BR112015014926B1 - combinação compreendendo fator tecidual lipidado, trombina e fibrinogênio, composição selante, composição farmacêutica, uso da referida combinação e kit - Google Patents

Abstract

resumo patente de invenção: "composições selantes". a invenção fornece uma combinação que compreende trombina, fibrinogênio e fator tecidual lipidado, assim como composições selantes que os compreendam e seu uso como um agente selante assim como no tratamento de hemorragias. a combinação e as composições da invenção mostram propriedades hemostáticas e, ao mesmo tempo, a qualidade do coágulo formado é tão consistente que a eficiência selante está aperfeiçoada em relação aquelas composições selantes da técnica anterior.

Description

COMBINAÇÃO COMPREENDENDO FATOR TECIDUAL LIPIDADO, TROMBINA E FIBRINOGÊNIO, COMPOSIÇÃO SELANTE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DA REFERIDA COMBINAÇÃO E KIT.

[001] A presente invenção está no campo das composições selantes.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA [002] O conjunto de mecanismos fisiológicos desencadeados para parar um sangramento depois de uma lesão é conhecido como hemostasia. A hemostasia é um processo muito complexo que envolve uma variedade de moléculas e tipos celulares. Para facilitar seu estudo, a hemostasia pode ser subdividida em quatro etapas superpostas: i) vasoconstricção, ii) formação na área da lesão de um plugue de plaquetas inicial, iii) formação de um coágulo de fibrina resistente (cascata da coagulação) e iv) uma etapa de dissolução do coágulo ou fibrinólise, a partir da qual o processo de cicatrização da lesão se inicia.

[003] A via extrínseca da cascata de coagulação é iniciada depois da interação do Fator VII (FVII), em sua forma solúvel e inativa no plasma, com seu receptor específico conhecido como fator tecidual (daqui por diante referido como TF). Em sua forma nativa, TF está localizado predominantemente sobre a superfície de vários tipos celulares que circundam os vasos sanguíneos. Portanto, sob condições normais, ele contata unicamente com moléculas plasmáticas no caso de uma lesão ou ferimento. Depois da ruptura de um vaso sanguíneo, a cascata de coagulação é iniciada pela interação de TF com FVII, desencadeando a interação subsequente entres os vários fatores de coagulação sanguínea. O resultado final é a formação de trombina (FIIa) que, por sua vez, converte o fibrinogênio (FI) que é muito abundante no plasma, nas fibras de fibrina. Essas fibras de fibrina são insolúveis e formam uma rede que, junto com as plaquetas, resulta naquilo que é conhecido como um coágulo de fibrina.

[004] Com o objetivo de facilitar uma rápida hemostasia nos ca

Petição 870160075343, de 14/12/2016, pág. 5/20

2/47 sos de hemorragia maciça, vários procedimentos têm sido usados durante séculos, tais como pressão direta, curativo com gaze, fios como suturas e o torniquete. Essas técnicas, embora eficazes, são conhecidas como meios hemostáticos não ativos e auxiliam no processo hemostático quando usados com diferentes tipos de curativos.

[005] Na tentativa de aperfeiçoar configurações hemostáticas cirúrgicas, durante as últimas décadas um grande esforço tem sido feito para o desenvolvimento de novos produtos que contenham ingredientes ativos que, em adição às técnicas tradicionais, possam auxiliar no aperfeiçoamento da hemostasia. Com relação a isso, as colas teciduais ou selantes de fibrina (daqui por diante referidos como FS), representam novas estratégias para uma indústria de produtos hemostáticos/adesivos que está evoluindo rapidamente. O conceito de uso de um FS para selar as bordas de lesões é uma ideia relativamente nova. De fato, o FDA aprovou o uso do primeiro FS aceito (Tisseel, Baxter) em 1988. Desde então, selantes de fibrina comercialmente preparados, tais como Tiseel (Immuno, Viena, Austria), Beriplast (Behringwerke AG), Tissued (Baxter), e Biocol (CRTS) têm sido usados intensamente em todo o mundo por quase 15 anos.

[006] FS possuem várias aplicações cirúrgicas e consistem, primariamente, em Fl, Fila, cloreto de cálcio e, ocasionalmente, Fator VXIII (FXIIIa) ativado. Em algumas preparações ou em indicações selecionadas, um agente antifibrinolítico é incluído (aprotinina, ácido tranexâmico) para evitar a lise do coágulo. Os FS são designados para mimetizar o estágio final da cascata de coagulação durante a qual, devido a ação catalítica de Fila, Fl é transformado em fibrina. As fibras de fibrina formadas se associam intimamente a plaquetas e dão origem à formação do coágulo de fibrina. Em tal interação, FXIIIa desempenha um papel importante, já que sua presença permite que o arranjo da rede de fibrina resultante adquira a conformação estrutural

3/47 ótima em termos de resistência e elasticidade.

[007] Os FS fornecem Fl e Fila em concentrações muito maiores do que eles estão presentes naturalmente no sangue, permitindo dessa maneira uma rápida formação de um coágulo sólido. Portanto, eles polimerizam independentemente de outros componentes sanguíneos e até funcionam melhor na ausência de sangue.

[008] Como a polimerização de Fl e Fila é muito rápida (menos do que 5 segundos), ambos componentes devem ser mantidos em frascos separado até seu uso. Portanto, FS comercializados são apresentados em duas seringas independentes cujos conteúdos são misturados no local da aplicação.

[009] O mecanismo de ação de FS é apoiado pela criação de um coágulo forte que atua como uma barreira de vedação no local de aplicação. FS são indicados para serem usados sobre áreas lesionadas onde a perda de fluidos corporais tais como o sangue, bile, etc., ocorre. Eles também podem ser usados para a prevenção de vazamento de ar em lesões pulmonares. Em adição a sua função como agentes de vedação, FS podem ser usados em várias aplicações médicas como: i) matriz para a cicatrização de uma lesão, ii) substrato para adesão tecidual e iii) liberação de fármaco.

[0010] É bem conhecido no estado da técnica que uma composição selante deve ser dupla, mostrando ambas atividades hemostática e selante.

[0011] Em contraste com FS convencionais que consistem em componentes duplos isolados (Fila e Fl), WO97/29792 descreve uma composição de Fl de componente único sem Fila. A combinação de TF e Fl não induz a formação de um coágulo estável. Portanto, em adição à TF e Fl, vários fatores de coagulação são necessários. Esse documento descreve a necessidade de incluir Fll, FV, FVII, FX e FXIII para induzir um coágulo. Portanto, a fim de ser eficaz, a composição

4/47 selante descrita em WO97/29792 é aplicada sobre sangue saudável ou, alternativamente, deve conter também os fatores de coagulação que faltam (Fll, FV, FVII, FX e FXIII) em concentrações fisiológicas.

[0012] Apesar dos esforços feitos, portanto, ainda há uma necessidade de composições adicionais capazes de evitar efetivamente a migração de fluido de ou para um tecido, que mostrem ambas atividades hemostática e de vedação apropriadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0013] Os inventores da presente invenção descobriram que pela adição de TF lipidado a composições de FS já conhecidas, que compreendem ambos trombina e fibrinogênio, há uma melhora substancial no perfil hemostático. Em adição, o coágulo resultante da aplicação da combinação da invenção mostra uma consistência maior, que é indicativo de sua eficiência na vedação de um ferimento/lesão hemorrágica. Isso significa que uma combinação que compreende pelo menos trombina, fibrinogênio e TF lipidado é uma composição selante promissora que supera/aperfeiçoa o efeito duplo hemostático/selante das composições de FS já conhecidas.

[0014] Essa melhoria substancial no perfil hemostático é devida principalmente à capacidade de propagação da combinação coagulante próximo de seu sítio de aplicação. Esse efeito de propagação é extremamente importante não apenas no sangue saudável, mas também no sangue cuja atividade dos componentes hemostáticos cruciais, tais como Fila e FX, está prejudicada pela administração de certos fármacos amplamente usados em cirurgia, tais como heparinas. Inesperadamente, a propagação do coágulo observada com a combinação da invenção supera o estágio anticoagulante do sangue tratado com heparinas. Nenhum documento da técnica anterior que descreve composições selantes, descreve sua eficácia com base na capacidade de propagação do coágulo na área próxima ao local de aplicação.

5/47 [0015] Isso significa que uma combinação que compreenda pelo menos trombina (Fila), fibrinogênio (Fl) e TF lipidado é uma composição selante promissora que supera/aperfeiçoa o efeito duplo hemostático/selante das composições de FS já conhecidas.

[0016] Portanto, em um aspecto, a presente invenção fornece uma combinação que compreende um fator tecidual lipidado, trombina e fibrinogênio.

[0017] Na FIG. 1(A), é mostrado que quando o fator tecidual lipidado é adicionado a uma composição selante comercial, Tissucol® (que compreende trombina e fibrinogênio), a coagulação induzida no plasma (através da propagação do coágulo no plasma saudável em uma distância de 3 cm do local da aplicação) ocorre em um período de tempo substancialmente menor do que aquele necessário quando apenas Tissucol® é usado. De fato, como pode ser derivado a partir desses dados, quando a coagulação é de cerca de 50% com a combinação da invenção (triângulo preto), a combinação da técnica anterior (Tissucol®, quadrado cinza) começa a coagular a amostra de plasma. É notável e primeiramente aqui descrito, que essa diferença é até maior no caso de plasma tratado com heparina na dose terapeuticamente menor (FIG. 1B) e a diferença é máxima quando a dose terapeuticamente maior de heparina foi usada (FIG. 1C). Nesse último caso, o plasma tratado com heparina não começa sequer a coagular com 7 min depois da aplicação de FS. Portanto, pela adição de TF lipidado a um FS que compreende Fila e Fl, é obtido um aperfeiçoamento substancial no perfil hemostático.

[0018] Isso significa que administrando a combinação descrita na invenção, muito menos tempo é necessário para parar o sangramento. Isso tem relevância especial nos casos de pacientes tratados com heparina, em que compressões com trombina ou outros produtos hemostáticos não são eficientes o suficiente para parar o sangramento, ha

6/47 vendo um alto risco que o paciente morra.

[0019] Adicionalmente, os presentes inventores descobriram que a combinação que compreende fibrinogênio, trombina e fator tecidual mostra um efeito selante surpreendente. Como é explicado abaixo, no Exemplo 4, uma combinação que compreende trombina, fator tecidual lipidado e fibrinogênio, quando aplicada a uma amostra de plasma heparinizado, se dissemina substancialmente mais rápido através dele do que uma combinação selante que não inclui o TF lipidado. Adicionalmente, foi observado que o coágulo obtido com a combinação que inclui o fator tecidual, trombina e fibrinogênio tem uma consistência muito maior do que o coágulo obtido com Tissucol® (isto é, que não inclui o fator tecidual lipidado). Sem estar ligado a teoria, os presentes inventores acreditam que o fator tecidual está embebido na rede de fibrina formada (devido a trombina e fibrinogênio incluídos na combinação) e que devido a essa distribuição do fator tecidual dentro da rede de fibrina, ocorre um efeito de expansão do coágulo, dando origem à vedação eficiente do ferimento ou da lesão. O fato de que o coágulo obtido com a combinação da invenção mostra uma consistência melhor com relação àquela obtida com Tissucol®, significa que a combinação da invenção é mais eficaz na prevenção da migração do sangue, que é mais eficaz na vedação do ferimento ou da lesão, reduzindo substancialmente o risco de quebra do coágulo.

