BR112015015138B1 - Composição de vacina contra o vírus da dengue, ácido nucleico e uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

composição de vacina contra o vírus da dengue. a presente invenção refere-se a composições de vacina que compreendem pelo menos um antígeno à base da proteína do capsídeo do vírus da dengue (vd) e do oligonucleotídeo identificado como seq id no. 1. a composição de vacina que compreende uma proteína de fusão formada pelo capsídeo de vd2 e o domínio iii da proteína do envoltório do mesmo sorotipo, em conjunto com o oligonucleotídeo identificado como seq id no. 1, gera os maiores níveis de resposta imunológica celular e proteção em camundongos, em comparação com aquela gerada por formulações do mesmo antígeno em conjunto com oligonucleotídeos de capacidade adjuvante potencial, relatados anteriormente. a eficácia das composições que compreendem o oligonucleotídeo de seq id no. 1 foi demonstrada em primatas não humanos. estas composições podem ser monovalentes, bivalentes e tetravalentes e se combinam em diferentes regimes de imunização para induzir uma resposta imunológica funcional para os quatro sorotipos virais.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia e da indústria farmacêutica, em particular com a obtenção de uma formulação de vacina contra o vírus da dengue (VD) à base de antígenos proteicos recombinantes e um oligonucleotídeo de sequência definida. Estado da T écnica

[002] A dengue é uma enfermidade viral transmitida por artrópodes mais amplamente difundida que afeta a população humana. A cada ano são informados entre 50 e 100 milhões de casos de Febre da Dengue, 500.000 dos quais resultam na forma mais grave da enfermidade, conhecida como Febre Hemorrágica da Dengue (Guzman e cols., Lancet Infect. Dis. 2002; 2:33-42). O agente causal desta enfermidade é o VD, que pertence à família Flaviviridae, gênero flavivirus. O VD é um complexo viral formado por quatro sorotipos. É um vírus envolto cuja membrana lipídica contém duas de suas três proteínas estruturais: a proteína do envoltório e a proteína da membrana. Este envoltório lipoproteico envolve um nucleocapsídeo icosaédrico composto pela terceira de suas proteínas estruturais, a proteína do capsídeo (Leyssen e cols., Clin. MicrobioI. Rev. 2000; 13:67-82).

[003] Nas últimas décadas, a expansão global das infecções com estes vírus se converteu no desenvolvimento de uma vacina eficaz, em uma prioridade da saúde pública. Este propósito se viu limitado por vários fatores. Em primeiro lugar, a infecção por um sorotipo não induz uma proteção cruzada de ampla duração contra os sorotipos restantes (Leyssen e cols., Clin. MicrobioI. Rev. 2000; 13:67-82) e, por sua vez, as infecções secundárias heterotípicas são o principal fator de risco para o desenvolvimento das formas graves da enfermidade (Guzman e cols., Lancet Infect. Dis. 2002; 2:33-42; Mongkolsapaya e cols., Nat. Med. 2003; 9:921-927). Portanto, uma vacina ideal contra o VD deve induzir uma imunidade de proteção de ampla duração contra os quatro sorotipos virais (VD1, VD2, VD3 e VD4).

[004] Os candidatos de vacina que se encontram atualmente em fases mais avançadas de desenvolvimento são constituídos por cepas virais atenuadas mediante passes em série em cultivos celulares ou por via recombinante. Estes candidatos têm como limitação fundamental a interferência viral entre os quatro sorotipos nas formulações tetravalentes, por isso fica muito complexo controlar a indução de uma resposta imunológica equivalente, e têm que ser administradas doses de vacina com longos intervalos de tempo entre as mesmas (Bhamara- pravati e cols., Vaccine. 2000; 18:44-47; Kanesa-Thasan e cols., Vaccine. 2001; 19:3179-3188; Morrison e cols., J. lnfect. Dis. 2010; 201 :370-377). Além disso, devido à sua natureza de se tratar de vírus vivos, não é possível a sua administração em crianças com menos de um ano de idade.

[005] Como uma alternativa atraente, foi desenvolvida uma série de estudos pré-clínicos à base de vacinas de subunidades. Este enfoque apresenta três vantagens fundamentais em relação à vacinação com vírus vivos atenuados: 1) são vacinas potencialmente seguras, 2) não deve ocorrer o fenômeno de interferência viral pela natureza não replicativa do imunógeno e 3) podem ser propostos esquemas curtos de vacinação, ao contrário do que ocorre com as administrações de vírus vivos atenuados, que requerem grandes intervalos entre as doses de vacina para obter um efeito de reforço.

[006] Um dos candidatos de vacinas por subunidades mais promissores, é aquele que é desenvolvido pela empresa Hawai Bio- tec/Merck (Hombach, Rev. Panam. Salud Publica. 2007; 21 :254-260). Trata-se de um candidato formado pelas quatro proteínas do envoltório viral expressos em células de insetos. Formulações monovalentes e tetravalentes foram avaliadas em camundongos e símios, com resultados de imunogenicidade comparáveis com aqueles obtidos com os vírus vivos atenuados (Clements e cols., Vaccine. 2010; 28:27052715). No entanto, no caso das formulações monovalentes, são requeridos potentes adjuvantes, ainda não licenciados para uso em seres humanos, para obter a resposta imunológica adequada. Por sua vez, a formulação tetravalente ensaiada em primatas não humanos, além de apresentar um adjuvante ainda não licenciado em seres humanos, continha a proteína NS1 do VD2, com uma possível homologia com células endoteliais humanas, e poderia desencadear um fenômeno de autoimunidade. Além disso, não existem dados a respeito da indução de resposta imunológica mediada por células, um ramo do sistema imunológico que foi recentemente identificado com um papel protetor contra a dengue (Gil e cols., Viral Immunol. 2009; 22:23-30; Yauch e cols., J. lmmunol. 2009; 182:4865-4873; Yauch e cols., J. lmmunol. 2010; 185:5405-5416).

[007] Mantendo as vantagens associadas às vacinas por subuni-dades e por sua vez procurando formulações mais imunogênicas que empreguem a alumina como adjuvante base, um grupo de pesquisadores cubanos desenvolveu uma linha de trabalho à base da proteína do capsídeo e do domínio 111 (Domlll) da proteína do envoltório do VD (Guzman e cols., Exp. Ver. Vaccines. 2010; 9: 137-147).

[008] A proteína do capsídeo do VD é essencial no ajuste do ví-rion, e tem como função principal proteger o genoma viral. O seu peso molecular varia de 9 a 12 kDa (112 a 127 aminoácidos) e apresenta um caráter básico marcante, uma vez que 25% de seus aminoácidos consistem em arginina e lisina. A proteína fica totalmente interna na estrutura do vírion, sem nenhuma região exposta (Kuhn e cols., Cell. 2002; 108:717-725), o que a torna extremamente atraente para formar parte de uma vacina, pois, teoricamente não deve ser isenta de anticorpos imunoamplificadores. Por outro lado, foram descritos vários epítopos CTL para seres humanos em sua sequência, o que deve permitir a indução de uma resposta imunológica celular eficaz contra o vírus (Gagnon e cols., J. Virol. 1996; 70:141-147; Gagnon e cols., J. Virol. 1999; 73:3623-3629).

[009] Apesar de existir vários estudos sobre as características estruturais desta proteína, não foi antes do ano de 2007 que foi avaliada pela primeira vez a imunogenicidade da proteína do capsídeo do VD em camundongos. Neste estudo foi obtida a proteína do capsídeo do VD2 por via recombinante em Escherichia coli. Depois de um processo de semipurificação foi realizado um esquema de imunização em camundongos, e foi obtida uma proteção parcial nos camundongos depois da estimulação intracranial com VD2 infectivo, sem a detecção de anticorpos neutralizantes (Lazo e cols., Vaccine. 2007; 25:10641070). Posteriormente, foi desenvolvido um processo de purificação e agregação in vitro da dita molécula em escala de laboratório, e se voltou a ensaiar em camundongos para medir a resposta imunológica de proteção, assim como os mecanismos imunológicos relacionados com a sua funcionalidade (Lopez e cols., Arch. Virol. 2009; 154:695-698). A análise da imunogenicidade revelou a indução de uma resposta imu- nológica celular, medida por secreção de gama interferon (IFN-e), proveniente das células do baço dos camundongos que receberam a forma agregada da proteína. A dita secreção era dependente de células CD4+ e CD8+. Por sua vez, depois da estimulação com VD2 infectivo, foi obtida uma proteção significativa nos animais imunizados com a variante agregada da proteína, e a dita proteção também era dependente das células CD4+ e CD8+ (Gil e cols., Int. lmmunol. 2009; 21: 1175-1183). Com nos resultados descritos anteriormente, foi proposto então combinar, em uma mesma construção genética, a proteína do capsídeo do VD2 com a região do Domlll da proteína do envoltório do mesmo sorotipo viral. O Domlll foi amplamente descrito como uma região que envolve a união ao receptor celular (Chen e cols., J. virol. 1996; 70:8765-8772) e, além disso, foi demonstrada a indução de resposta imunológica neutralizante e de proteção em camundongos imunizados com proteínas de fusão contendo a dita região (Crill e cols., J. virol. 2001; 75:7769-7773; Hermida e cols., J. Virol. Methods. 2004; 115:41-49; Simmons e cols., Am. J. Trop. Med. Hyg. 2001; 65:159161). Por sua vez, em estudos realizados em primatas não humanos, foi demonstrada a indução de resposta imunológica funcional de proteção unicamente ao empregar o adjuvante de Freund (Hermida e cols., Vaccine. 2006; 24:3165-3171).

