BR112014028617B1 - métodos para produzir um líquido de açúcar a partir de biomassa contendo celulose e para produzir uma substância química - Google Patents

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Abstract

MÉTODOS PARA PRODUZIR UM LÍQUIDO DE AÇÚCAR E PARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA QUÍMICA E APARELHO PARA PRODUZIR UM LÍQUIDO DE AÇÚCAR. Trata-se de um método para produzir um líquido de açúcar a partir de biomassa que contém celulose, sendo que o método compreende as seguintes etapas (1) a (3): etapa (1): a etapa de submeter uma biomassa que contém celulose a tratamento hidrotérmico e, em seguida, separar a biomassa que contém celulose tratada em um líquido tratado hidrotermicamente e um teor de sólidos que contêm celulose; etapa (2): a etapa de adicionar uma celulase derivada de fungo filamentoso ao teor de sólidos que contêm celulose obtido na etapa (1) para hidrolisar a celulose e, em seguida, separar o hidrolisado em um resíduo de sacarificação e um líquido de açúcar; e etapa (3): a etapa de lavar o resíduo de sacarificação obtido na etapa (2) com o líquido tratado hidrotermicamente obtido na etapa (1) para eluir a celulase derivada de fungo filamentoso adsorvida ao resíduo de sacarificação no líquido tratado hidrotermicamente e, depois disso, obter um componente de solução que compreende a celulase derivada de fungo filamentoso através de separação de sólido do líquido.

Description

CAMPO DA TÉCNICA
[001] A presente invenção refere-se a um método para produzir um líquido de açúcar a partir de biomassa que contém celulose.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[002] Recentemente, os métodos para produzir um líquido de açúcar foram amplamente examinados, tais métodos compreendem um pré- tratamento de biomassa que contém celulose por um tratamento de ácido, um tratamento hidrotérmico, um tratamento alcalino, ou similar, seguido pela adição de celulase derivada de fungo filamentoso para hidrólise. Entretanto, como um obstáculo de tais métodos com o uso de celulases derivadas de fungo filamentoso, há um problema no qual o custo de produção do líquido de açúcar aumenta devido a uma grande quantidade de enzimas de sacarificação usadas e a um preço alto da mesma.
[003] Como uma técnica para resolver esse problema, os métodos foram propostos, nos quais a celulase derivada de fungo filamentoso, que é usada em hidrólise de celulose é recuperada e reusada. Os exemplos do que foi revelado incluem um método que compreende realizar a separação sólido-líquido contínua por um filtro de giro, filtrar um líquido de açúcar obtido por meio da separação através de uma membrana de ultrafiltração, e recuperar celulase derivada de fungo filamentoso (Documento de Patente 1); um método que compreende adicionar um tensoativo no estágio de sacarificação enzimática para inibir a adsorção de celulase derivada de fungo filamentoso e, dessa forma, aprimora um eficiência de recuperação (Documento de Patente 2); um método que compreende submeter resíduos após a sacarificação enzimática a tratamento elétrico para recuperar o componente de celulase derivada de fungo filamentoso (Documento de Patente 3); um método que compreende realizar uma hidrólise secundária do resíduo de sacarificação para, dessa forma, aumentar a intensidade de recuperação da enzima adsorvida (Documento de Patente 4); e um método que compreende realizar uma hidrólise primária adicionando-se primeiro a celulase recuperada e subsequentemente realizar uma hidrólise secundária repetidamente por meio da adição de celulase não usada para aumentar a quantidade de enzimas recuperadas e a quantidade de açúcares gerados (Documento de Patente 5); mas esses métodos ainda falharam em alcançar soluções fundamentais para o problema.
REFERÊNCIAS DA TÉCNICA ANTERIOR DOCUMENTOS DE PATENTE
[004] Documento de Patente 1: Publicação de Pedido de Patente aberta à inspeção pública nQ JP 2006-87319
[005] Documento de Patente 2: Publicação de Pedido de Patente aberta à inspeção pública n^ JP 63-87994
[006] Documento de Patente 3: Publicação de Pedido de Patente aberta à inspeção pública n^ JP 2008-206484
[007] Documento de Patente 4: WO 2011Z115039
[008] Documento de Patente 5: WO 2011Z115040
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO
[009] Nos casos em que o tratamento hidrotérmico foi empregado como pré-tratamento, quando um líquido de açúcar foi produzido a partir de biomassa que contém celulose, uma grande quantidade de líquido tratado hidrotermicamente foi descarregada quando a celulose foi hidrolisada por meio do uso de celulase de fungo filamentoso após o tratamento hidrotérmico da biomassa que contém celulose, tal líquido tratado hidrotermicamente continha oligossacarídeos diluídos e inibidores de sacarificação enzimática como compostos à base de furano e compostos aromáticos.
[010] Em vista disso, um objetivo da presente invenção é encontrar um meio de utilizar o líquido tratado hidrotermicamente que foi tratado como um líquido descartável no momento do processo de sacarificação da biomassa que contém celulose e reduzir a quantidade de enzimas usada na hidrólise do teor de sólidos que contêm celulose.
MEIO PARA RESOLVER OS PROBLEMAS
[011] Afim de resolver os problemas acima, o presente inventor estudou de forma intensiva para descobrir que o líquido tratado hidrotermicamente obtido por um tratamento hidrotérmico de biomassa que contém celulose pode ser usado como um eluente para recuperar celulases derivadas de fungo filamentoso para a hidrólise de celulose a partir de um processo de sacarificação, que dessa forma completa a presente invenção.
[012] Um ou mais objetivos da invenção acima mencionada é (são) alcançado(s) por meio das seguintes realizações 1 a 15 a seguir. Realização 1: Um método para produzir um líquido de açúcar a partir de biomassa que contém celulose, sendo que o método compreende as etapas (1) a (3) seguintes: etapa (1): a etapa de submeter uma biomassa que contém celulose a tratamento hidrotérmico e, em seguida, separar a biomassa que contém celulose tratada em um líquido tratado hidrotermicamente e um teor de sólidos que contêm celulose; etapa (2): a etapa de adicionar uma celulase derivada de fungo filamentoso ao teor de sólidos que contêm celulose obtido na etapa (1) para hidrolisar a celulose e, em seguida, separar o hidrolisado em um resíduo de sacarificação e um líquido de açúcar; e etapa (3): a etapa de lavar o resíduo de sacarificação obtido na etapa (2) com o líquido tratado hidrotermicamente obtido na etapa (1) para eluir a celulase derivada de fungo filamentoso adsorvida ao resíduo de sacarificação no líquido tratado hidrotermicamente e, depois disso, obter um componente de solução que compreende a celulase derivada de fungo filamentoso por separação sólido-líquido.
[013] Realização 2: O método para produzir um líquido de açúcar de acordo com a realização 1 que compreende a etapa (4) de filtrar o componente de solução obtido na etapa (3) através de uma membrana de ultrafiltração para, dessa forma, recuperar a celulase derivada de fungo filamentoso como um retentado e obter ao mesmo tempo um líquido de açúcar como um permeado.
[014] Realização 3: O método para produzir um líquido de açúcar de acordo com a realização 2, em que a celulase derivada de fungo filamentoso recuperada na etapa (4) é reusada na hidrólise de celulose na etapa (2).
[015] Realização 4: O método para produzir um líquido de açúcar de acordo com qualquer uma dentre as realizações 1 a 3, em que a celulase derivada de fungo filamentoso é celulase derivada de Trichoderma.
[016] Realização 5: O método para produzir um líquido de açúcar de acordo com qualquer uma dentre as realizações 1 a 4, em que o tratamento hidrotérmico da etapa (1) é um tratamento dentro de uma faixa de temperatura de 120 a 240 °C.
[017] Realização 6: O método para produzir um líquido de açúcar de acordo com qualquer uma dentre as realizações 1 a 5, em que o líquido tratado hidrotermicamente usado na etapa (3) compreende 1 g/l ou mais de um íon inorgânico, ácido acético e/ou furfural no total.
[018] Realização 7: O método para produzir um líquido de açúcar de acordo com qualquer uma dentre as realizações 1 a 6, em que o resíduo de sacarificação é lavado com um líquido tratado hidrotermicamente em 30 a 70 °C na etapa (3).
[019] Realização 8: O método para produzir um líquido de açúcar de acordo com qualquer uma dentre as realizações 1 a 7, em que a etapa (2) compreende separar o hidrolisado em um resíduo de sacarificação e um líquido de açúcar por separação por membranas, e a etapa (3) compreende lavar o resíduo de sacarificação passando-se o líquido tratado hidrotermicamente através do resíduo de sacarificação na superfície da membrana em uma direção vertical para obter um componente de solução que compreende a celulase derivada de fungo filamentoso.
[020] Realização 9: O método para produzir um líquido de açúcar de acordo com a realização 8, em que a separação por membranas é filtração por prensa ou separação por membranas por um filtro de correia.
[021] Realização 10: Um método para produzir uma substância química que compreende etapa de produzir o líquido de açúcar por meio do método para acordo com qualquer uma dentre as realizações 1 a 9 e a etapa de cultura de um micro-organismo com a capacidade de produzir uma substância química com o uso do líquido de açúcar como uma matéria-prima de fermentação.
[022] Realização 11: Um aparelho para produzir um líquido de açúcar que compreende: um aparelho de tratamento hidrotérmico para tratamento hidrotérmico de biomassa que contém celulose e separação sólido- líquido de um produto tratado hidrotermicamente; um aparelho de hidrólise para hidrólise de um teor de sólidos que contêm celulose descarregada do aparelho de tratamento hidrotérmico por celulase derivada de fungo filamentoso; um aparelho de recuperação de líquido de açúcar para separação sólido-líquido de um hidrolisado do teor de sólidos que contêm celulose obtida no aparelho de hidrólise; e um aparelho de recuperação de enzima para mistura, retenção térmica e separação sólido-líquido de um resíduo de sacarificação separado no aparelho de recuperação de líquido de açúcar e um líquido tratado hidrotermicamente descarregado do aparelho de tratamento hidrotérmico.
[023] Realização 12: O aparelho para produzir um líquido de açúcar de acordo com a realização 11, em que o aparelho de recuperação de líquido de açúcar e o aparelho de recuperação de enzima são um aparelho integrado.
[024] Realização 13: O aparelho para produzir um líquido de açúcar de acordo com a realização 12, em que o aparelho integrado do aparelho de recuperação de líquido de açúcar e o aparelho de recuperação de enzima são um aparelho de filtração por prensa ou um aparelho de filtração por correia.
[025] Realização 14: O aparelho para produzir um líquido de açúcar de acordo com a realização 13, em que o aparelho de separação por membranas é um aparelho de filtração por prensa ou um aparelho de filtração por correia.
[026] Realização 15: O aparelho para produzir um líquido de açúcar de acordo com qualquer uma dentre as realizações 11 a 14, em que o aparelho de recuperação de enzima compreende um aparelho de separação por membranas de ultrafiltração para separar a mistura nas celulases derivadas de fungo filamentoso e no líquido de açúcar.
EFEITOS DA INVENÇÃO
[027] De acordo com a presente invenção, a quantidade de enzima recuperada e atividade de celulase derivada de fungo filamentoso adsorvida a um resíduo de sacarificação enzimática pode ser aprimorada em virtude de um efeito de um componente de extração de biomassa contido em um líquido tratado hidrotermicamente que, dessa forma, reduz a quantidade de enzimas usada na etapa de produzir um líquido de açúcar com biomassa que contém celulose como uma matéria-prima. Além disso, por meio da eluição de celulases derivadas de fungo filamentoso adsorvidas no resíduo de sacarificação enzimática com o líquido tratado hidrotermicamente para recuperar a celulase derivada de fungo filamentoso, a sacarificação de oligossacarídeos contidos no líquido tratado hidrotermicamente também se torna viável, o que, dessa forma, aumenta a produção de açúcar de todo o processo de produção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[028] A Figura 1 é uma ilustração que mostra um fluxo de blocos do método para produzir um líquido de açúcar da presente invenção.
[029] A Figura 2 é uma ilustração que mostra um exemplo de um aparelho para conduzir o método para produzir um líquido de açúcar da presente invenção (o caso de usar um aparelho de filtração por prensa como um aparelho de recuperação de líquido de açúcar e um aparelho de recuperação de enzima).