[0020] É notável que a disseminação do coágulo formado pela composição ternária da presente invenção em ambos os plasmas normal e tratado com heparina, não pudesse ter sido antecipada pelos ensinamentos de WO97/29792. Em particular, esse documento descreve composições selantes sem trombina que incluem tromboplastina. No dito documento, página 6, linhas 6-8, é estabelecido que a inclusão de tromboplastina como iniciador da formação do coágulo de fibrina pode aperfeiçoar as qualidades hemostáticas do adesivo. Entre

7/47 tanto, os dados experimentais fornecidos no Exemplo II (também resumidos na Tabela VI) mostram que o tempo necessário para a hemostasia é substancialmente o mesmo ou até maior que o tempo requerido para adesivos teciduais da técnica anterior. O que significa que ele é um agente hemostático igual ou pior do que as composições da técnica anterior. Portanto, os dados experimentais fornecidos no WO97/29792 não motivaram à pessoa versada na técnica a adicionar o fator tecidual lipidado a uma composição que compreende trombina e fibrinogênio a fim de obter uma composição selante com propriedades hemostáticas aperfeiçoadas. Pelo contrário, a partir dos ensinamentos desse documento, a pessoa experiente não esperaria qualquer aperfeiçoamento substancial no efeito hemostático de uma composição com a adição de tromboplastina.

[0021] Os inventores da presente invenção tentaram reproduzir o conteúdo de WO97/29792 a fim de determinar qual o efeito do fator tecidual lipidado quando ele é adicionado a uma composição selante sem trombina. Como está resumido na Tabela I abaixo, as composições de WO97/29792 mostram valores de MCF e G muito baixos, quando comparados com aqueles de algumas composições selantes comerciais. Como a pessoa experiente sabe, quanto maiores são os valores de G e MCF, melhores os perfis hemostático e selante terá a composição. Portanto, a partir dos resultados resumidos na Tabela I abaixo, a pessoa experiente concluirá que a inclusão do fator tecidual lipidado em uma composição selante sem trombina, como descrita no WO97/29792, não aperfeiçoará o perfil hemostático de tal composição. [0022] Finalmente, WO97/29792 é silenciosa a cerca do efeito da adição de fator tecidual lipidado sobre o perfil selante de composições selantes de trombina.

[0023] Concluindo, a partir de WO97/29792 a pessoa experiente não teria motivação para adicionar fator tecidual lipidado a uma com

8/47 posição selante com a expectativa de obter um aperfeiçoamento substancial nos perfis hemostático e selante.

[0024] Surpreendentemente, os inventores da presente invenção, como ficou estabelecido acima, descobriram que incluindo o fator tecidual lipidado em uma composição que compreende trombina e fibrinogênio, é obtido um aperfeiçoamento substancial nos perfis hemostático e selante.

[0025] Portanto, devido às excelentes propriedades hemostática e selante da combinação que compreende trombina, fibrinogênio e fator tecidual lipidado, tal combinação pode ser usada na formulação de uma composição selante junto com um material de veículo apropriado.

[0026] Portanto, em um segundo aspecto, a presente invenção fornece uma composição selante que compreende a combinação como definida no primeiro aspecto da invenção e um material de veículo.

[0027] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece o uso da combinação do primeiro aspecto da invenção como um agente selante.

[0028] Devido às propriedades da combinação e composição de selante da invenção, elas podem ser usadas na forma de composições farmacêuticas ou veterinárias.

[0029] Portanto, em um quarto aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica ou veterinária que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz da combinação como definidas acima junto com outros excipientes e/ou veículos farmaceuticamente apropriados ou veterinários aceitáveis.

[0030] Como foi discutido acima, a combinação e a composição da invenção, devido aos seus efeitos hemostático e selante, são úteis no tratamento de hemorragias.

[0031] Portanto, em um quinto aspecto, a presente invenção fornece a combinação ou composição como definidas acima para uso

9/47 como um medicamento. Esse aspecto pode ser formulado como um método para o tratamento de uma doença, compreendendo administrar a um indivíduo necessitado uma quantidade terapeuticamente eficaz da combinação ou composição como definidas acima junto com outros excipientes e/ou veículos farmaceuticamente apropriados ou veterinários aceitáveis.

[0032] Em um sexto aspecto, a presente invenção fornece a combinação ou composição como definidas acima para uso no tratamento de hemorragias.

[0033] Esse aspecto pode ser formulado alternativamente como o uso de uma combinação ou composição como definidas acima na fabricação de um medicamento para o tratamento de hemorragias. Esse aspecto pode ser formulado alternativamente como um método para o tratamento de hemorragias, o método compreendendo administrar a um indivíduo necessitado uma quantidade terapeuticamente eficaz da combinação ou composição da invenção.

[0034] A frequência de uso de FS comerciais como adesivo ou selante em várias configurações cirúrgicas abre a possibilidade de seu uso como um veículo para a liberação lenta de fármacos relevantes.

[0035] Com relação a isso, vários FS contendo antibióticos têm sido testados para reduzir as infecções oculares pós-operatórias e para o tratamento de infecções peritoneais localizadas. Foi descoberto que tais composições melhoram o efeito terapêutico da substancia ativa devido ao tempo prolongado em que elas podem permanecer aderidas sobre o local. Portanto, combinações e composições da invenção que compreendem trombina, fibrinogênio e TF lipidado que contêm também outras moléculas ativas, tais como antibióticos, fatores do crescimento, agentes quimioterapêuticos, anestésicos tópicos ou vetores baseados em DNA podem fornecer um efeito terapêutico aumentado.

10/47 [0036] Em um aspecto adicional, portanto, a presente invenção fornece o uso da combinação ou da composição da presente invenção como um sistema de liberação de fármaco.

[0037] Também já foi descrito no estado da técnica o uso de FS para auxiliar com a construção de pele, cartilagem e ossos. Portanto, a combinação proposta de FS mas TF lipidado poderá ser usada também como um arcabouço aperfeiçoado para o acoplamento celular e para o crescimento de um novo tecido. Esse potencial pode ser amplificado pelo efeito angiogênico bem conhecido de TF.

[0038] Portanto, em um aspecto adicional, a presente invenção fornece o uso de uma combinação ou composição da presente invenção como um agente cicatrizante de lesões. Finalmente, a combinação da invenção ou qualquer uma das composições do segundo e terceiro aspectos da invenção pode ser fornecida como um kit.

[0039] Portanto, em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um kit que compreende a combinação como definida no primeiro aspecto da invenção e um aplicador que permita a aplicação simultânea de fibrinogênio, trombina e fator tecidual lipidado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0040] A FIG. 1 mostra a progressão da coagulação nas amostras de plasma normal (A) ou plasma tratado com heparina (B e C) em diferentes tempos depois da adição da composição de FS comercializada sob o nome comercial de Tissucol® (quadrado cinza) ou uma combinação de TF lipidado e Tissucol® (triângulo preto). A coagulação foi determinada 3 cm fora do local da aplicação do item de teste. Eixo de Y = % de coagulação; eixo de X = tempo (A segundos, B e C minutos).

[0041] A FIG. 2 representa a perda de sangue em mL/kg para cada rato correspondendo aos grupos tratados com diferentes produtos: Tissucol® (FS), Tissucol® + TF lipidado e controle (não tratado). Cada ponto (triângulo ou quadrado) representa o valor da perda de sangue

11/47 de um único animal e cada uma das linhas horizontais represente a média de cada grupo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0042] Como já foi estabelecido acima, a combinação da presente invenção contém trombina, fibrinogênio e fator tecidual lipidado.

[0043] Na presente invenção, a expressão fator tecidual (TF) deve ser compreendida como uma glicoproteína da membrana íntegra que está amplamente distribuída no reino animal. TF aparece em diferentes tipos celulares, predominantemente no tecido subendotelial e é necessária para a iniciação da via extrínseca da cascata de coagulação levando a produção de Fila e a formação de um coágulo de fibrina estável. Proteínas TF exemplificadoras que podem ser usadas na presente invenção incluem TF humana (UniProtKB/Swiss-Prot. Versão 148, novembro de 2012, número de acesso P13726), TF de camundongo (UniProtKB/Swiss-Prot. Versão 103, novembro de 2012, número de acesso P20352), TF bovina (UniProtKB/Swiss-Prot. Versão 89, novembro de 2012, número de acesso P30931), TF de coelho (UniProtKB/Swiss-Prot. Versão 90, novembro de 2012, número de acesso P24055) e proteínas TF de diferentes animais.

[0044] A proteína TF humana com o número de acesso P13726 de SwissProt tem uma estrutura de domínio bem definida que compreende (1) um peptídeo de sinal ou uma região com uma sequência líder com 32 aminoácidos que é processada depois da tradução da forma imatura para a madura; (2) um domínio extracelular hidrofílico Nglicosilado que compreende 219 aminoácidos; (3) um fragmento altamente hidrofóbico de 23 aminoácidos que forma o domínio transmembrana; e (4) a terminação carboxila com 21 aminoácidos que é o fragmento citoplasmático da proteína.

[0045] Em uma modalidade particular, o TF corresponde ao TF maduro.

12/47 [0046] A expressão TF maduro como usada aqui, se refere à proteína TF cuja sequência de aminoácidos carece do peptídeo de sinal. Em uma modalidade, a dita proteína TF madura é o TF humano maduro de SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, o TF é glicosilado.

[0047] Como usada aqui, a expressão glicosilada inclui qualquer grau de glicosilação. Como TF maduro contém vários sítios de glicosilação, como explicado em detalhes abaixo. A expressão fator tecidual também abrange aquelas formas da proteína que mostram diferentes graus de glicosilação, as ditas formas sendo obtidas pela expressão de TF em hospedeiros capazes de realizar as reações de Nglicosilação.

[0048] Em adição, a expressão fator tecidual também abrange aquelas variantes que resultam da inserção, deleção ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência nativa de TF. Ensaios funcionais adequados que podem ser usados para avaliar se um dado polipeptídeo é uma variante funcional de TF são aqueles ensaios baseados na determinação da habilidade da variante de TF de se ligar especificamente a FVIIa ou na determinação in vitro do tempo de coagulação no plasma ou sangue total, por um ensaio in vitro em um modelo anima de hemorragia severa ou pelo ensaio in vivo em um modelo animal de hemorragia letal.

[0049] Tais variantes de acordo com a presente invenção incluem sequências de aminoácidos que são pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 96% idênticas às moléculas nativas de TF mencionadas acima. Como conhecido na técnica, a identidade entre duas proteínas é determinada pela comparação da sequência de aminoácidos e seus aminoácidos substitutos conservados de uma proteína com uma sequência de uma segunda proteína. O grau de identidade entre duas proteínas é determinado usando algoritmos de computador e métodos que são amplamente conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.