[0010] A união das regiões virais do capsídeo e do Domllll do envoltório viral permite a presença de duas regiões potencialmente de proteçãos em uma mesma molécula, com a capacidade de induzir de uma vez anticorpos neutralizantes (Domlll) e uma resposta imunológi- ca celular (capsídeo). Foi então obtida a construção genética denominada DIIIC-2 (Domlll fundido à região N-terminal da proteína do capsí- deo, sorotipo 2), a qual foi expressa na bactéria E. coli; e a proteína resultante foi purificada em escala de laboratório, e foi submetida ao processo de agregação com uma mistura de oligonucleotídeos de sequência desconhecida. Depois da administração de três doses em camundongos, pôde ser detectada a presença de anticorpos antivirais e neutralizantes. De maneira similar, pôde ser medida a secreção de IFN-e nos esplenócitos dos animais imunizados, sendo detectados níveis significativos nos animais que receberam a variante adicionada. Em consonância com a resposta imunológica celular, foi obtida uma proteção significativa depois da estimulação intracranial, e a dita proteção dependeu das células CD4+ e CD8+ induzidas durante o processo de imunização (Valdes e cols., Virology. 2009; 394:249-258). Estes resultados, em seu conjunto, permitiram selecionar a forma agregada da proteína DIIIC-2 para os estudos seguintes em primatas não humanos.

[0011] O primeiro estudo em primatas não humanos foi realizado em animais previamente infectados com VD2 para conhecer a capacidade de reforço da proteína. De acordo com o esperado, ao administrar a proteína DIIIC-2 e três meses depois da infecção viral, os animais desenvolveram altos níveis de anticorpos antivirais neutralizantes ao vírus homólogo, o que indica a presença de epitopos funcionais na proteína recombinante (Valdes e cols., Clin. Vaccine Immunol. 2011; 18:455-459).

[0012] Com anterioridade a esta invenção, era sabido que a adi ção de oligonucleotídeos para formar variantes em conjuntos da proteína DIIIC-2 favorecia a resposta imunológica celular, e a proteção contra o vírus homólogo em camundongos (Valdes e cols., Virology. 2009; 394:249-258). No entanto, não era sabido se a sequência do oligonu- cleotídeo empregado tinha alguma influência na qualidade da resposta imunológica que é induzida.

[0013] De acordo com os elementos previamente referidos, o de senvolvimento de uma vacina contra o VD capaz de induzir uma resposta imunológica segura e eficaz contra os quatro sorotipos deste pa- tógeno é um problema não resolvido. A presente invenção é voltada precisamente a este objetivo.

Explicação da Invenção

[0014] A presente invenção resolve o problema acima exposto, ao prover uma composição de vacina que é caracterizada pelo fato de que compreende a) pelo menos um antígeno que compreende pelo menos 50% da sequência da proteína do capsídeo do VD e b) o oligo- nucleotídeo identificado como SEQ ID NO. 1. Em uma realização da invenção, a composição de vacina é caracterizada pelo fato de que o antígeno que compreende pelo menos 50% da sequência da proteína do capsídeo do VD é um antígeno recombinante que compreende os aminoácidos 1 a 99 da dita proteína. Em uma materialização, a composição de vacina da invenção compreende um antígeno quimérico que compreende os aminoácidos 1 a 99 da proteína do capsídeo, e os aminoácidos 286 a 426 da região do Domlll da proteína do envoltório viral. Em uma realização particular, os ditos antígenos recombinantes são selecionados dentro do grupo composto pela SEQ ID NO. 5 (antí- geno DIIIC-1), SEQ ID NO. 6 (antígeno DIIIC-2), SEQ ID NO. 7 (antí- geno DIIIC-3), e SEQ ID NO. 8 (antígeno 01lIC-4).

[0015] Para demonstrar se, na dependência do tipo de oligonucle-otídeo que é empregado para a agregação das proteínas, é induzida a melhor resposta imunológica, a composição correspondente ao soroti- po 2 foi selecionada como modelo. Para isso, a proteína DIIIC-2 (antí- geno quimérico que compreende o Domlll da proteína do envoltório viral e os aminoácidos 1 a 99 da proteína do capsídeo do VD2) foi precipitada na presença de vários oligonucleotídeos de sequência conhecida, descritos no estado da técnica. É sabido que alguns destes oli- gonucleotídeos possuem uma capacidade adjuvante (Klinman, Int. Rev. lmmunol. 2006; 25:1-20; Vollmer, Int. Rev. lmmunol. 2006;25:125-134). Além disso, é incluído um novo oligonucleotídeo, formado pela fusão de dois dos oligonucleotídeos mencionados (Krug e cols., Eur. J. lmmunol. 2001; 31 :2154-2163; Verthelyi e cols., J. lmmunol.2001; 166:2372-2377). Depois da avaliação da imunogenicidade em camundongos, pôde ser comprovado que o novo oligonucleotídeo (SEQ ID NO. 1) favoreceu a melhor resposta celular, medida por secreção de IFN-e, por isso este foi selecionado para determinar a capacidade de proteção com a estimulação com o vírus homólogo letal no modelo de encefalite viral em camundongos. Como resultado, o que se obteve é que tanto pela percentagem de sobrevida quanto pela dimi- nuição dos níveis de viremia no cérebro, a formulação do DIIIC-2 com o oligonucleotídeo da SEQ ID NO. 1, adjuvada em alumina, gerou uma potente resposta imunológica de proteção em camundongos.

[0016] Portanto, na presente invenção é demonstrado, pela primeira vez, que a natureza do oligonucleotídeo é crucial na indução da resposta imunológica efetora celular e, consequentemente, na capacidade de proteção da proteína recombinante. Apesar de serem ensaiados vários oligonucleotídeos, só um deles, o oligonucleotídeo cuja sequência é identificada como SEQ ID NO. 1, resultou ser o melhor em termos de indução de resposta imunológica celular e proteção. Foram testados vários oligonucleotídeos sintéticos de sequências diferentes, que continham ou não motivos CpG e tinham ligações fosfodiéster em suas estruturas. Este último elemento difere em relação aos oligonu- cleotídeos com atividade imunopotenciadora descritos na literatura, pois as ligações que são empregadas para a síntese destes oligonu- cleotídeos são do tipo fosforotioato, com a finalidade de proteger os mesmos contra a degradação por exonucleases. Além disso, foram demostradas várias talhas, tais como 19, 20 e 39 bases. Este último oligonucleotídeo de 39 bases contém um número de motivos CpG, e em uma disposição dentro da sequência, que não permite a inclusão do mesmo dentro das classificações descritas para os oligonucleotí- deos com atividade imunopotenciadora no estado da técnica.

[0017] Por outro lado, em todos os casos estas moléculas foram empregadas para a agregação dos antígenos recombinantes, por isso foram adicionadas quantidades mínimas das mesmas. Este constitui outro elemento de diferença com respeito aos oligonucleotídeos empregados como agentes estimuladores do sistema imunológico, pois são requeridas grandes quantidades dos mesmos para exercer essa função (Riedl e cols., J. lmmunol. 2002; 168:4951-4959).

[0018] Tal como foi explicado anteriormente, logo depois da avali- ação imunológica em camundongos foi demonstrado que, inesperadamente, o oligonucleotídeo cuja sequência é identificada como SEQ ID NO. 1 potencializou, de maneira significativa, a resposta imunológi- ca celular e de proteção que é induzida com a proteína recombinante DIIIC-2, com diferenças notáveis com respeito ao restante dos oligo- nucleotídeos empregados.

