BR112014025571B1 - método não terapêutico para reduzir metanogênese de ruminantes e uso de glicosídeos de flavanonas para reduzir metanogênese de ruminantes - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA REDUZIR A PRODUÇÃO DE METANO EM RUMINANTES E USO DE GLICOSÍDEO DE FLAVANONA. A presente invenção refere-se a um método para reduzir a produção de metano em ruminantes compreendendo administrar ao dito ruminante uma composição de alimentação contendo um glicosídeo de flavanona, selecionado do grupo consistindo em neoesperidina, isonaringina, poncirina, e hesperidina ou uma mistura das mesmas. Além disso, refere-se também ao uso glicosídeo de flavanona na preparação de composição de alimentação para reduzir a produção de metano em ruminantes.
Description
[0001] A presente invenção refere-se às novas composições para a redução de metanogênese de ruminante.
[0002] Metano, dióxido de carbono e óxido nitroso são os principais gases de efeito estufa.
[0003] Metano (CH4) é um gás estufa cuja concentração atmosférica tem aumentado drasticamente durante o último século e, depois do dióxido de carbono, é o contribuinte de maior potencial para o aquecimento da Terra. O aumento no nível de metano troposférico se correlaciona de perto com a expansão global da população humana. Consequentemente acredita-se que aproximadamente 70% de emissões de metano estão associadas com as atividades dos seres humanos. O enchimento de resíduos na terra e as práticas agrícolas geram e liberam metano para a atmosfera em quantidades que aumentarão, enquanto número de pessoas cresce no mundo.
[0004] Ruminantes, que incluem gado, búfalo, ovelha, e cabras, tem um esôfago grande onde a fermentação que produz metano ocorre. O trato digestivo do rúmen é feito de quatro compartimentos gástricos, o rúmen, o retículo, o abomaso e o omaso. O maior e mais importante destes é o rúmen. As funções do rúmen como um compartimento de fermentação. Ele contém grandes populações de microorganismos incluindo archaea produtora de metano, que faz a divisão do material da planta. Os ditos microorganismos são comumente referidos como metanogênicos. As populações de archaea usam os produtos de hidrogênio e dióxido de carbono, produtos de fermentação microbiana anaeróbica, para gerar energia para o crescimento, produzindo metano co- fermentação microbiana anaeróbica, para gerar energia para o crescimento, produzindo metano como um produto final. Finalmente, metano é expelido para fora do rúmen através de eructação (arroto).
[0005] A produção de metano por gado e ovelha representa uma via de perda de carbono que reduz a produtividade. Se a energia que é perdida através da síntese de metano poderá ser recanalizada através de outras vias bioquímicas, comumente para síntese de propionato, a fermentação do rúmen se tornará mais eficiente e será refletida no ganho de peso do animal ou melhoramentos da produção de leite. Será custo eficaz para o produtor como também para prover uma ferramenta eficaz para reduzir emissões de metano para a atmosfera. Na verdade, por causa do tempo de vida de metano na atmosfera ser de 12 anos (enquanto aqueles de dióxido de carbono e óxido nitroso são de 100 anos e 120 anos, respectivamente) reduzindo as emissões de metano terá um mais e mais rápido efeito no ambiente.
[0006] Estudos do passado com animais ruminantes mostraram que a produção de metano é afetada por dieta. Aumentando a proporção de carboidratos estruturais/não estruturais (celulósicos/amiláceos), as emissões de metano aumentam. Além do mais, a adição de fontes de lipídeos para a dieta reduz emissões de metano entérico. Se bem que, em paralelo à redução de metano, taxas de alta suplementação de gordura reduzem a fermentação microbiana do rúmen, a ingestão da alimentação e digestibilidade de fibras. Um número de aditivos químicos da alimentação tais como antibióticos, (isto é, ionóforos) ou agentes defaunadores foram introduzidos na nutrição de ruminante para promover crescimento, melhorar a utilização da alimentação e diminuir a produção de metano. Entretanto, preocupações sobre a presença de resíduos químicos nos produtos animais, e o desenvolvimento de resistência bacteriana aos antibióticos, têm estimulado a busca por alternativas naturais mais seguras que seriam úteis no cultivo de criação orgânica.
[0007] Plantas ou extratos de plantas contendo óleos essenciais, taninas, saponinas, flavonoides e muitos outros metabolites secundários de plantas, têm mostrado melhorar o metabolismo do rúmen alvejando grupos específicos de populações microbianas de rúmen. Patraa A.K. and Saxenab J (2010). Phytochemistry, 71(11- 12): 1198-222 descreve o uso de metabólitos secundários de plantas para inibir a metanogênese no rúmen. O documento W02005000035 refere-se a um procedimento para intensificar a fermentação ruminante e, em particular, reduzir a metanogênese, consistindo na administração de um extrato de alfafa solúvel obtido de alfafa fresca.
