BR112013009673A2 - anticorpos humanos e usos diagnósticos e terapêuticos destes para o tratamento de doença neurológica - Google Patents

Abstract

  ANTICORPOS HUMANOS E USOS DIAGNÓSTICOS E TERAPÊUTI-COS DOS MESMOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇA NEURO-LÓGICA. A presente invenção refere-se a membros de ligação específica, especialmente anticorpos humanos, especialmente anticorpos recom-binantes e seus fragmentos, que sejam capazes de se ligar a neurô-nios e de reconhecê-los no sistema nervoso central e de suscitar res-postas em neurônios do sistema nervoso central. Os membros da li-gação específica são úteis para a neuroproteção e no diagnóstico e no tratamento de condições associadas a danos, lesão ou degenera-ção em nervos e de doença neurodegenerativa. Os anticorpos, sequên-cias de regiões variáveis ou de domínios de CDR destes, e seus frag-mentos, podem ser utilizados também em combinação com quimiote-rápicos, imunomoduladores ou agentes neuroativos e/ou com outros anticorpos ou fragmentos destes. Os anticorpos são exemplifi-cados pelos anticorpos lgM12 e lgM42, cujas sequências são providas pela presente invenção.

Description

D.

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR-

POS HUMANOS E USOS DIAGNÓSTICOS E TERAPÊUTICOS DOS MESMOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇA NEUROLÓGICA".

Declaração de apoio concedido pelo Governo 5 A presente invenção descrita neste pedido de patente recebeu apoio, no todo ou em parte, concedido pelo National lnstitutes of Health (Subsídios N°" ROl NS 24180, ROl NS 32129, ROl CA104996, ROI CA096859), e pela National Esc/erose mú/t(p/a Society (Subsídio N° CA 1011 A8-3). O Governo dos Estados Unidos detêm certos direitos sobre a 10 invenção- Campo da invenção A presente invenção refere-se a anticorpos, especialmente a an- ticorpos recombinantes derivados de anticorpos naturais humanos e seus

N " fragmentos, os quais são capazes de se ligarem e reconhecerem neurônios W 15 no sistema neNoso central (SNC) e de suscitarem respostas em neurônios do sistema nervoso central. Estes anticorpos são úteis no diagnóstico e no tratamento de condições associadas com danos, lesão ou degeneração de neurônios. Os anticorpos, suas sequências de regiões variáveis ou de domí- nios de CDR, e fragmentos destes, da presente invenção podem ser utiliza- 20 dos também em terapia combinada com quimioterápicos, moduladores imu- nes ou agentes neuroativos e/ou com outros anticorpos ou seus fragmentcis. Esta invenção diz respeito em geral à modulação do crescimento neural no sistema nervoso central e, mais especificamente, a métodos e agentes, construções e composições associados para melhorar o crescimento neural 25 do sistema nervoso central. Antecedentes da invenção Neuroregeneração refere-se ao novo crescimento ou reparo de tecidos, células ou de produtos celuiares nervosos. Tais mecanismos podem incluir remielinização, geração de novos neurônios, glia, axônios, mielina ou 30 de sinapses. A neurodegeneração difere entre o Sistema Nervoso Periférico (SNP) e o Sistema Nervoso Central (SNC) por ambos os mecanismos fun- cionais que estão envolvidos e pela extensão e a velocidade da regenera-

*

ção- A regeneração de axônios no sistema neNoso central maduro de mamíferos é muito limitada após a Iesão.

Consequentemente, déficits funcionais persistem depois de lesão da medula espinhal (SCl), lesão cere-

5 bral traumática, acidente vascular cerebral e de condições relacionadas que envolvem a desconexão axonal.

Essa situação é diferente da ocorrida no sistema nervoso periférico de mamíferos, no qual é possÍvel ocorrer regene- ração de axônios por longas distâncias e recuperação funcional substancial.

As moléculas extracelulares e a capacidade intrínseca de crescimento influ-

lO enciam ambos o sucesso regenerativo.

Os axônios do sistema neNoso central (CNS) não se regeneram espontaneamente depois de sofrerem lesão em mamíferos adultos.

Por ou- tro lado, os axônios do sistema nervoso periférico (PNS) se regeneram rapi- t damente, permitindo a recuperação de função após danos ao nervo periféri-

,. 15 co.

Aguayo e colaboradores demonstraram que pelo menos alguns neurô- nios maduros do sistema nervoso central retêm a capacidade para se rege- nerar quando dotados de um enxerto permissivo de nervo periférico (Ri- chardson PM, McGuinness UM, Aguayo AJ (1980) Nature 284:264-265; Ri- chardson PM, lssa VM, Aguayo AJ (1984) J Neurocytol 13:165-182; David S,

20 Aguayo AJ (1981) Science 214:931-933; Benfey M, Aguayo AJ (1982) Natu- re 296:150-152). Esse trabalho sugeriu que o ambiente do sistema nervoso periférico é estimulador e/ou que o ambiente do sistema nervoso central é inibidor para o crescimento de axônio.

Estudos subsequentes identificaram tanto fatores promotores do crescimento no sistema nervoso periférico como

25 fatores inibidores do crescimento no sistema nervoso central. lnibidores da regeneração incluem proteínas específicas na mielina e em moléculas do sistema nervoso associadas com a cicatriz astroglial.

Adicionalmente, a de- puração mais lenta de resíduos no sistema nervoso central, em relação ao periférico, pode impedir o novo crescimento axonal.

Compreender os fatores

30 que influenciam o crescimento de axônios é fundamental para o desenvolvi- mento de agentes terapêuticos que promovam a regeneração do sistema nervoso centra).

Após a lesão do nervo periférico, os axônios se regeneram rapi- damente.

A porção distal do axônio, que é desconectada do corpo celular, sofre degeneração Walleriana.

Esse processo ativo resulta em fragmentação e desintegração do axônio.

Os resíduos são removidos por células gliais,

5 predominantemente macrófagos.

Os axônios proximais podem então se re- generar e reinervar seus alvos, permitindo a recuperação de função.

As duas principais classes de inibidores da regeneração do sis- tema nervoso central são os inibidores associados à mielina (MAIS) e os pro- teoglicanos do tipo sulfato de condroitina (CSPGS). Estas moléculas limitam

10 a regeneração de axônios, e a interferência em sua função permite que al- gum grau de crescimento no sistema nervoso central do adulto seja alcan- çado.

Fatores autônomos das células são também importantes determinan- tes de falha na regeneração do sistema nervoso central.

Os neurônios do !\ sistema nervoso central não regulam positivamente genes associados ao

W 15 crescimento na mesma medida que os neurônios do sistema nervoso perifé- rico.

Consequentemente, a habilidade que possuem para se regenerar é res- tringida mesmo na ausência de inibidores.

Aumentar a capacidade intrínseca de crescimento dos neurônios permite regeneração modesta dos axônios dentro do sistema nervoso central (Bomze HM et al (2001) Nat Neurosci

20 4:38-43; Neumann S, Woolf CJ (1999) Neuron 23:83-91). MAIS são proteínas expressas por oligodendrócitos como com- ponentes da mielina no sistema neNoso central.

Os MAIS comprometem o crescimento de neuritos in vitro e acredita-se que restrinjam o crescimento de axônios in vivo após danos ao sistema nervoso central.

Os MAIs incluem

25 Nogo-A (Chen MS et aj (2000) Nature 403:434-439; GrandPre T et al (2000) Nature 403:439-44), glicoproteína associada à mielina (MAG) (Mckerracher L et al (1994) Neuron 13:805-811), glicoproteína da mielina dos oligodendró- citos (OMgp) (KOttis V et al (2002) J Neurochem 82:1566-1569), efrina-83 (Benson MD et al (2005) Proc Nat Acad Sci USA 102:10694-10699) e Sema-

30 forina 4D (Sema4D) (Moreau-Fauvarque C et al (2003) J Neurosci 23:9229- 9239). Três destes (Nogo-A, MAG e OMgp) interagem com receptor Nogo- 66 1 (NgR1) neuronai para limitar o crescimento de axônios.

Estes três ligan-

P tes estruturalmente não relacionados mostram também áfitiidadé por um segundo receptor inibidor do crescimento, o receptor pareado similar à imu- noglobulina B (Pir8) (Atwal JK et al (2008) Science 322:967-970). Diversas moléculas de reconhecimento que atuam como sinais 5 moleculares subjacentes à promoção e/ou a inibição do crescimento de neu- ritos foram identificadas. Entre as moléculas de reconhecimento que promo- vem o crescimento de neuritos, a molécula de adesão de célula neural Ll desempenha uma função proeminente na mediação do crescimento de neu- ritos (Schachner M (1990) Seminars in the Neurosciences 2:497-507). O 10 crescimento de neuritos dependente de Ll é mediado por interação hornofí- lica. A L1 intensifica o crescimento de neuritos que expressam Ll, de células de Schwann e de fibroblastos transfectados com Ll (Bixby et al (1982) Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 84:2555-2559; Chang et al (1987) J Ce// Biol 104:355-

N ' 362; Lagenaur et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:7753-7757; Seilhei- . 15 mer et al (1988) J Ce// B/o/ 107:341-351; Kadmon et al (1990) J Cell Biol 110:193-208; Wiliiams et al (1992) J Ce// Biol 119:883-892). Lesões no sistema nervoso afetam mais de 90.000 pessoas ao ano, e um número muito maior quando eventos vasculares cerebrais, tais como acidentes vasculares cerebrais, são incluídos. Estima-se que apenas 20 lesões da medula espinhal afetem 10.000 ao ano. Como resultado dessa alta incidência de lesões neurológicas, a regeneração e o reparo de neNos, um campo secundário da engenharia do tecido neural, estão se tomando um campo em rápido crescimento dedicado à descoberta de novas maneiras para recuperar a funcionalidade dos nervos depois de lesões. O sistema 25 neNoso é dividido em duas partes: o sistema nervoso central, que consiste no cérebro e na medula espinhal, e o sistema nervoso periférico, formado por nervos cranianos e espinhais juntamente com seus gânglios associados. Embora o sistema nervoso periférico seja dotado de capacidade intrínseca para reparo e regeneração, o sistema nervoso central é, comparativamente 30 e na maioria das vezes, limitado em sua capacidade para se reparar e rege- nerar. Não há atualmente qualquer tratamento aceito e aprovado para recu- perar a função de nervos humanos após lesão ao sistema nervoso central.

» A proteção e o reparo de axônios após lesão à medula espinhal (SCl) exibem grande potencial como estratégia eficaz para prevenir a perda de neurônios motores e a incapacidade permanente. A proteção a neurônios foi conseguida utilizando fatores tróficos direcionados para prevenir o dano e 5 para promover o reparo de axônios após a lesão. Essas moléculas foram predominantemente identificadas por meio de estratégias de seleção com base em sistemas in vitro cujo enfoque era direcionado a fatores neurotrófi- cos específicos formados por pequenas moléculas. Embora estas moléculas demonstrassem resultados neuroprotetores em modelos pré-clínicos, os re- lO sultados de estudos clínicos foram menos favoráveis. Anticorpos monocfonais naturais autorreativos demonstraram funções biológicas benéficas em células do SNC em múltiplos modelos de lesão e doença- A promoção mediada por anticorpos de sobrevida de neurô- r nios, regeneração de axônios e recuperação funcional foram demonstradas . 15 in v/vO utilizando a lgM monoclonal de camundongos IN-1 (Bregman BS et al (1995) Nature 378(6556):498-501; Caroni P, Schwab ME (1988) Neuron 1(1):85-96). Resultados similares foram obtidos pela imunização com homo- genato de medula espinhal (SCH) antes do dano ao SNC (Ellezam B, Ber- trand j, Dergham P, McKerracher L (2003) Neurobiol Dis 12(1):1-10; Huang 20 DW et al (1999) Neuron 24(3):639-647). A esclerose múltipla (MS) é uma doença inflamatória crônica, frequentemente progressiva, do sistema nervoso central (SNC) que é carac- terizada patologicamente por desmielinização primária, geralmente sem Ie- são axonal inicial. A etiologia e a patogênese da MS são desconhecidas.

25 Diversas características imunológicas da MS, e sua associação moderada com certos alelos do complexo principal de histocompatibilidade, provoca- ram a especulação de que a MS seria uma doença mediada pelo sistema imunológico. Uma hipótese de autoimunidade é apoiada pelo modelo de en- cefalomielite autoimune (alérgica) experimental (EAE), no qual a injeção de 30 certos componentes da mielina em animais geneticamente suscetíveis leva à desmielinização do SNC mediada por células T. Contudo, autoantígenos específicos e células T patogênicas reativas à mielina não foram definitiva-

P mente identificadas no SNC de pacientes com MS, nem a MS é associada com outras doenças autoimunes.

Uma hipótese alternativa, com base em dados epidemiológicos, é de que um fator ambiental, talvez um vÍrus não identificado, precipite uma resposta inflamatória no SNC, que leva à destrui-

5 ção direta ou indireta ("bystandeF' [efeito de presença]) de mielina, potenci- almente com um componente autoimune induzido.

Esta hipótese é apoiada pela evidência de que diversas infecções virais de ocorrência natural, em seres humanos e em animais, podem causar desmielinização.

Um modelo viral experimental comumente utilizado é induzido pelo vÍrus da encefalomie-

lO lite murina de Theiler (TMEV) (Dal Canto, M.C., and Lipton, H.L., Am.

J.

Pa- th., 88:497-500 (1977)). A eficácia Iimitada das terapias atuais para a esclerose múltipla e para outras doenças desmielinizantes ou neurodegenerativas estimulou o h interesse em novas terapias que melhorem estas doenças.

Contudo, em vir-

. 15 tude da etiopatogênese aparentemente complexa destas doenças, possi- velmente envolvendo fatores ambientais e autoimunes, ainda existe a ne- cessidade de um tratamento eficaz para estes transtornos desmilienizantes.

No caso da esclerose múltipla, a desmielinização resulta no final em morte da célula nervosa.

Contudo, a morte de axônios após a desmielini-

20 zação não é imediata.

Se fornecidas moléculas ou células de apoio apropri- adas, o sistema nervoso possui uma capacidade significante para o reparo- Proteger axônios do sistema nervoso central promete ser uma estratégia eficaz para limitar a perda de axônios sobreviventes e para prevenir a inca- pacidade permanente.

A neuroproteção pode ser conseguida modulando o

25 ambiente inflamatório potencialmente neurotóxico em lesões.

Reagentes destinados a limitar a excitotoxicidade, inibir óxido nítrico ou bloquear canais iônicos estão em estudo como métodos para proteger axônios em perigo (Pitt, D., P.

Werner, and C.

S.

Raine (2000) Nat Med 6:67-70; Okuda, Y et al (1997) joumal of neumimmunology 73:107-116; Waxman, S.