[0019] Em seguida, procedeu-se a testar o conceito em primatas não humanos negativos à dengue. Para isso, os animais receberam quatro doses da formulação agregada de DI/IC-2 com o oligonucleotí- deo da SEQ ID NO. 1, adjuvada em alumina. Além disso, foi incluído um grupo de animais imunizados com um antígeno recombinante que compreende os aminoácidos 1 a 99 da proteína do capsídeo do VD2, que, ao ser incubada com o oligonucleotídeo da SEQ ID NO. 1, forma partículas semelhantes a nucleocapsídeos (PSNs-2). Foi determinada a resposta de anticorpos antivirais e antiproteínas recombinantes, além da funcionalidade desta resposta, por meio de um ensaio de neutralização por redução do número de placas virais, empregando diferentes cepas de VD2 e diferentes linhagens celulares para o ensaio. Por outro lado, foi avaliada a resposta celular gerada através da determinação dos níveis de secreção de IFN-e, depois da estimulação in vitro das células mononucleares de sangue periférico (CMSP) com VD2 infectivo. Posteriormente, os animais foram estimulados com o VD2, e foi determinada a presença do vírus no sangue. Como resultado, o que se obteve é que a proteína induziu nos macacos uma resposta de anticorpos com atividade neutralizante robusta, medida por seis sistemas diferentes (100% de seroconversão), assim como uma resposta celular adequada mediada pela secreção de IFN-e, antes e depois da estimulação com o vírus. Em consonância com os resultados de imunogenicidade, os animais vacinados foram protegidos de maneira significativa em relação à estimulação viral, uma vez que em dois dos três animais imunizados não foi isolado vírus em nenhum dia depois da estimulação, e o terceiro só apresentou um dia de viremia com valores menores do que 10 unidades formadoras de placas por mililitro (ufp/ml).

[0020] Este estudo em primatas não humanos, previamente negativos à dengue, constitui o primeiro estudo sobre a capacidade de proteção de uma proteína recombinante que contém a região do capsídeo viral do VD. Esta descoberta permitiu extrapolar estas condições ao restante das proteínas quiméricas que foram obtidas, correspondentes aos sorotipos 1, 3 e 4.

[0021] Em seguida, foram projetadas e obtidas as proteínas re-combinantes correspondentes aos sorotipos 1, 3 e 4, as quais foram denominadas DIIIC-1, DIIIC-3 e DIIIC-4, respectivamente. Todas as moléculas foram obtidas em E. coli com percentagens de expressão adequadas. Por sua vez, estas foram purificadas e reconhecidas por anticorpos policlonais murinos específicos contra o sorotipo homólogo. Além disso, pôde ser determinada a correta formação da ponte dissul- fureto em cada proteína, tanto por espectrometria de massa (para DIIIC-1, DIIIC-2, DIIIC-3 e DIIIC-4) quanto por perda de reconhecimento em relação ao soro policlonal murino, logo depois da redução- carboximetilação das cisteínas da ponte dissulfureto intracatenario do Domlll (para DIIIC-1, DIIIC-2 e DIIIC-4).

[0022] Nos estudos que são incluídos na presente invenção, pôde ser demonstrado que as proteínas quiméricas DIIIC destes sorotipos (1, 3 E 4), as quais são descritas pela primeira vez, também induzem uma resposta imunológica funcional e de proteção em camundongos contra os sorotipos homólogos. Além disso, é comprovado que a mistura das quatro proteínas quiméricas, previamente formuladas com o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1 e adjuvadas em alumina, induz a resposta aos quatro sorotipos, tanto celular, humoral, quanto de prote- ção em camundongos, sem a ocorrência do fenômeno de competência antigênica.

[0023] As quatro proteínas quiméricas DIIlC-1, DIIIC-2, DIIIC-3 e DIIIC-4 se agregaram ao adicionar o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1, e posteriormente foram adjuvadas na presença de alumina, para sua avaliação posterior em camundongos. Depois da administração de três doses, pôde ser detectada a presença de anticorpos antivirais contra os quatro sorotipos em 100% dos animais imunizados. De maneira similar, foi detectada a atividade neutralizante nos soros destes camundongos, medida contra os quatro sorotipos. Em consonância com este resultado, ao realizar a estimulação viral intracranial com os sorotipos 1 e 4, foi obtida uma proteção significativa nos dois casos, ficando assim provado o conceito em camundongos da funcionalidade das formulações monovalentes e da tetravalente ensaiada.

[0024] A formulação tetravalente também pôde induzir em macacos uma resposta imunológica funcional, tanto do tipo humoral quanto celular. Para a avaliação da imunogenicidade desta formulação, se procedeu ao segundo ensaio em primatas não humanos, negativos à dengue. Os animais receberam a formulação tetravalente em três ocasiões, por diferentes vias, segundo o grupo de estudo, e um mês depois da última dose foi determinada a resposta imunológica humoral e celular induzida. Como resultado, o que se obteve é que em 100% dos macacos foi gerada uma resposta imunológica antiviral, de anticorpos neutralizantes, contra todos os sorotipos virais. Também o ensaio de resposta imunológica celular revelou a indução de resposta positiva em todos os animais estudados.

[0025] Este trabalho, em seu conjunto, demonstra a capacidade de proteção, contra os quatro sorotipos do VD, das quatro proteínas DIIIC agregadas com o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1.

[0026] A invenção também compreende uma composição de vaci- na que é caracterizada pelo fato de que compreende dois dos antíge- nos quiméricos que são selecionados dentro do grupo composto pela SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 e SEQ ID NO. 8. É também objeto da invenção uma composição de vacina que é caracterizada pelo fato deque compreende os quatro antígenos quiméricos identificados como SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 e SEQ ID NO. 8.

[0027] Em outro aspecto, a invenção provê um ácido nucleico que é caracterizado pela sequência identificada como SEQ ID NO. 1. Tal como é demonstrado amplamente na invenção, o dito ácido nucleico é útil para incrementar a resposta imunológica contra um antígeno de vacina que compreende pelo menos 50% da sequência da proteína do capsídeo do VD. Em uma materialização da invenção, é demonstrado o uso do ácido nucleico identificado como SEQ ID NO. 1 para incrementar a resposta imunológica contra um antígeno recombinante que compreende os aminoácidos 1 a 99 da proteína do capsídeo do VD. Em uma realização particular, é revelado o uso do ácido nucleico identificado como SEQ ID NO. 1 para incrementar a resposta imunológica contra os antígenos quiméricos que são identificados como SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 e SEQ ID NO. 8.

[0028] Além disso, é objeto da presente invenção um método para induzir uma resposta imunológica contra o VD, o qual é caracterizado pelo fato de que é administrada a uma pessoa uma composição de vacina que compreende a) pelo menos um antígeno que compreende pelo menos 50% da sequência da proteína do capsídeo do VD e b) o oligonucleotídeo identificado como SEQ ID NO. 1. Em um aspecto, a invenção provê um método para induzir uma resposta imunológica contra o VD, o qual é caracterizado pelo fato de que é administrada uma composição que compreende um antígeno recombinante que compreende os aminoácidos 1 a 99 de dita proteína. Em uma materia- lização de dito método, o antígeno recombinante é um antígeno quimérico que possui uma sequência de aminoácidos que são selecionados dentro do grupo composto pela SEQ ID NO. 5, a SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 e SEQ ID NO. 8.

[0029] Na invenção foi realizado um estudo em camundongos com o objetivo de diminuir o total da dose de cada proteína DIIIC no esquema de imunização. Para isto, foram administradas duas formulações bivalentes diferentes, administradas de maneira sequencial, e foi administrada uma terceira dose de reforço. Como resultado, o que se obteve é que não existiam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos ensaiados, para nenhum dos 4 sorotipos virais, o que indica que é possível, através de administrações sequenciais de formulações bivalentes, e reforço com a formulação tetravalente DIIlC, que inclui o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1, obter os mesmos níveis de imunogenicidade que aqueles ao administrar três dose da formulação tetravalente DIIIC com o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1. Portanto, é também objeto da invenção um método para induzir uma resposta imunológica contra o VD onde as composições de vacina que compreendem os antígenos quiméricos identificados como SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 e SEQ ID NO. 8 são administradas de maneira sequencial em composições bivalentes. A invenção também provê um método onde também é administrada uma dose de reforço que compreende a composição tetravalente dos quatro antíge- nos quiméricos identificados como SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 e SEQ ID NO. 8.

[0030] Tal como é demonstrado nos Exemplos, as composições que compreendem pelo menos um antígeno que compreende pelo menos 50% da sequência da proteína do capsídeo do VD e o oligonu- cleotídeo identificado como SEQ ID NO. 1 foram imunogênicas por diferentes vias, por isso no método da invenção a composição de vacina é administrada pelas rotas que são bem conhecidas pelos elementos versados neste campo da técnica, por exemplo a via subcutânea, in- tradérmica ou intramuscular.