13/47

A identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada preferivelmente usando o algoritmo BLASTP.

[0050] O TF pode ser completamente glicosilado, parcialmente glicosilado ou não glicosilado.

[0051] No presente pedido, completamente glicosilado significa que todos os sítios de glicosilação em potencial foram glicosilados.

[0052] No presente pedido, parcialmente glicosilado significa que pelo menos um dos três sítios de glicosilação não é funcional, não sendo possível sua glicosilação.

[0053] No presente pedido, não glicosilado significa que nenhum dos sítios de N-glicosilação é funcional ou, alternativamente, que o polipeptídeo de TF foi expresso por um método de não glicosilação in vitro (isto é, sistema de expressão sem célula) ou em um vetor privado de vias de glicosilação metabólicas (isto é, E. coli).

[0054] Em uma modalidade, o TF é parcialmente glicosilado ou não glicosilado. Nessa modalidade, o TF foi modificado de tal maneira que pelo menos um dos sítios de glicosilação não é funcional, não sendo possível a glicosilação.

[0055] Todas as proteínas TF maduras contêm três sítios de glicosilação ligados a N em potencial que possuem a sequência de consenso Asn-Xaa-Ser/Thr. No caso de TF humano maduro, tais três sítios de glicosilação estão localizados em Asn11 (sequência Asn11Leu12-Thr13), Asn124 (sequência Asn124-Val125-Thr126) e Asn137 (sequência Asn137-Asn138-Thr139), as ditas posições estando relacionadas à SEQ ID NO:1.

[0056] Em uma modalidade, o sítio ou sítios de N glicosilação que podem ser modificados para torná-los não funcionais na proteína TF humana madura são aqueles que correspondem aos sítios de Nglicosilação NLT nas posições 11-13, NVT nas posições 124-126 e NNT nas posições 137-139 na proteína TF humana madura de SEQ ID

14/47

N0:1 acima.

[0057] Em outra modalidade, o TF carrega uma ou mais substituições dos resíduos de Asn em resíduos que não são aceptores para Nglicosilação. Em uma modalidade ainda mais preferida, a variante de TF compreende uma ou mais mutações de Asn para Ala nos resíduos de Asn nas posições que correspondem às posições 11, 124 ou 137 no TF humano maduro. Preferivelmente, o TF humano maduro carrega a mutação Asn para Ala na posição 124 de SEQ ID NO:1.

[0058] A glicosilação variará dependendo do sistema de expressão usado para a produção de TF. Por exemplo, a proteína do fator tecidual pode inclui um ou mais glicano específico para planta, glicano específico para levedura, glicano específico para inseto ou glicano específico para animal.

[0059] Quando TF é produzido na levedura, a glicosilação envolverá tipicamente um núcleo interno de cerca de dez resíduos de manose, ligados à asparagina através de dois resíduos GlcNAc e uma cadeia externa ramificada de 50 a 100 resíduos de manose. Portanto, a glicosilação ligada a N pode adicionar potencialmente tantos quanto 300 resíduos de manose ao TF, um aumento de massa molecular de cerca de 60 kDa. Além disso, também é possível que vários resíduos de manose possam ser acoplados a vários sítios de glicosilação ligados a O (mais do que 25). Portanto, moléculas de TF incluídas nas combinações e composições da presente invenção possuem um grau e uma composição variáveis de glicosilação ligada a N em um ou mais sítios de N-glicosilação.

[0060] Em outra modalidade, a proteína TF é uma proteína de fusão, a dita proteína de fusão compreendendo uma primeira porção, que compreende a dita proteína TF e uma segunda porção que compreende outro peptídeo ou proteína.

[0061] A dita segunda porção pode estar ligada à primeira porção

15/47 da terminação N do dito fragmento de proteína TF ou, alternativamente, a dita segunda porção pode estar ligada à região C terminal do dito fragmento de proteína TF. Ambas as primeira e segunda porções podem estar diretamente ligadas ou ligadas através de um polipeptídeo ligante entre as ditas primeira e segunda regiões.

[0062] Em outra modalidade, a dita segunda porção é um marcador. O marcador pode estar ligado a um domínio C terminal ou N terminal da primeira porção da proteína TF. Na presente invenção, a expressão marcador deve ser compreendida como qualquer peptídeo ou sequência de aminoácidos, ligado ao domínio C terminal ou N terminal da dita proteína TF, que pode ser usado no isolamento ou purificação da proteína de fusão. Portanto, o dito marcador é capaz de se ligar a um ou mais ligantes tais como, por exemplo, um ou mais ligantes de uma matriz de afinidade tal como um suporte de cromatografia ou uma esfera com alta afinidade. Um exemplo do dito marcador é um marcador de histidina (His-tag ou HT), tal como um marcador que compreende 6 resíduos de histidina (His6 ou H6), que pode se ligar a uma coluna de níquel (Ni²⁺) ou de cobalto (Co²⁺) com alta afinidade. Exemplos ilustrativos, não limitantes adicionais de marcadores úteis para o isolamento e a purificação de uma proteína de fusão incluem Arg-tag, FLAG-tag, Strep-tag, um epítopo capaz de ser reconhecido pelo anticorpo tal como o marcador c-myc (reconhecido pelo anticorpo anti-c-myc), SBP-tag, S-tag, peptídeo que se liga a calmodulina, domínio de ligação da celulose, domínio de ligação de quitina, marcador de glutationa S-transferase, proteína de ligação a maltose, NusA, TRxA, DsbA, Avi-tag, entre outros, uma sequência de aminoácidos tal como Ala-His-Gly-His-Arg-Pro (SEQ ID NO:2); Pro-lle-His-Asp-His-Asp-HisPro-His-Leu-Val-lle-His-Ser (SEQ ID NO:3); Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys (SEQ ID NO:4); β-galactosidase e semelhantes.

[0063] Foi descrito previamente que His-tag, usado para o isola

16/47 mento ou purificação de TF recombinante, tem a característica desejável de que ele se liga a seus ligantes sob condições que são desnaturantes para a maioria das proteínas e que rompem as interações de proteína-proteína. Portanto ele pode ser usado para remover a isca de proteína marcada com H6 depois da ruptura das interações de proteína-proteína com as quais a isca tenha participado.

[0064] Portanto, em uma modalidade, o marcador é His-tag. Em outra modalidade, tal His-tag está ligado ao domínio C terminal da primeira porção da proteína TF. Em outra modalidade, tal His-tag está ligado ao domínio N terminal da primeira porção da proteína TF.

[0065] Em outra modalidade, a primeira porção da proteína de fusão compreende a proteína TF madura, preferivelmente, a proteína TF humana madura. Em outra modalidade, a primeira porção é p TF maduro humano.

[0066] Em outra modalidade, a proteína de fusão tem uma primeira porção que compreende o fator tecidual humano maduro com pelo menos um dos sítios de N glicosilação não sendo funcional e uma segunda porção que compreende um His tag. Em uma modalidade preferida, o fator tecidual é uma proteína de fusão que compreende uma TF humana de SEQ ID NO:5 que: (a) carece da sequência de sinal, (b) tem uma mutação N124A no sítio de glicosilação, (c) tem um marcador de hexa-histidina na terminação C.

[0067] A dita proteína de fusão pode ser obtida por meios convencionais, por exemplo, por meio da expressão de gene da sequência de nucleotídeos que codifica a dita proteína de fusão em uma célula de levedura adequada. O marcador eventual pode ser usado, se desejado, para o isolamento ou a purificação da dita proteína de fusão.

[0068] A expressão fator tecidual lipidado (TF) como usada aqui se refere a qualquer fonte de TF sendo esse TF totalmente ou parcialmente inserido em vesículas lipídicas ou membranas celulares.

17/47

Exemplos ilustrativos não limitantes de fontes de TF lipidado são: 1) extrato de tecido que contém TF lipidado (cujo isolamento pode ser realizado a partir de vários tecidos tais como tecido cerebral, placentário e pulmonar, tecidos a partir de diferentes animais tais como carneiros, vacas, coelhos, cães e seres humanos, entre outros); 2) componente proteináceo de TF purificado e (re)lipidado, isto é, qual componente lipídico (fosfolipídeos) foi adicionado depois da purificação de TF; e 3) extrato celular que contém TF lipidado, onde a fração lipídica se origina na célula hospedeira e TF tenha sido recombinantemente expresso.

[0069] TF purificado e (re)-lipidado pode ser preparado, por meio de um exemplo, ilustrativo, não limitante, de acordo com o protocolo previamente descrito por Mimms L. T. et al., Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside, Bichemistry , 1981, vol 20(4), p.833-840. No dito protocolo, TF não lipidado é incorporado dentro de vesículas de fosfolipídeo usando um detergente não iônico, tal como N-octil-beta-D-galactopiranosídeo, por exemplo. Os fosfolipídeos que podem ser usados no TF lipidado de acordo com a invenção podem ter qualquer origem (animal, planta ou sintético). Virtualmente qualquer fosfolipídeo pode ser usado na preparação do TF lipidado dessa invenção. Exemplos ilustrativos, não limitantes de fosfolipídeos que podem ser usados na preparação de TF lipidado incluem fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, etc. A proporção (molar, em peso, volumétrica) de componente proteináceo:fosfolipídico de TF pode variar dentro de uma grande faixa, por exemplo, entre cerca de 1:50000 a cerca de 1:3000. Em uma modalidade particular, o TF lipidado é um TF lipidado humano e consiste no componente proteináceo de um TF isolado de um tecido humano ou a partir de células recombinantes e inserido em uma membrana lipídica em uma proporção adequada de componente proteináceo:fosfolipídico

18/47 de TF. As proporções molares preferidas da composição de lipídeo (preferivelmente fosfatidilcolina e fosfatidilserina) para obter uma atividade ótima de TF é bem conhecida no estado da técnica.

[0070] No que diz respeito à preparação de um extrato celular que contém TF lipidado onde a fração lipídica se origina da célula hospedeira e TF tenha sido recombinantemente expresso, como a molécula de TF contém um grande domínio hidrofóbico, é razoável presumir que a clonagem do gene de rTF em qualquer um dos sistemas de expressão eucariótica resulte na expressão ou na proteína TF recombinante (rTF) associada às membranas lipídicas das células hospedeiras. Nessa associação, será possível que os componentes membranosos do hospedeiro possam mimetizar ou fornecer um arcabouço similar ou idêntico às moléculas de rTF como aqueles encontrados nas células de mamífero aos quais TF normalmente se associa. Portanto, a purificação desses componentes membranosos resultará em uma fonte disponível de rTF lipidado. Devido a sua composição química, esses componentes membranosos lipídicos isolados serão encontrados predominantemente na forma de vesículas de diferentes tamanhos. Em adição a rTF, aquelas vesículas também conterão proteínas ou lipídeos específicos dependendo da origem da célula hospedeira. Portanto, as membranas lipídicas se originam de levedura, bactérias, células de origem diferente tais como insetos, mamíferos, plantas, peixes, algas, também conterão proteínas e lipídeos característicos de tais células hospedeiras).