[0008] Existe desse modo uma necessidade de composições de alimentação de ruminante alternativa, compreendendo compostos de origem natural e que são, ambos, eficazes na redução de produção de metano e seguros para seu uso na lavoura de criação.
[0009] Os autores da presente invenção descobriram agora que, administrando uma composição de alimentação compreendendo compostos naturais para ruminantes, a emissão de metano é significativamente reduzida.
[0010] Desta maneira, em um aspecto, a presente invenção refere- se a um método para reduzir a produção de metano em ruminantes, compreendendo administrar oralmente para o dito ruminante uma composição de alimentação contendo um glicosídeo de flavanona selecionado do grupo consistindo em neoesperidina, isonaringina, poncirina, e hesperidina ou uma mistura dos mesmos.
[0011] Em uma modalidade particular da invenção, a dita composição é uma mistura compreendendo neo-esperidina e poncirina. Em uma modalidade mais particular, a dita mistura adicionalmente compreende naringina. Em uma modalidade preferida, a dita mistura é um extrato de planta natural. Em uma modalidade mais preferida, a dita planta é um extrato de planta cítrica.
[0012] Em uma modalidade particular da invenção, a dita composição adicionalmente compreende um veículo. Em uma modalidade preferida, o dito veículo é espuma-do-mar (sepiolita).
[0013] Em uma modalidade particular, a dita composição é uma mistura compreendendo 25 a 55 % em peso de naringina, 10% a 20% em peso de neoesperidina, 1% a 5% em peso de poncirina e quantidade suficiente até 100% em peso de um veículo. Em uma modalidade preferida, a dita composição compreende 40 a 50 % em peso de naringina, 11 a 15 % em peso de neoesperidina, 3 a 5 % de poncirina e quantidade suficiente até 100% em peso de um veículo.
[0014] Em uma modalidade particular da invenção o dito ruminante é um bezerro, uma vaca, um búfalo, uma ovelha, um cervo ou uma abra. Em uma modalidade preferida, o dito ruminante é um bezerro.
[0015] Em uma modalidade particular, a composição da invenção é adicionada para alimentar de forma sólida e em uma concentração de 50 a 1000 mg/Kg de DM. Em uma modalidade preferida, a composição é adicionada em uma concentração de 200 a 500 mg/Kg de DM.
[0016] Figura 1 representa o perfil da produção de biogás e metano. Média de doses usadas no sistema de simulação "in vitro" obtidas com porção (controle) não suplementada ou suplementada com diferentes tipos de flavonoides.
[0017] Como explicado acima, os autores da presente invenção descobriram que administrando para um ruminante uma composição de alimentação compreendendo flavonoides, em particular, glicosídeos de flavanona, as emissões de metano são significativamente reduzidas.
[0018] Desta maneira, em um aspecto, a presente invenção refere- se a um método para reduzir produção de metano em ruminantes compreendendo administrar oralmente para o dito ruminante uma composição de alimentação contendo um glicosídeo de flavanona selecionado do grupo consistindo em neoesperidina, isonaringina, poncirina, e esperidina ou uma mistura das mesmas.
[0019] O termo “ruminante”, como usado aqui, refere-se a qualquer mamífero artiodáctilo da subordem Ruminantia. Os ditos mamíferos mastigam o alimento ruminando e tem um estômago de quatro compartimentos, um dos quais é o rúmen. O grupo inclui, entre outros, cervo, antílopes, búfalo, gado, ovelha, camelo, e cabra.
[0020] O termo “flavonoides”, como usado aqui, se refere a uma classe de pigmentos de vegetais hidrossolúveis produzindo pigmentação amarela ou vermelha/azul em pétalas. O termo “flavanonas” se refere a um tipo de flavonoides. Flavanonas são geralmente glicosiladas por um dissacarídeo na posição sete para dar “glicosídeos de flavanona”.
[0021] Como é mostrado nos exemplos abaixo, os inventores surpreendentemente descobriram que as emissões de metano são significativamente reduzidas administrando para ruminantes uma composição de alimentação de acordo com a presente invenção.