Breve Descrição das Figuras

[0031] Figura 1. Gráfico da resposta de anticorpos antivirais nos animais imunizados. No eixo Y é representado o log Título anti-VD2 e no eixo X os grupos de animais que receberam as diferentes variantes de formulações de DIlIC-2. Os títulos foram determinados por meio de um ensaio ELlSA amplificado de captura, ao usar o vírus como antíge- no. A análise estatística foi feita por meio de um teste de Kruskal- Wallis e a comparação múltipla a posteriori mediante o teste de Ounn. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas significativas entre os grupos. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.

[0032] Figura 2. Gráfico que representa a concentração de IFN-e medida por ELISA, depois da estimulação in vitro de esplenócitos provenientes dos camundongos imunizados com as diferentes formulações de DIIIC-2, cultivados com o VD2 ou com uma preparação de controle negativo (mock). No eixo Y é representada a concentração de IFN-e (pg/ml). No eixo X são representados os grupos que receberam as diferentes formulações de DIIIC-2. As percentagens refletidas em cima de cada conjunto de pontos representa a porcentagem de animais que responderam. A linha descontínua indica o valor por cima do qual se considera uma resposta positiva. A análise estatística foi feita ao usar um ANOVA de classificação simples, e para as comparações múltiplas entre os grupos foi realizado um teste de Tukey. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas significativas entre os grupos. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (n = 8).

[0033] Figura 3. Gráfico que representa os ensaios de proteção contra o VD2. A. Curvas de sobrevida dos camundongos imunizados depois da estimulação intracranial com uma cepa letal de VD2. O eixo Y representa a percentagem de sobrevida, e o eixo X representa o tempo de observação depois da estimulação intracranial. B. Quantificação viral em células VERO, medida a partir de cérebro infectado no dia 7 após a estimulação. O eixo Y representa o número de ufp/ml obtidas depois do plaqueamento em células VERO de homogenato de cérebro de camundongo infectado. O eixo X representa os grupos de estudo. Para a curva de sobrevida, a análise estatística foi feita de acordo com o teste de sobrevida Log-rank. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas significativas entre os grupos. Os dados são representativos de dois experimentos independentes (n = 10). Para a carga viral, a análise estatística foi feita por meio de um teste de Kruskal-Wallis e a comparação múltipla a posteriori mediante o teste de Dunn. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas entre os grupos. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (n = 5). A linha descontínua indica 100 ufp/ml.

[0034] Figura 4. Gráfico que representa a cinética de anticorpos anti-DIIIC-2 gerados em símios, e medida por meio de ELlSA. No eixo Y é representado o Log Título e no eixo X é representado o tempo, em dias, durante o ensaio. As setas negras indicam o momento de cada imunização.

[0035] Figura 5. Gráfico que representa a cinética de anticorpos anti-VD, medida por um ensaio ELlSA de captura, nos macacos imunizados com o preparado placebo (A), com a proteína DIlIC-2 adicionada (8) ou com as PSNs-2 (C). No eixo Y é representado o log 1/título, e no eixo X é representado o tempo em dias durante o ensaio. As setas negras indicam o momento de cada imunização e a seta descontínua indica o dia da estimulação viral.

[0036] Figura 6. Gráfico que representa a concentração de IFN-e depois da estimulação in vitro medida por meio de ELlSA, das células mononucleares de sangue periférico provenientes dos símios que re- ceberam o preparado placebo ou a proteína DIIlC-2. No eixo Y é representada a concentração de IFN-e (pg/ml) e no eixo X é representado o tempo de realização do ensaio. As CMSP provenientes dos macacos imunizados foram cultivadas com VD2 ou com um preparado de controle negativo (mock). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (n = 3). A linha descontínua indica o valor por cima do qual se considera uma resposta positiva.

[0037] Figura 7. Gráficos que representam a carga viral presente no soro dos macacos do grupo imunizado com a formulação Placebo (A), a proteína DIIIC-2 adicionada (8) ou as PSNs-2 (C), medida por plaqueamento direto em células VERO. O eixo do lado direito corresponde às cargas detectadas nos macacos 2, 5 e 9 (linha descontínua). O eixo do lado esquerdo corresponde às cargas detectadas no restante dos animais. No eixo X é representado o tempo (em dias) posterior à estimulação.

[0038] Figura 8. Estratégia de clonagem para a obtenção das construções genéticas pDIlIC-1, pDIlIC-2, pDIlIC-3 e pDIIIC-4.

[0039] Figura 9. Gráfico que representa níveis de reconhecimento das proteínas quiméricas DIIlC, em condições redutoras e não redutoras, por anticorpos policlonais de camundongo com elevados títulos neutralizantes ao sorotipo homólogo, determinados por meio de ELl- SA. No eixo Y são representados os valores de absorbância, e no eixo X são representadas as proteínas ensaiadas.

[0040] Figura 10. Gráfico da resposta de anticorpos antivirais nos animais imunizados, medidos 15 dias depois da última imunização. No eixo Y é representado o log Título anti-VD, e no eixo X são representados os grupos de animais que receberam cada formulação. (A) Resposta de anticorpos anti-VD1, (B) resposta de anticorpos anti-VD2, (C) resposta de anticorpos anti-VD3 e (D) resposta de anticorpos anti- VD4. Os títulos foram determinados por meio de um ensaio ELlSA amplificado de captura, usando cada vírus como antígeno. A análise estatística foi feita por meio de um teste de Kruskal-Wallis, e a comparação múltipla a posteriori por meio do teste de Ounn. Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (n = 10).

[0041] Figura 11. Gráfico que representa a concentração de IFN-e, medida por meio de ELlSA, depois da estimulação in vitro de esplenó- citos provenientes dos camundongos imunizados com as formulações monovalentes e tetravalente DlllC (que incluem o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1) ou com a formulação placebo, e estimulados com cada proteína DllIC. No eixo Y é representada a concentração de IFN-e (pg/ml). No eixo X são representados os grupos do estudo. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.

[0042] Figura 12. Gráfico que representa as curvas de sobrevida dos camundongos imunizados, depois da estimulação intracranial com uma cepa letal de vírus VD1 (A) e vírus VD4 (B). O eixo Y representa a percentagem de sobrevida, e o eixo X representa o tempo de observação depois da estimulação intracranial. A análise estatística foi feita de acordo com o teste de sobrevida Log-rank. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas significativas entre os grupos. Os dados são representativos de dois experimentos independentes (n = 9).

[0043] Figura 13. Gráfico que representa a resposta de anticorpos antivirais contra os quatro sorotipos do VD, determinada por meio de um ensaio ELlSA de captura, logo depois de três doses da formulação tetravalente DlllC com o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1 em primatas não humanos, empregando as vias subcutânea (SC), intradérmica (ID) e intramuscular (IM). No eixo Y é representado o Log Título antiVD e no eixo X os grupos de animais.

[0044] Figura 14. Gráfico que representa a frequência de células produtoras de IFN-e a partir dos linfócitos de sangue periférico estimu- lados in vitro com as proteínas recombinantes DllIC, logo depois de três doses da formulação tetravalente DlllC com o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1, em primatas não humanos. No eixo Y é representada a frequência de células produtoras de IFN-e, em número de pontos/ml. No eixo X são representados os grupos de animais.

[0045] Figura 15. Gráfico da resposta de anticorpos antivirais nos animais imunizados, medidos 15 dias depois da última imunização. No eixo Y é representado o log Titulo anti-VD, e no eixo X são representados os grupos de animais que receberam cada formulação. (A) Resposta de anticorpos anti-VD1, (B) resposta de anticorpos anti-VD2, (C) resposta de anticorpos anti-VD3 e (O) resposta de anticorpos anti- VD4. Os títulos foram determinados por meio de um ensaio ELlSA amplificado de captura, usando cada vírus como antígeno. A análise estatística foi feita por meio de um teste de Kruskal-Wallis e a comparação múltipla a posteriori por meio do teste de Dunn. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas entre os grupos. Os dados são apre-sentados como média ± desvio padrão (n = 10).

[0046] Figura 16. Gráfico que representa a concentração de IFN-e, medida por meio de ELISA, depois da estimulação in vitro de esplenó- citos provenientes dos camundongos imunizados e estimulados com cada proteína DIIIC. No eixo Y é representada a concentração de IFN- e (pg/ml). No eixo X são representados os grupos do estudo. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (n = 5).

Exposição detalhada de modalidades/Exemplos de realização Exemplo 1. Avaliação da imunogenicidade em camundongos da proteína DIllC-2 adicionada com diferentes oligonucleotídeos de sequência definida.