[0071] TF compreende uma região hidrofóbica (o domínio transmembrana) que está ancorado em uma membrana lipídica, enquanto que as regiões hidrofílicas desse (isto é a região amino terminal e a região carboxi terminal da dita proteína TF) faceiam o lado exoplasmático da membrana.

[0072] TF compreende uma região hidrofóbica (o domínio trans

19/47 membrana) que está ancorado em uma membrana lipídica, enquanto que as suas regiões hidrofílicas (isto é, a região terminal amino e a região terminal carboxila da dita proteína TF) faceiam o lado exoplasmático da membrana.

[0073] Na presente invenção, a expressão membrana lipídica deve ser compreendida como uma camada organizada de poucas moléculas (lipídeos e proteínas) de espessura que forma o limite de uma célula (isto é, a célula ou membrana plasmática) ou os limites de organelas intracelulares. Tipicamente, uma membrana é composta por duas camadas lipídicas orientadas nas quais as proteínas podem estar embebidas. Uma bicamada lipídica, que é a estrutura básica das membranas de uma célula, é formada geralmente pelas moléculas anfipáticas (por exemplo, fosfolipídeos, ácidos graxos, etc) em um ambiente aquoso, cada molécula sendo orientada com o grupo hidrofílico sobre o exterior da camada e o grupo hidrofóbico para o interior da camada. Preferivelmente, o TF está ancorado em uma microvesícula lipídica.

[0074] Na presente invenção, microvesícula lipídica deve ser compreendida como um compartimento pequeno e fechado, que é composto substancialmente pelas mono ou bicamadas de lipídeos. O tamanho da microvesícula que abriga o TF da invenção pode variar dentro de uma faixa relativamente ampla, geralmente, o dito tamanho é igual ou menor do que 10 pm, tipicamente igual ou menor do que 0,5 pm. Em uma modalidade particular, o tamanho das microvesículas derivadas de levedura que abrigam TF da invenção varia entre 10 a 0,01 pm. As microvesículas são formadas pelas membranas lipídicas ou seus fragmentos, de células eucarióticas. Em uma modalidade, a microvesícula pode ser enriquecida em fosfolipídeos negativamente carregados, preferivelmente fosfatidilserina. Métodos de enriquecimento de tais microvesículas em fosfatidilserina estão descritos, por exemplo,

20/47 no WO201131658. Resumidamente, as ditas microvesículas enriquecidas com fosfolipídeos que abrigam TF podem ser preparadas pelo processo que compreende: a) submeter uma cultura de células eucarióticas recombinantes que expressam a proteína TF ou seu fragmento, que possua atividade pró-coagulante; b) peletizar as células cultivadas que resultam da fermentação da etapa a), para obter um produto de fermentação; c) submeter o dito produto de fermentação da etapa b) à homogeneização, para obter um homogenate de fermentação; e d) submeter o dito homogenato de fermentação da etapa c) à separação, para obter um pélete e um extrato de levedura clarificado (CYE) que contém as ditas microvesículas derivadas de levedura que abrigam TF que possuem atividade pró-coagulante; e, opcionalmente, f) se desejado, isolar ou purificar as ditas microvesículas derivadas de levedura que abrigam TF que possuem atividade pró-coagulante pelos procedimentos de fracionamento de tamanho e g) enriquecimento das microvesículas obtidas com fosfolipídeo negativamente carregado (isto é, fosfatidilserina) pela incubação de ambos os componentes, fosfatidilserina e microvesículas que contêm TF, como descrito no WO2011131658. Como uma etapa prévia à incubação mencionada, a fosfatidilserina pode ser preparada como vesículas multilamelares pela re-suspensão de lipídeos em uma solução tamponada seguida pela sonicação.

[0075] O método de produção de TF depende da célula eucariótica usada. Geralmente, a célula eucariótica é transformada com um vetor de expressão que compreende a sequência de nucleotídeo que codifica a proteína TF operativamente ligado com um promotor funcional em uma célula que pode ser de: fungos, levedura, planta ou animal (tal como de peixe, réptil, mamífero, inseto, etc.). O cDNA que codifica a proteína TF pode ser amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) usando uma biblioteca de cDNA como modelo e os iniciado

21/47 res apropriados. O Exemplo 1 descreve a amplificação do cDNA que codifica a proteína hTF madura com 18 nucleotídeos extras (que codificam seis histidinas) na extremidade 3'.

[0076] Em outra modalidade, a proteína TF pode ser purificada a partir das etapas a) a d) acima, de acordo com procedimentos de purificação cromatográficos bem estabelecidos. Uma vez purificada, a proteína TF pode ser lipidado in vitro com concentrações ótimas de fosfolipídeos.

[0077] Em uma modalidade adicional, TF lipidado pode ser obtido a partir de extratos de tecido animal, tal como tecido cerebral, placentário e pulmonar e tecidos de animais diferentes, tais como carneiros, vacas, coelhos, cães e seres humanos, entre outros. Preferivelmente, o TF lipidado é de um ser humano. Mais preferivelmente, o TF lipidado é recombinante humano.

[0078] Na presente invenção, a expressão trombina (Fila) deve ser compreendida como a serina protease chave que desempenha um papel essencial na hemostasia. Fila ativa muitos dos fatores de coagulação envolvidos na cascata da coagulação, incluindo o Fibrinogênio (Fl), Fator V (FV), Fator VIII (FVIII), Fator IX (FIX) e Fator XIII (FXIII). Fila também ativa as plaquetas e as células endoteliais vasculares. O precursor da trombina é o zimogênio Protrombina (FU), que é secretado no sangue a partir do fígado. Durante a cascata de coagulação, Fll é convertido em Fila em taxas diferentes primeiro pelo FX ativado (FXa) e nas últimas etapas da cascata pelo complexo de protrombinase (FXa:FVa). Fila comercial é produzido depois do isolamento de Fll do plasma humano ou de origem bovina. Depois de seu isolamento, Fll é transformado in vitro em Fila. Todos os FS atualmente comercializados contêm Fila de origem humana ou bovina. Adicionalmente, Fila humano recombinante altamente purificado também está disponível. Esse Fila humano recombinante é obtido depois da purificação de

22/47

Fll humano a partir de células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), seguida pelo seu processamento para Fila por procedimentos in vitro. [0079] Proteínas Fila exemplificadoras que podem ser usadas na presente invenção incluem Fll humana (UniProtKB/Swiss-Prot. Versão 182, novembro de 2012, número de acesso P00734), Fila bovino (UniProtKB/Swiss-Prot. Versão 153, novembro de 2012, número de acesso P00735), Fll de camundongo (UniProtKB/Swiss-Prot. Versão 141, novembro de 2012, número de acesso P19221), Fll de porco (UniProtKB/Swiss-Prot. Versão 37, novembro de 2012, número de acesso B3STX9) e proteínas Fll de diferentes animais. Preferivelmente, a trombina é de origem humana ou bovina, embora mais preferivelmente a trombina é humana e até mais preferivelmente a trombina seja recombinante humana.

[0080] Na presente invenção, a expressão fibrinogênio (Fl) corresponde à penúltima proteína na hemostasia. Fl mostra uma estrutura complexa, já que ela consiste em duas cadeias α (66 kDa), duas β (52 kDa) e duas γ (46,5 kDa), mantidas juntas por 29 ligações de dissulfeto. Fl é sintetizado no fígado e circula no plasma em uma concentração de 2 a 4 mg/mL. Durante a última etapa da cascata da coagulação, Fl é ativado para Fibrina por Fila. Os agregados de fibrina formam uma rede reticulada de fibras que, em colaboração com as plaquetas, formam o coágulo. FS atual contém fibrinogênio derivado de plasma, que é purificado a partir de sangue humano. Esse procedimento tem riscos associados de contaminação por patógeno. Esses riscos podem ser minimizados pela produção de uma versão recombinante de fibrinogênio humano. Fl recombinante humano tem sido produzido em E. coli, células de RIM de Filhote de Hamster (BHK), células de Rim de Macaco (COS-1) e células CHO. Recentemente, Fl tem sido produzido em vacas transgênicas de onde Fl recombinante é obtido do leite.

23/47 [0081] Proteínas Fl exemplificadoras que podem ser usadas na presente invenção cadeia α (UniProtKB/Swiss-Prot. Versão 174, Novembro de 2012, número de acesso P02671), cadeia β (UniProtKB/Swiss-Prot. Versão 163, Novembro de 2012, número de acesso P02675), cadeia γ (UniProtKB/Swiss-Prot. Versão 171, Novembro de 2012, número de acesso P02679); Fl bovino: cadeia α (UniProtKB/Swiss-Prot. Versão 104, Novembro de 2012, número de acesso P02672), cadeia β (UniProtKB/Swiss-Prot. Versão 102, Novembro de 2012, número de acesso P02676) e proteínas Fl de diferentes animais. Preferivelmente, o fibrinogênio incluído na combinação da invenção é de origem humana e mais preferivelmente é Fl recombinante humano.

[0082] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, a combinação compreende adicionalmente um agente de reticulação.

[0083] Em outra modalidade do primeiro aspecto da invenção, a combinação compreende adicionalmente um inibidor da fibrinólise.

[0084] Em outra modalidade do primeiro aspecto da invenção, a combinação compreende adicionalmente CaCI₂.

[0085] Em outra modalidade do primeiro aspecto da invenção, a combinação compreende adicionalmente um agente de reticulação e um inibidor da fibrinólise.

[0086] Em outra modalidade do primeiro aspecto da invenção, a combinação compreende adicionalmente um agente de reticulação, um inibidor da fibrinólise e CaCI₂.

[0087] Preferivelmente, o dito agente de reticulação é FXIII.

[0088] Preferivelmente, o dito inibidor da fibrinólise é selecionado entre aprotinina, ácido tranexâmico e ácido aminocapróico.

[0089] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece composições selantes hemostáticas que compreendem as combinações da invenção e um material de veículo.

[0090] Na presente invenção, a expressão hemostático com refe

24/47 rência a composições, efeito e uso, deve ser compreendida como uma substancia que promove a hemostasia, ou seja, que para o sangramento. Ele pode ser referido também como anti-hemorrágico e prócoagulante.

[0091] A expressão material de veículo deve ser compreendida como um substrato de material adequado que permite o depósito das combinações da invenção sobre ele, seu transporte e sua liberação no sítio desejado, por exemplo, no sítio onde as composições da invenção devem exercer seu efeito terapêutico. O dito material de veículo pode ser um suporte sólido ou um suporte não sólido, por exemplo, um suporte líquido, um suporte em pó ou um suporte gasoso. Exemplos ilustrativos, não limitantes de suportes sólidos incluem ataduras, bandaids, compressas, emplastros, etc. Exemplos ilustrativos, não limitantes de suportes líquidos incluem géis, sprays, enxaguantes bucais, etc. Exemplos ilustrativos, não limitantes de suportes gasosos incluem ar, propelentes, etc. A fabricação de tais composições pode ser obtida por métodos convencionais, por exemplo, pela misturação das combinações da invenção e o material de veículo. A interação entre os componentes da combinação e o material sólido pode ser uma interação física ou química.

