BR112015016297B1 - Processo para hidrólise enzimática de material lignocelulósico - Google Patents

Abstract

processo para hidrólise enzimática de material lignocelulósico. a invenção refere-se a um processo para a hidrólise de biomassa contendo celulose, que compreende um passo de liquefação em que uma primeira enzima ou primeira composição de enzima é adicionada para liquefazer, pelo menos uma parte de, os sólidos presentes na biomassa e para manter a viscosidade da biomassa contendo celulose inferior a 1000 cp, de preferência inferior a 800 cp, mais preferencialmente inferior a 600 cp no passo de liquefação; seguido por umo passo de sacarificação em que uma segunda composição de enzima é adicionada para formar açúcares oligoméricos e/ou monoméricos; e em que a primeira enzima ou primeira composição de enzima é diferente da segunda composição de enzima; em que a primeira enzima ou primeira composição de enzima compreende uma endoglicanase; em que a segunda composição de enzima compreende uma celulase; e em que a primeira enzima ou primeira composição de enzima compreende mais endogluconase do que a segunda composição de enzima (expresso em % de proteína em peso).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção refere-se a um processo para a hidrólise enzimática de material lignocelulósico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Material vegetal lignocelulósico, aqui também denominado matéria prima ou material contendo celulose, é uma fonte renovável de energia sob a forma de açúcares que podem ser convertidos em produtos valiosos, por exemplo, biocombustíveis, tal como bioetanol. Durante este processo, (ligno ou hemi)-celulose presente na matéria-prima, tal como palha de trigo, palha de milho, cascas de arroz, etc., são convertidos em açúcares redutores, por enzimas (hemi)- celulóticas, que são depois convertidos em produtos valiosos, tal como o etanol, por microrganismos como leveduras, bactérias e fungos.

[003] Visto que a hemicelulose é cristalina e aprisionada em uma rede de lignina, a conversão em açúcares redutores é, em geral, lenta e incompleta. Tipicamente, a hidrólise enzimática da matéria-prima não tratada produz açúcares < 20% da quantidade teórica. Através da aplicação de um pré-tratamento termoquímico e físico, a hemicelulose é mais acessível para as enzimas hemicelulolíticas, e, assim, as conversões ocorrem mais rapidamente e com rendimentos mais elevados.

[004] A produção de etanol típica a partir da glicose, derivada de palha de milho pré-tratada, é de 40 litros de etanol por 1000 kg de palha de milho seca (Badger, P, Ethanol from cellulose: a general review, Trends in new crops and new uses (Etanol a partir de celulose: uma revisão geral, tendências em novas culturas e novos usos). 2002. J. Janick e A. Whipkey (eds.) ASHS Press, Alexandria, VA), ou 0,3 g de etanol por grama de matéria-prima. O rendimento máximo de etanol em base de celulose é, aproximadamente, 90%.

[005] As enzimas celulolíticas - a maioria delas é produzida por espécies como Trichoderma, Humicola e Aspergillus - são comercialmente utilizadas para converter matéria-prima pré-tratada em uma mistura contendo hemicelulose insolúvel, açúcares redutores feitos a partri destes e lignina. Esta mistura é, em seguida, utilizada em uma fermentação durante a qual os açúcares redutores são convertidos em biomassa de levedura (células), dióxido de carbono e etanol. O etanol produzido desta maneira é chamado de bioetanol.

[006] A produção comum de açúcares a partir de matérias-primas lignocelulósicas pré-tratadas, a hidrólise também chamada de liquefação, pré-sacarificação ou sacarificação, geralmente ocorre durante um processo com duração de 6 - 168 horas (Kumar, S., Chem. Eng. Technol. 32 (2009) 517-526; Murray, P., et al., Enzyme Microbial Technol. 29 (2001) 90-98); sob temperaturas elevadas de 4550°C (Kumar, S., Chem. Eng. Technol. 32 (2009) 517-526) e condições não estéreis. Durante esta hidrólise, a celulose presente é, em parte (tipicamente 30-95%, dependente das condições de atividade e hidrólise de enzimas) convertida em açúcares redutores. No caso da inibição de enzimas por compostos presentes na matéria-prima pré-tratada e por açúcares liberados; e para minimizar a inativação térmica, este período de temperatura elevada é minimizado tanto quanto possível.

[007] A fermentação após a hidrólise ocorre em uma etapa de processo anaeróbio separada, quer no mesmo ou em um recipiente diferente, em que a temperatura é ajustada para 30-33°C (processo mesofílico) para acomodar o crescimento e a produção de etanol a partir da biomassa microbiana, comumente, leveduras. Durante este processo de fermentação, o material hemicelulósico restante é convertido em açúcares redutores pelas enzimas já presentes da etapa de hidrólise, enquanto a biomassa microbiana e etanol são produzidos. Este tipo de fermentação é, por conseguinte, muitas vezes chamado Sacarificação e Fermentação Simultâneas, SSF. A fermentação é terminada uma vez que o material hemicelulósico é convertido em açúcares fermentáveis e todos os açúcares fermentáveis são convertidos em etanol, dióxido de carbono e células microbianas.

[008] O mosto fermentado assim obtido é composto de açúcares não fermentáveis, material hemicelulósico não hidrolisável, lignina, células microbianas (mais comumente células de levedura), água, etanol, dióxido de carbono dissolvido. Durante as etapas sucessivas, o etanol é destilado a partir da mistura e posteriormente purificado. A suspensão de sólido restante é seca e utilizada como, por exemplo, combustível de queima, fertilizante ou alimento para o gado.

[009] Com cada lote de matéria-prima, enzimas são adicionadas para maximizar o rendimento e a taxa de açúcares fermentáveis liberados a partir da matéria-prima lignocelulósica pré-tratada durante o dado momento de processo. Em geral, os custos para a produção de enzimas, matéria-prima para produções e investimentos de etanol são os principais fatores de custos nos custos de produção globais (Kumar, S., Chem. Eng. Technol. 32 (2009) 517-526). Até agora, o custo da redução de utilização da enzima é alcançado através da aplicação de produtos de enzimas a partir de uma única ou de várias fontes microbianas (WO2008/008793) com atividade hidrolítica mais ampla e/ou superior (específica) cuja utilização visa uma necessidade de enzima inferior, taxas de conversão mais rápidas e/ou mais elevados rendimentos de conversão e, portanto, em geral menores custos de produção de bioetanol. Isso requer grandes investimentos em pesquisa e desenvolvimento destes produtos enzimáticos. No caso de um produto de enzima constituído por enzimas a partir de várias fontes microbianas, são necessários grandes investimentos de capital para a produção de cada composto de enzima indivudual.

[0010] É desejável, por conseguinte, melhorar o processo acima envolvendo hidrólise e fermentação.

[0011] Enzimas celulolíticas termostáveis provenientes de Talaromyces têm sido utilizadas para degradar matéria- prima lignocelulósica e estas enzimas são conhecidas pela sua termoestabilidade em WO2007091231. No entanto, nenhuma divulgação é dada em como otimizar o processo de hidrólise e fermentação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0012]Um objeto da invenção é proporcionar um processo para a hidrólise de biomassa contendo celulose, que compreende: - uma etapa de liquefação no qual uma primeira enzima ou primeira composição de enzima é adicionada para liquefazer, pelo menos uma parte de, os sólidos presentes na biomassa e manter a viscosidade da biomassa contendo celulose inferior a 1000 cP, de preferência inferior a 800 cP, mais preferencialmente inferior a 600 cP, na etapa de liquefação; seguida por; - uma etapa de sacarificação em que é adicionada uma segunda composição de enzima para formar açúcares oligoméricos e/ou monoméricos; e em que a primeira enzima ou primeira composição de enzima é diferente da segunda composição de enzima; em que a primeira enzima ou primeira composição de enzima compreende uma endoglicanase; em que a segunda composição de enzima compreende uma celulase; e em que a primeira enzima ou primeira composição de enzima compreende mais endogluconase do que a segunda composição de enzima (expresso em % de proteína em peso).

[0013] Outro objetivo da invenção é o de proporcionar um processo para a hidrólise da biomassa contendo celulose, que compreende: - uma etapa de liquefação na qual uma primeira enzima ou primeira composição de enzima é adicionada para liquefazer, pelo menos uma parte de, os sólidos presentes na biomassa e para obter um fator de redução de viscosidade de, pelo menos, 2, pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 10, pelo menos 15 ou pelo menos 20, na etapa de liquefação; seguida por - uma etapa de sacarificação em que é adicionada uma segunda composição de enzima para formar açúcares oligoméricos e/ou monoméricos; e em que a primeira enzima ou primeira composição de enzima é diferente da segunda composição de enzima; em que a primeira enzima ou primeira composição de enzima compreende uma endoglicanase; em que a segunda composição de enzima compreende uma celulase; e em que a primeira enzima ou primeira composição de enzima compreende mais endogluconase do que a segunda composição de enzima (expresso em % de proteína em peso).

[0014] De preferência, a etapa de liquefação ocorre em um reator (reator de liquefação) que tem um volume menor do que o volume do reator (reator de sacarificação) no qual a etapa de sacarificação ocorre, de preferência, a razão entre o volume do reator de liquefação e o volume do reator de sacarificação está entre 1:2 e 1:50, mais preferencialmente entre 1:3 e 1:40.

[0015] De acordo com outro aspecto da invenção, o reator de liquefação e/ou o reator de sacarificação tem um volume de mais de 1 m3, de preferência, tem um volume de entre 10 e 5000 m3.

[0016] De um modo vantajoso, na etapa de liquefação ou no reator de liquefação é adicionado menos enzima (em matéria seca de proteína) por volume de reator do que na fase em que o açúcar oligomérico e/ou monomérico é formado ou no reator de hidrólise de açúcares monoméricos.

[0017] De acordo com um outro aspecto da invenção, a segunda composição de enzima compreende, pelo menos, duas celobiohidrolases diferentes e, opcionalmente, uma beta- glicosidase e/ou GH61.

[0018] De preferência, a primeira enzima ou primeira composição de enzima e/ou a segundo enzima ou composição de enzima compreende uma enzima termoestável.

[0019] De acordo com uma forma de realização preferida, a etapa de liquefação é feita em modo descontínuo alimentado, semi-contínuo ou contínuo, mais preferencialmente em modo contínuo.

[0020] De acordo com uma outra forma de realização preferida, a etapa de sacarificação é realizada em modo descontínuo alimentado, semi-contínuo ou descontínuo, mais preferencialmente em modo descontínuo ou descontínuo alimentado.