G. (2002) .J

30 Rehabil Res Dev 39:233-242). Muitos destes reagentes são pequenas molé- culas com toxicidade demonstrada e que atuam sistemicamente em todas as células.

q 7/176

«

Foram identificados autoanticorpos monoclonais humanos que exibem atividade no sistema nervoso central e que foram especialmente as- sociados com a estimulação de remielinização.

Seria desejável identificar, caracterizar e desenvolver anticorpos monoclonais humanos com atividade

5 no sistema nervoso central, especialmente anticorpos recombinantes com essas atividades e com a capacidade para promover regeneração neural e/ou para proteger neurônios contra doença, lesão, danos e/ou morte.

A pre- sente invenção é direcionada à conquista desse objetivo.

A citação de referências neste pedido de patente não será inter-

lO pretada como admissão de que estas representam a técnica anterior a esta invenção.

Sumário da invenção A invenção refere-se a agentes neuromoduladores com eficácia « específica no sistema nervoso central, agentes estes que compreendem um

. 15 material selecionado a partir do grupo constituído por um anticorpo do subti- po lgM, seus fragmentos ativos, seus monômeros, seus agonistas e combi- nações destes.

Os agentes neuromoduladores ou anticorpos da invenção possuem uma ou mais das seguintes características: protegem e/ou estabili- zam neurônios; têm como alvo sÍtios do sistema nervoso central ou dano,

20 comprometimento ou lesão de células nervosas; reduzem ou bloqueiam mor- te celular, por exemplo, morte celular induzida por peróxido de hidrogênio.

A invenção provê anticorpos monoclonais que se ligam a neurô- nios e dotados da capacidade para promover a extensão de neurônios, atuar em neuroregeneração e/ou para proteger neurônios de danos, para fins d1-

25 agnósticos e terapêuticos, no sistema nervoso central.

Em particular, são providos anticorpos recombinantes especlficos, em que os referidos reco- nhecem e são capazes de se ligar a neurônios, incluindo neurônios corticais, neurônios do hipocampo, células granulares do cerebelo e células ganglio- nares da retina.

A presente invenção provê anticorpos inteiramente humanos

30 recombinantes.

Os anticorpos da presente invenção possuem utilização di- agnóstica e terapêutica em condições ou doenças associadas com compro- metimento, danos ou lesão a nervos.

Em um aspecto geral, a presente invenção provê anticorpos di- recionados contra e capazes de se Iigarem a um ou mais epítopos em neu- rônios, incluindo neurônios corticais, neurônios do hipocampo, células granu- lares do cerebelo e células ganglionares da retina.

Em um aspecto amplo, a

5 presente invenção provê um membro de Iigação específica isolado, especi- almente um anticorpo ou seu fragmento, incluindo um anticorpo humano re- combinante, o qual reconhece, se liga e/ou cujo alvo é neurônios.

A inven- ção provê um anticorpo, especialmente um anticorpo humano, especialmen- te um anticorpo IgM, que se liga especificamente a neurônios e os protege

10 contra morte celular e que não promove a remielinização.

O anticorpo da invenção possui utilização em tratar ou melhorar doenças ou condições em mamiferos nas quais nervos estão comprometidos, lesados ou danificados ou estão em risco dessas ocorrências, incluindo em lesão na medula espi- . nhal (SCl), lesão cerebral traumática (TBI), esclerose lateral amiotrófica

. 15 (ALS), esclerose múltipla (MS), doença de Alzheimer, acidente vascular ce- rebral, doença de Parkinson, doença de Huntington, anóxia pré-natal/isque- mia perinatal, paralisia cerebral, encefalopatia, mielopatia ou doenças do neurônio motor, e especialmente na proteção, sobrevida ou manutenção de neurônios e da capacidade neurológica nestas doenças.

Em um aspecto

20 especifico, a presente invenção provê um anticorpo ou seu fragmento, que é um anticorpo 12 ou 42, especialmente lgM12 ou IgM42 recombinante ou de-

rivada de soro.

Em um aspecto da invenção, é provido um anticorpo recombi- nante ou sintético que se liga a neurônios, compreendendo as sequências

25 de CDRs da região variável especificadas na Figura 5 e/ou 6. O Anticorpo 12 compreende as sequências de CDRS de cadeia pesada: CDRI GGSVSLYY (SEQ ID NO:31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO:32) e CDR3 ARSA- SIRGWFD (SEQ ID NO:33), e as sequências de CDRS de cadeia leve: C- DRI QSISSY (SEQ IDNO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO:35) e CDR3 QQS-

30 YHTPW (SEQ ID NO:36), conforme especificadas na Figura 5. O Anticorpo 42 compreende as sequências de CDRS de cadeia pesada: CDRI GFTFST- YA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO:38) e CDR3 VR-

RSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO:39), e as sequências de CDRS de cadeia leve: CDRI QGlG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO:41) e CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42), conforme especificadas na Figura 6. Assim sendo, anticorpos recombinantes que tenham como base as CDRS do(s) 5 anticorpo(s) aqui identificados serão úteis para serem direcionados e prote- gerem neurônios, especialmente neurônios suscetíveis, comprometidos, da- nificados ou lesados em doenças ou em cânceres. A invenção provê, por conseguinte, anticorpos lgM humanos iso- lados ou seus fragmentos que se ligam especificamente a neurônios e os 10 protegem contra morte celular e que não promovem remielinização, em que o anticorpo ou fragmento compreende: (a) as sequências de aminoácidos de domínios da cadeia variável pesada: CDRI GGSVSLYY (SEQ ID NO:31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO:32) e CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID

N NO:33), e as sequências de CDRS da cadeia leve variável: CDRI QSISSY . 15 (SEQ IDNO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO:35) e CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO:36), conforme especificadas na Figura 5; ou (b) as sequências de ami- noácidos de domínios da cadeia variável pesada:CDR1 GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO:38) e CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO:39), e as sequências de CDRS da cadeia Ieve variável: CDRI 20 QGlG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO:41) e CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42), conforme especificadas na Figura 6, para uso em tratar ou doenças ou condições em mamíferos nas quais nervos estão comprometi- dos, lesados ou danificados ou em risco dessas ocorrências. Em um aspecto específico adicional, o anticorpo da invenção 25 compreende a sequência de aminoácidos do Anticorpo 12 ou 42, inclusive conforme especificadas na Figura 5 e/ou Figura 6. O anticorpo recombinante lgM12 da presente invenção compreende a sequência da cadeia pesada variável (SEQ ÍD NO: 1) e a sequência da cadeia leve variável (SEQ ID NO: 11) conforme especificadas na Figura 5. O anticorpo recombinante lgM42 da 30 presente invenção compreende a sequência da cadeia pesada variável (SEQ ID NO: 17) e a sequência da cadeia leve variável (SEQ ID NO: 27) conforme especificadas na Figura 6. Em um aspecto específico da invenção,

.

os anticorpos recombinantes são anticorpos recombinantes inteiramente humanos, compreendendo região variável, região constante da cadeia pesa- da humana e cadeia J humana. A presente invenção provê anticorpos lgM12 recombinantes inteiramente humanos, compreendendo a cadeia pesada de 5 imunoglobulina huniana, incluindo região variável (SEQ ID NO: 1), ou as CDRS desta, uma região constante humana, especialmente uma sequência kappa (SEQ ID NO: 3, 5, 7 e 9) e cadeia J humana (SEQ ID NO:15) confor- me especificadas na Figura 5. Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um anti- lO corpo isolado ou seu fragmento capaz de se ligar a um antígeno, em que o referido anticorpo ou seu fragmento compreende um domínio polipeptídico de Iigação contendo uma sequência de aminoácidos substancialmente con- forme especificada neste relatório descritivo e na Figura 6. A invenção provê + ^ um anticorpo humano isolado ou seu fragmento capaz de se ligar a neuro- k . 15 nios, em que o referido anticorpo ou seu fragmento compreende uma região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 17), ou as CDRs desta, e uma regi- ão variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 27), ou as CDRS desta, ou que compreende uma sequência de aminoácidos substancialmente conforme especificada neste relatório descritivo e na Figura 6.

20 Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um anti- corpo inteiramente humano isolado ou seu fragmento capaz de se ligar a um antlgeno, em que o referido anticorpo ou seu fragmento compreende um domlnio polipeptídico de ligação incluindo uma sequência de aminoácidos substancialmente conforme especificada neste relatório descritivo e na Figu- 25 ra 5. A invenção provê um anticorpo inteiramente humano isolado ou seu fragmento capaz de se ligar a neurônios, em que o referido anticorpo ou seu fragmento compreende uma região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 1), ou as CDRS desta, e uma região variável de cadeia Ieve (SEQ ID NO: 11), ou as CDRS destas, ou que compreende uma sequência de aminoáci- 30 dos substancialmente conforme especificada neste relatório descritivo e na Figura 5. A invenção especialmente provê um anticorpo lgM humano isolado ou seu fragmento ativo, compreendendo as sequências de aminoácidos de

>'

domínios CDRS da cadeia pesada variável: CDRI GGSVSLYY (SEQ ID NO:31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO:32) e CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO:33), as sequências de CDRs da cadeia leve variável: CDRI QSISSY (SEQ IDNO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO:35) e CDR3 QQSYHTPW

5 (SEQ ID NO:36), conforme especificadas na Figura 5. Em um aspecto espe- cÍfico, a invenção provê um anticorpo lgM recombinante inteiramente huma- no isolado ou seu fragmento ativo, compreendendo as sequências de ami- noácidos de domínios CDRs da cadeia pesada variável: CDRI GGSVSLYY (SEQ ID NO:31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO:32) e CDR3 ARSA-

lO SIRGWFD (SEQ ID NO:33), e as sequências de CDRS da cadeia leve variá- vel: CDRI QSISSY (SEQ IDNO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO:35) e CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO:36), uma região constante humana e uma se- quência de cadeia J humana conforme especificada na SEQ ID NO: 15. « Em aspectos adicionais, a invenção provê um ácido nucleico iso-

. 15 lado que compreende uma sequência codificadora de um polipeptídeo de Iigação a neurônios ou anticorpo conforme definido acima, e métodos para preparar poIipeptídeos ou anticorpos da invenção, os quais compreendem expressar os referidos ácidos nucleicos em condições que ocasionem a ex- pressão do referido polipeptídeo ou anticorpo, e recuperar o polipeptídeo ou

20 anticorpo.

Em um de tais aspectos, é provido um ácido nucleico que codifica uma sequência de região variável de anticorpo tendo as sequências de ami- noácidos conforme especificadas nas Figuras 5 ou 6, ou é provido um anti- corpo tendo sequências de domínios de CDR conforme especificadas nas Figuras 5 ou 6. Em um aspecto, é provido um ácido nucleico compreenden-

25 do a sequência de ácido nucleico da Figura 5 ou 6. Em um aspecto adicio- nal, é provido um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada VH ou uma região variável de cadeia L conforme especificado na Figura 5 ou 6. A presente invenção diz respeito também a uma molécula de DNA recombinante ou gene clonado, ou uma variante degenerada deste,

30 que codifica um anticorpo da presente invenção; de preferência uma molécu- Ia de ácido nucleico, especialmente uma molécula de DNA recombinante ou gene clonado, que codifica VL e VL do anticorpo, especialmente as sequên-

cias de regiões CDR, que possua uma sequência ou que seja capaz de codi- ficar uma sequência mostrada na Figura 5 ou 6. Em aspectos preferidos, a invenção provê um ácido nucleico que codifica uma sequência de região va- riável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 2) e de cadeia leve (SEQ ID NO: 12) e

5 lgM12, e um ácido nucleico que codifica uma sequência de região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO:18) e de cadeia leve (SEQ ID NO: 28) de lgM42. Em um aspecto da invenção, é provido um ácido nucleico que codifi- ca um anticorpo ou seu fragmento contendo as sequências de aminoácidos de domínios CDR da cadeia pesada variável: CDRI GGSVSLYY (SEQ ID

10 NO:31). CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO:32) e CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO:33), e as sequências de CDRs de cadeia Ieve variável: CDRI QSISSY (SEQ IDNO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO:35) e CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO:36). Em um aspecto adicional, o ácido nucleico codifica ainda uma região constante humana e uma cadeia J humana, especialmente a

. 15 cadeia J da SEQ ID NO: 15. Em um aspecto da invenção, é provido um áci- do nucleico que codifica um anticorpo ou seu fragmento, incluindo as se- quências de aminoácidos de domínios CDRS da cadeia pesada variável: CDRI GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO:38) e CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO:39), e as sequências de CDR da

20 cadeia leve variável: CDRI QGlG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO:41) e CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42). Em um aspecto ad icional, o ácido nucleico codifica ainda uma região constante humana e uma cadeia J humana, especialmente a cadeia J da SEQ ÍD NO: 15. Os anticorpos, seus fragmentos e os anticorpos recombinantes

25 compreendendo as sequências de região variável de acordo com a invenção podem ser utilizados em um método de tratamento, prevenção ou diagnósti- co do corpo humano ou animal, tal como um método de neuroproteção em um mamífero, o qual compreende administrar ao referido mamífero uma quantidade eficaz dos anticorpos, de seus fragmentos ou dos anticorpos re-

30 combinantes da invenção.

Anticorpos recombinantes ou seus fragmentos compreendendo as sequências da região de domínios CDR de acordo com a invenção podem ser utilizados em um método de neuroproteção em um te

W,

mamífero, o qual compreende administrar ao referido mamífero uma quanti- dade eficaz dos anticorpos, de seus fragmentos ou dos anticorpos recombi-

nantes da invenção.

Os agentes da invenção, especialmente anticorpos recombinan-

5 tes ou seus fragmentos podem ser utilizados como agentes neuroprotetores em métodos para prevenção, tratamento ou melhora de lesão, dano ou comprometimento de neNos e complicações capazes, que possam ou que resultem em dano ao sistema nervoso central.

Os métodos de tratamento ou prevenção da invenção são aplicáveis quando perda de estrutura, função ou

10 sobrevida de neurônios estiver envolvida ou associada, incluindo lesão ou trauma cerebral, lesão na medula espinhal (SCl), lesão de nervos, lesão na cabeça, condições nas quais o suprimento sanguíneo ao cérebro está redu- zido ou comprometido, doenças infecciosas do cérebro, doenças neurode- . generativas.

Exemplos destas doenças ou condições para tratamento, pre-

, 15 venção ou melhora de acordo com os métodos da invenção incluem lesão na medula espinhal (SCl), lesão cerebral traumática (TBI), esclerose Iateral amiotrófica (ALS), esclerose múltipla (MS), doença de Alzheimer, acidente vascular cerebral, doença de Parkinson, doença de Huntington, anóxia pré- natal/isquemia perinatal e/ou paralisia cerebral, encefalopatia, mielopatia e

20 doenças do neurônio motor.

