BR112014028957B1 - Processo para cultivar bactérias acetogênicas em gás de síntese - Google Patents

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Abstract

processos para fermentar substrato gasoso contendo monóxido de carbono (co), para cultivar bactérias em substrato selecionado e para cultivar bactérias em gás de síntese. é provido um processo que é efetivo para permitir que sejam cultivadas bactérias num substrato selecionado. as bactérias são esporuladas e, em seguida, germinadas na presença de um substrato e um meio selecionados. é ainda proporcionado um processo para fermentar substratos gasosos contendo co. as bactérias são esporuladas e em seguida germinadas na presença de um substrato gasoso contendo co para fornecer um inóculo. o inóculo resultante é efetivo para proporcionar uma fermentação com uma produtividade de etanol tendo um sty específico de 1 ou superior.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO
[0001] O presente Pedido reivindica o benefício dos Pedidos Provisórios dos EUA no 61/650.098, 61/650.093, 61/650.077 e 61/650.084, todos depositados no dia 22 de maio de 2012, todos os quais se incorporam ao presente documento na íntegra por referência.
[0002] Propõe-se um processo para fermentar substratos gasosos contendo CO. Mais especificamente, bactérias são esporuladas e, então, germinadas na presença de um substrato gasoso contendo CO para produzir um inóculo. O inóculo resultante é eficiente para prover fermentação com uma produtividade de etanol com um STY específico de 1 ou mais.
ANTECEDENTES
[0003] Microrganismos acetogênicos produzem etanol a partir do monóxido de carbono (CO) através da fermentação de substratos gasosos. A fermentação usando Microrganismos anaeróbicos do gênero Clostridium produz etanol e outros produtos úteis. Por exemplo, a Patente dos Estados Unidos no 5.173.429 descreve o Clostridium Ijungdahlii, ATCC no 49587, um microrganismo anaeróbico que produz etanol e acetato a partir do gás de síntese. A Patente dos Estados Unidos no 5.807.722 descreve um método e aparelho para converter gases queimados em ácidos orgânicos e álcoois usando o Clostridium Ijungdahlii, ATCC no 55380. A Patente dos Estados Unidos no 6.136.577 descreve um método e aparelho para converter gases queimados em etanol usando o Clostridium Ijungdahlii, ATCC no 55988 e 55989.
[0004] Muitos microrganismos acetogênicos são pouco adequados ao bioprocessamento em escala industrial e, portanto, não demonstraram viabilidade comercial para esse fim. Esses Microrganismos têm tempo de duplicação lento e produtividades totais baixas. Além disso, muitas técnicas para a manipulação genética (nocaute, superexpressão de transgenes via integração ou reprodução de plasmídeos episômicos) são ineficientes, demoradas, árduas ou inexistentes.
[0005] Os microrganismos acetogênicos podem ser cultivados para produzir etanol a partir de monóxido de carbono. O processo de cultivo pode envolver cultivar as bactérias acetogênicas em quantidades crescentes de CO ao longo do tempo. Existe a necessidade de desenvolver Microrganismos mais rapidamente e métodos de seu uso para utilizar gasogênio ou outras fontes gasosas de carbono na produção de produtos químicos e combustíveis desejados.
SUMÁRIO
[0006] Um processo para fermentar um substrato gasoso contend monóxido de carbono (CO) inclui alimentar um inóculo de células bacterianas capaz de se desenvolver com o referido substrato gasoso contendo CO como única fonte de carbono e energia. O processo inclui alimentar o substrato gasoso para manter uma absorção específica de CO de ao menos cerca de 0,25 mmol por g de células e alimentar um meio nutritivo. Em um aspecto, o inóculo de células bacterianas é produzido por um processo que inclui esporular, seguido por germinar na presença de substrato gasoso contendo CO. O processo é eficiente para produzir um STY específico de cerca de 1 g de etanol/(L^dia^grama de células) ou mais.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0007] Os aspectos, traços e vantagens acima, bem como outros aspectos, traços e vantagens dos vários aspectos do processo transparecerão melhor pela análise das Figuras a seguir. A FIG. 1 ilustra o desenvolvimento de Butyribacterium methylotrophicum em gás de síntese através da esporulação e germinação após cultivo em metanol e redução do pH. A FIG. 2 ilustra o desenvolvimento de Butyribacterium methylotrophicum em gás de síntese através da esporulação e germinação após cultivo em extrato de levedura, metanol e acidificação. A FIG. 3 ilustra o desenvolvimento de Butyribacterium methylotrophicum em gás de síntese após cultivo em extrato de levedura e acidificação. A FIG. 4 ilustra o desenvolvimento de Butyribacterium methylotrophicum em gás de síntese após cultivo prévio de Butyribacterium methylotrophicum em gás de síntese. A FIG. 5 ilustra o desenvolvimento de Butyribacterium methylotrophicum em gás de síntese após cultivo em extrato de levedura e redução do pH. A FIG. 6 ilustra o desenvolvimento de Clostridium ljungdahlii em gás de síntese após cultivo em extrato de levedura e redução do pH. A FIG. 7 ilustra o desenvolvimento de Clostridium ljungdahlii fermentando em gás de síntese em frutose.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0008] A descrição a seguir não deve ser interpretada de maneira limitante, pois foi elaborada com o mero objetivo de descrever os princípios gerais de concretizações exemplificativas. O âmbito da invenção deve ser determinado com referência às Reivindicações.
[0009] Os processos descritos neste documento são eficientes produzir uma fermentação com alto nível de produtividade de etanol. Nesse aspecto, o processo é eficiente para produzir um STY específico (rendimento espaço-tempo específico expresso em g de etanol/(L^dia^grama de células) de ao menos cerca de 1, em outro aspecto, de cerca de 1 a cerca de 10, em outro aspecto, de cerca de 2 a cerca de 8, em outro aspecto, de cerca de 3 a cerca de 7 e, em outro aspecto, de cerca de 4 a cerca de 6.