[0047] Tomando como base a prova de conceito realizada em camundongos com a proteína DIIIC-2 ao empregar uma mistura de oli- gonucleotídeos de cerca de 50 b, de sequência desconhecida, seleci- onados ao acaso para a agregação da proteína (Valdes e cols., Virology. 2009; 394:249-258), foram ensaiados diferentes oligonucleotí- deos de sequência definida. Distintamente do que é relatado na literatura em relação aos oligonucleotídeos com capacidade adjuvante, o que foi ensaiado no presente estudo é formado unicamente por ligações fosfodiéster. Além disso, foram incluídos dois oligonucleotídeos de uma extensão de 39 bases, que não são classificados dentro dos oligonucleotídeos que exercem atividade adjuvante, tal como definido na literatura.

[0048] Os oligonucleotídeos ensaiados foram os seguintes: Oligonucleotídeo K3 (SEQ ID NO. 2): ATCGACTCTCGAG- CGTTCTC, 20 meros (contém motivos CpG para humanos e símios. Esqueleto de ligações fosfodiéster) Oligonucleotídeo 2216 (SEQ ID NO. 3): GGGGGA- CGATCGTCGGGGG, 19 meros (contém motivos CpG para camundongos e símios. Esqueleto de ligações fosfodiéster) Oligonucleotídeo misto (SEQ ID NO. 1): ATCGACTCTCGAGCGTTCTCGGGGGACGATCG- TCGGGGG, 39 meros (Contém as sequências do oligonucleotídeo K3 e 2216, esqueleto de ligações fosfodiéster) Oligonucleotídeo OriC (SEQ ID NO. 4): CA T ACCTCGCTCTGCT AA TCCTGTT ACCAGTGG- CTGCTG 39 meros. (Esqueleto de ligações fosfodiéster) Poli I:C esqueleto de ARN: ICICICICICICICICICICICICIC 26 meros (Esqueleto de ligações fosfodiéster) Poli I:C esqueleto de AON: ICICICICICICICICICICICICIC 26 meros (Esqueleto de ligações fosfodiéster)

[0049] A reação de agregação foi executada com uma relação de massa de proteína em relação à massa do oligonucleotídeo que permitiu a precipitação de 50% da proteína, para ter desse modo como constante o parâmetro de: mesma quantidade de proteína solúvel e adicionada na formulação.

[0050] A proteína DIIIC-2, adicionada com os diferentes oligonu-cleotídeos, foi avaliada em camundongos BALB/c. Os grupos foram os seguintes: Grupo 1: DllIC-2 Solúvel (não agregada e sem oligonucleo- tídeo) (20 μg de proteína) Grupo 2: D1llC-2 com oligonucleotídeo misto (SEQ ID NO. 1): (20 μg de proteína + 2 μg de oligonucleotídeo) Grupo 3: DllIC-2 com oligonucleotídeo poli:IC, ARN (20 μg de proteína + 2 μg de oligonucleotídeo) Grupo 4: DllIC-2 com oligonucleotídeo polilC, ADN (20 μg de proteína + 2 μg de oligonucleotídeo) Grupo 5: DllIC-2 com oligonucleotídeo 2216 (SEQ ID NO. 3) (20 μg de proteína + 2 μg de oligonucleotídeo) Grupo 6: DllIC-2 com oligonucleotídeo K3 (SEQ ID NO. 2) (20 μg de proteína + 2 μg de oligonucleotídeo) Grupo 7: DllIC-2 com oligonucleotídeo OriC (SEQ ID NO. 4) (20 μg de proteína + 2 μg de oligonucleotídeo) Grupo 8: DllIC-2 Aquecida (controle de precipitação sem oligonucleotídeo) (contém a metade da proteína precipitada (10 μg) e a metade solúvel (10 μg)) Grupo 9: Placebo com oligonucleotídeo misto (SEQ ID NO. 1) (2 μg) Grupo 10: 102 ufp de VD2 infectivo

[0051] Todas as variantes foram formuladas em alumina como adjuvante base, e foram inoculadas aos animais em um esquema de três doses, a cada 15 dias, por via intraperitoneal. Depois da terceira dose, a detecção de anticorpos reativos ao VD2 foi determinada por meio de um ensaio ELlSA de captura, através do qual foram determinados os títulos por diluição ao ponto final dos soros destes animais. Tal como pode ser apreciado na Figura 1, foram detectados elevados títulos de anticorpos antivirais para todos os grupos ensaiados, sem diferenças estatísticas entre eles (p > 0,05), o que indica que a agregação da proteína quimérica DIIIC-2 não afeta a resposta de anticorpos antivirais.

[0052] Com o objetivo de determinar a funcionalidade dos anticorpos gerados pela imunização, também foi realizou o ensaio de neutralização viral in vitro. Na Tabela 1 são representados os títulos neutrali- zantes contra o VD2. O título neutralizante é definido como a diluição máxima em que são alcançados 50% de redução do número de placas. Tal como pode ser apreciado, os animais de todos os grupos eram positivos por neutralização, com 100% de seroconversão e com Títulos Médios Geométricos (TPG) maiores do que 1:70.Tabela 1. Desenvolvimento de anticorpos neutralizantes contra o VD2 nos grupos ensaiados

[0053] Neste esquema também foi avaliada a capacidade da proteína DIIIC-2, adicionada com diferentes oligonucleotídeos, de gerar uma resposta imunológica mediada por células. Para isso, foram extraídas as células do baço dos animais imunizados com cada variante e foi medida a secreção de IFN-e no sobrenadante de cultivo dos esple- nócitos, logo depois da estimulação com VD2 infectivo. Na Figura 2 são descritos os valores de secreção de citocina por cada grupo, e a percentagem de animais que responderam. Apesar do fato que foram obtidos níveis de secreção apreciáveis em todos os grupos, somente o grupo imunizado com a proteína adicionada com o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1 exibiu diferenças estatisticamente significativas com respeito ao grupo de controle negativo. Além disso, nesse grupo 100% dos animais responderam positivamente. Tendo em conta tanto a percentagem de animais que responderam quanto o valor médio da con- centração de IFN-e no ensaio de resposta imunológica celular, foram selecionadas para o ensaio de proteção as formulações da proteína D111C-2 adicionada com os oligonucleotídeos: misto (SEQ ID NO. ,22161) (SEQ ID NO. 3), K3 (SEQ ID NO. 2) e Ori C (SEQ ID NO. 4).

[0054] Para este estudo, foram formados os seguintes grupos de 15 camundongos: Grupo 1: DIIIC-2 oligonucleotídeo misto (SEQ ID NO. 1) (5 g de proteína + 0,5 μg de oligonucleotídeo) Grupo 2: DIIlC-2 oligonucleotídeo 2216 (SEQ ID NO. 3) (5 μg de proteína + 0,5 μg de oligonucleotídeo) Grupo 3: DIIIC-2 oligonucleotídeo K3 (SEQ ID NO. 2) (5 μg de proteína + 0,5 μg de oligonucleotídeo) Grupo 4: DIIIC-2 oligonucleotídeo OriC (SEQ ID NO. 4) (5 μg de proteína + 0,5 μg de oligonucleotídeo) Grupo 5: Placebo com oligonucleotídeo misto (SEQ ID NO. 1) (0,5 μg) Grupo 6: 102 ufp de V02 infectivo

[0055] Todas as variantes foram formuladas em alumina como adjuvante base, e foram inoculadas aos animais em um esquema de três dose, a cada 15 dias, por via intraperitoneal.

[0056] Dois meses depois do começo do esquema de imunização,10 animais de cada grupo foram estimulados com 50 doses letais médias (DL50) de vírus homólogo neuroadaptado, e foram observados durante 21 dias para medir a sobrevida. A Figura 3A descreve as porcentagens de sobrevida obtidas. Tal como se observa, mais de 80% dos camundongos que receberam a formulação DIIIC-2 com o oligonucleo- tídeo de SEQ ID NO. 1 sobreviveram à estimulação viral, sem diferenças estatísticas com respeito ao grupo de controle positivo imunizado com o VD2 (p > 0,05). Por sua vez, somente 10% dos animais do grupo de controle negativo sobreviveram à estimulação viral, com diferenças estatisticamente significativas com respeito ao grupo imunizado com DIIIC-2 e oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1 e ao controle positivo (p < 0,05). Por outro lado, os animais imunizados com as formulações contendo os oligonucleotídeos 2216, K3 e OriC não alcançaram níveis de sobrevida com diferenças estatisticamente significativas com respeito ao grupo de Placebo.

