BR112015009022B1 - Métodos para determinação da abundância de um analito em uma pluralidade de amostras - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DA ABUNDÂNCIA DE UM ANALITO EM UMA PLURALIDADE DE AMOSTRAS. A invenção fornece métodos de espectrometria de massa, composições e sistemas que possibilitam uma plataforma única para a quantificação de analito que acessa graus muito elevados de multiplexação e quantificação acurada, particularmente bem adequados para uma gama de análise quantitativa para aplicações em proteômica. Modalidades dos presentes métodos e sistemas combinam agentes que codificadores isotópicos caracterizados por diferenças muito pequenas na massa molecular com métodos de espectrometria de massa que fornecem um grande poder de resolução para fornecer uma quantificação relativa ou absoluta do analito em um grande número de amostras.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Esse pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente U.S. No. 13/660.667, depositado em 25 de outubro de 2012, que está incorporado aqui pela referência em sua totalidade.

DECLARAÇÃO COM RELAÇÃO À PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL

[002] Essa invenção foi realizada com apoio governamental sob GM080148 concedido pelo National Institutes of Health. O governo tem certos direitos na invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A quantificação do proteoma tornou-se um componente ca da vez mais essencial da biologia moderna e da medicina translacio- nal. Se direcionada ou global, a incorporação estável de um isótopo com a análise de espectrometria de massa (MS), é o mecanismo primário pelo qual as medidas de abundância de proteína são determinadas. Existem numerosas abordagens para introduzir isótopos estáveis nos peptídeos - SILAC, marcação isobárica (TMT/iTRAQ), iCAT, etc. Nas abordagens mais convencionais, entretanto, esses métodos incorporam isótopos pesados para aumentar a massa em pelo menos 1 Da. SILAC, a quantificação padrão ouro, por exemplo, utiliza tipica-mente um espaçamento de 4 Da de maneira a limitar a superposição de cluster isotópico dos peptídeos pesado e leve. Esse requisito limita a capacidade quantitativa de SILAC para o tríplex. A razão para isso é dupla: (1) a massa dos aminoácidos pode apenas ser elevada para ~ +12 Da e (2) a complexidade espectral da massa é aumentada já que múltiplos clusters isotópicos são introduzidos.

[004] A marcação isobárica aborda o problema de aumentos na complexidade dos espectros de massa pela ocultação da informação quantitativa na sondagem MS1, permitindo dessa maneira um nível maior de multiplexação do que aquele obtido através de métodos SI- LAC convencionais. Mc Alister et al. relataram recentemente métodos para expandir o rendimento de métodos usando reagentes TMT isobáricos de 6-plex para 8-plex, por exemplo, através de técnicas que resolvem a mudança isotópica relativamente pequena que resulta da substituição de um 15N por um 13C nos agentes de marcação isobárica. [Veja, Mc Alister et al., Analytical Chemistry, manuscrito aceito, DOI:10.1021/ac301572t]. Apesar dos avanços no grau de multiplexa- ção acessível usando a marcação isobárica, esses métodos têm de-monstrados ser suscetíveis a certas limitações que impactam seu uso na análise quantitativa para aplicações em proteômica. Primeiro, os métodos isobáricos sofrem compressão severa da amplitude dinâmica e perda de exatidão quantitativa devido à interferência do precursor com a janela de isolamento de MS/MS. A interferência do precursor nos métodos isobáricos, por exemplo, tem sido demonstrada degradar significativamente a exatidão quantitativa da técnica. Segundo, os dados quantitativos podem apenas ser obtidos para peptídeos que são selecionados para a análise MS2 adicional. Quando replicatas das análises são necessárias, portanto, isso se torna um problema sério já que há uma alta variação na qual os peptídeos são selecionados para MS2 de uma corrida para a próxima (~60%). Terceiro, os métodos de marcação isobárica atuais são apenas compatíveis com a ativação da colisão para dissociação, limitando assim a versatilidade global dessa técnica.

[005] A partir do precedente, ficará claro que existe atualmente uma necessidade de técnicas de espectrometria de massa para análise proteômica. Por exemplo, são necessárias técnicas de espectrome- tria de massa avançadas que sejam capazes de atingir altos graus de multiplexação necessários para uma análise de alto rendimento de amostras que contêm proteína. Adicionalmente, são necessárias técnicas avançadas de espectrometria de massa que não sejam suscetíveis a problemas de interferência do precursor que podem impactar a exatidão quantitativa e que sejam compatíveis com uma faixa de técnicas de dissociação que incluem a captura de elétron e os métodos de dissociação de transferência de elétron.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] A invenção fornece métodos de espectrometria de massa, composições e sistemas que possibilitam uma plataforma única para a quantificação de analito que acessa graus muito elevados de multiple- xação e quantificação acurada, particularmente bem adequados para uma gama de análise quantitativa para aplicações em proteômica. Modalidades dos presentes métodos e sistemas combinam agentes que codificadores isotópicos caracterizados por diferenças muito pequenas na massa molecular com métodos de espectrometria de massa que fornecem um grande poder de resolução para fornecer uma quantificação relativa ou absoluta do analito em um grande número de amostras. Em algumas modalidades, por exemplo, os métodos de quantificação da invenção acessam um alto grau de multiplexação pela introdução de marcadores isotópicos a partir de um grande número (por exemplo, que varia de 2 a 10 e em algumas modalidades maior do que 20) de agentes codificadores isotópicos que são isotopólogos tais como aminoácidos, agentes de marcação e/ou proteínas e peptí- deos sintéticos, que possuem diferenças de massa que podem ser precisamente resolvidas usando a espectrometria de massa de alta resolução. Os métodos, composições e sistemas aqui descritos possibilitam uma precisão aumentada da quantificação compatível com a multiplexação necessária para obter altos níveis de rendimento.

[007] Em um aspecto, a invenção fornece um método para de- terminar as abundâncias de um analito em uma pluralidade de amostras compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma pluralidade de culturas celulares que incluem pelo menos uma primeira cultura celular e uma segunda cultura celular; (b) fornecer um aminoácido diferente iso- topicamente marcado para cada uma das ditas culturas celulares, em que os ditos aminoácidos isotopicamente marcados de cada uma das ditas culturas celulares são isotopólogos do mesmo aminoácido; (c) cultivar as células de cada uma das ditas culturas celulares, introduzindo dessa maneira um marcador isotópico diferente nas proteínas geradas por cada cultura celular; (d) gerar uma amostra para cada uma das ditas culturas celulares, em que cada amostra é caracterizada por um analito isotopicamente diferente, as ditas amostras incluindo pelo menos uma primeira amostra para a dita primeira cultura celular que possui um primeiro analito isotopicamente marcado e uma segunda amostra para a dita segunda cultura celular que possui um segundo analito isotopicamente marcado, em que os ditos analitos isotopica- mente marcados de cada amostra são isotopólogos; e em que a diferença das massas moleculares do dito primeiro analito isotopicamente marcado e do dito segundo analito isotopicamente marcado é menor ou igual a 300 mDa; (e) analisar os ditos analitos isotopicamente marcados para cada amostra usando uma técnica de análise de espec- trometria de massa que fornece um poder de resolução igual ou maior do que 100.000, gerando dessa maneira um sinal de espectrometria de massa independente e distinguível para os analitos isotopicamente marcados de cada amostra; e (f) comparar os ditos sinais de espec- trometria de massa para os analitos isotopicamente marcados de cada amostra, determinando dessa maneira a abundância do analito na dita pluralidade de amostras.

[008] Em um aspecto, a invenção fornece um método para de terminar as abundâncias de um analito em uma pluralidade de amos- tras compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma pluralidade de amostras, cada uma possuindo o dito analito, incluindo pelo menos uma primeira amostra e uma segunda amostra; (b) fornecer um reagente de marcação isotópica diferente para cada amostra, em que os ditos reagentes de marcação isotópica de cada uma das ditas amostras são isotopólogos e em que os ditos reagentes de marcação isotó- pica não são marcadores isobáricos que possuem um grupo repórter e um grupo de equilíbrio de massa; (c) reagir quimicamente o dito analito e o reagente de marcação isotópica de cada amostra, gerando dessa maneira um analito isotopicamente marcado diferente para cada amostra que inclui um primeiro analito isotopicamente marcado para a dita primeira amostra e um segundo analito isotopicamente marcado para a dita segunda amostra; em que os ditos analitos isotopicamente marcados de cada amostra são isotopólogos; e em que a diferença das massas moleculares do dito primeiro analito isotopicamente marcado e do dito segundo analito isotopicamente marcado é menor ou igual a 300 mDa; (d) analisar os ditos analitos isotopicamente marcados para cada amostra usando uma técnica de análise de espectrome- tria de massa que fornece um poder de resolução igual ou maior do que 100.000, gerando dessa maneira um sinal de espectrometria de massa independente e distinguível para os analitos isotopicamente marcados de cada amostra; e (e) comparar os ditos sinais de espec- trometria de massa para os analitos isotopicamente marcados de cada amostra, determinando dessa maneira a abundância do analito na dita pluralidade de amostras.

[009] Em um aspecto, a invenção fornece um método para de terminar as abundâncias de um analito em uma pluralidade de amostras compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma pluralidade de amostras, cada uma possuindo o dito analito, incluindo pelo menos uma primeira amostra e uma segunda amostra; (b) fornecer um rea- gente de marcação isotópica diferente para cada amostra, em que os ditos reagentes de marcação isotópica de cada uma das ditas amostras são isotopólogos; (c) reagir quimicamente o dito analito e o reagente de marcação isotópica de cada amostra, gerando dessa maneira um analito isotopicamente marcado diferente para cada amostra que inclui um primeiro analito isotopicamente marcado para a dita primeira amostra e um segundo analito isotopicamente marcado para a dita segunda amostra; em que os ditos analitos isotopicamente marcados de cada amostra são isotopólogos; e em que a diferença das massas moleculares do dito primeiro analito isotopicamente marcado e do dito segundo analito isotopicamente marcado é menor ou igual a 300 mDa; (d) analisar os analitos isotopicamente marcados para cada amostra usando uma técnica de análise de espectrometria de massa que fornece um poder de resolução igual ou maior do que 100.000, gerando dessa maneira um sinal de espectrometria de massa independente e distinguível para os analitos isotopicamente marcados de cada amostra; e (e) comparar os sinais de espectrometria de massa para os ana- litos isotopicamente marcados de cada amostra, determinando dessa maneira a abundância do analito na pluralidade de amostras; em que a etapa de analisar os analitos isotopicamente marcados para cada amostra usando a técnica de análise por espectrometria de massa não usa um método de marcação isobárica, por exemplo, em que a etapa de analisar os analitos isotopicamente marcados para cada amostra usando uma técnica de análise de espectrometria de massa não gera um íon repórter ou os dados da espectrometria de massa correspondem a um íon repórter.

[0010] Em alguns métodos da invenção, os analitos isotopicamen- te marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopi- camente marcados e/ou peptídeos ou proteínas isotopicamente marcadas das amostras não compreendem um marcador de massa isobá- rico, tal como o marcador de massa TMT ou iTRAQ. Em algumas mo-dalidades, por exemplo, os analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados e/ou peptídeos ou proteínas isotopicamente marcadas das amostras não possuem pelo menos uma porção dos grupos funcionais de marcadores de massa isobáricos convencionais, tal como não possuem um grupo repórter e/ou não possuem um grupo de equilíbrio de massa. Entretanto, é notado que os reagentes de marcação isotópica da invenção comumente contêm grupos reativos, tais como grupos de proteína ou peptídeo reativo, por exemplo, para permitir a incorporação de um marcador isotópico no analito através de reações químicas.

[0011] Em alguns métodos da invenção, a etapa de analisar os analitos isotopicamente marcados para cada amostra é realizada usando uma técnica de espectrometria de massa de estágio único, tal como uma técnica que envolve a fragmentação e a detecção de íons produto gerados diretamente a partir do analito tal como íons gerados diretamente pelas técnicas de ionização em electrospray e MALDI. Em algumas modalidades, por exemplo, a etapa de analisar os analitos isotopicamente marcados para cada amostra usando a técnica da análise de espectrometria de massa compreende: (i) gerar íons de cada um dos analitos isotopicamente marcados para cada amostra; (ii) fragmentar os ditos íons de modo a gerar íons produto que possuem um marcador isotópico diferente para cada amostra; e (iii) detectar os ditos íons produto para cada amostra. Em algumas modalidades, por exemplo, os íons produto são íons de fragmento de peptídeo que possuem um marcador isotópico, opcionalmente em que os íons produto são detectados sem seleção de massa adicional ou fragmentação dos íons produto. Em uma modalidade específica, a etapa de analisar os anali- tos isotopicamente marcados para cada amostra não é realizada usando a espectrometria de massa de múltiplos estágios MSx, em que x é maior do que ou igual a 2,por exemplo,em que a etapa de analisar os analitos isotopicamente marcados para cada amostra não é realizada usando uma espectrometria de massa sequencial. Alternativamente, a invenção inclui métodos nos quais a etapa de analisar os analitos isotopicamente marcados para cada amostra é realizada usando uma espectrometria de massa de múltiplos estágios MSx, em que x é maior do que ou igual a 2, tal como as técnicas de espectro- metria de massa sequencial.

[0012] Métodos da invenção são compatíveis com uma ampla fai xa de abordagens para a introdução de marcadores isotópicos em analitos para gerar analitos isotopicamente marcados, tais como técnicas reativas, técnicas sintéticas e técnicas metabólicas. Nas técnicas reativas, por exemplo, um ou mais reagentes de marcação isotópica são fornecidos a uma amostra sob condições (por exemplo, concentração de reagente de marcação, temperatura, pH, força iônica, composição do solvente, etc.) tal que pelo menos uma porção do reagente de marcação isotópica reage com o analito para gerar o analito isoto- picamente marcado. Nas técnicas sintéticas, por exemplo, um ou mais padrões isotopicamente marcados, tal como um padrão de peptídeo isotopicamente marcado, são sintetizados, por exemplo, através de reações químicas de aminoácidos codificados com isótopo e depois adicionados a uma amostra sob análise. Nas técnicas metabólicas, por exemplo, compostos codificados com isótopo, tais como aminoácidos e peptídeos isotopicamente marcados, são fornecidos a uma cultura celular sob condições nas quais os aminoácidos ou peptídeos isotopi- camente marcados são incorporados em peptídeos e peptídeos modificados gerados pelas células.

[0013] Em uma modalidade, por exemplo, a etapa de fornecer os aminoácidos isotopicamente marcados diferentes para cada uma das culturas celulares compreende fornecer um meio de crescimento para cada uma das culturas celulares que compreende os aminoácidos iso- topicamente marcados. Em uma modalidade, por exemplo, a introdução de um marcador isotópico diferente nas proteínas geradas por cada cultura celular é obtida através da incorporação metabólica dos aminoácidos isotopicamente marcados nas células das culturas celulares. Em uma modalidade, por exemplo, a etapa de gerar uma amostra para cada uma das culturas celulares compreende lisar as células de cada uma das culturas celulares. Em uma modalidade, por exemplo, a etapa de gerar uma amostra para cada uma das culturas celulares compreende a extração de proteínas de cada uma das culturas celulares. Em uma modalidade, por exemplo, a etapa de gerar a amostra para cada uma das culturas celulares compreende digerir as proteínas de cada uma das culturas celulares. Em uma modalidade, por exem-plo, as amostras são digeridas usando tripsina ou Endo LysC.

[0014] Um aspecto importante dos presentes métodos é o uso de uma série de analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos marcados isotopicamente e/ou peptídeos ou proteínas marcadas isotopicamente que possuem diferenças de massa que podem ser resolvidas usando uma técnica de análise de espectrometria de massa que fornece um poder de resolução igual ou maior do que 100.000. O uso de pelo menos uma porção dos analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoá- cidos marcados isotopicamente e/ou peptídeos ou proteínas marcadas isotopicamente que possuem diferenças de massa molecular (por exemplo, menor ou igual a 300 mDa) é benéfico em algumas modalidades para acessar altas capacidades de multiplexação. Em algumas modalidades, por exemplo, a etapa de analisar os analitos isotopica- mente marcados para cada amostra compreende resolver as diferenças das relações de massa para carga e/ou massas moleculares dos analitos isotopicamente marcados. Em algumas modalidades, por exemplo, a diferença das massas moleculares do primeiro analito iso- topicamente marcado e do segundo analito isotopicamente marcado é menor ou igual a 100 mDa e opcionalmente para algumas aplicações em que a diferença massas moleculares do primeiro analito isotopica- mente marcado e do segundo analito isotopicamente marcado é menor ou igual a 50 mDa e, opcionalmente, para algumas aplicações em que a diferença das massas moleculares do primeiro analito isotopi- camente marcado e do segundo analito isotopicamente marcado é maior ou igual a 10 mDa. Em algumas modalidades, por exemplo, a diferença das massas moleculares do primeiro analito isotopicamente marcado e do segundo analito isotopicamente marcado é selecionada sobre a faixa entre 100 mDa a 1 mDa e, opcionalmente para algumas aplicações em que a diferença das massas moleculares do primeiro analito isotopicamente marcado e do segundo analito isotopicamente marcado é selecionada sobre a faixa entre 50 mDa a 1 mDa e, opcionalmente para algumas aplicações em que a diferença das massas moleculares do primeiro analito isotopicamente marcado e do segundo analito isotopicamente marcado é selecionada sobre a faixa entre 10 mDa a 1 mDa. Em algumas modalidades, por exemplo, cada um dos analitos isotopicamente marcados tem uma massa molecular entre 100 mDa ou 1 mDa de outro analito isotopicamente marcado e, opcionalmente para algumas aplicações, cada um dos analitos isotopica- mente marcados possui uma massa molecular entre 50 mDa a 1 mDa de outro analito isotopicamente marcado e, opcionalmente para algumas aplicações, cada um dos analitos isotopicamente marcados possui uma massa molecular entre 10 mDa a 1 mDa de outro analito iso- topicamente marcado. Em algumas modalidades, por exemplo, as massas moleculares de cada um dos analitos isotopicamente marcados estão dentro de uma faixa de 10000 mDa a 10 mDa e opcionalmente para algumas aplicações, as massas moleculares de cada um dos analitos isotopicamente marcados estão dentro de uma faixa de 1000 mDa a 10 mDa e opcionalmente para algumas aplicações, as massas moleculares de cada um dos analitos isotopicamente marcados estão dentro de uma faixa de 100 mDa a 10 mDa.

[0015] Compostos diferentes codificados isotopicamente da inven ção podem ter vários isótopos pesados estáveis selecionados de uma ampla faixa de aplicações diferentes. Como usados aqui, compostos isotopicamente codificados se referem aqui a compostos que possuem um ou mais isótopos pesados que funcionam como um marcador iso- tópico. Compostos isotopicamente codificados incluem uma gama de reagentes de marcação, analitos padronizados e/ou marcados, tais como analitos isotopicamente marcados, reagentes isotopicamente marcados, aminoácidos isotopicamente marcados, padrões isotopica- mente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas. Compostos isotopicamente marcados incluem compostos que possuem um ou mais isótopos pesados estáveis que são isotopólogos, por exemplo, isotopólogos que podem ser precisamente distinguidos usando a espectrometria de massa com base nas relações de massa para carga medidas.

[0016] Em uma modalidade, por exemplo, os analitos isotopica- mente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos iso- topicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas possuem um número de isótopos pesados estáveis selecionados do grupo que consiste em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20. Em uma modalidade, os analitos isotopi- camente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas possuem um número de isótopos pesados estáveis igual ou maior do que 1 e opcionalmente para algumas aplicações um número de isótopos pesados estáveis igual ou maior do que 4 e opcionalmente para algumas aplicações um número de isótopos pesados estáveis igual ou maior do que 10 e, opcionalmente para algumas aplicações um número de isótopos pesados estáveis igual ou maior do que 15.

[0017] Em algumas modalidades, por exemplo, os analitos isotopi- camente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas são selecionados do grupo que consiste em: um analito iso- topicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 15N; um analito iso- topicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 13C; um analito iso- topicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 18O; um analito isotopicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 34S; e um analito isotopicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 2H.

[0018] Em algumas modalidades, por exemplo, os analitos isotopi- camente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas são selecionados do grupo que consiste em: um analito iso- topicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos dois isótopos de 13C; um analito isotopicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 13C e pelo menos um isótopo de 15N; um analito isotopicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptí- deo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 13C e pelo menos um isótopo de 2H; um analito isotopi- camente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isoto- picamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 13C e pelo menos um isótopo de 18O; um analito isotopicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 13C e pelo menos um isótopo de 34S; um analito isotopicamen- te marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopica- mente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos dois isótopos de 15N; um analito isotopica- mente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopi- camente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 15N e pelo menos um isótopo de 2H; um analito isotopicamente marcado, reagente de marcação iso- tópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 15N e pelo menos um isótopo de 18O; um analito isotopicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 15N e pelo menos um isótopo de 34S; um analito isotopicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos dois isótopos de 2H; um analito isotopicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 2H e pelo menos um isótopo de 18O; um analito isotopicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptí- deo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 2H e pelo menos um isótopo de 34S; um analito isotopi- camente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isoto- picamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos dois isótopos 18O ; um analito isotopi- camente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isoto- picamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 18O e pelo menos um isótopo de 34S; um analito isotopicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 13C, pelo menos um isótopo de 15N e pelo menos um isótopo de 2H; um analito isotopicamente marcado, reagente de marcação iso- tópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 13C, pelo menos um isótopo de 15N e pelo menos um isótopo de 18O; um analito isotopicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isoto- picamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 13C, pelo menos um isótopo de 15N e pelo menos um isótopo de 34S; e um analito isotopicamente marcado, reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isoto- picamente marcados que possuem pelo menos um isótopo de 18O, pelo menos um isótopo de 15N e pelo menos um isótopo de 34S.

[0019] Em uma modalidade, por exemplo, os analitos isotopica- mente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos iso- topicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas são selecionados do grupo que consiste em: um analito iso- topicamente marcado, um reagente de marcação isotópica, aminoáci- do isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados selecionados do grupo que consiste em: um analito isotopi- camente marcado, um reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou que possuem 1, 2, 3, ou 4 isótopos de 15N; um analito isotopicamente marcado, um reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 isótopos de 13C; um analito isotopicamente marcado, um reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem 1 ou 2 isótopos de 18O; um analito isotopicamente marcado, um reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados que possuem um isótopo de 34S; e um analito isotopicamente marcado, um reagente de marcação isotópica, aminoácido isotopicamente marcado e/ou peptí- deo ou proteína isotopicamente marcados que possuem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 isótopos de 2H.

[0020] Os métodos da invenção incluem abordagens de quantifi cação que usam aminoácidos isotopicamente codificados, tais como aminoácidos isotopicamente marcados. Em uma modalidade, por exemplo, os aminoácidos isotopicamente marcados são isotopólogos de um aminoácido que ocorre naturalmente. Em uma modalidade, por exemplo, os aminoácidos isotopicamente marcados são isotopólogos de serina, leucina, tirosina, lisina, metionina ou arginina. Em uma modalidade, por exemplo, os isotopólogos possuem um número estável de isótopos pesados selecionados do grupo que consiste em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, e 20. Em uma modali- dade, por exemplo, os aminoácidos isotopicamente marcados de cada amostra possuem uma fórmula de composição isotópica para seu elemento codificado selecionada do grupo que consiste em: 12C3-i13Ci1H4-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo , em que i<3, j<4, n<1, o<1; 12C6-i13Ci1H7-j2Hj14N4-n15Nn16O1-o18Oo , em que i<6, j<7, n<4, o<1; 12C4-i13Ci1H3-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo , em que i<4, j<3, n<2, o<2; 12C4-i13Ci1H3-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo , em que i<4, j<3, n<1, o<2; 12C3-i13Ci1H3-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo32S1-p34Sp , em que i<3, j<3, n<, o<1, p<1; 12C5-i13Ci1H5-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo , em que i<5, j<5, n<1, o<2; 12C5-i13Ci1H5-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo , em que i<5, j<5, n<2, o<2; 12C2-i13Ci1H2-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo , em que i<2, j<2, n<1, o<1; 12C6-i13Ci1H5-j2Hj14N3-n15Nn16O1-o18Oo , em que i<6, j<,5 n<3, o<1; 12C6-i13Ci1H10-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo , em que i<6, j<10, n<1, o<1; 12C6-i13Ci1H10-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo , em que i<6, j<1,0 n<1, o<1; 12C6-i13Ci1H9-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo , em que i<6, j<9, n<2, o<1; 12C5-i13Ci1H8-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo32S1-p34Sp , em que i<5, j<8, n<1, o<1, p<1; 12C9-i13Ci1H8-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo , em que i<9, j<8, n<1, o<1; 12C5-i13Ci1H7-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo , em que i<5, j<7, n<1, o<1; 12C3-i13Ci1H3-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo , em que i<3, j<3, n<1, o<1; 12C4-i13Ci1H5-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo , em que i<4, j<5, n<1, o<1; 12C11-i13Ci1H8-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo , em que i<11, j<8, n<2, o<1; 12C9-i13Ci1H7-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo , em que i<9, j<7, n<1, o<1; e 12C5-i13Ci1H8-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo , em que i<5, j<8, n<1, o<1; em que cada um de i, j, n, o e p são independentemente um número inteiro ou 0.