[030] A Figura 3 é uma ilustração que mostra um exemplo de um aparelho para conduzir o método para produzir um líquido de açúcar da presente invenção (o caso de adicionar uma membrana de ultrafiltração aparelho como um aparelho de recuperação de enzima).
[031] Figura 4 é uma ilustração que mostra detalhes dos aparelhos de produção para o líquido de açúcar das Figuras 1 a 3.
[032] A Figura 5 é uma fotografia de um gel tingido após conduzir a SDS-PAGE de uma enzima recuperada.
[033] A Figura 6 é um diagrama esquemático de quando a separação sólido-líquido na etapa (2) e a lavagem de resíduo de sacarificação e a separação sólido-líquido na etapa (3) são conduzidas no mesmo aparelho (aparelho de separação por membranas).
MODO PARA CONDUZIR A INVENÇÃO
[034] Os modos para conduzir a presente invenção serão descritos em detalhes para cada etapa.
[035] [Etapa (1)] A etapa de submeter uma biomassa que contém celulose a tratamento hidrotérmico e, em seguida, separar a biomassa que contém celulose tratada em um líquido tratado hidrotermicamente e um teor de sólidos que contêm celulose: Biomassa que contém celulose refere-se à biomassa herbácea como bagaço, gramínea, capim elefante, Eríanthus, palha de milho, sabugo de milho, palha de arroz, palha de trigo, ou cascas de coco, ou biomassa à base de madeira como árvores, álamo, ou materiais de construção descartáveis; e refere-se adicionalmente à biomassa derivada de ambiente aquático como algas marinhas ou ervas marinhas. Tal biomassa contém, além da celulose e hemicelulose (daqui por diante, chamada de "celulose" como um termo geral de celulose e hemicelulose), lignina, que é um polímero aromático, e similares.
[036] Nessa etapa, para o propósito de aprimorar a eficácia de sacarificação enzimática na etapa 2 descrita depois, um tratamento hidrotérmico de biomassa que contém celulose é conduzido. Um objetivo do tratamento hidrotérmico é hidrolisar hemicelulose presente na biomassa que contém celulose e promover a solubilização de lignina para colocar celulose e hemicelulose em um estado de estarem suscetíveis à hidrólise enzimática por meio da adição de água para que o teor de sólidos da biomassa que contém celulose venha a ser 0,1 a 50% em peso, e submeter a biomassa que contém celulose ao tratamento hidrotérmico em uma temperatura de 100 a 400 °C e para a partir de um segundo a 60 minutos. Deve-se verificar que uma temperatura de reação do tratamento hidrotérmico nessa etapa não é particularmente restrita, precisa apenas ser estabelecida conforme apropriado para uma temperatura ideal que leva à alta eficácia de sacarificação enzimática de acordo com o tipo de biomassa que contém celulose. A mesma é normalmente em uma faixa de 120 °C a 240 °C e preferencialmente em uma faixa de 180 °C a 240 °C. Além disso, um ácido como ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ou ácido acético, ou um álcali como hidróxido de sódio ou hidróxido de cálcio pode ser adicionado no tratamento hidrotérmico. Ainda, a quantidade de adição do mesmo é preferencialmente mantida ao mínimo; e a concentração final é preferencialmente menos do que 2% em peso mediante condução do tratamento hidrotérmico, e de adicional preferência menos do que 1% em peso. Deve-se verificar que, nos casos em que o ácido ou o álcali for adicionado no momento do tratamento hidrotérmico, o ácido ou álcali é preferencialmente neutralizado em um estágio anterior à adição de uma hidrólise ou enzima de sacarificação descrita posteriormente. A adição do ácido ou álcali no momento do tratamento hidrotérmico possibilita que o tratamento hidrotérmico seja conduzido em uma condição de temperatura mais baixa.
[037] A quantidade de vezes que o tratamento hidrotérmico é conduzido não é particularmente limitada e o tratamento hidrotérmico precisa apenas ser conduzido uma vez ou mais. Além disso, nos casos em que o tratamento hidrotérmico é conduzido duas vezes ou mais, o segundo tratamento hidrotérmico, ou posterior, pode ser conduzido em um estabelecimento de condição diferente daquele do primeiro tratamento.
[038] Nessa etapa, um líquido tratado hidrotermicamente e um teor de sólidos que contêm celulose são separados após o tratamento hidrotérmico. Quando a biomassa que contém celulose for submetida ao tratamento hidrotérmico, compostos de baixo peso molecular que inibem a sacarificação enzimática como furfural, HMF, vanilina, álcool guaiacílico, ácido siríngico, ácido cumárico, ácido ferúlico, ácido acético, ácido fórmico, ou íons inorgânicos são gerados como subprodutos (daqui por diante, os mesmos são coletivamente chamados de inibidores de sacarificação enzimática); e o inibidor de sacarificação enzimática pode ser separado em um lado do líquido tratado hidrotermicamente por separação sólido-líquido do produto tratado hidrotermicamente no líquido tratado hidrotermicamente e no teor de sólidos que contêm celulose. Como para uma técnica de separação sólido-líquido, filtração por prensa, filtro de correia, Pneumapress, prensa de parafuso, centrifugação, decantação por parafuso, ou similares podem ser usados e, adicionalmente, nos casos em que uma função de separação como prensa de parafuso está presente dentro de um aparelho de tratamento hidrotérmico, a separação no líquido tratado hidrotermicamente e o teor de sólidos que contêm celulose é viável no processo daquele tratamento hidrotérmico. Além disso, o inibidor de sacarificação enzimática pode ser removido mais completamente por meio da lavagem do teor de sólidos que contêm celulose com água ou similares. Após o tratamento hidrotérmico, o teor de sólidos que contêm celulose obtido por meio da separação sólido-líquido pode ser submetido a um tratamento alcalino, um tratamento de ácido, ou similares.
[039] [Etapa (2)] A etapa de adicionar celulase derivada de fungo filamentoso ao teor de sólidos que contêm celulose obtido por meio da separação sólido-líquido na etapa (1) para hidrolisar a celulose e, em seguida, separar em um resíduo de sacarificação que contém as celulases derivadas de fungo filamentoso e um líquido de açúcar: Na etapa (2), as celulases derivadas de fungo filamentoso são adicionadas ao teor de sólidos que contêm celulose obtido por meio da separação sólido-líquido na etapa (1) para hidrolisar a celulose, e então separar em um resíduo de sacarificação e um líquido de açúcar.
[040] As celulases derivadas de fungo filamentoso para o uso nessa etapa são caracterizadas por compreenderem um grupo de enzimas de celulase com a capacidade de hidrolisar um polímero de açúcar com glicose ligada por ligação β1 -4 como celobiohidrolase, endoglicanase, exoglicanase, ou β-glicosidase; e um grupo de enzimas de hemicelulase com a capacidade de hidrolisar um polímero de açúcar com xilose ligado por ligação β1 -4 como xilanase ou xilosidase.
[041] A celobiohidrolase é um termo geral para celulases caracterizadas pela hidrolisação de celulose da porção terminal. O grupo de enzimas que pertence à celobiohidrolase é descrito como o número de EC: EC3.2.1.91.
[042] A endoglicanase é um termo geral para celulases caracterizadas pela hidrolisação de cadeias moleculares de celulose a partir de sua porção do meio. O grupo de enzimas que pertence à exoglicanase é descrito como os números de EC: EC3.2.1.4, EC3.2.1.6, EC3.2.1.39, e EC3.2.1.73.
[043] A exoglicanase é um termo geral para celulases caracterizadas pela hidrolisação de cadeias moleculares de celulose a partir de seus terminais. O grupo de enzimas que pertence à exoglicanase é descrito como os números de EC: EC3.2.1.74 e EC3.2.1.58.
[044] A β-glicosidase é um termo geral para celulases caracterizadas pela ação em celo-oligossacarídeos ou celobiose. O grupo de enzimas que pertence à β-glicosidase é descrito como o número de EC: EC3.2.1.21.
[045] A Xilanase é um termo geral para celulases caracterizadas pela ação em hemicelulose ou, em particular, xilano. O grupo de enzimas que pertence à xilanase é descrito como o número de EC: EC3.2.1.8.
[046] A Xilosidase é um termo geral para celulases caracterizadas pela ação em xilo-oligossacarídeos. O grupo de enzimas que pertence à xilosidase é descrito como o número de EC: EC3.2.1.37.
[047] Além disso, as celulases derivadas de fungo filamentoso podem incluir outros componentes de enzima que estão envolvidos em degradação de biomassa diferente dos acima. Os exemplos de outros componentes de enzima incluem mananase, manosidase, arabinofuranosidase, xilano esterase, ácido ferúlico esterase, e chitinase. Como a enzima de sacarificação para o uso na presente invenção, uma que tenha uma atividade específica alta para a hidrólise do teor de sólidos que contêm celulose pode preferencialmente ser usada.
[048] Como as celulases derivadas de fungo filamentoso, o que pode ser usado é celulase derivada do gênero Tríchoderma, do gênero Aspergillus, do gênero Cellulomonas, do gênero Clostridium, do gênero Streptomyces, do gênero Humicola, do gênero Acremonium, do gênero Irpex, do gênero Mucor, do gênero Talaromyces, do gênero Phanerochaete, fungos de podridão branca, fungos de podridão marrom, ou similares. Na presente invenção, é preferencial usar, dentre essas celulases derivadas do fungo filamentoso, celulases derivadas de fungo filamentoso derivado de Tríchoderma que tem uma alta atividade de degradação de celulose.
[049] Além disso, o micro-organismo do gênero Tríchoderma não é particularmente restrito; e os exemplos concretos dos mesmos podem incluir QM9414 de Tríchoderma reesei, QM9123 de Tríchoderma reesei, RutC-30 de Tríchoderma reesei, PC3-7 de Tríchoderma reesei, ATCC68589 de Tríchoderma reesei, CL-847 de Tríchoderma reesei, MCG77 de Tríchoderma reesei, MCG80 de Tríchoderma reesei, e QM9123 de Tríchoderma viride. Também se pode usar uma cepa mutante usada que é um micro-organismo derivado do gênero Tríchoderma descrito anteriormente e é obtido por meio da submissão do micro-organismo a um tratamento de mutação com um mutagênico ou irradiação UV, ou similares para aprimorar a produtividade de enzimas de sacarificação.
[050] Como a celulase derivada de Tríchoderma, as enzimas brutas são preferencialmente usadas. A enzima bruta é derivada de um sobrenadante de cultura obtido por meio da cultura de um micro-organismo do gênero Tríchoderma em um período de tempo opcional em um meio de cultura preparado para que o micro-organismo produza enzimas de sacarificação. Os componentes de meio que devem ser usados não são particularmente restritos e um meio de cultura ao qual a celulose ou o xilano é adicionado para o propósito de promover a geração de celulase pode ser usado em geral. E, como a enzima bruta, um líquido de cultura, como é, ou um sobrenadante da cultura obtido apenas por meio da remoção de células bacterianas é preferencialmente usado.
[051] O micro-organismo do gênero Tríchoderma produz um componente de celulase forte em um líquido de cultura. Quando se trata de β- glicosidase, devido ao fato de que retém atividade de β-glicosidase intracelularmente ou na camada de superfície celular, a atividade de β- glicosidase é baixa no líquido de cultura. Assim, a β-glicosidase de diferentes espécies ou da mesma espécie pode ainda ser adicionada à enzima bruta. Como a β-glicosidase de diferentes espécies, a β-glicosidase derivada do gênero Aspergillus pode ser preferencialmente usada. Os exemplos da β- glicosidase derivada do gênero Aspergillus incluem Novozyme188 que é comercialmente disponível junto à Novozymes A/S. Como um método para adicionar a β-glicosidase de diferentes espécies ou da mesma espécie à enzima bruta, um método que compreende introduzir um gene ao microorganismo do gênero Tríchoderma, cultura do micro-organismo do gênero Tríchoderma submetido à recombinação genética de modo a produzir β- glicosidase em um líquido de cultura, e o isolamento do líquido de cultura pode ser também empregado.
[052] A temperatura para uma reação de hidrólise por celulase derivada de fungo filamentoso se encontra preferencialmente em uma faixa de 15 a 100 °C, mais preferencialmente 40 a 60 °C, e de máxima preferência 50 °C. Além disso, o pH no momento da reação de hidrólise é preferencialmente em uma faixa de pH 3 a 9, mais preferencialmente pH 4 a 5,5, e de máxima preferência pH 5. Para ajuste de pH, um ácido ou álcali pode ser adicionado para ajustar a um pH pretendido e, adicionalmente um tamponamento pode usado conforme apropriado. Além disso, é preferencial conduzir a agitação e mistura durante a hidrólise do teor de sólidos que contêm celulose para atingir uma concentração de açúcar homogênea no hidrolisado para o propósito de promover contato com celulase e hemicelulase. A concentração de sólidos de produto de celulose pré-tratado é preferencialmente em uma faixa de 1 a 25% em peso.