[0021]Na etapa de liquefação, de preferência, um teor de matéria seca de 5% em peso ou superior, 8% em peso ou superior, 10% em peso ou superior, 11% em peso ou superior, 12% em peso ou superior, 13% em peso ou superior, 14% em peso ou superior, 15% em peso ou superior, 20% em peso ou superior, 25% em peso ou superior, 30% em peso ou superior, 35% em peso ou superior, ou 40% em peso ou superior e, de preferência, menos do que 42% em peso, é mantido.

[0022]A etapa de liquefação é, de preferência, conduzida a uma temperatura de 50°C ou mais, 55°C ou mais, 60°C ou mais, 65°C ou mais, ou 70°C ou, mais preferencialmente, a etapa de liquefação é conduzida a uma temperatura de entre 65°C e 110°C, ainda mais preferencialmente entre 65°C e 90°C, ainda mais preferencialmente entre 65°C e 80°C e mais preferencialmente entre 70°C e 80°C.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0023] Figura 1: o efeito de pré-liquefação com endoglicanase.

[0024] Figura 2: decaimento de viscosidade durante liquefação de matéria-prima lignocelulósica a diferentes temperaturas (♦ = 62°C, ▲ = 70°C e • = 75°C).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0025] A presente invenção é direcionada a reduzir os custos operacionais, tais como custos de enzima, custos de reator e custos de energia, em um processo para a hidrólise de biomassa contendo celulose. Os custos de enzima podem ser reduzidos através da utilização de menos enzimas e, ao mesmo tempo, mantendo os resultados de produção elevados, tal como níveis elevados de açúcares, etanol, biogás ou outros produtos desejados, todos em comparação com os processos de hidrólise conhecidos. Os custos de reator podem ser reduzidos através da seleção de condições de processo que resultem em menor volume de reator total em comparação com processos de hidrólise conhecidos. A economia de energia pode ser obtida, de acordo com o invento, através de uma menor necessidade de fornecimento de energia para o processo da invenção.

Material lignocelulósico

[0026]Material lignocelulósico aqui, inclui qualquer material lignocelulósico e/ou hemicelulósico. O material lignocelulósico adequado para utilização como matéria-prima ou material contendo celulose na invenção inclui biomassa, por exemplo, biomassa virgem e/ou biomassa não-virgem tal como biomassa agrícola, orgânicos comerciais, restos de construção e demolição, resíduos sólidos urbanos, resíduos de papel e resíduos de jardim. As formas mais comuns de biomassa incluem árvores, arbustos e gramíneas, trigo, palha de trigo, bagaço de cana-de-açúcar, switch grass, miscanthus, milho, palha de milho, casca de milho, espigas de milho, caules de canola, caule de soja, sorgo doce, semente de milho, incluindo fibra de grãos, produtos e subprodutos da moagem de grãos como milho, trigo e cevada (incluindo moagem úmida e moagem a seco), muitas vezes chamado de "farelo ou fibra", bem como os resíduos sólidos urbanos, resíduos de papel e resíduos de jardim. A biomassa também pode ser, mas não está limitada a, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos municipais, resíduos de papel e resíduos de polpa e moinhos de papel. A "biomassa agrícola" inclui ramos, arbustos, canas, milho e palha de milho, culturas energéticas, florestas, frutas, flores, grãos, gramíneas, culturas herbáceas, folhas, cascas, agulhas, troncos, raízes, mudas, culturas lenhosas de curta rotação, arbustos, gramíneas americanas, árvores, vegetais, cascas de frutas, videiras, polpa de beterraba, triguilho, cascas de aveia e madeiras duras e macias (não incluindo madeiras com materiais nocivos à saúde). Além disso, a biomassa agrícola inclui materiais de resíduos orgânicos gerados a partir de processos agrícolas, incluindo atividades agrícolas e florestais, incluindo especificamente os resíduos de madeira florestal. As biomassas agrícolas podem ser qualquer uma das acima mencionadas, isoladamente ou em qualquer combinação ou mistura das mesmas.

Pré-tratamento

[0027]A matéria-prima pode ser, opcionalmente, pré- tratada com calor, microbiana mecânica, modificação enzimática e/ou química ou qualquer combinação de tais métodos, a fim de melhorar a acessibilidade do substrato à hidrólise enzimática e/ou hidrolisar a hemicelulose e/ou solubilizar a hemicelulose e/ou celulose e/ou lignina, de qualquer maneira conhecida na arte. Em uma forma de realização, o pré-tratamento é realizado o tratando a lignocelulose com explosão de vapor, tratamento de água quente ou por tratamento com ácido diluído ou base diluída.

Etapa de lavagem

[0028] Opcionalmente, o processo de acordo com a invenção compreende uma etapa de lavagem. A etapa de lavagem opcional pode ser utilizada para remover os compostos solúveis em água que podem atuar como inibidores para a etapa de fermentação. A etapa de lavagem pode ser conduzida de maneira conhecida.

Etapa de liquefação

[0029] O processo de acordo com a invenção compreende a liquefação da matéria-prima. Nesta etapa, o material lignocelulósico opcionalmente pré-tratado e, opcionalmente, lavado é posto em contato com uma primeira enzima ou primeira composição de enzima. Dependendo do material lignocelulósico e o pré-tratamento, as diferentes condições de reação, por exemplo, temperatura, dosagem da enzima, tempo de reação de hidrólise e concentração de matéria seca, podem ser adaptadas pelo versado na técnica, a fim de conseguir uma conversão desejada de lignocelulose. Algumas indicações são dadas a seguir.

[0030] De um modo preferido, na etapa de liquefação, uma primeira enzima ou primeira composição de enzima é adicionada para liquefazer, pelo menos, parte dos sólidos presentes na biomassa e manter a viscosidade da biomassa contendo celulose nesta etapa inferior a 1000 cP, de preferência inferior a 800 cP, mais preferencialmente inferior a 600 cP. A biomassa contendo celulose nesta etapa tem, de preferência, um teor de matéria seca de entre 12 e 35% em peso, mais preferencialmente de entre 15 e 30% em peso.

[0031]No teor de matéria seca de 5% em peso ou superior, por exemplo, a 20% em peso, a biomassa contendo celulose terá uma viscosidade superior a 1000 cP, por exemplo 2000 cP.

[0032] De acordo com uma outra forma de realização preferida da etapa de liquefação, uma primeira enzima ou primeira composição de enzima é adicionada para liquefazer, pelo menos parte de, os sólidos presentes na biomassa para obter um fator de redução de viscosidade de pelo menos 2, pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 10, pelo menos 15 ou pelo menos 20, na etapa de liquefação. Em geral o fator de redução da viscosidade irá ser inferior a 50. Por fator de redução de viscosidade é denotado a viscosidade da biomassa que entra na etapa de liquefação dividida pela viscosidade da biomassa que deixa a etapa de liquefação (cP/cP).

[0033]A fim de obter alto teor de sólidos e uma viscosidade baixa na etapa de liquefação, na fase de arranque o reator de liquefação pode conter água e biomassa contendo celulose (e a primeira enzima ou primeira composição de enzima) em uma quantidade que a viscosidade seja inferior a 1000 cP, de preferência inferior a 800 cP, mais preferencialmente inferior a 600 cP. Após a viscosidade ser diminuída devido à enzima adicionada, mais biomassa contendo celulose pode ser adicionada e, assim, o teor de matéria seca na etapa de liquefação irá aumentar. Este processo de arranque pode ser feito até que o teor de matéria seca desejado no reator de liquefação seja atingido. Subsequentemente, a etapa de liquefação pode ser mantida em modo descontínuo alimentado, semi-contínuo ou contínuo.

[0034] Outra forma de arranque é um procedimento em que a biomassa contendo celulose, na etapa de liquefação, tem, inicialmente, uma viscosidade mais elevada do que 500 cP. Neste procedimento, apenas após a primeira enzima ou primeira composição de enzima ter diminuído a viscosidade a inferior a 1000 cP, de preferência inferior a 800 cP, mais preferencialmente inferior a 600 cP, a etapa de liquefação é continuada em modo descontínuo alimentado, semi-contínuo ou contínuo. Neste procedimento, com vantagem, na fase de arranque mais primeira enzima ou primeira composição de enzima é doseada (por quantidade de matéria seca de biomassa contendo celulose) na fase de arranque do que no subsequente modo descontínuo alimentado, semi-contínuo ou contínuo.

[0035]A primeira enzima ou primeira composição de enzima a qual é adicionada na etapa de liquefação é diferente da segunda composição de enzima utilizada na etapa de sacarificação.

[0036]A primeira enzima ou primeira composição de enzima compreende uma endoglicanase.

[0037]A primeira enzima ou primeira composição de enzima compreende mais endogluconase do que a segunda composição de enzima (expresso em % de proteína em peso).

[0038]Em um aspecto da invenção, a etapa de liquefação é conduzida a uma temperatura de 50°C ou mais, 55°C ou mais, 60°C ou mais, 65°C ou mais, ou 70°C ou, mais preferencialmente, a etapa de liquefação é conduzida a uma temperatura de entre 65°C e 110°C, mais preferencialmente entre 65°C e 90°C, ainda mais preferencialmente entre 65°C e 80°C e mais preferencialmente entre 70°C e 80°C. A temperatura elevada durante a liquefação tem muitas vantagens as quais incluem trabalhar à temperatura ótima da composição de enzima, a redução do risco de contaminação (bacteriana), atividade enzimática mais elevada, viscosidade mais baixa após a etapa de liquefação, maior decaimento da viscosidade durante a etapa de liquefação, menor quantidade de água de arrefecimento necessária, utilização de água de arrefecimento com uma temperatura mais elevada, a reutilização das enzimas é mais fácil e muito mais (todas as vantagens relativas à situação em que uma temperatura mais baixa é utilizada na etapa de liquefação).

[0039]Em um outro aspecto da invenção, a quantidade de primeira enzima ou primeira composição de enzima adicionada (aqui também chamado de dosagem de enzima ou carga de enzima) é baixa. Em uma forma de realização, a quantidade de enzima adicionada na etapa de liquefação é de 6 mg de proteína/g de matéria seca em peso ou inferior, 5 mg de proteína/g de matéria seca ou inferior, 4 mg de proteína/g de matéria seca ou inferior, 3 mg de proteína/g seco matéria ou inferior, 2 mg de proteína/g de matéria seca ou inferior, ou 1 mg de proteína/g de matéria seca ou inferior (expresso como proteína em mg de proteína/g de matéria seca). Em uma forma de realização, a quantidade de enzima é de 0,5 mg de enzima/g em peso de matéria seca ou inferior, 0,4 mg de composição de enzima/g de matéria seca em peso ou inferior, 0,3 mg de enzima/g de matéria seca em peso ou inferior, 0,25 mg de enzima/g de matéria seca em peso ou inferior, 0,20 mg de enzima/g de matéria seca em peso ou inferior, 0,18 mg de enzima/g de matéria seca em peso ou inferior, 0,15 mg de enzima/g de matéria seca em peso ou inferior ou 0,10 mg de enzima/g de matéria seca em peso ou inferior (expresso como total de enzimas celulase em mg de enzima/g de matéria seca).