[0022] A produção de metano pelos ruminantes pode ser medida usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o método Rastreador de Hexafluoreto de Enxofre (SF6) é uma técnica que permite medir o metano de vacas individuais no campo, usando recipientes evacuados em torno do pescoço da vaca, que continuamente amostra a respiração expirada. Outros métodos incluem câmaras de respiração de circuito aberto, que são salas lacradas e controladas climaticamente, em que cada uma aloja uma única vaca, permitindo a análise de todos os gases produzidos pelo animal.
[0023] O metano emitido pode também ser medido por técnicas de espectroscopia de infravermelho, cromatografia de gás, espectroscopia de massa, e diodo a laser ajustável, técnicas de cercado (por exemplo, calorimetria da respiração) equações de previsão baseadas no equilíbrio de fermentação de características de alimento, técnicas de rastreador isotópico, etc.
[0024] Além disso, a produção de metano pode ser medida “in vitro”. Neste caso, o fluido de rúmen é coletado do animal e incubado com um meio de incubação sob condições anaeróbicas.
[0025] Em uma modalidade particular da invenção, a dita composição é uma mistura compreendendo neoesperidina e poncirina. Em uma modalidade mais particular, a dita mistura compreende neoesperidina, poncirina e naringina. Em uma outra modalidade particular da invenção, a dita mistura é na forma de um extrato de planta natural. Em uma modalidade preferida, o dito extrato de planta é um extrato de planta cítrica, e mais preferivelmente um extrato de planta de laranja azeda, o dito extrato contendo diferentes flavanoides, in particular, glicosídeos de flavanonas. Em uma modalidade preferida, o dito extrato de planta contém uma mistura de neoesperidina, poncirina e naringina. Como é mostrado nos Exemplos abaixo, o dito extrato de planta é um extrato de planta natural compreendendo cerca de 20% em peso de naringina e 40% em peso de extrato de laranja azeda (25 a 27 % de naringina; 11 a 13 % de neoesperidina e 3 a 5 % de poncirina). Em um caso particular, o dito extrato de planta natural está comercialmente disponível (Bioflavex®).
[0026] Desta maneira, de acordo com a presente invenção, as flavanonas da composição da presente invenção podem ser obtidas de uma planta, mais particularmente, de uma planta cítrica.
[0027] Todos os componentes na composição, de acordo com a presente invenção, são produtos de origem natural e facilmente podem ser obtidos. Além disso, quando a composição é na forma de uma mistura, a dita mistura é fácil de manusear e pode ser preparada de acordo com procedimentos de formulação industrial conhecidos dos versados no campo.
[0028] O termo “cítrico”, como usado aqui, refere-se à uma planta do gênero Cítrico. Exemplos de ditas plantas cítricas incluem Citrus maxima (Pomelo), Citrus medica (Citron) Citrus reticulate (laranja Mandarin), Citrus aurantium (laranja azeda), Citrus latifolia (lima da Pérsia), Citrus limon (Limão) Citrus paradisi (Toronja), Citrus sinensis (Laranja doce), Citrus trifoliata (Laranja Trifoliado), etc.
[0029] Métodos para o isolamento de flavanoides de plantas são bem conhecidos no estado da técnica. Em um caso particular, o extrato de laranja azeda pode ser obtido de frutos cítricos da terra (especialmente Citrus aurantium) através de métodos comuns bem conhecidos da pessoa versada na técnica, tais como extração, filtragem, concentração, precipitação, clarificação e secagem final. Processos de extração podem ser realizados em sistemas de alcanol binário/água, em que o alcanol é selecionado de metanol, etanol, propanol e similares. Metanol é preferivelmente usado. Como um exemplo ilustrativo, não limitativo, 50 g de laranja azeda seca são extraídas com 300 ml de metanol. A suspensão é centrifugada para separar o resíduo, e a outra substância líquida é concentrada à vácuo para um volume final de 50 ml. O líquido resultante é deixado permanecer na temperatura ambiente durante cinco dias, filtrado para separar material insolúvel, concentrado, filtrado novamente através de através de um leito de terra diatomácea e secado por atomizador.
[0030] Em uma modalidade particular, a dita flavanona pode ser obtida da fruta de uma planta cítrica. Por exemplo, naringina é uma flavanona glicosilada obtida da casca de algumas frutas cítricas tal como toranja (Citrus paradise) e laranja azeda (Citrus aurantium). Descobriu-se também na polpa da fruta e nas folhas, flores e sementes da planta. Métodos ilustrativos, não limitativos, para o isolamento de flavonoides, de acordo com a presente invenção são, por exemplo, aqueles descritos nos documentos US2421063A e US2421062A, em que um método para a recuperação de naringina do material da planta é descrito. Também, a hesperidina pode ser obtida de acordo com os métodos descritos nos documentos US2442110A, US2348215A e US2400693A. Da mesma maneira, a neoesperidina pode ser obtida de acordo com o método descrito no documento US3375242A. US3375242A descreve um método para produzir neoesperidina, em que naringina é reagida com isovanilina para produzir neoesperidina chalcona. Esta chalcona é depois ciclizada para render neoesperidina.