[053] Além disso, nessa etapa, o hidrolisado por celulase derivada de fungo filamentoso é separado em resíduos de sacarificação e um líquido de açúcar que é um produto pretendido da presente invenção. A separação sólido-líquido do hidrolisado pode ser conduzida por meio de uma técnica conhecida para separação sólido-líquido. É preferencial a separação sólido-líquido por meio de separação por membranas; e mais preferencial é a separação sólido-líquido por filtração por prensa ou filtro de correia por meio da qual o teor de sólidos ou componentes suspensos contidos no líquido tratado hidrotermicamente separado podem ser relativamente reduzidos. Tal separação sólido-líquido pode ser conduzida por meio da combinação de uma ou mais técnicas; e não é restrita, contanto que seja um meio com a capacidade de recuperar com eficácia o resíduo de sacarificação, que inclui a celulase derivada de fungo filamentoso.
[054] Deve-se verificar que, apesar de a maioria de celulases derivadas de fungo filamentoso serem adsorvidas ao resíduo de sacarificação, uma pequena quantidade das mesmas permanece no líquido de açúcar e, assim, a etapa de recuperar a enzima de sacarificação do líquido de açúcar pode ser adicionada. Em tal caso, se o líquido de açúcar for submetido adicionalmente à filtração por membrana por uma membrana de microfiltração após a primeira separação sólido-líquido por um método para filtração, como método para centrifugação ou filtração por prensa, para remover adicionalmente sólidos, a incrustação da membrana de ultrafiltração pode ser inibida quando a celulase derivada de fungo filamentoso for recuperada do líquido de açúcar por uma membrana de ultrafiltração descrita posteriormente.
[055] [Etapa (3)] A etapa de lavar o resíduo de sacarificação obtido na etapa (2) com o líquido tratado hidrotermicamente obtido na etapa (1) para eluir a celulase derivada de fungo filamentoso adsorvida ao resíduo de sacarificação no líquido tratado hidrotermicamente e, depois disso, obter um componente de solução que compreende a celulase derivada de fungo filamentoso por meio de separação sólido-líquido:
[056] Na etapa (3), a celulase derivada de fungo filamentoso adsorvida (ligada) ao resíduo de sacarificação é eluída (dessorvida) ao líquido tratado hidrotermicamente com a utilização de componentes de extração de biomassa contidos no líquido tratado hidrotermicamente por meio da lavagem do resíduo de sacarificação com o líquido tratado hidrotermicamente. Enquanto isso, devido a um efeito causado pelos componentes diferentes de açúcares contidos no líquido tratado hidrotermicamente, a dessorção de celulase e hemicelulase adsorvidas ao resíduo de sacarificação ao líquido tratado hidrotermicamente é promovida. Isso é devido ao fato de que a concentração de íons inorgânicos, ácido acético, e/ou furfural contidos no líquido tratado hidrotermicamente é mais alta, o efeito de dessorver a celulase derivada de fungo filamentoso adsorvida ao resíduo de sacarificação é mais alta. É preferencial que o líquido tratado hidrotermicamente na etapa (3) contenha íons inorgânicos, ácidos acéticos, e/ou furfural em 1 g/l ou mais no total. Além disso, como um outro efeito da lavagem do resíduo de sacarificação com o líquido tratado hidrotermicamente, os oligossacarídeos contidos no líquido tratado hidrotermicamente são hidrolisados por meio da ação de celulase derivada de fungo filamentoso adsorvida no resíduo de sacarificação. A quantidade de xilose aumenta principalmente por meio da hidrólise do líquido tratado hidrotermicamente.
[057] Como para a lavagem do resíduo de sacarificação, é preferencial lavar com um líquido tratado hidrotermicamente em 30 a 70 °C. Isso é devido ao fato de que o uso do líquido tratado hidrotermicamente em 30 a 70 °C produz um efeito de promover a dessorção de componentes de enzima adsorvidos ao resíduo de sacarificação e, adicionalmente, um efeito de hidrolisar oligossacarídeos contidos no líquido tratado hidrotermicamente por meio da ação do componente de enzima adsorvido ao resíduo de sacarificação conforme descrito acima. Deve-se verificar que a temperatura mais preferencial do líquido tratado hidrotermicamente é 40 a 60 °C.
[058] Como para a separação sólido-líquido na etapa (3), uma separação sólido-líquido conhecida pode ser usada; e, de forma semelhante àquela da etapa mencionada acima (2), é preferencial a separação sólido- líquido por meio de separação por membranas é preferencial e mais preferencial é filtração por prensa ou filtro de correia. Em particular, nos casos em que as etapas (2) e (3) envolvem separação sólido-líquido por meio de separação por membranas, a separação sólido-líquido em um resíduo de sacarificação e um líquido de açúcar por meio de separação por membranas é conduzida na etapa (2) e depois disso, por meio da passagem do líquido tratado hidrotermicamente através do resíduo de sacarificação na superfície de membrana, a lavagem do resíduo de sacarificação pelo líquido tratado hidrotermicamente e a separação sólido-líquido podem ser conduzidas, o que dessa forma possibilita que as etapas (2) e (3) sejam conduzidas no mesmo aparelho.
[059] Como para passar o líquido tratado hidrotermicamente através do resíduo de sacarificação, é preferencial passar o líquido tratado hidrotermicamente através do resíduo de sacarificação na superfície de membrana em uma direção vertical que, dessa forma, pode gerar um fluxo rápido do líquido tratado hidrotermicamente no resíduo de sacarificação, o que possibilita que mais componentes de enzima adsorvidas no resíduo de sacarificação sejam recuperados. Além disso, é preferencial circular e passar novamente um que já tenha sido passado pelo resíduo de sacarificação, o que possibilita dessa forma que ainda mais componentes de enzima sejam recuperados.
[060] O líquido de lavagem usado na etapa (3) é submetido à separação sólido-líquido, e o componente de solução é filtrado através de uma membrana de ultrafiltração. Como um retentado, a celulase derivada de fungo filamentoso pode ser separada, recuperada, e concentrada adicionalmente íon (etapa (4)). Enquanto isso, um líquido de açúcar pode ser obtido como um permeado da membrana de ultrafiltração. A separação sólido-líquido na etapa 3 pode ser conduzida por meio de uma técnica conhecida para separação sólido- líquido como um método para centrifugação como decantação por parafuso, um método para filtração como filtração por sucção de pressão, ou método para filtração por membrana como microfiltração. Tal separação sólido-líquido pode ser conduzida por meio da combinação de uma ou mais técnicas; e não é restrita, contanto que seja um meio com a capacidade de remover com eficiência o resíduo de sacarificação. Note que, a partir do ponto de vista da inibição da incrustação de uma membrana de ultrafiltração descrita posteriormente, é preferencial que o componente de solução após a separação sólido-líquido contenha a menor quantidade de sólidos possível. Em particular, é preferencial que, após a primeira separação sólido-líquido por um método para centrifugação ou um método para filtração como filtração por prensa, o componente de solução obtido assim é submetido adicionalmente à filtração por membrana com uma membrana de microfiltração para remover completamente o sólido. A membrana de microfiltração é citada também como filtração por membrana e é uma membrana de separação com a capacidade de separar e remover partículas de cerca de 0,01 a 10 pm de uma suspensão de partículas finas com o uso de diferença de pressão como uma força de ativação. A membrana de microfiltração tem poros finos na faixa a partir de 0,01 a 10 pm na superfície da mesma e os componentes de partícula fina que forem maiores do que o poro fino podem ser separados e removidos no lado da membrana. Os exemplos de materiais da membrana de microfiltração incluem acetato de celulose, poliamida aromática, álcool polivinílico, polissulfona, fluoreto de polivinilideno, polietileno, poliacrilonitrila, cerâmica, polipropileno, policarbonato, e politetrafluoroetileno (Teflon (marca registrada)); e não é particularmente restrito, e uma membrana de microfiltração produzida a partir de fluoreto de polivinilideno é preferencial em vista de propriedades anti- incrustração, resistência química, força e propriedades de filtração.
[061] Subsequentemente, o componente de solução mencionado acima obtido por meio de separação sólido-líquido é submetido a um tratamento por membrana de ultrafiltração. Uma membrana de ultrafiltração refere-se a uma membrana de separação que tem em geral um tamanho de poro fino de 1,5 a 250 nanômetros e tem a capacidade de bloquear polímeros solúveis em água com um peso molecular de 1.000 a 200.000 como um retentado. A membrana de ultrafiltração precisa apenas ter um peso molecular reduzido que possibilita a recuperação de celulase derivada de fungo filamentoso; e a redução de peso molecular preferencial é 1.000 a 100.000 Da e mais preferencialmente 10.000 a 30.000 Da. Como para um material da membrana de ultrafiltração, uma membrana feita de materiais como poliéter sulfona (PES), difluoreto de polivinilideno (PVDF), ou celulose regenerada pode ser usada; e é preferencial usar uma membrana de ultrafiltração com um polímero sintético como PES ou PVDF como um material devido ao fato de que a celulose sofre degradação por celulase. Como para o formato da membrana de ultrafiltração, um sistema tubular, um elemento espiral, uma membrana de placa plana, ou similares pode ser preferencialmente usada. Os exemplos da membrana de ultrafiltração filtração incluem um sistema de fluxo cruzado ou um sistema de filtração sem saída; e o sistema de filtração de fluxo cruzado é preferencial em termos da incrustação ou fluxo.
[062] Deve-se verificar que a celulase derivada de fungo filamentoso separada e recuperada pela membrana de ultrafiltração pode ser reusada no sólido que contém celulose da etapa 2. Mediante o reuso, uma celulase ou hemicelulase que não foi usada pode ser adicionada e usada em conjunto com a enzima recuperada e também componentes de enzima diferentes desses podem ser separadamente adicionados.
ETAPA DE CONCENTRAR AÇÚCARES
[063] O líquido de açúcar obtido por meio do método para produzir um líquido de açúcar de acordo com a presente invenção pode ser submetido adicionalmente à filtração através de uma membrana de nanofiltração e/ou uma membrana de osmose reversa, que é um método descrito no documento na WO 2010/067785 para produzir dessa forma, como um retentado, um líquido de açúcar concentrado no qual o componente de açúcar é concentração.
[064] A membrana de nanofiltração é uma membrana que também é chamada de nanofiltro (membrana de nanofiltração, membrana NF) e é, em geral, definida como uma "membrana que permeia íons monovalentes enquanto bloqueia íons divalentes". Acredita-se que seja uma membrana que tem aberturas microscópicas de cerca de diversos nanômetros e usada principalmente para bloquear moléculas ou partículas finas, íons, sais, ou similares em água.
[065] A membrana de osmose reversa é uma membrana que também é chamada de membrana de RO e é em geral definida como uma "membrana que tem uma função de remover sais que incluam íons monovalentes". Acredita-se que a membrana é uma membrana que tem aberturas microscópicas na faixa a partir de cerca de diversos angstroms a diversos nanômetros e usada principalmente para remover componentes de íon, por exemplo, em dessalinização de água do mar ou produção de água ultrapura.
[066] Como materiais da membrana de nanofiltração ou membrana de osmose reversa para o uso na presente invenção, materiais de polímero como polímeros à base de acetato de celulose, poliamida, poliéster, poliimida, polímeros de vinila, ou polissulfona podem ser usados; e a membrana não é limitada a ser uma membrana composta de um tipo do material mencionado acima e pode ser uma membrana que contém vários materiais de membrana.