[0040] Em um outro aspecto da invenção, o tempo de liquefação é de 10 horas ou menos, 5 horas ou menos, 3 horas ou menos ou 2 horas ou menos. Em um outro aspecto, o tempo de liquefação é de 10 horas a 1 minuto, 5 horas a 3 minutos ou 3 horas a 5 minutos. Devido à estabilidade da enzima ou composição de enzima, a enzima ou composição de enzima irá permanecer ativa na próxima (sacarificação) etapa.

[0041] O pH durante a liquefação pode ser escolhido pelo versado na técnica. Em um outro aspecto da invenção, o pH durante a liquefação pode ser 3,0 - 6,4. As enzimas estáveis da invenção podem ser escolhidas para terem um amplo intervalo de pH de até 2 unidades de pH, até 3 unidades de pH, até 5 unidades de pH. O pH ótimo pode estar dentro dos limites de pH 2,0 a 8,0; 3,0-8,0; 3,5-7,0; 3,56,0; 3,5-5,0; 3,5-4,5; 4,0-4,5 ou é de cerca de 4,2.

[0042] Significativamente, um processo da invenção pode ser realizado utilizando níveis elevados de matéria seca (do material lignocelulósico) na etapa de liquefação. Assim, a invenção pode ser realizada com um teor de matéria seca de 5% em peso ou superior, 8% em peso ou superior, 10% em peso ou superior, 11% em peso ou superior, 12% em peso ou superior, 13% em peso ou superior, 14% em peso ou superior, 15% em peso ou superior, 20% em peso ou superior, 25% em peso ou superior, 30% em peso ou superior, 35% em peso ou superior ou 40% em peso ou superior, e, de preferência, menos do que 42% em peso. Em uma outra forma de realização, o teor de matéria seca na etapa de liquefação é de 14% em peso, 15% em peso, 16% em peso, 17% em peso, 18% em peso, 19% em peso, 20% em peso, 21% em peso, 22% em peso, 23% em peso, 24% em peso, 25% em peso, 26% em peso, 27% em peso, 28% em peso, 29% em peso, 30% em peso, 31% em peso, 32% em peso, 33% em peso ou mais ou 1433% em peso.

[0043] De preferência, o reator de liquefação tem um volume de 1 m3 ou mais, preferencialmente de mais de 10 m3 e mais preferencialmente de 50 m3 ou mais. Em geral, o reator de liquefação vai ser menor do que 3000 m3 ou 5000 m3.

Sacarificação

[0044] O processo de acordo com a invenção compreende uma etapa de sacarificação enzimática. A hidrólise enzimática inclui, mas não está limitada a hidrólise com a finalidade de hidrólise para a finalidade de liberação de açúcar a partir da matéria-prima liquefeita. Nesta etapa, o material lignocelulósico, opcionalmente, pré-tratado e, opcionalmente, lavado é mantido, após a liquefação, em contato com a segunda composição de enzima.

[0045] Dependendo do material lignocelulósico, a etapa de pré-tratamento e liquefação, as diferentes condições de reação, por exemplo, temperatura, enzimas presentes ou opcionalmente doseadas, tempo de reação de hidrólise e a concentração de matéria seca podem ser adaptados pelo versado na técnica a fim de conseguir uma conversão desejada de lignocelulose em açúcar. Algumas indicações são dadas a seguir.

[0046]Na etapa de sacarificação uma segunda composição de enzima é adicionada para formar açúcares oligoméricos e/ou monoméricos; e a segunda composição de enzima compreende uma celulase. A segunda composição compreende, preferencialmente, pelo menos, duas celobiohidrolases diferentes e, opcionalmente, uma beta-glicosidase e/ou GH61.

[0047] Em um aspecto da invenção, a sacarificação é realizada a uma temperatura de 50°C ou mais, 55°C ou mais, 60°C ou mais, 65°C ou mais, ou 70°C ou mais. A temperatura elevada durante a hidrólise tem muitas vantagens, as quais incluem trabalhar à temperatura ótima da composição de enzima, a redução de risco de contaminação (bacteriana), uma quantidade menor de água de arrefecimento necessária, a utilização de água de arrefecimento com uma temperatura mais elevada, reutilização das enzimas e muito mais.

[0048]Em um outro aspecto da invenção, a quantidade de segunda composição de enzima opcionalmente adicionada (aqui também chamada de dosagem de enzima ou carga de enzima) é baixa. Em uma forma de realização, a quantidade de enzima adicionada na etapa de sacarificação é de 6 mg de proteína/g de matéria seca em peso ou inferior, 5 mg de proteína/g de matéria seca ou inferior, 4 mg de proteína/g de matéria seca ou inferior, 3 mg de proteína/g de matéria seca ou inferior, 2 mg de proteína/g de matéria seca ou inferior ou 1 mg de proteína/g de matéria seca ou inferior (expresso como proteína em mg de proteína/g de matéria seca). Em uma forma de realização, a quantidade de enzima é de 0,5 mg de enzima/g de matéria seca em peso ou inferior, 0,4 mg de composição de enzima/g de matéria seca em peso ou inferior, 0,3 mg de enzima/g de matéria seca em peso ou inferior, 0,25 mg de enzima/g de matéria seca em peso ou inferior, 0,20 mg de enzima/g de matéria seca em peso ou inferior, 0,18 mg de enzima/g de matéria seca em peso ou inferior, 0,15 mg de enzima/g de matéria seca em peso ou inferior ou 0,10 mg de enzima/g de matéria seca em peso ou inferior (expresso como total de enzimas celulase em mg de enzima/g de matéria seca). A baixa dosagem de enzima é possível, uma vez que, devido à atividade e a estabilidade das enzimas, é possível aumentar o tempo de reação de sacarificação.

[0049] Em um outro aspecto da invenção, o tempo de reação de sacarificação na etapa de sacarificação é de 40 horas ou mais, 50 ou mais horas, 60 horas ou mais, 70 ou mais horas, 80 horas ou mais, 90 ou mais horas, 100 horas ou mais, 120 horas ou mais, 130 horas ou mais. Em um outro aspecto, o tempo de reação de hidrólise é 40-130 horas, 50120 horas, 60-120 horas, 60-110 horas, 60-100 horas, 70-100 horas, 70-90 horas ou 70-80 horas. Devido à estabilidade da composição de enzima, tempos de reação de hidrólise mais longos são possíveis com correspondentes rendimentos de açúcar mais elevados.

[0050] O pH durante a hidrólise, na etapa de sacarificação, pode ser escolhido pelo versado na técnica. Em um outro aspecto da invenção, o pH durante a hidrólise pode ser de 3,0 - 6,4. As enzimas estáveis da invenção podem ter um amplo intervalo de pH de até 2 unidades de pH, até 3 unidades de pH, até 5 unidades de pH. O pH ótimo pode estar dentro dos limites de pH 2,0 a 8,0; 3,0-8,0; 3,5-7,0; 3,5-6,0; 3,5-5,0; 3,5-4,5; 4,0-4,5 ou é de cerca de 4,2.

[0051]Em um outro aspecto da invenção, a etapa de sacarificação é realizada até 70% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 92% ou mais, 95% ou mais de açúcar disponível em material lignocelulósico ser liberado.

[0052] Significativamente um processo da invenção pode ser realizado utilizando níveis elevados de matéria seca (do material lignocelulósico) na etapa de sacarificação. Assim, a invenção pode ser realizada com um teor de matéria seca de 5% em peso ou superior, 8% em peso ou superior, 10% em peso ou superior, 11% em peso ou superior, 12% em peso ou superior, 13% em peso ou maior, 14% em peso ou superior, 15% em peso ou superior, 20% em peso ou superior, 25% em peso ou superior, 30% em peso ou superior, 35% em peso ou superior, ou 40% em peso ou superior, e, de preferência, menos do que 42% em peso. Em uma outra forma de realização, o teor de matéria seca na etapa de sacarificação é de 14% em peso, 15% em peso, 16% em peso, 17% em peso, 18% em peso, 19% em peso, 20% em peso, 21% em peso, 22% em peso, 23% em peso, 24% em peso, 25% em peso, 26% em peso, 27% em peso, 28% em peso, 29% em peso, 30% em peso, 31% em peso, 32% em peso, 33% em peso ou mais ou 14-33% em peso.

[0053]De preferência, o reator de sacarificação tem um volume de 1 m3 ou mais, preferencialmente de mais de 10 m3 e mais preferencialmente de 50 m3 ou mais. Em geral, o reator de sacarificação vai ser menor do que 3000 m3 ou 5000 m3.

A utilização de enzimas termoestáveis sob condições ideais de temperatura

[0054] Em uma forma de realização, a invenção refere-se à utilização de uma enzima termoestável, tal como enzima celulolítica de Talaromyces, em processos de liquefação e sacarificação separados (SLS) para a produção de açúcares redutores a partir da matéria-prima lignocelulósica pré- tratada, mas não se limitando a, produção de etanol. As enzimas celulolíticas de Talaromyces aplicadas sobre matéria-prima lignocelulósica pré-tratada mostrou taxas de conversão máximas a temperatura dentro do intervalo de 5070°C. A enzima permanece ativa nestas circunstâncias por 14 dias e mais sem a cessação completa da atividade.

[0055]Utilizando as condições ideais de temperatura, quantidade máxima de açúcares redutores pode ser liberada a partir da matéria-prima (hidrólise total) dentro do menor tempo de hidrólise possível. Desta forma, 100% de conversão de celulose em glicose é alcançado em menos de 5 dias em um processo SLS com uma dosagem de enzima de 0,175 mL (6 mg de proteína)/g de matéria seca de matéria-prima. Sob condições de SSF a 33°C, a conversão total da celulose na matéria- prima lignocelulósica durará, aproximadamente, 168 h e, concomitantemente, estas condições mesofílicas determinam o tempo de processo necessário para a produção de etanol máxima a partir da matéria-prima.