[0021] Em uma modalidade, por exemplo, os aminoácidos isotopi- camente marcados têm a fórmula:

em que gN e hN são ambos 15N; ou um de gN e hN é 15N, e um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C; ou um de gN e hN é 15N, e um de j k l m n o p q r s t u v 2 i 18 H, H, H, H, H, H, pH, qH, H, H, H, H e H é H; ou O é O; ou dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C; ou um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H.

[0022] Em uma modalidade, por exemplo, os aminoácidos isotopi- camente marcados têm a fórmula:

em que gN e hN são ambos 15N, e iO é 18O; ou gN e hN são ambos 15N, e dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C; ou gN e hN são ambos 15N, um de aC, bC, cC, dC, eC e fC is 13C, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH is 2H; ou um de gN e hN is 15N, um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e iO é 18O; ou gN e hN são ambos 15N, e dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou um de gN e hN é 15N, e três de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C; ou um de gN eh 15 j k l m n o p q r s t u v 2 N é N, um de H, H, H, H, H, H, pH, qH, H, H, H, H e H é H, e iO é 18O; ou um de gN e hN é 15N, dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C, e iO é 18O; ou um de gN e hN é 15 a b c d e f 13 j k l m n o N, um de C, C, C, C, C e C é C, e dois de H, H, H, H, H, H, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou quatro de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C; ou um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H, e iO é 18O; ou um de gN e hN é 15N, e três de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou três a b c d e f 13 j k l m n o p q de C, C, C, C, C e C são C, e um de H, H, H, H, H, H, pH, qH, r s t u v 2 jk l m n o p q r s H, H, H, H e H é H; ou dois de H, H, H, H, H, H, pH, qH, H, H, tH, uH e vH são 2H, e iO é 18O; ou dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C, e dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; a b c d e f 13 j k l m n o ou um de C, C, C, C, C e C é C, e três de H, H, H, H, H, H, p q r s t u v 2 jk l m n o p pH, qH, H, H, H, H e H são H; ou quatro de H, H, H, H, H, H, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H.

[0023] Em uma modalidade, por exemplo, os aminoácidos isotopi- camente marcados possuem a fórmula:

em que dois de gN, hN, wN e xN são 15N; ou um de gN, hN, wN e xN é 15N, e um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C; ou um de gN, hN, w x 15 j k l m n o p q r s t u v N e N é N, e um de H, H, H, H, H, H, pH, qH, H, H, H, H e H é 2H; ou iO é 18O; ou dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C; ou um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, s t u v 2 jk l m n o p q r s t H, H, H e H é H; ou dois de H, H, H, H, H, H, pH, qH, H, H, H, uH e vH são 2H.

[0024] Em uma modalidade, por exemplo, os aminoácidos isotopi- camente marcados possuem a fórmula:

em que quatro de gN, hN, wN e xN são 15N; ou três de gN, hN, wN e xN são 15N, e um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C; ou três de gN, hN, wN e xN são 15N, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou dois de gN, hN, wN e xN são 15N, e iO é 18O; ou dois de gN, hN, wN e xN são 15N, e dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C; ou dois de gN, hN, wN e xN são 15N, um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou um de gN, hN, wN e xN é 15N, um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e iO é 18O; ou dois de gN, hN, wN e xN são 15N, e dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou um de gN, hN, wN e xN é 15N, e três de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C; ou um de gN, hN, wN e xN é 15N, um de j k l m n o p q r s t u v 2 i 18 H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H e H é H, e O é O; ou um de gN, hN, wN e xN é 15N, dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C, e iO é 18O; ou um de gN, hN, wN e xN é 15N, um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qrstu v 2 abcde f qH, H, H, H, H e H são H; ou quatro de C, C, C, C, C e C são 13C; ou um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H, e iO é 18O; ou um de gN, hN, wN e xN é 15 j k l m n o p q r s t u v 2 N, e três de H, H, H, H, H, H, pH, qH, H, H, H, H e H são H; ou três de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, r s t u v 2 i 18 a b c d e f H, H, H, H e H são H, e O é O; ou dois de C, C, C, C, C e C são 13C, e dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e três de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou quatro de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H.

[0025] Os métodos da invenção incluem abordagens de quantifi cação que usam agentes de marcação isotopicamente codificados, tais como reagentes de marcação isotopicamente marcados e marcadores isotopicamente codificados, tais como grupos funcionais isotopi- camente marcados de analitos que incluem grupos de peptídeos iso- topicamente marcados. Em uma modalidade, por exemplo, os reagentes de marcação isotópica compreendem um grupo amino reativo ou um grupo de ácido carboxílico reativo de uma proteína ou peptídeo. Em uma modalidade, por exemplo, os reagentes de marcação isotópi- ca são isotopólogos de um marcador isotópico de peptídeo ou um marcador isotópico de peptídeo modificado. Em uma modalidade, por exemplo, os reagentes de marcação isotópica são isotopólogos de um reagente de marcação de peptídeo. Em uma modalidade, por exemplo, os isotopólogos do marcador isotópico de peptídeo ou marcador isotópico de peptídeo modificado possuem uma fórmula de composição isotópica para seu elemento codificado selecionada do grupo que consiste em: 12C9-i13Ci1H7-j2Hj35Cl1-m37Clm14N1-n15Nn16O1- o18Oo 12C5-i13Ci1H1-j2Hj14N5-n15Nn16O1-o18Oo 12C5-i13Ci1H6-j2Hj14N2-n15Nn 12C3-i13Ci1H2-j2Hj14N5-n15Nn 12C4-i13Ci1H7-j2Hj14N3-n15Nn 12C4-i13Ci1H6-j2Hj14N4-n15Nn 12C9-i13Ci1H7-j2Hj79Br1-l81Brl14N1-n15Nn16O1- o18Oo 12C4-i13Ci1H2-j2Hj14N3-n15Nn16O1-o18Oo 12C4-i13Ci1H2-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo 12C5-i13Ci1H4-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo 12C14-i13Ci1H14-j2Hj14N3-n15Nn16O4-o18Oo 12C9-i13Ci1H11-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo 12C10-i13Ci1H10-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo 12C10-i13Ci1H9-j2Hj14N3-n15Nn16O3-o18Oo 12C7-i13Ci1H7-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo 12C11-i13Ci1H12-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo32S1- 34 p Sp 12C12-i13Ci1H17-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo 12C9-i13Ci1H9-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo 12C14-i13Ci1H14-j2Hj14N3-n15Nn16O4-o18Oo 12C14-i13Ci1H14-j2Hj14N3-n15Nn16O4-o18Oo 12C12-i13Ci1H13-j2Hj14N2-n15Nn16O3-o18Oo 12C16-i13Ci1H23-j2Hj14N2-n15Nn16O4-o18Oo 12C12-i13Ci1H15-j2Hj14N2-n15Nn16O3-o18Oo 12C14-i13Ci1H19-j2Hj14N2-n15Nn16O4-o18Oo 12C11-i13Ci1H13-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo 12C8-i13Ci1H7-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo 12C18-i13Ci1H21-j2Hj14N4-n15Nn16O5-o18Oo 12C18-i13Ci1H21-j2Hj14N4-n15Nn16O5-o18Oo em que cada um de i, j, l, m, n, o e p são independentemente um número inteiro ou 0.

[0026] Em uma modalidade, por exemplo, os analitos isotopica- mente marcados compreendem independentemente um marcador de peptídeo. Em uma modalidade, por exemplo, o marcador de peptídeo de cada analito isotopicamente marcado tem uma fórmula de composição isotópica para seu elemento codificado selecionado do grupo que consiste em: 12C14-i13Ci1H12-j2Hj14N8-n15Nn16O1-o18Oo 12C27-i13Ci1H27-j2Hj14N8-n15Nn16O4-o18Oo 12C17-i13Ci1H10-j2Hj14N6-n15Nn16O1-o18Oo 12C9-i13Ci1H10-j2Hj14N6-n15Nn16O1-o18Oo 12C30-i13Ci1H31-j2Hj14N12-n15Nn16O4-o18O 12C31-i13Ci1H35-j2Hj14N8-n15Nn16O6-o18Oo 12C15-i13Ci1H12-j2Hj14N8-n15Nn16O1-o18Oo 12C12-i13Ci1H8-j2Hj14N9-n15Nn16O1-o18Oo 12C11-i13Ci1H6-j2Hj14N8-n15Nn16O1-o18Oo 12C31-i13Ci1H35-j2Hj14N8-n15Nn16O4-o18Oo 12C12-i13Ci1H20-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo 12C7-i13Ci1H13-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo 12C18-i13Ci1H25-j2Hj14N3-n15Nn16O3-o18Oo em que cada um de i, j, n, e o são independentemente um número inteiro ou 0.

[0027] Em uma modalidade, por exemplo, os reagentes de marca ção isotópica dos métodos são isotopólogos de um marcador isotópico de molécula pequena. Em uma modalidade, por exemplo, os isotopó- logos de um marcador isotópico de molécula pequena de cada amostra possuem uma fórmula de composição isotópica para seu elemento codificado selecionado do grupo que consiste em: 12C9-i13Ci1H14-j2Hj14N1-n15Nn 12C3-i13Ci1H9-j2Hj28Si1-q30Siq 12C11-i13Ci1H7-j2Hj14N1-n15Nn32S1-p34Sp 12C12-i13Ci1H16-j2Hj14N6-n15Nn16O2-o18Oo32S1- 34 p Sp 12C6-i13Ci1H15-j2Hj28Si1-q30Siq 12C2-i13Ci1H3-j2Hj16O2-o18Oo 12C3-i13Ci16O1-o18Oo 12C4-i13Ci1H5-j2Hj16O2-o18Oo 12C1-i13Ci1H2-j2Hj14N2-n15Nn 12C6-i13Ci1H4-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo 12C2-i13Ci16O1-o18Oo 12C7-i13Ci1H6-j2Hj14N2-n15Nn16O3-o18Oo 12C7-i13Ci1H7-j2Hj14N3-n15Nn16O1-o18Oo 12C6-i13Ci1H3-j2Hj14N4-n15Nn16O4-o18Oo 12C6-i13Ci1H1-j2Hj16O2-o18Oo 12C15-i13Ci1H11-j2Hj16O2-o18Oo 12C6-i13Ci1H8-j2Hj16O2-o18Oo 12C12-i13Ci1H12-j2Hj14N3-n15Nn16O2-o18Oo32S1- 34 p Sp 12C18-i13Ci1H23-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo 12C5-i13Ci1H4-j2Hj14N3-n15Nn 12C6-i13Ci1H8-j2Hj16O2-o18Oo 12C6-i13Ci1H7-j2Hj14N3-n15Nn 12C6-i13Ci1H11-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo 12C11-i13Ci1H11-j2Hj14N3-n15Nn16O1-o18Oo 12C6-i13Ci1H2-j2Hj14N3-n15Nn16O3-o18Oo 12C9-i13Ci1H10-j2Hj14N2-n15Nn32S1-p34Sp 12C11-i13Ci1H7-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo 12C4-i13Ci16O1-o18Oo 12C7-i13Ci1H4-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo32S1-p34Sp 12C7-i13Ci1H4-j2Hj14N1-n15Nn16O4-o18Oo 12C8-i13Ci1H14-j2Hj14N1-n15Nn16O3-o18Oo 12C14-i13Ci1H14-j2Hj14N1-n15Nn16O4-o18Oo 12C9-i13Ci1H12-j2Hj14N2-n15Nn 12C12-i13Ci1H12-j2Hj14N3-n15Nn16O2-o18Oo32S1- 34 p Sp 12C12-i13Ci1H12-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo32S1- 34 p Sp 12C6-i13Ci1H4-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo 12C6-i13Ci1H4-j2Hj14N4-n15Nn16O1-o18Oo 12C20-i13Ci1H15-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo 12C6-i13Ci1H12-j2Hj14N2-n15Nn 12C5-i13Ci1H13-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo 12C6-i13Ci1H4-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo 12C8-i13Ci1H18-j2Hj14N1-n15Nn em cada um de i, j, n, o, p e q são independentemente um número inteiro ou 0.

[0028] Compostos isotopicamente marcados úteis nos presentes métodos, tais como os analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas podem compreender uma ampla gama de combinações de isótopos estáveis. Em uma modalidade, por exemplo, pelo menos uma porção dos analitos isotopi- camente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas compreende pelo menos um isótopo de 12C e pelo menos um isótopo de 15N; e pelo menos uma porção dos analitos isotopica- mente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos iso- topicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas compreende pelo menos um isótopo de 13C e pelo menos um isótopo de 14N. Em uma modalidade, por exemplo, pelo menos uma porção dos analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas compreende pelo menos um isótopo de 12C e pelo menos um isótopo de 2H; e pelo menos uma porção dos analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas compreende pelo menos um isótopo de 13C e pelo menos um isótopo de 1H. Em uma modalidade, por exemplo, pelo menos uma porção dos analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas compreende pelo menos um isótopo de 14N e pelo menos um isótopo de 2H; e pelo menos uma porção dos analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas compreende pelo menos um isótopo de 15N e pelo menos um isótopo de 1H. Em uma modalidade, por exemplo, pelo menos uma porção dos analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoá- cidos isotopicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopica- mente marcadas compreende pelo menos um isótopo de 16O; e pelo menos uma porção dos analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas compreende pelo menos um isótopo de 18O. Em uma modalidade, por exemplo, pelo menos uma porção dos analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas compreende pelo menos dois isótopos de 13C, 2H ou 15N e pelo menos um isótopo de 16O; e pelo menos uma porção dos analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas compreende pelo menos um isótopo de 18O e pelo menos dois isótopos de 12C, 1H ou 14N. Em uma modalidade, por exemplo, pelo menos uma porção dos analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotó- pica, aminoácidos isotopicamente marcados e/ou peptídeo ou proteí- nas isotopicamente marcadas compreende pelo menos dois isótopos de 13C, 2H ou 15N; e pelo menos uma porção dos analitos isotopica- mente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos iso- topicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas compreende pelo menos um isótopo de 34S e pelo menos dois isótopos de 12C, 1H ou 14N.

[0029] Em uma modalidade, por exemplo, cada um dos analitos isotopicamente marcados é independentemente analito de proteína ou um analito de proteína modificada que possui um marcador isotópico diferente. Em uma modalidade, por exemplo, cada um dos analitos iso- topicamente marcados é independentemente analito de peptídeo ou um analito de peptídeo modificado que possui um marcador isotópico diferente. Em uma modalidade, por exemplo, os analitos isotopicamen- te marcados possuem massas moleculares selecionadas da faixa entre 50 Da a 250 kDa, opcionalmente selecionadas da faixa entre 400 Da a 250 kDa, por exemplo, para aplicações direcionadas para anali- tos de proteína e peptídeo. Em uma modalidade, por exemplo, os ana- litos isotopicamente marcados possuem massas moleculares com 1 a 300 mDa entre si.

[0030] Os métodos da invenção fornecem um aperfeiçoamento nas abordagens de quantificação isobáricas e do tipo SILAC, por exemplo, através do acesso de graus muito maiores para multiplexa- ção. A multiplexação intensificada em algumas modalidades resulta, pelo menos em parte, da compatibilidade dos métodos para um grande número de analitos isotopicamente codificados, reagentes, agentes de marcação, marcadores, padrões, aminoácidos, etc. que são isoto- pólogos que são distinguíveis com base na relação massa para carga usando técnicas de análise de espectrometria de massa. Em uma modalidade, a invenção fornece um método multiplex de análise das abundâncias absoluta e relativa do analito na pluralidade de amostras, por exemplo, uma pluralidade de amostras que corresponde às diferenças das condições in vivo e in vitro. Em uma modalidade, por exemplo, o método é para analisar a abundância relativa ou absoluta de um analito em pelo menos 2 amostras, opcionalmente para algumas aplicações pelo menos 4 amostras, opcionalmente para algumas aplicações pelo menos 8 amostras, opcionalmente para algumas aplicações pelo menos 20 amostras. Em uma modalidade, por exemplo, a etapa de fornecer uma pluralidade de culturas celulares compreende fornecer 2 a 20 culturas celulares; e em que a etapa de gerar uma amostra para cada uma das culturas celulares compreende gerar 2 a 100 amostras. Em uma modalidade, por exemplo, a etapa de analisar os analitos isotopicamente marcados para cada amostra usando a técnica da análise de espectrometria de massa que fornece um poder de resolução igual ou maior do que 100.000, gera 2 a 150 dos sinais de espectrometria de massa independentes e distinguíveis que correspondem aos analitos isotopicamente marcados.

[0031] Os presentes métodos são compatíveis com uma ampla faixa de técnicas de espectrometria de massa que fornecem poderes de resolução úteis, incluindo técnicas designadas para sondar as abundâncias dos analitos em uma pluralidade de amostras, tais como amostras que contêm proteína e peptídeo. Em uma modalidade, por exemplo, um método da invenção compreende adicionalmente a etapa de combinar as amostras caracterizadas por um analito marcado iso- topicamente diferente antes da etapa de analisar os analitos isotopi- camente marcados ou os padrões isotopicamente marcados para cada amostra usando a técnica da análise de espectrometria de massa que fornece o poder de resolução igual ou maior do que 100.000, garantindo dessa maneira que cada amostra seja submetida às condições similares de preparação, purificação, ionização, fragmentação e/ou detecção da amostra. Em uma modalidade, por exemplo, analitos isoto- picamente marcados diferentes ou padrões isotopicamente marcados para a pluralidade de amostras são analisados concomitantemente, por exemplo, através de etapas de purificação e etapas de análise es- pectrométrica de massa de uma combinação de uma pluralidade de amostras. Em uma modalidade, por exemplo, a etapa de analisar os analitos isotopicamente marcados para cada amostra compreende: gerar um ou mais íons produto para cada um dos analitos isotopica- mente marcados e medir as relações de massa para carga para pelo menos uma porção dos íons produto usando a técnica da análise de espectrometria de massa que fornece um poder de resolução igual ou maior do que 100.000. Em uma modalidade, por exemplo, a etapa de analisar os analitos isotopicamente marcados diferentes ou padrões isotopicamente marcados para cada amostra é realizada usando uma armadilha de íons quadrupolar, armadilha de íon com ressonância ci- clotrônica de íons com transformada de Fourier, armadilha de íon qua- drupolar linear, armadilha de íon orbitrap, analisador de massa qua- drupolar ou analisador de massa por tempo de voo.

[0032] Em uma modalidade, por exemplo, a etapa de analisar os analitos isotopicamente marcados ou padrões isotopicamente marcados compreende gerar a partir do analito isotopicamente marcado ou padrões isotopicamente marcados, por exemplo, usando técnicas de ionização por electrospray ou MALDI. Em uma modalidade, por exemplo, a etapa de analisar os analitos isotopicamente marcados ou padrões isotopicamente marcados compreende fragmentar íons gerados a partir dos analitos isotopicamente marcados ou padrões isotopica- mente marcados, por exemplo, usando uma ou mais técnicas selecionadas do grupo que consiste em dissociação induzida por colisão (CID), dissociação induzida pela superfície (SID), dissociação induzida por laser (LID), dissociação com captura de elétron (ECD), dissociação com transferência de elétron (ETD).

[0033] Em uma modalidade, por exemplo, o método da invenção compreende adicionalmente purificar as proteínas ou peptídeos das amostras antes da etapa de analisar ao analitos de proteína ou peptí- deo isotopicamente marcados para cada amostra, por exemplo, através de cromatografia em fase líquida (por exemplo, HPLC), cromato- grafia em fase gasoso e/ou eletroforese capilar. Em uma modalidade, por exemplo, o método da invenção compreende adicionalmente fracionar as proteínas ou peptídeos das amostras antes da etapa de analisar ao analitos de proteína ou peptídeo isotopicamente marcados para cada amostra.

[0034] Os métodos da presente invenção são úteis para analisar uma variedade de amostras, incluindo materiais biológicos e amostras derivadas de materiais biológicos, tais como biofluidos, estratos celulares, lisados celulares, extratos de tecido, etc. Os métodos da presente invenção são úteis para analisar amostras derivadas de materiais bio-lógicos in vivo. Os métodos da presente invenção são úteis para analisar amostras para análise proteômica tais como amostras em microar- ranjo e derivadas de ensaios in vitro. Em uma modalidade, por exemplo, o analito é uma proteína, um peptídeo, uma proteína modificada ou um peptídeo modificado. Os métodos da presente invenção são úteis para analisar amostras para análise através de cromatografia a gás - métodos de espectrometria de massa, cromatografia líquida - métodos de espectrometria de massa e eletroforese - métodos de es- pectrometria de massa.

[0035] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para de terminar a abundância de um analito em uma amostra compreendendo as etapas de: (a) fornecer a amostra que possui o analito, em que o analito é um peptídeo ou proteína; (b) fornecer um padrão isotopica- mente marcado para a amostra, em que o analito e o padrão isotopi- camente marcado são isotopólogos; e em que a diferença de massa molecular do analito e do padrão isotopicamente marcado é menor ou igual a 300 mDa; (c) analisar o analito e o padrão isotopicamente marcado na dita amostra usando a técnica da análise de espectrometria de massa que fornece um poder de resolução igual ou maior do que 100.000, gerando dessa maneira sinais de espectrometria de massa independentes e distinguíveis para o analito e o padrão isotopicamente marcado da amostra; e (e) comparar os sinais de espectrometria de massa para o analito e o padrão isotopicamente marcado da amostra, determinando dessa maneira a abundância de analito na amostra. Como usado aqui, um "padrão isotopicamente marcado" se refere a um composto isotopicamente codificado fornecido a uma amostra para permitir a quantificação absoluta ou relativa, tal como um peptídeo ou proteína isotopicamente codificados que são fornecidos a uma amostra em uma quantidade conhecida (por exemplo, tendo uma concentração conhecida). Em uma modalidade, por exemplo, o padrão isoto- picamente marcado é um peptídeo ou proteína isotopicamente codificados sintetizados usando um ou mais aminoácidos isotopicamente marcados, tais como aqueles fornecidos ao longo da presente descrição. Em uma modalidade, o método desse aspecto compreende adicionalmente: (a) fornecer uma pluralidade de amostras, em que cada amostra tenha o analito; (b) fornecer o padrão isotopicamente marcado para cada uma das amostras; (c) analisar o analito e o padrão isotopi- camente marcado em cada uma das amostras usando uma técnica de análise por espectroscopia de massa que fornece um poder de resolu-ção igual ou maior do que 100.000, gerando dessa maneira sinais de espectrometria de massa independentes e distinguíveis para o analito e o padrão isotopicamente marcado de cada amostra; e (e) comparar os sinais de espectrometria de massa para os ditos analitos e os padrões isotopicamente marcados de cada amostra, determinando dessa maneira as abundâncias de analito na pluralidade de amostras.

[0036] A invenção também fornece composições em questão que incluem qualquer um dos compostos isotopicamente codificados aqui descritos, tais como aminoácidos isotopicamente marcados, padrões isotopicamente marcados, analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica e/ou peptídeos ou proteínas isotopicamente marcadas aqui descritas, fornecidos em um estado purificado. Em uma modalidade, por exemplo, a invenção também fornece composições em questão que incluem qualquer um dos compostos isotopicamente codificados aqui descritos, tais como aminoácidos isotopicamente marcados, padrões isotopicamente marcados, analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica e/ou peptídeos ou proteínas isotopicamente marcadas aqui descritas, fornecidos como uma composição enriquecida.