A presente invenção, portanto, diz respeito a métodos para tratar ou mefhorar doenças ou condições em mamíferos nas quais nervos estão comprometidos, lesados ou danificados ou situações nas quais nervos ou neurônios são suscetíveis ou estão em risco de comprome- timento, lesão ou dano, os quais compreendem administrar um anticorpo

25 recombinante ou um anticorpo inteiramente humano ou seu fragmento, sele- cionado a partir de lgM12 e lgM42. Em um aspecto da invenção, os anticorpos, seus fragmentos e anticorpos recombinantes, compreendendo as sequências da região variável de acordo com a invenção, podem ser utilizados em métodos ou administra-

30 dos em composições para melhorar ou estabilizar a função neurológica ou a função motora em circunstâncias, doenças ou condições nas quais nervos estejam comprometidos, lesados ou danificados, ou em situações nas quais

V nervos ou neurônios sejam suscetíveis ou estejam em risco de comprometi- mento, lesão ou dano.

Em um aspecto específico, os anticorpos ou seus fragmentos são utilizados ou administrados em estágios precoces ou iniciais de uma doença ou condição, ou repetidos durante a evolução ou a duração

5 de uma doença ou condição, visando facilitar ou manter a melhora ou estabi- lização de função neurológica ou função motora, incluindo ou selecionada a partir de movimento, tal como andar, função cognitiva, tal como evocação ou reconhecimento.

Os métodos da invenção podem compreender a administração

10 de mais de um anticorpo ou fragmento, incluindo combinações de anticorpos lgM12 e 42. Em um aspecto da invenção, são providos métodos que com- preendem administrar um ou mais anticorpos ou seus fragmentos, em que um anticorpo inclui (a) as sequências de aminoácidos de dominios CDR da cadeia pesada variável: CDRI GGSVSLYY (SEQ ID NO:31), CDR2

. 15 GYIYSSGST (SEQ ID NO:32) e CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO:33), e as sequências de CDRs da cadeia leve variável: CDRI QSISSY (SEQ IDNO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO:35) e CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO:36) ou (b) as sequências de aminoácidos de domínios CDR da cadeia pesada vari- ável: CDRI GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID

20 NO:38) e CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO:39), e as sequências de CDRs da cadeia leve variável: CDRI QGlG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO:41) e CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42). Em outro de tais métodos, um ou mais entre anticorpo lgM12 e/ou anticorpo lgM42 podem ser combinados com outros anticorpos ativos no sistema nervoso central, espe-

25 cialmente incluindo um ou mais anticorpos rHigM22 e/ou rHlgM46. O anti- corpo rHlgM22 contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 43 e 44, ou as CDRS destas SEQ IDS.

O anticorpo rHlgM46 contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 45 e 46, ou das CDRS destas SEQ IDS.

Consequentemente, um ou mais entre anticorpo

30 lgM12 e/ou anticorpo IgM42 podem ser combinados com um ou mais anti- corpos remielinizantes compreendendo (a) CDRS da região variável da ca- deia pesada incluindo CDRI com a sequência SSGMH, CDR2 com a se-

V quência V(1)ISYDGSRKYYADSVKG e CDR3 com a sequência GVTGSP- TLDY, e CDRS da região variável da cadeia leve incluindo CDRI com a se- quência SGSSSNIGNNFVS, CDR2 com a sequência DITKRPS e CDR3 com a sequência G(E)T\NDSSLSAV V; ou (b) CDRs da região variável da cadeia

5 pesada incluindo CDRI com a sequência SGFTFSSYW, CDR2 com a se- quência IKKDGSEK e CDR3 com a sequência ARPNCGGDCYLPWYFD, e CDRs da região variável da cadeia leve incluindo CDRI com a sequência QSVLYSSNNKNY, CDR2 com a sequência YWAS e CDR3 com a sequência QQYYNTPQA.

Combinações de anticorpos podem ser administradas coleti-

lO vamente ou em série, e em vários momentos e várias quantidades ou con- centrações.

Anticorpos bi ou multiespecíficos podem ser utilizados.

Em um destes aspectos específicos, o anticorpo 12 e/ou 42 é administrado em com- binação com o anticorpo 22 e/ou 46 e/ou um anticorpo tendo a região CDR P-

com as sequências de CDRI, CDR2 e CDR3 de lgM22 ou lgM46, por admi-

. 15 nistração combinada ou em série, separada um espaço curto de tempo ou espaço maior de tempo, incluindo por horas, dias ou semanas.

Em um de tais aspectos específicos, o anticorpo 12 e/ou 42 é administrado em combi- nação com o anticorpo 22 e/ou 46, por administração combinada ou em sé- rie para o tratamento visando melhorar uma doença ou condição que envol-

20 va neurodegeneração e, especialmente, que inclua desmielinização.

Em ou- tro de tais aspectos, o anticorpo 12 e/ou 42 é administrado em combinação com o anticorpo 22 e/ou 46, por administração combinada ou em série para o tratamento visando melhorar uma doença ou condição desmielinizante.

Em um aspecto específico, o anticorpo 12 e/ou 42 é administrado em combina-

25 ção com anticorpo 22 e/ou 46, por administração combinada ou em série para o tratamento visando melhorar esclerose múltipla.

Em um de tais as- pectos, a remielinização e a neuroproteção são conseguidas por efeitos combinados, incluindo efeitos sinérgicos, sobre um aspecto clínico mensurá-

vel da doença MS. 30 Em vista das capacidades neuroprotetoras e/ou neurodegenera- tivas dos agentes da invenção, esta invenção diz respeito ainda a métodos in vitro para produzir e estimular a proliferação de neurônios, incluindo a pro-

V liferação de neurônios corticais, neurônios do hipocampo, células granulares do cerebelo e células ganglionares da retina. Tais neurônios proliferados podem ser adequados para o transplante e protocolos e métodos terapêuti- cos relativos a células nervosas. 5 A utilidade diagnóstica da presente invenção estende-se ao uso dos anticorpos da presente invenção em ensaios e métodos para caracteri- zar lesão ou dano a nervos do sistema nervoso central ou para rastrear ou avaliar doenças ou condições que envolvam lesão, dano ou morte de nervos (incluindo morte necrótica ou apoptótica), abrangendo ensaios diagnósticos 10 in vitro e in vivo e de imagem. Em um imunoensaio, uma quantidade controle dos anticorpos, ou similares, pode ser preparada e marcada com uma enzi- ma, um parceiro de ligação específica, ligante, corante, etiqueta fluorescente e/ou um elemento radioativo e pode, então, ser introduzida em uma amostra " ce ular Depois que o material marcado ou seu(s) parceiro(s) de iigação tive . 15 rem tido oportunidade de reagirem com sÍtios dentro da amostra, a massa resultante pode ser examinada por técnicas conhecidas, as quais podem variar com a natureza da marcação anexada. Em uma aplicação diagnóstica ou de imagem in vivo, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a neurônio pode ser preparado e marcado com uma enzima, um parceiro de ligação 20 específica, ligante, corante, etiqueta fluorescente e/ou elemento radioativo e pode, então, ser introduzido em um animal. Depois que o material marcado ou seu(s) parceiro(s) de ligação tenham tido oportunidade de reagirem com sÍtios dentro do animal, o animal pode ser examinado por técnicas conheci- das, as quais podem variar com a natureza da marcação anexada.

25 Membros radiomarcados de ligações específicas, especialmente anticorpos e seus fragmentos, são úteis em técnicas diagnósticas ih vitro e em técnicas de radioimagem in vivo. Em um aspecto adicional da invenção, membros radiomarcados de ligações específicas, especialmente anticorpos e seus fragmentos, especialmente radioimunoconjugados, são úteis em ra- 30 dioimunoterapia, especialmente como anticorpo radiomarcados para reparo de lesão em neNos, recuperação neurodegenerativa, terapia para câncer ou tumor do sistema neNoso central ou, alternativamente, para ablação de teci-

mmãi

0 do nervoso ou neurônios danificados em certas situações.

Em um aspecto in vivo, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a neurônios é marcado e ad- ministrado ao animal antes, durante ou depois de cirurgia ou de técnica ci- rúrgica, inclusive técnica estereotática ou minimamente invasiva, com o pro-

5 pósito de localizar uma lesão no nervo ou para avaliar a presença de restos de tecido neural danificado ou lesado.

Em um de tais aspectos, os membros marcados de Iigações específicas, especialmente anticorpos e seus frag- mentos, são úteis em técnicas cirúrgicas radioimunoguiadas, em que estes são capazes de identificar e indicar a presença e/ou a localização de células

10 nervosas, neurônios ou tecido nervoso comprometidos, danificados ou lesa- dos ou em vias de morrer, antes, durante ou depois da cirurgia para apontar como alvo, identificar ou remover tais células.

A presente invenção inclui imunoconjugados ou proteínas de fu- são de anticorpos, em que os membros de ligações específicas, especial-

. 15 mente anticorpos e seus fragmentos, da presente invenção são conjugados ou ligados a outras moléculas, ou agentes incluem ainda, entre outros, membros de ligação conjugados a um fármaco neuroativo, agente de abla- ção química, toxina, imunomodulador, citocina, agente citotóxico, agente ou fármaco quimioterápico. 20 A presente invenção inclui um sistema de ensaio que pode ser preparado na forma de um kit de teste para a análise quantitativa da exten- são da presença de, por exemplo, neurônios danificados, comprometidos ou Iesados ou para quantificar neurônios em uma amostra.

O sistema ou kit de teste pode incluir um componente marcado, preparado por uma das técnicas

25 radioativas e/ou enzimáticas aqui discutidas por acoplamento de uma mar- cação ao anticorpo, e um ou mais reagentes imunoquímicos adicionais, op- cionalmente um destes ao menos estando Iivre ou componente(s) imobiliza- do(s) ou seu(s) parceiro(s) de ligação.

Os anticorpos da presente invenção e, em uma concretização

30 específica, anticorpo(s) recombinante(s) compreendendo as sequências de cadeia pesada e/ou leve apresentadas na Figura 5 e 6 deste pedido de pa- tente, ou seus fragmentos ativos, e anticorpos de cadeia única, recombinan-

«

tes ou sintéticos deles derivados, especialmente compreendendo as se- quências de região CDR retratadas nas Figuras 5 e 6, podem ser prepara- dos em composições farmacêuticas, contendo um veículo, carreador ou di- luente adequado, para administração em situações nas quais a terapia seja

5 apropriada, tais como para tratar ou melhorar condições ou doenças que envolvem comprometimento, dano, lesão ou morte de neurônios.

Tais com- posições farmacêuticas podem incluir também métodos para modular a mei- a-vida dos anticorpos ou fragmentos por métodos conhecidos na técnica, tais como peguilação.

Tais composições farmacêuticas podem compreender

10 ainda anticorpos ou agentes terapêuticos adicionais.

A presente invenção também inclui anticorpos e seus fragmen- tos que estejam Iigados covalentemente ou de outra forma associados com outras moléculas ou agentes.

Estas outras moléculas ou agentes incluem, u entre outros, moléculas (inclusive anticorpos ou fragmentos de anticorpos)

W 15 com características distintas de reconhecimento, toxinas, ligantes, agentes neuroativos e agentes quimioterápicos.

Em um aspecto adiciona!, os anti- corpos ou fragmentos da invenção podem ser utilizados para orientar ou di- recionar moléculas terapêuticas ou outros agentes, por exemplo, orientar moléculas ou agentes para neurônios, por exemplo, para neurônios corticais,

20 neurônios do hipocampo, células gangiionares da retina ou células granula- res do cerebelo, inclusive situados em locais de feridas, sÍtios isquêmicos, sÍtios tumorais, áreas inflamatórias ou lesões neurodegenerativas.

Outros objetivos e vantagens se tornarão evidentes aos técnicos no assunto a partir de uma análise da descrição detalhada subsequente, a

25 qual prossegue com referência aos desenhos ilustrativos a seguir e às rei- vindicações que a acompanham.

Descrição resumida dos desenhos Figura 1: IgMs humanas ligam-se à superfície de múltiplos tipos de neurônios. sHlgM42 (A) e rHlgM12 (C) ligam-se à superfície de neurônios

30 corticais vivos que coexpressam neurofilamento (NF) (B e D). As células fo- ram mantidas em gelo durante uma incubação de 10 minutos com lgMs 10 µg/mL no meio.

As células foram fixadas, lavadas, e lgM humana detectada m por com um Ab secundário FITC-Fab'2 anti-cadeia mu humana. NF intemo está presente como padrão segmentado característico. Células corticais fo- ram cultivadas por 6 dias em meio Neurobasal B27 sobre lamínulas de vidro revestidas com poliornitina. Nem todos os neurônios corticais expressam NF 5 ainda, mas as lgMs se ligam a todos os neurônios na cultura. rHIgM12 (E verde) e sHlgM42 (F verde) ligam-se à superfície de neurônios vivos do hi- pocampo de camundongos que coexpressam neurofilamento (NF, verme- lho). Neurônios do hipocampo foram cultivados por 1 semana em meio Neu- robasal B27 sobre plástico revestido com poIilisina. Células isoladas de um 10 Iobo temporal humano ressecado foram cultivadas em DMEM/F12/N2/B27 por 21 dias. rHlgM12 ligou-se à superfície de células (G) que foram positivas também para j3 lll tubulina (F, anti-[3 lll da Promega). Figura 2: IgMs humanas marcam a superfície de células granula- res do cerebelo em padrões distintos. Células granulares do cerebelo de rato ,. 15 no Dia 1 em cultura foram incubadas vivas com 10 µg/mL das lgMs huma- nas derivadas de soro, sHlgM12 ou sHlgM42, em meio de cultura por 15 minutos em gelo. Depois de lavagem e fixação com paraformaldeído 4°/0, as células foram incubadas à temperatura ambiente com um anticorpo conjuga- do a FITC anti-cadeia mu humana e visualizadas utilizando microscópio de 20 imunofluorescência. O padrão da marcação de membranas neuronais utili- zando estes dois anticorpos é diferente. Áreas curtas de membrana de neuri- tos são ligadas por sHlgM12 resultando em um padrão nitidamente pontilha- do. Áreas maiores de membrana de neuritos são ligadas por sHlgM42 resul- tando em padrão segmentado. A ampliação é de 40Ox.