[0092] Em uma modalidade, o material de veículo é um suporte sólido jeito de colágeno, gelatina ou celulose regenerada oxidada.

[0093] Em outra modalidade, o material de veículo é um spray, um aerossol ou um dispositivo para a dispensação de um pó.

[0094] Em uma modalidade do segundo aspecto da invenção, a composição selante compreende adicionalmente um agente de reticulação.

[0095] Em outra modalidade do segundo aspecto da invenção, a composição selante compreende adicionalmente um inibidor da fibrinólise.

25/47 [0096] Em outra modalidade do segundo aspecto da invenção, a composição selante compreende adicionalmente CaCI₂.

[0097] Em outra modalidade do segundo aspecto da invenção, a composição selante compreende adicionalmente um agente de reticulação e um inibidor da fibrinólise.

[0098] Em outra modalidade do segundo aspecto da invenção, a composição selante compreende adicionalmente um agente de reticulação, um inibidor da fibrinólise e CaCI₂.

[0099] Preferivelmente, o dito agente de reticulação é FXIII.

[00100] Preferivelmente, o dito inibidor da fibrinólise é selecionado entre aprotinina, ácido tranexâmico e ácido aminocapróico.

[00101] Como mencionado acima, em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica ou veterinária que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz das combinações da invenção, junto com excipientes farmaceuticamente apropriados ou veterinários aceitáveis e/ou veículos.

[00102] A expressão quantidade terapeuticamente eficaz como usada aqui, se refere à quantidade da combinação que, quando administrada, é suficiente para evitar o desenvolvimento de, ou aliviar em alguma extensão um ou mais dos sintomas da doença de interesse. A dose particular das combinações administradas de acordo com essa invenção será determinada, é claro, pelas circunstancias particulares que circundam o caso, incluindo o composto administrado, a via de administração, a condição particular a ser tratada e considerações similares.

[00103] Processos para a preparação de tais composições selantes são bem conhecidas no estado da técnica.

[00104] A composição farmacêutica ou veterinária da invenção deve ser aplicada topicamente no sítio do sangramento, diretamente ou em um material de veículo, tal como uma gaze. Exemplos de aplicação

26/47 tópica incluem, mas não são limitados a aplicação externa, cutânea, intranasal, intravesicular, intravaginal, bucal, retal, oftálmica, endoscópica tópica e instilação. Preferivelmente, a combinação e as composições da presente invenção são aplicadas topicamente.

[00105] A composição farmacêutica ou veterinária pode assumir a forma de um gel macio ou rígido, líquido, loção, creme, unguentos, pastas, formulações roll-on, sprays, aerossóis, formulações aplicadas com esponja e formulações que formam filme.

[00106] Para a administração tópica, excipientes farmacêuticos apropriados ou veículos incluem, mas não se limitam a agentes hidratantes, emolientes, emulsificantes, umectantes, agentes reguladores do pH, antioxidantes, agentes de conservação, veículos ou misturas desses. Os excipientes ou veículos usados possuem afinidade pela pele, são bem tolerados, estáveis e são usados em uma quantidade adequada para fornecer a consistência desejada e de fácil aplicação.

[00107] Quando a composição farmacêutica da presente invenção é tópica, ela pode ser formulada de várias formas que incluem, mas não são limitadas a soluções, loções, géis, unguentos, pastas, cremes, gel macio ou rígido, líquido, loção, creme, unguentos, pastas, formulações roll-on, sprays, aerossóis, formulações aplicadas com esponja e formulações que formam filme. Essas composições farmacêuticas tópicas podem ser preparadas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Os excipientes farmacêuticos apropriados e/ou veículos e suas quantidades podem ser rapidamente determinadas por aqueles versados na técnica de acordo com o tipo de formulação a ser preparada.

[00108] As composições da invenção podem ser usadas como um adjunto para a hemostasia em pacientes submetidos a cirurgia para controle de sangramento pelas técnicas cirúrgicas convencionais (tais como sutura, ligadura ou cauterização), assim como adjunto em técni

27/47 cas cirúrgicas padronizadas (tais como sutura e ligadura) para evitar o vazamento.

[00109] Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso da combinação do quarto aspecto da invenção como agente selante.

[00110] Como foi observado acima, a combinação da invenção, devido à alta consistência do coágulo produzido e a propagação com a qual ela se expande, pode selar com eficiência qualquer ferimento ou lesão em um período de tempo muito curto, é evitada a migração de líquido de uma maneira segura e eficaz por que o risco de ruptura é substancialmente reduzido. Essa aplicação é de interesse no fechamento de lesões ou feridas na pele, órgãos e depois de um traumatismo interno, entre outros.

[00111] Em uma modalidade, a combinação ou as composições como definidas acima são usadas para vedar um tecido pela sutura dos tecidos, quando possível, e aplicando a combinação ou composição aos tecidos.

[00112] Em outra modalidade, a combinação ou composições como definidas acima são usadas para fixar um enxerto a um tecido, pela aplicação da combinação ou composição ao tecido antes de colocar o enxerto sobre ele.

[00113] Devido às propriedades apontadas em detalhes acima, as combinações e composições da invenção podem ser usadas como um sistema de liberação de fármaco ou como um agente para a cicatrização de uma lesão.

[00114] A expressão cicatrização de uma lesão se refere a um processo intrincado, no qual a pele (ou algum outro órgão) se repara depois de uma lesão, cicatrizando o ferimento de qualquer tipo e em qualquer local. Ela pode ser uma cicatrização de feridas normal ou prejudicada. A última é encontrada, em particular, no caso de doenças, tais como diabetes mellitus, vasculite, doença arterial oclusiva, úlcera

28/47 venosa crônica e/ou infectada assim como úlcera gástrica de difícil cicatrização; A cicatrização prejudicada de um ferimento também é encontrada no caso de lesões nervosas tais como paraplegia, hanseníase, neuropatia, etc. e gangrena de decúbito de pessoas que necessitam de cuidados. A cicatrização prejudicada de feridas também poderá ocorrer se suturas frouxas e cicatrização deficiente ocorrerem depois de cirurgias, particularmente dos intestinos e transplantes de pele e outros órgãos, respectivamente.

[00115] A cicatrização prejudicada de feridas também é encontrada no caso de fraturas ósseas, queimaduras e tratamentos usando esteroides.

[00116] Como usada aqui, a expressão ferimento inclui uma lesão em qualquer tecido incluindo, por exemplo, retardo ou dificuldade de cicatrizar feridas e feridas crônicos. Exemplos de feridas podem incluir ambas feridas abertas e fechadas. A expressão ferida também pode incluir, por exemplo, feridas na pele e tecido subcutâneo iniciadas de diferentes modos (por exemplo, úlceras de pressão por confinamento prolongado no leito e feridas induzidas pelo trauma) e com características variáveis. As feridas podem ser classificadas em um de quatro graus dependendo da profundidade da ferida: i) Feridas de Grau I limitadas ao epitélio; Feridas de Grau II que se estendem na derme; iii) Feridas de grau III que se estendem para o tecido subcutâneo; e iv) Feridas de Grau IV (ou feridas profundas) onde os ossos estão expostos (por exemplo, um ponto de pressão óssea tal como o grande trocanter ou o sacro).

[00117] A expressão ferida crônica se refere geralmente a uma ferida que não cicatrizou. Feridas crônicas incluem úlceras venosas, úlceras de estase venosa, úlceras arteriais, úlceras de pressão, úlceras diabéticas, úlceras do pé diabético, úlceras de vasculite, úlceras de decúbito, úlceras de queimadura, úlceras induzidas por trauma, úlce29/47 ras infecciosas, úlceras mistas e pioderma gangrenoso.

[00118] As combinações e as composições da invenção também podem ser usadas no tratamento de hemorragias. Tais hemorragias podem ser devidas a coagulopatias, lesões, feridas ou distúrbios plaquetários, entre outros.

[00119] Como mostrado abaixo, as combinações da invenção atuam como agente anti-hemorrágico e, consequentemente, podem ser usadas para tratar ou corrigir distúrbios hemorrágicos, particularmente aqueles distúrbios hemorrágicos associados com a diátese hemorrágica.

[00120] A expressão diátese hemorrágica se refere ao processo que causa um distúrbio hemostático e que, como resultado dá origem à ocorrência de uma síndrome hemorrágica que pode ocasionalmente ocorrer com sangramento prolongado e excessivo.

[00121] A expressão coagulopatia se refere a um distúrbio de um fator de coagulação. Esse distúrbio pode ser devido à uma deficiência ou déficit de um fator de coagulação específico, cuja consequência será a ocorrência de uma síndrome hemorrágica ou devido à um distúrbio do fator de coagulação. A coagulopatia pode ser geralmente uma coagulopatia congênita ou uma coagulopatia adquirida. Como exemplos ilustrativos, não limitantes de coagulopatias congênitas, deficiências de fatores de coagulação selecionados entre Fator de coagulação V (FV), Fator de coagulação VII (FVII), Fator de coagulação VIII (FVIII), cujo déficit ou deficiência causam a hemofilia A, Fator de coagulação IX (FIX), cujo déficit ou deficiência causa a hemofilia B, Fator de coagulação X (FX), Fator de coagulação XI (FXI), cujo déficit ou deficiência causam a hemofilia C, Fator de coagulação XII (FXII), Fator de coagulação XIII (FXIII) e suas combinações, podem ser mencionadas. As coagulopatias congênitas podem ter origens diferentes. Exemplos ilustrativos incluem as deficiências de síntese do fator de

30/47 coagulação na insuficiência hepática severa, terapia anticoagulante (tal como heparina, heparinas de baixo peso molecular, warfarin, derivados de cumarina, dicumarínicos, etc). Um mecanismo alternativo é baseado no consumo exagerado dos fatores de coagulação tal que eles não estejam disponíveis para formar o coágulo em uma lesão hemorrágica. Esse mecanismo ocorre na síndrome da coagulação intravascular disseminada ou coagulopatia devida ao consumo que ocorre em múltiplas enfermidades tais como sepse severa que danifica o endotélio da microcirculação, ativando as plaquetas e os fatores de coagulação com a formação de múltiplos micro-trombos; invasão do sangue por TF tal como pela liberação placentária; na retenção de um feto morto; em múltiplos traumas com o esmagamento de tecidos; no envenenamento por picadas de cobra, etc. Na vasculite, a lesão parietal e endotelial libera ativadores da coagulação. O consumo de fatores de coagulação é piorado pela lise da fibrina dos numerosos microtrombos devido à ação da plasminas, que são antiplaquetárias e anticoagulantes.