[0037] Sem desejar estar ligado a qualquer teoria em particular, pode haver uma discussão sobre as opiniões ou entendimentos dos princípios subjacentes que se referem aos aparelhos e métodos aqui descritos. É reconhecido que independentemente da correção final de qualquer explicação mecanicista ou hipótese, uma modalidade da in-venção pode, contudo, ser operacional e útil.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[0038] Figura 1. Ilustração de como calcular o poder de resolução. Figura 1A - Como uma definição, o poder de resolução é m/.\m = 500/1 = 500. Figura 1B - Como uma segunda definição, o poder de resolução para o mesmo par de picos é m/m1/2 = 500/0,481 = 1,040. Figura 1C - Com a segunda definição, dois picos e, m/z 500 e 501 são apenas um pouco discerníveis se o poder de resolução for 500.

[0039] Figura 2. Resultados de espectrometria de massa para um par de peptídeos selecionados marcados com lisina em configurações de resolução variáveis. Na resolução de operação típica do sistema Orbitrap MS (30.000), os dois peptídeos marcados com NeuCode são indistinguíveis e aparecem como uma espécie. Quando analisados em um poder de resolução de 240.000, o par é resolvido na linha de base. A operação do sistema em sua resolução mais elevada - 480.000 - produziu uma resolução na linha de base de quase todas as espécies de peptídeo detectadas na mistura complexa.

[0040] Figura 3. Um gráfico que mostra 41 isotopólogos diferentes gerados pela incorporação de nove isótopos pesados em posições di-ferentes no aminoácido Lisina (selecionados entre 15N, 13C, 2H, e 18O). Os isotopólogos possuem um intervalo de faixa de massa de apenas 41,4 mDa. O eixo de x representa cada número de isotopólogo e o eixo de y é a diferença de massa em Da dos resíduos normais de Lys.

[0041] Figura 4. Visão geral dos métodos SILAC e de marcação isobárica. Em SILAC, três clusters isotópicos são gerados: "leve" (0 Da adicionado), "médio" (4 Da adicionados) e "pesado" (8 Da adicionados). Esses sinais são distinguíveis durante a análise MS1 e os croma- togramas de íon para cada um são extraídos ao longo do perfil completo da eluição tal que os dados quantitativos têm a média calculada sobre ~50 varreduras por peptídeo. Na marcação isobárica, todos os plexes possuem a mesma massa tal que apenas um pico de cluster isotópico é gerado durante MS1.Durante a fragmentação da dissociação ativada por colisão (CAD) durante MS2, os marcadores clivam e os sinais do íon repórter são detectados. Esses sinais de íon repórter podem ser integrados para determinar a abundância relativa.

[0042] Figuras 5-7. Varreduras de MS/MS de um peptídeo marca do com NeuCode. Em baixa resolução, tal como mostrado na Figura 5, a informação quantitativa é invisível e os picos aparecem como picos únicos. Em alta resolução (Figura 6), entretanto, esses picos são revelados como picos múltiplos fornecendo dados adicionais (Figura 7). Esses dados são reflexivos da abundância e podem ser usados para a quantificação.

[0043] Figura 8. Cálculos teóricos que ilustram o espaçamento de massa mínimo que pode ser distinguido em R = 480.000 ou 960.000. Figura 8A - O espaçamento m/z mínimo (Th) que pode ser resolvido em m/z 1200 para resoluções de massa de 103 a 106. Figura 8B - Percentual de peptídeos que são resolvidos (FWOM) em várias resoluções de massa (103 a 106).

[0044] Figura 9. Possíveis isotopólogos de Lisina quando sua massa é aumentada em 2 Da usando várias combinações de átomos de 13C, 2H, 15N, 18O. A faixa de massa abrangida pelos isotopólogos depende do número de isótopos pesados e da composição global da molécula marcada. Para Lys +2Da, uma faixa de massa de 18,5 mDa pode ser obtida.

[0045] Figura 10. Dados preliminares usando o método NeuCode SILAC com dois isotopólogos de Lys que diferem em 36 mDa. Figura 10A -Cromatograma do pico basal depois de 60 minutos de análise nLC-MS/MS de peptídeos de levedura trípticos. Figura 10B - varredura MS1 #12.590, coletada a 30K e inserção de um precursor selecionado que possui m/z a 827. Também mostrado na Figura 10B é o sinal registrado em uma varredura MS1 de alta resolução subsequente (480K) e a inserção mostra que o par de SILAC está oculto na resolução típica. Figura 10C - espectro de MS/MS depois de CAD e análise de m/z por captura de íon de par de SILAC codificado por nêutron.

[0046] Figura 11. NeuCode fornece dados quantitativos que são compatíveis com SILAC tradicional. Figura 11A - as linhas horizontais tracejadas indicam a proporção verdadeira (cinza = 1:1, preto = 5:1) enquanto que os gráficos de caixas demarcam a mediana (faixa) e o 25° ao 75° percentil (faixa interquartil, box), 1,5 vezes a faixa interquar- til (whiskers) e anexos (círculos abertos). A partir desses dados, foi concluído que NeuCode SILAC (referido na figura como OMNE SILAC) oferece uma exatidão quantitativa e uma precisão que não é distinguí- vel de SILAC tradicional. Figura 11B - o percentual de tempo que um PSM produziu informação quantitativa para ambos NeuCode SILAC e SILAC tradicional como função da intensidade do precursor. Ambos os métodos produzem dados quantitativos menos frequentemente (em essencialmente a mesma taxa) conforme a intensidade do precursor é diminuída; entretanto NeuCode SILAC gerou 1824 PSMs que possuem uma intensidade de precursor menor do que 105,5 (unidades arbitrárias) enquanto que SILAC tradicional detectou apenas 522 na mesma faixa. NeuCode SILAC permite uma amostragem profunda aumentada comparado com SILAC tradicional, enquanto mantém exatidão quantitativa e precisão altamente comparáveis.

[0047] Figura 12. Um gráfico da distribuição do erro de massa (ppm) como uma função da identificação do valor de (~ significância) para ambos NeuCode SILAC (marcado na figura como OMNE SILAC) e SILAC tradicional para todas as identificações (FDR 1%). A marcação com NeuCode não afetou significativamente a precisão da massa quando comparado com SILAC tradicional.

[0048] Figura 13. Número de isotopólogos codificados por nêutron e suas faixas de massa para os seis aminoácidos mais comumente usados em SILAC.

[0049] Figura 14. Ilustração da estratégia tríplex e quadruplex NeuCode SILAC usando isotopólogos de +8 Da Lisina. Em um poder de resolução de 480K, peptídeos marcados diferencialmente com NeuCode que carregam Lisina espaçada ~ 18 mDa de distância fornecem um método de quantificação tríplex (isotopólogos vermelho e vermelho/azul). Em um poder de resolução maior (isto é, 960K), os isotopólogos podem ser espaçados mais perto em conjunto (~ 12 mDa) tal que agora a quantificação quadriplex pode ser realizada (iso- topólogos azul e vermelho/azul).

[0050] Figura 15. Sumário de isotopólogos possíveis, faixas de massa e capacidade de plexing para isotopólogos de Lisina com +4 Da, +8 Da e +12 Da. A combinação desses três marcadores produz uma capacidade quantitativa altamente plexed.

[0051] Figura 16. Um gráfico das massas e da composição de isó topo de isotopólogos teóricos para o aminoácido Lisina quando 4, 8 ou 12 nêutrons extras são adicionados usando várias combinações de átomos de 13C, 2H, 15N, 18O.

[0052] Figura 17. Resultados preliminares para o acoplamento da estratégia NeuCode SILAC com a estratégia multi-Da SILAC convencional para obter uma capacidade de multiplexação muito alta usando os isotopólogos duplos de Lys (13C6/15N2 Lys (+8,0142 Da) ou 2H8 (+8.0502 Da)). Uma vez marcados, os peptídeos que contêm o duplex NeuCode SILAC e mTRAQ foram misturados (six-plex) em relações de 1:1:1:1:1:1 (esquerda) ou 10:10:5:5:1:1 (direita).

[0053] Figura 18. Diferentes isotopólogos de um marcador quími co que compreende até 8 átomos de 13C e 15N e 4 átomos de 18O (sem átomos de 2H).

[0054] Figura 19. Espectros teóricos obtidos usando marcadores 9-plex aqui descritos em um poder de resolução de 480K. O painel C exibe os dados quantitativos e que são apenas revelados depois da análise de alta resolução.

[0055] Figura 20. Um composto que posse conter átomos de C, N e O suficientes para fornecer as combinações de isotopólogo da Figura 18.

[0056] Figura 21. Outro composto que pode ser usado como mar cador químico NeuCode.

[0057] Figura 22. Ilustração da estratégia NeuCode usando duas versões de Lue isotopicamente marcadas que diferem em massa em 27 mDa. Um isotopólogo tem seis átomos de 13C e um átomo de 15N e o segundo isotopólogo contém sete átomos de 2H. Duas culturas de levedura foram cultivadas em meio de evasão de leucina, cada uma contendo um desses isotopólogos de leucina. As proteínas de cada cultura foram digeridas, misturadas e um peptídeo resultante (AAA- VRDL*SE) analisado pela espectrometria de massa de alta resolução usando um sistema Orbitrap MS. As medidas de abundância relativa foram feitas pela comparação das alturas do pico entre as espécies de isotopólogo.

[0058] Figura 23. Ilustração da marcação por carbamilação de aminas primárias em peptídeos. Figura 23A - A ureia carbamila as aminas primárias de peptídeos quando exposta ao calor. Peptídeos carbamilados com ureia (marcada com 13C ou 15N2) são carbamilados com um único 13C ou 15N para cada grupo carbamila adicionado. Esses marcadores de carbamila diferem em 6,3 mDa por sítio de carba- milação. Figura 23B - O peptídeo LEQNPEESQDIK foi carbamilado usando cada uma das ureias marcadas. Ambos, o peptídeo n-terminal e a amina primária sobre a cadeia de lisina foram carbamilados produzindo dessa maneira peptídeos que estão separados por 12,6 mDa. Essa diferença foi observada como uma diferença m/z de 6,6 para o peptídeo com carga (z) = 2.

[0059] Figura 24. Uma tabela que mostra os elementos comuns que possuem isótopos pesados estáveis que podem ser incorporados nas moléculas. A terceira coluna fornece a massa nominal de cada isótopo enquanto que a terceira coluna fornece as massas exatas. A quarta coluna fornece as relações de abundância dos isótopos.

[0060] Figura 25. Estruturas, fórmulas químicas e fórmulas de elementos codificados para aminoácidos comuns que podem ser usados como reagentes de marcação isotópica.

[0061] Figura 26. Estruturas, fórmulas químicas e fórmulas de elementos codificados para marcadores de peptídeo que podem ser usados como reagentes de marcação isotópica, que são reagidos com um peptídeo ou acoplados ao peptídeo durante a síntese do peptídeo.

[0062] Figura 27. Estruturas, fórmulas químicas e fórmulas de elementos codificados para marcadores de peptídeo adicionais que podem ser usados como reagentes de marcação isotópica.

[0063] Figura 28. Estruturas, fórmulas químicas e fórmulas de elementos codificados para marcadores de molécula pequena que po dem ser usados como reagentes de marcação isotópica.

[0064] Figura 29. Gráfico mostrando que NeuCode SILAC e SI- LAC demonstram uma forte correlação para as alterações de quantificação de proteína durante a diferenciação miogênica de mioblastos C2C12 derivados de camundongo (m = 0,82, R2 = 0,78).

[0065] Figura 30. SILAC e NeuCode para o enriquecimento da ontologia de genes. Os termos do bioprocesso de ontologia de gene estatisticamente diferentes que são regulados negativamente (-) ou regulados positivamente durante a diferenciação de mioblasto para miotubo (valor de p, teste exato de Fisher com correção de Benjamini Hochberg). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0066] Em geral, as expressões e frases usadas aqui possuem seu significado reconhecido na técnica, que podem ser encontrados pela referência a textos padronizados, referências em jornais e contextos conhecidos por aqueles versados na técnica. As definições a seguir são fornecidas para esclarecer seus usos específicos no contexto da invenção.

[0067] Em uma modalidade, uma composição ou composto da in venção tal como um composto isotopicamente codificado que inclui analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados, padrões isotopicamente marcados e/ou peptídeos ou proteínas isotopicamente marcadas, é isolado ou purificado. Em uma modalidade, um composto isolado ou purifi- cado é pelo menos parcialmente isolado ou purificado como é com-preendido na técnica. Em uma modalidade, uma composição ou composto da invenção tem uma pureza química de 90%, opcionalmente para algumas aplicações 95%, opcionalmente para algumas aplicações 99%, opcionalmente para algumas aplicações 99,9%, opcionalmente para algumas aplicações 99,99%, e opcionalmente para algumas aplicações 99,999% puro. Em algumas modalidades, um composto isolado ou purificado da invenção, tal como um composto isoto- picamente codificado que inclui analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados, padrões isotopicamente marcados e/ou peptídeos ou proteínas isotopicamente marcadas, é uma composição isotopicamente enriquecida.

[0068] Várias das moléculas aqui descritas contêm um ou mais grupos ionizáveis. Grupos ionizáveis incluem grupos a partir dos quais um próton pode ser removido (por exemplo, -COOH) ou adicionado (por exemplo, aminas) e grupos que podem ser quaternizados (por exemplo, aminas). Todas as formas iônicas possíveis de tais moléculas e seus sais são pretendidas estar incluídas individualmente na descrição desse. Com relação aos sais dos compostos, aquele especialista na técnica pode selecionar entre uma grande variedade de contraíons disponíveis que são apropriados para a preparação de sais dessa invenção para uma dada aplicação. Em aplicações específicas, a seleção de um dado ânion ou cátion para a preparação de um sal pode resultar em solubilidade aumentada ou diminuída daquele sal.

[0069] Os compostos dessa invenção podem conter um ou mais centros quirais. Consequentemente, essa invenção é pretendida incluir misturas racêmicas, diastereoisômeros, enantiômeros, tautômeros e misturas enriquecidas em um ou mais estereoisômero. O escopo da invenção como descrito e reivindicado abrange as formas racêmicas dos compostos assim como os enantiômeros individuais e misturas não racêmicas desses.

[0070] Como usada aqui, a expressão "grupo" pode se referir a um grupo funcional de um composto químico. Os grupos dos presentes compostos se referem a um átomo ou coleção de átomos que são uma parte do composto. Os grupos da presente invenção podem estar aco-plados a outros átomos do composto através de uma ou mais ligações covalentes. Os grupos também podem ser caracterizados com relação ao seu estado de valência. A presente invenção inclui grupos caracterizados como estados de valência monovalente, divalente, trivalente, etc.

[0071] Como usada aqui, a expressão "íon precursor" é usada aqui para se referir a um íon que é produzido durante o estágio de io-nização da análise de espectrometria de massa, incluindo o estágio de ionização MS1 da análise de MS/MS.

[0072] Como usada aqui, as expressões "íon produto" e "íon se cundário" são usadas alternativamente na presente descrição e se referem a um íon que é produzido durante os processos de ionização e/ou fragmentação durante a análise de espectrometria de massa. A expressão "íon produto secundário" como usada aqui se refere a um íon que é o produto de fragmentações sucessivas.

[0073] Como usada aqui, a expressão "analisar" se refere a um processo para determinar uma propriedade de um analito. A análise pode determinar, por exemplo, as propriedades físicas dos analitos tais como a massa, a relação massa para carga, concentração, abundância absoluta, abundância relativa, ou composição atômica ou do substituinte. No contexto da análise proteômica, a expressão analisar pode se referir a determinação da composição (por exemplo, sequência) e/ou abundância de uma proteína ou peptídeo em uma amostra.

[0074] Como usada aqui, a expressão "analito" se refere a um composto, mistura de compostos ou outra composição que é o objetivo de uma análise. Analitos incluem, mas não são limitados a proteínas, proteínas modificadas, peptídeos, peptídeos modificados, moléculas pequenas, compostos farmacêuticos, oligonucleotídeos, açúcares, po-límeros, metabolitos, lipídeos e misturas desses. Um "analito isotopi- camente marcado" se refere a um analito que tenha sido marcado com um ou mais marcadores isotópicos, tais como um ou mais isótopos pesados estáveis, por exemplo, de uma maneira que permita que iso- topólogos de um analito isotopicamente marcado seja distinguido com base na relação massa para carga e analisado quantitativamente independentemente através da espectrometria de massa. Por exemplo, um " analito isotopicamente marcado" inclui um analito que possui um ou mais isótopos pesados estáveis de hidrogênio, carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre, cloro, bromo e silício, tal como 13C, 15N, 2D, 17O, 18O, 34S, 37Cl, 81Br, 29Si, e 30Si.

[0075] Como usada aqui, a expressão "fonte de íon" se refere a um componente do dispositivo que produz íons a partir de uma amostra, por exemplo, durante a análise de espectrometria de massa. Exemplos de fontes de íon úteis nos presentes métodos incluem, mas não são limitadas a fontes de ionização em electrospray e fontes de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI).

[0076] Como usada aqui, a expressão "espectrometria de massa" (MS) se refere a uma técnica analítica para a determinação da composição elementar, relação massa para carga, abundância absoluta e/ou abundância relativa de um analito. As técnicas espectrométricas de massa são úteis para elucidar a composição e/ou a abundância de analitos, tais como proteínas, peptídeos e outros compostos químicos. A espectrometria de massa inclui processos que compreendem anali- tos ionizantes para gerar espécies carregadas ou fragmentos de espécies, fragmentação de espécies carregadas ou fragmentos de espé- cies, tais como íons produto, e medir as relações de massa para carga de espécies carregadas ou de fragmentos das espécies, incluindo op-cionalmente processos adicionais de isolamento com base na relação massa para carga, processamento de fragmentação adicional, processos de transferência de carga, etc. A condução de uma análise de es- pectrometria de massa de um analito resulta na geração de dados de espectrometria de massa, por exemplo, que compreendem relações de massa para carga dados de intensidade correspondentes para o analito e/ou fragmentos de analito. Os dados de espectrometria de massa que correspondem ao íon do analito ou fragmentos de íon de analito são comumente fornecidos como as intensidades como uma função de unidades de massa para carga (m/z) que representam as relações de massa para carga dos íons de analito e/ou fragmentos de íon de analito. A espectroscopia de massa comumente permite intensidades que correspondem a diferenças de analitos a serem resolvidos em termos de relações diferentes de massa para carga. Na espectro- metria de massa sequencial (MS/MS ou MS2), sequências múltiplas de análise de espectrometria de massa são realizadas. Por exemplo, amostras que contêm uma mistura de proteínas e peptídeos podem ser ionizadas e os íons precursores resultantes separados de acordo com as suas relações de massa para carga. Os íons precursores selecionados podem então ser fragmentados e analisados posteriormente de acordo com a proporção de massa para carga dos fragmentos.

[0077] Como usada aqui, a expressão "interferência" se refere a uma espécie detectada em uma análise que interfere com a detecção de uma espécie ou analito de interesse. A interferência pode se referir a detecção de uma proteína ou fragmento de proteína que não é a proteína ou fragmento de proteína de interesse e que interfere com a detecção exata ou a quantificação do fragmento de proteína ou peptídeo de interesse. A interferência pode ser quantificada como uma propor- ção de interferência, tal como uma proporção de uma quantidade se sinal de interferência para uma quantidade de sinal de analito. Em uma análise de espectro de massa, a interferência pode ser manifestada como um pico de interferência que corresponde à detecção de uma espécie que não é um analito de interesse.

[0078] Como descrito aqui, "isolamento" ou uma "janela de isola mento" se refere a uma variedade de íons, tal como íons precursores que são seletivamente separados e fragmentados, manipulados ou isolados.

[0079] Como usada aqui, a expressão "espécie" se refere a uma molécula particular, composto, íon, ânion, átomo, elétron ou próton. A espécie inclui analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas.

[0080] Como usada aqui, a expressão "relação sinal-ruído" se re fere a uma medida que quantifica o quanto do sinal foi corrompido pelo ruído ou sinal indesejado. Também se refere à relação da força do sinal pra a força do ruído que corrompe o sinal. Uma relação maior do que 1:1 indica mais sinal do que ruído e é desejável para algumas aplicações.

[0081] Como usada aqui, a expressão "relação massa para carga" se refere à relação da massa de uma espécie para o estado da carga de uma espécie. A expressão "unidade de m/z" se refere a uma medida da relação de massa para carga. A unidade Thomson (abreviada como Th) é um exemplo de uma unidade de m/z e é definida como o valor absoluto da relação da massa de um íon (em Daltons) para a carga do íon (com relação à carga elementar).

[0082] Como usada aqui, a expressão "íon óptico" se refere a um componente do dispositivo que auxilia no transporte e na manipulação de partículas carregadas, por exemplo, pela aplicação de campos elé- tricos e/ou magnéticos. O campo elétrico ou magnético pode ser estático, alternante ou pode conter ambos componentes estático e alter- nante. Componentes do dispositivo de íon óptico incluem, mas não são limitados a defletores de íon que desviam os íons, lentes de íons que focalizam os íons e multipolos (tais como quadrupolos) que confinam os íons em um espaço ou trajetória específicos. Íon óptico inclui componentes do dispositivo de multipolos RF que compreendem múltiplas hastes que possuem ambos campos elétrico e/ou magnético estático ou alternante.

[0083] Como usada aqui, a expressão "espectrômetro de massa" se refere a um dispositivo que gera íons a partir de uma amostra, separa os íons de acordo com a relação massa para carga e detecta íons, tais como íons produto derivados de analitos isotopicamente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos isotopica- mente marcados e/ou peptídeos ou proteínas isotopicamente marcadas. Espectrômetros de massa incluem espectrômetros de massa de estágio único e de múltiplos estágios. Espectrômetros de massa de múltiplos estágios incluem espectrômetros de massa sequencial fragmentam os íons separados pela massa e separam os íons produto pela massa uma vez.

[0084] Como usada aqui, a expressão "estado de doença" se refe re a uma condição que pode causar dor, disfunção, estresse, problemas sociais e/ou morte de um paciente. Métodos e sistemas aqui descritos podem ser úteis para o diagnóstico de um estado de doença.

[0085] As expressões "peptídeo" e "polipeptídeo" são usadas co mo sinônimos na presente descrição e se referem a uma classe de compostos formados por resíduos de aminoácidos quimicamente ligados juntos pelas ligações amida (ou ligações peptídicas). Peptídeos e polipeptídeos são compostos poliméricos que compreendem pelo menos dois resíduos de aminoácidos ou resíduos de aminoácidos modifi- cados. As modificações de aminoácidos em peptídeos incluem, mas não são limitados a fosforilação, glicosilação, lipidação, prenilação, sul- fonação, hidroxilação, acetilação, metilação, oxidação de metionina, alquilação, acilação, carbamilação, iodetação e a adição de cofatores. Peptídeos incluem proteínas e incluem adicionalmente composições geradas pela degradação de proteínas, por exemplo, pela digestão proteolítica. Peptídeos e polipeptídeos podem ser gerados substanci-almente pela digestão completa ou digestão parcial de proteínas. Poli- peptídeos incluem, por exemplo, polipeptídeos que compreendem 2 a 100 unidades de aminoácidos, opcionalmente para algumas modalidades 2 a 50 unidades de aminoácidos e, opcionalmente para algumas modalidades 2 a 20 unidades de aminoácidos e, para algumas modalidades 2 a 10 unidades de aminoácidos.

[0086] "Proteína" se refere a uma classe de compostos que com preende uma ou mais cadeias de polipeptídeo e/ou cadeias de poli- peptídeo modificado. Proteínas podem ser modificadas pelos processos que ocorrem naturalmente tais como modificações pós-tradu- cionais ou modificações cotraducionais. Modificações pós-traducionais ou modificações cotraducionais exemplificadoras incluem, mas não são limitadas a fosforilação, glicosilação, lipidação, prenilação, sulfo- nação, hidroxilação, acetilação, metilação, oxidação de metionina, adição de cofatores, proteólise e montagem de proteínas em complexos macromoleculares. As modificações de proteínas também podem incluir derivados que não ocorrem naturalmente, análogos e miméticos funcionais gerados pela síntese química. Derivados exemplificadores incluem modificações químicas tais como alquilação, acilação, carba- milação, iodetação e qualquer modificação que derivatiza a proteína.