[0031] Adicionalmente, as flavononas da composição da presente invenção podem ser facilmente obtidas, uma vez que elas estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, como é mostrado nos exemplos que acompanham a presente invenção, isonaringina, neoeritrocina e poncirina são compradas de INDOFINE Chemical Company, Inc (USA). Também, como descrito acima, o dito extrato de planta natural de acordo com a presente invenção está comercialmente disponível (Bioflavex®).
[0032] Em uma modalidade particular da invenção, a dita composição é uma mistura compreendendo 25 a 55 % em peso de naringina, 10% a 20% em peso de neoesperidina, 1% a 5% em peso de poncirina e quantidade suficiente, até 100% em peso, de um veículo. Em uma modalidade mais particular, a dita composição compreende 40 a 50 % em peso de naringina, 11 a 15 % em peso de neoesperidina, 3 a 5 % de poncirina e quantidade suficiente até 100% em peso de um veículo.
[0033] De acordo com outra modalidade preferida da presente invenção, a composição compreende um veículo. Em uma modalidade particular, o dito veículo é sepiolita. Sepiolita é um mineral de argila de ocorrência natural de origem sedimentar. É uma argila de não tumefação, de peso leve, porosa com grande área de superfície específica. Quimicamente, sepiolita é um silicato de magnésio hidratado em que as partículas individuais têm uma morfologia do tipo agulha. A área de superfície alta e a porosidade dessa argila são responsáveis por sua excepcional capacidade de absorção para líquidos. Essas propriedades a tornam um material valioso para uma grande faixa de aplicações tais como ninhadas de animais domésticos, aditivos de alimentação animal, veículos, absorventes, aditivos de suspensão e tixotrópicos e agentes de espessamento.
[0034] De acordo com o método da invenção, emissões/produções de metano são reduzidas em ruminantes quando os animais são alimentados com uma composição de acordo com a presente invenção, compreendendo flavonoides de origem natural. A eficiência da alimentação tem uma relevância econômica na indústria do cultivo. Está sendo sabido que compostos que inibem metanogênese em ruminantes resultam em um desvio da fermentação do rúmen para produzir um mais desejável perfil de ácidos graxos, aumentando a proporção de propionato em vez de acetato, desse modo a fermentação energética de rúmen se torna mais eficiente (ver Patentes U.S. Nos. 3.745.221; 3.615.649; e 3.862.333). É, desta maneira, um objetivo adicional da presente invenção prover um método para a inibição de metanogênese em animais ruminantes com o efeito benéfico resultando na fermentação microbial do rúmen aumentando a eficiência da utilização da alimentação. Como é mostrado nos exemplos abaixo, as composições de acordo com a presente invenção diminuíram os níveis de metano produzido e desviaram a produção de ácidos graxos voláteis em favor do ácido propiônico.
[0035] Métodos para a determinação de ácidos graxos voláteis são bem conhecidos na técnica. Tipicamente, são usados métodos cromatográficos tais como HPLC ou cromatografia de gás com detecção de ionização de chama.
[0036] A maneira de alimentar não está restrita a qualquer uma em particular, e a composição de alimentação da presente invenção pode ser dada por fertilizante de topo sobre o composto da alimentação, ou alimentando depois da presente composição de alimentação ser misturada com o alimento de composto. Além disso, a quantidade de alimentação não está restrita, desde que a metanogênese seja eficientemente reduzida enquanto o equilíbrio de nutrientes não é adversamente afetado.
[0037] Desse modo, em uma modalidade preferida da invenção, a dita composição é adicionada à alimentação em forma sólida. Em uma modalidade particular, a dita composição é adicionada em uma concentração de 50 a 1000 mg/Kg DM (matéria seca). Em uma modalidade mais particular, a dita composição é adicionada à alimentação em forma sólida a uma concentração de 200 a 500 mg/Kg DM.
[0038] A composição de acordo com a presente invenção pode conter outros ingredientes de alimentação tais como vitaminas, enzimas, sais minerais, cereais moídos, componentes contendo proteína, componentes contendo carboidratos, farelo de trigo e/ou farelos.