[0056]No caso, enzimas celulolíticas termoestáveis, tal como a partir de Talaromyces, são utilizadas em um processo SSF com microrganismos produtores de etanol termofílicos, tempos de fermentação serão mais curtos uma vez que enzimas celulolíticas de Talaromyces liberam os açúcares redutores mais rápido a temperaturas mais elevadas do que a temperaturas mesofílicas.

[0057]Na operação de SSF, a concentração do produto (g/L) é dependente da quantidade de glicose produzida, mas isto não é visível já que os açúcares são convertidos em produto em SSF, e concentrações de produto podem ser relacionadas com a concentração de glicose subjacente através da multiplicação pelo rendimento máximo teórico.

[0058] Rasamsonia é um novo gênero que compreende espécies Talaromyces e Geosmithia termotolerantes e termofílicas (J. Houbraken et al., vide supra). Com base em dados fenotípicos, fisiológicos e moleculares, Houbraken et al. propôs a transferência de espécies T. emersonii, T. byssochlamydoides, T. eburneus, G. argillacea e G. cylindrospora para o novo gênero de Rasamsonia. Talaromyces emersonii, Penicillium Geosmithia emersonii e Rasamsonia emersonii são aqui utilizados indiferentemente.

[0059] Em um aspecto da invenção, a segunda composição de enzima compreende uma celulase, preferencialmente, pelo menos, 2 celulases, mais preferencialmente duas celobiohidrolases diferentes e, opcionalmente, GH61. De preferência, pelo menos uma, mais preferencialmente pelo menos duas, ainda mais preferencialmente, pelo menos três das últimas três enzimas diferentes são termoestáveis.

[0060]Uma enzima "termoestável" significa que a enzima tem uma temperatura ótima de 60°C ou superior, por exemplo, 70°C ou superior, tal como 75°C ou superior, por exemplo, 80°C ou superior tal como 85°C ou superior. O versado pode selecionar polinucleotídeos adequados utilizando o conhecimento comum. Eles podem, por exemplo, ser isolados a partir de microrganismos termofílicos, ou podem ser concebidos pelo versado na técnica e sintetizados artificialmente. Em uma forma de realização, os polinucleotídeos podem ser isoladas a partir de fungos filamentosos termofílicos ou termotolerantes ou isolados a partir de fungos não termofílicos ou não-termotolerantes, mas são encontrados serem termostáveis.

[0061]Aqui, uma celulase é qualquer polipeptídeo que é capaz de degradar ou modificar celulose. Um polipeptídeo que é capaz de degradar a celulose é um que é capaz de catalisar o processo de decomposição de celulose em unidades menores, tanto parcialmente, por exemplo, em celodextrinas, quanto completamente em monômeros de glicose. Uma celulase, de acordo com a invenção, pode dar origem a uma população mista de celodextrinas e monômeros de glicose quando em contato com a celulase. Tal degradação irá, tipicamente, ocorrer por meio de uma reação de hidrólise.

[0062]As proteínas GH61 (glicosídeo hidrolase da família 61 ou, às vezes, referido como EGIV) são polissacarídeos monoxigenases dependentes de oxigênio (PMOs), de acordo com a literatura mais recente. Muitas vezes, na literatura, estas proteínas são mencionadas para reforçar a ação de celulases sobre substratos lignocelulósicos. GH61 foi originalmente classificada como endogluconase com base na medição de atividade de endo-1,4- β-d-glicanase muito fraca em um membro da família. O termo "GH61" tal como aqui utilizado, é para ser entendido como uma família de enzimas que compartilham porções e dobras de sequências conservadas comuns para serem classificadas na família 61 do sistema de classificação CAZY GH bem estabelecido (http://www.cazy.org/GH61.html). O glicosídeo hidrolase da família 61 é um membro da família de glicosídeo hidrolases EC 3.2.1. GH61 é aqui utilizado como sendo uma parte das celulases.

[0063]Aqui, uma hemicelulase é qualquer polipeptídeo que é capaz de degradar ou modificar hemicelulose. Isto quer dizer, uma hemicelulase pode ser capaz de degradar ou modificar um ou mais de xilano, glicuronoxilano, arabinoxilano, glicomanano e xiloglicano. Um polipeptídeo que é capaz de degradar uma hemicelulose é um que é capaz de catalisar o processo de quebrar a hemicelulose em pequenos polissacarídeos, tanto parcialmente, por exemplo em oligossacarídeos, quanto completamente em monômeros de açúcar, por exemplo, monômeros de açúcar hexose ou pentose. Uma hemicelulase de acordo com a invenção pode dar origem a uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar quando em contato com a hemicelulase. Tal degradação irá, tipicamente, ocorrer por meio de uma reação de hidrólise.

[0064]Aqui, uma pectinase é qualquer polipeptídeo que é capaz de degradar ou modificar pectina. Um polipeptídeo que é capaz de degradar a pectina é um que é capaz de catalisar o processo de quebrar a pectina em unidades menores, tanto parcialmente, por exemplo, em oligossacarídeos, quanto completamente em monômeros de açúcar. Uma pectinase, de acordo com a invenção, pode dar origem a uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar quando em contato com a pectinase. Tal degradação irá, tipicamente, ocorrer por meio de uma reação de hidrólise.

[0065]Aqui, uma celobiohidrolase (EC 3.2.1.91) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de ligações 1,4-β-D-glucosidicas em celulose ou celotetraose, liberando celobiose das extremidades das cadeias. Esta enzima pode também ser referida como uma celulase, 1,4-β-celobiosidase, 1,4-β-celobiohidrolase, 1,4- β-D-glicano-celobiohidrolase, avicelase, exo-1,4-β-D- glicanase, exocelobiohidrolase ou exoglicanase.

[0066]Aqui, uma endo-β-1,4-glicanase (EC 3.2.1.4) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a endohidrólise de ligações 1,4-β-D-glucosidicas em celulose, liquenina ou β-D-glicanos de cereais. Tal polipeptídeo pode também ser capaz de hidrolisar ligações 1,4 em β-D-glicanos contendo também ligações 1,3. Esta enzima pode também ser referida como celulase, avicelase, β-1,4-endoglicano hidrolase, β-1,4-glicanase, carboximetilcelulase, celudextrinase, endo-1,4-β-D-glicanase, endo-1,4-β-D- glicano-hidrolase, endo-1,4-β-glicanase ou endoglicanase.

[0067]Aqui, uma β-glicosidase (EC 3.2.1.21) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de β-D-glicose não redutores terminais com a liberação de β-D-glicose. Um tal polipeptídeo pode ter uma ampla especificidade para β-D-glicosideos e também pode hidrolisar um ou mais dos seguintes: umae-D-galactosídeo, um a-L-arabinosídeo, um β-D-xilosídeo ou um e-D-fucosídeo. Esta enzima pode também ser referida como amigdalase, β-D- glicosídeo glicohidrolase, celobiase ou gentobiase.

[0068]Aqui uma β-(1,3)(1,4)-glicanase (EC 3.2.1 0,73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de ligações 1,4-β-D-glucosidicas em β-D-glicanos contendo ligações 1,3 e 1,4. Um tal polipeptídeo pode atuar sobre liquenina e β-D-glicanos de cereais, mas não em β-D- glicanos contendo apenas ligações 1,3 ou 1,4. Esta enzima pode também ser referida como liqueninase, 1,3-1,4-β-D- glicano 4-glicanohidrolase, β-glicanase, endo-β-1,3-1,4- glicanase, liquenase ou ligações mistas de β-glicanase. Uma alternativa para este tipo de enzima é EC 3.2.1.6, que é descrito como endo-1,3(4)-beta-glicanase. Este tipo de enzima hidrolisa ligações 1,3 ou 1,4 em beta-D-glicanase quando o resíduo de glicose, cujo grupo de redução está envolvido na ligação a ser hidrolisada, é ele próprio substituído na posição C-3. Nomes alternativos incluem endo-1,3-beta-glicanase, laminarinase, 1,3-(1,3;1,4)-beta- D-glicano 3 (4) glicanohidrolase; substratos incluem laminarina, liquenina e beta-D-glicanas de cereais.

[0069]Uma hemicelulase pode ser utilizada no processo da invenção, por exemplo, uma endoxilanase, um β- xilosidase, uma α-L-arabionofuranosidase, uma α-D- glicuronidase, uma acetil-xilano esterase, uma feruloil esterase, uma cumaroil esterase, um α-galactosidase, uma β- galactosidase, uma β-mananase ou uma β-manosidase.

[0070]Aqui, uma endoxilanase (EC 3.2.1.8) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a endohidrólise de ligações 1,4-β-D-xilosidicas em xilanos. Esta enzima pode também ser referida como endo-1,4-β-xilanase ou 1,4-β-D- xilano xilanohidrolase. Uma alternativa é EC 3.2.1.136, uma glicuronoarabinoxilano endoxilanase, uma enzima que é capaz de hidrolisar ligações 1,4 xilosídicas em glicuronoarabinoxilanos.

[0071]Aqui, uma β-xilosidase (EC 3.2.1.37) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de 1,4-β- D-xilanos para remover resíduos de D-xilose sucessivos a partir dos terminais não redutores. Estas enzimas também podem hidrolisar xilobioses. Esta enzima pode também ser referida como xilano 1,4-β-xilosidase, 1,4-β-D-xilano xilohidrolase, exo-1,4-β-xilosidase ou xilobiase.

[0072]Aqui, uma α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que é capaz de atuar sobre α-L- arabinofuranosides, α-L-arabinanos contendo ligações (1,2) e/ou (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. Esta enzima também pode ser referida como α-N- arabinofuranosidase, arabinofuranosidase ou arabinosidase.

[0073]Aqui, uma α-D-glicuronidase (EC 3.2.1.139) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação da seguinte forma: alfa-D-glicuronosídeo + H(2)O = um álcool + D-glicuronato. Esta enzima pode também ser referida como alfa-glicuronidase ou alfa-glicosiduronase. Estas enzimas também podem hidrolisar ácido glicorônico 4- O-metilado, que também pode estar presente como um substituinte em xilanos. Alternativa é EC 3.2.1.131: xilano alfa-1,2-glicuronosidase, que catalisa a hidrólise de ligações alfa-1,2-(4-O-metil) glicoronosil.

[0074]Aqui, uma acetil xilano esterase (EC 3.1.1.72) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a desacetilação de xilanos e xilo-oligossacarídeos. Um tal polipeptídeo pode catalisar a hidrólise de grupos acetil a partir de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, acetato de alfa-naftila ou acetato de p- nitrofenila, mas, normalmente, não a partir de triacetilglicerol. Tal polipeptídeo, normalmente, não atua em manana ou pectina acetilada.