[0087] Como usada aqui, a expressão "controlador" se refere a um componente do dispositivo que pode ser programado para controlar um dispositivo ou sistema, como é bem conhecido na técnica. Contro- ladores podem, por exemplo, ser programados para controlar sistemas de espectrômetro de massa de modo a realizar o método como aqui descrito. A invenção inclui espectrômetros de massa que possuem um controlador configurado para realizar qualquer um dos métodos aqui descritos.

[0088] Como descrito aqui, a expressão "fracionado" ou "fracionar" se refere à separação física de uma amostra, como é bem conhecido na técnica. A amostra pode ser fracionada de acordo com as propriedades físicas tais como massa, comprimento ou afinidade por outro composto entre outros, usando as técnicas cromatográficas como são bem conhecidas. O fracionamento pode ocorrer em um estágio de separação que atua para fracionar uma amostra de interesse por uma ou mais propriedades físicas, como bem conhecido na técnica. Os estágios de separação podem empregar, entre outras técnicas, as técnicas cromatográficas líquida e gasosa. Os estágios de separação incluem, mas não estão limitados a sistemas de separação de cromatografia líquida, sistemas de separação de cromatografia a gás, sistemas de separação de cromatografia de afinidade e sistemas de separação de eletroforese capilar.

[0089] Análise quantitativa em química é a determinação da abun dância absoluta ou relativa de uma, várias ou todas as substâncias particulares em uma amostra. Para amostras biológicas, a análise quantitativa realizada através da espectrometria de massa pode de-terminar as abundâncias relativas de peptídeos e proteínas. O processo de quantificação envolve tipicamente a marcação isotópica de anali- tos de proteína e peptídeo e a análise através da espectrometria de massa.

[0090] "Fragmento" se refere a uma porção de molécula, tal como um peptídeo. Os fragmentos podem ser íons carregados isolados ou múltiplos. Os fragmentos podem ser derivados da clivagem de uma ligação em uma molécula parental, incluindo a clivagem específica para o sítio de ligações de polipeptídeo em um peptídeo parental. Fragmentos também podem ser gerados a partir de eventos ou etapas de clivagem múltipla. Os fragmentos podem ser um peptídeo truncado, na terminação carboxila, na terminação amino ou em ambas de um peptí- deo parental. Um fragmento pode se referir a produtos gerados depois da clivagem de uma ligação de polipeptídeo, uma ligação de C-C, uma ligação de C-N, uma ligação de C-O ou uma combinação desses processos. Os fragmentos podem se referir a produtos formados pelos processos através dos quais uma ou mais cadeias laterais de aminoá- cidos são removidas ou uma modificação é removida ou qualquer combinação desses processos. Fragmentos úteis na presente invenção incluem fragmentos formados sob condições metaestáveis ou resultam da introdução de energia para o precursor por uma variedade de métodos que incluem, mas não são limitados a dissociação induzida por colisão (CID), dissociação induzida por superfície (SID), dissociação induzida por laser (LID), dissociação por captura de elétron (ECD), dissociação por transferência de elétron (ETD) ou qualquer combinação desses métodos ou quaisquer equivalentes conhecidos na técnica de espectrometria de massa sequencial. Fragmentos úteis na presente invenção também incluem, mas não são limitados a fragmentos do tipo x, fragmentos do tipo y, fragmentos do tipo z, fragmentos do tipo a, fragmentos do tipo b, fragmentos do tipo c, íon interno (ou íons de clivagem interna), íons de imônio ou íons satélites. Os tipos de fragmentos derivados de um analito, tal como um analito isoto- picamente marcado, padrão isotopicamente marcado e/ou peptídeo ou proteína isotopicamente marcados, geralmente dependem da sequência do parental, método de fragmentação, estado da carga do íon precursor parental, quantidade de energia introduzida no íon precursor parental e método de liberação de energia no íon precursor parental. As propriedades dos fragmentos tais como a massa molecular podem ser caracterizadas pela análise de um espectro de massa de fragmentação.

[0091] Um "grupo amina reativa" de um reagente de marcação po de ser qualquer grupo funcional capaz de reagir com um grupo amina de um peptídeo, proteína ou outra molécula, formando dessa maneira uma ligação entre o reagente de marcação e o peptídeo, proteína ou outra molécula.

[0092] Um "aminoácido" se refere a um composto orgânico que contém um grupo amino (NH2), um grupo de ácido carboxílico (COOH) e qualquer um de vários grupos de cadeia lateral. Aminoácidos podem ser caracterizados pela fórmula básica NH2CHRCOOH, onde R é o grupo da cadeia lateral. Aminoácidos naturais são aqueles aminoáci- dos que são produzidos na natureza tais como isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, ácido aspártico, metionina, cisteína, fenila- lanina, ácido glutâmico, treonina, glutamina, triptofano, glicina, valina, prolina, serina, tirosina, arginina e histidina assim como ornitina e se- lenocisteína.

[0093] Como usado aqui, "isotopicamente marcado" se refere a compostos (tais como aminoácidos isotopicamente marcados, padrões isotopicamente marcados, analito isotopicamente marcado, reagentes de marcação isotópica e/ou peptídeo e proteínas isotopicamente marcadas) que possuem um ou mais marcadores isotópicos, tais como um ou mais isótopos pesados estáveis. Um "marcador isotópico" se refere a um ou mais isótopos pesados estáveis introduzidos em um composto, tal como aminoácidos isotopicamente marcados, padrões isotopi- camente marcados, analito isotopicamente marcado, reagentes de marcação isotópica e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas, tal que o composto gere um sinal quando analisado usando a es- pectrometria de massa que pode ser distinguido de outros isotopólo- gos com base na relação de massa para carga. "isotopicamente pesado" se refere a um composto ou fragmentos/porções desse que possuem uma ou mais massas altas ou isótopos pesados (por exemplo, isótopos pesados estáveis tais como 13C, 15N, 2D, 17O, 18O, 33S, 34S, 37Cl, 81Br, 29Si, e 30Si).

[0094] Em uma modalidade, uma composição isotopicamente en riquecida compreende um composto da invenção que possui uma composição isotópica específica, em que o composto está presente em uma abundância que é pelo menos 10 vezes maior, para algumas modalidades pelo menos 100 vezes maior, para algumas modalidades pelo menos 1000 vezes maior, para algumas modalidades pelo menos 10.000 vezes maior do que a abundância do mesmo composto que possui a mesma composição isotópica em uma amostra que ocorre naturalmente. Em outra modalidade, uma composição isotopicamente enriquecida tem uma pureza com relação a um composto da invenção que possui uma composição isotópica específica que é substancialmente enriquecida, por exemplo, uma pureza igual ou maior do que 90%, em algumas modalidades igual ou maior do que 95%, em algumas modalidades igual ou maior do que 99%, em algumas modalidades igual ou maior do que 99,9%, em algumas modalidades igual ou maior do que 99,99% e em algumas modalidades igual ou maior do que 99,999%. Em outra modalidade, uma composição isotopicamente enriquecida é uma amostra que tenha sido purificada com relação a um composto da invenção que possui uma composição isotópica específica, por exemplo, usando os métodos de purificação de isótopo conhecidos na técnica.

[0095] "Poder de resolução de espectrometria de massa", frequen temente denominado resolução, é uma medida quantitativa do quanto os picos de m/z em um espectro de massa estão separados (isto é, resolvidos). Existe uma variedade de convenções para calcular o po- der de resolução. A definição da IUPAC é: Poder de resolução (R): R = m/&m

[0096] A Figura 1A, é de Harris, Quantitative Chemical Analysis. Essa Figura e a equação acima ilustram como calcular o poder de re-solução (R) onde m é a massa que corresponde ao pico e Δm é o es-paçamento entre o pico e o pico vizinho mais próximo. Outra definição utilizada para o poder de resolução é:

[0097] Nessa definição (veja a Figura 1B), m é a massa que cor-responde ao pico (m) e m ^ é uma variável que se refere a largura total na metade do valor máximo do pico (m ^ = FWHM). Com a segunda definição, dois picos em m/z 500 e 501 são apenas um pouco dis- cerníveis se o poder de resolução for 500 (Figura 1C). Esse método de calcular a resolução é particularmente útil já que ele fornece uma métrica para avaliar a largura do pico não importando se há um vizinho próximo para comparar com ele. Para os cálculos contidos nessa descrição nós usamos esse método de cálculo da resolução.

[0098] Como usada aqui, a "fórmula codificada elementar" de um composto se refere aos elementos constituintes do composto, assim como ao número de átomos de cada elemento que são adequados para serem isotopicamente marcados com isótopos pesados estáveis, por exemplo, para formar isotopólogos que podem ser analisados através da espectrometria de massa nos presentes métodos. A fórmula codificada elementar de um composto conterá os mesmos ou menos elementos, assim como o mesmo ou um número menor de átomos de cada elemento do que a fórmula química do composto devido ao fato de que alguns átomos do composto podem não ser adequados para serem marcados isotopicamente para formar isotopólogos para uso nos presentes métodos. Por exemplo, átomos de H do composto que são facilmente permutáveis por átomos de H de solventes tal co- mo a água, podem não ser adequados para serem isotopicamente marcados nos presentes métodos por que tais processos de troca podem degradar a assinatura isotópica dos analitos e/ou padrões isotopi- camente marcados. Similarmente, se o composto contém grupos de partida ou grupos reativos que não estão, em última análise, presentes nas espécies isotopicamente marcadas, tais como analitos isotopica- mente marcados, reagentes de marcação isotópica, aminoácidos iso- topicamente marcados e/ou peptídeo ou proteínas isotopicamente marcadas, então os átomos dentro dos grupos de partida ou grupos reativos também não serão adequados para serem isotopicamente marcados na presente invenção e, portanto, não serão incluídos na fórmula codificada elementar. Certos elementos de tais grupos reativos e/ou grupos de partida, por exemplo, podem ser trocados e/ou removidos de outra maneira ou perdidos na reação química entre o marcador e o analito e, portanto, não resultarão na incorporação em um marcador isotópico. Por exemplo, em uma modalidade, a fórmula química para lisina é: C6H14N2O2, enquanto que a fórmula codificada elementar para a lisina é: C6H9N2O. Em uma modalidade, os átomos de H que são facilmente permutáveis por átomos de H de solventes não estão incluídos em uma formula codificada elementar do composto. Por exemplo, em uma modalidade, os átomos de H de pelo menos alguns e, opcionalmente, de todos os grupos -OH, -SH, -NH- e -NH2 farão parte da fórmula química do composto, mas não farão parte da fórmula codificada elementar do composto. Em uma modalidade adicional, os átomos de O de pelo menos alguns e, opcionalmente de todos os grupos OH não farão parte da fórmula codificada elementar do composto. Em uma modalidade adicional, os átomos de O de pelo menos alguns e, opcionalmente de todos os grupos OH não farão da fórmula codificada elementar do composto. Em uma modalidade, todos os átomos de carbono em um composto, particularmente um aminoácido, farão parte da fórmula codificada elementar do composto. Em uma modalidade, todos os átomos de nitrogênio em um composto, particularmente um aminoácido, farão parte da fórmula codificada elementar do composto.

Descrição resumida da quantificação do proteoma

[0099] Existem atualmente dois métodos principais para a quantifi cação global do proteoma. O primeiro é SILAC (análise da razão de isótopos estáveis em aminoácidos em cultura celular), que é muito po-pular e tem sido usado por quase uma década. Em SILAC, átomos de 13C são incorporados em aminoácidos tal que esses aminoácidos (chamados de aminoácidos pesados) são 3 a 6 Da mais pesados do que os aminoácidos normais. As células foram então cultivadas em culturas separadas, uma cultura contendo os aminoácidos pesados e a outra cultura contendo os aminoácidos normais.

[00100] As novas proteínas sintetizadas nas culturas incorporam os aminoácidos pesados ou os aminoácidos normais e as células são então tratadas com uma perturbação e as proteínas são combinadas. Depois da digestão enzimática, os peptídeos produzidos possuem a mesma sequência, mas possuem massas discretamente diferentes devido aos átomos de 13C nos aminoácidos pesados. Quando analisadas por MS, dois picos distintos são vistos para o mesmo peptídeo - um pico leve e um pico pesado. Esses picos estão geralmente separados por aproximadamente 3 a 8 Da. Entretanto, tem sido muito difícil a análise multiplex (comparar 4 ou mais amostras simultaneamente) com SILAC por que uma separação mínima de 3 Da entre os peptí- deos marcados é necessária para minimizar a superposição de distribuição isotópica. Com uma faixa máxima de 10 Da, plexing é limitado grosseiramente a 3 amostras.

[00101] Devido à falta de habilidade para multiplex (>3), os pesquisadores se tornaram cada vez mais animados com a marcação isobá- rica (produtos comerciais TMT ou iTRAQ). A marcação isobárica envolve a dição de um marcador para os peptídeos do analito. Marcadores isobáricos são designados para ter três componentes: (1) um grupo reativo para o acoplamento ao analito, (2) um grupo de equilíbrio e (3) um grupo repórter ionizável. Os grupos de equilíbrio e repórter são designados com uma distribuição de isótopos estáveis tal que eles possuam a mesma massa com aproximadamente 6 a 8 marcadores diferentes. Quando as amostras eluem no espectrômetro de massa, as amostras marcadas possuem todas a mesma massa de modo que um único pico é obtido. Os alvos nesse pico são isolados e o grupo repórter é clicado. Cada grupo repórter tem uma massa que está aproximadamente 1 Da separado do próximo grupo repórter de modo que 6 a 8 analitos se tornam distinguíveis usando MS/MS. Entretanto, existem dois problemas genuínos com a marcação isobárica. Primeiro, os alvos são isolados com uma janela ampla, aproximadamente 2 a 3 m/z e assim as interferências ficam isoladas, depois cofragmentadas durante MS/MS e produzem picos repórter nos mesmos valores de m/z, levando a uma faixa dinâmica e uma precisão quantitativa menores. O segundo problema é que uma varredura de MS/MS deve ser adquirida para dar dados quantitativos. Isso se torna problemático com múltiplas replicatas já que o que se torna superposto entre o que é isolado por MS/MS em um experimento para o próximo pode ser baixo.

[00102] Os desenvolvedores dos marcadores isobáricos TMT publicaram recentemente um trabalho que mostra que pela troca de um 12C por um 13C e concomitantemente um 15N por um 14N nos reagentes de TMT, pode ser obtido um novo reagente que tem uma diferença de massa de 6 mDa devido à energética da diferença de ligação do nêutron entre N e C. Essa discreta diferença de massa os torna distinguíveis usando espectrômetros de massa de alta resolução. Com essa abordagem, eles expandiram seus reagentes de TMT de um sistema de 6-plex para um de 8-plex.

Descrição Resumida do Presente Sistema de Marcação

[00103] A presente invenção descreve um novo método e reagentes de marcação customizados para a quantificação de proteoma por MS chamada de modo geral "marcação de massa codificada por nêutron" ou "NeuCode". Esse método também é referido aqui como "desvio de massa codificado de nêutron" ou "OMNE". Nesse método, a diferença de massa de nêutron entre isótopos pesados, tais como N e C, pode ser acoplada com aminoácidos e novos marcadores reagentes, para criar um método de quantificação baseado em MS1 que é superior a ambos SILAC convencional e marcação isobárica de várias maneiras. Essa ideia foi testada incialmente usando dois aminoácidos pesados de lisina com +8 Da, um com seis 13C e dois 15N e outro com oito deutérios (2H).

[00104] Figura 2 ilustra os resultados do par de lisina marcada selecionado de peptídeos em configurações de resolução variáveis. Na resolução de operação típica do sistema Orbitrap MS (30.000) os dois peptídeos marcados NeuCode são indistinguíveis e aparecem como uma espécie. Quando analisados em 240.000, entretanto, o par é resolvido na linha de base e a abundância relativa de cada analito pode ser determinada.

[00105] Esses marcadores de nêutron podem ser incorporados em aminoácidos e depois os aminoácidos modificados usados durante a cultura celular similar a SILAC. Usando tal sistema de marcação poderá aliviar o problema de complicação espectral associado com SILAC e permite a multiplexação aumentada. Cálculos iniciais para a incorporação de nove isótopos pesados diferentes no aminoácido Lisina (átomos de 15N, 13C, 2H, ou 18O) mostraram que a construção de 41 isoto- pólogos diferentes que possuem intervalos de massa de apenas 41,4 mDa é possível (mostrado na Figura 3).

[00106] Adicionalmente, esse sistema de marcação pode ser usado com novos reagentes de marcação e não são limitados aos métodos relacionados com SILAC. Isso pode permitir a análise dos tecidos e outros fluidos corporais que não são compatíveis com a cultura de tecido. A tecnologia de éster de NHS é uma química amplamente usada para ligar marcadores em peptídeos para análise proteômica. Ambos os métodos de marcação isobárica (iTRAQ e TMT) usam essa abordagem. Consequentemente, o presente sistema de marcação poderá usar um marcador semelhante a um dipeptídeo ou outros marcadores capazes de se ligar aos peptídeos, o que é simples de sintetizar que também usa a química de ligação de éster NHS. Diferente dos marcadores isobáricos, entretanto, o presente sistema de marcação não exige projetos especializados que incorporam grupos repórter, ligantes e sítios de carga. Ao invés disso, os marcadores da presente invenção são designados para permanecerem ligados ao peptídeo e fornecer uma medida quantitativa apenas quando examinados sob condições de alta resolução. Uma versão inicial desse marcador foi testada in silico e mostra possibilitar uma análise de 5-plez nos poderes de resolução de MS atuais. A resolução dos sistemas de espectrometria de massa é esperada razoavelmente dobrar dentro de alguns anos, o que significa que esse marcador poderá permitir então a análise de 9-plex.

[00107] Portanto, o uso desse sistema de marcação com cultura celular permite maior multiplexação comparado com métodos SILAC convencionais, enquanto também melhora o problema da complexidade espectral associado com SILAC. Usando esse sistema de marcação com novos marcadores reagentes permite uma multiplexação similar comparado com os métodos de marcação isobárica, mas sem os problemas causados pelas interferências devidas ao co-isolamento ou a necessidade de realizar MS/MS.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Antecedentes dos Métodos SILAC e de Marcação Isobárica e Visão Geral da Marcação de Massa Codificada por Nêutron

[00108] As tecnologias de identificação de proteína têm amadurecido rapidamente tal que a construção de catálogos de milhares de proteínas presentes em uma célula usando a espectrometria de massa é agora relativamente simples. Conhecer como a abundância dessas moléculas se altera sob várias circunstâncias, entretanto, não é simples. A incorporação de um isótopo estável é o componente central de várias estratégias de quantificação de proteína baseadas em MS. Atualmente, existem duas abordagens principais para conseguir isso. A primeira é introduzir metabolicamente isótopos pesados estáveis (isto é, 13C, 18O, 15N, 2H) em proteínas durante o crescimento celular. Em SILAC, os aminoácidos que incorporam isótopos estáveis, que são 4 a 8 Da mais pesados do que os aminoácidos normais, são incluídos no meio da cultura celular tal que as proteínas sintetizadas incorporem os aminoácidos pesados, A combinação do crescimento celular em meios pesado e leve produz proteomas idênticos, exceto que cada peptídeo que inclui um aminoácido pesado difere em +4 Da de sua contrapartida leve. Usando essa técnica, os proteomas podem ser comparados simultaneamente pela análise de MS dos peptídeos pesado e leve.

[00109] A marcação isobárica é uma solução elegante para esse problema, permitindo a quantificação relativa de até oito proteomas simultaneamente. Adicionalmente, diferente das abordagens de marcação metabólica, ela é compatível com tecidos e biofluidos de mamíferos. Apesar do seu potencial, a marcação isobárica não tem sido amplamente abraçada para estudos em larga escala - principalmente por causa do problema de interferência do precursor. Esse problema não existe para SILAC por que as medidas de abundância são obtidas de espectros de massa com pesquisa em alta resolução (MS1). Mesmo para amostras muito complexas que possuem centenas de peptí- deos que coeluem, os analisadores de massa de alto poder de resolução podem distinguir facilmente o alvo dos picos da vizinhança com menos do que 0,01 Th de distância.

[00110] Marcadores isobáricos são designados para ter três com-ponentes: (1) um grupo reativo para o acoplamento ao analito, (2) um grupo de equilíbrio e (3) um grupo repórter ionizável. Os grupos de equilíbrio e repórter são projetados com isótopos estáveis tal que eles têm a mesma massa agregada com 6 a 8 marcadores diferentes. Dessa maneira, 6 a 8 amostras são coanalisadas. Quando as amostras marcadas eluem no espectrômetro de massa, todas as amostras terão a mesma massa e assim apenas um pico é produzido. Quando a MS/MS é realizada, o peptídeo marcado é fragmentado fazendo com que o grupo repórter seja clivado e seja detectado. Cada grupo repórter tem uma massa que está aproximadamente separada por 1 Da do próximo grupo repórter, e assim 6 a 8 analitos se tornam distinguíveis na análise MS/MS. A partir disso, a abundância do analito em cada uma das 6 a 8 condições pode ser determinada. Qualidade da Quantificação de MS1 vs. MS2

[00111] SILAC é a estratégia de multiplexação mais amplamente usada para a quantificação de proteína. Pela obtenção de dados quantitativos a partir da varredura de MS1, SILAC pode oferecer um desempenho quantitativo aperfeiçoado sobre as abordagens de marcação isobárica por três razões principais. Primeiro, as medições de abundância por MS1 permitem calcular a média de vários pontos de dados por peptídeo. A marcação isobárica, por outro lado, tipicamente extrai todas as informações a partir de uma única varredura de MS/MS. Um segundo benefício da quantificação baseada em MS1 vs MS2 é que depois da identificação do peptídeo, a informação quantitativa para aquele peptídeo pode ser extraída apenas dos dados de MS1 em cada replicata. A marcação isobárica, entretanto, requer ambos a coleta de uma varredura de MS2 e uma identificação em cada análise de replicata. Com uma superposição de ~ 50 a 75% de corrida para corrida nas identificações espectrais, essa ressalva limita o teste de significância estatística para o subgrupo de peptídeos/proteínas identificado através de múltiplos experimentos. A terceira vantagem da quantificação centrada de MS1 é a precisão quantitativa aperfeiçoada. Especificamente, a marcação isobárica sofre do problema bem documentado de interferência do precursor - o coisolamento de impurezas. Esse problema não existe em SILAC por que as medidas de abundância são obtidas a partir de varreduras de MS1 de alta resolução e mesmo para amostras muito complexas que possuem centenas de peptídeos que eluem em conjunto, analisadores de massa de alto poder de resolução podem distinguir o alvo dos picos vizinhos distantes em menos do que 0,01 m/z. Na abordagem da marcação isobárica, o peptídeo alvo é isolado em uma resolução muito menor (tipicamente 13 m/z), depois dissociado para produzir marcadores repórteres. Portanto, o sinal quantitativo na região repórter é compilado de cada espécie na janela de isolamento. O isolamento concomitante de múltiplas espécies é a regra e não a exceção mesmo para amostras altamente fracionadas. Multiplexação

[00112] Mesmo com essas limitações fundamentais, duas vantagens essenciais - compatibilidade com o tecido e alta capacidade de multiplexação - impelem o uso disseminado da marcação isobárica. Como a marcação isobárica é uma estratégia de marcação química ao invés de metabólica, podem ser comparadas até 8 amostras de tecido de mamífero. A habilidade para analisar fluidos e tecidos biológicos é vital para aplicação da proteômica na medicina translacional. Além da análise direta óbvia de tecidos humanos, existem incontáveis modelos de doença de mamífero, por exemplo, câncer, diabetes, esclerose múl- tipla, etc., onde a caracterização do proteoma requer tecnologias com-patíveis com o tecido. O progresso da proteômica quantitativa a partir de cultura celular frente a modelos de doença baseados em animais mais complexos,requer a análise aumentada de replicatas e, tipicamente, vários estados biológicos. Em um experimento simples para examinar os efeitos da restrição calórica (CR) e a deacetilase Sirt3 em camundongos, existem quatro condições - wt (tipo selvagem) (controle), knockout para Sirt3, CR wt e CR knockout para Sirt3. Para o teste de significância estatística, pelo menos 3 animais em cada condição devem ser analisados com um mínimo de 12 amostras. E esse experimento considera apenas a análise de um tecido, uma idade e uma linhagem. Portanto, a habilidade de obter comparações proteômicas multiplexadas expandidas com alta precisão quantitativa e reprodutibi- lidade impactará profundamente a biologia e a medicina modernas. Questões de precisão com a quantificação por MS2 não estão aceita-velmente resolvidas

[00113] Embora as abordagens de MS2 já forneçam capacidade de multiplexação, a qualidade dos dados e a superposição da quantificação (reprodutibilidade, veja acima) ainda estão precisando de aperfei-çoamento. Têm sido feitos esforços para ultrapassar essas deficiências. Por exemplo, as reações de íon/íons para a purificação do precursor na fase gasosa têm sido exploradas assim como as estratégias baseadas em MS3. Apesar da precisão quantitativa aperfeiçoada em sistemas de modelo (aproximadamente -20% de viés de precisão, isto é, valor verdadeiro 10:1 detectado como 8:1), ciclo de trabalho, sensibilidade e disponibilidade de ambas abordagens são problemáticos. Ambos os métodos de aquisição MS3 e QuantMode reduzem o ciclo de trabalho e, consequentemente, geram cerca de 50 a 70% das identificações quando comparadas com análises típicas de shotgun. A sensibilidade de cada abordagem é igualmente restrita pela profundi- dade limitada da amostragem (ciclo de trabalho) e pelas intensidades reduzidas do íon repórter (perdas de purificação). Finalmente, ambos requerem a presença de uma captura de íon e QuantMode requer ca-pacidade de ETD. A experiência com essas abordagens de purificação indica que não há recurso simples para as questões de ciclo de trabalho, sensibilidade e compatibilidade delineadas acima. Esses problemas, combinados com a falta de reprodutibilidade da quantificação baseada em MS2 sobre análises de múltiplas replicatas (veja acima), sugerem acentuadamente que o desenvolvimento de uma abordagem centrada em MS1 multiplexada é a chave para o progresso da proteô- mica quantitativa e, em particular, sua aplicação na medicina translaci- onal. Multiplexação com MS1 - O caminho a seguir

[00114] Infelizmente, a obtenção da análise multiplexada com a tecnologia baseada em MS1 tem sido desafiadora. SILAC fornece um meio de fazer comparações binárias ou ternárias e pelo entrelaçamento desses experimentos, comparações de alta ordem podem ser obtidas; entretanto, a obtenção de tais medidas é trabalhosa e apenas relatada por um grupo de laboratórios especializados. SILAC é praticamente limitado a comparações triplas por que uma separação mínima de 4 Da entre os peptídeos marcados é necessária para minimizar a superposição de distribuição isotópica. Esse espaçamento é grandemente comprimido quando a carga do precursor é 3 ou maior.