[067] Como a membrana de nanofiltração para o uso na presente invenção, um elemento de membrana do tipo espiral é preferencialmente usado. Os exemplos concretos de elementos de membrana de nanofiltração preferenciais incluem GEsepa produzido pela GE Osmonics, que é um elemento de membrana de nanofiltração à base de acetato de celulose; NF99 ou NF99HF produzidos pela Alfa Lavai, que são um elemento de membrana de nanofiltração com poliamida como uma camada funcional; NF-45, NF-90, NF- 200, NF-270, ou NF-400 produzidos pela Filmtec, que são um elemento de membrana de nanofiltração com piperazina e poliamida com ligação cruzada como uma camada funcional; e SU-210, SU-220, SU-600, ou SU-610 produzidos pela Toray Industries, Inc. que são um elemento de membrana de nanofiltração que contém uma membrana de nanofiltração, UTC60 produzido pela mesma empresa que piperazina e poliamida com ligação cruzada como um componente principal. Mais preferencial são NF99 ou NF99HF; NF-45, NF- 90, NF-200, ou NF-400; ou SU-210, SU-220, SU-600, ou SU-610; e ainda mais preferencial são SU-210, SU-220, SU-600, ou SU-610.
[068] Os exemplos de materiais da membrana de osmose reversa para o uso na presente invenção incluem membranas compósitas com um polímero à base de acetato de celulose como uma camada funcional (daqui por diante chamadas de membranas de osmose reversa à base de acetato de celulose) e membranas compósitas com poliamida como uma camada funcional (daqui por diante chamadas de membranas de osmose reversa à base de poliamida). Aqui, os exemplos do polímero à base de acetato de celulose incluem aqueles com o uso de ésteres de ácido orgânico de celulose como acetato de celulose, diacetato de celulose, triacetate de celulose, propionate de celulose, ou butirato de celulose por si só; ou uma mistura desses; e um éster misturado. Os exemplos de poliamida incluem polímeros lineares e polímeros com ligação cruzada com diaminas alifáticas e/ou aromáticas como monômeros.
[069] Os exemplos concretos da membrana de osmose reversa para o uso na presente invenção incluem, em adição aos SUL-G10 e SUL-G20 dos tipos de pressão ultrabaixa, e SU-710, SU-720, SU-720F, SU-710L, SU-720L, SU-720LF, SU-720R, SU-710P, e SU-720P, dos tipos de pressão baixa, os quais são módulos de membrana de osmose reversa à base de poliamida produzidos pela Toray Industries, Inc.; SU-810, SU-820, SU-820L, e SU-820FA dos tipos de pressão alta que contêm UTC80 como uma membrana de osmose reversa; as membranas de osmose reversa à base de acetato de celulose SC-L100R, SC-L200R, SC-1100, SC-1200, SC-2100, SC-2200, SC-3100, SC-3200, SC-8100, e SC-8200, que são produzidos pela mesma empresa; NTR-759HR, NTR-729HF, NTR-70SWC, ES10-D, ES20-D, ES20-U, ES15-D, ES15-U, e LF10-D, que são produzidos pela Denko Corporation; RO98pHt, RO99, HR98PP, e CE4040C-30D, que são produzidos pela Alfa Lavai; GE Sepa produzida pela GE, BW30-4040, TW30-4040, XLE-4040, LP- 4040, LE-4040, SW30-4040, e SW30HRLE^Í040, que são produzidos pela Filmtec; TFC-HR e TFC-ULP, que são produzidos pela KOCH; ACM-1, ACM-2, e ACM-4, que são produzidos pela TRISEP.
[070] Como um efeito de se concentrar um líquido de açúcar por meio do uso de uma membrana de nanofiltração e/ou uma membrana de osmose reversa, há vantagens em se aumentar a concentração de açúcar no líquido de açúcar e de possibilitar que inibidores de fermentação sejam removidos como um permeado. O inibidor de fermentação, quando usado no presente documento, refere-se a componentes diferentes de açúcares, sendo que os componentes inibem a fermentação em uma etapa de fermentação descrita posteriormente; e os exemplos específicos dos mesmos podem incluir compostos aromáticos, compostos à base de furano, ácidos orgânicos, e sais inorgânicos monovalentes. Os exemplos de tais compostos aromáticos e compostos à base de furano representativos incluem furfural, hidroximetilfurfural, vanilina, ácido vanílico, ácido siríngico, aldeído coniferílico, ácido cumárico, e ácido ferúlico. Os exemplos de ácidos orgânicos e sais inorgânicos incluem ácido acético, ácido fórmico, potássio, e sódio. A concentração de açúcar do líquido de açúcar concentrado pode ser opcionalmente estabelecida em uma faixa de 50 g/l a 400 g/l dependendo das condições de tratamento da membrana de nanofiltração e/ou da membrana de osmose reversa e precisa apenas opcionalmente estabelecer de acordo com a aplicação de uso do líquido de açúcar concentrado ou similares. Além disso, nos casos em que a maior remoção do inibidor de fermentação descrito anteriormente for desejada, a única coisa que precise ser feita é adicionar água ao líquido de açúcar ou ao líquido de açúcar concentrado e concentrar com a membrana de nanofiltração e/ou a membrana de osmose reversa até uma concentração de açúcar pretendida ser atingida; e, sob essa circunstância, o inibidor de fermentação pode ser removido como um permeado. Deve-se verificar que a membrana de nanofiltração é preferencial devido ao fato de que o efeito de remoção é mais alto quando a membrana de nanofiltração é usada, como em comparação com quando a membrana de osmose reversa é usada. O uso da membrana de nanofiltração ou uso da membrana de osmose reversa precisa apenas ser determinada em vista da concentração do inibidor de fermentação contido no líquido de açúcar misturado ou influência na fermentação descrita posteriormente.
APLICAÇÃO DE USO DE LÍQUIDO DE AÇÚCAR
[071] Várias substâncias químicas podem ser produzidas por meio do cultivo de micro-organismos que têm uma capacidade de produzir as substâncias químicas com o uso do líquido de açúcar obtido por meio da presente invenção como uma matéria-prima de fermentação. Cultivar um micro-organismo como uma matéria-prima de fermentação no presente documento significa proliferação e cultivo mantido de um micro-organismo com o uso de componentes de açúcar ou fontes de amino contidos no líquido de açúcar como nutrientes do micro-organismo. Os exemplos concretos da substância química podem incluir substâncias produzidas em uma grande escala na indústria de fermentação como álcoois, ácidos orgânicos, aminoácidos, ou ácidos nucleicos. Tais substâncias químicas são acumuladas e produzidas como substâncias químicas dentro ou fora do organismo no processo de metabolismo com o uso do componente de açúcar no líquido de açúcar como uma fonte de carbono. Os exemplos concretos de substâncias químicas produzíveis pelo micro-organismo incluem álcool como etanol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol, ou glicerina; ácidos orgânicos como ácido acético, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido succínico, ácido málico, ácido itacônico, ou ácido cítrico; nucleosídeos como inosina ou guanosina, nucleotideos como ácido inosínico ou ácido guanílico, e compostos amino como cadaverina. Além disso, o líquido de açúcar da presente invenção pode ser aplicado à produção de enzimas, antibióticos, proteínas recombinantes, ou similares. Esses micro-organismos para o uso na produção da substância química precisam apenas ser micro-organismos que podem produzir com eficácia uma substância química pretendida; e micro-organismos como Escherichia coli, levedura, fungos filamentosos, ou basidiomicetos podem ser usados.
APARELHO
[072] Os aparelhos para conduzir o método para produzir um líquido de açúcar de acordo com a presente invenção serão descritos com base nas Figuras 1 a 4.
[073] A Figura 1 é um aparelho para produzir um líquido de açúcar que compreende o aparelho de tratamento hidrotérmico (1) para tratamento hidrotérmico da biomassa que contém celulose e separação sólido- líquido do produto tratado hidrotermicamente; o aparelho de hidrólise (14) para hidrólise de um teor de sólidos que contêm celulose descarregado do aparelho de tratamento hidrotérmico por celulase derivada de fungo filamentoso; o aparelho de recuperação de líquido de açúcar (23) para separação sólido- líquido de um hidrolisado do teor de sólidos que contêm celulose obtido no aparelho de hidrólise; e o aparelho de recuperação de enzima (28) para mistura, retenção térmica, e separação sólido-líquido de resíduos de sacarificação separada pelo aparelho de recuperação de líquido de açúcar e do líquido tratado hidrotermicamente descarregado do aparelho de tratamento hidrotérmico.
[074] A Figura 2 é um exemplo de um aparelho que compreende o aparelho de filtração por prensa (24, 35) especialmente na separação sólido- líquido do aparelho de recuperação de líquido de açúcar e do aparelho de recuperação de enzima; e a Figura 3 é um exemplo de um aparelho que compreende aparelho de separação por membranas de ultrafiltração (40) para separação adicional de celulase derivada de fungo filamentoso e um líquido de açúcar.
[075] A seguir, a fim de descrever o aparelho para produzir um líquido de açúcar em detalhes mostrados nas Figuras 1 a 3, a configuração de aparelho será descrita em referência à Figura 4. É preferencial que o aparelho de tratamento hidrotérmico (1) para tratamento hidrotérmico de biomassa que contém celulose e separação sólido-líquido de um produto tratado hidrotermicamente seja um aparelho que compreendo vaso pressurizado de retenção térmica (2) para conduzir um tratamento hidrotérmico; o aquecedor (3) para aquecer o vaso pressurizado de retenção térmica (2) mencionado acima; o alimentador de matéria-prima (4) para fornecer a biomassa ao vaso pressurizado de retenção térmica (2); o aparelho de agitação (5) para misturar a biomassa que contém celulose no vaso pressurizado de retenção térmica; o tanque de liberação de pressão (7) para liberar a pressão do vaso pressurizado de retenção térmica (2); o tanque de diluição de água (8) para diluir o produto tratado hidrotermicamente com água; o aparelho de transferência (6) para transferir o produto tratado hidrotermicamente do tanque de liberação de pressão (7) ao tanque de diluição de água (8); o separador de sólido do líquido (10) para submeter o produto tratado hidrotermicamente à separação sólido- líquido; a bomba (9) para transferir o produto tratado hidrotermicamente ao separador de sólido do líquido (10); a membrana de separação (11) instalada dentro do separador de sólido do líquido (10); e a válvula (12) para regular a descarga do líquido tratado hidrotermicamente. O aquecedor (3) pode preferencialmente aquecer o vaso pressurizado de retenção térmica (2) até que a biomassa que contém celulose alcance uma determinada temperatura (170 °C a 220 °C). O aparelho de agitação (5) é preferencialmente um com a capacidade de fazer com que a biomassa que contém celulose se mova continuamente dentro do vaso pressurizado de retenção térmica (2) e de uniformizar a temperatura, biomassa à base de celulose, e água. Além disso, alimentando-se continuamente ou intermitentemente biomassa que contém celulose fresca ao vaso pressurizado de retenção térmica (2) por meio do alimentador de matéria-prima que alimenta (4), um tratamento hidrotérmico contínuo da biomassa que contém celulose se toma viável. O separador de sólido do líquido (10) envolve centrifugação, filtração, separação por sedimentação, ou similares; e um método para separação que utiliza a membrana de separação (11) é preferencial devido ao fato de que um teor de sólidos que contêm celulose com uma alta concentração de sólidos pode ser obtido. O material da membrana de separação (11) é conforme selecionado apropriadamente a partir de malha de metal, pano tecido, pano não tecido, e similares. Devido ao fato de que o teor de sólidos que contêm celulose separado é um sólido, é preferencial usar o transportador de correia (13) para transferir o teor de sólido ao aparelho de hidrólise (14).
[076] A respeito do aparelho de hidrólise (14) para hidrólise do teor de sólidos que contêm celulose descarregado do aparelho de tratamento hidrotérmico por celulase derivada de fungo filamentoso, é preferencial conduzir uma hidrólise primária para o propósito de misturar homogeneamente o teor de sólidos que contêm celulose e a celulase derivada de fungo filamentoso e de diminuir a viscosidade dos mesmos por meio do uso do misturador (15) para conduzir a hidrólise do teor de sólidos que contêm celulose pela celulase derivada de fungo filamentoso. O misturador (15) preferencialmente tem o aparelho de transferência de líquido de agitação (16) e o aquecedor (17) para estabelecer uma temperatura para hidrólise. Além disso, subsequentemente à hidrólise primária pelo misturador (15), uma hidrólise secundária é conduzida enquanto a agitação e mistura pelo aparelho de agitação (18) no tanque de agitação (19). Assim como o misturador (15), o tanque de agitação (19) preferencialmente tem o aquecedor (20). A parte inferior do tanque de agitação (19) preferencialmente tem, por meio da válvula (21), a bomba (22) para transferir um líquido.