[0075]Aqui, uma feruloil esterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação na forma: feruloil-sacarídeo + H(2)O = ferulato + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Pode-se, tipicamente, catalisar a hidrólise do grupo 4-hidroxi-3-metoxicinamoil (feruloil) a partir de um açúcar esterificado, que é, geralmente, de arabinose em substratos "naturais". Acetato de p-nitrofenol e metil ferulato são, tipicamente, substratos pobres. Esta enzima pode também ser referida como hidrolase de ésteres de cinamoíla, esterase de ácido ferúlico ou esterase de hidroxicinamoil. Ela pode também ser referida como uma enzima acessória de hemicelulase, uma vez que ela pode ajudar xilanases e pectinases a quebrar a parede celular vegetal de hemicelulose e pectina.

[0076]Aqui, uma cumaroil esterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação da forma: cumaroil-sacarídeo + H(2)O = cumarato + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Esta enzima pode também ser referida como trans-4-cumaroil esterase, trans- p-cumaroil esterase, p-cumaroil esterase ou esterase de ácido p-cumárico. Esta enzima também é abrangida por EC 3.1.1.73, então pode também ser referida como uma feruloil esterase.

[0077]Aqui, uma α-galactosidase (EC 3.2.1.22) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de α-D-galactose não redutores terminais em α- D-galactosídeos, incluindo oligossacarídeos de galactose, galactomananas, galactanas e arabinogalactanas. Tal polipeptídeo pode também ser capaz de hidrolisar α-D- fucosídeos. Esta enzima pode também ser referida como melibiase.

[0078]Aqui, uma β-galactosidase (EC 3.2.1.23) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de β-D-galactose não redutores terminais em β- D-galactosídeos. Tal polipeptídeo pode também ser capaz de hidrolisar α-L-arabinosideos. Esta enzima pode também ser referida como exo-(1->4)-β-D-galactanase ou lactase.

[0079]Aqui, uma β-mananase (EC 3.2.1.78) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise aleatória das ligações 1,4-β-D-mannosidicas em mananas, galactomananas e glicomananas. Esta enzima pode também ser referida como manana endo-1,4-3-manosidase ou endo-1,4- mananase.

[0080]Aqui, uma β-manosidase (EC 3.2.1.25) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de β-D-manose não redutores terminais em β-D- manosídeos. Esta enzima pode também ser referida como mananase ou manase.

[0081]Uma composição de enzima pode compreender qualquer pectinase, por exemplo, uma endo- poligalacturonase, uma pectina metil esterase, uma endo- galactanase, uma beta-galactosidase, uma pectina acetil esterase, uma endo-pectina liase, liase de pectato, alfa- ramnosidase, uma exo-galacturonase, uma liase expoligalacturonato, uma hidrolase de ramnogalacturonano, uma liase de ramnogalacturonano, uma ramnogalacturonano acetil esterase, uma ramnogalacturonano galacturonohidrolase, um xilogalacturonase.

[0082]Aqui, uma endo-poligalacturonase (EC 3.2.1.15) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise aleatória das ligações 1,4-a-D-galactosidurônicas em pectato e outros galacturonanos. Esta enzima pode também ser referida como pectina despolimerase poligalacturonase, pectinase, endopoligalacturonase, pectolase, pectina hidrolase, pectina poligalacturonase, poli-α-1,4- galacturonídeo glicanohidrolase, endogalacturonase; endo-D- galacturonase ou poli (1,4-a-D-galacturonídeo) glicanohidrolase.

[0083]Aqui, uma pectina metil esterase (EC 3.1.1.11) é qualquer enzima que é capaz de catalisar a reação: pectina + n H2O = n metanol + pectato. A enzima pode também ser conhecida como pectinesterase, pectina demetoxilase, pectina metoxilase, pectina metilesterase, pectase, pectinoesterase ou pectina pectilhidrolase.

[0084]Aqui, uma endo-galactanase (EC 3.2.1.89) é qualquer enzima capaz de catalisar a endohidrólise de ligações 1,4-e-D-galactosídicas em arabinogalactanas. A enzima pode também ser conhecida como arabinogalactano endo-1,4-β-galactosidase, endo-1,4-β-galactanase, galactanase, arabinogalactanase ou arabinogalactano 4-beta- D-galactanohidrolase.

[0085]Aqui, uma pectina acetil esterase é aqui definida como qualquer enzima que tem uma atividade acetil esterase que catalisa a desacetilação dos grupos acetil para os grupos hidroxila dos resíduos GaIUa de pectina.

[0086]Aqui, uma endo-pectina liase (EC 4.2.2.10) é qualquer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminatória de éster metílico de (1^4)-α-D-galacturonano para se obter oligossacarídeos com grupos 4-desoxi-6-O-metil-α-D-galact- 4-enuronosil nas suas extremidades não redutoras. A enzima pode também ser conhecida como pectina liase, pectina trans-eliminase; endo-pectina liase, transeliminase polimetilgalacturônica, pectina metiltranseliminase, pectoliase, PL, PNL ou PMGL ou (1^4)-6-O-metil-α-D- galacturonano liase.

[0087]Aqui, uma liase de pectato (EC 4.2.2.2) é qualquer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminatória de (1 ■4)-α-D-galacturonano para dar oligossacarídeos com grupos 4-desoxi-α-D-galact-4-enuronosil nas suas extremidades não redutoras. A enzima pode também ser conhecida como transeliminase poligalacturônica, transeliminase de ácido péctico, poligalacturonato liase, endopectina metiltranseliminase, transeliminase de pectato, endogalacturonate transeliminase, liase de ácido péctico, liase péctica, liase de ácido α-1,4-D- endopoligalacturônico, PGA liase, PPase-N, liase de ácido endo-a-1,4- poligalacturônico, liase de ácido poligalacturônico, pectina trans-eliminase, ácido poligalacturônico trans-eliminase ou (1^4)-α-D- galacturonano liase.

[0088]Aqui, uma alfa ramnosidase (EC 3.2.1.40) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de α-L-ramnose não redutores terminais em α-L- ramnosídeos ou, alternativamente, em ramnogalacturonanos. Esta enzima também pode ser conhecida como α-L-ramnosidase T, α-L-ramnosidase N ou α-L-ramnosideo ramnohidrolase.

[0089]Aqui, exo-galacturonase (EC 3.2.1.82) é qualquer polipeptídeo capaz de hidrólise de ácido péctico a partir da extremidade não redutora, liberando digalacturonate. A enzima pode também ser conhecida como exo-poli-α- galacturonosidase, exopoligalacturonosidase ou exopoligalacturanosidase.

[0090]Aqui, exo-galacturonase (EC 3.2.1.67) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar: (1,4-α-D-galacturonideo)n + + H2O = (1,4-a-D-galacturonídeo) + D-galacturonato. A enzima pode também ser conhecida como galacturano 1,4-α- galacturonidase, exopoligalacturonase, poli(galacturonato) hidrolase, exo-D-galacturonase, exo-D-galacturonanase, exopoli-D-galacturonase ou poli(1,4-α-D-galacturonato) galacturonohidrolase.

[0091]Aqui, exopoligalacturonato liase (EC 4.2.2.9) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar a clivagem eliminatória de 4-(4-desoxi-α-D-galact-4-enuronosil)-D- galacturonato da extremidade redutora de pectato, isto é, a pectina desesterificada. Esta enzima pode ser conhecida como pectato dissacarídeo-liase, pectato exo-liase, ácido exopéctico transeliminase, exopectato liase, ácido exopoligalacturônico transeliminase, PATE, exo-PATE, exo- PGL ou (1^4)-α-D-galacturonano redutor-terminal- dissacarídeo-liase.

[0092]Aqui, ramnogalacturonano hidrolase é qualquer polipeptídeo que é capaz de hidrolisar a ligação entre o ácido galactosilurônico e ramnopiranosila em uma endo-forma em estruturas de ramnogalacturonano estritamente alternadas, que consiste no dissacarídeo [ácido (1,2-alfa- L-ramnoil-(1,4)-alfa-galactosilurônico].

[0093]Aqui, ramnogalacturonano liase é qualquer polipeptídeo que é qualquer polipeptídeo que é capaz de clivar ligações α-L-Rhap-(1^4)-α-D-GalpA em uma endo-forma em ramnogalacturonano por beta-eliminação.

[0094]Aqui, ramnogalacturonano acetil esterase é qualquer polipeptídeo que catalisa a desacetilação do esqueleto de resíduos de ácido galacturônico e ramnose alternados em ramnogalacturonano.

[0095]Aqui, galacturonohidrolase ramnogalacturonano é qualquer polipeptídeo que é capaz de hidrolisar o ácido galacturônico da extremidade não redutora das estruturas de ramnogalacturonano estritamente alternadas em uma exoforma.

[0096]Aqui, xilogalacturonase é qualquer polipeptídeo que atua sobre xilogalacturonano por clivagem do esqueleto do ácido galacturônico β-xilose substituído em uma endoforma. Esta enzima pode também ser conhecida como xilogalacturonano hidrolase.

[0097]Aqui, uma α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que é capaz de atuar sobre α-L- arabinofuranosídeos, α-L-arabinanos contendo ligações (1,2) e/ou (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. Esta enzima pode também ser referida como α-N- arabinofuranosidase, arabinofuranosidase ou arabinosidase.

[0098]Aqui, endo-arabinanase (EC 3.2.1.99) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a endohidrólise de ligações 1,5-a-arabinofuranosídicas em 1,5-arabinanos. A enzima também pode ser conhecida como endo-arabinase, arabinano endo-1,5-α-L-arabinosidase, endo-1,5-α-L- arabinanase, endo-α-1,5-arabanase; endo-arabanase ou 1,5-α- L-arabinano 1,5-α-L-arabinanohidrolase.

[0099]Uma composição de enzima pode compreender, pelo menos, uma celulase e, opcionalmente, pelo menos, uma hemicelulase e, opcionalmente, pelo menos, uma pectinase (uma das quais é um polipeptídeo de acordo com a invenção). Uma segunda composição pode compreender uma enzima GH61, uma celobiohidrolase, uma endoglicanase e/ou um β- glicosidase. Tal composição pode também compreender uma ou mais hemicelulases e/ou um ou mais pectinases.

[00100] Além disso, uma ou mais (por exemplo, dois, três, quatro ou todas) de uma amilase, uma protease, uma lipase, uma ligninase, um hexosiltransferase, uma glicuronidase ou uma expansina ou uma proteína induzida por celulose ou uma proteína de integração de celulose ou tipo proteína pode ser utilizada no processo da invenção (estas referidas como atividades auxiliares acima).