Definições
[00010] Salvo definição em contrário, os termos a seguir, conforme usados ao longo deste Relatório Descritivo da presente invenção, são definidos conforme o seguinte e podem incluir flexões no singular ou plural das definições abaixo:
[00011] O termo “cerca de” modificando qualquer quantidade se refere a uma variação nessa quantidade encontrada em condições no mundo real, por exemplo, no laboratório, na planta piloto ou na usina de produção. Por exemplo, uma quantidade de um ingrediente ou uma medida usada em uma mistura ou quantidade quando modificada por “cerca de” inclui a variação e grau de tratamento geralmente usados na medição em condições experimentais em usinas de produção ou laboratórios. Por exemplo, a quantidade de um componente de um produto quando modificada por “cerca de” inclui a variação entre bateladas em vários experimentos na usina ou laboratório e a variação inerente no método analítico. Sejam ou não modificadas por “cerca de”, as quantidades incluem equivalentes delas. Qualquer quantidade mencionada neste documento e modificada por “cerca de” também pode ser empregada na presente invenção como a quantidade não modificada por “cerca de”.
[00012] Os termos “gasogênio” ou “gás de síntese” significam gás de síntese, que é o nome dado a uma mistura de gás que contém quantidades variantes de monóxido de carbono e hidrogênio. Exemplos de métodos para sua produção incluem a reformulação a vapor do gás natural ou de hidrocarbonetos para produzir hidrogênio, a gaseificação do carvão e em alguns tipos de usinas de gaseificação de resíduos em energia. O nome vem de seu uso como intermediário na criação do gás natural sintético (GNS) e para produzir amônia ou metanol. O gás de síntese é inflamável e geralmente usado como fonte de combustível ou como intermediário na produção de outros produtos químicos.
[00013] Os termos “fermentação”, “processo de fermentação” ou “reação de fermentação” e seus semelhantes visam a abranger tanto a fase de crescimento quanto a fase de biossíntese do produto do processo. Em um aspecto, fermentação refere-se à conversão do CO em álcool.
[00014] O termo “densidade celular” significa massa de células de microrganismos por unidade de volume do caldo de fermentação, por exemplo, gramas/litro.
[00015] O termo “reciclagem celular” refere-se à separação de células microbianas de um caldo de fermentação e ao retorno de todas essas células microbianas separadas, ou de uma fração delas, ao fermentador. Em geral, um dispositivo de filtragem é usado para fazer as separações.
Cultura Acetogênica
[00016] Em um aspecto, o processo inclui cultivar ou reproduzir bactérias em um primeiro meio que pode incluir um primeiro substrato. O primeiro meio pode oferecer às bactérias fontes adequadas de carbono e energia e outros nutrientes, incluindo fatores de crescimento. Nesse aspecto, o primeiro meio inclui componentes como vitaminas, microelementos e aminoácidos. O primeiro meio pode incluir fontes de carbono, inclusive extrato de levedura, carboidratos, álcool, aminoácidos, peptona, peptídeos, proteína, ácidos graxos, lipídios e misturas desses. Por exemplo, bactérias alimentadas a partir de acervos de cultura, tais como ATCC, podem incluir meios recomendados que incluem componentes como peptona, glicose, frutose, extrato de levedura, aminoácidos, vitaminas e microelementos. O primeiro meio pode oferecer componentes que permitem rápido aumento na densidade celular. Nesse aspecto, o primeiro meio pode ter um pH de cerca de 5,7 a cerca de 7,0. Alguns exemplos de um primeiro meio que podem ser usados incluem meio ATCC 1754 (http://www.atcc.org/Attachments /2940.pdf), meio ATCC 1136 (com extrato de levedura a 0,1%, acetato de sódio a 50 mM e metanol a 100 mM, http://www.atcc.org/ Attachments/2408.pdf), meio ATCC 1019 (http://www.atcc.org/ Attachments/3112.pdf) e meio ATCC 1016 (http://www.atcc.org/ Attachments/2299.pdf).
[00017] Em outro aspecto, o primeiro meio e o primeiro substrato são eficientes para manter uma densidade celular de cerca de 0,005 g/L ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,02 g/L ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,03 g/L ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,04 g/L ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,05 g/L ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,1 g/L ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,3 g/l ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,5 g/L ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,75 g/L ou mais e, em outro aspecto, de cerca de 1,0 g/L ou mais.
[00018] Em um aspecto, os Microrganismos usados incluem bactérias acetogênicas. Exemplos de bactérias acetogênicas úteis incluem as do gênero Clostridium, como linhagens de Clostridium ljungdahlii, inclusive as descritas no documento WO 2000/68407, no documento EP 117309, nas Patentes dos Estados Unidos no 5.173.429, 5.593.886 e 6.368.819, no documento WO 1998/00558 e no documento WO 2002/08438, linhagens de Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 e DSM 19630 do DSMZ, Alemanha), inclusive as descritas no documento WO 2007/117157 e no documento WO 2009/151342, e Clostridium ragsdalei (P11, ATCC BAA-622) e Alkalibaculum bacchi (CP11, ATCC BAA-1772), inclusive as descritas respectivamente na Patente dos Estados Unidos no 7.704.723 e em “Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas”, Hasan Atiyeh, apresentado na Conferência Anual do Estado de Oklahoma EPSCoR, 29 de abril de 2010, e Clostridium carboxidivorans (ATCC PTA-7827), descrita no pedido de Patente dos Estados Unidos no 2007/0276447. Outros Microrganismos adequados incluem os do gênero Moorella, inclusive a Moorella sp. HUC22-1, e os do gênero Carboxydothermus. Cada um desses documentos incorpora-se ao presente documento por referência. Culturas misturadas com dois ou mais microrganismos podem ser usadas.
[00019] Alguns exemplos de bactérias úteis incluem Acetogenium kivui, Acetoanaerobium noterae, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchi CP11 (ATCC BAA-1772), Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacificus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium acetobutylicum P262 (DSM 19630 do DSMZ, Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 19630 do DSMZ, Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 do DSMZ, Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 23693 do DSMZ, Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 24138 do DSMZ, Alemanha), Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Clostridium coskatii (ATCC PTA- 10522), Clostridium drakei, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii O-52 (ATCC 55889), Clostridium magnum, Clostridium pasteurianum (DSM 525 do DSMZ, Alemanha), Clostridium ragsdali P11 (ATCC BAA-622), Clostridium scatologenes, Clostridium thermoaceticum, Clostridium ultunense, Desulfotomaculum kuznetsovii, Eubacterium limosum, Geobacter sulfurreducens, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina barkeri, Morrella thermoacetica, Morrella thermoautotrophica, Oxobacter pfennigii, Peptostreptococcus productus, Ruminococcus productus, Thermoanaerobacter kivui e misturas dessas.