[00115] Em SILAC, são gerados múltiplos clusters isotópicos, tipicamente afastados por 4 Da, para cada plex adicional que é quantificado - até três plex (veja a Figura 4). Esses sinais são distinguidos durante a análise MS1 e os cromatogramas de íon para cada um são extraídos sobre o perfil de eluição completo tal que a média dos dados quantitativos é calculada sobre ~ 50 varreduras por peptídeo. Na marcação isobárica, todos os plexes têm a mesma massa, tal que apenas um pico de cluster isotópico é gerado durante MS1. Durante MS2, os marcadores são clivados e os sinais dos íons repórter são detectados. Esses podem ser integrados para determinar a abundância relativa. Essa abordagem, entretanto, frequentemente extrai dados quantitativos a partir de uma única varredura e um evento MS2 é necessário.

[00116] A habilidade para introduzir isótopos pesados na Lys para SILAC é limitada por sua composição (seis átomos de C e 2 átomos de N); portanto, a versão pesada mais amplamente comercializada é de +8 Da. Algumas tentativas para aumentar a multiplexação de SI- LAC têm sido relatadas, mas requerem computação não trivial e a presença de Arg dentro de cada peptídeo. Essas limitações impedem sua adoção disseminada. Um segundo problema da multiplexação de SI- LAC é a complexidade espectral aumentada. Especificamente, para cada peptídeo, cada canal de SILAC produz um conjunto adicional de picos de m/z. A amostragem de MS/MS de mais do que um desses picos produz identificações redundantes e, consequentemente, consome a largura de banda tal que uma abundância menor de picos de m/z frequentemente não seja amostrada. Em geral, tal complexidade aumentada reduz a cobertura do proteoma. Marcação Isobárica de Massa Codificada por Nêutron

[00117] Os desenvolvedores dos marcadores isobáricos de TMT descobriram recentemente que a troca de 12C por um 13C e concomi-tantemente de um 15N por um 14N nos reagentes TMT pode fornecer um novo reagente que tem uma diferença de massa de 6 mDa. A mudança de massa resulta da discrepância na energia de ligação do nêutron entre N e C e pode ser distinguida com uma resolução de massa de 50.000 em m/z 130. Pela implementação dessa abordagem, os reagentes de TMT podem ser expandidos de um sistema 6-plex para um sistema 8-plex. Esse novo conceito de TMT isobárico ainda recai na quantificação baseada em MS2 e tudo isso não resolve as questões delineadas acima. A presente invenção faz progressos nesse conceito de codificação por nêutron para desenvolver uma tecnologia de quantificação baseada em MS1 ultramultiplexada (até 45 plex) que combine os melhores aspectos de ambos, SILAC e marcação isobárica. Diferenças Entre a Codificação por Nêutron e a Marcação Isobárica Tradicional

[00118] A marcação isobárica tradicional repousa sobre a introdução de marcadores químicos para peptídeos. Os marcadores químicos são designados para ter três componentes específicos: um grupo reativo, um grupo de equilíbrio e um grupo repórter. Durante a análise MS1, os analitos marcados com marcadores isobáricos aparecem como um único pico de m/z e a informação quantitativa não pode ser obtida a partir da análise MS1 - não importando quão alto é o poder de resolução. Os dados quantitativos são só recuperados depois da fragmentação dos íons precursores pela ativação pela colisão. Durante esse processo, o grupo repórter carregado é liberado do grupo de equilíbrio e produz um pico m/z detectável em uma massa definida. Marcadores isobáricos atualmente oferecem até 8 canais de quantificação. Os íons repórter variam em massa entre cada canal por 1 Da. Por exemplo, m/z 126, 127 e 128. Portanto, os dados quantitativos podem apenas ser medidos pela realização, primeiro, da ativação pela colisão e pelo monitoramento dos íons produto por MS/MS.

[00119] As limitações dessa abordagem são várias. Primeiro, como nenhum dado é derivado da varredura de MS1, se um evento de MS/MS não é adquirido para um dado precursor, então nenhum dado quantitativo de qualquer tipo é registrado. Segundo, todos os precursores dentro da janela de isolamento de MS/MS (geralmente cerca de 1 a 3 m/z) são submetidos à colisão e produzem marcadores repórter. Isso significa que o sinal quantitativo é a convolução de todos os precursores dentro da janela de isolamento. Essa deficiência limita seve- ramente a precisão quantitativa. Terceiro, a marcação isobárica é apenas compatível com um tipo de dissociação - ativação por colisão. A chave para a marcação isobárica é que o grupo repórter pode ser clivado do grupo de equilíbrio e detectado. Para os produtos comerciais, esses devem ter sido otimizados para a ativação por colisão; entretanto, vários tipos de dissociação estão presentes e incluem a captura de elétron e a dissociação por transferência junto com aquelas que usam fótons.

[00120] A estratégia de codificação com nêutron da presente invenção abrange diferenças de massa muito sutis nos analitos para os processos quantitativos. Essas diferenças são tão pequenas (<50 mDa) que não podem ser distinguidas em poderes de resolução normais de MS. A análise sob condições de alta resolução, entretanto (>100.000) pode separar esses picos pouco espaçados e revelar a informação quantitativa. Códigos de nêutrons podem ser introduzidos pelas células em crescimento em isotopólogos de aminoácidos personalizados ou pela colocação de marcadores químicos nos peptídeos. Para o último caso, os reagentes químicos não possuem as características de um marcador isobárico tradicional, isto é, sem grupo repórter ou de equilíbrio. Ao invés disso, o marcador é simplesmente um veículo de liberação para incorporar um perfil de nêutron em cada analito. Esse perfil é então detectado apenas quando a amostra é analisada sob condições de alta resolução, tipicamente na varredura de MS1.

[00121] As Figuras 5-7 mostram varreduras de MS/MS de um pep- tídeo marcado codificado com nêutron. Em baixa resolução, tal como mostrado na Figura 5, a informação quantitativa é invisível e o pico aparece como picos únicos. Em alta resolução (Figura 6), entretanto, esses picos são revelados como picos múltiplos que fornecem dados adicionais (Figura 7). Esses dados são reflexivos da abundância e podem ser usados para a quantificação.

[00122] Outra diferença principal da marcação isobárica tradicional é que as assinaturas que codificam nêutron da presente invenção permanecem com o peptídeo depois da dissociação. A dissociação pode ser obtida por qualquer método de fragmentação. Íons produto que resultam da clivagem do arcabouço de peptídeo que contém o marcador de codificação de nêutron, seja o aminoácido ou o marcador químico, serão detectados se analisados sob altas condições de resolução (>100.000). Diferente da marcação isobárica tradicional, esses sinais não ocorrem na mesma massa para cada precursor (a massa do fragmento repórter), eles ocorrem junto com os fragmentos de arcabouço do peptídeo e em cada fragmento que contém o marcador de nêutron. Isso significa que a informação quantitativa também pode ser coletada dos espectros de MS/MS, mas apenas se rastreados sob alta resolução e em picos de m/z onde o peptídeo se fragmenta. Portanto, para a codificação com nêutron, o problema da interferência de marcadores isobáricos tradicionais é eliminado. Visão Geral de NeuCode

[00123] A diferença de massa codificada por nêutron que tem sido explorada para expandir a capacidade de multiplexação da marcação isobárica pode ser aproveitada para criar um método de quantificação MS1 - um que seja superior a ambos, SILAC e marcação isobárica convencionais.

[00124] Para determinar a praticabilidade de NeuCode, uma biblioteca de 105.067 espectros de massa sequencial identificados foi examinada e foi determinado que 99,4% dos precursores de peptídeo tinham valores de m/z de 1200 ou menos. Depois, a diferença de resolução mínima (amplitude total em 1% max, FWOM, isto é, apenas 1% de superposição em áreas de pico) foi calculada para um precursor de 1200 Th como uma função do poder de resolução que varia entre 103 a 107 (Figura 8A). O Orbitrap atual comercialmente disponível é capaz de um poder de resolução de 480.000, possibilitando a separação de precursores espaçados tão limitadamente quanto 11,1 mTh. Esse valor cai pela metade (5,6 mTh) com a mais alta resolução de Orbitrap relatada de 960.000. O precursor médio tem m/z muito menor (~750) e pode ser resolvido a 7,0 e 3,5 mTh em 480.000 e 960.000 respectivamente. Usando esses cálculos como guia, a biblioteca de peptídeo foi usada para modelar o percentual do peptidoma que poderia ser quanti- ficável (isto é, separado em FWOM) quando marcado em intervalos de 12, 18 e 36 mDa (Figura 8B). Isso leva e consideração a diversidade do precursor, z e m/z que é tipicamente observada em um experimento shotgun. Esses dados demonstram que em um poder de resolução de 480.000, >85% dos peptídeos identificados podem ser quantificados (isto é resolvidos) quando espaçados com intervalo de 18 mDa. Em um poder de resolução de 960.000, >90% de cobertura foi obtida com 12 mDa de espaçamento.

[00125] Esses dados confirmam que com a capacidade de 480.000 do poder de resolução do Orbitrap comercial atual, a detecção e a identificação usando a estratégia de marcação NeuCode podem ser obtidas para aproximadamente o peptidoma inteiro com espaçamento de ~18 mDa entre os picos marcados. Com o poder de resolução mais elevado de 960.000 relatado para Orbitrap, uma cobertura similar pode ser obtida com um espaçamento de pico de apenas 12 mDa. Foi determinado a seguir quais faixas de espaçamento e tamanhos de lacuna poderiam ser obtidos usando os elementos comuns encontrados em sistemas biológicos - isto é, C, H, N e O. A Figura 9 apresenta todos os isotopólogos teóricos do aminoácido Lisina que contém uma compensação de +2 Da pela incorporação de 13C, 2H, 15N, 18O em várias combinações. Com apenas uma modesta diferença de massa de 2 Da, 7 isotopólogos podem ser criados abrangendo uma faixa de massa de 18,5 mDa (referida aqui como a massa deslocada) oferecendo uma marcação de duplex ou tríplex (isto é, espaçamento de ~9 e 18 mDa). A incorporação de isótopos mais estáveis, +8 Da, pode fornecer faixas de deslocamento de massa em excesso de 50 mDa. Junto com os cálculos teóricos acima, concluiu-se que deslocamentos de massa suficientes podem ser introduzidos para possibilitar a implementação da estratégia NeuCode com o poder de resolução de massa disponível atualmente.

[00126] Aminoácidos Codificados com Nêutron para SILAC Multi- plexado (NeuCode SILAC)

[00127] Análise racional: A síntese de aminoácidos que incorporam a estratégia de marcação NeuCode produzirá reagentes de SILAC que expandem muito (4 a 10X) a capacidade de multiplexação da técnica de quantificação de proteína padrão ouro - SILAC. Essa capacidade de multiplexação adicionada não aumenta a complexidade espectral de MS1 nem reduz a taxa de identificação do peptídeo, quando comparada com a estratégia SILAC convencional.

[00128] Hipótese: O uso de espaçamento isotópico com multi-Da convencional limita SILAC a comparações binárias e ternárias. Expe-rimentos altamente multiplexados permite a medida de experimentos ao longo do tempo, permite a coleta de dados de replicatas biológicas e possibilita a comparação direta de dados transcriptômicos e proteô- micos. Pela incorporação de vários isotopólogos de Lisina, cada um diferindo em aproximadamente 10 mDa, um conjunto de aminoácidos é criado, fornecendo 12 canais para quantificação quando combinados. Esses aminoácidos fornecem um nível grandemente aumentado de multiplexação e desempenho comparados a SILAC.

[00129] Dados Preliminares: Para testar a hipótese de que os iso- topólogos isobáricos de aminoácidos podem permitir a hiperplexação de SILAC, dois aminoácidos de lisina pesada +8 Da foram adquiridos, um com seis átomos de 13C e dois átomos de 15N e o outro com oito átomos de 2H. Esses dois isotopólogos diferem em massa por 36 mDa e são facilmente distinguíveis na resolução de sistemas Orbitrap atuais comercialmente disponíveis (480 K). Duas culturas de levedura (BY4741 Lys1Δ) foram cultivadas em meio "drop-out" completo sintético definido suplementado com a lisina "leve" (+0 Da), "pesada 1" 13C6/15N2 Lys (+8,0142 Da) ou “pesada 2” 2H8 (+8,0502 Da). Para assegurar a incorporação completa de Lys, as células foram propagadas por pelo menos 10 duplicações, depois coletadas em fase semiloga- rítmica por centrifugação a 3000 xg por 3 minutos. Os péletes celulares foram ressuspensos em 5 mL de tampão de lise e a proteína foi extraída pela trituração com esfera de vidro. A proteína das células de levedura lisadas foi reduzida, alquilada e digerida com endo-LysC. Depois, três amostras para SILAC tradicional foram preparadas em proporções de misturação conhecidas pela combinação dos peptídeos marcados com "leve" (+0 Da) e "pesada 1" (+8 Da) em proporções de 1:1 e 1:5 em massa. As proporções para NeuCode SILAC foram preparadas exatamente da mesma maneira, exceto pelo uso de peptídeos marcados com "pesada 1" (+8,0142 Da) e “pesada 2” (+8,0502 Da).

[00130] Amostras de cada método (isto é, NeuCode SILAC e SILAC tradicional) foram carregadas independentemente em uma coluna capilar nLC e o gradiente eluído em uma captura de íon- MS hibrido com Orbitrap durante 60 minutos. Para SILAC tradicional, as análises de MS1 foram realizadas em um poder de resolução de 30.000 com os 10 precursores top mais intensos selecionados para a análise de MS/MS (captura de íon CAD). Para a análise NeuCode SILAC, uma varredura de MS1 adicional foi implementada em um poder de resolução de 480.000 imediatamente depois da primeira varredura completa com poder de resolução de 30.000. A varredura de alta resolução distinguiu os pares de NeuCode SILAC - decodificando efetivamente os dados quantitativos incorporados. Exemplos de espectros a partir dessa aná- lise estão apresentados na Figura 10; o painel A exibe uma varredura de MS1 (R=30K) e o painel B apresenta o cluster isotópico de um precursor selecionado em m/z 827. Aqui, o sinal que é gerado sob o po-der de resolução típico de 30K e a varredura para a quantificação de alta resolução (480K) são colocados em um gráfico. Ambos isotopólo- gos de Lisina "pesada" que estão espaçados por apenas 36 mDa foram observados. O espaçamento muito próximo de m/z desses parceiros de NeuCode SILAC é ideal para o rastreamento por MS/MS, já que ambos isotopólogos são coisolados, fragmentados e analisados juntos quanto a massa. De fato, como a análise de MS/MS é tipicamente executada em baixa resolução (isto é, <7500), os espectros de MS/MS de NeuCode SILAC são essencialmente idênticos àqueles da amostra não multiplexada, não marcada. O Painel C da Figura 10 exibe a MS/MS com captura de íon do precursor isolado mostrados no Painel B. Nessas baixas resoluções, a informação da abundância codificada está oculta e a combinação espectral é executada como se nenhuma multiplexação tivesse sido realizada. Deve ser notado que a varredura em alta resolução leva ~ 1,6 segundos para completar; entretanto, o sistema realiza as análises de MS/MS com captura de íon (top 10) durante esse tempo tal que muito pouco efeito sobre a sobrecarga seja induzido (16.852 vs. 18.973 espectros de MS/MS adquirido, NeuCode SILAC vs SILAC tradicional, respectivamente). O experimento NeuCo- de SILAC produziu combinações espectrais de peptídeo único (PSMs) mais consideravelmente - 2.935 vs 2401. Isso por que em SILAC tradicional, cada precursor de peptídeo único aparece em dois valores distintos de m/z - separados por 4 Da. Isso significa que existe uma quantidade tremenda de redundância nas identificações de peptídeo por que a maioria dos peptídeos parceiros abundantes são ambos se-lecionados. O resultado é uma profundidade de amostragem limitada. NeuCode SILAC elimina esse problema já que toda informação quanti- tativa está codificada dentro de um único pico de m/z para cada precursor (inserto da Figura 10B) tal que as varreduras de MS/MS re-dundantes sobre os picos dos parceiros não são adquiridas. Exatidão e precisão quantitativa de NeuCode SILAC

[00131] A seguir, a qualidade dos dados quantitativos gerados por NeuCode SILAC (também referido como OMNE SILAC) foi avaliada em comparação com SILAC tradicional. Figura 11A captura a métrica quantitativa para ambos os métodos: as linhas pontilhadas horizontais indicam a proporção verdadeira (cinza = 1:1, preto = 5:1), enquanto que os gráficos de caixas demarcam a mediana (faixa), o 25° ao 75° percentil (faixa interquartil, box), 1,5 vezes a faixa interquartil (whiskers) e anexos (círculos abertos). A partir desses dados, foi concluído que NeuCode SILAC oferece uma exatidão e uma precisão quantitativas que não é distinguível de SILAC tradicional. Dos 2935 PSMs postados por NeuCode SILAC, 80% era quantificável (2572). Para SILAC tradicional, 2120 PSMs produziram dados quantitativos - 88% dos 2401 PSMs totais. Foi perguntado por que NeuCode SILAC teria uma taxa quantificável reduzida? Deve ser notado que os PSMs foram quantificados apenas se ambos os parceiros tivessem sido detectados com uma proporção S/N em excesso de 2:1. Foi suposto que já que NeuCode SILAC permitiu uma maior profundidade de amostragem e, portanto, mais identificações para precursores S/N inferiores, provavelmente não há diferença fundamental na frequência com a qual o peptídeo pode ser identificado entre os dois métodos. Para testar essa hipótese, o percentual de tempo no qual um PSM produziu informação quantitativa foi representado em gráfico (Figura 11B) para ambos, NeuCode SILAC e SILAC tradicional como uma função da intensidade do precursor. Ambos os métodos produziram dados quantitativos menos frequentemente (em essencialmente a mesma taxa) conforme a intensidade do precursor é diminuída; entretanto, NeuCode SILAC ge- rou 1824 PSMs que tinham uma intensidade de precursor menor do que 105,5 (unidades arbitrárias) enquanto que SILAC tradicional só detectou 522 na mesma faixa. NeuCode SILAC permite uma profundidade de amostragem aumentada comparado com SILAC tradicional, enquanto mantém uma exatidão e precisão quantitativas altamente comparáveis.

[00132] Preliminarmente, todas as identificações dos dados de NeuCode SILAC foram geradas usando varreduras de MS1 coletadas sob ajustes de baixa resolução (30K, Figura 10B). Como esses picos contêm duas versões não resolvidas de cada peptídeo que diferem em massa por 36 mDa, foi questionado se poderia resultar em qualquer diminuição importante na exatidão da massa. Para testar isso, o erro de distribuição de massa (ppm) foi representado em gráfico como uma função do valor de e da identificação (~ significância) para ambos, NeuCode SILAC e SILAC tradicional, para todas as identificações (FDR 1%, Figura 12). Uma diminuição muito sutil na exatidão da massa para NeuCode SILAC - 3,5 vs. 2,5 ppm - está presente com precisão comparável. Foi concluído que esse aumento sutil no erro de massa não é problemático já que a maioria dos bancos de dados de pesquisa estabelece tolerâncias de erro de massa de ± 7 a ± 25 ppm. Também foi notado que o uso dos valores de massa da varredura de MS1 de alta resolução, onde os isotopólogos são resolvidos, poderia eliminar completamente esse erro sutil.

[00133] Preparação da amostra. A cepa BY4741 Lys 1Δ de Sac- charomyces cerevisiae foi cultivada em meio drop-out definido, sintético completo (SC, Sunrise Science) suplementado com lisina leve (+0 Da), lisina pesada 613C/215N (+8.0142 Da, Cambridge Isotopes), ou pesada 8D (+8.0502 Da, Cambridge Isotopes). As células foram deixadas propagar por um mínimo de 10 duplicações para assegurar a completa incorporação da lisina. Depois de alcançar a fase semiloga- rítmica, as células foram coletadas por centrifugação a 3000 xg por 3 minutos e lavadas três vezes com ddH2O gelada. Péletes celulares foram suspensos novamente em 5 mL de tampão de lise (Tris 50 mM pH 8, ureia 8 M, cloreto de sódio 75 mM, butirato de sódio 100 mM, ortovanadato de sódio 1 mM, comprimido de inibidor de protease e fosfatase) e a proteína total foi extraída pela trituração com esfera de vidro (Retsch). A concentração de proteína no lisado foi medida por BCA (Pierce).

[00134] A proteínas das células de levedura lisadas foi reduzida pela adição de ditiotitriol 5 mM e incubação por 30 minutos em temperatura ambiente. Os tióis livres foram alquilados pela adição de iodoace- tamida 15 mM e incubados no escuro, em temperatura ambiente por 30 minutos, seguidos pelo resfriamento súbito com ditiotitriol 5 mM. A concentração de ureia foi diluída para 4 M com tris 50 mM pH 8,0. A digestão proteolítica foi realizada pela adição de LysC (Wako), proporção de enzima para proteína 1:50 e incubada em temperatura ambiente por 16 horas. A reação de digestão foi extinta pela adição de TFA e dessalinizada com um sep-pak tC18 (Waters).