[077] O aparelho de recuperação de líquido de açúcar (23) no qual o hidrolisado do teor de sólidos que contêm celulose obtido pelo aparelho de hidrólise é submetido à separação sólido-líquido pode ter o separador de sólido do líquido (24) para separar o líquido de açúcar do resíduo de sacarificação; e, adicionalmente, o separador de sólido do líquido pode ter a membrana de separação (25) para separação e a válvula (26). O resíduo de sacarificação é transferido ao aparelho de recuperação de enzima (28) por meio do uso do transportador de correia (27).
[078] O aparelho de recuperação de enzima (28) para mistura, retenção térmica, e separação sólido-líquido do resíduo de sacarificação separado pelo aparelho de recuperação de líquido de açúcar e do líquido tratado hidrotermicamente descarregado do aparelho de tratamento hidrotérmico preferencialmente tem o permutador de calor (29) para submeter o líquido tratado hidrotermicamente à permuta de calor; e o tanque de retenção térmica (31), o aparelho de agitação (32), e o aparelho de retenção térmica (30) para misturar o líquido tratado hidrotermicamente com o resíduo de sacarificação e para a retenção térmica. O tanque de retenção térmica (31) é ligado, por meio da válvula (33) e da bomba (34), ao separador de sólido do líquido (35), onde o resíduo de sacarificação e a enzima recuperada são separados. O separador de sólido do líquido (35) preferencialmente tem a membrana de separação (36); e o líquido recuperado de enzima pode ser controlado por meio do uso da válvula (38). O resíduo de sacarificação separado é lavado pelo líquido de lavagem no tanque de líquido de lavagem (37) para recuperar o componente de enzima no resíduo de sacarificação. Além disso, o resíduo de sacarificação obtido por meio da separação sólido-líquido é descarregado pelo transportador de correia (39). O resíduo de sacarificação descarregado é transferido a uma caldeira para converter vapor e potência elétrica que são preferencialmente usadas na produção do líquido de açúcar. O aparelho de recuperação de enzima (28) preferencialmente compreende adicionalmente aparelho de separação por membranas de ultrafiltração (40) para separar a celulase derivada de fungo filamentoso do líquido de açúcar. Além disso, no aparelho de separação por membranas de ultrafiltração (40), o tanque de armazenamento de líquido de açúcar (41), a bomba de membrana de microfiltração (42), e o módulo de membrana de microfiltração (43) são preferencialmente instalados para remover o componente de partícula fina como um pré-tratamento de ultrafiltração. O filtrado do módulo de membrana de microfiltração (43) é recuperado no tanque de filtrado de membrana de microfiltração (44) por um momento e submetido adicionalmente ao módulo de membrana de ultrafiltração (46) por meio da bomba membrana de ultrafiltração (45), que possibilita que o componente de celulase e hemicelulase seja separado e recuperado como um retentado. O componente de enzima separado pode ser recuperado como um líquido concentrado de enzima no tanque de filtrado de membrana de microfiltração (44). Além disso, o líquido concentrado de enzima recuperada é transferido, como uma enzima recuperada, ao aparelho de hidrólise de celulose (14) por meio do uso da bomba (47). Enquanto isso, o permeado do módulo de membrana de ultrafiltração (46) pode ser usado como um líquido de açúcar que serve como uma matéria-prima para vários tipos de produções por fermentação.
[079] Além disso, a Figura 6 mostra um diagrama esquemático do caso em que a separação sólido-líquido da etapa (2) e a separação sólido-líquido da etapa (3) são conduzidas no mesmo aparelho (o aparelho de separação por membranas). O hidrolisado obtido na etapa (2) é fornecido ao aparelho de separação por membranas 48 (preferencialmente, o aparelho de filtração por prensa ou o aparelho de filtração por correia) por meio da linha de fornecimento de hidrolisado 50. A membrana 49 é instalada no aparelho de separação por membranas 48; e, por meio de uma pressão a partir do lado da membrana ou uma pressão negativa a partir do lado do permeado, o resíduo de sacarificação é separado no lado de fornecimento da membrana 49 e o líquido de açúcar é separado no lado do permeado. O líquido de açúcar obtido é recuperado por meio da linha de recuperação 51. Além disso, como para o resíduo de sacarificação separado na superfície de membrana, o líquido tratado hidrotermicamente pode ser fornecido ao resíduo de sacarificação por meio da linha de fornecimento de hidrolisado 50 que é a mesma descrita na etapa (2) ou a linha de fornecimento de tratamento hidrotérmico 51 que é independente da linha de fornecimento de hidrolisado 50. O líquido tratado hidrotermicamente fornecido ao resíduo de sacarificação passa através do resíduo de sacarificação por uma pressão a partir do lado da membrana ou uma pressão negativa a partir do lado do permeado que deve ser adicionalmente recuperado no lado do permeado da membrana. Nessa ocasião, o resíduo de sacarificação pode ser lavado pelo líquido tratado hidrotermicamente. Além disso, o líquido de lavagem pode ser recuperado a partir da linha de recuperação 51; e o líquido de lavagem recuperado pode ser adicionalmente passado através do resíduo de sacarificação múltiplas vezes por meio da linha de fornecimento de hidrolisado 50 ou da linha de fornecimento de tratamento hidrotérmico 51.
EXEMPLOS
[080] A título de exemplo, a presente invenção será agora descrita de forma concreta abaixo. A presente invenção, entretanto, não é limitada ao mesmo.
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1: MEDIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES
[081] A concentração de glicose e xilose que estavam contidas em um líquido de açúcar foi quantificada nas condições de HPLC descritas abaixo por meio da comparação a uma amostra padrão.
[082] Coluna: Luna NH2 (produzida pela Phenomenex)
[083] Fase móvel: Milli-Q:acetonitrila= 25:75 (taxa de fluxo 0,6 ml/min)
[084] Líquido de reação: Nenhum
[085] Método para detecção: RI (índice de retração diferencial)
[086] Temperatura: 30 °C
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2: MÉTODO PARA MEDIR A ATIVIDADE DE ENZIMA RECUPERADA DE CELULASE DERIVADA DE FUNGO FILAMENTOSO
[087] A quantidade de enzima recuperada de celulase derivada de fungo filamentoso que poderia ser recuperada na etapa (3) foi quantificada por meio da medição de três tipos de atividades de degradação (daqui por diante chamadas de valor de atividade): 1) atividade de degradação de celulose cristalina, 2) atividade de degradação de celobiose, e 3) atividade de degradação de xilano.
ATIVIDADE DE DEGRADAÇÃO DE CELULOSE CRISTALINA
[088] A um líquido de enzima (preparado em condições predeterminadas), Avicel, que é 1 g/l de celulose cristalina (Cellulose Microcrystalline produzida pela Merck) e tamponamento de acetato de sódio (pH 5,0) foram adicionados em 100 mM. A mistura resultante foi possibilitada de reagir em 50 °C por 24 horas. O líquido de reação foi preparado em um tubo de 1 ml; e a reação foi conduzida enquanto girado e misturado na condição mencionada acima. Após a reação, o tubo foi centrifugado; e a concentração de glicose do componente sobrenadante foi medida. A concentração de glicose foi medida em concordância com o método descrito no Exemplo de Referência 2. A concentração de glicose gerada (g/l) foi usada da presente forma como o nível de atividade da atividade de degradação de celulose cristalina, que foi usada para a comparação da quantidade de enzima recuperada.
ATIVIDADE DE DEGRADAÇÃO DE CELOBIOSE
[089] A um líquido de enzima, 500 mg/l de celobiose (produzida pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e tamponamento de acetato de sódio (pH 5,0) foram adicionados em 100 mM. A mistura resultante foi possibilitada de reagir 50 °C por 0,5 hora. O líquido de reação foi preparado em um tubo de 1 ml; e a reação foi conduzida enquanto girado e misturado na condição mencionada acima. Após a reação, o tubo foi centrifugado; e a concentração de glicose do componente sobrenadante foi medida. A concentração de glicose foi medida em concordância com o método descrito no Exemplo de Referência 2. A concentração de glicose gerada (g/l) foi usada da presente forma como o nível de atividade da atividade de degradação de celobiose, que foi usada para a comparação da quantidade de enzima recuperada.
ATIVIDADE DE DEGRADAÇÃO DE XILANO
[090] A um líquido de enzima, 10 g/l de xilano (Birch wood xylan, produzido pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e tamponamento de acetato de sódio (pH 5,0) foram adicionados em 100 mM. A mistura resultante foi possibilitada de reagir em 50 °C por quarto horas. O líquido de reação foi preparado em um tubo de 1 ml; e a reação foi conduzida enquanto girado e misturado na condição mencionada acima. Após a reação, o tubo foi centrifugado; e a concentração de glicose do componente sobrenadante foi medida. A concentração de xilose foi medida em concordância com o método descrito no Exemplo de Referência 2. A concentração de xilose gerada (g/l) foi usada da presente forma como o nível de atividade da atividade de degradação de xilose, que foi usada para a comparação da quantidade de enzima recuperada.
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3: MEDIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE ÍONS INORGÂNICOS, COMPOSTOS AROMÁTICOS, ÁCIDO ACÉTICO, ÁCIDO FÓRMICO, E ÁCIDO LÁCTICO
[091] A Concentração De Cátions E Ânions, Compostos aromáticos, ácido acético, e ácido fórmico no líquido de açúcar foi quantificada nas condições de HPLC mostradas abaixo em comparação com amostras padrão.
ANÁLISE DE CÁTIONS
[092] Coluna: Ion PacAS22 (produzida pela DIONEX)
[093] Fase móvel: Na2COs 4,5 mM ZNaHCOa 1,4 mM (taxa de fluxo 1,0 ml/min)
[094] Solução de reação: nenhuma
[095] Método para detecção: condutividade elétrica (com um supressor em uso)
[096] Temperatura: 30 °C
ANÁLISE DEÃNIONS
[097] Coluna: Ion Pac CS12A (produzida pela DIONEX)
[098] Fase móvel: ácido metanossulfônico 20 mM (taxa de fluxo 1,0 ml/min)
[099] Solução de reação: nenhuma
[0100] Método para detecção: condutividade elétrica (com um supressor em uso)
[0101]Temperatura: 30 °C
ANÁLISE DE COMPOSTOS AROMÁTICOS
[0102] Coluna: Synergi HydroRP 4,6 mmx250 mm (produzida pela Phenomenex)
[0103] Fase móvel: acetonitrila-0,1% de H3PO4 (taxa de fluxo 1,0 ml/min)
[0104] Método para detecção: UV (283 nm)
[0105]Temperatura: 40 °C
ANÁLISE DE ÁCIDO ACÉTICO, ÁCIDO FÓRMICO E ÁCIDO LÁCTICO
[0106] Coluna: Shim-Pack SPR-H (produzida pela Shimadzu Corporation) em series
[0107] Fase móvel: ácido p-toluenossulfônico 5 mM (taxa de fluxo 0,8 ml/min)
[0108] Solução de reação: ácido p-toluenossulfônico 5 mM, bis tris 20 mM, EDTA 2Na 0,1 mM (taxa de fluxo 0,8 ml/min)
[0109] Método para detecção: condutividade elétrica
[0110]Temperatura: 45°C
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 4: MÉTODO PARA ANALISAR AÇÚCARES ESTRUTURAIS NO PRODUTO TRATADO HIDROTERMICAMENTE DE BIOMASSA QUE CONTÉM CELULOSE
[0111] Em referência ao método LAP ("Determinação de Carboidratos Estruturais e Lignina em Biomassa, Procedimento Analítico Laboratorial (LAP)"), a composição foi analisada pelo método a seguir.
[0112] Uma quantidade apropriada de uma amostra foi aliquotada e o teor de água da mesma foi medida por meio do método no Exemplo de Referência 2 acima. Subsequentemente, após calcular o teor de água do Exemplo de Referência 2, a amostra seca obtida foi submetida à ignição em uma temperatura de 600 °C para determinar o teor de cinzas da mesma.