[0057] Os cinco animais restantes de cada grupo receberam 500 DL50 do mesmo vírus, e sete dias posteriores a esta estimulação viral todos foram sacrificados, para a extração do cérebro, e foi quantificada a carga viral em células VERO. De maneira consonante com a sobre- vida observada na Figura 3A, os camundongos imunizados com a formulação DllIC-2 com o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1 apresentaram uma carga viral baixa no cérebro (<102 ufp/ml), sem diferenças estatísticas com respeito ao grupo de controle positivo (p > 0,05), enquanto que os camundongos do grupo que recebeu a formulação placebo exibiram uma carga viral maior do que 104 ufp/ml como valor médio (Figura 3B). Os animais imunizados com as formulações contendo os oligonucleotídeos 2216, K3 e Ori C exibiram níveis intermédios de carga viral entre aqueles alcançados com a formulação de DllIC-2 e o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1, e a formulação placebo, sem diferenças estatisticamente significativas entre eles.

EXEMPLO 2. Teste de conceito em primatas não humanos imunizados com os agregados da proteína DIIIC-2 e as Partículas Semelhantes aos nucleocapsídeos obtidas a partir da proteína recombinante do capsídeo do VD2.

[0058] Com base nos estudos pré-clínicos em camundongos, procedeu-se à avaliação da proteína DllIC-2, agregada com o oligonucleo- tídeo de SEQ ID NO. 1, e adjuvada em alumina, em primatas não humanos negativos ao VD. Além disso, foi incluído um grupo que recebeu as PSNs-2 (que contêm o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1). Por sua vez, o grupo placebo recebeu uma formulação que continha a quantidade máxima do oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1, empregado no processo de agregação das proteínas recombinantes, adjuvado em alumina. Em todos os grupos do esquema foram incluídos 3 animais.

[0059] A dose selecionada foi de 100 μg de proteína e 10 μg de oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1 para DIlIC-2, e de 50 μg de proteína e 10 μg de oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1 para as PSNs-2. Os macacos receberam quatro doses, por via subcutânea, espaçadas a cada dois meses. Foram realizadas sangrias no momento de cada dose, e quinze dias depois das mesmas, para medir a resposta imunológica humoral induzida. Na Figura 4 é representada a cinética de aparecimento de anticorpos anti-DllIC-2. Tal como pode ser apreciado, nos macacos que receberam a formulação de DllIC-2 começam a ser detectados anticorpos 15 dias depois da administração da primeira dose. Os títulos aumentaram depois da inoculação da segunda dose, a valores maiores do que 10.000. Logo depois da terceira dose, os títulos aumentaram ligeiramente, e logo depois da quarta dose se mantiveram ao mesmo nível (valor médio: 80.000). A resposta de anticorpos anticapsídeo no grupo imunizado com as PSNs-2 comportou-se de forma similar (Figura 4).

[0060] A detecção de anticorpos reativos ao VD2 foi determinada por meio de um ensaio ELlSA de captura, através do qual foram determinados os títulos por diluição ao ponto final dos soros destes animais. Os resultados do estudo cinético do desenvolvimento de anticorpos antivirais são mostrados na Figura 5. Os anticorpos antivirais, nos macacos que receberam a formulação de DlllC-2 com o oligonucleotí- deo de SEQ ID NO. 1, começaram a ser detectados aos 15 dias posteriores à administração da segunda dose (valor médio: 6.000), e caíram para valores indetectáveis no momento da terceira dose, ou seja, 2 meses depois de ter recebido a segunda inoculação do imunógeno. Em seguida, depois da administração da terceira dose, os títulos au- mentaram a valores similares àqueles obtidos 15 dias depois da segunda dose; no entanto, nesta ocasião eles se mantiveram detectáveis (valor médio: 800) no momento da quarta dose, que corresponde a dois meses depois de administrada a terceira dose. Novamente, depois de receber a quarta inoculação, os animais desenvolveram anticorpos com valores ligeiramente superiores àqueles detectados no momento da administração, e estes foram mantidos até o momento da estimulação viral com um valor médio de 5.000. Quando foi administrada a dose viral, pôde ser detectado um ligeiro aumento dos títulos de anticorpos aos 20 e 27 dias posteriores à estimulação, com valores médios de 12.000.

[0061] A resposta de anticorpos neutralizantes também foi medida neste estudo, uma vez que os mesmos constituem uma possível correlação de proteção contra este vírus. A Tabela 2 reflete os valores obtidos por cada amostra, nos tempos assinalados, utilizando a linhagem celular Vero e a cepa de VD2 S88553.

[0062] Tal como se pode observar, começam a ser detectados anticorpos neutralizantes depois da administração da segunda dose de DIllC-2. Quinze dias depois da terceira inoculação foram detectados títulos maiores, os quais são mantidos no momento da quarta administração. Logo depois de 15 dias, os títulos aumentaram, evidenciando um claro efeito de reforço. Por sua vez, um mês depois da última dose, no momento da estimulação viral, foram detectados os maiores níveis de anticorpos neutralizantes para todos os animais imunizados com DllIC-2. No caso do grupo que recebeu as PSNs-2, tal como esperado, não foi detectada resposta neutralizante em nenhum dos tempos avaliados antes da estimulação viral (título neutralizante menor do que 10, resultados não mostrados). O grupo placebo se comportou de forma similar com títulos neutralizantes menores do que 10 (resultados não mostrados). Tabela 2. Desenvolvimento de anticorpos neutralizantes contra o VD2 durante o esquema de imunização em macacos com a proteína DIIIC-2 adicionada e as PSNs-2.

[0063] Um mês depois da última dose, para o grupo do DllIC-2, também foram determinados os anticorpos neutralizantes, ao empregar três cepas virais e três linhagens celulares diferentes. Em todos os casos foram detectados 100% de seroconversão, indicando a indução de uma resposta neutralizante robusta (Tabela 3). Tabela 3. Títulos de anticorpos neutralizantes induzidos pela proteína DIIIC-2 adicionada com o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1, no momento da estimulação, ao empregar três linhagens celulares e cepas virais diferentes.

[0064] São refletidos os títulos neutralizantes de cada animal de modo independente, assim como o TPG e a % de seroconversão alcançada com o sistema experimental empregado.

[0065] A resposta imunológica celular foi outro dos parâmetros medidos no presente estudo. Os linfócitos de sangue periférico, isolados em quatro pontos: dia da quarta dose, 15 dias depois da quarta dose, dia da estimulação viral, e 27 dias posteriores à estimulação vi ral, estimulados com VD2 infectivo, e foi medida a secreção de IFN-e no sobrenadante de cultivo. Na Figura 6 são mostrados os valores obtidos em cada ponto ensaiado. Dos três animais imunizados com DIIIC-2 e o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1, um (macaco 6) induziu a secreção de IFN-e nos três pontos analisados antes da estimulação viral. Por sua vez, posterior à infecção, no dia 27, outro macaco deste grupo também resultou positivo, indicando a medição de uma resposta celular anamnéstica.

[0066] Por outro lado, dos três animais que receberam as PSNs-2, dois deles foram positivos por secreção de IFN-e no dia de estimulação viral. Por sua vez, depois da infecção, no dia 27, os três símios deste grupo resultaram positivos, também indicando neste caso a medição de uma resposta celular anamnéstica. É importante assinalar que em nenhum dos animais que receberam a formulação placebo foi detectada secreção de citocina antiviral nem sequer depois da estimulação viral.

[0067] Para medir a proteção em relação a VD2, todos os animais do estudo foram estimulados com uma dose infectiva do mesmo, um mês depois da última dose. A presença do vírus no sangue foi determinada por quantificação direta na linhagem celular VERO. Na Figura 7 são mostrados os resultados obtidos. Os animais que receberam a formulação placebo desenvolveram viremia durante 3,6 dias como valor médio, e com cargas virais médias de 102 ufp/ml. Por outro lado, dois dos símios que receberam a formulação de proteína DIIIC-2 com o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1 não desenvolveram viremia e, por conseguinte, são classificados como totalmente protegidos. Em um animal (símio 5), só foi detectado o vírus no dia 5, e com um valor muito baixo de carga viral (<10 ufp), o que também indica um nível apreciável de proteção.

[0068] Para o caso do grupo que recebeu as PSNs-2, em todos os macacos foi detectada a presença de vírus, no entanto, a carga viral era menor em comparação com aquela detectada no grupo de controle. De fato, o macaco 9 apresentou uma carga viral muito baixa (<10 ufp), também indicando um nível apreciável de proteção.

[0069] De modo geral, pode-se afirmar que as proteínas à base do capsídeo viral, adicionadas com o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1, induzem uma resposta de proteção em símios.

EXEMPLO 3. Obtenção e caracterização das proteínas: DIIIC-1, DIIIC3 e DIIIC-4.