[00135] Proporções conhecidas de SILAC foram preparadas pela misturação de peptídeos marcados com "leve" = +0 Da e "pesada" = +8 Da nas proporções de "leve" para pesada" de 1:1, 1:5 e 1:10 em massa. As proporções para NeuCode foram preparadas exatamente da mesma maneira, exceto para leve = +8,0142 Da e pesada = +8.0502 Da.

[00136] Amostras com 6 plex foram preparadas pela marcação de cada peptídeo de levedura para NeuCode SILAC com três marcadores mTRAQ (AB SCIEX), de acordo com o protocolo do fabricante, exceto que a hidroxilamina foi adicionada para extinguir a reação de marcação depois de 12 horas. Esses peptídeos foram misturados na proporção de 10:10:5:5:1:1 em massa.

[00137] LC-MS/MS. Para a comparação de NeuCode SILAC vs. SILAC, cada amostra foi carregada independentemente sobre um capilar de 75 μm embalado com partículas com 5 μm Magic C18 (Mi- chrome) em fase móvel A (ácido fórmico 0,2% em água). Os peptídeos foram eluídos em um gradiente de fase móvel B (ácido fórmico 0,2% em acetonitrila) durante 60 minutos. Os peptídeos eluídos foram analisados por um espectrômetro de massa Orbitrap elite (Thermo Scientific). Uma varredura de avaliação foi realizada pelo Orbitrap em um poder de resolução de 30.000 para identificar os precursores da amostra para os dados dependentes de espectrometria de massa sequencial com captura de íon por CAD top-10. A análise de NeuCode SILAC uma varredura quantitativa adicional com alto poder de resolução de 480.000 imediatamente depois da varredura de avaliação. O modo de pré-visualização foi ativado e precursores com carga desconhecida ou carga = +1 foram excluídos da amostragem de MS2. Os valores de acúmulo de íon-alvo de MS1 e MS2 foram ajustados para 1 x 106 e 4 x 104, respectivamente. A exclusão dinâmica foi ajustada para 30 segundos para -0,55 m/z e +2,55 m/z de precursores selecionados. Amostras de MS1 6 plex foram analisadas como acima, exceto para as alterações a seguir. As amostras foram eluídas sobre um gradiente de 90 minutos. A espectrometria de massa sequencial foi realizada pela fragmentação de HCD na célula HCD seguida pela detecção no Orbitrap com poder de resolução de 15.000. Finalmente, os valores de acúmulo de íon-alvo em MS2 foram ajustados para 5 x 104.

[00138] Análise de dados. Os arquivos brutos de MS foram convertidos em arquivos de texto pesquisáveis e pesquisados contra um banco de dados de captura de alvo (Saccharomyces Genome Database (levedura), www.yeastgenome.org; UniProt (camundongo), www.uniprot.org) usando o Open Source Mass Spectrometry Search Algorithm (OMSSA). Para todas as amostras, a oxidação da metionina e a carbamidometilação da cisteína foram pesquisadas como uma modificação variável e fixa, respectivamente. As amostras de SILAC foram pesquisadas independentemente com uma lisina não modificada e uma +8,014199 com modificação fixa e combinadas mais tarde durante a filtração da taxa de descoberta falsa. As amostras de NeuCode SILAC foram pesquisadas com uma única modificação fixa que representa a média da mudança de massa dos isotopólogos 613C/215N e 82H (+8,0322). A tolerância de massa do precursor foi definida como 100 ppm e a tolerância de massa de íon do fragmento foi ajustada para 0,5 Da. Essa tolerância de massa do precursor relativamente ampla foi usada para responder pela diferença de massa observada entre os isotopólogos. Os resultados da pesquisa foram filtrados para FDR 1% com base nos valores de E. Amostras de 6 plex foram pesquisadas como acima, exceto para as seguintes alterações. A versão leve (l), média (m) e pesada (h) de mTRAQ foram pesquisadas independentemente. As modificações fixas N terminais do peptídeo: +140,0953 (l), +144,1024 (m), ou +148,104 (h); modificações fixas da lisina: +148,1275 (l), +152,1346 (m), ou +156,1362 (h); modificações variáveis da tirosina: +140,0953, +144,1024, ou +148,104. A tolerância de massa de fragmento de íon foi reduzida para 0,1 Da. As três pesquisas independentes foram combinadas durante a filtração FDR. Os peptí- deos foram agrupados em proteínas e filtrados para FDR 1% de acordo com as regras previamente descritas.

[00139] Quantificação. Depois da pesquisa do banco de dados, a lista filtrada por FDR de combinações do espectro de peptídeo foi utilizada primeiro para calcular o erro de massa sistemático do precursor associado com o conjunto de dados. Depois de ajustar as massas do precursor "leve" e "pesado" para esse erro, um algoritmo inspecionou cada varredura de MS1 de alta resolução dentro de 30 segundos de todos os PSMs identificando uma sequência única de peptídeo. Em cada varredura de MS1, os picos "leve" e "pesado" foram isolados para os primeiros quatro isótopos do cluster isotópico. Se pelo menos dois picos, como S/N maior do que 3, são encontrados dentro da tolerância especificada (±5 ppm para NeuCode; ±10 ppm para SILAC), um par de SILAC é criado. Quaisquer picos abaixo do nível de ruído contribuem simplesmente com uma intensidade baseada no ruído para o canal "leve" ou "pesado" que falta apropriado. Os picos que exibem uma possível coalescência de pico, como determinada pela intensidade de desnormalização pelo tempo de injeção, são excluídos da quantificação. As intensidades para os canais "leve" e "pesado" são somadas através de seus perfis de eluição. Para eliminar os picos cobertos pelo ruído sobre as margens de um perfil de eluição de peptídeo que condensa a proporção quantitativa na direção de 1:1, picos com intensidades abaixo de 1/2e da intensidade máxima, foram descartados. Os peptídeos foram requeridos ter um mínimo de 3 pares que fornecem uma proporção (isto é, quantificados através de pelo menos 3 varreduras de MS1) a ser elegível para a quantificação. A quantificação de proteína foi obtida pela média das proporções de todos os peptídeos correspondentes. As proporções de proteína resultantes foram normalizadas para uma alteração média em torno de 0 para responder pela misturação desigual. Esse algoritmo foi utilizado para quantificar ambos os conjuntos de dados de SILAC tradicional e NeuCode SILAC. Exemplo 2 - Assinaturas Codificadas por Nêutron para a Quantificação de Proteína Multiplexada

[00140] A aplicação de um sistema de marcação codificada por nêutron para a quantificação de proteína envolve a exploração das diferenças sutis de massa que são induzidas pelas energias variáveis da ligação ao nêutron nos átomos de C, N, O, S, Cl, Br, Si e H. Por exemplo, uma diferença na massa de 6 mDa pode ser induzida pela permuta de um átomo de 14N por um de 15N, enquanto concomitante- mente um átomo de 13C é trocado por um de 12C na molécula do anali- to. Fazer esse processo em várias combinações gera dúzias de isoto- pólogos quimicamente idênticos que, quando analisados sob condições normais de análise por MS (resolução de massa < 30.000), são indistinguíveis - isto é, produzem um pico de m/z. A análise com alto poder de resolução (resolução >100.000), entretanto, revela picos de m/z distintos cujas abundâncias podem ser extraídas e usadas para determinar a quantidade de analito através das condições diversas. Essa tecnologia permitirá níveis muito altos de multiplexação (tal como sistemas com 45 plex, ultraplexação) enquanto evita os imprevistos de SILAC e da marcação isobárica. As aplicações de tal sistema de marcação incluem a análise do proteoma mitocondrial do músculo esquelético (1098 proteínas), que é de grande importância para a saúde humana. Por exemplo, o sistema de marcação da presente invenção pode ser usado para monitorar precisamente as alterações dos níveis de proteína e fosfoproteínas mitocondriais em resposta à privação de ferro celular, o principal distúrbio nutricional mundial. Aminoácidos codificados com nêutron para SILAC multiplexado

[00141] Versões isotópicas codificadas por nêutron de Lisina e Ar- ginina permitem a quantificação por SILAC com até 11 plex. Entretanto, esses reagentes de SILAC altamente multiplexado oferecerão menos complexidade espectral do SILAC tradicional com 3 plex. Isso é obtido pela incorporação de vários isotopólogos de cada aminoácido - cada um diferindo por aproximadamente 6 mDa - para criar aminoáci- dos Arg /Lys com 5 plex e 6 plex que quando combinados fornecem 11 canais de quantificação. Esses aminoácidos liberam um nível se precedentes de multiplexação e desempenho para a tecnologia de quantificação de proteína padrão ouro atual, SILAC. Desempenho de NeuCode SILAC em um Sistema Biológico Complexo

[00142] Para referenciar o desempenho de NeuCode contra SILAC tradicional em um sistema biológico complexo, marcadores para Neu- Code e SILAC foram usados cada um para quantificar a proteína em mioblastos de camundongo e durante sua diferenciação miogênica em miotubos. A diferenciação de mioblastos C2C12 derivados de camun-dongo é um modelo de sistema exaustivamente estudado para o de-senvolvimento de miócitos do músculo esquelético. NeuCode quantifica x% mais proteínas do que SILAC tradicional (1458 vs. 1031), enquanto avalia comparativamente a abundância relativa de proteína (m = 0,82, R2 = 0,78; Figura 29). Ambos os métodos medem alterações de proteína que apoiam a diferenciação miogênica em andamento, como evidenciado pelo enriquecimento em termos de GO, tal a cadeia de transporte de elétron e processos do sistema muscular (Figura 30). Exemplo 3 - Aminoácidos Codificados por Nêutron

[00143] Os dados acima demonstram a viabilidade da estratégia de marcação NeuCode e dobra a capacidade de plexing fornecida por SILAC. Para plexing aumentado, isotopólogos personalizados de ami- noácidos de SILAC são sintetizados. Para determinar a estratégia mais conveniente, a faixa de massa e o número de isotopólogos de NeuCode para cada um dos seis aminoácidos usados para SILAC (Ser, Leu, Tyr, Lys, Met e Arg) foram calculados. Esses seis aminoáci- dos sozinhos podem ser manipulados para produzir 3004 isotopólogos (Figura 13). Em média, esses isotopólogos são espaçados com uma distância de 1,07 mDa sobre faixas de 26 a 63 mDa. Isso significa que a capacidade de plexing pode ser maximizada pela combinação precisa do espaçamento de massa deslocada do isotopólogo com a resolução de massa atualmente obtenível. Arg oferece a faixa mais ampla de deslocamento de massa (62,8 mDa) e portanto, o potencial para o maior nível de multiplexação.

[00144] Experimentos de SILAC tradicional, entretanto, utilizam Lys, sozinha ou em combinação com Arg. Como a síntese de aminoácidos personalizados pode ser dispendiosa, isotopólogos padronizados apenas de Lys foram gerados inicialmente. Se for usada apenas Lys para SILAC, os melhores resultados são obtidos com a protease endo LysC. Essa enzima cliva peptídeos em Lys, assegurando que cada peptídeo gerado contenha um marcador. Endo LysC está se tornando rapidamente a protease preferida para proteômica e é frequentemente usada no lugar da tripsina. LysC produz apenas peptídeos discretamente maiores, em média, do que a tripsina (11 vs. 13 resíduos, levedura). Além disso, LysC é frequentemente preferida já que ela mantém a atividade proteolítica em quantidades muito grandes de agentes de desnaturação tal como a ureia (até 8 M). Desenvolvimento de Isotopólogos de Lisina para NeuCode

[00145] Figura 14 exibe as composições isotópicas e pesos moleculares dos 39 isotopólogos de Lys que são +8 Da mais pesados do que Lys não marcada. Um deslocamento de massa máximo de 38,5 mDa pode ser obtido (a adição de um total de 10 Da de isótopos pesados gera o deslocamento máximo mostrado na Figura 13). Apenas dois dos isotopólogos +8 estão comercialmente disponíveis (13C62H015N2 e 13C02H815N0, barras listradas de vermelho/azul na Figura 14), Esses dois isotopólogos quase se estendem pela faixa de deslocamento de massa inteira (36,0 mDa) e para esse experimento são usados como os dois marcadores mais extremos (isto é, o mais leve e o mais pesado) em uma estratégia NeuCode SILAC tríplex ou quadru- plex. A síntese do isotopólogo +8 Da Lys, 13C32H415N1, criará um "meio" marcador que está a precisamente 18,0 mDa do "pesado" e do "leve" (barra vermelha, Figura 14). Esse espaçamento é compatível com o poder de resolução de 480K - a capacidade comercial atual do sistema Orbitrap e a resolução usada para os dados preliminares mostrados aqui. É antecipado que a ampla implementação comercial do poder de resolução de 960K em sistemas Orbitrap ocorrerá num futuro próximo. Para esses sistemas e sistemas FT-ICR-MS, um método NeuCode SILAC quadruplex pode ser implementado pela síntese de dois isotopólogos adicionais de +8 Lys - 13C52H215N1 e 13C42H415N0. Esses dois isotopólogos personalizados, em combinação com os resíduos "pesado" e "leve" de +8 Da Lys comercialmente disponíveis, são igualmente espaçados em intervalos de ~ 12 mDa (barras azuis, Figura 14). A duplicação da resolução de MS de 480K para 960K e o uso desses isotopólogos personalizados, permitirá um método NeuCode SILAC quadruplex que, quando analisado sob condições de rotina (isto é, resolução < 100K) oferece a complexidade espectral de uma amostra não marcada. O caminho para NeuCode SILAC 11-plex

[00146] Como discutido acima, NeuCode SILAC reduz a complexidade espectral dos experimentos com SILAC; além disso, ele aumenta muito a capacidade de multiplexação (até quadruplex). Foi fundamentado que o acoplamento da estratégia NeuCode SILAC acima com a estratégia SILAC multi-Da convenciona, permitirá ordens até maiores de multiplexação baseada em MS1. Isso pode ser obtido diretamente pela geração dos isotopólogos de NeuCode mostrados acima com vários deslocamentos de massa (por exemplo, +4, +8, +12 Da). A Figura 15 exibe o número de isotopólogos disponíveis quando a massa de Lys é aumentada em 4, 8 e 12 Da pela incorporação de um isótopo pesado estável. Pela divisão da faixa de massa sobre a qual esses isotopólogos abrangem com deslocamento de massas definidos de 6, 12 ou 18 mDa, o número de plexes que cada um oferece pode ser calculado (Figura 15). Pela combinação desses três grupos de Lys, isto é, +4, +8 e +12 Da, NeuCode SILAC com 8 plex (espaçamento de 18 mDa) ou 11 plex (espaçamento de 12 mDa) pode ser produzido. As massas e as composições de isótopo dos isotopólogos para o aminoá- cido Lisina quando 4, 8 ou 12 nêutrons extras são adicionados, usando várias combinações de átomos de 13C, 2H, 15N, 18O são mostradas na Figura 16.

[00147] Para transformar isotopólogos quadruplex padronizados de Lys em um experimento NeuCode SILAC 12 plex, os peptídeos são quimicamente marcados usando um marcador mTRAQ comercial. mTRAQ transmite um marcador com +0, +4 e +8 Da sobre todas as aminas primárias (isto é Lys e terminações N). Nessa estratégia, os peptídeos que possuem as mesmas sequências são distribuídos através de 3 clusters isotópicos de MS1 - cada cluster compreende a informação quantitativa de quatro plex que é revelada apenas depois da varredura de MS1 de alta resolução. Deve ser notado que mTRAQ fornece as diferenças de massa bruta que produzem os três clusters iso- tópicos distintos. Essa marcação química serve para mimetizar os resultados que serão obtidos se os isotopólogos de Lys personalizados descritos acima estiverem disponíveis. A Figura 17 apresenta os resultados preliminares que usam essa estratégia com o duplex de iso- topólogos de Lys (13C6/15N2 Lys (+8,0142 Da) ou 2H8 (+8,0502 Da)). Uma vez marcados, os peptídeos que contêm o duplex de NeuCode SILAC e mTRAQ foram misturados (seis plex) em uma proporção de 1:1:1:1:1:1 (Figura 17, esquerda) ou 10:10:5:5:1:1 (Figura 17, direita) e analisados pelo mesmo método nLC-MS/MS descrito acima.

[00148] A Figura 14 apresenta um gráfico das massas de todos os isotopólogos teóricos do aminoácido lisina em deslocamentos de massa de +4, +8 e +12 Da. Cada um tem 18, 39 e 45 isotopólogos únicos que abrangem 26,8, 38,5 e 35,6 mDa respectivamente. A instrumentação atual não tem resolução adequada para distinguir cada um desses isotopólogos, já que uma capacidade de 92 plex de SILAC não possível com a instrumentação comercial atual. Com a tecnologia atual, entretanto, é possível resolver isotopólogos espaçados em ~ 10-20 mDa de distância. Como indicado na Figura 8, aproximadamente 40% dos peptídeos são quantificáveis com um espaçamento de 10 mDa em um poder de resolução de 480K (resolução máxima de Orbitrap comercial atual). Em 20 mDa, aproximadamente 90% são quantificáveis nesse poder de resolução. Com o poder de resolução de 960K, que foi publicado recentemente e está sob desenvolvimento comercial para Orbitraps, pode-se quantificar ~ 90% dos peptídeos observados em um espaçamento de 10 mDa. Usando um espaçamento de ~10-12 mDa, 3, 5 e 4 isotopólogos foram selecionados dos grupos de deslocamento de massa de +4, +8 e +12 Da. Quando combinados, esses resíduos oferecerão até SILAC 12 plex que é compatível com a instrumentação atual de FT-MS.

[00149] As diferenças de massa dos isotopólogos podem ser codificadas pelo uso apenas de 13C, 15N, 18O. Figura 18 mostra isotopólo- gos diferentes que podem ser introduzidos em um marcador químico que compreende até 8 átomos de 13C e 15N e até 4 átomos de 18O (em átomos de 2H). Os isotopólogos destacados na Figura 18 mostram apenas os isotopólogos que usam 0 a 8 átomos de 13C e 0 a 8 átomos de 15N (sem átomos de 18O ou átomos de 2H). Em uma modalidade da presente invenção, marcadores sintéticos usam de modo ideal apenas 13C e 15N já que o deutério (2H) pode induzir mudanças de pico croma- tográfico e são evitados pelo uso apenas de 13C e 15N. Nessa modalidade, 18O não é preferivelmente usado por que 18O não fornece uma diferença de massa tão grande quanto os átomos de 13C e 15N. No espaçamento de 6 mDa, pode ser produzido um reagente químico capaz de oferecer uma quantificação 9 plex usando apenas 13C e 15N. Desse modo, a estratégia sintética também é simplificada já que apenas dois elementos precisam ser variados.

[00150] A Figura 19 mostra uma simulação teórica do que os isoto- pólogos destacados mostrados na Figura 18 (átomos pesados de C e N apenas) produzirão se usados para marcar um peptídeo (presumin- do dois marcadores sobre o peptídeo). Usando a resolução de 480K, pode ser distinguido cada uma desses marcadores e a obtenção de dados de quantificação 9 plex (camundongos destacados).

[00151] Figura 20 mostra a estrutura de um possível composto que pode conter átomos de C, N e O suficientes para fornecer as combinações de isotopólogos da Figura 18.

[00152] Um marcador químico alternativo que similarmente pode ser codificado para fornecer um grande número de isotopólogos é mostrado na Figura 21. Parâmetros Experimentais Adicionais

[00153] Amostragem - O desenvolvimento de uma alta ordem de multiplexação necessitará do aumento do número de clusters de isoto- pólogos de peptídeos marcados de MS1. O número de clusters de MS1 aumenta a complexidade dos espectros e provavelmente diminuirá o ciclo de trabalho. As opções de controle do instrumento para a exclusão dinâmica podem ser utilizadas para identificar quais picos são da mesma espécie de peptídeo e então apenas amostrar o mais abundante desses, enquanto exclui os outros da amostragem de MS2. Isso evitará a amostragem da mesma espécie com formas diferentes. A análise de faixas de massa truncadas para maximizar as identificações também pode ser utilizada.

[00154] Alvos AGC - Para cada precursor de peptídeo, quanto mais íons analisados durante uma varredura quantitativa, mais provavelmente os pares de NeuCode coalescerão. Esse pode ser mais um problema para as amostras fracionadas, onde a contagem total de íon é disseminada através de alguns precursores de peptídeo. A diminuição do alvo de AGC da quantificação diminuirá a probabilidade da coalescência, mas também resultará em um sinal menor, mas também em menos ruído. Portanto é improvável que a proporção do sinal para o ruído, que dita a sensibilidade, mude.

[00155] Fragmentação - As estratégias atuais empregam uma captura de íon com fragmentação por CAD e análise de MS, embora o uso da captura de íon por HCD e ETD sejam similarmente possíveis. O ciclo de trabalho para essas funções de varredura será similar a CAD, mas provavelmente dará melhor fragmentação para os produtos de peptídeo mais altamente carregados da digestão de LysC.

[00156] Teste de resolução - Baseado nos experimentos acima, sete pares de NeuCode SILAC podem ser resolvidos com R = 480K e nove podem ser resolvidos em R = 960K. É esperado que mais do que 80% dos peptídeos marcados com sete ou nove pares de NeuCode SILAC, misturados em proporções de 1:1, possua uma série completa de pares resolvíveis em FWOM.

[00157] Taxas de varredura - O impacto do número de espectros de MS1 e MS2 coletados pode ser avaliado quando uma varredura de quantificação adicional em poder de resolução 480K ou 960K é incor-porada na sequência da varredura. Há provavelmente pouco impacto da varredura quantitativa adicional por que os espectros de captura de íon MS2 e a varredura quantitativa podem ser coletados simultaneamente.

[00158] Número de identificações de peptídeo - O número de identificações espectrais de peptídeo feitas por um experimento NeuCode SILAC sete ou onze plex é similar a um experimento SILAC tríplex. O número de identificações feitas provavelmente se correlaciona indiretamente com o número de clusters de MS1 presentes. Portanto, os experimentos descritos acima são muito similares à SILAC tríplex e devem ser comparados com ele.

[00159] Faixa dinâmica/Exatidão/Precisão - A mistura de pares de NeuCode SILAC e pares de SILAC em proporções de 1:1, 1:2, 1:5 e 1:10 demonstra que os valores médios (exatidão) e o desvio de padrão (precisão) para NeuCode SILAC e SILAC são similares para cada uma dessas proporções.

Ferramentas de informática

[00160] As ferramentas da informática traduzem os espectros adquiridos na quantificação centrada de peptídeo por MS1, altamente multiplexada. Isso é ilustrado usando um experimento duplex que emprega duas versões de lisina: "pesada" (13C615N2, +8,0142 Da) e “pesada” (D8, +8,0502 Da). Primeiro, a pesquisa no banco de dados combinará os espectros de MS/MS de baixa resolução para os peptídeos da composição da lisina "média" para um dado experimento (isto é, modificação fixa na lisina igual a diferença média de massa entre todas as versões diferentes de lisina empregadas; nesse caso, +8,0322 Da). Essa lista de combinações de espectro de peptídeo direcionará então um algoritmo que interage através de cada varredura de MS1 de alta resolução dentro de uma certa janela de tempo de retenção de todos os PSMs identificando uma única sequência de peptídeo. Em cada varredura de MS1, o pico que produz a identificação será isolado. Como sua identidade como "leve" ou "pesado" permanece desconhecida nesse ponto, seu pico parceiro será pesquisado para usar a diferença de massa apropriada, calculada usando a informação de se-quência e do estado de carga, sobre ambos os lados superior e inferior do pico de identificação. Se um pico é encontrado cuja massa está dentro da tolerância (0,002 Da) e cuja intensidade está acima do nível de ruído para o pico de identificação, ele é considerado um pico parceiro e um par é formado. Se nenhum de tais picos é encontrado, um pico de ruído será substituído como o parceiro para o pico de identificação para fornecer um par para a avaliação da proporção. Uma vez que os pares tenham sido extraídos de todas as varreduras de MS1 dentro da faixa apropriada para reunir os perfis "leve" e "pesado", esses perfis serão traduzidos tal que os ápices dos picos "leve" e "pesado" se alinhem. Essa relocação corrige as mudanças cromatográficas na retenção induzida por certas versões isotopicamente marcadas de aminoácidos, mais notavelmente aqueles que contêm deutério, o que impede a avaliação da proporção de exatidão. Para perfis alinhados, os pares cuja intensidade cai abaixo de 1/e do perfil máximo serão descartados e a proporção mediana dos pares remanescentes relatada. Os peptídeos serão requeridos ter um mínimo de 3 pares que fornecem uma proporção para serem elegíveis para a quantificação. Exemplo 4 - Síntese de reagentes químicos codificados por nêutron para uma comparação proteômica de até 45 plex

[00161] Para obter a capacidade de multiplexação máxima (isto é, ultraplexação) e assegurar a compatibilidade com a análise de tecido e fluidos biológicos, um grupo de reagentes codificados por nêutron é sintetizado, o que permite uma análise de 45 plex sem precedentes. Esses reagentes empregam os grupos éster reativos NHS bem estu-dados e colocam os marcadores sobre as aminas livres do peptídeo. A variação do conteúdo de 15N e 13C de um precursor de peptídeo fornece 9 variantes, cada uma espaçada por ~ 6 mDa. A ultraplexação será obtida pelo acoplamento dos 9 isotopólogos com isótopos +0, +4, +8, +12 e +16 Da de 13C/18O - também sobre o marcador. Nesse modo ultraplexado, serão observados 5 picos de cluster isotópico no espectro de MS1. A análise de alta resolução revelará 9 picos isotópicos distintos sob cada um desses 5 clusters.