[0113] Além disso, a amostra foi transferida a uma cuba de aço inoxidável e seca a ar na atmosfera do laboratório de modo a estar aproximadamente no estado de equilíbrio; e o resultado foi triturado por um moinho de Wiley e passado através de uma peneira para ajustar seu tamanho de partícula a cerca de 200 a 500 pm. A amostra, após esse ajuste, foi seca a vácuo em uma temperatura de 60 °C; e o teor de cada componente em uma base absolutamente seca foi determinado por meio da correção de massa absolutamente seca. Para um béquer, 0,3 g dessa amostra para análise foi medido por um equilíbrio de balança; e 3 ml de ácido sulfúrico com uma concentração de 72% foram adicionados à mesma e deixada em repouso, enquanto ocasionalmente agitada, em uma temperatura de 30 °C por uma hora. Essa solução de reação foi completamente transferida a uma garrafa de pressão com 84 ml de água purificada e então autoclavado para termólise em uma temperatura de 120 °C por uma hora. Após a termólise, um líquido e um resíduo degradados foram filtrados e adicionados a um líquido de lavagem e filtrado de resíduos para compor um volume constante de 100 ml. O resultado foi usado como um líquido de teste. Além disso, um teste de recuperação por fortificação com o uso de monossacarídeos foi conduzido simultaneamente no momento de termólise para o propósito de corrigir a quebra excessiva de açúcares. A respeito do monossacarídeo (xilose, arabinose, manose, glicose, e galactose) no líquido de teste, a quantificação foi conduzida por um método de cromatopografia de líquido de alta velocidade (GL-7400 produzido pela GL Sciences Inc., detecção de fluorescência). A partir da concentração de monossacarídeo de o líquido degradado obtido e a quantidade da amostra quebrada, a quantidade de elementos estruturais na amostra foi determinada.
EXEMPLO 1: CONFIGURAÇÃO DE CONDIÇÕES DE TRATAMENTO HIDROTÉRMICO (ETAPA (D)
[0114] A palha de arroz foi triturada em uma velocidade de giro de 420 revoluções/min por meio do uso de um moinho de corte giratório-RCM-400 (malha de 8 mm) produzido pela Nara Machinery Co., Ltd. Depois disso, o tratamento hidrotérmico foi conduzido. Como para um aparelho, um aparelho de jateamento (reator com tamanho de 2 I) produzido pela Nihon Dennetsu Co., Ltd. foi usado. Como para um gerador de vapor, uma caldeira elétrica de 40 kW foi usada. Um tratamento temperatura é inequivocamente determinado uma vez que a pressão do tratamento seja estabelecida e, portanto, como para a condição de reação, vários tipos de condições foram testados por meio da alteração da pressão do tratamento e tempo de tratamento conforme mostrado na Tabela 1. Nessa condição, 200 g da palha de arroz triturada foram fornecidos por execução; uma reação foi conduzida sob a condição da Tabela 1. A água que contém teor de sólido que foi obtida por um tratamento por jateamento foi adicionada com 2 I de água, agitada, e separada em um líquido tratado hidrotermicamente e um teor de sólidos que contêm celulose com o uso de um centrifugador para laboratório "HimacCF7D2" produzida pela Hitachi Koki Co., Ltd. em 5.000 rpm. A análise dos açúcares estruturais no teor de sólidos que contêm celulose separado foi conduzida. Depois disso, o teor de água foi medido para cada um dos produtos de tratamento por jateamento. Água e solução de hidróxido de sódio aquosa 1 N (produzida pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foram adicionadas para ajustar o pH em uma faixa de 4,6 a 5,0; e água foi adicionalmente adicionada para ajustar um líquido pastoso para que a concentração de sólidos seja eventualmente 5%. Além disso, a celulase derivada de fungo filamentoso (celulase derivada de Tríchoderma) "Accellerase DUET" (concentração de enzimas: 40 g/l) produzida pela Genencor foi adicionada ao líquido pastoso para que o peso de enzima seja um centésimo do peso seco do produto tratado por jateamento; e a taxa de sacarificação do componente de glicose e do componente de xilose foi medida. Os resultados são mostrados na Tabela 1. TABELA 1: CONDIÇÃO DE TRATAMENTO HIDROTÉRMICO E TAXA DE SACARIFICAÇÃO
Figure img0001
N2 de teste Tempo de tratamento Pressão Temperatura (°C) Taxa de sacarificação de celulose (%) Taxa de sacarificação de xilano (%) 1 5 minutos 3,5 MPa 243 82 - 2 2,5 minutos 3,5 MPa 243 82 - 3 5 minutos 3 MPa 235 82 - 4 2,5 minutos 3 MPa 235 83 100 5 5 minutos 2,5 MPa 225 82 100 6 2,5 minutos 2,5 MPa 225 80 99 7 5 minutos 2,0 MPa 215 75 85 8 2,5 minutos 2,0 MPa 215 56 75 9 5 minutos 1,5 MPa 200 57 70 10 2,5 minutos 1,5 MPa 200 40 60 11 5 minutos 1,0 MPa 183 35 55 12 5 minutos 0,5 MPa 157 15 15
[0115]A partir do resultado da Tabela 1, constatou-se ser, nos casos em que palha de arroz foi usada como a biomassa que contém celulose, preferencial conduzir em uma faixa de temperatura de 180 a 240 °C.
EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DO LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE E DO TEOR DE SÓLIDOS QUE CONTÊM CELULOSE (ETAPA (1)
[0116]O produto tratado hidrotermicamente obtido na condição do número de teste 7 descrito no Exemplo 1 (a condição em 215 °C por 5 minutos) foi centrifugado em 3.000 G por 10 minutos para separar e recuperar um líquido tratado hidrotermicamente; e o sólido obtido foi adicionalmente adicionado com água e centrifugado para remover um sobrenadante. Essa série de operação foi conduzida duas vezes. Os sólidos obtidos foram usados nos Exemplos e Exemplos Comparativos a seguir como um teor de sólidos que contêm celulose.
EXEMPLO COMPARATIVO 1: HIDRÓLISE NO CASO DE MISTURAR UM TEOR DE SÓLIDOS QUE CONTÊM CELULOSE COM UM LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE.
[0117]A 1 g do teor de sólidos que contêm celulose do Exemplo 2, "Accellerase DUET" que foi usada no Exemplo 1 foi adicionada de modo a ter uma concentração final de 1 g/l, 0,8 g/l, 0,5 g/l, e 0,35 g/l e a hidrólise foi conduzida em 50 °C por 24 horas. Além disso, a preparação foi feita para que a concentração de sólidos do teor de sólidos que contêm celulose venha a ser 10% em peso por meio da adição do líquido tratado hidrotermicamente obtido no Exemplo 2. Além disso, o pH no momento da hidrólise foi ajustado com ácido sulfúrico diluído e hidróxido de sódio diluído de modo a estar em uma faixa de pH 4,6 a 5,4. O hidrolisado obtido foi centrifugado para separar 8 g de líquido de açúcar e 2 g de resíduo de sacarificação. O resultado obtido por meio da medição da concentração de glicose do líquido de açúcar foi mostrado na Tabela 2. TABELA 2: HIDRÓLISE NO CASO DE MISTURAR TEOR DE SÓLIDOS QUE CONTÊM CELULOSE E LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE
Figure img0002
EXEMPLO 3: HIDRÓLISE DO TEOR DE SÓLIDOS QUE CONTÊM CELULOSE (ETAPA (2))
[0118] A1 g do teor de sólidos que contêm celulose do Exemplo 2, a "Accellerase DUET" usada no Exemplo 1 foi adicionada para que a concentração final do mesmo venha a ser 1 g/l, 0,8 g/l, 0,5 g/l, e 0,35 g/l; e hidrólise foi conduzida em 50 °C por 24 horas. Além disso, a preparação foi feita para que a concentração de sólidos do teor de sólidos que contêm celulose venha a ser 10% em peso por meio da adição de água de RO. Além disso, o pH no momento de hidrólise foi ajustado com ácido sulfúrico diluído e hidróxido de sódio diluído de modo a estar em uma faixa de pH 4,6 a 5,4. O hidrolisado obtido foi centrifugado e separado em 8 g do líquido de açúcar e 2 g do resíduo de sacarificação. A concentração de glicose do líquido de açúcar foi medida. O resultado é mostrado na Tabela 3. TABELA 3: HIDRÓLISE DE TEOR DE SÓLIDOS QUE CONTÊM CELULOSE
Figure img0003
[0119]Em comparação com o resultado de hidrólise no caso de misturar o teor de sólidos que contêm celulose e o líquido tratado hidrotermicamente no Exemplo Comparativo 1 (Tabela 2), foi constatado que a quantidade de glicose gerada com uma quantidade idêntica de enzima de sacarificação foi mais alta no Exemplo 3 onde o teor de sólidos que contêm celulose foi empregado por si só. Ou seja, é mostrado que o componente que inibe a hidrólise do teor de sólidos que contêm celulose está incluída no líquido tratado hidrotermicamente; e a separação aumenta a quantidade de glicose gerada e a quantidade de açúcares gerados.
EXEMPLO COMPARATIVO 2: SACARIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DO LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE
[0120]Ao líquido tratado hidrotermicamente obtido no Exemplo 2, “Accellerase DUET” usada no Exemplo 1 foi adicionada para que a concentração final do mesmo venha a ser 0,04 g/l a 0,8 g/l; e hidrólise foi conduzida em 50 °C por 24 horas. Após a reação, o líquido tratado hidrotermicamente foi centrifugado; e a concentração de glicose e xilose no componente sobrenadante foi medida. O resultado de análise obtido é mostrado na Tabela 4. TABELA 4: HIDRÓLISE DE LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE
Figure img0004
[0121] Como resultado, foi constatado que, como a concentração de enzimas aumentou, a quantidade de glicose gerada e a quantidade de xilose gerada aumentaram.
[0122]Além disso, foi constatado que, mesmo se a concentração de enzimas fosse 0,16 g/l ou mais, a quantidade de açúcar gerada não aumenta muito na reação em 50 °C por 24 horas. Constatou-se assim que, a fim de realizar hidrólise suficiente do líquido tratado hidrotermicamente na reação em 50 °C por 24 horas, foi necessário que 0,16 g/l de enzima fosse adicionado.
EXEMPLO 4: LAVAGEM DE RESÍDUOS DE SACARIFICAÇÃO COM O LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE (ETAPA (3))
[0123] A 2 g de resíduo de sacarificação (que inclui água) obtido quando a concentração de "Accellerase DUET" adicionada era 0,8 g/l no Exemplo 3, o líquido tratado hidrotermicamente foi adicionado em uma razão de peso de 1:4 ou 1:8 e manteve a temperatura em 50 °C por 0 horas, 6 horas, 24 horas, 48 horas, ou 72 horas para lavar o resíduo de sacarificação. Após a lavagem, o líquido de lavagem em cada tempo de reação foi centrifugado (8.000 G, 20 minutos) para recuperar o sobrenadante (o caso de 1:4: 8 g, o caso de 1:8: 16 g); e a concentração de glicose e xilose contida no líquido de lavagem foi medida pela técnica no Exemplo de Referência 1. Esse resultado é mostrado na Tabela 5 e na Tabela 6.
EXEMPLO COMPARATIVO 3: LAVAGEM DE RESÍDUO DE SACARIFICAÇÃO POR ÁGUA DE RO
[0124] A um peso de 2 g de resíduo de sacarificação (que inclui água) do Exemplo 4, água de RO foi adicionada em uma razão de 1:4 ou 1:8 e a temperatura do mesmo foi mantida em 50 °C por 0 hora, 6 horas, 24 horas, 48 horas e 72 horas. O sobrenadante foi recuperado por centrifugação (8.000 G, 20 minutos) (o caso de 1:4: 8 g, o caso de 1:8: 16 g). A concentração de glicose e xilose em cada sobrenadante foi medida pela técnica no Exemplo de Referência 1. O resultado é mostrado na Tabela 5 e na Tabela 6. TABELA 5: LAVAGEM DE RESÍDUO DE SACARIFICAÇÃO POR LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE: QUANTIDADE DE GLICOSE GERADA
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TABELA 6: LAVAGEM DE RESÍDUO DE SACARIFICAÇÃO POR LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE: QUANTIDADE DE XILOSE GERADA
Figure img0006
[0125] Conforme mostrado nas Tabelas 5 e 6, foi constatado que quando o líquido tratado hidrotermicamente foi adicionado ao resíduo de sacarificação e mantido aquecido, a quantidade de glicose e xilose geradas aumentou. A razão do resíduo de sacarificação para o líquido tratado hidrotermicamente foi alterada (resíduo de sacarificação:líquido tratado hidrotermicamente foi 1:4 e 1:8) e o mesmo estudo foi conduzido; e foi constatado que a quantidade de glicose e xilose geradas aumentou em ambos os estudos. Além disso, foi constatado que apenas adicionar água de RO ao resíduo de sacarificação e manter o resultado aquecido aumentou unicamente a quantidade de açúcares gerados, em particular, a quantidade de glicose gerada.