Esporulação
[00020] Depois de estabelecer uma bactéria em um primeiro meio e primeiro substrato, a quantidade do primeiro substrato é reduzida. As concentrações de componentes no primeiro meio também podem ser reduzidas junto com o primeiro substrato. Nesse aspecto, o primeiro meio pode ser substituído por um meio de produção. Em outros aspectos, o primeiro substrato e o substrato selecionado podem ser o mesmo ou podem ser diferentes.
[00021] Em um aspecto, o primeiro meio e o primeiro substrato podem ser substituídos até uma taxa máxima igual à taxa máxima da bomba usada para alimentar o meio de produção. Em outro aspecto, bactérias podem ser concentradas a partir do primeiro meio, tal como, por exemplo, na forma de um grânulo, e transferidas diretamente a um meio de produção.
[00022] Em outro aspecto, antes da esporulação, uma fonte de carbono pode ser adicionada para manter uma densidade celular de cerca de 0,005 g/L ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,02 g/L ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,03 g/L ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,04 g/L ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,05 g/L ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,1 g/L ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,3 g/l ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,5 g/L ou mais, em outro aspecto, de cerca de 0,75 g/L ou mais e, em outro aspecto, de cerca de 1,0 g/L ou mais. Alguns exemplos de fontes de carbono que podem ser adicionadas incluem extrato de levedura, carboidratos, álcool, aminoácidos, peptona, peptídeos, proteína, ácidos graxos, lipídios e misturas desses.
[00023] Reduzir a entrada de um primeiro substrato é eficiente para fazer com que ao menos uma fração das bactérias esporule. Os esporos são formados por divisão intracelular dentro do citoplasma de uma célula-mãe. Bactérias esporíferas iniciam a esporulação em resposta a mudanças adversas no ambiente, tais como limitação dos nutrientes. Depois de formados, os esporos maduros são liberados das células-mãe (para mais detalhes, consulte Brun, et al. eds. Prokaryotic Development. Endospore-forming bacteria: an overview, ed. A.L. Sonenshein. 2000, American Society for Microbiology: Washington, D.C., 133 a 150; Cutting, S., ed. Molecular Biology Methods for Bacillus. Sporulation, germination and outgrowth, ed. W.L. Nicholson and P. Setlow, 1990, John Wiley and Sons: Sussex, England, 391 a 450, que se incorporam por referência ao presente documento). Os esporos geralmente são ovais ou esféricos e são mais largos do que células bacterianas vegetativas. Outros formatos de esporo diferentes incluem estruturas fusiformes, basculiformes e em forma de raquete de tênis.
[00024] Nesse aspecto, um primeiro substrato é reduzido em uma quantidade eficiente para produzir uma razão do número de esporos para o número de células de ao menos cerca de 0,05, em outro aspecto, uma razão do número de esporos para o número de células de ao menos cerca de 0,1 e, em outro aspecto, uma razão do número de esporos para o número de células de ao menos cerca de 0,5. Os esporos podem ser quantificados usando métodos conhecidos, tais como, por exemplo, inspeção visual e contagem usando um hemocitômetro.
Germinação
[00025] De acordo com o processo, adiciona-se um substrato selecionado em um meio de produção aos esporos bacterianos. A adição de um substrato selecionado é eficiente para fazer com que os esporos germinem. À medida que um esporo avança na germinação rumo à divisão celular, há vários estágios, incluindo (1) ativação do esporo; (2) germinação de estágio I, durante a qual a água reidrata parcialmente o núcleo do esporo; (3) germinação de estágio II, durante a qual a hidrólise do córtex acontece e o metabolismo continua; e (4) florescimento, durante o qual a divisão celular acontece (para mais detalhes, consulte Setlow, P., Spore germination. Curr Opin Microbiol, 2003. 6: p. 550 a 556; Foster, S.J. et al. Pulling the trigger: the mechanism of bacterial sporegermination. Mol Microbiol, 1990. 4: p. 137 a 141; e Moir, et al., Spore germination. Cell Mol Life Sci, 2002. 59: p. 403 a 409, cada um dos quais se incorpora ao presente documento por referência).
[00026] De acordo com o processo, a germinação é eficiente para produzir uma razão do número de esporos para o número de células de ao menos cerca de 0,04, em outro aspecto, uma razão do número de esporos para o número de células de ao menos cerca de 0,01 e, em outro aspecto, uma razão do número de esporos para o número de células de ao menos cerca de 0,001. Em um aspecto onde o substrato selecionado é CO, o processo é eficiente para produzir uma absorção específica de CO de ao menos cerca de 0,25 mmol/min/grama de células, em outro aspecto, ao menos cerca de 0,50 mmol/min/grama de células, em outro aspecto, ao menos cerca de 0,75 mmol/min/grama de células e, em outro aspecto, ao menos cerca de 1,0 mmol/min/grama de células.
[00027] Meios de produção são aqueles que contêm uma concentração mais baixa de nutrientes para o crescimento. O meio de produção pode conter uma fonte de carbono para crescimento bacteriano, vários sais, que podem variar entre espécies bacterianas e condições de crescimento; esses geralmente proporcionam elementos essenciais como magnésio, nitrogênio, fósforo e enxofre para permitir que as bactérias sintetizem proteína e ácidos nucleicos. O meio de produção pode ter um pH de cerca de 5 a cerca de 4,1. Em um aspecto, o único carbono oferecido pelo meio de produção é proporcionado pelo gás de síntese. Um exemplo de meio de produção é o seguinte:
Figure img0001
Figure img0002
[00028] Em um aspecto, o meio inclui um ou mais dentre uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo e uma fonte de potássio. O meio pode incluir qualquer um dos três, qualquer combinação dos três e, em um aspecto importante, inclui todos os três. Uma fonte de nitrogênio pode incluir uma fonte de nitrogênio selecionada dentre o grupo composto por cloreto de amônio, fosfato de amônio, sulfato de amônio, nitrato de amônio e misturas desses. Uma fonte de fósforo pode incluir uma fonte de fósforo selecionada dentre o grupo composto por ácido fosfórico, fosfato de amônio, fosfato de potássio e misturas desses. Uma fonte de potássio pode incluir uma fonte de potássio selecionada dentre o grupo composto por cloreto de potássio, fosfato de potássio, nitrato de potássio, sulfato de potássio e misturas desses.