[00101] "Protease" inclui enzimas que hidrolisam ligações peptídicas (peptidases), bem como enzimas que hidrolisam ligações entre peptídeos e outras porções, tal como açúcares (glicopeptidases). Muitas proteases são caracterizadas sob EC 3.4, e são adequadas para utilização na invenção incorporadas aqui por referência. Alguns tipos específicos de proteases incluem, proteases de cisteína, incluindo proteases de pepsina, papaína e serina, incluindo quimotripsinas, carboxipeptidases e metaloendopeptidases.

[00102] "Lipase" inclui enzimas que hidrolisam lipídios, ácidos graxos e acilglicerídeos, incluindo fosfoglicerídeos, lipoproteínas, diacilgliceróis e semelhantes. Em plantas, os lipídios são utilizados como componentes estruturais para limitar a perda de água e infecção patogênica. Estes lipídios incluem ceras derivadas a partir de ácidos graxos, bem como cutina e suberina.

[00103] "Ligninase" inclui enzimas que hidrolisam ou podem quebrar a estrutura de polímeros de lignina. As enzimas que podem quebrar a lignina incluem peroxidases de lignina, peroxidases de manganês, lacases e feruloil esterases, e outras enzimas descritas na técnica conhecida para despolimerizar ou, de outro modo, quebrar polímeros de lignina. Também estão incluídas as enzimas capazes de hidrolisar ligações formadas entre açúcares hemicelulósicos (nomeadamente arabinose) e lignina. Ligninases incluem, mas não estão limitadas ao seguinte grupo de enzimas: peroxidases de lignina (EC 1.11.1.14), peroxidases de manganês (EC 1.11.1.13), lacases (EC 1.10.3.2) e feruloil esterases (EC 3.1.1.73).

[00104] "Hexosiltransferase" (2.4.1-) inclui enzimas que são capazes de catalisar uma reação de transferase, mas que também podem catalisar uma reação de hidrólise, por exemplo celulose e/ou produtos de degradação de celulose. Um exemplo de uma hexosiltransferase que pode ser utilizada na invenção é uma β-glicanosiltransferase. Uma tal enzima pode ser capaz de catalisar a degradação de (1,3)(1,4)glicano e/ou celulose e/ou um produto de degradação de celulose.

[00105] "Glicuronidase" inclui enzimas que catalisam a hidrólise de um glicuronídeo, por exemplo, β-glicuronideo para se obter um álcool. Muitas glicuronidases foram caracterizadas e podem ser adequadas para utilização na presente invenção, por exemplo, β-glicuronidase (EC 3.2.1.31), hialurono-glicuronidase (EC 3.2.1.36), glicuronosil-disulfoglucosamina glicuronidase (3.2.1.56), glicirrizinato β-glicuronidase (3.2.1.128) ou α-D- glicuronidase (EC 3.2.1.139).

[00106] Uma composição para utilização na invenção pode compreender uma expansina ou proteína semelhante a expansina, tal como uma swolenina (ver Salheimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 4202-4211, 2002) ou uma proteína semelhante a swolenina.

[00107] As expansinas estão implicadas no afrouxamento da estrutura da parede celular vegetal durante o crescimento celular. As expansinas foram propostas para interromper ligações de hidrogênio entre a celulose e outros polissacarídeos da parede celular sem ter atividade hidrolítica. Desta forma, eles são pensados permitir o deslizamento de fibras de celulose e alargamento da parede celular. Swolenina, uma proteína semelhante a expansina contém um domínio de Módulo de Ligação a carboidrato N- terminal da Família 1 (CBD) e um domínio semelhante a expansina C-terminal. Para os fins da presente invenção, uma proteína semelhante a expansina ou proteína semelhante a swolenina pode compreender um ou ambos os referidos domínios e/ou pode perturbar a estrutura das paredes celulares (tal como perturbação da estrutura de celulose), opcionalmente, sem a produção de quantidades detectáveis de açúcares redutores.

[00108] No processo da invenção, um membro de cada uma das classes de enzimas acima referidas, vários membros de uma classe de enzimas, ou qualquer combinação destas classes de enzimas ou proteínas auxiliares (isto é, as proteínas aqui mencionadas que não têm atividade enzimática por si só, mas, no entanto, contribuem para a degradação lignocelulósica) podem ser utilizadas.

[00109] No processo da invenção as enzimas podem ser utilizadas a partir de (1) fornecedores comerciais; (2) genes clonados que expressam enzimas; (3) caldo complexo (tal como aquele resultante do crescimento de uma estirpe microbiana em meios, em que as estirpes segregam proteínas e enzimas para o meio; (4) lisados de células de estirpes cultivadas como em (3); e/ou (5) material de plantas que expressam as enzimas. Diferentes enzimas em uma composição da presente invenção podem ser obtidas a partir de diferentes fontes.

[00110] As enzimas podem ser produzidas tanto exogenamente em microrganismos, leveduras, fungos, bactérias quanto plantas, em seguida, isoladas e adicionadas, por exemplo, a matéria-prima lignocelulósica. Alternativamente, as enzimas são produzidas, mas não isoladas, e caldo de fermentação de massa celular bruto, ou material de planta (tal como palha de milho ou de palha de trigo), e outros semelhantes podem ser adicionados a, por exemplo, matéria-prima. Alternativamente, a massa celular em bruto ou meio de produção enzimático ou material de planta pode ser tratado para impedir o crescimento microbiano (por exemplo, por aquecimento ou adição de agentes antimicrobianos), em seguida, adicionado a, por exemplo, uma matéria-prima. Essas misturas de enzimas em bruto podem incluir o organismo de produção da enzima. Alternativamente, a enzima pode ser produzida em uma fermentação que utiliza matéria-prima (pré-tratada) (tal como, palha de milho, palha de trigo) para proporcionar nutrição a um organismo que produz uma (s) enzima (s). Deste modo, as plantas que produzem as enzimas podem elas próprias servir como uma matéria-prima lignocelulósica e serem adicionadas em matéria-prima lignocelulósica.

Fermentação

[00111] O processo de acordo com a invenção pode ainda compreender uma etapa de fermentação. Em um outro aspecto, a invenção inclui, opcionalmente, um processo de fermentação em que um microrganismo é utilizado para a fermentação de uma fonte de carbono que compreende açúcar (es), por exemplo, glicose, L-arabinose e/ou xilose. A fonte de carbono pode incluir qualquer carboidrato oligoou polímero que compreende unidades de L-arabinose, xilose ou glicose, como por exemplo, lignocelulose, xilanos, celulose, amido, arabinano e outros semelhantes. Para liberação de unidades de xilose ou glicose de tais carboidratos, carboidrases apropriadas (tais como xilanases, glicanases, amilases e semelhantes) podem ser adicionadas ao meio de fermentação ou podem ser produzidas pela célula hospedeira modificada. Neste último caso, a célula hospedeira pode ser modificada por engenharia genética para produzir e excretar tais carboidrases. Uma vantagem adicional da utilização de fontes de glicose oligo- ou poliméricas é que elas permitem manter uma baixa concentração de glicose livre durante a fermentação, por exemplo, utilizando quantidades limitantes de velocidade das carboidrases. Este, por sua vez, irá impedir a repressão dos sistemas necessários para o metabolismo e o transporte de açúcares não-glicose, tal como xilose. Em um processo preferido, a célula hospedeira modificada fermenta tanto a L-arabinose (opcionalmente xilose) quanto a glicose, de preferência simultaneamente, caso em que, de preferência, uma célula hospedeira modificada é utilizada que é insensível à repressão de glicose para prevenir o crescimento diauxico. Além de uma fonte de L-arabinose, opcionalmente, xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação irá ainda compreender o ingrediente apropriado necessário para o crescimento da célula hospedeira modificada. As composições de meios de fermentação para o crescimento de microrganismos, tal como leveduras ou fungos filamentosos, são bem conhecidas na arte.

[00112] O tempo de fermentação pode ser mais curto do que em fermentação convencional nas mesmas condições, em que parte da hidrólise enzimática tem ainda que participar durante a fermentação. Em uma forma de realização, o tempo de fermentação é de 100 horas ou menos, 90 horas ou menos, 80 horas ou menos, 70 horas ou menos, ou 60 horas ou menos, para uma composição de açúcar de 50 g/L de glicose e outros açúcares correspondentes a partir da matéria-prima lignocelulósica (por exemplo, 50 g/L de xilose, 35 g/L de L-arabinose e 10 g/L de galactose). Para composições de açúcar mais diluídas o tempo de fermentação pode ser correspondentemente reduzido.

[00113] O processo de fermentação pode ser um de um processo de fermentação anaeróbio ou aeróbio. Um processo de fermentação anaeróbio é aqui definido como um processo de fermentação de execução na ausência de oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é consumido, de preferência menos do que 5, 2,5 ou 1 mmol/L/h, mais preferencialmente, 0 mmol/L/h é consumido (isto é, o consumo de oxigênio não é detectável), e em que as moléculas orgânicas servem tanto como doadores de elétrons como aceitadores de elétrons. Na ausência de oxigênio, o NADH produzido na formação de glicólise e biomassa não pode ser oxidado por fosforilação oxidativa. Para resolver este problema muitos microrganismos utilizam piruvato ou um de seus derivados, como um aceitador de elétron e hidrogênio regenerando assim NAD+. Assim, em um processo de fermentação anaeróbio preferido, piruvato é utilizado como um aceitador de elétron (e hidrogênio) e é reduzido a produtos de fermentação, tal como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, metano ou biogás, um antibiótico β- lactâmico e uma cefalosporina. Em uma forma de realização preferida, o processo de fermentação é anaeróbio. Um processo anaeróbio é vantajoso uma vez que é mais barato do que processos aeróbios: menos equipamento especial é necessário. Além disso, processos anaeróbios são esperados se obter um maior rendimento de produto do que processos aeróbios. Em condições aeróbicas, o rendimento de biomassa é, geralmente, maior do que sob condições anaeróbias. Como uma consequência, em geral, sob condições aeróbicas, o rendimento esperado do produto é menor do que sob condições anaeróbias.

[00114] Em uma outra forma de realização, o processo de fermentação é sob condições limitadas de oxigênio. Mais preferencialmente, o processo de fermentação é aeróbio e sob condições limitadas de oxigênio. Um processo de fermentação limito em oxigênio é um processo em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo de gás existente, bem como as propriedades de mistura/transferência de massa reais do equipamento de fermentação utilizado. De um modo preferido, em um processo sob condições limitadas de oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é pelo menos 5,5, mais preferencialmente pelo menos 6, e ainda mais preferencialmente pelo menos 7 mmol/L/h.