[0039] A forma da composição de alimentação, de acordo com a presente invenção, não é restrita a qualquer uma em particular e pode ser em qualquer forma de uma composição de alimentação convencional, tais como pó e péletes. Também, a dita composição de alimentação pode ser produzida de acordo com o método geralmente empregado para produzir uma alimentação de composto e um suplemento de alimentação.
[0040] Em uma modalidade particular da invenção o dito ruminante é um bezerro, uma vaca, um búfalo, uma ovelha, um cervo, um camelo ou uma cabra. Em uma modalidade preferida, o dito ruminante é um bezerro.
[0041] A presente invenção será agora descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos a seguir, que não deverão de maneira alguma ser considerados como sendo limitantes do escopo da presente invenção.
[0042] Dois estudos clínicos seguindo um protocolo experimental idêntico foram projetados para estudar o efeito de flavonoides puros diferentes na fermentação do rúmen, usando um sistema simulador "in vitro" baseado no protocolo experimental descrito por Theodorou M K et al. (1994) Animal Feed Science and Technology, 48 (3), p. 185-197; Mauricio, R.M., et al. (1999) Animal Feed Science and Technology 79, 321-330.
[0043] A produção de gás foi determinada a partir de um medidor de pressão semiautomática, a relação entre os níveis de pressão e o volume de gás produzido foi calculada anteriormente.
[0044] O rúmen de vacas em forma de cânula que receberam uma ração misturada, principalmente composta de concentrado (90:10), foram usadas como doadoras de fluido de rúmen; a composição de alimentação é apresentada na Tabela 1. O inoculado foi coletado e filtrado através de uma tela cirúrgica de duas camadas e mantido em vasos térmicos. Flavonoides (Tabela 2) mais 600 mg de concentrado (Tabela 1) e 60 mg de palha de cevada como o substrato, foram dosados por triplicado nas garrafas preaquecidas (39 °C) e mantidos sob condições anaeróbicas. Flavonoides de isonaringina, neoeritrocina, poncirina foram comprados de INDOFINE Chemical Company, Inc (USA). Posteriormente 10 ml de fluido de rúmen e 40 ml de meio de incubação foramadicionados às garrafas (McDougall, El (1948) Estudos em saliva de ruminantes. 1. A composição e produção de saliva de ovelha. Biochem J. 43(1) 99-109). Uma vez que as garrafas estavam cheias e a condição anaeróbica foi aplicada, as garrafas foram lacradas e o processo de incubação foi iniciado em um banho de água quente. Leituras da pressão foram feitas em 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36 e 48 horas. Cada amostra foi incubada em triplicata em dois conjuntos ou lotes. Tabela 1. Composição química de concentrado (%) Matéria Seca, ME: Energia metabolizável. (*) 20% em peso de naringina; 40% em peso de extrato de laranja azeda; sepiolita até 100% em peso. Tabela 2: Doses de Flavonoides (mg/Kg DM) usadas no primeiro e no segundo experimentos.
[0045] Depois 12 horas de incubação, uma garrafa (replicado) de cada tratamento foi aberta, o pH foi registrado e a garrafa foi amostrada para análises de ácidos graxos voláteis (Jouany, J.P., 1982 Science des Aliments 2, 131–144), lactato (Taylor, K.A.C.C., 1996. Appl. Biochem. Biotechnol. Enzym. Eng. Biotechnol. 56, 49-58) e análise de amônia (Chaney, A.L., Marbach, E.P., 1962. Clin. Chem. 8, 130-132). O DNA ambiental foi extraído usando a técnica proposta por Yu e Morrison (2004). Quantificação de DNA de Streptococcusbovis , M elsdenii y S. bovis, Megasphaera elsdenii e Selenomonasruminantium ruminantium foi feita por qPCR usando iniciadores específicos (Tajima, K. et al. 2001. Appl. Environ. Microb. 67, 2766-2774; Ouwerkerk, D., et al. 2002. J. Appl. Microbiol. 92, 753- 758). Os resultados foram analisados estatisticamente usando o procedimento PROC MIXED de embalagem estatística de SAS (SAS, 2000, User's guide: Statistics, versão 8 edições inst., Inc., Cary, NC). A menor diferença significativa foi usada para comparar os meios. Diferenças entre meios em que P <0,05 foi aceito como significativo.
[0046] A Figura 1 mostra a cinética de gás e produção de metano quando a cultura "in vitro" de fluido ruminal foi suplementada com diferentes tipos e doses de flavonoides. Os perfis representam os valores médios para ambas as doses. Valores médios para cada tratamento, dose e tempo de amostragem são apresentados na Tabela 3 junto com a análise estatística dos resultados.