[00029] Em um aspecto, o meio inclui um ou mais dentre ferro, tungstênio, níquel, cobalto, magnésio, enxofre e tiamina. O meio pode incluir qualquer um desses componentes, qualquer combinação e, em um aspecto importante, inclui todos esses componentes. Ferro pode incluir uma fonte de ferro selecionada dentre o grupo composto por cloreto ferroso, sulfato ferroso e misturas desses. Uma fonte de tungstênio pode incluir uma fonte de tungstênio selecionada dentre o grupo composto por tungstato de sódio, tungstato de cálcio, tungstato de potássio e misturas desses. Uma fonte de níquel pode incluir uma fonte de níquel selecionada dentre o grupo composto por cloreto de níquel, sulfato de níquel, nitrato de níquel e misturas desses. Uma fonte de cobalto pode incluir uma fonte de cobalto selecionada dentre o grupo composto por cloreto de cobalto, fluoreto de cobalto, brometo de cobalto, iodeto de cobalto e misturas desses. Uma fonte de magnésio pode incluir uma fonte de magnésio selecionada dentre o grupo composto por cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, fosfato de magnésio e misturas desses. Uma fonte de enxofre pode incluir cisteína, sulfeto de sódio e misturas desses.
[00030] Em um aspecto, um meio de produção incluirá uma fonte de carbono que é proporcionada somente pelo substrato selecionado, tal como, por exemplo, CO. Nesse aspecto, o meio de produção pode ter menos que cerca de 0,01 g/L de uma fonte de carbono diferente do carbono oferecido pelo substrato selecionado. Exemplos de outros carbonos adicionados podem incluir extrato de levedura, álcool, peptídeos, proteína, ácido graxo, lipídio e misturas desses.
Gás de Síntese
[00031] O gás de síntese pode ser proveniente de qualquer fonte conhecida. Em um aspecto, o gás de síntese pode ser oriundo da gaseificação de materiais carbonados. A gaseificação envolve a combustão parcial da biomassa em um suprimento restrito de oxigênio. O gás resultante inclui principalmente CO e H2. Nesse aspecto, o gás de síntese conterá ao menos cerca de 10% em mols de CO, em um aspecto, cerca de 20% em mols, em um aspecto, cerca de 10% em mols a cerca de 100% em mols, em outro aspecto, cerca de 20% a cerca de 100% em mols de CO, em outro aspecto, cerca de 30% a cerca de 80% em mols de CO, em outro aspecto, cerca de 40% a cerca de 80% em mols de CO e, em outro aspecto, cerca de 50% a cerca de 70% em mols de CO. O gás de síntese tem uma razão CO/CO2 de ao menos cerca de 0,75. Alguns exemplos de métodos e aparelhos de gaseificação adequados são descritos nos pedidos dos Estados Unidos de número de série 13/427.144, 13/427.193 e 13/427.247, todos os quais foram depositados no dia 6 de abril de 2011 e todos os quais se incorporam ao presente documento por referência.
[00032] Em outro aspecto, o gás de síntese usado para reproduzir bactérias acetogênicas pode ser substancialmente CO. Conforme usado neste documento, “substancialmente CO” significa ao menos cerca de 50% em mols de CO, em outro aspecto, ao menos cerca de 60% em mols de CO, em outro aspecto, ao menos cerca de 70% em mols de CO, em outro aspecto, ao menos cerca de 80% em mols de CO e, em outro aspecto, ao menos cerca de 90% em mols de CO.
Operação do Biorreator
[00033] De acordo com um aspecto, o processo de fermentação se inicia com a adição de um meio ao vaso reator. O meio é esterilizado para remover Microrganismos indesejados e o reator é inoculado com os Microrganismos desejados.
[00034] Quando da inoculação, uma velocidade de alimentação inicial do gás de alimentação é estabelecida de maneira eficiente para alimentar a população inicial de microrganismos. Analisa-se o gás efluente para determinar seu conteúdo. Os resultados dessa análise do gás são usados para controlar a velocidade de alimentação do gás. Ao obter níveis desejados, a fase líquida e o material celular são retirados do reator e realimentados com meio.
EXEMPLOS Exemplo 1: Desenvolvimento de Butyribacterium methylotrophicum em gás de síntese após cultivo em metanol e redução do pH.
[00035] Preparo do inóculo: Cultivou-se Butyribacterium methylotrophicum em frascos de soro (13 frascos com 25 ml cada) em meio BM. O meio BM teve a seguinte composição: Composto ml/L 1) água destilada 807 2) solução mineral #1 50 3) solução mineral #2 25 4) 8% de solução de Na2Co3 50 5) Solução de Mineral de Wolfe 10 6) Resazurina (1 g/L) 1 7) Extrato de levedura 1 8) Acetato de sódio (3M) 17 Após autoclave: 9) Solução de Vitamina de Wolfe 10 10) Agente redutor cisteína-sulfeto 20 11) Metanol (100%) 10 A solução de Mineral de Wolfe é disponibilizada pela ATCC (Suplemento de Traços Minerais, número de catálogo MD-TMS). A solução de Vitamina de Wolfe é disponibilizada pela ATCC (Suplemento Vitamínico, número de catálogo MD-VS). Protocolo de mistura: Mistura de #1 a #8, autoclave, resfriamento em N2 Transferência para câmara anaeróbica, adição de #9 a #11 (anaeróbico e estéril) Ajuste para pH de 7,2
[00036] Operação do biorreator: Um biorreator foi inoculado com 325 ml do Butyribacterium methylotrophicum cultivado conforme descrito acima. Adicionou-se metanol ao biorreator (92,5 mL/L) na inicialização para aumentar a densidade celular original (0,049 g/L) da cultura. O meio de cultivo foi gradualmente substituído por um meio de produção (meio mínimo de pH baixo com gás de síntese como única fonte de carbono) conforme descrito abaixo. Eventos de mudança de meios Tempo (Horas) Evento de mudança de meios 149 10 ml de metanol/L a frasco de meios 191 frasco de meios mudado para 5 ml de metanol/L 214 10 ml/L de traços metálicos ATCC adicionados ao frasco de meios 335 frasco de meios mudado para 2,5 ml de metanol/L avaliação visual da cultura 359 frasco de meios mudado para o meio de produção sem metanol 383 avaliação visual da cultura 360 5 ml de metanol adicionados ao reator 20 ml de MPFN/L adicionados ao frasco de meios 407 14,7 ml de vitamina ATCC/L adicionados ao frasco de meios avaliação visual da cultura 480 avaliação visual da cultura Mudança das taxas de fluxo do meio de cultura ao reator Tempo do Processo (horas) Mudança na taxa de fluxo por litro ao reator 76,30 0,28 ml/min meio BM 119,33 0,38 ml/min meio BM 171,50 0,00 ml/min meio BM 196,50 0,28 ml/min meio BM 335,42 0,53 ml/min meio BM 359,83 0,46 ml/min meio de produção 461,67 0,63 ml/min meio de produção
[00037] Meio de Produção (cujo preparo é descrito na Patente dos EUA no Meio de Produção (cujo preparo é descrito na Patente documento) Componente Quantidade por litro 2 g/L de FeCl2• 4 H2O 10 ml 85% de H3PO4 0,05 ml Traços metálicos MPFN 20 mL (NH4)2HPO4 0,6 g NH4Cl 2,0 g NaCl 0,2 g KCl 0,15 g MgCl2 • 6 H2O 0,5 g CaCl2 • 2 H2O 0,2 g Cisteína 0,25 g
[00038] Conforme ilustrado acima, o metanol no biorreator foi reduzido em 50% duas vezes e, então, removido por completo em um período de 15 dias. MPFN (que contém Ni) foi adicionado dois dias após a remoção de metanol do meio.