[00122] A expressão distúrbio plaquetário se refere a um distúrbio em ambos, no número e na habilidade funcional das plaquetas, cujo resultado é a ocorrência de uma síndrome hemorrágica. O dito distúrbio plaquetário pode ser congênito ou adquirido. Exemplos ilustrativos, não limitantes de distúrbios plaquetários congênitos incluem a doença de Glanzmann, doença de Bernard Soulier, síndrome de BolinJamieson, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de Paris-TrousseauJacobsen, trombocitopenia do cromossomo X, síndrome plaquetária de Gray, síndrome de Sebastian e anemia de Fanconi. Em outra modalidade particular, o dito distúrbio plaquetário é um distúrbio plaquetário adquirido. Exemplos ilustrativos, não limitantes de distúrbios plaquetários adquiridos incluem as doenças mieloproliferativas, tais como a trombocitopenia, policitemia, leucemia mielocítica crônica, etc.; exis

31/47 tem distúrbios plaquetários funcionais na metaplasia mielóide com tempo de sangramento aumentado, defeitos de retenção de esfera de vidro, defeito de agregação plaquetária, liberação anormal e defeito do fator III plaquetário. Defeitos plaquetários funcionais têm sido encontrados nas disproteinemias no escorbuto e na doença cardíaca congênita e cirrose.

[00123] Em uma modalidade do sétimo aspecto da invenção, é fornecida a combinação ou as composições como definidas acima para uso no tratamento tópico de hemorragias pela sua aplicação no local da lesão.

[00124] A expressão indivíduo como usada aqui inclui qualquer membro de uma espécie animal, incluindo a espécie humana; como um exemplo ilustrativo, não limitante, o dito indivíduo pode ser um mamífero, tal como um primata, um animal doméstico, um roedor, etc. O dito indivíduo é preferivelmente um homem ou uma mulher de qualquer idade e raça. Em uma modalidade particular, o dito indivíduo é um ser humano sem história de distúrbios da hemostasia, tal como um indivíduo que não possui coagulopatias ou distúrbios plaquetários. Em outra modalidade particular, o dito indivíduo é um ser humano que possui uma história de distúrbios da hemostasia, tal como um indivíduo que possui uma diátese hemorrágica, por exemplo, uma coagulopatia, tal como uma coagulopatia congênita ou adquirida ou um distúrbio plaquetário, tal como um distúrbio plaquetário congênito ou adquirido.

[00125] Já que TF é uma molécula pró-angiogênica bem conhecida, combinações e composições da invenção também podem ser usadas no tratamento de uma doença associada à angiogênese deficiente.

[00126] A expressão doença associada à angiogênese deficiente, como usada aqui, se refere a doenças que podem ser curadas pela ativação da formação de um vaso. A expressão formação de um va

32/47 so se refere à formação de um vaso de qualquer tipo e em qualquer lugar. A promoção da formação de um vaso pode ser útil em várias condições clínicas. Por exemplo, as combinações da invenção podem ser usadas para promover a angiogênese da vascularização colateral no tecido miocárdico durante ou depois de uma doença isquêmica, infarto do miocárdio ou depois da cirurgia de by-pass coronariano. Outras doenças ou condições que podem ser tratadas pelo fornecimento das combinações e composições da invenção incluem a doença vascular e/ou a doença isquêmica que causa patologia do sistema nervoso central ou periférico. Tais condições/doenças podem incluir acidentes cerebrovasculares, por exemplo, causados pelas oclusões com coágulos ou pelo rompimento de aneurismas, ou isquemia generalizada/localizada que causa morte neuronal ou déficit funcional periférico, tais como nas funções motoras ou sensoriais ou prejuízo da fala, cardiomiopatia isquêmica ou doença arterial periférica tal como claudicação isquêmica crônica de um membro (músculo esquelético), dor em repouso/ulceração isquêmica/gangrena. Além disso, a promoção da formação de vaso é adequada para a substituição de vasos sanguíneos danificados, por exemplo, velhos. Eles podem estar presentes, por exemplo, no cérebro ou no coração, tal que uma apoplexia ou infarto podem ser evitados ou tratados. Devem ser tomadas precauções também contra a presbifrenia. Adicionalmente, ela se refere a formação de vasos para o tratamento da aterosclerose, doença de Crohn e oolite ulcerativa, retinopatia diabética e trombose venosa profunda das pernas/úlcera crural assim como a prevenção de recidivas.

[00127] Finalmente, em um aspecto adicional, a presente invenção fornece kits que compreendem as combinações e composições da invenção junto com um aplicador.

[00128] O kit pode ter a forma de (a) três partes, de tal maneira que cada parte contenha cada um dos componentes que formam a combi

33/47 nação da invenção, ou seja, uma parte do kit contém a trombina, outra contém o fibrinogênio e a outra contém o fator tecidual lipidado; ou alternativamente, (b) como duas partes, de tal maneira que dois dos componentes da combinação (trombina e fator tecidual lipidado ou fibrinogênio e fator tecidual lipidado) compartilham uma parte e o terceiro componente está contido, separadamente, em uma segunda parte. [00129] Portanto, em uma modalidade, o kit compreende: a) uma primeira parte que compreende trombina; b) uma segunda parte que compreende fibrinogênio; e c) uma terceira parte que compreende o fator tecidual lipidado recombinante; e d) um aplicador para aplicar simultaneamente todos os componentes incluídos no kit.

[00130] Em outra modalidade, o kit compreende: a) uma primeira parte que compreende trombina e o fator tecidual lipidado; b) uma segunda parte que compreende fibrinogênio; c) um aplicador para aplicar simultaneamente todos os componentes incluídos no kit.

[00131] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um kit que compreende: a) uma primeira parte que compreende trombina; b) b) uma segunda parte que compreende fibrinogênio e o fator tecidual lipidado; e c) um aplicador para aplicar simultaneamente todos os componentes incluídos no kit.

[00132] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um kit que compreende uma única parte que contém a trombina, fibrinogênio e o fator tecidual lipidado.

[00133] A trombina, fibrinogênio e o fator tecidual lipidado contidos no kit podem estar em qualquer forma adequada, tal como em solução, suspensão ou pó, junto com excipientes e/ou veículos farmaceuticamente apropriados ou veterinários aceitáveis.

[00134] Adicionalmente, o kit pode incluir instruções quanto ao seu uso em qualquer uma das aplicações mencionadas acima.

[00135] Em uma modalidade, o kit compreende adicionalmente um

34/47 agente de reticulação.

[00136] Em outra modalidade, o kit compreende adicionalmente um inibidor da fibrinólise.

[00137] Em outra modalidade, o kit compreende adicionalmente CaCI₂.

[00138] Em uma modalidade adicional, o kit compreende adicionalmente um agente de reticulação e um inibidor da fibrinólise.

[00139] Em uma modalidade adicional, o kit compreende adicionalmente um agente de reticulação, um inibidor da fibrinólise e CaCI₂.

[00140] O agente de reticulação, o inibidor da fibrinólise e CaCI₂ podem estar incluídos em qualquer uma das partes identificadas acima para a trombina, fibrinogênio e fator tecidual lipidado ou, alternativamente, cada um pode estar em partes adicionais separadas ou podem estar compartilhando a mesma parte do kit.

[00141] Qualquer componente adicional pode estar incluído no kit desde que ele não afete negativamente os perfis hemostático e selante da combinação incluída nele. Tais componentes extras podem estar incluídos em qualquer uma das partes identificadas acima para a trombina, fibrinogênio e fator tecidual lipidado. Alternativamente, cada um dos componentes extras do kit pode estar em partes separadas adicionais ou podem estar compartilhando a mesma parte do kit.

[00142] Preferivelmente, o dito agente de reticulação é FXIII.

[00143] Preferivelmente, o dito inibidor da fibrinólise é selecionado entre aprotinina, ácido tranexâmico e ácido aminocapróico.

[00144] Exemplos ilustrativos não limitantes de aplicadores que permitam aplicar simultaneamente todos os componentes incluídos no kit são seringas, aplicadores em spray ou um dispositivo para liberação dos componentes quando eles estão em forma de pó, entre outras.

[00145] Um exemplo de dispositivo para a liberação de pó é aquele

35/47 descrito no WO2010/07033.

[00146] Ao longo da descrição e das reivindicações, a palavra compreende e variações da palavra não são pretendidas excluir outras características técnicas, aditivos, componentes ou etapas. Além disso, a palavra compreende abrange o caso de consiste em. Objetivos, vantagens e características adicionais da invenção ficarão aparentes para aqueles versados na técnica depois de examinar a descrição ou podem ser aprendidas pela prática da invenção. Os exemplos e figuras a seguir são fornecidos como ilustração e eles não são pretendidos ser limitantes da presente invenção. Sinais de referência relacionados às figuras e colocados nos parênteses em uma reivindicação são apenas para tentar aumentar o entendimento da reivindicação e não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção. Além disso, a presente cobre todas as combinações possíveis das modalidades particulares e preferidas aqui descritas.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Produção de fator tecidual recombinante com base na expressão da proteína modificada com His tag TF de extensão completa em levedura (daqui por diante também referida como TT-173) [00147] O vetor epissomal de levedura pTT-10301 descrito no Exemplo 1 de W02008080989 que compreende o gene de URA3. o gene de resistência à ampicilina, a origem de replicação 2 μ de levedura, o promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD) e o sinal de terminação da transcrição em levedura de fosfoglicerato quinase, foi usado para clonar, sob o controle do promotor de GPD, um cDNA de SEQ ID NO:6 que codifica a proteína hTF madura (aa 33-295 de SEQ ID NO:1) com His tag na terminação 3' e uma mutação Asn124Ala que inativa um dos sítios de glicosilação em potencial na sequência nativa de hTF (SEQ ID NO:5).

[00148] A SEQ ID NO:6 foi obtida como a seguir. A sequência de

36/47 cDNA humano de TF (número de acesso no GenBank BC011029, SEQ ID NO:11) foi amplificada usando os iniciadores de SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8. A sequência de DNA amplificada resultante foi adicionalmente modificada pela mutagênese direcionada ao sítio usando os iniciadores de SEQ ID NO:9 e SEQ ID NQ:10. Para isso, o kit de mutagênese direcionada ao sítio Quick Change (Stratagene) foi usado, de acordo com o método descrito nos manuais da Stratagene. Com esta tal última mutagênese, a sequência de TE contendo uma mutação pontual de Asn para Ala no resíduo de aminoácido 124 da sequência da proteína TF foi gerada.

[00149] Depois da transformação, cepas de levedura capazes de crescer em meio sem uracil foram coletadas e testadas quanto a sua habilidade de expressar hTF pela análise Western blot dos extratos de levedura essencialmente como descrito em WQ2008080989. Resumidamente, leveduras contendo o plasmídeo de expressão epissomal com uma versão modificada do gene que codifica TF (SEQ ID NO:6) são cultivadas em um fermentador e as células resultantes coletadas por centrifugação. As células coletadas são re-suspensas em um tampão de lise apropriado (fosfato 20 mM, NaCI 50 mM, pH 7,4) e submetidas à lise em alta pressão pela passagem três vezes através de um homogeneizador a 1000 bar de pressão para obter o lisado de fermentação (homogenate de fermentação). A suspensão celular é mantida fria pela submersão do recipiente em um banho de gelo. Depois disso, o material mais pesado é eliminado do lisado de fermentação por meio de centrifugação, obtendo assim o sobrenadante do extrato de levedura clarificado (CYE). O CYE obtido da etapa de homogeneização é diluído com tampão de lise até que o conteúdo de proteína total atinja uma concentração entre 5-6 mg/mL e filtrado através de filtros consecutivos de 0,45 pm, 0,2 pm e 0,1 pm, respectivamente, para reduzir a quantidade de proteínas de não membrana derivadas da célula hos

37/47 pedeira (HCP) e para obter um material mais homogêneo em vesículas de rTF.