[0126] Enquanto isso, foi constatado que a quantidade de xilose gerada no Exemplo 4 aumentou, em comparação com a do Exemplo Comparativo 3 (Tabela 6). Acreditava-se ser devido ao fato de que xilano ou xilooligossacarídeo no líquido tratado hidrotermicamente ter sido hidrolisado por meio da ação de componentes de enzima adsorvidos no resíduo de sacarificação. Isso é consistente com uma tendência de que a quantidade de xilose gerada, em particular, nitidamente aumenta por meio da adição da celulase derivada de fungo filamentoso ao líquido tratado hidrotermicamente do Exemplo Comparativo 2 descrito anteriormente.
EXEMPLO 5: RECUPERAÇÃO DE ENZIMAS DO LÍQUIDO DE LAVAGEM DE RESÍDUO DE SACARIFICAÇÃO POR LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE (ETAPA (4))
[0127] A 2 g de resíduo de sacarificação (que inclui água) obtido quando a concentração de "Accellerase DUET" adicionada foi 0,8 g/l no Exemplo 3, o líquido tratado hidrotermicamente foi adicionado em uma razão de peso de 1:4 e mantido a temperatura em 50 °C por 24 horas para lavar o resíduo de sacarificação. Após a lavagem, o líquido de lavagem em cada tempo de reação foi centrifugado (8.000 G, 20 minutos) para recuperar o sobrenadante, obter dessa forma 8 g do líquido de lavagem. 8 g do líquido de lavagem mencionado acima foram adicionalmente filtrados com o uso de filtração de unidade de filtro Millex HV (Millipore, 33 mm, feita de PVDF, tamanho de poro fino 0,45 pm). O filtrado obtido foi filtrado com uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular reduzido de 10.000 (VIVASPIN 20 produzido pela Sartorius stedim biotech, material: PES); e uma fração de membrana foi centrifugada em 4.500 G até que o volume da mesma tenha chegado a 1 ml. Água destilada 10 ml foi adicionada à fração de membrana e centrifugada novamente em 4.500 G até que o volume da fração de membrana tenha alcançado 0,5 ml. Depois disso, a enzima foi recuperada da fração de membrana. Cada atividade da enzima recuperada foi medida em concordância com o Exemplo de Referência 2. Além disso, em prol da comparação, cada atividade de enzima de "Accellerase DUET" (0,8 g/l) por si só foi medida em concordância com o Exemplo de Referência 2; e a atividade naquele momento foi usada como 100(%) para determinar um valor relativo. A atividade de celulase e hemicelulase é resumida na Tabela 7 conforme expressado pelos termos do valor relativo.
EXEMPLO COMPARATIVO 4: RECUPERAÇÃO DE CELULASE DERIVADA DE FUNGO FILAMENTOSO NO CASO DO LÍQUIDO DE AÇÚCAR DE FILTRAÇÃO OBTIDO POR HIDRÓLISE DO TEOR DE SÓLIDOS QUE CONTÊM CELULOSE ATRAVÉS DA MEMBRANA DE ULTRAFILTRAÇÃO
[0128] O líquido de açúcar (8 g) obtido quando a concentração de "Accellerase DUET" adicionada foi 0,8 g/l no Exemplo 3 foi adicionalmente filtrada com o uso de uma unidade de filtro Millex HV (Millipore, 33 mm, feita de PVDF, tamanho de poro fino 0,45 pm). O filtrado obtido foi filtrado com o uso de uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular reduzido de 10.000 (VIVASPIN 20 produzido pela Sartorius stedim biotech, material: PES); e uma fração de membrana foi centrifugada em 4.500 G até que o volume da mesma tenha chegado a 0,5 ml. 10 ml de água destilada foram adicionados à fração de membrana que foi centrifugada novamente em 4.500 G até que o volume da fração de membrana tenha alcançado 0,5 ml. Depois disso, a enzima foi recuperada da fração de membrana. Cada atividade da enzima recuperada foi medida em concordância com o Exemplo de Referência 4 (Tabela 7).
EXEMPLO COMPARATIVO 5: RECUPERAÇÃO DE ENZIMAS DO LÍQUIDO DE LAVAGEM DE RESÍDUO DE SACARIFICAÇÃO POR ÁGUA DE RO
[0129] A 2 g de resíduo de sacarificação (que inclui água) obtido quando a concentração de 'Accellerase DUET" adicionada foi 0,8 g/l no Exemplo 3, água de RO foi adicionada em 1:4 e o resultado foi hidrolisado em 50 °C por 24 horas e adicionalmente filtrado com o uso de uma unidade de filtro Millex HV (Millipore, 33 mm, feita de PVDF, tamanho de poro fino 0,45 pm). O filtrado obtido foi filtrado com o uso de uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular reduzido de 10.000 (VIVASPIN 20 produzido pela Sartorius stedim biotech, material: PES); e uma fração de membrana foi centrifugada em 4.500 G até que o volume da mesma tenha chegado a 1 ml. 10 ml de água destilada foram adicionados à fração de membrana que foi centrifugada novamente em 4.500 G até que o volume da fração de membrana tenha alcançado 0,5 ml. Depois disso, a enzima foi recuperada da fração de membrana. Cada atividade da enzima recuperada foi medida em concordância com o Exemplo de Referência 4 (Tabela 7). TABELA 7: ENZIMA RECUPERADA E CADA ATIVIDADE DE ENZIMA
Figure img0007
[0130] Quando a atividade de enzima recuperada do líquido de açúcar derivado do teor de sólidos que contêm celulose foi comparada com a atividade de enzima recuperada do líquido de lavagem de resíduo de sacarificação pelo líquido tratado hidrotermicamente, foi constatado que cada uma das atividades (atividade de degradação de Avicel, atividade de degradação de celobiose, e atividade de degradação de xilano) da enzima recuperada do líquido de lavagem de resíduo de sacarificação pelo líquido tratado hidrotermicamente foi mais alta. Ou seja, pensou-se que a recuperação de enzima foi promovida pelo componente contido no líquido tratado hidrotermicamente.
EXEMPLO 6: ANÁLISE DE COMPONENTES DO LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE
[0131] A medição da concentração de íons inorgânicos contidos no líquido tratado hidrotermicamente foi conduzida pelo procedimento do Exemplo de Referência 3. Como resultado, conforme mostrado na Tabela 8, foi constatado que o líquido tratado hidrotermicamente em 1 g/l ou mais de íons inorgânicos e, em particular, uma grande quantidade de componente de potássio. TABELA 8: ANÁLISE DE LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE:ÍON INORGÂNICO
Figure img0008
[0132] A seguir, como para a análise de componentes aromáticos e ácidos orgânicos, a medição foi conduzida pelo procedimento do Exemplo de Referência 3. Como resultado, conforme mostrado na Tabela 9, foi constatado que, dentre os componentes aromáticos, a quantidade de componentes de furfural era dentro de 1 g/l ou mais. Além disso, foi constatado que, dentre os ácidos orgânicos, os componentes de ácido acético eram em 1 g/l ou mais. Ou seja, o resultado da análise do componente do líquido tratado hidrotermicamente mostrou que havia uma relação entre recuperação de enzima aprimorada em a adição do líquido tratado hidrotermicamente e a concentração de íon inorgânico, furfural, e ácido acético em um nível eficaz no líquido tratado hidrotermicamente. TABELA 9: ANÁLISE DE LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE: ÍON ORGÂNICO DE COMPOSTO AROMÁTICO ■
Figure img0009
EXEMPLO 7: SEPARAÇÃO ANÁLISE DE ENZIMA RECUPERADA POR SDS-PAGE
[0133] Para cada um dos líquidos de enzima recuperada do Exemplo Comparativo 4, Exemplo Comparativo 5, e do Exemplo 5, a análise por SDS-PAGE foi conduzida. Para cada líquido de enzima recuperada, um tamponamento de líquido de preparação de amostra (Ez Apply, ATTO) foi adicionado para realizar SDS-PAGE (e-PAGEL, 15% de concentração de gel, ATTO). O tingimento foi conduzido com o uso de Coomassie Brilliant Blue (BioSafecoomassie Stain, BioRAD). Deve-se notar que um marcador de peso molecular (Precision Plus Protein Standard, Kaleidoscope, BioRAD) foi usado para medir o peso molecular. O resultado é mostrado na Figura 5. Foi possível confirmar que o componente de enzima recuperada do Exemplo 5 aumentou em comparação com os do Exemplo Comparativo 4 e do Exemplo Comparativo 5. Além disso, em comparação com o marcador de peso molecular, foi possível confirmar que os componentes que exibem recuperação aprimorada no Exemplo 5 foram um celobiohidrolase componente e um xilanase componente (Figura 5).
EXEMPLO 8: PRODUÇÃO DE ETANOL POR FERMENTAÇÃO COM O LÍQUIDO DE AÇÚCAR COMO UMA MATÉRIA-PRIMA DE FERMENTAÇÃO
[0134] Com o uso do líquido de açúcar obtido no Exemplo 4 como uma matéria-prima de fermentação, um teste de fermentação de etanol por levedura (OC-2 de Saccharomycecs cerevisiae\ levedura de vinho) foi conduzido. A levedura mencionada anteriormente foi pré-cultivada em meio YPD (2% de glicose, 1% de extrato de levedura (Bacto Extrato de Levedura/BD), 2% de polipeptona (produzido pela Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.)) em 25 °C por um dia. Subsequentemente, o líquido de cultura obtido foi adicionado ao primeiro líquido de açúcar de modo a ser 1%. Após ser adicionado, o micro-organismo foi incubado em 25 °C por dois dias. A concentração cumulativa de etanol contido no líquido de cultura obtido por essa operação foi medida por um método de cromatopografia a gás (com o uso de Shimadzu GC-2010 capillary GC TC-1 (GL science) 15 meter I/O,53 mm I.D., df 1,5 pm com detecção e cálculo por um detector de ionização de chama para avaliação). Como resultado, foi possível confirmar que o líquido de cultura continha 8 g/l de etanol. Ou seja, foi possível confirmar que etanol poderia ser produzido quando a matéria-prima de fermentação é o líquido de açúcar da presente invenção.
EXEMPLO 9: PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO POR FERMENTAÇÃO COM O LÍQUIDO DE AÇÚCAR COMO UMA MATÉRIA-PRIMA DE FERMENTAÇÃO
[0135] Com o uso do líquido de açúcar obtido no Exemplo 4 como uma matéria-prima de fermentação, a cepa JCM7638 de Lactococcus lactis, que é um lactobacilo, foi submetida à cultura estática em uma temperatura de 37 °C por 24 horas. A concentração de ácido l-láctico contido no líquido de cultura foi analisada na condição do Exemplo de Referência 3. Como resultado, confirmou-se que ácido l-láctico acumulado continha 11 g/l e foi possível confirmar que a produção de ácido láctico é viável pelo líquido de açúcar da presente invenção.
EXEMPLO 10: LAVAGEM DO RESÍDUO DE SACARIFICAÇÃO PELO LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE (ETAPA (3)): EFEITO DA TEMPERATURA DO LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE
[0136] A 2 g de resíduo de sacarificação (que inclui água) obtido quando a concentração de 'Accellerase DUET" adicionada foi 0,8 g/l no Exemplo 3, o líquido tratado hidrotermicamente foi adicionado em uma razão de peso de 1:4 e manteve a temperatura em cada um dentre 4 °C, 25 °C, 40 °C, 60 °C, 70 °C, e 80 °C para lavar o resíduo de sacarificação. Após a lavagem, o líquido de lavagem em cada tempo de reação foi centrifugado (8.000 G, 20 minutos) para recuperar o sobrenadante, e obter dessa forma 8 g do líquido de lavagem. A concentração de glicose e xilose contida em cada líquido de lavagem foi medida pela técnica do Exemplo de Referência 1. Esse resultado é mostrado nas Tabelas 10 e 11. TABELA 10: EFEITOS DE TEMPERATURA DE LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE EM QUANTIDADE DE AÇÚCARES GERADOS: QUANTIDADE DE GLICOSE GERADA
Figure img0010
TABELA 11: EFEITOS DE TEMPERATURA DE LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE EM QUANTIDADE DE AÇÚCARES GERADOS: QUANTIDADE DE XILOSE GERADA
Figure img0011
[0137] Como para a temperatura do líquido tratado hidrotermicamente no momento da lavagem, foi possível confirmar que a faixa de 40 a 60 °C é preferencial devido ao fato de que a oligo-hidrólise no líquido tratado hidrotermicamente progrediu mais e ambas a glicose e a xilose no líquido de lavagem aumentaram.