[0047] Os níveis de produção de gás aumentaram exponencialmente com o tempo de incubação. A adição de flavonoides alterou significativamente a produção de biogás (P <0,05), embora esta mudança não tenha ocorrido homogeneamente entre as diferentes substâncias. Neoeriocitrina aumentou os níveis de produção de gás em comparação ao controle (266,7 vs. 253,72 P> 0,05), naringina não mudou (P> 0,05), enquanto o resto de polifenóis reduziu os níveis de produção média (P <0,05). Os valores mais baixos corresponderam a neoesperidina e a mistura Bioflavex® (230,7 e 233,3, respectivamente). Isonaringina, poncirina e hesperidina (236,6, 238 e 239,6, respectivamente) também reduziram a produção de gás. Níveis de inclusão (200 e 500 mg / kg) tiveram um efeito significativo (P <0,001) sobre a produção de gás, mas este efeito foi diferente de acordo com o tipo de flavonoide. O efeito de dosagem mais pronunciado foi realizado com neoesperidina.Como era de esperar Os efeitos de substâncias de flavonoides na atividade de fermentação de certas populações de archea, que são teoricamente responsáveis pela produção de metano foram analisados. . A Figura 1 (b) mostra a produção de valores de evolução de metano e a Tabela 4 apresenta valores médios e análise estatística.
[0048] O rendimento do metano médio foi mais baixo do que o biogás total produzido total. Para o controle, o rendimento de metano foi em torno de 15% da produção total de gás. ITratamentos experimentais modificaram a produção de metano média e cumulativa, mas essas mudanças foram distintas entre os tratamentos: neoeriocitrina aumentou (P <0,05) o nível de produção de metano comparado ao controle. A atividade de metanogênica não foi modificada pela inclusão de hesperidina ou naringina no meio de cultura (P <0,01). Entretanto, neoesperidina, isonaringina, poncirina e a mistura de Bioflavex diminuíram a produção de metano (P <0,05). A neoesperidina mostrou a diminuição mais pronunciada, que foi também diferente de hesperidina (P<0,05). Em geral, a dosagem "per se" não mostrou diferença significativa, exceto no caso de neoesperidina, em que a produção de metano foi mais reduzida por aumento da dose.
[0049] O projeto experimental possibilitou determinar se o efeito de flavonoides na redução de metano foi derivado de uma redução geral na atividade microbiana e produção de biogás ou, ao contrário, o flavonoide afeta especificamente as populações metanogênicas (archea).. Para este fim, a análise estatística da contribuição de metano na produção total de gás é mostrada na Tabela 5. A presença de flavonoides no meio de cultura reduziu a contribuição de metano na produção total de biogás (P <0,05),entretanto, novamente, o impacto mencionado acima foi heterogêneo.
[0050] A inclusão de neoeriocitrina (Tabela 5) aumentou significativamente a proporção de metano, mas a presença de Bioflavex e neoesperidina claramente a diminuiu (13,70 vs. 13,66 e 14,58 para neoesperidina, Bioflavex e o controle, respectivamente). O resto de polifenóis numericamente diminuiu a atividade metanogenésica, se bem que as diferenças reportadas não foram estatisticamente significativas. A dosagem (500 vs. 200 mg / kg DM) de neoeriocitrina e mistura de Bioflavex tenderam a abaixar a produção de metano embora o resto das substância de FL- não mostrou qualquer efeito e está refletido em uma interação significativa de Dose x Tipo de substância de FL- (P<0,05).