[00039] Resultados: Observações visuais dadas pelas indicações a seguir: Tempo (Horas) Razão esporo para célula 335 1:1 383 5,7:1 407 9,75:1 480 0,23:1
[00040] Parâmetros de cultivo, inclusive massa celular, absorção específica de CO e absorção específica de H2, foram monitorados. Conforme ilustra a Figura 1, a absorção específica de CO e a absorção específica de H2 começaram a aumentar a cerca de 450 horas.
Exemplo 2: Inicialização do Reator com Butyribacterium methylotrophicum congelado previamente cultivado em gás de síntese.
[00041] Seiscentos mililitros de Butyribacterium methylotrophicum congelado colhidos do Exemplo 1 foram inoculados em 1.400 ml do meio de produção. A densidade celular inicial foi de 0,39 g/L. O consumo de CO foi monitorado e foi acima de 0,4 mmol/min/g dentro das primeiras 24 horas.
Exemplo 3: Desenvolvimento de Butyribacterium methylotrophicum em gás de síntese após cultivo em extrato de levedura, metanol e acidificação.
[00042] Preparo do inóculo: Cultivou-se Butyribacterium methylotrophicum em frascos de soro em um meio que incluía extrato de levedura e pH de 7,2 a 7,4. O meio é descrito em Heiskanen et al. (2007), Enzyme and Microbial Technology, Vol. 41, Issue 3, páginas de 362 a 367, que se incorpora ao presente documento por referência.
[00043] Operação do biorreator: Um biorreator contendo um litro de meio conforme descrito acima foi inoculado com 100 ml de Butyribacterium methylotrophicum cultivado conforme descrito acima. A densidade celular inicial foi de 0,04 g/L.
[00044] Adicionou-se extrato de levedura ao biorreator para aumentar a densidade celular de acordo com o protocolo a seguir: Tempo (horas) Volume adicionado por litro no reator 85,38 h 2,5 ml 89,08 h 2,5 ml 113,73 h 3,75 ml 330,58 h 3,77 ml
[00045] Composição do extrato de levedura: 20% em água DI
[00046] Adicionou-se uma solução acética ao biorreator para diminuir o pH. A solução acética e o protocolo de adição foram conforme o seguinte: Solução Acética Composto Quantidade NaCl 0,9 g/L MgCl2 • 6 H2O 0,2 g/L CaCl2 • 2 H2O 0,1 g/L NH4Cl 1,0 g/L extrato de levedura 0,5 g/L Solução de traços minerais 10 ml/L Resazurina 2 ml/L Ácido Acético 80,0 ml/L Protocolo de Adição da Solução Acética Tempo (horas) Volume adicionado por litro no reator 66,82 11,25 ml 84,22 6,25 ml 89,50 7,5 ml
[00047] Adicionou-se metanol (26,92 ml de uma solução a 10%) às 253,8 horas para aumentar a densidade celular. O meio de cultivo foi gradualmente substituído por um meio de produção (meio mínimo de pH baixo com gás de síntese como única fonte de carbono) conforme descrito abaixo. Mudança das taxas de fluxo do meio de cultura ao reator Tempo (horas) Mudança na taxa de fluxo do meio mínimo por L ao reator 109,00 0,63 ml/min 226,67 0,00 ml/min 402,08 0,20 ml/min 419,00 0,42 ml/min 425,40 0,59 ml/min 443,73 0,77 ml/min
[00048] Resultados: Observações visuais dadas pelas indicações a seguir: Tempo (Horas) Razão esporo para célula 36 0,15:1 60 0,75:1 84 1,25:1 108 1,29:1 132 1,23:1
[00049] Parâmetros de cultivo, inclusive massa celular, absorção específica de CO e absorção específica de H2, foram monitorados. Conforme ilustra a Figura 2, a absorção específica de CO e a absorção específica de H2 começaram a aumentar a cerca de 450 horas.
Exemplo 4: Desenvolvimento de Butyribacterium methylotrophicum em gás de síntese após cultivo em extrato de levedura e acidificação.
[00050] Preparo do inóculo: Cultivou-se Butyribacterium methylotrophicum em frascos de soro em meio conforme descrito no Exemplo 3.