EXEMPLO 11: RECUPERAÇÃO DE ENZIMAS DO LÍQUIDO DE LAVAGEM DE RESÍDUO DE SACARIFICAÇÃO PELO LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE (EXEMPLO 10) (ETAPA (4))
[0138] Cada líquido de lavagem 8 g obtido no Exemplo 10 foi filtrado por uma membrana de ultrafiltração no mesmo procedimento conforme descrito no Exemplo 5 para recuperar a enzima no líquido de lavagem. Cada atividade da enzima recuperada foi medida em concordância com o Exemplo de Referência 2. Além disso, em prol de comparação, cada atividade de enzima de 'Accellerase DUET" (0,8 g/l) por si só foi medida em concordância com o Exemplo de Referência 2; e a atividade naquele momento foi usada como 100(%) para determinar um valor relativo. A atividade de celulase e hemicelulase está resumida na Tabela 12 conforme expressado pelos termos do valor relativo. TABELA 12: ENZIMA RECUPERADA E CADA ATIVIDADE DE ENZIMA
Figure img0012
[0139] Como para a temperatura do líquido tratado hidrotermicamente no momento da lavagem, foi possível confirmar que a faixa de 40 a 60 °C é preferencial devido ao fato de que as atividades de enzima (atividade de degradação de Avicel, atividade de degradação de celobiose, e atividade de degradação de xilano) no líquido de lavagem foram mais aprimoradas.
EXEMPLO 12: LAVAGEM DE RESÍDUOS DE SACARIFICAÇÃO PELO LÍQUIDO TRATADO HIDROTERMICAMENTE COM O Uso Do APARELHO DE FILTRAÇÃO POR PRENSA (ETAPA (3)), E RECUPERAÇÃO DE ENZIMAS DO LÍQUIDO DE LAVAGEM (ETAPA (4))
[0140]A 100 g de sólido que contém celulose do Exemplo 2, "Accellerase DUET" foi adicionada para que a concentração final do mesmo se tome 0,8 g/l; e a hidrólise foi conduzida em 50 °C por 24 horas. Nessa ocasião, a concentração de sólidos no teor de sólidos que contêm celulose foi ajustada a 10% em peso por meio da adição de água de RO (10 I no total). Os 10 I de hidrolisado assim obtidos foram submetidos à filtração por prensa com o uso de um aparelho de filtro de prensa de tamanho pequeno (filtro de prensa MO-4 produzido pela Yabuta Industries Co., Ltd.). Como para um pano de filtro, um pano tecido feito de poliéster (T2731C produzido pela Yabuta Industries Co., Ltd.) foi usado. Um líquido pastoso 10 I foi colocado em um tanque pequeno. Embora o líquido pastoso tenha sido areado com ar comprimido a partir do fundo, uma porta de inserção de líquido foi aberta e o líquido pastoso foi gradualmente fornecido a uma câmara de filtração por uma bomba de ar (66053-3EB produzida pela Taiyo International Corporation). Após a pasta ter sido fornecida, um filtro de prensa filtrado foi recuperado como um líquido de açúcar ((etapa (3))). O líquido tratado hidrotermicamente foi submetido a uma etapa de compressão por meio da insuflação de um diafragma anexado. A pressão de compressão foi gradualmente elevada a 0,5 MPa e deixada em repouso por cerca de 30 minutos para recuperar adicionalmente um filtrado como um líquido de açúcar. A quantidade do líquido de açúcar que foi possível de ser recuperado como o filtrado foi 7 I. Subsequentemente, para o resíduo de sacarificação separado na câmara de filtração, a temperatura foi antecipadamente mantida em 50 °C e 5 I de um líquido tratado hidrotermicamente foram passados e circulados. O líquido tratado hidrotermicamente foi colocado no tanque pequeno; a porta de inserção de líquido foi aberta; e o líquido tratado hidrotermicamente foi passado através do resíduo de sacarificação separado na câmara de filtração pela bomba de ar. Após a passagem, um filtrado foi gradualmente obtido, novamente mantido à temperatura do mesmo em 50 °C, e então posto de volta ao tanque pequeno; essa operação circular foi repetida. Essa operação foi conduzida em intervalos regulares por duas horas, e a pressão de compressão foi novamente gradualmente elevada a 0,5 MPa e deixada em repouso por cerca de 30 minutos para recuperar 5 I do líquido de lavagem.
[0141] 5 I do líquido de lavagem obtido foram filtrados com o uso de unidade de filtro HV STERICUP (produzido pela Millipore). O filtrado obtido foi filtrado através de um aparelho de filtração por membrana em placa plana pequena ("Sepa" (marca registrada) CF II Med/High Foulant System produzido pela GE Osmonics) ao qual uma membrana de placa plana de membrana de ultrafiltração com um peso molecular reduzido de 10.000 (SEPA PW series produzido pela GE, material de superfície funcional: poliéter sulfona) foi estabelecida para separar uma enzima recuperada de um líquido de componente de açúcar. Como para a filtração, embora uma pressão operante tenha sido controlada para que a taxa de fluxo no lado de água de fornecimento bruta e o fluxo de membrana sejam mantidos constantes em 2,5 l/min e 0,1 m/D, 4,5 I de 5 I foram separados como um filtrado e concomitantemente 0,5 I foi recuperado como uma enzima recuperada. A atividade da enzima recuperada foi medida em concordância com o Exemplo de Referência 1. Em prol de comparação, cada atividade de enzima de 'Accellerase DUET" (0,8 g/l) por si só foi medida em concordância com o Exemplo de Referência 2; e a atividade naquele momento foi usada como 100(%) para determinar um valor relativo. A atividade de celulase e hemicelulase é resumida na Tabela 13 conforme expressado pelos termos do valor relativo.
EXEMPLO COMPARATIVO 6: LAVAGEM DE RESÍDUOS DE SACARIFICAÇÃO POR ÁGUA DE RO COM O Uso Do APARELHO DE FILTRAÇÃO POR PRENSA, E RECUPERAÇÃO DE ENZIMAS DO LÍQUIDO DE LAVAGEM
[0142] No mesmo procedimento, conforme descrito no Exemplo 12, em vez do líquido tratado hidrotermicamente mencionado acima, a água de RO foi passada e circulada no mesmo procedimento. Além disso, a enzima recuperada foi obtida a partir do líquido de lavagem no mesmo procedimento conforme descrito no Exemplo 12. A atividade de enzima recuperada nesse momento é designada como 1 e mostrada na Tabela 13. Em prol de comparação, cada atividade de enzima de "Accellerase DUET" (0,8 g/l) por si só foi medida em concordância com o Exemplo de Referência 2; e a atividade naquele momento foi usada como 100(%) para determinar um valor relativo. A atividade de celulase e hemicelulase é resumida na Tabela 13 conforme expressado pelos termos do valor relativo. TABELA 13: ENZIMA RECUPERADA E CADA ATIVIDADE DE ENZIMA (EXEMPLO 12, EXEMPLO COMPARATIVO 5)
Figure img0013
[0143] Conforme mostrado na Tabela 13, a intensidade de recuperação de enzima foi aumentada consideravelmente no caso em que o resíduo de sacarificação foi lavado com o líquido tratado hidrotermicamente (Exemplo 12), em comparação com o caso em que a mesma operação foi conduzida com água de RO (Exemplo Comparativo 5).
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[0144] O líquido de açúcar obtido por meio do método para produzir um líquido de açúcar da presente invenção pode ser usado como uma matéria-prima de fermentação para várias substâncias químicas. DESCRIÇÃO DOS SÍMBOLOS 1 Aparelho de tratamento hidrotérmico 2 Vaso pressurizado de retenção térmica 3 Aquecedor 4 Alimentador de matéria-prima 5 Aparelho de agitação 6 Aparelho de transferência 7 Tanque de liberação de pressão 8 Tanque de diluição de água 9 Bomba 10 Separador de sólido do líquido 11 Membrana de separação 12 Válvula 13 Transportador de correia 14 Aparelho de hidrólise 15 Misturador 16 Aparelho de transferência de líquido de agitação 17 Aquecedor 18 Aparelho de agitação 19 Tanque de agitação 20 Aquecedor 21 Válvula 22 Bomba 23 Aparelho de recuperação de líquido de açúcar 24 Separador de sólido do líquido 25 Membrana de separação 26 Válvula 27 Transportador de correia 28 Aparelho de recuperação de enzima 29 Permutador de calor 30 Aparelho de retenção térmica 31 Tanque de retenção térmica 32 Aparelho de agitação 33 Válvula 34 Bomba Separador de sólido do líquido Membrana de separação Líquido de lavagem tank Válvula Transportador de correia Membrana de ultrafiltração aparelho Tanque de armazenamento de líquido de açúcar Bomba de membrana de microfiltração Membrana de microfiltração módulo Tanque de filtrado de membrana de microfiltração Bomba membrana de ultrafiltração Módulo de membrana de ultrafiltração Bomba Aparelho de separação por membranas Membrana Linha de fornecimento de hidrolisado Linha de recuperação Linha de fornecimento de líquido tratado hidrotermicamente

Claims (9)

1. MÉTODO PARA PRODUZIR UM LÍQUIDO DE AÇÚCAR a partir de biomassa que contém celulose, caracterizado por compreender as seguintes etapas (1) a (3): etapa (1): a etapa de submeter uma biomassa que contém celulose a tratamento hidrotérmico e em seguida separar a biomassa que contém celulose tratada em um líquido tratado hidrotermicamente e um teor de sólidos que contêm celulose; etapa (2): a etapa de adicionar uma celulase derivada de fungo filamentoso ao teor de sólidos que contêm celulose obtido na etapa (1) para hidrolisar a celulose e em seguida separar o hidrolisado em um resíduo de sacarificação e um líquido de açúcar; e etapa (3): a etapa de lavar o resíduo de sacarificação obtido na etapa (2) com o líquido tratado hidrotermicamente obtido na etapa (1) para eluir a celulase derivada de fungo filamentoso adsorvida ao resíduo de sacarificação no líquido tratado hidrotermicamente e em seguida obter um componente de solução que compreende a celulase derivada de fungo filamentoso por meio de separação sólido-líquido, em que o resíduo de sacarificação é lavado com o líquido tratado hidrotermicamente a 30 a 70 °C e em que a razão em peso do resíduo de sacarificação para o líquido tratado é de 1:4 a 1:8.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a etapa (4) de filtrar o componente de solução obtido na etapa (3) através de uma membrana de ultrafiltração para dessa forma recuperar a celulase derivada de fungo filamentoso como um retentado e obter ao mesmo tempo um líquido de açúcar como um permeado.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela celulase derivada de fungo filamentoso recuperada na etapa (4) ser reusada na hidrólise de celulose na etapa (2).
4. MÉTODO, de acordo ∞m qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela celulase derivada de fungo filamentoso ser celulase derivada de Tríchoderma.
5. MÉTODO, de acordo ∞m qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo tratamento hidrotérmico da etapa (1) ser um tratamento dentro de uma faixa de temperatura de 120 a 240 °C.
6. MÉTODO, de a∞rdo ∞m qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo líquido tratado hidrotermicamente usado na etapa (3) compreender 1 g/l ou mais de um íon inorgânico, ácido acético e/ou furfural no total.
7. MÉTODO, de a∞rdo ∞m qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela etapa (2) compreender separar o hidrolisado em um resíduo de sacarificação e um líquido de açúcar por meio de separação por membrana, e a etapa (3) ∞mpreender lavar o resíduo de sacarificação pela passagem do líquido tratado hidrotermicamente através do resíduo de sacarificação na superfície da membrana em uma direção vertical para obter um componente de solução que compreende a celulase derivada de fungo filamentoso.
8. MÉTODO, de acordo ∞m a reivindicação 7, caracterizado pela separação por membrana ser filtração por prensa ou separação por membrana por meio de um filtro de correia.
9. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA QUÍMICA, caracterizado por compreender as seguintes etapas: - produzir o líquido de açúcar pelo método ∞nforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8; - cultivar um micro-organismo capaz de produzir uma substância química usando o líquido de açúcar como uma matéria-prima de fermentação; e - fermentar o líquido de açúcar para produzir uma substância química.
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