNNEWPEVFGGGTKVEIK

SEQUÊNCIA DE DNA DA CADEIA PESADA DO ANTICORPO 1: SEQ ID NO: 5

[0078] CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAAGTGAAGA AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCATCTGGCTAC GAGTTCACCAGCTACTGGATTCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGG ACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAATATTTCTCCTAATAGTGGTAG TGCTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTCACCATGACCAG GGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGA GATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGCCCT TACAGTTATTATCCGAGTAGGGAGTACTATGGCTCTGACCTCTGG GGGCAAGGGACCCTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGG CCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCG AGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTC CCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGA AGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGG TGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCT GCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG TCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTC CAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGG TCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACC AGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTA CAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGA ATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT

SEQUÊNCIA DE DNA DO ANTICORPO 1 DA CADEIA LEVE: SEQ ID NO: 6

[0079] GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTT GTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAAA GTATCAGCAATAACCTACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGG CTCCCAGGCTCCTCATCTATTATACTTCCCGGTCCGTCTCTGGCAT CCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTC TCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTG TGGACAGAATAACGAGTGGCCTGAGGTGTTCGGCGGAGGGACCA AGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCT TCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTG TGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGT GTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAG CACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTA CGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAA AGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC

LCDR1 DO ANTICORPO 1/ANTICORPO 2: SEQ ID NO: 7

[0080] RASQSISNNLH

LCDR2 DO ANTICORPO 1/ANTICORPO 2: SEQ ID NO: 8

[0081] YTSRSVS

LCDR3 DO ANTICORPO 1/ANTICORPO 2: SEQ ID NO: 9

[0082] GQNNEWPEV

HCDR1 DO ANTICORPO 1/ANTICORPO 2: SEQ ID NO: 10

[0083] GYEFTSYWIH

HCDR2 DO ANTICORPO 1/ANTICORPO 2: SEQ ID NO: 11

[0084] NISPNSGSANYNEKFKS

HCDR3 DO ANTICORPO 1: SEQ ID NO: 12

[0085] EGPYSYYPSREYYGSDL

SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA CADEIA PESADA DO ANTICORPO 2: SEQ ID NO: 13

[0086] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYEFTSYWIHWVR QAPGQGLEWMGNISPNSGSANYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELS SLRSEDTAVYYCAREGPYSYYPSRQYYGSDLWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA PESADA DO ANTICORPO 2: SEQ ID NO: 14

[0087] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYEFTSYWIHWVR QAPGQGLEWMGNISPNSGSANYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELS SLRSEDTAVYYCAREGPYSYYPSRQYYGSDLWGQGTLVTVSS

SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA CADEIA LEVE DO ANTICORPO 2: SEQ ID NO: 15

[0088] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNNLHWYQQKP GQAPRLLIYYTSRSVSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC GQNNEWPEVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA LEVE DO ANTICORPO 2: SEQ ID NO: 16

[0089] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNNLHWYQQKP GQAPRLLIYYTSRSVSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC GQNNEWPEVFGGGTKVEIK

SEQUÊNCIA DE DNA DA CADEIA PESADA DO ANTICORPO 2: SEQ ID NO: 17

[0090] CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAAGTGAAGA AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCATCTGGCTAC GAGTTCACCAGCTACTGGATTCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGG ACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAATATTTCTCCTAATAGTGGTAG TGCTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTCACCATGACCAG GGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGA GATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGCCCT TACAGTTATTATCCGAGTAGGCAGTACTATGGCTCTGACCTCTGG GGGCAAGGGACCCTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGG CCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCG AGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTC CCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGA AGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGG TGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCT GCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG TCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTC CAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGG TCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACC AGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTA CAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGA ATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT

SEQUÊNCIA DE DNA DO ANTICORPO 2 DA CADEIA LEVE: SEQ ID NO: 18

[0091] GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTT GTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAAA GTATCAGCAATAACCTACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGG CTCCCAGGCTCCTCATCTATTATACTTCCCGGTCCGTCTCTGGCAT CCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTC TCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTG TGGACAGAATAACGAGTGGCCTGAGGTGTTCGGCGGAGGGACCA AGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCT TCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTG TGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGT GTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAG CACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTA CGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAA AGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC

HCDR3 DO ANTICORPO 2: SEQ ID NO: 19

[0092] EGPYSYYPSRQYYGSDL

SEQUÊNCIAS DE CONSENSO DE HCDR3: SEQ ID NO: 20

[0093] EGPYSYYPSRXaaYYGSDL

[0094] em que Xaa é E ou Q.

GRO-ALFA HUMANO (CXCL1): SEQ ID NO: 21

[0095] ASVATELRCQCLQTLQGIHPKNIQSVNVKSPGPHCAQTEV IATLKNGRKACLNPASPIVKKIIEKMLNSDKSN

GRO-BETA HUMANO (CXCL2): SEQ ID NO: 22

[0096] APLATELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVKVKSPGPHCAQTEVI ATLKNGQKACLNPASPMVKKIIEKMLKNGKSN

GRO-GAMA HUMANO (CXCL3): SEQ ID NO: 23

[0097] ASVVTELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVNVRSPGPHCAQTEV IATLKNGKKACLNPASPMVQKIIEKILNKGSTN

ENA-78 HUMANA (CXCL5): SEQ ID NO: 24

[0098] AAVLRELRCVCLQTTQGVHPKMISNLQVFAIGPQCSKVEV VASLKNGKEICLDPEAPFLKKVIQKILDGGNKEN

GCP-2 HUMANO (CXCL6): SEQ ID NO: 25

[0099] VSAVLTELRCTCLRVTLRVNPKTIGKLQVFPAGPQCSKVE VVASLKNGKQVCLDPEAPFLKKVIQKILDSGNKKN

NAP-2 HUMANA (CXCL7): SEQ ID NO: 26

[00100] AELRCMCIKTTSGIHPKNIQSLEVIGKGTHCNQVEVIATLK DGRKICLDPDAPRIKKIVQKKLAGDESAD

IL-8 HUMANA (CXCL8): SEQ ID NO: 27

[00101] SAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVK LSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS

Claims (12)

1. Anticorpo que liga Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gama, ENA-78, GCP-2, NAP-2 e IL-8 humanos, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a cadeia leve compreende a região variável da cadeia leve (LCVR) e a cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada (HCVR), em que a LCVR compreende LCDR1, LCDR2, LCDR3 e a HCVR compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, em que LCDR1 é RASQSISNNLH (SEQ ID NO: 7), LCDR2 é YTSRSVS (SEQ ID NO: 8), LCDR3 é GQNNEWPEV (SEQ ID NO: 9), HCDR1 é GYEFTSYWIH (SEQ ID NO: 10), HCDR2 é NISPNSGSANYNEKFKS (SEQ ID NO: 11), e HCDR3 é EGPYSYYPSRXaaYYGSDL (SEQ ID NO: 20) em que Xaa é E ou Q.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da HCVR é SEQ ID NO: 2.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da LCVR é SEQ ID NO:

4. 4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da HCVR é SEQ ID NO: 2 e a sequência de aminoácidos da LCVR é SEQ ID NO: 4.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácidos da cadeia leve é SEQ ID NO: 3.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende duas cadeias pesadas que têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e duas cadeias leves que têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

7. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira sequência de polinucleotídeos que tem a sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 5; e compreende uma segunda sequência de polinucleotídeos que tem a sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 6.

8. Processo para produzir um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula de mamífero que compreende a molécula de DNA como definida na reivindicação 7, sob condições de modo que o anticorpo seja expresso, e recuperar o anticorpo expresso.

9. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratamento de colite ulcerativa, câncer renal ou câncer ovariano em um paciente.

10. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.

11. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de colite ulcerativa, câncer renal ou câncer ovariano.

12. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para terapia.