[00051] Operação do biorreator: Um biorreator foi inoculado com 350 ml do Butyribacterium methylotrophicum cultivado conforme descrito acima. Os 350 ml acima do inóculo de Butyribacterium methylotrophicum foram transferidos a 1.250 ml do meio de cultivo contendo extrato de levedura. A composição do meio de cultivo inicial no reator foi a seguinte: Meio de Cultivo Inicial Componente Quantidade solução estoque de sais minerais 12,5 ml/L Suplemento de traços minerais ATCC 10,0 ml/L Suplemento vitamínico ATCC 10,0 ml/L agente redutor 10,0 ml/L cisteína 0,45 g/L extrato de levedura 0,1%
[00052] Solução de sais minerais: (80 g/L de NaCl, 100 g/L de NH4C1, 10 g/L de KCl, 10 g/L de KH2PO4, 20 g/L de MgSO4 • 7 H2O, 4 g/L de CaC12 • H2O)
[00053] Não houve consumo de gás de síntese mensurável pela cultura após a inoculação. Como forma de aumentar a densidade celular da cultura, adicionou-se extrato de levedura ao reator nos pontos no tempo indicados abaixo. O pH do reator foi alterado gradualmente para 4,7 adicionando uma solução acética (descrita acima) ao reator conforme indicado na tabela abaixo. Além disso, o meio no reator foi trocado gradualmente para o meio de produção desejado (descrito acima) conforme indicado na tabela abaixo. Adição de extrato de levedura para aumentar a massa celular inicial no reator: Tempo (horas) Volume adicionado por litro no reator 47,25 4,12 ml 91,25 4,67 ml 122,35 4,17 ml Composição do extrato de levedura: 20% em água DI. Adição de solução acética para diminuir o pH no reator: Tempo (horas) Volume adicionado por litro no reator 117,25 13,33 ml 118,42 20,00 ml 120,25 32,26 ml 120,97 31,25 ml 121,25 30,30 ml Troca do meio no reator com pH baixo pelo meio de produção sem extrato de levedura: Tempo (horas) Mudança na taxa de fluxo do meio mínimo ao biorreator 122,63 0,18 ml/min 161,75 40 ml de meio adicionados diretamente ao biorreator 163,28 0,32 ml/min 168,28 0,65 ml/min 225,25 0,00 ml/min 427,00 0,59 ml/min 428,38 1,18 ml/min 433,87 0,00 ml/min 576,97 0,16 ml/min 625,33 0,50 ml/min 625,88 0,58 ml/min
[00054] Resultados: Observações visuais dadas pelas indicações a seguir: Tempo (Horas) Razão esporo para célula 163 043:1 499 3,4:1 571 5,4:1 595 0,45:1 619 0,27:1
[00055] Parâmetros de cultivo, inclusive massa celular, absorção específica de CO e absorção específica de H2, foram monitorados. Conforme ilustra a Figura 3, a absorção específica de CO e a absorção específica de H2 começaram a aumentar a cerca de 600 horas.
Exemplo 5: Inoculação de um Biorreator contendo meio de produção de pH baixo com Butyribacterium methylotrophicum previamente cultivado em gás de síntese.
[00056] Bactérias do Exemplo 4 foram mantidas em frascos de soro em meio MES (sem extrato de levedura nem frutose) durante 28 dias. Esses frascos de soro foram regularmente verificados quanto à composição de gás na área superior e preenchidos novamente com gás de síntese quando necessário.
[00057] O biorreator foi inoculado com 210 ml do Butyribacterium methylotrophicum cultivado nos frascos de soro acima. Os 210 ml de Butyribacterium methylotrophicum foram transferidos a 1 litro de meio de produção (conforme descrito acima) sem nenhum extrato de levedura nem nenhum substrato de carbono orgânico. A densidade celular inicial e o pH da cultura após a inoculação foram de 0,03 g/L e 4,7, respectivamente. Taxas de fluxo do meio de produção ao reator Tempo (horas) Mudança na taxa de fluxo do meio mínimo ao reator 122 0,5 ml/min 144 1,0 ml/min 152 2,0 ml/min
[00058] Resultados: Observações visuais dadas pelas indicações a seguir: Tempo (Horas) Razão esporo para célula 2 0,37:1 26 0,04:1 50 0,06:1 74 0,23:1
[00059] Parâmetros de cultivo, inclusive massa celular, absorção específica de CO e absorção específica de H2, foram monitorados e são ilustrados na Figura 4.
Exemplo 6: Adaptação de Clostridium autoethanogenum através de esporulação e germinação para utilizar gás de síntese em um meio de pH baixo (sem extrato de levedura)
[00060] Preparo do inóculo: Preparou-se um inóculo de Clostridium autoethanogenum conforme o seguinte: Meio de Cultivo do Inóculo Componente Quantidade Tampão MES 10 g/L solução estoque de sais minerais 12,5 ml/L Suplemento de traços minerais ATCC 10,0 ml/L Suplemento vitamínico ATCC 10,0 ml/L Frutose 10,0 g/L extrato de levedura 1,0 g/L resazurina 0,01 g/L
[00061] Solução de sais minerais: (80 g/L de NaCl, 100 g/L de NH4C1, 10 g/L de KCl, 10 g/L de KH2PO4, 20 g/L de MgSO4 • 7 H2O, 4 g/L de CaC12 • H2O)
[00062] Operação do biorreator: Um biorreator foi inoculado com Clostridium autoethanogenum cultivado no meio descrito acima contendo extrato de levedura e frutose. O pH inicial da cultura no reator foi de 4,7 e a densidade celular de 0,03 g/L. Não houve consumo de gás de síntese mensurável pela cultura após a inoculação.
[00063] Não houve aumentos na densidade celular nas primeiras 20 horas após a inoculação. Frutose e extrato de levedura foram adicionados ao reator, conforme indicado abaixo, para tornar as condições menos desfavoráveis e também como forma de aumentar a densidade celular inicial da cultura. Além disso, o reator foi inoculado com bactérias mais três vezes, conforme indicado abaixo. As inoculações adicionais acima foram feitas para aumentar ainda mais a densidade celular inicial do reator. Durante o experimento, conforme indicado abaixo, o meio no reator foi trocado gradualmente por um meio de produção (conforme descrito neste documento). Durante esse processo, as bactérias no reator esporularam e germinaram em uma cultura que pode utilizar gás de síntese em um meio mínimo de pH baixo sem extrato de levedura e frutose. A oxirredução da cultura no reator foi mantida abaixo de -140 mv adicionando um dos dois agentes redutores descritos abaixo. Adição de extrato de levedura para aumentar a massa celular inicial no reator: Tempo do Processo (horas) Volume adicionado por litro no reator ou frasco de meios 168 5,0 ml Ao reator e ao frasco 216 10,0 ml Ao frasco 284 5,0 ml Ao frasco Composição do extrato de levedura: 20% em água DI Adição de frutose para aumentar a massa celular inicial no reator: Tempo do Processo (horas) Volume adicionado por litro no reator ou ao frasco de meios 20 12,5 ml Ao reator 23 12,5 ml Ao reator 24 12,5 ml Ao reator 25 12,5 ml Ao reator 216 10,0 ml Ao frasco de meios 310 10,3 ml Ao reator 311 32,4 ml Ao reator 312 10,8 ml Ao reator 329 10,8 ml Ao reator 330 21,6 ml Ao reator 337 32,4 ml Ao reator 353 22,2 ml Ao reator 362 10,5 ml Ao reator 368 10,5 ml Ao reator Composição da frutose: 25% em água DI Inoculação adicional do reator com Clostridium autoethanogenum cultivado em um meio rico: Processo (horas) Volume adicionado por litro no reator 47 36 ml 168 163 ml 187 29 ml
[00064] Composição dos agentes redutores usados no experimento: 9 g/L de NaOH, 40 g/L de L-cisteína, 40 g/L de Na2S, H2O, TiCl3 (Sigma Aldrich 14010).