[0051] Em um segundo estudo clínico, sepiolita (como agente de enchimento) e o CBC (Complexo de Bioflavonoides Cítricos) foram testados contra uma referência negativa (sem flavonoides, CONTROL) e duas positivas (com fontes de flavonoides como neoesperidina e Bioflavex) O efeito do excipiente (sepiolita) foi nulo no gás e em termos de produção de metano (Tabela 6 e 7), enquanto o CBC reduziu moderadamente a produção de gás, mas nenhuma mudança foi detectada na produção de metano. Tabela 3. Produção cumulativa (72 horas) e média de biogás em meio de cultura de fluido de rúmen "in vitro" 1 SEM: erro de padrão da média 2Doses: 0,2 g/kg DM y 0,5 g/kg DM do substrato *P <0,05, **P <0,01, *** P <0,001 e ns Não Significativos. Médias com índices diferentes (a, b, c, d) indicam diferenças significativas entre esses meios (P <0,05). Petição 870200041984, de 01/04/2020, pág. 23/46 Tabela 4. Produção de metano média e acumulada (72 horas) em meio de fluido de cultura ruminal "in vitro" suplementada com diferentes tipos de flavonoides (tratamentos), dose e tempo de incubação. 1 SEM: erro de padrão do meio 2Doses: 0,2 g/kg DM y 0,5 g/kg DM do substrato *P <0,05, **P <0,01, *** P <0,001 e ns Não Significativos. Meios com índices diferentes (a, b, c, d) indicam diferenças significativas entre esses meios (P <0,05). Petição 870200041984, de 01/04/2020, pág. 24/46 Tabela 5, Proporção de metano em biogás produzido em cultura de fluido de rúmen "in vitro" suplementada com diferentes tipos de flavonoides (tratamentos), dose e tempos de incubação. 1 SEM: erro de padrão do meio 2Doses: 0,2 g/kg DM y 0,5 g/kg DM do substrato *P <0,05, **P <0,01, *** P <0,001 e ns Não Significativos. Meios com índices diferentes (a, b, c, d) indicam diferenças significativas entre esses meios (P <0,05). Petição 870200041984, de 01/04/2020, pág. 25/46 Tabela 6. Produção cumulativa (72h) e meio de cultura de fluido de rúmen de biogás "in vitro" suplementado com diferentes tipos de flavonoides [Tratamentos], doses e tempos de incubação. 1 SEM: erro de padrão do meio 2Doses: 0,2 g/kg DM y 0,5 g/kg DM do substrato *P <0,05, **P <0,01, *** P <0,001 e ns Não Significativos. Meios com diferentes índices (a, b, c, d) indicam diferenças significativas entre esses meios (P <0,05). Petição 870200041984. de 01/04/2020, pág. 26/46 Tabela 7. Produção de metano cumulativa e média (72 horas) em meio de cultura de fluido de rúmem "in vitro" suplementada com diferentes tipos de flavonoides [Tratamentos], doses e tempos de incubação. 1 SEM: erro de padrão do meio 2Doses: 0,2 g/kg DM y 0,5 g/kg DM do substrato *P <0,05, **P <0,01, *** P <0,001 e ns Não Significativos. Meios com índices diferentes (a, b, c, d) indicam diferenças significativas entre esses meios (P <0,05).
[0052] As médias de concentrações de ácidos graxos voláteis (VFA) e amónia (N-NH3) no meio ‘in vitro’, com ou sem flavonoides (com relação aos tipos e doses) são apresentadas na Tabela 8.. As concentrações médias (p) de ambos (VFA e N-NH3) são mostradas nas primeiras respectivas colunas seguindo suas evoluções ao longo de todo 0 tempo de incubação para cada tipo e doses de flavonoide. Numericamente, Bioflavex mostrou médias de VFA e concentrações acumuladas mais altas; entretanto as diferenças não alcançaram significado estatístico (P> 0,05). Níveis de amónia excederam os níveis de início para garantir fermentação microbina apropriada (50 mg / L). Aparentemente, a neoeriocitrina (227,84 mg / L) e mistura de Bioflavex (209,92 mg / L) mostraram os valores médios mais altos e mais baixos respectivamente.
[0053] Concentrações iniciais de VFA [valores constantes registrados a t = 0] aumentaram. Os aumentos foram maiores entre 0 e 12 horas do que os valores registrados entre 12 e 72 horas, refletindo a fermentação gradativa do substrato durante 0 tempo de incubação [isto é, 0 aumento na concentração média de VFA (mmol / L) foi 2,1 mmoles / hora no primeiro período (0-12 horas), enquanto que depois desse período estes aumentos foram reduzidos para uma média de 0,2 mmol / hora]. De acordo com a atividade de tampão da mistura de minerais, 0 aumento na concentração de VFA não foi refletido no aumento da acidez do meio. As média de valores de pH foram 6,81, 6,77±0,0034 y 6,73±0,0033 em 0, 12, e 72 horas, respectivamente. Essa estabilidade do meio é provada pelo erro de padrão restrito dos meios.