[00115] O processo de fermentação é, de preferência, efetuado a uma temperatura que é ótima para a célula modificada. Assim, para a maioria das leveduras ou células de fungos, o processo de fermentação é realizado a uma temperatura que é inferior a 42°C, de preferência inferior a 38°C. Para células hospedeiras de levedura ou fungos filamentosos, o processo de fermentação é, preferencialmente, realizado a uma temperatura que é inferior a 35, 33, 30 ou 28°C e a uma temperatura que é superior a 20, 22, ou 25°C.

[00116] Em uma forma de realização da invenção, a fermentação é realizada com um microrganismo que é capaz de fermentar, pelo menos, um açúcar C5. Em uma forma de realização o processo é um processo para a produção de etanol por meio de que o processo compreende a etapa d) compreende a fermentação de um meio contendo açúcar (es) com um microrganismo que é capaz de fermentar, pelo menos, um açúcar C5, em que a célula hospedeira é capaz de fermentar glicose, L-arabinose e xilose a etanol. Em uma forma de realização, o mesmo microrganismo que é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C5 é uma levedura. Em uma forma de realização, a levedura pertence ao gênero Saccharomyces, de preferência da espécie Saccharomyces cerevisiae.

[00117] Em uma forma de realização, o processo de fermentação para a produção de etanol é anaeróbio. Anaeróbico já foi definido anteriormente no presente documento. Em uma outra forma de realização preferida, o processo de fermentação para a produção de etanol é aeróbio. Em uma outra forma de realização preferida, o processo de fermentação para a produção de etanol é sob condições limitadas de oxigênio, mais preferencialmente, sob aeróbia e sob condições limitadas de oxigênio. Condições limitadas de oxigênio já foi definido aqui anteriormente.

[00118] Em tal processo, a produtividade volumétrica de etanol é, preferencialmente, de pelo menos 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 ou 10,0 g de etanol por litro por hora. O rendimento de etanol em L-arabinose e, opcionalmente, xilose e/ou glicose no processo é, de preferência, pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 98%. O rendimento de etanol é aqui definido como um percentual do rendimento teórico máximo, que, para a glicose e, opcionalmente, a L-arabinose e xilose é 0,51 g de etanol por g de glicose ou xilose.

[00119] Em um aspecto, o processo de fermentação opcional que conduz à produção de etanol tem várias vantagens em comparação com os processos de fermentação de etanol conhecidos: - processos anaeróbios são possíveis; - condições limitadas de oxigênio também são possíveis; - rendimento de etanol e taxas de produção de etanol mais elevados podem ser obtidos; - a estirpe utilizada pode ser capaz de utilizar L- arabinose e, opcionalmente, xilose.

[00120] Como alternativa aos processos de fermentação descritos acima, podem ser utilizadas, pelo menos, duas células distintas, isto significa que este processo é um processo de co-fermentação. Todas as formas de realização preferidas dos processos de fermentação, tal como descrito acima, também são preferidas formas de realização do presente processo de co-fermentação: identidade do produto de fermentação, identidade da fonte de L-arabinose e fonte de xilose, condições de fermentação (condições aeróbicas ou anaeróbicas, condições de oxigênio limitado, a temperatura à qual o processo será realizado, produtividade de etanol, rendimento de etanol).

[00121] O processo de fermentação pode ser realizado sem qualquer necessidade de ajustar o pH durante o processo. Isto quer dizer, o processo é um que pode ser realizado sem a adição de qualquer ácido (s) ou base (s). No entanto, isto exclui uma etapa de pré-tratamento, em que pode ser adicionado ácido. A questão é que a composição da invenção é capaz de atuar a pH baixo e, portanto, não há necessidade de ajustar o pH de ácido de uma matéria-prima pré-tratada ácida, a fim de que a sacarificação possa ocorrer. Deste modo, um método da invenção pode ser um método de zero resíduos utilizando apenas os produtos orgânicos sem qualquer requisito para a entrada de produtos químicos inorgânicos.

Tempo total de reação

[00122] De acordo com a invenção, o tempo total de reação (isto é, o tempo de reação da etapa de liquefação e hidrólise, e opcionalmente a etapa de fermentação em conjunto), pode ser reduzido. Em uma forma de realização, o tempo de reação total é de 150 horas ou menos, 140 horas ou menos, 130 ou menos, 120 horas ou menos, 110 horas ou menos, 100 horas de menos, 90 horas ou menos, 80 horas ou menos, 75 horas ou menos, ou cerca de 72 horas a 90% de rendimento de glicose. Correspondentemente, os tempos totais inferiores podem ser alcançados em rendimentos de glicose mais baixos. Isto é independente do modo em que os processos são realizados no modo SLH.

Produtos de fermentação

[00123] Produtos de fermentação que podem ser produzidos de acordo com a presente invenção incluem aminoácidos, vitaminas, produtos farmacêuticos, suplementos para alimentação animal, produtos químicos especiais, matérias-primas de produtos químicos, plásticos, combustíveis, solventes, tais como metano ou biogás e etanol, ou outros polímeros orgânicos, ácido láctico, incluindo etanol (o termo "álcool" sendo entendido como incluindo álcool etílico ou misturas de álcool etílico e água).

[00124] Produtos de valor acrescentado específicos que podem ser produzidos pelos métodos da invenção incluem, mas não se limitando a, biocombustíveis (incluindo etanol e butanol); ácido lático; ácido 3-hidroxi-propiônico; ácido acrílico; ácido acético; 1,3-propano-diol; etileno; glicerol; um plástico; uma especialidade química; um ácido orgânico, incluindo ácido cítrico, ácido succínico e ácido maleico; um solvente; um suplemento alimentar animal; um agente farmacêutico tal como um antibiótico β-lactama ou uma cefalosporina; uma vitamina; um aminoácido, tal como lisina, metionina, triptofano, treonina, e ácido aspártico; uma enzima, tal como uma protease, uma celulase, uma amilase, uma glicanase, uma lactase, uma lipase, uma liase, uma oxidorredutase, uma transferase ou uma xilanase; uma matéria-prima de produto químico; ou um suplemento de alimentação animal.

Separação do produto de fermentação

[00125] O processo de acordo com a invenção compreende, opcionalmente, a recuperação do produto de fermentação. Um produto de fermentação pode ser separado a partir do caldo de fermentação de qualquer maneira conhecida. Para cada produto da fermentação, o versado na técnica irá, assim, ser capaz de selecionar uma técnica de separação adequada. Por exemplo, o etanol pode ser separado a partir de um caldo de fermentação de levedura por meio de destilação, por exemplo destilação a vapor/destilação a vácuo de maneira convencional.

[00126] Certas formas de realização da invenção serão a seguir descritas em mais detalhe, mas não são de modo algum limitativas do âmbito da presente invenção. Reciclagem de enzima após hidrólise com enzimas estáveis

[00127] No final da hidrólise, as atividades de enzima parecem ser baixas uma vez que pequenos açúcares redutores são liberados quando a quase totalidade de celulose é convertida. A quantidade de atividade enzimática presente, no entanto, diminuiu apenas um pouco, assumindo- se principalmente devido à absorção das enzimas ao substrato. Através da aplicação de separação sólido- líquido, depois da hidrólise, tal como centrifugação, filtração, “sedicantation”, etc., 60% ou mais, por exemplo, 70% da atividade da enzima em solução pode ser recuperada e reutilizada para a liquefação ou hidrólise de uma nova matéria-prima lignocelulósica pré-tratada durante a hidrólise seguinte.

[00128] Além disso, após a separação sólido-líquido a enzima em solução pode ser separada da solução contendo açúcares redutores e outros produtos de hidrólise das ações enzimáticas. Esta separação pode ser realizada por, mas não se limitando a (micro e ultra-) filtração, centrifugação, “sedicantation”, sedimentação, com ou sem primeira adsorção da enzima a um transportador de qualquer tipo.

[00129] Por exemplo, após hidrólise da matéria-prima pré-tratada com 0,175 mL/g de carga de enzima de matéria seca de matéria-prima por 20 horas, 50% do valor teórico máximo de açúcares redutores é liberado e após a mesma hidrólise durante 72 h, 90% do valor máximo teórico de açúcares redutores é liberado. Por centrifugação e ultrafiltração, 60-70% da atividade da enzima foi recuperada na fração retida, enquanto que o filtrado continha mais de 80% dos açúcares redutores liberados. Ao reutilizar o retentado, quer como está ou após a purificação adicional e/ou a concentração, a dosagem de enzima durante a próximo etapa de hidrólise pode ser reduzida a 60-70%. A redução de custos obtida por utilização de enzimas celulolíticas estáveis, como de Talaromyces, desta forma, resulta na exigência de menos enzima.

Reciclagem de enzima após liquefação com enzimas estáveis

[00130] No final da liquefação, as enzimas utilizadas na liquefação podem ser recicladas de uma maneira semelhante à descrita anteriormente para a reciclagem após hidrólise (liquefação e sacarificação).

Reciclagem de enzima após hidrólise em combinação com produção de enzima e reciclagem de células de levedura com enzimas estáveis

[00131] O processo incluindo a reciclagem de enzima após a hidrólise, tal como descrito acima, pode ser combinado com a reciclagem de microrganismo produtor de etanol após a fermentação e com a utilização de açúcares redutores contendo filtrado como um substrato (purificado e/ou concentrado ou diluído) em fermentação de produção de enzima e como substrato para o cultivo do microrganismo de produção de etanol.

Reciclagem de enzima após destilação sob vácuo com enzimas estáveis

[00132] A estabilidade térmica de enzimas, como aquelas de Talaromyces, provoca atividade celulolítica remanescente após hidrólise, fermentação e destilação a vácuo no resíduo fino. A atividade total da enzima é reduzida durante as três etapas sucessivas do processo com 10-15 unidades de substrato por g de matéria-prima de matéria seca, independentemente da dosagem inicial da enzima. O resíduo fino obtido após destilação sob vácuo, portanto, pode ser reutilizado como uma fonte de enzima para um novo ciclo de processo iniciado de hidrólise- fermentação-destilação de conversão de palha de trigo pré- tratada em etanol. O resíduo fino pode ser utilizado tanto na forma concentrada quanto (não) diluída e/ou purificada e com ou sem suplementação enzimática adicional. O resíduo fino, opcionalmente purificado, pode ser reutilizado para a liquefação ou hidrólise de material celulósico.