[00065] Troca do meio no reator do meio de cultivo inicial para o meio de produção:
[00066] Tempo do Processo (horas) Mudança na taxa de fluxo do meio mínimo ao reator, volume adicionado por litro e tipo do meio 30,5 0,49 ml/min Meio de cultivo mínimo inicial 161 0,0 ml/min Meio de cultivo mínimo inicial 216 0,28 ml/min Meio de cultivo mínimo inicial 284 0,51 ml/min Meio de cultivo mínimo inicial 407 0,53 ml/min Meio de cultivo mínimo final
[00067] Resultados: Observações visuais dadas pelas indicações a seguir: Tempo (Horas) Razão esporo para célula 187 0,58:1 210 0,83:1 234 1,07:1 282 0,18:1 306 0,25:1 330 0,16:1
[00068] Parâmetros de cultivo, inclusive massa celular, absorção específica de CO e absorção específica de H2, foram monitorados e são ilustrados na Figura 5.
Exemplo 7: Adaptação de Clostridium Ijungdahli PETC através de esporulação e germinação para utilizar gás de síntese em um meio de pH baixo (sem extrato de levedura)
[00069] Preparo do inóculo: O inóculo de Clostridium Ijungdahli PETC foi primeiramente cultivado em um meio com pH de 5,7 contendo extrato de levedura (0,1%) e frutose (1%) conforme descrito abaixo. O extrato de levedura e a frutose na cultura de inóculo acima foram diluídos transferindo essas culturas (160 ml) ao mesmo meio de cultivo (1.000 ml) sem extrato de levedura e frutose. Após incubar essa cultura durante 5 dias a 37° C, transferiram-se 930 ml dessa cultura a um reator de semeadura contendo 1.200 ml do meio mínimo conforme descrito abaixo. Após 16 dias de incubação, transferiram-se 200 ml dessa cultura de semeadura a outro reator contendo 1.200 do mesmo meio mínimo acima. O pH inicial da cultura no reator foi de 5,4 e a densidade celular inicial de 0,05 g/L. Meios usados para cultivar as bactérias do inóculo: Componente Quantidade MES 10 g/L solução estoque de sais minerais 12,5 ml/L Suplemento de traços minerais ATCC 10,0 ml/L Suplemento vitamínico ATCC 10,0 ml/L Agente redutor 10,0 ml/L resazurina 0,01 g/L
[00070] Solução estoque de sais minerais: (80 g/L de NaCL, 100 g/L de NH4CI, 10 g/L de KCL, 10 g/L de KH2PO4, 20 g/L de MgSO4 • 7 H2O, 4 g/L de CaCl2 • H2O)
[00071] Composição do agente redutor: 9 g/L de NaOH, 40 g/L de L-cisteína, 40 g/L de Na2S, 1 L de H2O.
[00072] Meio de produção: 0,15 g/L de KCl, 0,5 g/L de MgCl2 • 6 H2O, 0,2 de CaCl2 • 2 H2O, 2 g/L de NH4CI, 0,6 g de (NH4)2HPO4, 0,2 g/L de NaCl, 0,45 g/L de Cisteína. 10 ml/L de Suplemento de Traços Minerais: (100 ml/L de H3PO4 a 85%, 0,3 g/L de MgSO4 • 7 H2O, 0,5 g/L de MnSO4 • H2O, 1,0 g/L de NaCl, 0,1 g/L de FeSO4 • 7 H2O, 0,1 g/L de Co(NO3)2 • 6 H2O, 0,1 g/L de CaCl2, 0,1 g/L de ZnSO4 • 7 H2O, 0,01 g/L de CuSO4 • 5 H2O, 0,02 g/L de AIK(SO4)2 • 12 H2O, 0,01 g/L de H3BO3, 0,01 g/L de Na2MoO4 • 2 H2O, 0,001 g/L de Na2SeO3, 0,01 g/L de Na2WO4 • 2 H2O, 0,02 g/L de NÍCI2 • 6 H2O). 10 ml/L de vitaminas (0,002 g/L de ácido fólico, 0,01 g/L de cloridrato de piridoxina, 0,005 g/L de riboflavina, 0,026 g/L de Biotina, 0,065 g/L Tiamina, 0,005 g/L de Ácido nicotínico, 0,0353 g/L de Pantotenato de Cálcio, 0,0001 g/L de Vitamina B12, 0,005 g/L de Ácido p-aminobenzoico, 0,005 de Ácido tiótico, 0,9 g/L de Monofosfato de potássio).
[00073] Operação do biorreator: Como forma de aumentar a densidade celular da cultura, adicionou-se frutose ao reator nos pontos no tempo indicados abaixo. Conforme ilustrado abaixo, a taxa de fluxo de meios (mínimos) ao reator foi gradualmente aumentada para fornecer nutrientes à cultura, para diluir a frutose no meio de cultivo e também para diminuir o pH da cultura (de 5,4) para 4,9. Adição de frutose para aumentar a massa celular inicial no reator: Tempo do Processo (horas) Volume adicionado por litro no reator 167 17,2 ml 239 16,1 ml 279 16,1 ml 312 16,7 ml 332 16,1 ml 357 16,1 ml Composição da frutose: 20% em água DI Taxa de fluxo do meio de produção ao reator: Tempo do Processo (horas) Mudança na taxa de fluxo do meio de produção ao reator 50 0,21 ml/min 70 0,32 ml/min 572 0,70 ml/min Resultados: Observações visuais dadas pelas indicações a seguir: Tempo (Horas) Razão esporo para célula 19 0,38:1 43 0,71:1 67 0,94:1 139 0,6:1 307 2:1 379 0,8:1 475 0,36:1 571 0,05:1
[00074] Parâmetros de cultivo, inclusive massa celular, absorção específica de CO e absorção específica de H2, foram monitorados e são ilustrados na Figura 6.