[00162] Projeto Experimental: Dois aminoácidos lisina pesada com +8Da, um com seis átomos de 13C e dois átomos de 15N e outro com oito átomos de 2H. Esses dois isotopólogos diferem em massa por 36 mDa e, de acordo com os cálculos, são facilmente distinguíveis na resolução comercialmente disponível de sistemas Orbitrap atuais (480K). Duas culturas de levedura foram cultivadas em meio dropout de lisina contendo cada um desses isótopos de lisina. Nós então digerimos as proteínas de cada cultura, as misturamos e analisamos os peptídeos pela espectrometria de massa de alta resolução usando um sistema de MS Orbitrap.

[00163] Seleção de Lisina. Quais aminoácidos e seus vários iso- topólogos foram considerados para determinar o número máximo de plexação que NeuCode SILAC pode fornecer. Experimentos típicos de SILAC utilizam ou a Lisina sozinha ou em combinação com a Arginina. A Endo LysC está se tornando rapidamente uma protease preferida para proteômica e é frequentemente usada em lugar da tripsina. LysC produz um peptídeo apenas discretamente maior, em média, do que a tripsina (11 vs 13 resíduos, levedura). Além disso, LysC é frequentemente preferida já que ela mantém a atividade proteolítica em quantidades muito grandes de agentes desnaturantes tais como a ureia (até 8M). Devido ao forte desempenho de LysC, os isotopólogos de Lys foram selecionados para a síntese. A lógica é simples - LysC é frequentemente a enzima preferida para proteômica shotgun e seu uso pode possibilitar isotopólogos apenas de Lys - o que simplifica os experimentos. Ou seja, os esforços da síntese personalizada podem ser focalizados em apenas um aminoácido - Lys - e ainda obter uma profundidade e desempenho proteômicos excelentes pelo teste com a enzima LysC, o que irá assegurar que cada peptídeo produzido contenha um resíduo de lisina codificado por nêutron.

[00164] A Figura 14 apresenta um gráfico das massas de todos os isotopólogos teóricos do aminoácido lisina em deslocamentos de massa de +4, +8 e +12 Da. Cada um tem 18, 39 e 35 isotopólogos únicos abrangendo 26,8, 38,5 e 35,6 mDa, respectivamente. A instrumentação atual não possui resolução adequada para distinguir cada um desses isotopólogos e assim, a capacidade de 92 plex de SILAC não é atualmente possível com a instrumentação comercial atual. Com a tecnologia comercial atual, entretanto, isotopólogos espaçados em ~ 10 a 20 mDa podem ser resolvidos. A Figura 8 ilustra que ~40% dos peptídeos são quantificáveis com espaçamento de 10 mDa em um poder de resolução de 480K (resolução máxima do Orbitrap comercial atual). Com 20 mDa, aproximadamente 90% são quantificáveis nesse poder de resolução. O poder de resolução de 960K pode quantificar ~90% dos peptídeos observados em um espaçamento de 10 mDa. Usando um espaçamento de ~10-12 mDa, 3, 5 e 4 isotopólogos foram selecionados dos grupos com deslocamento de massa +4, +8 e +12 mDa. Quando combinados, esses resíduos oferecem um SILAC com até 12 plex que são compatíveis com a instrumentação FT-MS atual.

NeuCode SILAC

[00165] As versões isotópicas codificadas por nêutron de Lisina e Arginina que são geradas permitem uma quantificação por SILAC de até 11 plex. Esses reagentes de SILAC altamente multiplexadas, entretanto, fornecem menos complexidade espectral do que SILAC 3 plex tradicional. Vários isotopólogos de cada aminoácido - diferindo cada um por 6 mDa - são incorporados para criar um conjunto de aminoácidos Arg/Lys 5 plex ou 6 plex que quando combinados fornecem 11 canais para quantificação. Esses aminoácidos podem fornecer um nível aumentado de multiplexação e desempenho comparado com SILAC.

NeuCode ULTRA

[00166] Para obter a capacidade de multiplexação máxima (isto é, ultraplexação) e para assegurar a compatibilidade com a análise de tecido e fluido biológicos, um conjunto de reagentes codificados por nêutron é sintetizado permitindo uma análise com 45 plex sem precedentes. Esses reagentes empregam grupos éster reativos NHS bem estudados e colocam os marcadores sobre as aminas livres do peptí- deo. A variação do conteúdo de 15N e 13C de um precursor de peptídeo fornece 9 variantes, cada uma espaçada por ~ 6 mDa. A ultraplexação será obtida pelo acoplamento dos 9 isotopólogos com isótopos +0, +4, +8, +12 e +16 Da de 13C/18O - também sobre o marcador. Nesse modo ultraplexado, serão observados 5 picos de cluster isotópico no espectro de MS1. A análise de alta resolução revelará 9 picos isotópicos distintos sob cada um desses 5 clusters.

[00167] Proteômica Quantitativa com Codificação por Nêutron - Massa de O Codificada por Nêutron

[00168] O nêutron codificador pode ser incorporado 1) nos aminoá- cidos e 2) nos novos reagentes de marcação para criar um método de quantificação baseado em MS1 que é superior a ambos SILAC con-vencional e marcação isobárica de várias maneiras. Dois aminoácidos de lisina pesada +8 Da, um com seis átomos de 13C e dois átomos de 15N e outro com oito átomos de deutério (2H). Duas culturas de levedura foram cultivadas em meio dropout de lisina contendo cada um desses isótopos de lisina. As proteínas foram digeridas para cada cultura, misturadas e analisadas pela espectrometria de massa de alta resolução usando um sistema de MS Orbitrap.

[00169] A resolução necessária para separar os peptídeos marcados com essas lisinas aumenta com o aumento da massa do peptídeo. A resolução obtenível com um analisador Orbitrap diminui uma função da raiz quadrada do valor de m/z. Portanto, não ficou imediatamente óbvio que o instrumento de MS do estado da técnica atual fosse capaz de discernir diferenças de massa sutis induzidas por nêutron em valores altos de m/z e múltiplos estados de carga de precursores de peptí- deo. Deve ser notado que o estudo TMT descrito acima requer uma resolução de marcadores muito pequenos ~ 100 m/z e em apenas o estado de carga +1. Para a marcação de massa codificada por nêutron funcionar, essa diferença deve ser capaz de ser resolvida em uma massa muito maior e estados de carga altos. Com cada estado de carga aumentado, o espaçamento de m/z é reduzido por um fator de dois - requerendo assim uma resolução maior para separá-la.

[00170] A Figura 2 demonstra os resultados para um par de peptí- deos selecionado com lisina marcada em vários ajustes de resolução. Deve ser notado que na resolução de operação típica do sistema MS Orbitrap (30.000), os dois peptídeos marcados de NeuCode são indistinguíveis e aparecem como uma espécie. Quando analisado no poder de resolução de 240.000, entretanto, o par é resolvido na linha de base e a abundância relativa de cada analito pode ser determinada. A operação do sistema em sua mais alta resolução - 480.000 - produziu uma resolução na linha de base de aproximadamente cada espécie de peptídeo detectada na mistura complexa.

Aminoácidos de SILAC para NeuCode

[00171] Usando essa abordagem, marcadores de nêutron podem ser incorporados em aminoácidos que são introduzidos em uma cultura celular. Um método similar é feito em SILAC, mas com isótopos que diferem em 3 a 6 Da tal que os picos de m/z estão espaçados durante a análise de massa. Existe uma limitação principal com o espaçamento amplo de SILAC atual. Essa limitação é que apenas dois ou três plexes podem ser feitos por que os espectros de massa ficam muito complicados com todos os parceiros do dubleto ou do tripleto. A tecnologia NeuCode permite isso tal que os canais diferentes se superpõem no poder de resolução normal e assim o problema da complicação espectral desaparece.

[00172] Nove isótopos pesados podem ser incorporados em posições diferentes no aminoácido Lisina (átomos de 15N, 13C, 2H, e 18O diferentes). Ao fazer isso, os 41 isotopólogos diferentes que são construídos possuem abrangência de massa de apenas 41,4 mDa. A Figura 3 é um gráfico que mostra suas diferenças de massa. O eixo de X representa cada número de isotopólogo e o eixo de y é a diferença de massa em Da de resíduos de Lys normais. Podem ser selecionados muitos desses isotopólogos para sintetizar e incorporar na cultura celu- lar já que o poder de resolução da espectrometria de massa permite. É previsto que a tecnologia atual permita pelo menos um sistema de 4-6 plex e uma duplicação da resolução pode então dobrar esse número. Apesar de Lys ser exemplificada nesse experimento, pode-se fazer isso para qualquer aminoácido.

Reagentes Químicos para NeuCode

[00173] Esse sistema de marcação pode ser usado com os novos reagentes de marcação e não são limitados aos métodos relacionados a SILAC. Isso poderá permitir a análise de tecidos e outros fluidos corporais que não são compatíveis com a cultura de tecido, A tecnologia com éster de NHS é uma química amplamente usada para ligar marcadores sobre peptídeos para análise proteômica incluindo ambos métodos de marcação isobárica (iTRAQ e TMT). As Figuras 20 e 21 mostram marcadores potenciais compatíveis com a codificação por nêutron que são simples para sintetizar que também usam a química de ligação com éster de NHS. Diferentes dos marcadores isobáricos, entretanto, o presente sistema de marcação não necessita de projetos especializados que incorporam grupos repórteres, ligantes e sítios de carga. Pelo contrário, os marcadores da presente invenção são projetados para permanecerem ligados ao peptídeo e fornecer uma medida quantitativa apenas quando examinados sob condições de alta resolução.

Vantagens de NeuCode

[00174] Esse método tem vantagens consideráveis sobre SILAC e a marcação isobárica, os dois métodos mais populares para a quantificação do proteoma atualmente: 1. SILAC - SILAC introduz aminoácidos pesados, que co- mumente possuem uma diferença de massa de 3 a 6 Da, em cultura celular tal que durante a análise pares de peptídeo aparecem como dubletos separados por aproximadamente 3 a 8 Da. NeuCode pode ser usado em aminoácidos para SILAC, mas (1) proporciona a habili- dade de maior profundidade de amostragem comparado com SILAC tradicional; e (2) permite uma multiplexação muito maior (isto é, com-paração de 4 a 6 amostras vs. 2 a 3). 2. marcação isobárica - A marcação isobárica oferece a multiplexação, mas tem dois inconvenientes: (1) ele sofre com a inter-ferência de analitos marcados superpostos que diminui a faixa dinâmica e a exatidão quantitativa; e (2) ela requer a coleta de um evento de MS/MS para obter a quantificação. NeuCode é um método baseado em MS1 e assim a interferência não é mais um problema e não há necessidade de obter uma varredura de MS/MS. Entretanto, NeuCode ainda tem a habilidade de oferecer a multiplexação exatamente como na marcação isobárica. Exemplo 5 - Demonstração de NeuCode com um aminoácido diferente de Lisina

[00175] Os dados foram, coletados usando NeuCode com o amino- ácido Leucina. Duas versões de Leu isotopicamente marcadas - um isotopólogo possuindo seis átomos de 13C e um átomo de 15N e um segundo isotopólogo que possui sete átomos de 2H. Esses diferem massa por 27 mDa. Como ilustrado na Figura 22, duas culturas de levedura foram cultivadas em meio dropout de leucina, cada uma contendo um desses isotopólogos de leucina. As proteínas de cada cultura foram digeridas, misturadas e os peptídeos resultantes analisados por espectrometria de massa de alta resolução usando um sistema de MS Orbitrap. Os peptídeos resultantes carregando um resíduo de leu- cina foram resolvidos em alta resolução. As medidas de abundância relativa de proteína foram feitas pela comparação das alturas dos picos entre espécies de isotopólogos exatamente como os exemplos com Lys marcada descritos acima. Exemplo 6 - Reagentes químicos para NeuCode

[00176] Marcadores de isotopólogo de amina reativa podem ser usados para incorporar a estratégia de marcação NeuCode em anali- tos diferentes de peptídeos. Esse tipo de abordagem química precede a necessidade de introduzir o marcador durante a cultura celular e, portanto, é compatível com todos os tipos de amostras. Por exemplo, a ureia carbamila as aminas primárias de peptídeos quando expostos ao calor. Peptídeos foram carbamilados com isotopólogos de ureia que foram marcados com 13C ou 15N2. As aminas primárias do peptídeo foram carbamiladas com um único 13C ou 15N para cada grupo carba- mila adicionado, produzindo dessa maneira peptídeos que diferem por 6,3 mDa por sítio de carbamilação.

[00177] Figura 23 mostra o peptídeo LEQNPEESQDIK carbamilado usando cada um desses isotopólogos de ureia. Ambas, a terminação N e a amina primária do peptídeo sobre a cadeia lateral de lisina foram carbamiladas produzindo peptídeos que têm 12,6 mDa de distância. Esses peptídeos marcados foram resolvidos usando uma resolução de 480K que permite medidas de abundância relativa entre amostras marcadas com esses isotopólogos de NeuCode. Exemplo 7 - Elementos e Composições Úteis para Codificação com Nêutron

[00178] Nem todos os elementos são adequados para a codificação com nêutron. A Figura 24 mostra uma tabela que mostra os elementos comuns que possuem isótopos pesados estáveis que podem ser incorporados nas moléculas. A terceira coluna fornece a massa nominal de cada isótopo enquanto que a terceira coluna fornece as massas exatas. As diferenças entre a massa exata e a massa nominal surgem em grande parte devido às energias variantes da ligação ao neutro para cada elemento. A quarta coluna fornece as proporções de abundância dos isótopos. A Tabela 1 abaixo apresenta uma lista dos elementos mais desejáveis para esse método. Os elementos são agrupados pelo número de nêutrons adicionais codificados quando um isótopo é trocado por outro, por exemplo, 12C por 13C (1 nêutron adicionado) e o defeito de massa que ele introduz, 3,3 mDa para o último caso. O Grupo A tem elementos desejáveis que adicionam um nêutron e um defeito de massa positivo. O Grupo B adiciona dois nêutrons e inclui um defeito de massa positivo. O Grupo C adiciona um nêutron, mas introduz um defeito de massa negativo, enquanto que o Grupo D adiciona dois neutros e introduz um defeito de massa negativo. Usando esse sistema de agrupamento, várias composições de isotopólogo marcado com nêutron possíveis foram calculadas que podem ser incorporadas dentro de um sistema de marcação para codificação por nêutron. Esses cálculos consideraram o uso de até 36 átomos para o Grupo A, 8 átomos para o Grupo B, 12 para o Grupo C e até 16 átomos para o Grupo D. Todas as combinações possíveis desses elementos foram examinadas quando até 36 nêutrons adicionais são adicionados, isto é, a adição de 36 nêutrons pelo uso de elementos de vários grupos na Tabela 1. Tabela 1. Lista de pares de isótopos que são úteis para Codificação por Nêutron. Os isótopos são arranjados em um de quatro grupos baseados no número de nêutrons adicionados e se o defeito de massa introduzido é positivo ou negativo.

Grupo D

[00179] O resumo desses cálculos é mostrado na Tabela 2, que mostra o número de permutas que são possíveis para um marcador com átomo pesado (1 nêutron) até 36 nêutrons extras. Por exemplo, se 4 nêutrons adicionais estão incluídos, existem 14 combinações de elementos do Grupo A, B, C e D que somam 4 nêutrons adicionais. A variação desses elementos entre os respectivos grupos fornece numerosos isotopólogos que abrangem uma faixa de massa de até 37 mDa. Tabela 3 mostra as várias composições que são obtidas com a adição de 4 nêutrons adicionais usando elementos dos quatro grupos e o defeito de massa máximo que é obtido (isso é calculado usando o elemento dentro do grupo que tem o maior defeito de massa). Aqui é visto que a fórmula do isotopólogo que atinge os grandes defeitos de massa positivos extrai todos os quatro nêutrons dos elementos do Grupo A. O isotopólogo com o maior defeito de massa negativo extrai todos os quatro nêutrons do Grupo C. Esse processo permite criar isotopólogos para codificação por nêutron com alta flexibilidade para o tamanho do marcador e composição elementar, enquanto maximiza a faixa de massa e o espaçamento do isotopólogo. Tabela 2. Resumo de quantas combinações dos grupos A, B, C e D que podem compreender os isotopólogos, dado um número especificado de nêutrons adicionados (coluna da esquerda). Quanto mais nêutrons são adicionados, mais combinações são possíveis (coluna central). A coluna da direita apresenta a faixa de massa máxima dessas combinações.

Tabela 3. Tabela que descreve as 4 permutas dos grupos A, B, C e D que são possíveis quando 4 nêutrons adicionais são codificados. A coluna da direita exibe o deslocamento de massa máximo que é codificado por cada uma dessas permutas. No total, uma diferença de massa de 37 mDa pode ser obtida.

Exemplo 8 - Expressão Matemática de Isotopólogos Químicos

[00180] Os elementos que são isotopicamente marcados com isótopos pesados estáveis em um composto a fim de gerar isotopólogos químicos incluem, mas não são limitados a C, H, N, O, S, Br, Cl e Si. Portanto, em uma modalidade, os diferentes isotopólogos possíveis para um composto são definidos pela seguinte equação: (1) 12CA-i13Ci 1HB-j2Hj 14NC-n15Nn 16OD-o18Oo 32SE-p34Sp 79BrF- l81Brl 35ClG-m37Clm 28SiH-q30Si onde: A é o número total de átomos de carbono (C) na fórmula do elemento codificado; B é o número total de átomos de hidrogênio (H) na fórmula do elemento codificado; C é o número total de átomos de nitrogênio (N) na fórmula do elemento codificado; D é o número total de átomos de oxigênio (O) na fórmula do elemento codificado; E é o número total de átomos de enxofre (S) na fórmula do elemento codificado; F é o número total de átomos de bromo (Br) na fórmula do elemento codificado; G é o número total de átomos de cloro (Cl) na fórmula do elemento codificado; H é o número total de átomos de silício (Si) na fórmula do elemento codificado; e (1) j, n, o, p, l, m, q são números inteiros que representam o número de isótopos pesados para cada respectivo elemento e são > 0.

[00181] O número de isótopos pesados para cada elemento será igual ou menor do que o número total de átomos para aquele elemento na fórmula do elemento codificado. O número de isótopos leves para cada elemento será o número total de átomos na fórmula do elemento codificado menos o número de isótopos pesados para aquele elemento. Por exemplo, o número total de átomos de carbono será A, o núme- ro total de 13C será I e o número total de átomos de 12C será, portanto, A - i.

[00182] O número de nêutrons adicionados pela marcação isotópica (X) é descrito pela seguinte equação: (2) X = i + j + n + 2( o) + 2( p) + 2( l) + 2( m) + 2( q).

[00183] A adição de cada 13C, 2H e 15N resulta em um nêutron a ser adicionado, enquanto que a adição de cada 18O, 34S, 81Br, 37Cl e 30Si resulta em dois nêutrons sendo adicionados.

[00184] Como um exemplo, a lisina tem a fórmula química: C6H14N2 O2. Entretanto, como alguns dos átomos na lisina não são compatíveis com a codificação por nêutron (por exemplo, átomos de H que são permutáveis com solventes), a fórmula do elemento codificado contém menos cinco átomos de H e menos um átomo de O do que a fórmula química. Para a lisina, a fórmula do elemento codificado C6H9N2O1 fornece o número de átomos que são compatíveis com a marcação iso- tópica com isótopos pesados estáveis para formar isotopólogos para a análise de espectrometria de massa. Usando a fórmula do elemento codificado para a lisina, a equação (1) é modificada na seguinte equação: 12 13 1 2 14 15 16 18 (3) C6-i Ci H9-j Hj N2-n Nn O1-o Oo onde i < 6; j < 9; n < 2; o < 1 e i, j, n e o são > 0.

[00185] A Equação (2) é similarmente modificada para a lisina para ser: (4) X = i + j + n + 2(o)

[00186] Figura 9 ilustra todos os possíveis isotopólogos com +2 nêutrons de lisina (X=2) e a equação (3) pode ser usada para descrever cada uma dessas entradas. Por exemplo, a entrada para a primeira fileira, “13C0 2H0 15N2 18O0” incorpora apenas dois átomos pesados, ambos os quais são 15N. Nesse cenário, X = 2 e n = 2, tal que i, j e o = 0. Se forem introduzidos esses números na equação (3) será gerada a seguinte fórmula química: 12C613C01H92H014N015N216O218O0

[00187] Usando a fórmula do elemento codificado para lisina e a equação (1), todos os isotopólogos possíveis de lisina podem ser determinados. Exemplo 9 - Utilização de Aminoácidos Isotopicamente Marcados

[00188] Os analitos são sintetizados ou reagidos com reagentes de marcação isotópica a fim de formar analitos isotopicamente marcados. Para determinar a abundância relativa de um analito em uma pluralidade de amostras, um reagente de marcação isotópica diferente é fornecido para o analito em cada amostra, onde os diferentes reagentes de marcação isotópica são isotopólogos.

[00189] Em uma modalidade, o reagente de marcação isotópica é um aminoácido isotopicamente marcado. O aminoácido isotopicamen- te marcado é reagido com o analito, tal que o aminoácido isotopica- mente marcado se liga covalentemente ao analito. Alternativamente, quando o analito é um peptídeo, o peptídeo é sintetizado tal que o aminoácido isotopicamente marcado é incorporado no arcabouço do próprio peptídeo.

[00190] Figura 25 fornece as estruturas para vinte aminoácidos comuns que podem ser usados como reagentes de marcação isotópi- ca. A segunda coluna na Figura 25 (marcada como "Composição") fornece a fórmula química para cada composto e a terceira coluna fornece a fórmula do elemento codificado. Usando a fórmula do elemento codificado para cada composto, a equação (1) descrita acima é modificada para dar uma equação para cada composto que descreve todos os isotopólogos possíveis para aquele composto.

[00191] A Tabela 4a fornece as equações modificadas para cada aminoácido descrevendo os diferentes isotopólogos possíveis para cada aminoácido. O número máximo para cada isótopo pesado para cada equação modificada é fornecido na terceira coluna. Por exemplo, a lisina é fornecida como o item 12 na Tabela 4a e na Figura 25, com a equação modificada para a lisina apresentada na Tabela 4a sendo a mesma equação (3) apresentada acima: (3) 12C6-i13Ci1H9-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo.

[00192] Os isotopólogos de lisina são fornecidos para o analito em cada amostra e os isotopólogos são detectados durante a espectrome- tria de massa baseada em pequenas diferenças nas suas massas moleculares. A quantificação relativa do analito em cada amostra é então determinada pela comparação das quantidades relativas dos isotopó- logos detectados. Se uma das amostras compreende um padrão de lisina (isto é, um isotopólogo de lisina presente em uma quantidade conhecida), então a quantificação absoluta do analito em cada amostra é obtida. Tabela 4a - para todas as seguintes equações: i >0, j >0, l >0, m >0, n >0, o >0, p >0, e q >0.