[00150] As vesículas no microfiltrado retido de 0,1 pm possuem diâmetros abaixo de 0,2 pm. Para eliminar resíduos de DNA, o microfiltrado retido de 0,1 pm é então tratado com 10 U/mL da endonuclease Benzonase (Merck) e cloreto de magnésio até uma concentração final de 1 mM, incubado por 12 h a 4°C em um recipiente de vidro centrifugando em aproximadamente 20 rpm e usado para etapas de enriquecimento adicionais.

[00151] Para fracionar adicionalmente diferentes subpopulações de vesícula de acordo com seu tamanho e para remover material celular residual indesejado, o extrato de levedura clarificado por filtração é aplicado a uma coluna de cromatografia por exclusão de tamanho Sephacryl. Depois da separação, as frações 2 a 22, que correspondem às vesículas enriquecidas com rTF, são agrupadas e esterilizadas por filtração. Depois disso, fosfatidilserina (PS) em uma concentração final de 0,1 mg/mL é adicionada ao produto esterilizado e a mistura é mantida em temperatura ambiente por 2 h para permitir a incorporação de PS nas vesículas. Como uma etapa prévia, PS pode ser preparada como vesículas multilamelares pela re-suspensão de lipídeos em uma solução tamponada seguida pela sonicação, de acordo com o Morrissey Lab Protocol for Preparing Phospholipid Vesicles (SUV) pela sonicação. Resumidamente: (1) dispense 2,6 pmol de fosfolipideos (PL) totais em um tubo de teste de vidro (um tubo de 13 x 100 mm tern um tamanho conveniente); (2) na câmara de exaustão, seque a mistura de PL sob um fluxo moderado de nitrogênio ou argônio. Quando seco, aspire por um adicional de 60 minutos sob alto vácuo (Isso remove qualquer clorofórmio residual); (3) para secar PL, adicione 2,6 ml de uma solução de HBS em temperatura ambiente e cubra o fim do tubo com parafilme. Deixe depositar por 1 h em temperatura ambiente; (4)

38/47

Centrifugue o tubo vigorosamente para re-suspender completamente o PL. O resultado deve ser uma suspensão leitosa, uniforme. (5) preencha o banho do sonicador com água em temperatura ambiente. Usando um anel de suporte e uma braçadeira no tubo de teste, suspenda o tubo contendo a suspensão de PL no banho. O nível líquido dentro do tubo deve ser igual aquele do lado de fora do tubo. Sonicar até que a suspensão mude de leitosa para quase clara (isto é, apenas muito discretamente turva) na aparência. Verifique a cada 10 min; geralmente estará entre 10 a 30 min o tempo total de sonicação. (Assegure-se de não deixar o banho superaquecer e não drenar o banho até que ele esteja completamente frio); e (6) Armazene o produto final a 4°C. O resultado é uma suspensão de vesículas unilamelares pequenas (SUV) contendo um total de 1 mM de fosfolipídeos em HBS.

[00152] Depois de 2 h de incubação, o produto estéril contendo as vesículas enriquecidas com OS, é aliquotado e liofilizado. Esse material liofilizado corresponde ao rTF usado nos testes abaixo e consiste em uma proteína de SEQ ID NO:5 ancorada em uma vesícula lipídica altamente enriquecida em PS.

Exemplo 2: Efeito da adição de TF sobre FS na propagação do coágulo no plasma normal e no plasma heparinizado [00153] O FS usado como referência nesse teste é aquele comercializado como Tissucol®. 1 mL de Tissucol® contém: 500 U de trombina humana, 115 mg de fibrinogênio, 3000 U de aprotinina e 40 pmol de Cloreto de Cálcio.

[00154] A combinação da invenção foi feita pela adição de 2 mL de Tissucol e 300 ng de TF lipidado obtido de acordo com o Exemplo 1. [00155] Para esses estudos, 2,5 mL de plasma normal (plasma agrupado de cinco doadores saudáveis) foram colocados em uma banda com 4 cm de comprimento. Depois, 1 mL de combinação de selante a ser testada, a referência (Tissucol®) ou aquela da presente

39/47 invenção (Tissucol® mais TF lipidado), foi aplicado sobre uma das extremidades.

[00156] A cada 15 segundos depois da aplicação do item de teste, por 5 minutos, o grau de coagulação, a 3 cm de distância do sítio da aplicação, foi determinado com o auxílio de um espectrofotômetro (Biotek). Para isso, a densidade óptica do plasma foi medida com um espectrofotômetro (Biotek) a 340 nm. A FIG. 1 mostra o percentual de coagulação de FS de referência (Tissucol®) (quadrado cinza) e da combinação da invenção (FS + TF) (triângulo preto) em diferentes tempos depois da aplicação de cada produto, a 3 cm de distância do sítio de aplicação.

[00157] Como mostrado, a combinação de FS + TF já tinha fornecido 50% da coagulação no plasma normal depois de 105 segundos da aplicação (FIG. 1A). Entretanto, quando FS é administrado sozinho, é apenas nesse momento (105 segundos) que a coagulação começa. Essas diferenças são mais pronunciadas quando um experimento similar é realizado com plasma tratado com heparina (Clexane®) em ambos limites de sua concentração terapêutica: 0,5 U/mL (FIG. 1B) e 1 U/mL (FIG. 1C).

[00158] A partir desses resultados pode ser concluído que a adição de TF lipidado a FS que compreende Fila e Fl, aperfeiçoa o perfil hemostático através da propagação do coágulo.

Exemplo 3: Intensificação do efeito hemostático in vivo de um FS depois da adição de TF lipidado [00159] O ensaio realizado é aquele descrito por Kemal Karakaya et al no The Journal of Trauma Injury, Infection, and Critical Care, 2000, vol. 49 (2), p. 246-250.

[00160] Resumidamente, cinquenta e dois ratos machos (HsdHan: WIST, Harlan Interfauna) (380-400 g) foram usados nesse estudo. Os animais foram abrigados em uma instalação com clima controlado

40/47 (gaiolas: 25x50 cm. Dois animais por gaiola). Alimentação (Global Diet 2014, Harlan Tekland) e água estavam disponíveis a vontade. Os animais foram mantidos na Universidade de Barcelona, Faculdade de Biologia. Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular. ExperimentalAnimalsResearch Unit (CEREMET). O protocol de estudo foi aprovado pelo Ethic Committee of Experimental Animals (CEEA) da Universidade de Barcelona e o Department of Agriculture, Food, and Environment of the Generalitat of Catalonia. Referência da aprovação: DAAM 5996. Todos os animais receberam cuidado humano de acordo com os requisitos da UE Animal Welfare Regulations.

[00161] Os animais foram alocados aleatoriamente em três grupos para receber: Nenhum tratamento (n = 15), Tissucol® (n = 21) ou Tissucol® mais TF lipidado (200 ng/ml) obtido do Exemplo 1 (Tissucol® + TF = 16).

[00162] Os animais foram anestesiados com uma injeção intramuscular de 100 mg/kg de quetamina. Depois de realizar uma laparotomia na linha média, a cavidade abdominal foi seca com esponjas de algodão. Uma porção do fígado foi excisada com tesoura. Como um sangramento rápido na superfície do fígado foi facilmente visualizado, nenhuma manipulação da superfície com sangramento foi feita. A superfície ressecada foi então tratada com Tissucol®, Tissucol® mais TF lipidado ou deixada não tratada de acordo com a randomização. Depois disso, o sangue foi deixado acumular na cavidade peritoneal em todos os grupos e foi coletado com pequenas esponjas de algodão a fim de evitar o derramamento na cavidade abdominal. No fim do período de estudo, o sangue derramado na cavidade abdominal foi coletado com pequenas esponjas de algodão. A perda total de sangue foi calculada como as esponjas de algodão ensopadas com sangue menos o peso das esponjas de algodão secas pesadas previamente usadas para cada animal. Os animais foram monitorados por 30 min depois da

41/47 lesão hepática.

[00163] Como mostrado na FIG. 2, a aplicação de Tissucol® (FS) resulta na redução da perda de sangue quando comparada com animais não tratados. Entretanto, a adição de TF lipidado ao Tissucol® (FS) produz um aumento de aproximadamente 50% na eficácia em relação a FS sozinho.

[00164] A significância estatística dos resultados foi confirmada pelo teste de Comparação Múltipla de Newman-Keuls, dados os seguintes valores de p: Tissucol® vs Não Tratado: valor de p ,0,001, Tissucol® vs Tissucol® + TF lipidado: valor de p <0,01 e Tissucol® + TF lipidado vs Não tratado: valor de p <0,001.

Exemplo 4: Consistência do coágulo [00165] Cada um dos FS de referência e a combinação usada no Exemplo 2 foi aplicada sobre uma das extremidades de uma banda com 4 cm de comprimento contendo 2,5 mL de plasma tratado com heparina (Clexane®).

[00166] Quando a combinação da invenção foi aplicada, foi observado que ela se espalha substancialmente mais rápido através da banda do que o selante de referência. Adicionalmente, com o auxílio da ponta de uma pipeta, os coágulos obtidos com cada uma das combinações foram removidos: o coágulo obtido com FS comercial era frágil e quebrava com facilidade, enquanto que o coágulo que resultava da aplicação da combinação da invenção não. Isso foi indicativo de que o coágulo obtido com a combinação da invenção tinha uma consistência muito maior do que o coágulo obtido com o Tissucol® de referência. O fato de que o coágulo obtido com a combinação da invenção mostrou uma consistência muito melhor com relação àquele obtido com a referência comercial (Tissucol®) significa que ele tem um risco substancialmente reduzido de rompimento do coágulo associado com os selantes derivados de FS comercial e, portanto, ele é absolutamen42/47 te eficaz na vedação de uma lesão/ferida.

[00167] Sem estar ligado à teoria, os presentes inventores acreditam que o fator tecidual está embebido na rede de fibrina formada (devido à trombina e ao fibrinogênio incluídos na combinação) e que devido a essa distribuição do fator tecidual dentro da rede de fibrina, um efeito de expansão do coágulo ocorre, dando origem à vedação eficiente da ferida ou lesão.