[0070] Foi clonado o fragmento de genes BamHI/Hindlll contendo o Domlll da proteína do envoltório do VD do sorotipo 1, 3 e 4 (aminoá- cidos 286 a 426) fundido à proteína do capsídeo do mesmo vírus, no sítio de múltipla clonagem do plasmidio pET28. Este vetor de expressão foi previamente modificado, sendo eliminada a sequência de genes entre os sítios Ncol e BamHI, com exceção da cauda de histidina, com a finalidade de eliminar a tradução de aminoácidos não relacionados à proteína clonada. A construção genética dos plasmídios é mostrada na Figura 8.

[0071] Em todos os casos, as proteínas são fundidas a uma cauda de histidina em sua extremidade N-terminal, e são expressas sob a regulação do promotor T7 lac. Isto permitiu, uma vez expressas, desenvolver um processo de purificação das ditas proteínas, combinando a cromatografía de troca iônica e a cromatografía de afinidade a quela- tos metálicos. Esta mesma metodologia foi utilizada para a purificação da proteína DllIC-2 previamente obtida. Uma vez purificadas as quatro proteínas recombinantes, procedeu-se à caracterização das mesmas. Em primeiro lugar, foi analisada a reatividade de cada uma delas em relação a soros policlonais provenientes de camundongos imunizados com cada preparado viral, especificamente de líquidos ascíticos hipe- rimunes anti-VD de cada sorotipo (HMAF, do inglês hiperimmune asci- tic fluid). Tal como é mostrado na Figura 9, foi obtida uma reatividade por meio de ELlSA de cada proteína em relação a HMAF do sorotipo viral homólogo, indicando uma apresentação correta da região do Domlll no contexto do capsídeo, uma vez que os anticorpos da maior parte dos anticorpos gerados contra a proteína do envoltório viral são conformacionais.

[0072] Por outro lado, foi estudado o estado da ponte de dissulfu-reto (S-S) dentro da região do Domlll, que deve estar presente em cada molécula quimérica. Em primeiro lugar, cada proteína foi verificada por meio de espectrometria de massa, e foi concluída a formação correta da dita ponte. Em seguida, com base no fato que a ponte S-S está envolvida diretamente na reatividade do Domlll em relação a soros po- liclonais anti-VD, foi analisada novamente a reatividade de cada uma das proteínas recombinantes em relação a HMAF do sorotipo homólogo, em condições redutoras e não redutoras. Tal como se observa na Figura 9, para as proteínas DIIIC-1, 2 e 4 é observada uma diminuição na reatividade em relação a HMAF homólogo, quando as proteínas são reduzidas irreversivelmente por meio de alquilação. No caso de DllIC-3 também se observa uma diminuição, embora menos marcante do que no restante das proteínas. Estes resultados corroboram a formação correta da ponte S-S e por sua vez o seu possível papel na reatividade do Domlll em relação aos anticorpos policlonais anti-VD.

EXEMPLO 4. Avaliação imunológica em camundongos das formulações monovalentes DIIIC e tetravalente Tetra DIIC

[0073] Cada proteína quimérica, previamente agregada com o oli-gonucleotídeo de SEQ ID NO. 1, assim como a mistura tetravalente das quatro moléculas já agregadas, foram avaliadas em camundongos BALB/c. Todos os preparados foram formulados em alumina como adjuvante base, e foram inoculados aos animais em um esquema de três doses, administradas a cada 15 dias por via intraperitoneal. Como con- troles positivos, foram incluídos quatro grupos imunizados com cada sorotipo viral. Como controle negativo, um grupo recebeu um preparado placebo com a mesma quantidade de oligonucleotídeos contida na formulação tetravalente, e adjuvada em alumina. As quantidades de proteína para a formulação tetravalente foram de 20 μg cada uma e 8 μg totais de oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1. As formulações monovalentes continham 20 μg de proteína e 2 μg de oligonucleotídeo de SEQ ID NO.1.

[0074] Depois da terceira dose, a detecção de anticorpos reativos a cada vírus foi determinada por meio de um ensaio ELlSA de captura (Figura 10), através do qual foram determinados os títulos, por diluição ao ponto final dos soros destes animais. Nos animais que receberam as formulações monovalentes foram detectados elevados títulos de anticorpos antivirais no caso dos sorotipos 1, 2 e 3; enquanto que os animais imunizados com o DIIIC-4 não desenvolveram títulos contra o sorotipo homólogo (VD4). No entanto, os animais que receberam a formulação tetravalente Tetra DIIIC desenvolveram anticorpos contra o VD4, embora com títulos menores com respeito ao restante dos soro- tipos. Este resultado indica que a mistura das quatro proteínas favorece a indução de anticorpos contra o VD4, possivelmente por algum nível de reatividade cruzada com o restante dos sorotipos.

[0075] Com o objetivo de determinar a funcionalidade dos anticorpos gerados pela imunização com a formulação tetravalente Tetra DIIIC, foi realizado o ensaio de neutralização viral in vitro (Tabela 4) contra os sorotipos 1, 2, 3 e 4. O ensaio foi realizado de acordo com as normas da Organização Mundial da Saúde, e empregando as cepas de referência. Nos camundongos imunizados com as proteínas DIIIC-1, 2 e 3 foram induzidos elevados títulos de anticorpos neutrali- zantes contra o vírus homólogo, comparáveis àqueles induzidos com o vírus replicativo nos camundongos dos grupos de controle virais. Esse comportamento não se repetiu no caso dos animais imunizados com a proteína DIIIC-4, onde, em consonância com os resultados obtidos na resposta antiviral, não foram detectados anticorpos neutralizantes contra VD4. No entanto, a formulação tetravalente, além de induzir anticorpos neutralizantes contra os sorotipos 1, 2 e 3, também induziu anticorpos funcionais contra o VD4.Tabela 4. Títulos de anticorpos neutralizantes em camundongos imunizados com formulações monovalentes e tetravalentes das proteínas quiméricas DIIIC.

[0076] Em todos os casos foi analisada uma mistura dos soros dos camundongos. (-): não determinado.

[0077] A resposta imunológica celular foi outro dos parâmetros medido neste estudo. Para isto, foram extraídas as células do baço dos animais imunizados com a formulação tetravalente Tetra DIIlC, 30 dias depois da última dose e foi medida a secreção de IFN-e, no so- brenadante de cultivo dos esplenócitos, logo depois da estimulação com as quatro proteínas recombinantes. Como controle negativo, foram empregados os esplenócitos dos camundongos inoculados com a formulação de placebo. Os resultados obtidos são mostrados na Figu- ra 11. Tal como se pode apreciar, foram detectados elevados níveis de secreção de IFN-e depois da estimulação com as quatro proteínas re- combinantes, o que indica uma equivalência na resposta celular obtida para cada sorotipo.

[0078] Finalmente, foi realizado o ensaio de proteção no modelo de encefalite viral em camundongos. Para este experimento, foram selecionados os animais imunizados com a formulação tetravalente Tetra DIIIC, com as formulações monovalentes DIIIC-1 e DIIlC-4, os animais de controle positivos (imunizados com VD1 e VD4, respectivamente) e aqueles imunizados com a formulação placebo. Por sua vez, os vírus de estimulação a ser empregados foram VD1 e VD4, que podem provocar a morte dos animais. Tal como se pode apreciar na Figura 12, foram obtidos elevados níveis de proteção contra os soroti- pos 1 e 4, tanto com as formulações monovalentes quanto com a formulação tetravalente, em todos os casos, sem diferenças estatísticas com respeito ao grupo de controle viral (p > 0,05). Estes resultados indicam a capacidade de proteção contra os sorotipos 1 e 4 das formulações ensaiadas, com base nas proteínas DIlIC agregadas com o oli- gonucleotídeo de SEQ ID NO. 1.

EXEMPLO 5. Avaliação imunológica em primatas não humanos da formulação tetravalente Tetra DlIIC.

[0079] A formulação tetravalente Tetra DIIIC ensaiada em camun dongos foi avaliada de maneira similar em primatas não humanos. Foram conformados três grupos de estudo, de três animais cada um, para receber a formulação tetravalente por três vias diferentes de administração do antígeno: Grupo 1: subcutânea, Grupo 2: intradérmica e Grupo 3: intramuscular. Nos grupos 1 e 3 foram administrados 50 μg de cada proteína quimérica, previamente adicionadas com 5 μg do oli- gonucleotídeo de SEQ ID NO. 1, todas misturadas e adjuvadas em alumina. No grupo 2 que ia receber o imunógeno por via intradérmica foram inoculadas 10 vezes menos da dose administrada pelas outras duas vias, ou seja, 5 μg de cada proteína e 2 μg totais de oligonucleo- tídeo de SEQ ID NO. 1, todas mescladas e adjuvadas em alumina. Além disso, foi incluído um grupo placebo que recebeu a mesma quantidade de oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1 que os grupos 1 e 3, adjuvado em alumina e administrado por via intramuscular. Foram realizadas sangrias no momento de cada dose e um mês depois das mesmas, para medir a resposta imunológica humoral e celular induzida.