25 Figura 3: lgMs humanas ligando-se a neurônios, rHlgM12 e sHlgM42, protegem neurônios corticais em cultura da morte celular induzida por peróxido. Neurônios de camundongos em 3 dias de cultura foram trata- dos com H2O2 500 nM ou solução salina com ou sem 10 µg/mL de lgMs hu- manas por 30 minutos. As células foram lavadas com meio Neurobasal B27 30 frasco e 24 horas mais tarde a expressão de caspase-3 foi detectada em triplicata em 96 cavidades tratadas utilizando um kit de ensaio FLICA para caspase-3 (lmmunochemistry Technologies 935). Barras indicam °/) de pro-

'W teção contra ativação de caspase 3. A Figura 4 retrata um vetor amplificável para produzir anticorpo recombinante. Este mapa é o do vetor utilizado para gerar o anticorpo re- combinante com base em sHlgM22 (rHlgM22), que foi modificado para pro- 5 dução de lgM12 e IgM42 recombinantes. Para expressão em células CHO, o promotor VH foi substituído pelo promotor EIA. A região constante da cadeia leve CÀ foi substituída por uma região constante da cadeia leve kappa Ck. A Figura 5 retrata a sequência de ácido nucleico e aminoácidos do anticorpo lgM12, no vetor recombinante. A sequência de aminoácidos da 10 cadeia pesada e a sequência de ácido nucleico codificador estão em cinza, e cada uma das sequências de Vh e sequências CHl, CH2, CH3 e CH4 da região constante são fornecidas e indicadas. A sequência de aminoácidos da cadeia leve e sequência de ácido nucleico codificador estão em púrpura, e

P as duas sequências variável VL e constante CL (kappa) estão indicadas. As . 15 sequências da região CDR para as regiões variáveis da cadeia pesada e da leve estão anotadas. A cadeia j humana está indicada na sequência de a- minoácidos e do ácido nucleico. A Figura 6 retrata sequência de ácido nucleico e aminoácidos do anticorpo lgM42 no vetor recombinante. A sequência de aminoácidos da ca- 20 deia pesada e a sequência de ácido nucleico codificador estão em cinza, e cada uma das sequências de Vh e sequências CHl, CH2, CH3 e CH4 da região constante são fornecidas e indicadas. A sequência de aminoácidos da cadeia leve e sequência de ácido nucleico codificador estão em púrpura, e as duas sequências variável VL e constante CL (kappa) estão indicadas. As 25 sequências da região CDR para as regiões variáveis da cadeia pesada e da leve estão anotadas. Figura 7: rHlgM12 recombinante melhora déficits em camundon- gos com doença induzida pelo TMEV. A média da atividade noturna espon- tânea (quando camundongos são normalmente ativos) é alterada por volta 30 da 3' semana após uma dose i.p. única de 100 µg de sHlgM12. Grupos de of 5 camundongos SJL em 90 dias após a infecção pelo TMEV foram trata- dos com rHlgM12 (barras vermelhas) ou uma lgM humana controle (barras

8d pretas) e monitorados por 3 dias, semanalmente, em grupos acomodados em caixas para monitoramento de atividade AccuScan.

A média ± SEM de atividade horizontal noturna por hora durante 3 períodos noturnos foi compa- rada à atividade noturna das 3 noites anteriores ao tratamento com lgM.

Foi

5 constatado aumento em atividade noturna, em comparação a níveis anterio- res ao tratamento, da y semana até 7a semana depois do tratamento com uma dose única de rHlgM12 (P<O,O1), mas não após o tratamento com con- trole.

Níveis de atividade de camundongos não infectados de idades corres- pondentes são mostrados no gráfico para comparação (barra verde)-

1O Figura 8: Espectros de MRS coletados no tronco cerebral de camundongos.

Os painéis superiores indicam o voxel a partir do qual o sinal foi coletado.

Essa região de interesse foi posicionada utilizando marcos ana- tômicos.

Um exame muito curto por MRI é utilizado para obter as imagens em três planos ortogonais para posicionar o cubo de 2,5 mH sobre o tronco

. 15 cerebral (painel superior). Espectro de 1H a 300 MHZ do tronco cerebral do camundongo (painel inferior). Picos de coIina (Cho), creatina (Cr) e N-acetil- aspartato (NAA) são facilmente identificados.

O espectro é em referência à água a 4,7 ppm.

Figura 9: Níveis decrescentes de NAA no tronco cerebral corre-

20 lacionam-se com perda crescente de axônios. 10 camundongos SJL foram estudados prospectivamente de 0 a 270 dias depois da infecção pelo TMEV.

MRS obtida no tronco cerebral de cada camundongo e a concentração de NAA determinada (parte superior). Uma diminuição gradual em NAA foi re- gistrada em todos os camundongos e atingiu uma queda estatisticamente

25 significativa em 90 dias depois da infecção pelo vÍrus, o ponto em que é mostrada a perda de axônios grandes pela contagem direta em cortes trans- versais. (2) Os níveis de NAA permaneceram deprimidos enquanto durou a doença.

Contagem absoluta de axônios (parte inferior) no nivel T6 de ca- mundongos não infectados (barra preta), 90 dias (cinza) e 270 dias (branca)

30 após a infecção.

Figura 10: NAA no tronco cerebral após uma dose única de lgMs humanas.

Grupos de 10-15 camundongos SJL em 90 dias após infecção

H pelo TMEV, o tempo em que os níveis de NAA começam a cair e a perda de axônios grandes é detectável ao receberam uma dose única de 100 µg de sHlgM12, sHlgM42, uma lgM humana de controle, ou soiução salina (PBS) i.p.

MRS no tronco cerebral foi coletada antes e em 5 e 10 semanas após o

5 tratamento.

Os nlveis de NAA foram calculados a partir desses espectros.

Nos grupos tratados com sHlgM12 e sHlgM42, NAA diminuiu quando com- parado a níveis anteriores ao tratamento depois de 5 semanas (P=O,005, P=O,029) e em 10 semanas (P"O,OO1, P=O,037). Em grupos de camundon- gos tratados com controle, os reagentes ficaram estáveis ou apresentaram

10 tendência decrescente.

O gráfico representa a média +/- SEM dos níveis de NAA em voxel do tronco cerebral.

Figura 11: IgMs humanas que se ligam a neurônios não alteram a desmielinização, a remielinização ou a inflamação.

Grupos de 5 camun- . dongos infectados cronicamente pelo TMEV foram tratados com uma dose

., 15 única de 100 µg de lgMs humanas.

Todos os grupos continham o mesmo grau de inflamação da medula espinhal (barras pretas) e desmielinização (barras vermelhas) em 10 semanas após o tratamento.

Tal como previsto, ca- mundongos tratados com a lgM que se Iigava a oligodendrócitos, rHlgM22, mostraram remielinização maior (barras verdes). sHlgM12 e sHIçjM42 não

20 promovem a remielinização da medula espinhal. lsso sugere que pode haver múltiplas maneiras para proteger axônios in vivo- Figura 12: Meia-vida sérica de ÍgMs humanas que se ligam a neurônios na circulação de camundongos CD-l após injeção intravenosa.

A técnica de ELISA sanduíche foi utilizada para quantificar o declínio de cadeia

25 mu humana do soro de camundongos durante 48 horas.

A média da OD405 de substrato de fosfatase alcalina (Sigma 104) obtida a partir das médias.

O soro de 3 camundongos por grupo e o erro padrão são mostrados nos gráfi-

COS.

Figura 13: 35S rHlgM12 marcada penetrou o cérebro e a medula

30 espinhal de camundongos SJL infectados pelo TMEV e não infectados, 35S rHlgM12 marcada foi administrada i.p. a camundongos SJL de 5 meses in- fectados pelo TMEV e a não infectados com idade correspondente. 4 horas

H mais tarde, um par de camundongos foi perfundido com solução salina, os tecidos colhidos agudamente, pesados, picados com navalha e misturados com 10 mL de líquido de cintilação (Ultima Gold LSC). O procedimento foi repetido em 24 horas.

Depois de 48 horas que permitiram que o tecido se

5 solubilizasse, os frascos foram contados por 1 minuto em um contador de cintilação Beckman.

As contagens totais para o cérebro inteiro e a medula espinhal de cada camundongo são mostradas no gráfico.

As contagens de fundo sem tecido nos frascos foram 12. Figura 14: lgMs humanas que se ligam a neurônios têm como

10 alvo in vivo lesões na medula espinhal.

Camundongos com desmielinização crônica da medula espinhal induzida pelo TMEV receberam por via intraperi- toneal 1,0 mg de sHlgM42 (A), rHlgM12 (B) ou lgM monoclonal humana de controle (C). 4 horas mais tarde, os camundongos foram perfundidos com paraformaldeído 4°/0, as medulas espinhas removidas, cortadas congeladas

, 15 e imunomarcadas com fragmentos Fab'2 conjugados a FITC direcionados contra cadeia mu humana (Jackson lmmnoresearch). As medulas espinhais de camundongos que receberam sHlgM42 ou rHlgM12 continham lgM hu- mana em lesões.

Pouca lgM humana controle foi encontrada em lesões.

Os painéis inferiores são colorações com H/E para visualizar células inflamató-

20 rias e lesões.

Conctulmos que certas lgMs humanas conseguem cruzar a barreira hematoencefálica (BBB) no modelo TMEV.

Figura 15: ICjMS humanas que se ligam a neurônios delimitam axônios neurofilamênto+ (NF) em Iesões na medula espinhal- Camundongos com desmielinização crônica induzida pelo TMEV receberam por via intrape- 25 ritoneal 1,0 mg de lgM e foram sacrificados 4 horas mais tarde.

As medulas espinhais foram congeladas, cortadas longitudinalmente e imunomarcadas com fragmentos Fab'2 conjugados a FITC anti-cadeia mu humana (verde) e anti-NF (SMl-32 e 34, vermelho), seguido por secundário conjugado a TRICT. lmagens confocais fundidas confirmam a colocalização de sHlgM42

30 (A) com fibras Iongas NF+ (B), fundidas em (C). A localização de rHlgM12 (D, verde) também coincide com a de estruturas NF+ (D, vermelho), tais co- mo feixes de fibras de axônios cortados transversalmente.

N0

Figura 16: rHIgM12 e sHlgM42 não exacerbam pontuações clíni- cas de EAE.

Grupos de 10 camundongos C57BL6 com EAE induzida pelo peptideo MOG receberam uma dose única i.v. de 100 µg de rHlgM12, sHlgM42, lgM humana de controle ou solução salina quando atingiam indivi-

5 dualmente pontuação clínica de 1 (rabo hesitante) e foram monitorados em dias alternados até 28 dias após a imunização.

Os gráficos representam a média +/- SEM da pontuação clínica média de cada grupo de tratamento.

ANOVA em classificações de pontuações clínicas médias indicou não haver diferença entre os grupos (P=O,14)- 10 Figura 17: rHlgM12 e sHlgM42 não exacerbam patologia de EAE na medula espinhal.

No final do estudo na Figura 13, as medulas espinhais foram removidas, cortadas em blocos de 1 mm, seções transversais foram cortadas a cada três blocos consecutivos e coradas com erichrome para vi- . sualizar a patologia.

O grau de 10 seções transversais por camundongo (40

, 15 quadrantes) foi classificado de modo cego.

Não houve diferenças em infla- mação (P=0,825) ou desmielinização (P=0,766) entre os grupos.

Figura 18. rHlgM12 promove o crescimento de neuritos.

Neurônios E15 do hipocampo foram cultivados em lamínulas de vidro revestidas com poli-D-Iisina (PDL) (A) ou rHlgM12 (B) -nitrocelulose. 12

20 horas depois de semear as células, estes neurônios foram fixados e corados com anticorpo contra [33-tubulina (Al e Bl, verde) e Faloidina vermelho do Texas (A2 e B2). A3-B3 são sobreposições de A1-A2 e B1-B2, onde os nú- cleos foram corados com DAPI (azul). C, D e E mostram a mensuração dos comprimentos totais de neuritos (C, p=O,0056), do neurito mais longo (D,

25 p<O.OOO1) e do 2' mais Iongo (E, p=O,0782). Neurônios cultivados em rHIgM12 exibem menos neuritos (F, p"O,OOO1), e a maioria é formada por neurônios do estágio 3 (G), quando comparados a neurônios semeados em substratos PDL de controle (72% versus 18%) os quais exibem múltiplos neuritos assimétricos.

As análises estatísticas mostram a média ± SEM (tes-

30 te t não pareado). Figura 19: rHlgM12 impulsiona a formação de axônios Neurônios do hipocampo 12 horas após serem semeados em substratos de

W

PDL (A), PDL+Laminina (B) ou rHlgM12 (C) foram corados com Taul (A1- C1, verde) ou MAP2 (A2-C2, azul). A3-C3 são sobreposições de A1-C1 e A2-C2, e F-actina (vermelho) foi marcada com Faloidina vermelho do Texas.

D-F mostram a intensidade relativa de Taul ao longo dos neuritos mais lon-

5 gos do corpo celular ao cone de crescimento em A1-C1 marcada por linhas tracejadas.

A coloração com Taul está enriquecida assimetricamente na parte distal do neurito mais longo em neurônios do estágio 3 cultivados em substratos de rHlgM12 e de laminina.

Figura 20: Ligação de rHlgM12 reorganiza membranas neuro- 10 nais A.

Neurônios DlVl do hipocampo foram fixados primeiramente com paraformaldeido 4°/0 e depois corados por rHlgM12. rHlgM12 marca estruturas menores em ponto.

B.

Neurônios DlVl vivos do hipocampo foram p resfriados para 4°C por 30 minutos e depois marcados com rHlgM12, segui-

. 15 do por coÍoração com anticorpo antij3-tubulina lll após a fixação. rHIgM12 cora formações pontilhadas muito maiores na superfície de neurônios.

C.

Neurônios DlV3 vivos do hipocampo foram tratados com metil§-ciclodex- trina por 30 minutos a 37°C para esgotar as reservas de colesterol e depois resfriados para 4°C.

Os neurônios fixados foram então corados com

20 rHIgM12 (verde) e toxina colérica subunidade B (vemelho). rHlgM12 liga-se ao ponto maior que coincide com GMI marcado pela toxina colérica subuni- dade B.

O painel inferior mostra as regiões apresentadas em caixas em am- pliação mais alta.

Figura 21: A localização de rHlgM12 coincide com a de GMl em

25 microdomínios da membrana neuronal A.

Neurônios DlVl do hipocampo foram primeiramente fixados com paraformaldeído 4°/0 e depois corados por rHIgM12. rHlgM12 marca estruturas menores em pontos.

B.

Neurônios DlVl vivos do hipocampo fo- ram resfriados para 4°C por 30 minutos e depois marcados com rHlgM12,

30 seguido por coloração com anticorpo antj-Í3-tubu|ina lll depois de fixação. rHlgM12 cora formações pontilhadas muito maiores na superfície de neurô- nios.

C.

Neurônios DlV3 vivos do hipocampo foram tratados com metii©-

ciclodextrina por 30 minutos a 37°C para esgotar as reservas de colesterol e então resfriados para 4°C.

Os neurônios fixados foram depois corados com rHIgM12 (verde) e toxina colérica subunidade B (vermelho). rHlgM12 ligase ao ponto maior que coincide com GMI marcado pela toxina colérica subuni-

5 dade B.