[00193] Tabela 4b, fornecida como um apêndice,é uma parte do pedido fornecida aqui que também está incorporada por referência. A Tabela 4b fornece combinações possíveis de elemento codificado que resultam em isotopólogos de vinte aminoácidos que são úteis nas modalidades da invenção. Exemplo 10 - Utilização de Marcadores Isotópicos de Peptídeo

[00194] Em outras modalidades, o reagente de marcação isotópica é um composto diferente de um aminoácido. O reagente de marcação isotópica é qualquer composto capaz de se ligar covalentemente ao analito ou que é capaz de ser incorporado no analito durante a síntese do analito, particularmente quando o analito é um peptídeo.

[00195] A Figura 26 fornece as estruturas para vinte e oito marcadores de peptídeo, que podem ser isotopicamente marcados e reagidos com um peptídeo ou acoplados ao peptídeo durante a síntese do peptídeo. A segunda coluna na Figura 26 fornece a fórmula química para cada composto e a terceira coluna fornece a fórmula do elemento codificado.

[00196] A Figura 27 fornece as estruturas para treze marcadores de peptídeo adicionais que podem ser isotopicamente marcados e reagidos com um peptídeo. Cada um desses peptídeos contém um grupo de partida (designado como "LG" na estrutura) que deixa o marcador de peptídeo quando o marcador de peptídeo é reagido com o ana- lito peptídico. O grupo de partida é qualquer grupo que permita que o marcador de peptídeo reaja com um grupo funcional de um peptídeo, tal como um grupo amina reativo ou um grupo carboxila reativo. A segunda coluna na Figura 27 fornece a fórmula química para cada composto (não incluindo quaisquer grupos de partida (LG)) e a terceira coluna fornece a fórmula do elemento codificado. Usando a fórmula do elemento codificado para cada composto, a equação (1) descrita acima pode ser modificada para dar uma equação para cada composto que descreva todos os isotopólogos possíveis para aquele composto. A numeração dos compostos na Figura 27 começa com o número 29 a fim de continuar onde a numeração da Figura 26 terminou.

[00197] A Tabela 5 fornece equações modificadas para os marcadores de peptídeo das Figuras 26 e 27, onde as equações modifica- das descrevem os isotopólogos diferentes possíveis para cada marcador de peptídeo. O número máximo para cada isótopo pesado para cada equação modificada é fornecido na terceira coluna. Por exemplo, o composto 1 da Figura 26 é fornecido como o item 1 na Tabela 5, com a equação modificada para esse composto sendo: (4) 12C9-i13Ci1H7-j2Hj35Cl1-m37Clm14N1-n15Nn16O1-o18Oo.

[00198] Similarmente, o composto 29 da Figura 27 é fornecido como o item 29 na Tabela 5 que possui a equação modificada: 12 13 1 2 14 15 16 18 (5) C14-i Ci H12-j Hj N8-n Nn O1-o Oo.

[00199] Os isotopólogos possíveis desses compostos são abrangidos por suas respectivas equações modificadas.

[00200] Os isotopólogos para um marcador de proteína em particular são fornecidos para o analito em cada amostra e os isotopólogos são detectados durante a espectrometria de massa com base nas pequenas diferenças em suas massas moleculares. A quantificação relativa do analito em cada amostra é então determinada pela comparação das quantidades relativas dos isotopólogos detectados. A quantificação absoluta é pela incorporação de um padrão (isto é, um isotopólogo específico presente em uma quantidade conhecida) em uma das amostras. Tabela 5 - Para todas as equações a seguir: i >0, j >0, l >0, m >0, n >0, o >0, p >0, e q >0.

Exemplo 11 - Utilização de Marcadores Isotópicos de Molécula Pequena

[00201] Em outras modalidades, o analito é uma molécula pequena diferente de um peptídeo. Nesse exemplo, o reagente de marcação isotópica é qualquer composto capaz de ser covalentemente ligado ao analito de molécula pequena ou que é capaz de ser incorporado no analito durante a síntese do analito.

[00202] A Figura 28 fornece as estruturas de quarenta e oito marcadores de molécula pequena que podem ser isotopicamente marcados e acoplados a uma molécula pequena. Esses marcadores de molécula pequena contêm um ou mais átomos ou um grupo de partida (designado como "LG" na estrutura) que deixa o marcador de molécula pequena quando o marcador é reagido com o analito. Consequentemente, esses átomos ou o grupo de partida não fazem parte do analito isotopicamente marcado. O grupo de partida é qualquer grupo funcional que permite que o marcador de peptídeo reaja com um grupo funcional de um peptídeo, tal como um grupo amina reativo ou um grupo carboxila reativo. A segunda coluna na Figura 28 fornece a fórmula química para cada composto (não incluindo quaisquer grupos de partida (LG)) e a terceira coluna fornece a fórmula do elemento codificado. Usando a fórmula do elemento codificado para cada composto, a equação (1) descrita acima pode ser modificada para dar uma equação para cada composto que descreva todos os isotopólogos possíveis para aquele composto.

[00203] A Tabela 6a fornece as equações modificadas para os marcadores de molécula pequena da Figura 28, onde as equações modificadas descrevem os isotopólogos diferentes possíveis para cada marcador. O número máximo para cada isótopo pesado para cada equação modificada é fornecido na terceira coluna. Por exemplo, o composto 2 da Figura 28, que contém um grupo de partida que não faz parte do analito isotopicamente marcado, é fornecido como o item 2 na Tabela 6a, com a equação modificada para esse composto sendo: (6) 12C3-i13Ci1H9-j2Hj28Si1-q30Siq

[00204] Os isotopólogos possíveis desse composto estão abrangidos em suas respectivas equações modificadas.

[00205] Os isotopólogos para uma molécula pequena particular são fornecidos ao analito em cada amostra e os isotopólogos são detectados durante a espectrometria de massa com base nas pequenas diferenças em suas massas moleculares. A quantificação relativa do anali- to em cada amostra é então determinada pela comparação das quantidades relativas dos isotopólogos detectados. A quantificação absoluta é pela incorporação de padrão (isto é, um isotopólogo específico presente em uma quantidade conhecida) em uma das amostras. Tabela 6a - Para todas as equações a seguir: i >0, j >0, l >0, m >0, n >0, o >0, p >0, e q >0. 1

[00206] A Tabela 6b fornecida como um apêndice é uma parte do pedido fornecido aqui que também está incorporado por referência. A Tabela 6b fornece combinações de elementos codificados possíveis que resultam em isotopólogos de quarenta e dois marcadores de molécula pequena úteis nas modalidades da invenção. REFERÊNCIAS 1. A. Ducret, I. Van Oostveen, J.K. Eng, J.R. Yates, and R. Aebersold, High throughput protein characterization by automated re-verse-phase chromatography electrospray tandem mass spectrometry. Protein Science, 1998. 7(3): p. 706-719. 2. A.J. Link, J. Eng, D.M. Schieltz, E. Carmack, G.J. Mize, D.R. Morris, B.M. Garvik, and J.R. Yates, Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Biotechnology, 1999. 17(7): p. 676-682. 3. H.B. Liu, R.G. Sadygov, and J.R. Yates, A model for ran-dom sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics. Analytical Chemistry, 2004. 76(14): p. 4193-4201. 4. C.C. Wu, M.J. MacCoss, K.E. Howell, and J.R. Yates, A method for the comprehensive proteomic analysis of membrane proteins. Nature Biotechnology, 2003. 21(5): p. 532-538. 5. D.L. Tabb, L. Vega-Montoto, P.A. Rudnick, A.M. Variyath, A.J.L. Ham, D.M. Bunk, L.E. Kilpatrick, D.D. Billheimer, R.K. Blackman, H.L. Cardasis, S.A. Carr, K.R. Clauser, J.D. Jaffe, K.A. Kowalski, T.A. Neubert, F.E. Regnier, B. Schilling, T.J. Tegeler, M. Wang, P. Wang, J.R. Whiteaker, L.J. Zimmerman, S.J. Fisher, B.W. Gibson, C.R. Kinsinger, M. Mesri, H. Rodriguez, S.E. Stein, P. Tempst, A.G. Pau-lovich, D.C. Liebler, and C. Spiegelman, Repeatability and Reproducibility in Proteomic Identifications by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Journal of Proteome Research, 2010. 9(2): p. 761776. 6. J.V. Olsen, M. Vermeulen, A. Santamaria, C. Kumar, M.L. Miller, L.J. Jensen, F. Gnad, J. Cox, T.S. Jensen, E.A. Nigg, S. Brunak, and M. Mann, Quantitative Phosphoproteomics Reveals Widespread Full Phosphorylation Site Occupancy During Mitosis. Science Signaling, 2010. 3(104). 7. A. Moritz, Y. Li, A.L. Guo, J. Villen, Y. Wang, J. MacNeill, J. Kornhauser, K. Sprott, J. Zhou, A. Possemato, J.M. Ren, P. Hornbeck, L.C. Cantley, S.P. Gygi, J. Rush, and M.J. Comb, Akt-RSK-S6 Kinase Signaling Networks Activated by Oncogenic Receptor Tyrosine Kinases. Science Signaling, 2010. 3(136). 8. F.S. Oppermann, F. Gnad, J.V. Olsen, R. Hornberger, Z. Greff, G. Keri, M. Mann, and H. Daub, Large-scale Proteomics Analysis of the Human Kinome. Molecular & Cellular Proteomics, 2009. 8(7): p. 1751-1764. 9. J.R. Wisniewski, A. Zougman, N. Nagaraj, and M. Mann, Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods, 2009. 6(5): p. 359-U60. 10. G. Manning, D.B. Whyte, R. Martinez, T. Hunter, and S. Sudarsanam, The protein kinase complement of the human genome. Science, 2002. 298(5600): p. 1912-+. 11. M. Ashburner, C.A. Ball, J.A. Blake, D. Botstein, H. But-ler, J.M. Cherry, A.P. Davis, K. Dolinski, S.S. Dwight, J.T. Eppig, M.A. Harris, D.P. Hill, L. Issel-Tarver, A. Kasarskis, S. Lewis, J.C. Matese, J.E. Richardson, M. Ringwald, G.M. Rubin, G. Sherlock, and C. Gene Ontology, Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics, 2000. 25(1): p. 25-29.

DECLARAÇÕES COM RELAÇÃO À INCORPORAÇÃO POR REFE-RÊNCIA E VARIAÇÕES

[00207] Todas as referências ao longo desse pedido, por exemplo, documentos de patente incluindo patentes emitidas ou concedidas ou equivalentes; publicações de pedido de patente; e documentos de lite-ratura de não patente ou outra fonte de material; estão incorporadas aqui por referência em suas totalidades, como se individualmente in-corporadas por referência, à medida que cada referência é pelo menos parcialmente não inconsistente com a descrição nesse pedido (por exemplo, uma referência que é parcialmente inconsistente está incor-porada pela referência exceto para a porção parcialmente inconsistente da referência).

[00208] Os termos e as expressões que foram empregados aqui são usados como termos de descrição e não de limitação e não há intenção no uso de tais termos e expressões na exclusão de quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções dessas, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Portanto, deve ficar com-preendido que embora a presente invenção tenha sido especificamente descrita pelas modalidades preferidas, modalidades exemplificado- ras e características opcionais, modificações e variações dos conceitos aqui descritos podem ser utilizadas por aqueles versados na técnica e que tais modificações e variações são consideradas estar dentro do escopo dessa invenção como definida pelas reivindicações em anexo. As modalidades específicas fornecidas aqui são exemplos de modalidades úteis da presente invenção podem ser realizadas usando um grande número de variações dos equipamentos, componentes do equipamento, etapas do método descritas na presente descrição. Como ficará óbvio para aquele versado na técnica, os métodos e equipamentos úteis para os presentes métodos podem incluir um grande número de composições opcionais e elementos e etapas de processamento.

[00209] Quando um grupo de substituintes é descrito aqui, é com-preendido que todos os membros individuais daquele grupo e todos os subgrupos, incluindo quaisquer isômeros, enantiômeros e diastereoi- sômeros dos membros do grupo são descritos separadamente. Quando um grupo de Markush ou outro grupamento é usado aqui, todos os membros individuais do grupo e todas as combinações e subcombina- ções possíveis do grupo são pretendidas estar individualmente incluídos na descrição. Quando um composto está descrito aqui, tal que um isômero, enantiômero ou diastereoisômero particular do composto não está especificado, por exemplo, em uma fórmula ou em um nome quí-mico, essa descrição é pretendida incluir cada um dos isômeros e enantiômeros do composto individualmente descrito ou em qualquer combinação. Adicionalmente, a menos que especificado de outra ma-neira, todas as variantes isotópicas dos compostos aqui descritos são pretendidas estar abrangidas pela descrição. Por exemplo, será com-preendido que qualquer um ou mais hidrogênios em uma molécula descrita podem ser substituídos por deutério ou trítio. Variantes isotó- picas de uma molécula são geralmente úteis como padrões em ensaios para a molécula e na pesquisa química ou biológica relacionada com a molécula ou seu uso. Métodos para fazer tais variantes isotópi- cas são conhecidos na técnica. Os nomes específicos dos compostos são pretendidos ser exemplificadores, já que aquele versado na técnica pode nomear os mesmos compostos diferentemente.

[00210] Várias das moléculas aqui descritas contêm um ou mais grupos ionizáveis [grupos a partir dos quais um próton pode ser removido (por exemplo, -COOH) ou adicionado (por exemplo, aminas) ou que podem ser quaternizados (por exemplo, aminas)]. Todas as formas iônicas possíveis de tais moléculas e seus sais são pretendidas estar incluídas individualmente na descrição desse. Com relação aos sais dos compostos, aquele versado na técnica pode selecionar entre uma grande variedade de contraíons disponíveis, aqueles que são apropriados para a preparação dos sais dessa invenção para um dado pedido. Em aplicações específicas, a seleção de um dado ânion ou cátion para a preparação de um sal pode resultar em solubilidade aumentada ou diminuída daquele sal.

[00211] Cada formulação ou combinação de componentes descritos ou exemplificados aqui podem ser usadas para a prática da invenção, a menos que determinado de outra maneira.

[00212] Sempre que um intervalo é dado no pedido, por exemplo, um intervalo de temperatura, um intervalo de tempo ou uma composição ou faixa de concentração, todas as faixas intermediárias e subfai- xas, assim como todos os valores individuais incluídos nas faixas dadas são pretendidos estar incluídos na descrição. Será compreendido que quaisquer subfaixas ou valores individuais em uma faixa ou sub- faixa que estão incluídos na descrição podem ser excluídos das reivin-dicações desse.

[00213] Todas as patentes e publicações mencionadas no pedido são indicativas dos níveis de perícia daqueles versados na técnica ao qual a invenção pertence. As referências citadas estão incorporadas por referência em sua totalidade para indicar o estado da técnica a partir da data de sua publicação ou depósito e é pretendido que essa informação possa ser empregada aqui, se necessário, para excluir as modalidades específicas que são da técnica anterior. Por exemplo, quando a composição em questão é reivindicada, deve ficar compreendido que os compostos conhecidos e disponíveis na técnica anterior à invenção da Requerente, incluindo compostos para os quais uma possibilidade de divulgação é fornecida nas referências aqui citadas, não são pretendidos estar incluídos na composição das reivindicações em questão.

[00214] Como usado aqui, "compreendendo" é sinônimo de "incluindo", "contendo" ou "caracterizado por" e é inclusivo ou de sentido aberto e não exclui elementos adicionais, não citados ou etapas do método. Como usado aqui, "consistindo em" exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado na reivindicação. Como usado aqui, "consistindo essencialmente em" não exclui materiais ou etapas que não afetam materialmente as características básicas e novas da reivindicação. Em cada exemplo, qualquer uma das expressões "com-preendendo", "consistindo essencialmente em" e "consistindo em" pode ser substituída por qualquer uma das duas outras expressões. A invenção ilustrativamente descrita aqui pode ser praticada adequada-mente na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações que não estão especificamente descritas aqui.

[00215] Deve ser observado que, como usadas aqui e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem a referência no plural a menos que o contexto dite claramente de outra maneira. Assim, por exemplo, a referência a uma "célula" inclui uma pluralidade de tais células e seus equivalentes conhecidos por aqueles versados na técnica e assim por diante. As expressões "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usadas alternativamente também, Também deve ser notado que as expressões "compreendendo", "incluindo" e "tendo" podem ser usadas alternativamente. A expressão "de qualquer uma das reivindicações XX-YY" (em que XX e YY se referem aos números das reivindicações) é pretendida fornecer uma reivindicação dependente múltipla na forma alternativa e, em algumas modalidades, e alternativa com a expressão "como em qualquer uma das reivindicações XX - YY".

[00216] Aquele versado na técnica apreciará que os materiais de partida, materiais biológicos, reagentes, métodos sintéticos, métodos de purificação, métodos analíticos, métodos de ensaio e métodos biológicos diferentes daqueles especificamente exemplificados podem ser empregados na prática da invenção sem recorrer a experimentação excessiva. Todos os equivalentes funcionais conhecidos na técnica, de qualquer um de tais materiais e métodos, são pretendidos estar incluídos nessa invenção. Os termos e as expressões que foram empregados são usados como termos de descrição e não de limitação e não há intenção no uso de tais termos e expressões de exclusão de qualquer equivalente das características mostradas e descritas ou suas porções, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Portanto, deve ser compreendido que embora a presente invenção tenha sido especificamente descrita pelas modalidades preferidas e características opcionais, a modificação e a variação dos conceitos aqui descritos podem ser utilizadas por aqueles versados na técnica e que tais modificações e variações são consideradas estar dentro do escopo da invenção como definida nas reivindicações em anexo.

Claims (15)

1. Método para determinação da abundância de um analito em uma pluralidade de amostras, caracterizado pelo fato de que com-preende as etapas de: (a) fornecer uma pluralidade de culturas celulares que in-cluem pelo menos uma primeira cultura celular e uma segunda cultura celular; (b) fornecer um aminoácido diferente isotopicamente marcado para cada uma das ditas culturas celulares, em que os ditos ami- noácidos isotopicamente marcados de cada uma das ditas culturas celulares são isotopólogos do mesmo aminoácido; (c) cultivar as células de cada uma das ditas culturas celula-res, introduzindo dessa maneira um marcador isotópico diferente nas proteínas geradas por cada cultura celular; (d) gerar uma amostra para cada uma das ditas culturas ce-lulares, em que cada amostra é distinguida por um analito diferente isotopicamente marcado, as ditas amostras incluindo pelo menos uma primeira amostra para a dita primeira cultura celular que possui um primeiro analito isotopicamente marcado e uma segunda amostra para a dita segunda cultura celular que possui um segundo analito isotopi- camente marcado, em que os ditos analitos isotopicamente marcados de cada amostra são isotopólogos; e em que a diferença das massas moleculares do dito primeiro analito isotopicamente marcado e do dito segundo analito isotopicamente marcado é menor ou igual a 300 mDa; (e) analisar os ditos analitos isotopicamente marcados para cada amostra usando uma técnica de análise de espectrometria de massas que fornece um poder de resolução igual ou maior do que 100.000, gerando dessa maneira um sinal de espectrometria de massas independente e distinguível para os analitos isotopicamente marcados de cada amostra; e (f) comparar os ditos sinais de espectrometria de massas para os analitos isotopicamente marcados de cada amostra, determi-nando dessa maneira a abundancia do analito na dita pluralidade de amostras.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de fornecer o dito aminoácido isotopica- mente marcado diferente para cada uma das ditas culturas celulares compreende fornecer um meio de crescimento para cada uma das ditas culturas celulares que compreendem os aminoácidos isotopica- mente marcados.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita introdução de um marcador isotópico diferente nas proteínas geradas por cada cultura celular é obtida através da in-corporação metabólica de aminoácidos isotopicamente marcados nas células das ditas culturas celulares.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de gerar uma amostra para cada uma das ditas culturas celulares compreende lisar as ditas células de cada uma das ditas culturas celulares.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de gerar uma amostra para cada uma das ditas culturas celulares compreende extrair as proteínas de cada uma das ditas culturas celulares.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de gerar uma amostra para cada uma das ditas culturas celulares compreende digerir proteínas de cada uma das ditas culturas celulares.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as ditas amostras são digeridas usando tripsina ou Endo LysC.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ditos aminoácidos isotopicamente marcados são isotopólogos de um aminoácido que ocorre naturalmente.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ditos aminoácidos isotopicamente marcados são isotopólogos de serina, leucina, tirosina, lisina, metionina ou arginina.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os ditos isotopólogos possuem um número de isótopos pesados estáveis selecionados do grupo que consiste em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ditos aminoácidos isotopicamente marcados de cada amostra possuem uma composição isotópica para sua fórmula de elemento codificado selecionado do grupo que consiste em: , em que i<3, j<4, n<1, o<1; , em que i<6, j<7, n<4, o<1; , em que i<4, j<3, n<2, o<2; , em que i<4, j<3, n<1, o<2; , em que i<3, j<3, n<, o<1, p<1; , em que i<5, j<5, n<1, o<2; , em que i<5, j<5, n<2, o<2; , em que i<2, j<2, n<1, o<1; , em que i<6, j<,5 n<3, o<1; , em que i<6, j<10, n<1, o<1; , em que i<6, j<1,0 n<1, o<1; , em que i<6, j<9, n<2, o<1; , em que i<5, j<8, n<1, o<1, p <1; , em que i<9, j<8, n<1, o<1; , em que i<5, j<7, n<1, o<1; , em que i<3, j<3, n<1, o<1; , em que i<4, j<5, n<1, o<1; , em que i<11, j<8, n<2, o<1; , em que i<9, j<7, n<1, o<1; e , em que i<5, j<8, n<1, o<1; em que cada um de i, j, n, o e p são independentemente um número inteiro ou 0.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ditos aminoácidos isotopicamente marcados possuem a fórmula:

em que gN e hN são ambos 15N; ou um de gN e hN é 15N, e um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C; ou um de gN e hN é 15N, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou iO é 18O; ou dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C; ou um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ditos aminoácidos isotopicamente marcados pos-suem a fórmula:

em que gN e hN são ambos 15N, e iO é 18O; ou gN e hN são ambos 15N, e dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C; ou gN e hN são ambos 15N, um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou um de gN e hN é 15N, um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e iO é 18O; ou gN e hN são ambos 15N, e dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou um de gN e hN é 15N, e três de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C; ou um de gN e hN é 15N, um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H, e iO é 18O; ou um de gN e hN é 15N, dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C, e iO é 18O; ou um de gN e hN é 15N, um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou quatro de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C; ou um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H, e iO é 18O; ou um de gN e hN é 15N, e três de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou três de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H, e iO é 18O; ou dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C, e dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e três de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou quatro de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ditos aminoácidos isotopicamente marcados pos-suem a fórmula:

em que dois de gN, hN, wN and xN são 15N; ou um de gN, hN, wN e xN é 15N, e um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C; ou um de gN, hN, wN e xN é 15N, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou iO é 18O; ou dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C; ou um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ditos aminoácidos isotopicamente marcados pos- suem a fórmula:

em que quatro de gN, hN, wN e xN são 15N; ou três de gN, hN, wN e xN são 15N, e um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C; ou três de gN, hN, wN e xN são 15N, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou dois de gN, hN, wN e xN são 15N, e iO é 18O; ou dois de gN, hN, wN e xN são 15N, e dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C; ou dois de gN, hN, wN e xN são 15N, um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou um de gN, hN, wN e xN é 15N, um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e iO é 18O; ou dois de gN, hN, wN e xN são 15N, e dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou um de gN, hN, wN e xN é 15N, e três de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C; ou um de gN, hN, wN e xN é 15N, um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H, e iO é 18O; ou um de gN, hN, wN e xN é 15N, dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C, e iO é 18O; ou um de gN, hN, wN e xN é 15N, um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou quatro de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C; ou um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H, e iO é 18O; ou um de gN, hN, wN e xN é 15N, e três de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou três de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C, e um de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH é 2H; ou jk l m n o p q r s t u v dois de H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H e H são 2H, e iO é 18O; ou dois de aC, bC, cC, dC, eC e fC são 13C, e dois de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou um de aC, bC, cC, dC, eC e fC é 13C, e três de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H; ou quatro de jH,kH, lH, mH, nH, oH, pH, qH, rH, sH, tH, uH e vH são 2H.

Images