[0080] A detecção de anticorpos reativos a cada sorotipo viral foi determinada por meio de um ensaio ELlSA de captura, através do qual foram determinados os títulos por diluição ao ponto final dos soros destes animais. Na Figura 13 é representada a resposta de anticorpos antivirais gerada em macacos depois das três doses da formulação Tetra DIIIC incluindo o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1. Tal como se pode apreciar, independentemente da via de administração do antíge- no, nos macacos foi gerada uma resposta de anticorpos que podem reconhecer os quatro sorotipos virais em um sistema de ELlSA de captura. Além disso, esta resposta mostrou um padrão de homogeneidade para os quatro VD, sendo este um resultado importante para o desenvolvimento de uma vacina contra este patógeno humano, onde se requer uma resposta imunológica balanceada.

[0081] A medição dos anticorpos neutralizantes foi feita por meio da técnica de neutralização por redução de número de placas, em células VERO, e empregando as cepas virais VD1 Jamaica, VD2 S88553, VD3 Nicarágua e VD4 Dominica. Os valores obtidos depois da terceira imunização são refletidos na Tabela 5. Tabela 5. Títulos de anticorpos neutralizantes em primatas não humanos imunizados com a formulação tetravalente Tetra OlllC que inclui o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1.

[0082] Todos os animais imunizados com a formulação Tetra DIIIC geraram uma resposta de anticorpos que pode neutralizar a infecção viral in vitro, independentemente da via de administração do antígeno. A geração de uma resposta humoral neutralizante, com 100% de animais que responderam aos quatro sorotipos virais, constitui atualmente uma premissa no desenvolvimento de uma vacina contra a dengue. No caso do grupo placebo, os títulos neutralizantes foram inferiores a 20 em todos os animais imunizados.

[0083] A resposta imunológica celular foi outro dos parâmetros medidos. As CMSPs foram estimuladas com cada uma das proteínas recombinantes DIlIC, e foi medida a frequência de células produtoras de IFN-e, através de um ensaio ELlSPOT. Na Figura 14 são mostrados os valores obtidos. Logo depois da administração de três dose da formulação tetravalente Tetra DIIIC, foram geradas nos animais células que podem secretar a citocina antiviral, ante a estimulação com as proteínas recombinantes, sendo relativamente maior a resposta nos animais imunizados por via intramuscular. Em todos os grupos ensaiados foram obtidos 100% de animais que responderam às quatro proteínas ensaiadas.

EXEMPLO 6. Avaliação imunológica em camundongos da administração combinada das formulações bivalentes e tetravalente das proteínas DIIIC e oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1, em regime de sensibilização-reforço.

[0084] Com o objetivo de administrar somente duas doses de cada formulação de proteína OIIIC, em um mesmo esquema de imunização, foi realizado o seguinte projeto experimental: Grupo Sequencial I dose 1: Formulação bivalente DIIIC-1/DIIIC-2 dose 2: Formulação bivalente DIlIC-3/DIIIC-4 dose 3: Formulação tetravalente Tetra DIll/C Grupo Sequencial II dose 1: Formulação bivalente DIlIC-1/DIIIC-3 dose 2: Formulação bivalente DIIIC-2/DIIIC-4 dose 3: Formulação tetravalente Tetra DIlIC Grupo Tetra DIlIC: Todas as doses de formulação tetravalente Tetra DIIIC

[0085] As proteínas quiméricas DIIIC, previamente agregadas com o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1, foram misturadas para formar tanto as formulações bivalentes quanto a formulação tetravalente. O imunógeno compreendia 20 μg de cada proteína e 4 μg de oligonucle- otídeo de SEQ ID NO. 1 por formulação bivalente. As quantidades de proteína para a formulação tetravalente eram de 20 μg cada uma e 8 μg totais de oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 1. Todas as variantes foram formuladas em alumina como adjuvante base, e foram inoculadas a cada 15 dias, por via intraperitoneal.

[0086] O grupo que recebeu somente a formulação tetravalente Tetra DIIIC foi usado como controle positivo, e o grupo placebo como controle negativo.

[0087] Depois da terceira dose, a detecção de anticorpos reativos a cada vírus foi determinada por meio de um ensaio ELIA de captura (Figura 15), através do qual foram determinados os títulos por diluição ao ponto final dos soros destes animais. Como resultado, o que se obteve é que não havia diferenças estatisticamente significativas entre os grupos ensaiados, para nenhum dos 4 sorotipos virais, o que indica que é possível, através de administrações sequenciais de formulações bivalentes e um reforço com a formulação tetravalente Tetra DlllC, obter os mesmos níveis de imunogenicidade que aqueles ao administrar três dose com a formulação tetravalente.

[0088] Além disso, também foi medida a resposta imunológica ce lular. Foram extraídas as células do baço dos animais imunizados de cada grupo de ensaio, 30 dias depois da última dose, e foi medida a secreção de IFN-e no sobrenadante de cultivo dos esplenócitos, logo depois da estimulação com as quatro proteínas recombinantes. Como controle negativo foram empregados os esplenócitos dos camundongos inoculados com a formulação placebo. Os resultados obtidos são mostrados na Figura 16. Tal como se pode apreciar, foram detectados elevados níveis de secreção de IFN-e depois da estimulação com as quatro proteínas recombinantes em todos os grupos (exceto no placebo), o que indica uma equivalência na resposta celular obtida, independentemente do regime de imunização empregado e das formulações bivalentes administradas nas duas primeiras doses.

Claims (12)

1. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a) pelo menos um antígeno recombinante que compreende os aminoácidos 1 a 99 da proteína do capsídeo do vírus da dengue (VD) e b) o oligonucleotídeo identificado como SEQ ID NO. 1.

2. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o antígeno recombinante que compreende os aminoácidos 1 a 99 da proteína do capsídeo do vírus da dengue (VD) é um antígeno quimérico que é selecionado dentro do grupo consistindo na SEQ ID NO. 5 (antígeno DllIC-1), SEQ ID NO. 6 (antí- geno DllIC-2), SEQ ID NO. 7 (antígeno DllIC-3) e SEQ ID NO. 8 (antí- geno DlllC-4).

3. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelo fato de que compreende dois dos antígenos quiméricos que são selecionados dentro do grupo consistindo na SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 e SEQ ID NO. 8.

4. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende quatro antígenos quiméricos identificados como SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 e SEQ ID NO. 8.

5. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que é a sequência identificada como SEQ ID NO. 1.

6. Uso do ácido nucleico identificado como SEQ ID NO. 1, caracterizado pelo fato de é na preparação de um medicamento para incrementar a resposta imunológica contra um antígeno de vacina, em que dito antígeno compreende um antígeno recombinante que compreende os aminoácidos 1 a 99 da proteína do capsídeo do vírus da dengue (VD).

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o antígeno recombinante que compreende os aminoácidos 1 a 99 da proteína do capsídeo do vírus da dengue (VD) é um antíge- no quimérico que é selecionado dentro do grupo consistindo na SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 e SEQ ID NO. 8.

8. Uso de uma composição de vacina que compreende a) pelo menos um antígeno recombinante que compreende os aminoáci- dos 1 a 99 da proteína do capsídeo do vírus da dengue (VD) e b) o oligonucleotídeo identificado como SEQ ID NO. 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para induzir uma resposta imunológica contra o vírus da dengue (VD).

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o antígeno recombinante que compreende os aminoácidos 1 a 99 da proteína do capsídeo do vírus da dengue (VD) é um antíge- no quimérico que possui uma sequência de aminoácidos que é selecionado dentro do grupo consistindo na SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 e SEQ ID NO. 8.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os antígenos quiméricos identificados como SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 e SEQ ID NO. 8 são administrados de maneira sequencial em composições bivalentes.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que também é administrada uma dose de reforço que compreende a composição tetravalente dos quatro antígenos quiméricos identificados como SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 e SEQ ID NO. 8.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a composição de vacina que compreende a) pelo menos um antígeno recombinante que compreende os aminoácidos 1 a 99 da proteína do capsídeo do vírus da dengue (VD)e b) o oligonucleotídeo identificado como SEQ ID NO. 1 é administrado por via subcutânea, intradérmica ou intramuscular.

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