O painel inferior mostra as regiões apresentadas em caixas em am- pIiação mais alta.

Figura 22: rHlgM12 liga-se a balsas Iipídicas Foi permitido a neurônios corticais DlV7 vivos que se Iigassem a rHlgM12 ou ao anticorpo lgM de controle a 4 °C por 30 minutos.

A.

Os neu-

lO rônios foram lavados três vezes depois da ligação ao anticorpo e lisados em tampão contendo NP-40 0,5%, Os lisados foram separados por microcentri- fúgação a 4°C, e os sobrenadantes e os grânulos foram ambos precipitados (b/otted) com o anticorpo secundário anti-lgM humana.

HlgM12 distribui-se d no grânulo e no sobrenadante, quando comparado com o anticorpo IgM de . 15 controle, que não se liga a neurônios e vai para o washout.

O painel abaixo mostra um gel separado corado com Coomassie carregado com a mesma quantidade de proteína.

B.

Neurônios lisados em tampão contendo Triton X- lOO 1°/0 foram fracionados por ultracentrifugação em gradientes de sacarose a 4 °C.

As frações resultantes foram precipitadas (b/otteQ em sequência pa- 20 ra rHlgM12, caveolina-l, receptor da transferrina, j33-tubulina (83-Tub) e be- . ta-actina com anticorpos específicos. rHlgM12 está situado na fração de bai- xa densidade que contém caveolina-l e j33-tubulina.

As frações de densida- des mais altas contêm receptor da transferrina, [33-tubulina e actina.

Certa quantidade de rHIgM12 está localizada no grânulo insolúvel pelo detergente, 25 o qual é composto principalmente por proteínas do citoesqueleto ricas em tubulina.

A maior parte da actina vai para as frações solúveis com densidade mais altas do detergente.

Figura 23: rHlgM12 associa-se com microtúbulos A.

Neurônios DlVl do hipocampo foram primeiramente tratados 30 com rHlgM12 por 30 minutos a 37 °C, depois simultaneamente fixados e ex- traídos com tampão contendo paraformaldeído 4°/0 e Triton X-lOO i°/o e se- guidos por coloração para rHlgM12 (verde), j33-tubulina (azul) e F-actina

(vermelho). rHlgM12 liga-se às moléculas insolúveis do detergente cuja loca- lização coincide com a dos microtúbulos fasciculados ao longo das hastes de neuritos t (A 2 e 4) e no domínio central do cone de crescimento, mas não com F-actina localizada na periferia do cone de crescimento (A 3 e 4). B.

5 Neurônios corticais DlV7, após ter sido permitida sua ligação a rHlgM12, foram lisados em NP-40 0,5%. Os sobrenadantes foram submetidos à coi- munoprecipitação. rHIgM12 e |33-tubulina se imunoprecipitaram simultanea- mente. Figura 24: Mecanismos propostos para formação de axônios 10 promovida por rHlgM12 A. Membranas de neurônios contêm microdomínios especializa- dos (balsas) e não especializados (sem balsas). Os microdomínios especia- Iizados, que estão distribuídos uniformemente nas membranas neuronais, se b diferenciam em dois agrupamentos. Um destes está associado com microtú- . , 15 bulos. B. Ligação de rHlgM12 induz aglomerados de microdomínios especia- lizados, o que promove a estabilização de microtúbulos e a ancoragem em membranas de neurônios. C. Durante o crescimento de neuritos, os cones de crescimento exploram o ambiente e o aglomerado de microdomínios es- pecializados ao interagirem com rHlgM12. Como resultado, os microtúbulos 20 são estabilizados nos sÍtios de contato com rHlgM12 e servem de ancora- douro para as membranas de neurônios, o que intensifica a transição do co- ne de crescimento do domínio central para o periférico, conforme observado na Figura 3 e 6, onde o rHlgM12 aplicado a banho é agregado no domínio central do cone de crescimento. 25 Figura 25: rHlgM12 não se associa diretamente com tubulina A. Células N2A de neuroblastoma foram coradas com rHlgM12 (Al, verde) e j33-tubulina (A2, vermelho). Os núcleos foram marcados com DAPI (A3, azul). Células N2A são negativas para coloração com rHlgM12, mas expressam f33-tubulina. B. Sobrenadantes de lisados de células N2A 30 foram incubados com rHlgM12 e moléculas associadas com rHlgM12 foram co-purificadas (pul/ed down) com agarose de proteína L e submetidas a Westem B/otting. rHIgM12 não está associada com o grânulo. j33-tubulina

V não foi co-purificada por rHlgM12, embora detectada nos sobrenadantes.

Figura 26: rHlgM12 copurifica actina, mas não se colocaliza com F-actina A.

Neurônios DlVl vivos do hipocampo foram corados a 4°C

5 com rHlgM12 (AI, verde) primeiramente, e F-actina (A2, vermelho) foi mar- cada com faloidina vermelho do Texas depois da fixação.

Na região do cone de crescimento, F-actina retraiu-se e estava enriquecida no domínio central, ao passo que rHlgM12 corou uniformemente nas estruturas em ponto na superfície do cone de crescimento, o que marcou precisamente a borda do

10 cone de crescimento.

B.

Uma pequena quantidade de actina foi precipitada por rHlgM12, e nenhum dos três anticorpos anti-actina testados funcionaram em imunoprecipitação.

A banda em posição similar à da |33-tubulina é a ca- deia pesada da lgG indicada pela ponta de flecha vazia. * Figura 27 (a) As membranas celulares serão reconstituídas em

15 uma película fina de ouro perfurada com milhares de nanoporos (tamanho - de 200 nm). (b) A película de ouro suspensa está em contado com uma so- lução tampão nos dois lados, Figura 28: Um anticorpo humano que se liga a neurônios promo- ve a extensão de neuritos.

Neurônios foram semeados sobre substratos re- 20 vestidos com lgM humana, deixados que crescessem por 24 horas e imu- nomarcados com anti-neurofilamento. sHlgM42 induziu crescimento (A) quando comparada a um lgM humana não permissiva (B) Figura 29: Um anticorpo humano que se liga a neurônios aglo- mera domínios de membranas.

A imunomarcação uniforme em soma e axô- 25 nios foi realizada a 0° C (A). Quando as células foram aquecidas para 15 °C por 15 minutos, sHlgM42 é localizado em manchas mais distintas sobre a superfície celular de axônios (B). Figura 30: Anticorpo humano promotor da extensão de neuritos se direciona in vivo a áreas de lesão.

Camundongos com SCl crônica rece-

30 beram anticorpo por via i.p., as medulas espinhais foram removidas 4 horas mais tarde e lgM humana detectada em seções transversais da medula es- pinhal.

Áreas lesadas da medula espinhal de um camundongo que recebeu

M 29/176

"T " '" " " "

anticorpo demonstram fibras paralelas que se ligam a um anti-lgM humana marcado por fluorescência (A). Áreas Iesadas da medula espinhal de um camundongo que recebeu uma lgM humana de controle não contêm lgM humana (B). 5 Figura 31: Lesão por esmagamento da medula espinhal.

Fotomi- crografias mostram o aspecto típico da medula espinhal corada com hema- toxilina e eosina de camundongos controle (A) ou de camundongos 30 dias depois de compressão com grampo de Fejota de 8 g (b). Lesão por com- pressão é associada com infiltração intensa por células inflamatórias, perda

10 de motoneurônios.

Figura 32: Exempto de atividades noturnas espontâneas de ca- mundongos infectados pelo TMEV.

A) Registros originais completos da ativi- dade horizontal durante o período de 64 dias.

Atividades noturnas altas e e diurnas baixas são fáceis de serem reconhecidas.

Considerando que ca-

. 15 mundongos são normalmente ativos durante o horário noturno, as atividades noturnas foram selecionadas para análise (18h - 6h). Contudo, por inspeção visual de registros comprimidos não filtrados em atividade horizontal (B) ou vertical (C), pode ser difícil identificar alterações reais em longo prazo.

Figura 33: Uma dose única i.p. de anticorpo que se liga a neurô-

20 nios (rHlgM12) melhora a atividade horizontal em camundongos SJL infecta- dos cronicamente, Três grupos de 5 camundongos 5 SJL a 90 dpi foram co- locados em caixas AccuScan de monitoramento de atividade.

Medidas ba- sais foram coletadas ao longo de 8 dias.

Depois do tratamento, os camun- dongos foram monitorados continuamente durante 8 semanas.

Os painéis A,

25 C e E correspondem à atividade horizontal e os B, D e F correspondem à atividade vertical.

A, B) As atividades noturnas médias, apresentadas em compartimentos (bins) para cada dia, sugeriram a melhora em atividade ho- rizontal somente no grupo tratado com rHlgM12; C) Filtragem gaussiana (GB=2 dias) e E) o ajuste polinomial de 6a ordem de valores Z padronizados

30 forneceu uma melhora clara e distinta em camundongos tratados com rHlgM12. B, D e F) A atividade vertical não foi afetada por qualquer trata- mento.

A atividade (escala vertical) é indicada pelo número de interrupções

W ^ W" " do feixe por hora. O parâmetro GB pode ser interpretado como um valor (em dias) da metade da Iargura filtrada na metade da altura. Com o aumento do valor de GB o desvio padrão diminuiu. As faixas pontuais de confiança de 95% são fornecidas para cada dia. 5 Figura 34: Comparação de três tratamentos a 90 dpi por meio de valores previstos com o modelo. A análise estatística foi realizada para cada dia ante e depois do tratamento. A atividade noturna horizontal de camun- dongos tratados com rHIgM12, em comparação a camundongos tratados com lgM controle e solução salina divergiu/melhorou significativamente no 10 Dia 7 (p=O,045) e Dia 11 (p=O,042) após o tratamento, respectivamente (in- dicado por setas pretas). As faixas pontuais de confiança de 95% são forne- cidas para cada dia. Figura 35: rHlgM12 melhora a atividade horizontal e a vertical

K em camundongos SJL quando fornecida precocemente na doença. Três 15 grupos de 5 camundongos SJL a 45 dpi foram colocados em caixas AccuS- . can de monitoramento de atividade. Medidas basais foram coletadas ao lon- go de 8 dias. Depois do tratamento, os camundongos foram monitorados continuamente durante 8 semanas. Os painéis A, C, E e G correspondem à atividade horizontal e os B, D, F e H correspondem à atividade vertical. A, B) 20 Registros originais não filtrados para atividade horizontal e vertical; C, D) Atividade noturnas médias apresentadas em compartimentos para cada dia, E, F) Filtragem gaussiana (GB=2 dias) e G, H) o ajuste polinomial de 6a or- dem de valores Z padronizados revelou melhora em atividade horizontal e vertical no grupo tratado com rHlgM12. Grupos tratados com lgM controle e 25 soIução saíina mostraram niveis similares de atividade motora durante todo o estudo. As faixas pontuais de confiança de 95°6 são fornecidas para cada dia. Figura 36: Comparação de três tratamentos a 45 dpi por meio de valores previstos com o modelo. A análise estatística foi realizada para cada 30 dia antes e depois do tratamento. A, C) A atividade noturna horizontal de camundongos tratados com rHlgM12, em comparação a camundongos tra- tados com lgM controle e solução salina, divergiu significativamente no Dia

13 (p=O,015) e Dia 9 (p=O,036) após o tratamento, respectivamente.

B, D) A atividade vertical (elevação do corpo sobre as patas traseiras) de camun- dongos tratados com rHlgM12 divergiu/melhorou no Dia 14 (p=O,019) e Dia 6 (p=O,037) após o tratamento, respectivamente.

As setas pretas indicam

5 dias com aparecimento de melhora significante.

As faixas pontuais de confi- ança de 95% são fornecidas para cada dia.

Figura 37: Camundongos SJL normais, não infectados apresen- tam atividade espontânea altamente variável, que não foi influenciada por qualquer tratamento.

Três grupos de 5 camundongos SJL não infectados

10 foram colocados em caixas AccuScan de monitoramento de atividade.

Medi- das basais foram coletadas ao longo de 8 dias.

Depois do tratamento, os camundongos foram monitorados continuamente durante 8 semanas.

Ne- nhum dos tratamentos induziu alterações em atividade horizontal (A, C, E e G) ou vertical (B, D, F e H). As faixas pontuais de confiança de 95% são for-

. 15 necidas para cada dia.

Figura 38: Uma dose única de anticorpo humano aumentou a sobrevida em camundongos transgênicos mutantes SODl G86R.

Os ca- mundongos foram tratados com uma dose única de rHlgM12 ou PBS aos 55 dias de idade.

Alguns camundongos foram deixados sem tratamento.

Os

20 camundongos foram acompanhados até estarem moribundos e, depois, sa- crificados para análise de patologia.

Alguns camundongos morreram da do- ença.

Todos os camundongos apresentavam perda acentuada do peso an- tes da morte.

A sobrevida foi traçada utilizando curvas de Kaplan-Meyer e a significância estatlstica determinada por meio do teste não paramétrico de

25 Mantel-Cox.

Houve aumento na sobrevida em camundongos tratados com rHlgM12, quando comparados a camundongos tratados com PBS ou não tratados, P=O,008. Todas as análises e o tratamento foram efetuados em maneira cega, de tal modo que o investigador responsável pela decisão de sacrificar os camundongos não tinha conhecimento sobre os grupos de tra-

30 tamento.

No total, 45 camundongos foram estudados nesta análise. lrmãos da mesma ninhada de camundongos SOD +/+ do tipo selvagem apresenta- ram sobrevida normal e não exibiram perda de peso (dados não mostrados).

A Figura 39 retrata a perda de peso em camundongos G86R SODl em função do tempo de camundongos que receberam uma dose úni- ca de 200 µg de rHlgM12 aos 50 dias de idade em comparação a camun- dongos controle que receberam PBS.

Camundongos que receberam

5 rHlgM12 mostraram menor perda de peso durante um período de 60 dias após a injeção única do anticorpo.

Figura 40: Uma dose única de anticorpo humano diminuiu a de- generação de axônios da medula espinhal em camundongos transgênicos mutantes SODl G86R.

Os camundongos foram tratados com uma dose úni-

lO ca de 250 µg de rHlgM12 ou PBS aos 55 dias de idade.

Alguns camundon- gos foram deixados sem tratamento.

O número de feixes espiralados de mie- lina, característicos de axônios em degeneração, foi contado na medula es- pinhal ao nível torácico médio.

O número de axônios em degeneração era menor em camundongos mutantes SODl tratados com rHlgM12, em compa-

, 15 ração a camundongos tratados com PBS (P=O,003, teste T) e não tratados.

Observar que o número de axônios em degeneração na meduta espinhal de camundongos SOD-l- do tipo selvagem é mínimo, quando comparados a camundongos mutantes SODl+l+. Quando do sacrifício, os camundongos eram perfundidos com fixador de Trump (formaldeído 4°/0, glutaraldeldo

20 0,1%) e a medula espinhal cortada em blocos de 1 mm.