[0054] A suplementação média com fonte de carboidrato (principalmente composta de amido; isto é, concentrada) causou uma variação significativa no perfil de VFA, que leva a um aumento nas proporções de propionato (20,03, 28,20 e 26,45) e butirato (9,07, 9,88 e 10,45 em 0, 12 e 72 horas, respectivamente), enquanto uma diminuição na proporção de acetato (mol/100 mol; 62,5, 55,86 e 55,86 ) foi observada. Entretanto, os aumentos não foram homogêneos entre os diferentes tipos de flavonoide. A proporção de ácido Propiônico no meio foi melhorada por naringina, isonaringina, poncirina, mistura de Bioflavex e neoesperidina comparadas ao controle, enquanto o resto não foi. Deverá ser notado que em neoesperidina, naringina e Bioflavex a resposta para o tempo de incubação foi também modulada significativamente pelas doses (D x H: P <0,009). Em geral, um transporte de correlação negativa entre a produção de metano (Tabela 5) e a proporção de propionato (Tabela 9) foi observado, a inclusão de neoeriocitrina aumentou a proporção de metano, enquanto que o oposto foi verdadeiro no caso de neoesperidina e Bioflavex que claramente abaixaram a emissão de metano (13,70 e 13,66 vs. 14,58 para neoesperidina, Bioflavex e o controle, respectivamente) melhorando a proporção de propionato (25,7 e 25,8 vs. 24,4 (P<0,1 e 23,7 (P<0,05) para neoesperidina, Bioflavex, versus controle e proporções de propionato de neoeritrocina, respectivamente). Tabela 8. Concentração de ácido graxo volátil (VFA; mmol /1) e amónia (N-NH3; mg /1) θm culturas de fluido de ruminante "in vitro" sem suplementação (controle) ou suplementado com diferentes tipos e doses de flavonoides. 1 SEM: erro de padrão do meio 2Doses: 0,2 g/kg DM y 0,5 g/kg DM do substrato *P <0,05, **P <0,01, *** P <0,001 e ns Não Significativos. Meios com índices diferentes (a, b, c, d) indicam diferenças significativas entre esses meios (P <0,05). Tabela 9. Proporção molar (mol/100 mol) de ácidos acético, propiônico e butírico e Taxa de A / P em tempos diferentes de incubação de culturas de fluido ruminantes "in vitro" sem suplementação (controle) ou suplementados com diferentes tipos e doses de flavonoides. 1 SEM: erro de padrão do meio *P <0,05, **P <0,01, *** P <0,001 e ns Não Significativos.
[0055] A relação entre concentrações de lactato intrarruminal e disfunção de acidose tem sido experimentalmente demonstrada. Valores de concentração de lactato e produção de lactato fS. bovis) ou título de bactérias de consumo fS. ruminantium e M. elsdenii) obtidas de garrafas incubadas por 12 horas são mostrados na Tabela 10.
[0056] O efeito de suplementação com diferentes flavonoides na concentração de ácido láctico foi moderado e somente a presença de neoesperidina, hesperidina e Bioflavex tenderam para moderar o aumento registrado no período de incubação ([c] t = 0: 22,16 mg / I). Variações nas condições de fermentação descritas anteriormente (Tabelas 8 e 9) resultaram em um aumento nas concentrações de DNA microbial, Embora o aumento somente alcançou significância estatística, no caso de neoesperidina quando os títulos foram comparados contra controle, neoeriocitrina, poncirina e hesperidina. Os tratamentos experimentais não alteraram os títulos de S.bovis e S.ruminantium ,entretanto, de acordo com os resultados obtidos dos experimentos anteriores, ambas as misturas de neoesperidina e Bioflavex registraram título de M .elsdenii melhorado em comparação aos valores de controle registrados. Tabela 10: Efeito de tipo de flavonoide na concentração de ácido láctico e concentração de DNA bacteriano (mg / ml) determinado por qPCR, e quantificação relativa de populações de ruminantes de Selenomonas ruminantium, Streptococcus bovis e Megaesphera elsdenii a 12 horas de incubação em cultura de fluido de ruminante "in vitro" sem suplementação (controle), ou suplementado com tipos e doses de flavonoides diferentes.
1 SEM: erro de padrão do meio *P <0,05, **P <0,01, *** P <0,001 e ns Não Significativos. Meios com diferentes índices (a, b, c, d) indicam diferenças significativas entre esses meios (P <0,05).
Claims (5)
1. Uso de uma mistura compreendendo: 25 a 55 % em peso de naringina, 10% a 20% em peso de neoesperidina, 1% a 5% em peso de poncirina, e quantidade suficiente de até 100% em peso de sepiolita, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição de alimentação para reduzir a produção de metano em ruminantes.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito ruminante é um bezerro, uma vaca, um búfalo, uma ovelha, um cervo, um camelo ou uma cabra.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito ruminante é um bezerro.
4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dita composição é adicionada à alimentação em forma sólida em uma concentração de 50 a 1000 mg/Kg de matéria seca.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita composição é adicionada à alimentação em forma sólida em uma concentração de 200 a 500 mg/Kg de matéria seca.
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