Exemplo 5: perfil hemostático e selante das composições selantes sem trombina incluindo o fator tecidual lipidado [00168] Em uma tentativa para determinar as propriedades hemostáticas e selantes das composições descritas no WO97/29792, algumas composições selantes sem trombina foram preparadas e analisadas por TEM de acordo com as recomendações do fabricante (manual de instrução de ROTEM®). Os parâmetros de MCF (firmeza máxima do coágulo) e G (Resistência do Módulo Elástico), relacionados com a resistência global do coágulo foram registrados.

[00169] Para comparar a resistência do coágulo daquelas composições com o coágulo induzido por FS contendo Fila, os mesmos parâmetros também foram determinados para um FS comercial (Tissucol) e em um FS não comercial.

[00170] As amostras testadas foram:

1: Fll, FV, FVII, FX, FXIII, Fl (fonte: plasma agrupado obtido de cinco doadores saudáveis diferentes) + TF lipidado 200 ng/mL (fonte: TT173) + Cloreto de Cálcio 5 mM

2. Fll, FV, FVII, FX, FXIII, Fl (fonte: plasma agrupado obtido de cinco doadores saudáveis diferentes) + TF lipidado 200 ng/mL (fonte: TT173) + Fl 3 mg/mL (fonte: Sigma, ref. F4129) + Cloreto de Cálcio 5 mM

3. Fll, FV, FVII, FX, FXIII, Fl (fonte: plasma agrupado obtido de cinco doadores saudáveis diferentes) + TF lipidado 200 ng/mL (fonte: American Diagnostica, ref. 4500L) + Cloreto de Cálcio 5 mM

43/47

4. Fl I, FV, FVII, FX, FXIII, Fl (fonte: plasma agrupado obtido de cinco doadores saudáveis diferentes) + TF lipidado 200 ng/mL (fonte: American Diagnostica, ref. 4500L) + Fl 3 mg/mL (fonte: Sigma, ref. F4129) + Cloreto de Cálcio 5 mM

5. Fll: 100 pg/mL; FV 10 pg/mL; FVII: 0,5 pg/mL; FC: 8 pg/mL; FXIII 10 pg/mL, Fl 6 mg/mL (fonte: Fl (ref. F4129 SIGMA), Fll (ref. HCP-0010 CellSystems), FXIII: (ref. HCXI11-0160 CellSystems), FX (ref. HCX-0050 CellSystems), FV (ref. HCV-0100 CellSystems), FVII (ref. HCVII 0030 CellSystems)) + TF lipidado 200 ng/mL (fonte: TT-173) + Cloreto de Cálcio 5 mM. A mistura dos componentes foi preparada 10 min antes do uso.

6. Fll: 100 pg/mL, FV: 10 pg/mL, FVIIa: 0,5 pg/mL, FX: 8 pg/mL, FXIII: 10 pg/mL, Fl: 6 mg/mL (fonte: Fl (ref. F4129 SIGMA), Fila: (ref. HCP0010 CellSystems), FXIII: (ref. HCXIII-0160 CellSystems), FX (ref. HCX-0050 CellSystems), FV (ref. HCV-0100 CellSystems), FVII (ref. HCVII 0031 CellSystems)) + TF lipidado 200 ng/mL (fonte: TT-173) + Cloreto de Cálcio 5 mM. A mistura dos componentes foi preparada 10 min antes do uso.

[00171] Os valores de MCF e G também foram determinados para duas composições de FS: Tissucol® comercial e FS não comercial. [00172] FS não comercial, composição por mL:

Fibrinogênio (Fl) (ref. F4129 SIGMA): 115 mg Trombina (Fila) (ref. T4648 SIGMA): 500 IU Cloreto de Cálcio: 40 pmol [00173] Os resultados, que correspondem as análises de 400 pL de cada combinação estão mostrados na Tabela I (n=3):

TABELA I

	1	2	3	4	5	6	Tissucol®	FS
MCF (mm)	29	42	32	40	4	9	94,3	83
G (Kdyn/cm2)	2	3,6	2,3	3,3	0,2	0,5	90	24

44/47 [00174] A partir dos dados resumidos na Tabela I, pode ser visto que a inclusão de fator tecidual lipidado nas composições selantes sem trombina fornece composições selantes com valores de MCF (firmeza máxima do coágulo) e G (resistência do módulo elástico) substancialmente menores do que aqueles das composições selantes com trombina comerciais. Em particular, o MCF é pelo menos 200% menor do que o MCF das composições de referência. Por outro lado, o valor de G é pelo menos cerca de 2000% menos do que aqueles das composições selantes com trombina comerciais.

[00175] Como a pessoa versada na técnica conhece, quanto menores os valores de MCF e G, pior o perfil selante do coágulo. Portanto, pela adição de fator tecidual lipidado nas composições sem trombina, nenhum aperfeiçoamento na atividade selante é obtido. E, portanto, o efeito selante encontrado pelos presentes inventores quando o fator tecidual lipidado é adicionado nas composições selantes de trombina não pode ser derivado dos ensinamentos de WO97/29792.

Exemplo 6: Análise do tempo de coaqulação [00176] Outro parâmetro relevante para a análise da eficácia de um FS é o tempo requerido para seus diferentes componentes criarem um coágulo estável. Isso pode ser facilmente quantificado por um coagulômetro. Uma composição ternária que corresponde à presente invenção FS+TT-173 (Fibrinogênio (Fl) (ref. F4129. SIGMA): 115 mg/mL, Trombina (Fila) (ref. T4648 SIGMA): 500 lU/mL, TT-173 (200 ng TF/mL), cloreto de cálcio 40 pmol/mL) também foi incluída no ensaio.

[00177] As análises coagulométricas foram realizadas como a seguir: Alíquotas (200 pl_) das composições testadas no Exemplo 5 ou FS+TT-173, foram adicionadas a cubetas contendo uma esfera de aço inoxidável. Um agitador magnético incorporado no coagulometro (Diagnostica Stage, Inc. NJ, USA) move a esfera de aço até que ela pare por causa do coágulo. Esse tempo chamado de tempo de coagulação

45/47 (em segundos) foi registrado. O experimento foi parado depois de 300 segundos. Os resultados são mostrados na Tabela II.

Tabela II

Tempo de

Amostras Coagulação

FS+TT173<5

Plasma+TT17314,8

Plasma +TT173+FI 3mg/mL16,2

Plasma + rTF lipidado24,5

Plasma + rTF lipidado +FI 3mg/mL31,3

FV+FII +FX+FXIII+ FVII +TT17326,5

FV+FII+FX+FXIII+ FVIIa+TT17317,8 [00178] Como pode ser visto na Tabela II, o tempo de coagulação induzido por FS que contém Fila, mostra um tempo de coagulação abaixo de 5 segundos, enquanto que as combinações de WO97/29792 necessitam entre 15 e 31 segundos, isto é, pelo menos 300% mais tempo para induzir fibras de Fibrina suficientes para serem detectadas pelo coagulômetro.

[00179] A vista dos dados acima, nós podemos concluir que a composição ternária de FS descrita na invenção mostra um coágulo mais rápido e resistente do que as composições descritas no WO97/29792. Exemplo 7: capacidade hemostática da combinação da invenção em amostras de plasma heparinizado.

[00180] Um coágulo produzido por:

(a) 30 pl_ de um FS não comercial (veja a composição do Exemplo 5);

(b) 30 μΙ_ de uma combinação ternária de FS+TT173 (veja a composição do Exemplo 6); ou (c) 30 μΙ_ de uma combinação ternária similar, mas que contém rTF lipidado (200 ng/mL, fonte American Diagnostica ref. 4500L) ao invés de TT-173 como fonte de TF, foi adicionado a 300 mL de plasma he

46/47 parinizado (0,6 U/mL). Depois, os parâmetros de Tempo do Coágulo (CT = tempo a partir da aplicação do coágulo até o aparecimento das primeiras redes de fibrina), Tempo de Formação do Coágulo (CFT = tempo entre a formação das primeiras redes de fibrina até a formação do coágulo completo) e Formação Máxima do Coágulo (MCF = firmeza do coágulo) foram determinados por TEM, de acordo com as recomendações do fabricante (manual de instrução ROTEM).

[00181] Os resultados estão resumidos na Tabela III abaixo.

Tabela III

	FS	FS+TT-173	FS+rTF
CT	171,6	41,3	37,5
CFT	—	159,6	356,5
MCF	7	33,6	34,5

[00182] É notável o fato de que quando FS foi usado sozinho, nenhum coágulo estável foi obtido no ensaio. De fato, depois de 40 minutos (que foi o tempo gasto no ensaio) apenas o início da formação do coágulo foi detectado (o que requereu 171 segundos).

[00183] Pelo contrário, com a inclusão do fator tecidual lipidado, a combinação ternária iniciou a coagulação mais cedo e, em ambos os casos, um coágulo estável foi gerado, o dito coágulo mostrando uma alta consistência (valor de MCF).

[00184] O fato de que a combinação ternária da invenção é capaz de gerar coágulos consistentes estáveis em um período de tempo tão curto é de grande importância nos cenários médicos críticos.

REFERÊNCIAS CITADAS NO PEDIDO

W02008080989;

WO2010/07033;

WO2011131658;

WO97/29792;

Mimms L. T. et al., “Phospholipid vesicle formation and transmembrane

47/47 protein incorporation using octyl glucoside”, Biochemistry, 1981, vol. 20(4), p. 833-840; e

Kemal Karakaya et al., “Evaluation of a New Hemostatic Agent Ankaferd Blood Stopper in Experimental Liver laceration”, The Journal of Trauma Injury, Infection, and Critical Care, 2000, vol. 49 (2), p. 246250.

Claims (15)

1. Combinação, caracterizada pelo fato de que compreende fator tecidual lipidado, trombina e fibrinogênio.

2. Combinação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos um sítio de N-glicosilação do fator tecidual não é funcional.

3. Combinação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2 , caracterizada pelo fato de que o dito fator tecidual é uma proteína de fusão que compreende uma primeira porção que compreende a proteína do fator tecidual e uma segunda porção que compreende outro peptídeo ou proteína.

4. Combinação, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a segunda porção é um marcador.

5. Combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão tem uma primeira porção que compreende a proteína madura do fator tecidual maduro com pelo menos um dos sítios de N-glicosilação não sendo funcional e uma segunda porção que compreende um His-tag.

6. Combinação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão corresponde à SEQ ID NO:5.

7. Combinação, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o TF lipidado está inserido em uma microvesícula.

8. Combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a trombina é a trombina humana.

9. Combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o fibrinogênio é fibrinogênio humano.

Petição 870160075343, de 14/12/2016, pág. 6/20

2/2

10. Composição selante, caracterizada pelo fato de que compreende a combinação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e um material de veículo.

11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz da combinação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, junto com outros excipientes e/ou veículos farmaceuticamente apropriados ou veterinários aceitáveis.

12. Uso de uma combinação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou da composição, como definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é como um agente selante.

13. Uso de uma combinação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou da composição, como definida na reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças.

14. Uso de uma combinação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou da composição, como definida na reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de hemorragias.

15. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a combinação, como definida na reivindicação 1, e um aplicador que permita a aplicação simultânea de todos os componentes que formam a combinação.