Os blocos foram impregnados em pIástico Araldite e cortes de 1 mícron a partir do nível de T6 foram corados com fenilenodiamina para visualizar o envoltório de mielina.

Cortes da medula espinhal de camLjndongos SODJ- do tipo selvagem (parte superior à direita) e de mutantes SODl+l+ (parte inferior à direita) são mos-

25 trados.

Figura 41: Uma dose única de anticorpo humano preservou neu- rônios do corno anterior e do posterior na medula espinhal de camundongos transgênicos mutantes SODI G86R.

Os camundongos foram tratados com rHlgM12 ou PBS aos 55 dias de idade.

Alguns camundongos foram deixa-

30 dos sem tratamento.

O número de células do corno anterior e do posterior, coradas com um anticorpo contra NeuN que marca especificamente neurô- nios, foram contados em cortes impregnados em parafina da medula espi-

nhal ao nlvel torácico médio.

O número de células do corno anterior e do posterior em camundongos tratados com rHlgM12 foi significativamente maior (P=O,0025 e P=O,018 por teste T) do que em camundongos tratados com PBS ou naqueles deixados sem tratamento.

O número de células do 5 corno anterior e do posterior em camundongos SOD mutantes tratados com rHgM12 foi similar aos observados em camundongos SOD-l- do tipo selva-

gem.

Figura 42: O anticorpo humano recombinante, rHIgM12, liga-se a neurônios entre espécies. 10 Neurônios corticais de camundongos (A,B,C,D), neurônios do hipocampo de camundongos (E, F) e neurônios corticais humanos (G,H) fo- ram corados vivos com rHlgM12 (A,C,E e G) e as mesmas células foram simultaneamente marcadas com anticorpos contra neurofilamentos (B,D) ou beta tubulina (F,G). rHlgM12 foi detectado com um anticorpo secundário

. 15 marcado com fluorescência.

Descrição detalhada da invenção De acordo com a presente invenção, podem ser empregadas técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia e do DNA re- combinante abrangidas na área de competência da técnica.

Tais técnicas 20 estão inteiramente explicadas ria literatura.

Ver, por exemplo, Sambrook et al, "Mo/ecu/ar C/oning: A Laboratory Manual" (1 989); "Current Protoco/s in Mo/ecular Bio/ogj/' Volumes |-||| [Ausubel, R.

M., ed. (1994)]; "Ce// Bio/ogy: A Laboratory Handbook" Volumes |-|jj [j.

E.

Celis, ed. (1 994))]; "Current Proto- CO/S in /mmunology' Volumes l-lll [Coligan, j.

E., ed. (1 994)]; "O/igonuc/eo- 25 tide Synthesis" (M.J.

Gait ed. 1984); "Nuc/e/c Acid Hybrid/zation" [B.D.

Hames & S.J.

Higgins eds. (1985)]; "Transciiption And Trans/ation" [B.D.

Hames & S.J.

Higgins, eds. (1984)]; "Animal Ce// Cu/ture" [R.l.

Freshney, ed. (1986)]; "/mmobi/ized Ce//s And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B.

Perbal, "A Practical Guide To Mo/ecu/ar C/oning" (1984)- 30 Por conseguinte, se surgirem neste relatório descritivo, os ter- mos a seguir terão as definições apresentadas abaixo.

A.

Terminoloq ia

O termo "membro de ligação específica" descreve um membro de um par de moléculas que possui especificidade de ligação pelo outro.

Os membros de ligação específica que fomam um par podem ser derivados naturalmente ou serem produzidos no todo ou em parte sinteticamente.

Um

5 membro do par de moléculas possui uma área, ou uma cavidade, ou um componente sobre sua superfície que se liga especificamente e é, portanto, complementar a uma determinada organização espacial ou poIar do outro membro do par de moléculas.

Sendo assim, os membros do par possuem a propriedade de se ligarem especificamente um ao outro.

Exemplos de tipos

10 de pares de ligação específica incluem antígeno-anticorpo, biotina-avidina, hormônio-receptor do hormônio, receptor-ligante, enzima-substrato.

Este pedido de patente refere-se a reações do tipo antígeno-anticorpo.

O termo "anticorpo" descreve uma imunoglobulina, seja natural ou produzida em parte ou no todo sinteticamente.

O termo abrange também

. 15 qualquer polipeptídeo ou proteína com um domínio de ligação que seja, ou lhe seja homólogo, um domínio de Iigação de anticorpo.

Anticorpos com CDR enxertadas são também contemplados por este termo.

Um "anticorpo" é qualquer imunoglobulina, incluindo anticorpos e seus fragmentos, que se Iiga a um epitopo específico.

O termo abrange anticorpos poIiclonais, mono-

20 clonais e quiméricos, os últimos descritos mais detalhadamente nas Paten- tes U.S.

N°'" 4 816 397 e 4 816 567. O termo "anticorpo(s)" inclui uma molé- cula de imunoglobulina (lg) do tipo selvagem, em geral compreendendo qua- tro cadeias polipeptídicas completas, duas cadeias pesadas (H) e duas ca- deias leves (L), ou uma lg homóloga equivalente desta (por exemplo, um 25 nanobody camelídeo que compreende somente uma cadeia pesada); inclu- indo mutantes, variantes ou derivados funcionais completos destas que rete- nham as características essenciais de ligação a epítopos de uma molécula de lg, e incluindo anticorpos duplos específicos, biespecificos, multiespecífk cos e com duplo domínio variável; as moléculas de imunoglobulina podem

30 ser de qualquer classe (por exemplo, lgG, lgE, lgM, IgD, IgA e lgY), ou sub- classe (por exemplo, lgGl, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2). Adicionalmente, está incluído dentro do significado do termo "anticorpo" qualquer "fragmento de anticorpo". "Fragmento de anticorpo" significa uma molécula compreenden- do pelo menos uma cadeia polipeptÍdica que não seja completa, incluindo (i) fragmento Fab, que é um fragmento monovalente constituído pelos domínios 5 leve variável (VL), pesado variável (VH), leve constante (CL) e pesado cons- tante 1 (CHl); (ii) fragmento F(ab')2, que é um fragmento bivalente incluindo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de articula- ção (h/nge); (iii) uma parte da cadeia pesada de um fragmento Fab (Fd), que consiste nos domínios VH e CHl; (iv) um fragmento do fragmento variável 10 (Fv), que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticor- po, (v) um fragmento de domínio de anticorpo (dAb), que compreende um único domínio variável (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)); (vi) um anticorpo camelídeo; (vii) uma região determinante de complementarida- - de (CDR) isolada; (viii) um fragmento de cadeia única, Fv, no qual um domí-

, 15 nio VH e um domínio VL estão unidos por um peptídeo ligador que permite que os dois domínios se associem para formar um sÍtio de ligação a antíge- no (Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (ix) um diabody, que é um anticorpo bivalente, biespecífi- co no qual os domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia poli- 20 peptídica, mas por meio de um ligador que é curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, assim os forçando a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criando dois sÍ- tios de ligação a antígeno (\NO94/13804; P.

Holliger et al, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 90 6444-6448, (1993)); e (X) um anticorpo Iinear, que compreende 25 um par de segmentos Fv in tandem (VH-CHI-VH-CHI), os quais, juntamente com polipeptídeos complementares da cadeia leve, formam um par de regi- ões de ligação a antígenos; (xi) fragmentos multivalentes de anticorpos (dí- meros, trímeros e/ou tetrâmetros de SCFv (Power and Hudson, J lmmunol.

Methods 242: 193-204 9 (2000)); e (xii) outras partes não completas de ca- 30 deias pesadas e/ou de Ieves, ou mutantes, variantes ou derivados destas, isoladamente ou em qualquer combinação.

Considerando que anticorpos podem ser modificados em algu-

mas maneiras, o termo "anticorpo" deve ser interpretado de modo a cobrir qualquer membro de Iigação específica ou substância tendo um domínio de ligação com a especificidade exigida.

Consequentemente, este termo abran- ge fragmentos de anticorpos, derivados, equivalentes funcionais e homólo-

5 gos de anticorpos, incluindo qualquer polipeptídeo compreendendo um do- mínio de ligação de imunoglobulinas, seja natural ou total ou parcialmente sintético.

Moléculas quiméricas compreendendo um domínio de Iigação de imunoglobulina, ou equivalente, fundidas a outro polipeptideo estão, portan- to, incluídas.

A clonagem e a expressão de anticorpos quiméricos estão des-

IO critas em EP-A-0120694 e EP-A-0125023 e nas Patentes U.S.

N°' 4 816 397 e4816567. "SÍtio de combinação do anticorpo" é aquela parte estrutural da molécula de um anticorpo, formada por regiões de cadeia leve ou pesada e - de variáveis e hipervariáveis de cadeia leve, que Iiga especificamente antí-

, 15 geno.

A expressão "molécula de anticorpo" em suas várias formas gramaticais, neste relatório descritivo, contempla uma molécula intacta de imunoglobulina e uma parte imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina. 20 Moléculas exemplares de anticorpos são moléculas intactas de imunoglobulinas, moléculas substancialmente intactas de imunoglobulinas e as partes de uma molécula de imunoglobulina que contenham o parátopo, incluindo as partes conhecidas na técnica como Fab, Fab', F(ab')2 e F(v), sendo estas partes preferidas para uso nos métodos terapêuticos aqui des-

25 critos.

Anticorpos podem ser também biespecificos, em que um domí- nio de ligação do anticorpo é um membro de ligação específica da invenção, e o outro domínio de ligação possui uma especificidade diferente, por exem- plo, para recrutar uma função efetora ou os similares.

Anticorpos biespecifi-

30 cos da presente invenção incluem aqueles em que um domínio de ligação do anticorpo é um membro de ligação específica da presente invenção, incluin- do um fragmento deste, e o outro domínio de ligação é um anticorpo distinto ou seu fragmento, incluindo aquele de um anticorpo específico distinto anti- câncer ou antitumoral. O outro domínio de ligação pode ser um anticorpo que reconhece ou tem como alvo um determinado tipo celular, como em um anticorpo específico contra célula neural ou glial. Nos anticorpos biespecífi- 5 cos da presente invenção, o domínio de ligação do anticorpo da invenção pode ser combinado com outros domínios de ligação ou moléculas que re- conheçam receptores celulares em particular e/ou que modulem células em uma determinada maneira, como, por exemplo, um modulador imune (por exemplo, interleucina(s)), um modulador de crescimento ou citocina (por e- lO xemplo, fator de necrose tumoral (TNF), e especialmente, a modalidade bi- específica de TNF demonstrada em U.S.S.N. 60/355 838, depositado em 13 de fevereiro de 2002, aqui incorporado em sua totalidade) ou uma toxina (por exemplo, ricina) ou agente ou fator antimitótico ou apoptótico. Dessa

W forma, os anticorpos anti-FAP da invenção podem ser utilizados para dire- , 15 cionar ou orientar agentes, marcações, outras moléculas ou compostos ou anticorpos para sÍtios estromais, especialmente áreas de cicatrização de feridas, inflamação, câncer ou tumores. A expressão "anticorpo monoclonal" em suas várias formas gramaticais refere-se a um anticorpo tendo somente um tipo de sÍtio de 20 combinação do anticorpo capaz de imunorreagir com um determinado antí- geno. Um anticorpo monoclonal, por conseguinte, tipicamente exibe uma única afinidade de ligação por qualquer antígeno com o qual imunorreaja. Um anticorpo monoclonal pode conter também uma molécula de anticorpo tendo uma pluralidade de sÍtios de combinação do anticorpo, cada uma imu- 25 noespecífica para um antígeno d iferente; por exemplo, um anticorpo mono- clonal biespecífico (quimérico). O termo "domínio de ligação a antígeno" descreve a parte de um anticorpo que se liga especificamente e é complementar a uma parte ou a todo um antígeno. Quando um antígeno é grande, um anticorpo pode ligar- 30 se a uma determinada parte do antígeno somente, sendo esta parte deno- minada epítopo. Um domínio de ligação a antígeno pode ser munido de um ou mais domínios variáveis do anticorpo. De preferência, um domínio de li-

gação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo e uma região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo. lmunoconjugados ou proteínas de fusão de anticorpos da pre- sente invenção, em que os anticorpos, moléculas de anticorpos, ou seus

5 fragmentos, úteis na presente invenção estão conjugados ou ligados a ou- tras moléculas ou agentes, incluem ainda, entre outros, tais anticorpos, mo- léculas ou fragmentos conjugados a um agente de ablação quimica, toxina, imunomodulador, citocina, agente citotóxico, agente quimioterápico, agente antimicrobiano ou peptídeo, parede celular e/ou desregulador da membrana

10 celular, ou fármaco.

O termo "específico" pode ser utilizado para se referir à situação na qual um dos membros de ligação específica de um par não exibirá qual- quer ligação significante a moléculas que não sejam seu(s) parceiro(s) de - ligação específica.

O termo pode aplicar-se também quando, por exemplo,

. 15 um domínio de ligação a antígeno é específico para um determinado epítopo presente em uma série de antígenos, em cujo caso o membro de ligação específica que é portador do domínio de ligação a antígeno será capaz de se ligar aos vários antígenos portadores do epítopo.

O termo "compreende" é em geral utilizado no sentido de incluir,

20 ou seja, de permitir a presença de uma ou mais características ou compo- nentes.

O termo "consistindo essencialmente em" refere-se a um produ- to, especialmente uma sequência peptídica, de um número definido de resí- duos que não está Iigada covalentemente a um produto maior.

No caso do

25 peptídeo da invenção referido acima, os técnicos no assunto reconhecerão que modificações mínimas à terminação N ou C do peptídeo podem, contu- do, ser contempladas, tais como a modificação química da terminação para adicionar um grupo protetor ou os similares, por exemplo, a amidação do C- terminal. 30 O termo "isolado" refere-se ao estado no qual os membros de li- gação específica da invenção, ou o ácido nucleico que codifica tais membros de ligação, estarão de acordo com a presente invenção.

Os membros e o ácido nucleico estarão livres ou substancialmente livres de material com o qual estão naturalmente associados, tais como outros polipeptídeos ou áci- dos nucleicos com os quais são encontrados em seu ambiente natural, ou o ambiente no qual são preparados (por exemplo, cultura celular) quando tal 5 preparo é pela tecnologia do DNA recombinante DNA praticada in vitro ou in vivo. Os membros e o ácido nucleico podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e ainda assim, para fins práticos, estarem isolados - por e- xemplo, os membros estarão normalmente misturados com gelatina ou ou- tros veículos se utilizados para revestir placas de microtitulação para uso em 10 imunoensaios, ou estarão misturados com veículos ou diluentes farmaceuti- camente aceitáveis quando utilizados em diagnóstico ou terapia. Neste relatório descritivo, "pg" significa picograma, "ng" significa nanograma, "ug" ou "µg" significam micrograma, "mg" significa miligrama, "uL" ou "µL" significam microlitro, "mL" significa mililitro, "L" significa litro.