Exemplo 8: Adaptação inversa de Clostridium Ijungdahli
[00075] Cultivaram-se Clostridium ljungdahli em frascos de soro contendo 30 ml do meio de cultivo descrito abaixo (pH ajustado para 5,7) com ou sem frutose e com ou sem gás de síntese. Cultivaram-se culturas de C. ljungdahli em uma incubadora agitando (60 rpm) a 37 °C.
[00076] C. ljungdahli se desenvolvendo no meio de cultivo acima usando gás de síntese como fonte de carbono e energia foi transferido a um frasco de soro (rotulado frutose) contendo o mesmo meio de cultivo, mas suplementado com 1% de frutose. Esse frasco de soro não continha gás de síntese. Para fins de comparação, C. ljungdahlii usando gás de síntese como fonte de carbono e energia também foi transferido a um frasco de soro (rotulado gás de síntese) contendo gás de síntese e o meio de cultivo (sem frutose).
[00077] Conforme indicam a tabela abaixo e a Figura 7, o C. ljungdahli fermentando em gás de síntese transferido à frutose passou por um ciclo de esporulação e germinação antes de começar a se desenvolver usando frutose como a fonte de energia e carbono. Observações visuais dadas pelas indicações a seguir: Tempo (Horas) Razão esporo para célula no frasco de soro com frutose 0 1: 0,15 23 1: 1,63 70 1: 0,7 143 1: 0,1 Tempo (Horas) com gás de síntese Razão esporo para célula no frasco de soro 0 1:0,11 22,75 1:0,0625 46 1:0,14 72,75 1:0,12
[00078] Meios usados para cultivar as bactérias: 10 g/L de MES, 12,5 ml/L de Solução Estoque de Sais Minerais (80 g/L de NaCL, 100 g/L de NH4CI, 10 g/L de KCL, 10 g/L de KH2PO4, 20 g/L de MgSO4 • 7 H2O, 4 g/L de CaCl2 • H2O), 10,0 ml/L de Suplemento de Traços Minerais ATCC, 10,0 ml/L de Suplemento Vitamínico ATCC, 10,0 ml/L de Agente Redutor, 0,001 g/L de reasuzina.
[00079] Solução estoque de sais minerais: (80 g/L de NaCL, 100 g/L de NH4CI, 10 g/L de KCL, 10 g/L de KH2PO4, 20 g/L de MgSO4 • 7 H2O, 4 g/L de CaCl2 • H2O)
[00080] Composição do agente redutor: 9 g/L de NaOH, 40 g/L de L-cisteína, 40 g/L de Na2S, 1 L de H2O.
[00081] Embora tenha-se descrito a presente invenção neste documento com a ajuda de concretizações, exemplos e aplicações específicas dela, os versados na técnica podem fazer muitas modificações e variações a ela sem divergir de seu âmbito, estabelecido nas Reivindicações.

Claims (5)

1. Processo Para Cultivar Bactérias Acetogênicas em Gás de Síntese, caracterizado por que o processo compreende: cultivar as bactérias acetogênicas em um primeiro substrato para produzir uma densidade celular de 0,005 g/L, em que o primeiro substrato inclui uma fonte de carbono selecionada dentre o grupo constituído por extrato de levedura, carboidratos, álcool, aminoácidos, peptona, peptídeos, proteína, ácidos graxos, lipídios e misturas desses; esporular as bactérias acetogênicas substituindo ao menos uma parte do primeiro substrato com gás de síntese tendo pelo menos 10% molar de CO e substituindo ao menos uma parte de um primeiro meio por um meio de produção para converter ao menos uma parte das bactérias em esporos, em que a esporulação produza uma razão do número de esporos para o número de células de 0,05 ou mais; e germinar os esporos no meio de produção a um pH de 4,1 a 5 com gás de síntese tendo 10% molar de CO para produzir uma captação específica de CO de 0,25 mmol/min/grama de células e um rendimento no espaço-tempo (STY) de 1 g ou mais de etanol/(L^dia^grama de células).
2. Processo Para Cultivar Bactérias Acetogênicas em Gás de Síntese, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o gás de síntese tem uma razão molar CO/CO2 de 0,75.
3. Processo Para Cultivar Bactérias Acetogênicas em Gás de Síntese, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a bactéria acetogênica é selecionada dentre o grupo consistindo de Acetogenium kivui, Acetoanaerobium noterae, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchi CP11 (ATCC BAA-1772), Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacificus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium acetobutylicum P262 (DSM 19630 do DSMZ, Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 19630 do DSMZ, Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 do DSMZ, Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 23693 do DSMZ, Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 24138 do DSMZ, Alemanha), Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Clostridium coskatii (ATCC PTA-10522), Clostridium drakei, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii O-52 (ATCC 55889), Clostridium magnum, Clostridium pasteurianum (DSM 525 do DSMZ, Alemanha), Clostridium ragsdali P11 (ATCC BAA-622), Clostridium scatologenes, Clostridium thermoaceticum, Clostridium ultunense, Desulfotomaculum kuznetsovii, Eubacterium limosum, Geobacter sulfurreducens, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina barkeri, Morrella thermoacetica, Morrella thermoautotrophica, Oxobacter pfennigii, Peptostreptococcus productus, Ruminococcus productus, Thermoanaerobacter kivui e suas misturas.
4. Processo Para Cultivar Bactérias Acetogênicas em Gás de Síntese, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a germinação é eficiente para produzir uma razão do número de esporos para o número de células de 0,04 ou menos.
5. Processo Para Cultivar Bactérias Acetogênicas em Gás de Síntese, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o meio de produção compreende um ou mais de: 112 mg de nitrogênio por grama de células, 10,5 mg de fósforo por grama de células ou 26 mg de potássio por grama de células.
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