[00133] A invenção é ainda descrita pelos exemplos seguintes, os quais não devem ser interpretados como limitativos do âmbito da invenção.

EXEMPLOS Materiais e Métodos Determinação da viscosidade

[00134] A medição RVA (Rapid Visco Analyser - Analisador de Viscosidade Rápida) foi realizada utilizando o analisador de viscosidade rápida Newport RVA-4 equipado com uma pá de plástico (ver: D.L. Goode et al., Journal of the Institute of Brewing, Vol 111, No 2, 2005) .

Enzimas

[00135] A composição de celulase TEC-210 foi fermentada de acordo com os procedimentos de inoculação e fermentação descritos em WO2011/000949.

[00136] A estirpe Rasamsonia (Talaromyces) emersonii foi depositada na CENTRAAL BUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES, Uppsalalaan 8, PO Box 85167, NL-3508 AD Utrecht, Países Baixos em dezembro de 1964 com o número de acesso CBS 393,64. Outras estirpes adequadas podem ser igualmente utilizadas nos presentes exemplos para mostrar o efeito e vantagens da invenção. Por exemplo TEC-101, TEC-147, TEC- 192, TEC-201 ou TCE-210 são estirpes de Rasamsonia adequadas que estão descritas em WO2011/000949.

[00137] Endoglicanase (EG) é produzida por sobre- expressão de EBA8 em Aspergillus niger como descrito em WO2011/098577 seguida por fermentação de Aspergillus niger transformante. EBA8 é umq Rasamsonia emersonii (Talaromyces emersonii) endoglicanase e é identificadq em WO2011/098577 como T. emersonii beta-glicanase CEA (EG) e representada por SEQ ID NO: 3 em WO2011/098577.

Preparação de substrato palha de milho pré-tratada ácida

[00138] Palha de milho pré-tratada de ácido diluído (ACS) foi obtida como descrito em Schell, D.J., Applied Biochemistry and Biotechnology (2003), vol. 105-108, páginas 69-85. Um reator de pré-tratamento à escala piloto foi utilizado operando em condições de estado estacionário de 190°C, tempo de residência de 1 min e concentração de ácido H2SO4 efetiva de 1,45% (p/p) na fase líquida.

Exemplo 1 O efeito da endoglicanase durante a hidrólise da matéria- prima de lignocelulose

[00139] O efeito de endoglicanase durante a hidrólise da matéria-prima de lignocelulose é descrito de acordo com os procedimentos descritos abaixo. As reações de hidrólise foram realizadas com matéria-prima pré-tratada de palha de milho ácida (ACS). O pH da matéria-prima foi ajustado para pH 4,5 com uma solução de NaOH 4M. A reação de hidrólise foi realizada em duas fases: 1. Uma etapa de liquefação operada em um modo semi contínuo. 2. Uma etapa de sacarificação operada em modo descontínuo.

[00140] A liquefação foi conduzida como se segue: em um reator de liquefação foi preenchido com 1 kg de matéria- prima pré-tratada de palha de milho 10% (p/p). O reator foi operado sob agitação constante, controle de pH (pH 4,5, NaOH 4N) e 62°C. Diretamente após o enchimento, a enzima foi dosada (ver Tabela 1) para iniciar a reação de hidrólise. Em seguida, a cada 10 minutos uma quantidade adicional de 55 g de carga de matéria seca 30% foi adicionada ao reator de liquefação sob sangramento constante do teor do reator, a fim de manter o nível de enchimento do reator constante a 1 litro. Além disso, a enzima adicional foi doseada em conjunto com a matéria- prima adicional para manter uma relação enzima/substrato constante durante a reação. Após cerca de 3 horas, um nível de matéria seca de cerca de 20% (p/p) foi atingido no reator e a matéria seca de matéria-prima para adicionar, foi reduzida para 20% (p/p) para manter o nível de matéria seca no reator a cerca de 20% (p/p). 6 horas após o início da liquefação, a purga do reator de liquefação foi introduzida em um reator de sacarificação para processamento adicional. O tempo de residência no reator de liquefação foi, em média, cerca de 3 horas.

[00141] A sacarificação foi conduzida como se segue: um reator de sacarificação foi cheio com a forma de purga do reator de liquefação para um volume total de reação de cerca de 1 litro. Isso levou cerca de 3 horas. O reator foi operado sob agitação constante, controle de pH (pH 4,5, NaOH 4N) e 62°C. Durante o enchimento, enzima foi adicionada simultaneamente em uma das experiências, conforme se visualiza na Tabela 1. A reação de sacarificação foi realizada durante cerca de 70 horas. Tabela 1: esquema de dosagem de enzima

• Coquetel de celulase: TEC-210 • Endoglicanase: EBA8 • Dosagem de enzima: mg de proteína TCA por grama de matéria seca de matéria-prima

[00142] A seguir à hidrólise, as amostras foram arrefecidas em gelo e imediatamente 50 μL de cada sobrenadante foi diluído em 1.450 μL de água grau I. O sobrenadante foi diluído, subsequentemente filtrado (filtro de 0,45 μm, Pall PN 454) e os filtrados foram analisados quanto ao teor de açúcar, conforme descrito abaixo.

[00143] As concentrações de açúcar das amostras diluídas foram medidas utilizando um CLAE equipado com uma coluna Aminex HPX-87p (Biorad # 1250098), por eluição com água a 85°C a uma taxa de fluxo de 0,6 mL por minuto e quantificada por integração dos sinais de glicose de detecção do índice de refração (IR) calibrado com soluções padrão de glicose.

[00144] Os dados apresentados na Figura 1 mostram que a liberação de glicose a partir da matéria-prima pré- tratada com endoglicanase é mais rápida e resulta em um nível mais elevado (por exemplo, depois de 72 horas) do que a glicose liberada a partir da matéria-prima, onde endoglicanase e o coquetel de enzima celulase TCE-210 foram adicionados ao mesmo tempo.

[00145] Com base nestes resultados, conclui-se que a liquefação de matéria-prima de lignocelulose com uma composição de enzima contendo endoglicanase melhora o desempenho celulolítico das misturas de celulase.

Exemplo 2 O efeito da endoglicanase na etapa de liquefação

[00146] Amostras de 20% de matéria seca de matéria- prima pré-tratada (palha de milho pré-tratada ácida) de pH 4,5 em água foram pré-aquecidas a 62°C no Newport RVA-4, durante uma hora, a baixa velocidade de agitação. A enzima foi adicionada no tempo = 0 da medição e a diminuição da viscosidade foi registada a 62°C durante as duas horas subsequentes, e registados por um computador ligado.

[00147] Os resultados apresentados na Tabela 2 mostram que, EG (EBA8) melhorou a redução da viscosidade para o substrato de biomassa, bem como que um processo de arranque descontínuo pode ser utilizado para iniciar o processo da invenção. Tabela 2

Exemplo 3 O efeito da temperatura sobre a liquefação de matéria-prima lignocelulósica

[00148] O efeito da temperatura sobre a liquefação de matéria-prima lignocelulósica por endoglicanase é demonstrado por esta experiência. Os experimentos de liquefação foram realizados utilizando matéria-prima de palha de milho pré-tratada ácida (ACS), obtida a partir de NREL (National Renewable Energy Laboratory).

[00149] Amostras de 24% de matéria-prima pré-tratada de matéria seca de pH 4,5 em água foram pré-aquecidas no Newport RVA-4 durante uma hora a baixa velocidade de agitação. Enzima (0,2 mg EG [EBA8] por grama de matéria seca) foi adicionada no tempo = 0 de medição e a diminuição da viscosidade foi registada durante os subsequentes 60 minutos e registrados por um computador ligado. As incubações foram realizadas a 62, 70 e 75°C.

[00150] Os resultados apresentados na Figura 2 mostram que, por exemplo, (EBA8) pode liquefazer matéria- prima lignocelulósica a temperaturas de até 75°C e que as temperaturas mais elevadas resultam em menor viscosidade.

Claims (15)

1. Processo para a hidrólise de biomassa contendo celulose CARACTERIZADO por compreender: - uma etapa de liquefação na qual uma primeira enzima ou primeira composição de enzima é adicionada para liquefazer pelo menos parte dos sólidos presentes na biomassa e obter um fator de redução de viscosidade de pelo menos 2 na etapa de liquefação; seguida por - uma etapa de sacarificação na qual uma segunda composição de enzima é adicionada para formar açúcares oligoméricos e/ou monoméricos; e em que a primeira enzima ou primeira composição de enzima é diferente da segunda composição de enzima; em que a primeira enzima ou primeira composição de enzima compreende uma endoglicanase; em que a segunda composição de enzima compreende uma celulase; em que a primeira enzima ou primeira composição de enzima compreende mais endogluconase do que a segunda composição de enzima (expresso em % de proteína em peso); em que o teor de matéria seca na etapa de liquefação é 15% em peso ou superior; em que a etapa de liquefação é conduzida a uma temperatura de 60°C ou mais; e em que a etapa de sacarificação é conduzida a uma temperatura de 60°C ou mais.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de liquefação ocorre em um reator (reator de liquefação) que tem um volume menor do que o volume do reator (reator de sacarificação) no qual a etapa de sacarificação ocorre.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a razão do volume do reator de liquefação e o volume do reator de sacarificação é entre 1:2 e 1:50.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o reator de liquefação e/ou o reator de sacarificação tem um volume de mais de 1 m3.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda composição de enzima compreende, pelo menos, duas celobiohidrolases diferentes e, opcionalmente, uma beta- glicosidase e/ou GH61.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que na etapa de liquefação ou no reator de liquefação menos enzima (em matéria seca de proteína) por volume do reator é adicionada do que na fase em que o açúcar oligomérico e/ou monomérico é formado ou no reator de hidrólise de açúcares monoméricos.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira enzima ou primeira composição de enzima e/ou a segunda enzima ou composição de enzima compreende uma enzima termoestável.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de liquefação é realizada em modo descontínuo alimentado, semi-contínuo ou contínuo.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de sacarificação é realizada em modo descontínuo alimentado, semi-contínuo ou modo descontínuo.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o teor de matéria seca na etapa de liquefação é de 20% em peso ou superior.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de liquefação é conduzida a uma temperatura de 65°C ou mais.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o tempo de liquefação é de 10 horas ou menos.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o tempo de sacarificação é de 40 horas ou mais.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO por compreender ainda uma etapa de fermentação.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a fermentação é conduzida com um microrganismo que é capaz de fermentar, pelo menos, um açúcar C5.

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