. 15 Os termos "anticorpo", "anticorpo de Iigação a neurônios", "anti- corpo lgM12", "anticorpo lgM42", "anticorpo 12", "anticorpo 42", "sHlgM12", "sFllgM42", "rHigM12'°, "rHlgM42" e quaisquer variantes não especificamente listadas, a serem utilizados neste relatório descritivo e conforme utilizados por todo o presente pedido de patente e nas reivindicações, referem-se a 20 material proteáceo incluindo proteínas únicas ou múltiplas, e se estendem às proteínas que possuem os dados sobre sequência de aminoácidos aqui des- critos e apresentados nas Figuras 5 e 6 e o perfil de atividades estabelecido neste relatório descritivo e nas Reivindicações. Especificamente, anticorpo igM12, anticorpo 12, rHlgM12 referem-se especialmente a polipeptideos ou 25 anticorpos ou fragmentos, especialmente anticorpos recombinantes ou frag- mentos, que compreendem a sequência apresentada na Figura 5. Anticorpo IgM12, anticorpo 12, rHlgM12 referem-se especialmente a polipeptídeos ou anticorpos ou fragmentos, especialmente anticorpos recombinantes ou frag- mentos, que compreendem sequências de CDR da região variável da cadeia 30 pesada apresentadas nas SEQ ID NOS: 31-33 e sequências de CDR da re- gião variável da cadeia leve apresentadas nas SEQ ID NOS: 34-36. Anticor- po lgM12, anticorpo 12, rHlgM12 inclui o anticorpo com a sequência da regi-

ão variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1 e a sequência da região va- riável da cadeia Ieve da SEQ ID NO: 11. Especificamente, anticorpo lgM42, anticorpo 42, rHlgM42 referem-se especialmente a polipeptídeos ou anticor- pos ou fragmentos, especialmente anticorpos recombinantes ou fragmentos, 5 que compreendem a sequência apresentada na Figura 6. Anticorpo lgM42, anticorpo 42, rHlgM42 referem-se especialmente a polipeptídeos ou anticor- pos ou fragmentos, especialmente anticorpos recombinantes ou fragmentos, que compreendem as sequências de CDR da região variável da cadeia pe- sada apresentadas nas SEQ ID NOS: 37-39 e sequências de CDR da região 10 variável da cadeia leve apresentadas nas SEQ ID NOS: 40-42. Anticorpo lgM42, anticorpo 42, rHlgM42 inclui anticorpo com a sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 17 e a sequência da região variá- vel da cadeia leve da SEQ ID NO: 27. Dessa forma, proteínas exibindo ativi- . dade substancialmente equivalente ou alterada são do mesmo modo con- , 15 templadas.

Essas modificações podem ser intencionais, por exemplo, tais como modificações obtidas através de mutagênese sÍtio-dirigida, ou podem ser acidentais, tais como as obtidas através de mutações em hospedeiros que são produtores do complexo ou de suas subunidades nomeadas.

Adi- cionalmente, os termos "anticorpo", "anticorpo de ligação a neurônios", "anti- 20 corpo lgM12", "anticorpo lgM42", "anticorpo 12", "anticorpo 42", "sHlgM12". "sHlgM42", "rHlgM12", "rHlgM42" destinam-se a incluir, dentro de suas a- brangências, proteínas especificamente enunciadas neste relatório descriti- vo, bem análogas substancialmente homólogas e variações alélicas.

Os resíduos de aminoácidos aqui descritos estão de preferência 25 na forma isomérica "L". Contudo, resíduos na forma isomérica "D" podem ser substituídos para qualquer resíduo de L-aminoácido, desde que a propri- edade funcional desejada de ligação de imunoglobulinas seja retida pelo po- lipeptídeo.

NH2 refere-se ao grupo amino livre presente na terminação amino de um polipeptídeo.

COOH refere-se ao grupo carbóxi Iivre presente na ter- 30 minação carbóxi de um polipeptídeo.

Em conformidade com a nomenclatura padrão para polipeptídeos, J.

Biol.

Chem., 243:3552-59 (1969), as abrevia- ções para resíduos de aminoácidos são mostradas na Tabela de Correspon-

dência abaixo.

Tabela de Correspondência Símbolo Símbolo Aminoácido 1 letra 3 letras Aminoácido 5 Y Tyr tirosina G Gly glicina F Phe fenilalanina M Met metionina A Ala alanina 10 S Ser serina lle isoleucina L Leu Ieucina T Thr treonina r

V Val valina

. 15 P Pro prolina K Lys lisina H His histidina Q Gln glutamina E Glu ácido glutâmico 20 W Trp triptofano R Arg arginina D Asp ácido aspártico N Asn asparagina C Cys cisteína 25 Cabe notar que todas as sequências de resíduos de aminoáci- dos estão aqui representadas por fórmulas cuja orientação direita e esquer- da é na direção convencional de terminação amino para terminação carbóxi.

Além do mais, deve ser notado que um traço no início ou final de uma se- quência de resíduos de aminoácidos indica uma ligação peptídica com outra 30 sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos.

A Tabela acima é apre- sentada para correlacionar as notações de três letras com as de uma letra que podem aparecer alternadamente neste relatório descritivo.

"Replicon" é qualquer elemento genético (por exemplo, pIasmí- deo, cromossomo, vÍrus) que atua como unidade autônoma de replicação do DNA in vivo; ou seja, é capaz de replicação sob seu próprio controle. "Vetor" é um replicon, tal como plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao 5 qual outro segmento de DNA pode ser anexado de modo a ocasionar a re- plicação do segmento anexado. "Molécula de DNA" refere-se à forma polimérica de desoxirribo- nucleotídeos (adenina, guanina, timina ou citosina) em sua forma de fita simples ou em hélice de fita dupla.

Este termo refere-se somente à estrutura 10 primária e secundária da molécula, e não a restringe quanto a quaisquer formas terciárias em particular.

Por conseguinte, este termo inclui DNA de fita dupla, encontrado, inter a/ia, em moléculas de DNA Iinear (por exemplo, fragmentos de restrição), vÍrus, plasmídeos e cromossomos.

Na discussão u sobre a estrutura de moléculas específicas de DNA de fita dupla, as sequên-

, 15 cias podem estar descritas neste relatório de acordo com a convenção nor- mal de fornecer somente a sequência na direção 5' para 3' ao longo da fita não transcrita de DNA (ou seja, a fita com uma sequência homóloga ao mR- NA)- "Origem de replicação" refere-se às sequências de DNA que 20 participam na sÍntese do DNA. "Sequência de codificação" do DNA é uma sequência do DNA de fita dupla que é transcrita e traduzida em um polipeptídeo in vivo quando coIada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas.

Os limites da sequência de codificação são determinados por um códon de partida na ter- 25 minação 5' (amino) e por um códon de parada de tradução na terminação 3' (carboxila). Uma sequência de codificação pode incluir, entre outros, se- quências procarióticas, CDNA de mRNA eucariótico, sequências do DNA genômico de DNA eucariótico (por exemplo, de mamífero) e mesmo se- quências sintéticas de DNA.

Um sinal de poliadenilação e uma sequência de 30 terminação da transcrição estão normalmente situados em 3' à sequência de codificação.

Sequências de controle de transcrição e de tradução são se-

quências reguladoras do DNA, tais como promotoras, intensificadoras, de sinalização de poIiadenilação, terminadoras e as similares, que possibilitam a expressão de uma sequência de codificação em uma célula hospedeira. "Sequêr)cia promotora" é uma região reguladora no DNA capaz 5 de se ligar à RNA polimerase em uma célula e dar início à transcrição de uma sequência de codificação em sentido descendente (direção 3'). Para fins de definição na presente invenção, a sequência promotora é ligada em sua terminação 3' pelo sÍtio de início de transcrição e se estende em sentido ascendente (direção 5') de modo a incluir o número mínimo de bases ou e- lO lementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima do fundo. Dentro da sequência promotora, será encontrado um sÍtio de início de transcrição (convenientemente definido por mapeamento com nuclease Sl), bem como domínio de Iigação a proteinas (sequências de consenso),

H responsáveis pela ligação da RNA poIimerase. Promotores eucarióticos fre- 15 quentemente, mas nem sempre, conterão "TATA" boxes "CAT" boxes. Pro- - motores procarióticos contêm sequências de Shine-Dalgamo além das se- quências de consenso -10 e -35. "Sequência de controle da expressão" é uma sequência do DNA que controla e regula a transcrição e a tradução de outra sequência do DNA.

20 Uma sequência de codificação está "sob o controle" de sequências de con- trole de transcrição e de tradução em uma célula quando a RNA polimerase transcreve a sequência de codificação em mRNA, o qual é então traduzido na proteína codificada pela sequência de codificação. Uma "sequência de sinalização" pode ser incluída antes da se- 25 quência de codificação. Esta sequência codifica um peptídeo de sinalização, N-terminal ao polipeptídeo, que comunica à célula hospedeira para direcio- nar o polipeptÍdeo para superfície celular ou para secretar o polipeptídeo no meio, e este peptídeo de sinalização é cortado pela célula hospedeira antes que a proteína deixe a célula. Sequências de sinalização podem ser encon- 30 tradas associadas com uma variedade de proteínas nativas a procarióticos e eucarióticos. O termo "oHgonucleotídeo", neste relatório descritivo ao ser feita referência à sonda da presente invenção, é definido como uma molécula composta por dois ou mais ribonucleotídeos, de preferência mais de três.

Seu tamanho exato dependerá de muitos fatores, os quais, por sua vez, de- pendem da função e uso final do oligonucleotídeo. 5 O termo "primer" (iniciador) neste relatório descritivo refere-se a um oligonucleotídeo, seja natural como em material purificado resultante da digestão por enzimas de restrição ou produzido sinteticamente, que seja ca- paz de atuar como ponto de partida de síntese quando colocado em condi- ções nas quais a sÍntese de um produto da extensão do primer, o qual é

10 complementar a uma fita de ácido nucleico, é induzida, ou seja, na presença de nucleotídeos e de um agente indutor tal como DNA poIimerase e a tem- peratura e pH adequados.

O piimer pode ser de fita simples ou de dupla e precisa ser suficientemente longo para iniciar a sÍntese do produto desejado r da extensão na presença do agente indutor.

O comprimento exato do primer

. 15 dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, fonte do primer e uso do método.

Por exemplo, para aplicações diagnósticas, dependendo da complexidade da sequência alvo, o oligonucleotídeo iniciador contém tipica- mente 15-25 ou mais nucleotídeos, embora possa conter um número menor de nucleotídeos. 20 Os primers neste relatório descritivo são selecionados para se- rem "substancialmente" complementares a diferentes fitas de uma detemi- nada sequência alvo de DNA. lsso significa que os phmers precisam ser su- ficientemente complementares para se hibridizarem com suas respectivas fitas.

Por conseguinte, a sequência do primer não necessita refletir a se-

25 quência exata do modelo.

Por exemplo, um fragmento não complementar de nucleotídeos pode ser anexada à extremidade 5' do primer, sendo a se- quência restante do primer complementar à fita.

Alternativamente, bases não complementares ou sequências mais longas podem ser intercaladas no pri- mer, desde que a sequência do primer possua complementaridade suficiente

30 com a sequência da fita com a qual se hibridizará e assim formar o modelo para a síntese do produto de extensão.

Neste relatório descritivo, os termos "endonucleases de restri-

ção" e "enzimas de restrição" referem-se a enzimas bacterianas que cortam, cada qual, o DNA de fita dupla em ou próxima a uma sequência específica de nucleotídeos.

Uma célula foi "transformada" por DNA exógeno ou heterólogo

5 quando tal DNA foi introduzido no interior da célula.

O DNA transformante pode ou estar integrado (ligado covalentemente) ou não no DNA cromosso- mal, formando o genoma da célula.

Em procariotos, leveduras e células de mamíferos, por exemplo, o DNA transformante pode ser mantido em um e- lemento epissomal tal como um plasmídeo.

Com respeito a células eucarióti-

lO cas, uma célula estavelmente transformada é aquela na qual o DNA trans- formante tornou-se integrado em um cromossomo de tal modo que é herda- do por células filhas através da replicação do cromossomo.

Esta estabilidade é demonstrada pela capacidade da célula eucariótica de estabelecer Iinha- ,b gens celulares ou clones compostos por células filhas contendo o DNA

. 15 transformante. "Clone" é uma população de células derivadas a partir de uma única célula ou ancestral comum por mitose. "Linhagem celular" é um clone de uma célula primária que é capaz de crescimento estável in vitro por muitas gerações.

Duas sequências de DNA são "substancialmente homólogas"

20 quando ao menos aproximadamente 75% (de preferência ao menos aproxi- madamente 80% e mais preferivelmente ao menos aproximadamente 90 ou 95%) dos nucleotídeos se equiparam sobre o comprimento definido das se- quências de DNA.

Sequências que são substancialmente homólogas podem ser identificadas comparando as sequências utilizando um so/hvare padrão

25 disponível em bancos de dados de sequências, ou em um experimento de hibridização por Southem B/otting em, por exemplo, condições rigorosas conforme definidas para aquele sistema em particular.

Definir condições a- propriadas para hibridização está ao alcance da competência na técnica.

Ver, por exemplo, Maniatis et al., supra; DNA C/oning, Vol.

I & ll, supra; Nu-

30 c/eic Acid Hybridization, supra.

Deve ser reconhecido que são também abrangidas pelo âmbito da presente invenção sequências de DNA codificadoras de membros de li-

gação específica (anticorpos) da invenção, as quais codificam, por exemplo,

um anticorpo tendo a mesma sequência de aminoácidos que as fornecidas na Figura 2 ou 10, ou compreendendo as sequências de domínios de regi-

ões CDR apresentadas neste relatório descritivo ou na Figura 10, mas para

5 as quais se degeneraram, "Degenerar-se para" significa, neste relatório des- critivo, que um códon diferente de três letras é utilizado para especificar um determinado aminoácido.

É bem sabido na técnica que os códons a seguir podem ser utilizados alternadamente para codificar cada aminoácido especí-

fico:

10 Fenilalanina (Phe ou F) UUU ou UUC

Leucina (Leu ou L) UUA ou UUG ou CUU ou CUC ou CUA ou CUG lsoleucina (lle ou I) AUU ou AUC ou AUA

Metionina (Met ou M) AUG Valina (Val ou V) GUU ou GUC de GUA ou GUG UCU ou UCC ou UCA ou UCG ou AGU ou AGC , 15 Serina (Ser ou S) Prolina (Pro ou P) CCU ou CCC ou CCA ou CCG

Treonina (Thr ou T) ACU ou ACC ou ACA ou ACG

Alanina (Ala ou A) GCU ou GCG ou GCA ou GCG

Tirosina (Tyr ou Y) UAU ou UAC

20 Histidina (His ou H) ou CAC Glutamina (Gln ou Q) CAA ou CAG Asparagina (Asn ou N) AAU ou AAC Lisina (Lys ou K) AAA ou AAG Ácido aspártico (Asp ou D) GAU ou GAC 25 Ácido glutâmico (Glu ou E) GAA ou GAG Cisteina (Cys ou C) UGU ou UGC

Arginina (Arg ou R) CGU ou CGC ou CGA ou CGG ou AGA ou AGG

Glicina (Gly ou G) GGU ou GGC ou GGA ou GGG

Triptofano (Trp ou W) UGG

30 Códon de terminação UAA (ocre) ou UAG (âmbar) ou UGA (opala) Deve ser entendido que os códons especificados acima se des- tinam a sequências de RNA.

Os códons correspondentes para DNA possu-

em T em substituição a U.

Mutações podem ser efetuadas nas sequências codificadoras dos aminoácidos, fragmentos de anticorpos, sequências de regiões CDR apresentadas nas Figuras 5 ou 6, ou nas sequências de ácidos nucleicos 5 apresentadas na Figura 5 ou 6, de tal modo que um determinado códon é mudado para um códon que codifica um aminoácido diferente.

Tal mutação é em geral efetuada com o menor número possivel de mudanças em nucleo- tídeos.

Uma mutação de substituição desse tipo pode ser efetuada para mu- dar um aminoácido na proteína resultante em maneira não conseNadora 10 (por exemplo, mudando o códon de um aminoácido que pertença a um a- grupamento de aminoácidos com um determinado tamanho ou caracteristica para um aminoácido que pertença a outro agrupamento) ou em maneira conservadora (por exemplo, mudando o códon de um aminoácido que per- . tença a um agrupamento de aminoácidos com um determinado tamanho ou

. 15 característica para um aminoácido que pertença ao mesmo agrupamento). Tal mudança conseNadora leva geralmente a menos mudança na estrutura e função da proteína resultante.

Uma mudança não conservadora mais pro- vavelmente afterará a estrutura, a atividade ou a função da proteína resultan- te.

A presente invenção deve ser considerada no sentido de que inclui se- 20 quências contendo mudanças conservadoras que não alteram significativa- mente a atividade ou as características de ligação da proteína resultante.

A seguir, é apresentado um exemplo de vários agrupamentos de aminoácidos: Aminoácidos com grupos R não polares: 25 Alanina, Valina, Leucina, lsoleucina, Prolina, Fenilalanina, Triptofano, Metio- nina Aminoácidos com grupos R polares sem carga: Glicina, Serina, Treonina, Cisteína, Tirosina, Asparagina, Glutamina Aminoácidos com grupos R poIares com carga (com carga negativa em pH 30 6,0) Ácido aspártico, Ácido glutâmico Aminoácidos básicos (com carga positiva em pH 6,0)

Lisina, Arginina, Histidina (em pH 6,0) Outro agrupamento pode ser os aminoácidos com grupos fenila:

Fenilalanina, Triptofano, Tirosina Outro agrupamento pode ser de acordo com o peso molecular

5 (ou seja, tamanho de grupos R): Glicina 75 Alanina 89

Serina 105 Prolina 115

Valina 117 Treonina 119 Cisteína 121 Leucina 131

10 lsoleucina 131 Asparagina 132 Ácido aspártico 133 Glutamina 146

Lisina 146 Ácido glutâmico 147 Metionina 149 Histidina (em pH 6,0) 155 Fenilalanina 165 Arginina 174

, 15 Tirosina 181 Triptofano 204 Substituições especialmente preferidas são: - Lys para Arg e vice-versa de tal modo que uma carga positiva possa ser mantida; - GIu para Asp e vice-versa e tal modo que uma carga negativa

20 possa ser mantida; - Ser para Thr de tal modo que um -OH livre possa ser mantido;

e - Gln para Asn de tal modo que um NH2 livre possa ser mantido.

Substituições conservadoras exemplares e preferidas incluem

25 qualquer uma de: glutamina (Q) para ácido glutâmico (E) e vice-versa; leucina (L) para valina N) e vice-versa; serina (S) para treonina (T) e vice-versa; isoleu- cina (I) para valina (V) e vice-versa; lisina (K) para glutamina (Q) e vice- versa; isoleucina (I) para metionina (M) e vice-versa; serina (S) para aspara-

30 gina (N) e vice-versa; Ieucina (L) para metionina (M) e vice-versa; lisina (L) para ácido glutâmico (E) e vice-versa; alanina (A) para serina (S) e vice- versa; tirosina (Y) para fenilalanina (F) e vice-versa; ácido glutâm ico (E) para ácido aspártico (D) e vice-versa; leucina (L) para isoleucina (I) e vice-versa; lisina (K) para arginina (R) e vice-versa.

Substituições de aminoácidos podem também ser introduzidas para substituir um aminoácido com uma propriedade especiaknente preferí-

5 vel.

Por exemplo, Cys pode ser introduzida para um sítio potencial de pontes dissulfeto com outra Cys.

His pode ser introduzida como sÍtio especialmente "catalítico" (ou seja, His pode atuar como ãcido ou base e é o aminoácido mais comum em catálise bioquímica). Pro pode ser introduzida por causa de sua estrutura especialmente plana, o que induz cuNas (3 na estrutura da pro-

lO teína.

Duas sequências de aminoácidos são "substancialmente homó- logas" quando ao menos aproximadamente 70% dos resíduos de aminoáci- dos (de preferência ao menos aproximadamente 8Õ°/o e mais preferivelmente * ao menos aproximadamente 90 ou 95%) são idênticos, ou representam , 15 substituições conservadoras.

As regiões CDR de dois anticorpos são subs- tancialmente homólogas quando um ou mais aminoácidos sofrem uma subs- tituição similar ou conservadora de aminoácidos, e em que o anticorpo ou os anticorpos possuem o perfil de ligação e atividades de uma ou mais entre lgM12 ou lgM42 aqui descritas. 20 Uma região "heteróloga" do DNA construído é um segmento i- dentificável de DNA dentro de uma molécula maior de DNA que não é en- contrado em associação com a molécula maior na natureza.

Por conseguin- te, quando a região heterólogo codifica um gene de mamífero, o gene será normalmente flanqueado por DNA que não flanqueia o DNA genômico do

25 mamlfero no genoma do organismo de origem.

Outro exemplo de uma se- quência heterólogo de codificação é uma construção na qual a própria se- quência de codificação não é encontrada na natureza (por exemplo, um CD- NA no qual a sequência genômica de codificação contém introns, ou se- quências sintéticas tendo códons diferentes que o gene nativo). Variações 30 alélicas ou eventos mutacionais naturais não dão origem a uma região hete- róloga de DNA conforme definido neste relatório descritivo.

Uma sequência de DNA está "operativamente ligada" a uma se-

quência de controle de expressão quando a sequência de controle de ex- pressão controla e regula a transcrição e a tradução daquela sequência de DNA. O termo "operativamente ligado" inclui ter um sinal apropriado de par- tida (por exemplo, ATG) na frente da sequência de DNA a ser expressa e 5 mantendo o quadro correto de leitura para permitir a expressão da sequên- cia de DNA sob o controle da sequência de controle de expressão e a pro- dução do produto desejado codificado pela sequência de DNA. Se um gene que se deseja inserir em uma molécula de DNA recombinante não contiver um sinal apropriado de partida, tal sinal de partida pode ser inserido na fren- lO te do gene. O termo "condições padrão de hibridização" refere-se a condi- ções de sal e temperatura substancialmente equivalentes a 5 x SSC e 65 °C para hibridização e para lavagem. Contudo, um técnico no assunto reconhe- cerá que tais "condições padrão de hibridização" são dependentes de condi-

W 15 ções específicas incluindo a concentração de sódio e magnésio no tampão. o comprimento e a concentração da sequência de nucleotídeos, o percentual de erro de pareamento, o percentual de formamida e os similares. Adicio- nalmente importante na determinação de "condições padrão de hibridização" é se as duas sequências em hibridização são RNA-RNA, DNA-DNA ou RNA- 20 DNA. Tais condições padrão de hibridização são facilmente determinadas pelo técnico no assunto de acordo com fórmulas bem conhecidas, em que a hibridização é tipicamente a 10-20 °C abaixo da Tm prevista ou determinada com lavagens de rigor mais alto, se desejado. O termo "agente" significa qualquer molécula, incluindo polipep- 25 tídeos, anticorpos, polinucleotídeos, compostos químicos e pequenas molé- culas. Especificamente, o termo agente inclui compostos tais como compos- tos em teste ou compostos candidatos a fármacos. O termo "agonista" refere-se a um ligante que estimula o recep- tor a se ligar ao ligante no mais amplo sentido.

30 O termo "ensaio" significa qualquer processo utilizado para me- dir uma propriedade específica de um composto. "Ensaio de rastreamento" significa um processo utilizado para caracterizar ou selecionar compostos com base em sua atividade a partir de uma coleção de compostos.

O termo "prevenir" ou "prevenção" refere-se a uma redução no risco de adquirir ou desenvolver uma doença ou transtorno (ou seja, fazendo com que pelo menos um dos sintomas clínicos da doença não se desenvo1-

5 va) em um indivíduo que pode ser exposto a um agente causador da doença ou predisposto à doença antecipadamente ao aparecimento da doença- O termo "profilaxia" é relacionado e abrangido no termo "preven- ção" e refere-se a uma medida ou procedimento cuja finalidade é prevenir, em vez de tratar ou curar uma doença.

Exemplos não Iimitantes de medidas

10 profiláticas podem incluir a administração de vacinas; a administração de heparina de baixo peso molecular a pacientes hospitalizados em risco de trombose em decorrência, por exemplo, da imobilização; e a administração de um agente antimalárico como cloroquina, antecipadamente a uma vista a e uma região geográfica onde a malária é endêmica ou na qual o risco de con- . 15 trair malária é alto. "Quantidade terapeuticamente eficaz" significa aqueia quantida- de de um fármaco, composto, agente, anticorpo ou agente farmacêutico que suscitará a resposta biológica ou médica de um indivíduo que está sendo pretendida por um médico ou outro clínico.

Especificamente, com respeito a 20 doenças ou condições neurológicas, o termo "quantidade eficaz" destina-se a incluir uma quantidade eficaz de um composto ou agente, tal como anti- corpo ou seu fragmento, que ocasionará uma alteração biologicamente signi- ficativa em um parâmetro clinicamente relevante da doença.

Este parâmetro pode incluir alteração na quantidade de Iesão neurológica ou óbito observá-

25 vel ou avaliável quando da imagem, alteração em um parâmetro funcional tal como movimento, fala ou cognição, ou a ausência ou redução de tal altera- ção em condições de risco ou suscetibilidade.

A expressão "quantidade te- rapeuticamente eficaz" é utilizada neste relatório descritivo para indicar uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir e, de preferência reduzir em 30 pelo menos aproximadamente 20 porcento, pelo menos aproximadamente 30 porcento, mais preferivelmente em pelo menos 50 porcento, mais preferi- velmente em pelo menos 70 porcento, mais preferivelmente em pelo menos

80 porcento, o mais preferível em pelo menos 90 porcento uma alteração clinicamente significativa em um fenômeno mensurável ou avaliável, ou ca- racterística patológica ou avaliação de função. O termo "tratar" ou "tratamento" de qualquer doença, condição, 5 lesão ou infecção refere-se em uma concretização melhorar a doença, con- dição, lesão ou infecção (ou seja, parar a morte ou lesão a uma célula ou tecido, reduzir a manifestação, a extensão ou a gravidade de pelo menos um de seus sintomas cIínicos). Em outra concretização, "tratar" ou "tratamento" refere-se a melhorar pelo menos um parâmetro físico, o que pode não ser 10 discernível para o paciente. Em ainda outra concretização, "tratar" ou "trata- mento" refere-se a modular a doença, condição, lesão ou infecção, seja fisi- camente, (por exemplo, estabilização de um sintoma discernível), fisiologi- camente, (por exemplo, estabilização de um parâmetro físico), ou ambos. e Em uma concretização adicional, "tratar" ou "tratamento" está relacionado a 4 15 retardar a progressão de uma doença ou reduzir a quantidade de Iesão, da- no, morte a células ou tecidos. A expressão "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entida- des moleculares e composições que são fisiologicamente toleráveis e que tipicamente não produzem reação alérgica ou similar não desejada, tais co- 20 mo indisposição gástrica, tonteira e as similares, quando administradas a um ser humano. Neste relatório descritivo, "pg" significa picograma, "ng" significa nanograma, "ug" ou "µg" significam micrograma, "mg" significa miiigrama, "uL" ou "µL" significam microlitro, "mL" significa mililitro, "L" significa litro.

25 B. Descrição detalhada da invenção Agentes neuroprotetores visam prevenir e tratar complicações que resultam em dano ao sistema nervoso central. Compostos ou agentes com capacidade para neuroproteção encontram aplicação em transtornos agudos tais como acidente vascular cerebral e lesões do sistema nervoso, 30 bem como em doenças crônicas tais como transtornos neurodegenerativos. Muitos dos mecanismos subjacentes do dano a tecidos neurais são similares nestas condições, e um composto ou agente neuroprotetor poderia ser utili-

zado em mais de um transtorno.

As doenças incluem transtornos vasculares cerebrais, lesão cerebral traumática, lesão na medula espinhal, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose amiotrófi- ca lateral (ALS), esclerose múltipla, epilepsia, doença(s) do neurônio motor e

5 neuropatia isquêmica.

Outras aplicações incluem neuroproteção durante a- nestesia e cirurgia. lnúmeros produtos foram investigados quanto a efeitos neuroprotetores, incluindo aqueles pertencentes às categorias de removedo- res de radicais livres, agentes antiexcitotóxicos, inibidores de apoptose (mor- te celular programada), agentes anti-inflamatórios, fatores neurotróficos,

10 quelantes de Íons de metais, moduladores de canais iônicos e terapia gené- tica.

Diversos produtos candidatos a neuroprotetores chegaram a estudos clínicos e não conseguiram mostrar significância, incluindo antagonistas de NMDA e agentes que reduzem a Iiberação de neurotransmissores.

Clark m

WM et al (2000) Stroke 31(6):1234-9; Sarco Rl et al (2001) JAMA 285

. 15 (13):1719-28; Albers, GW et al (2001) JAMA 286(21):2673-82). Um desafio para agentes neuroprotetores é a especificidade e o direcionamento de mo- do que efeitos de um agente sejam direcionados contra lesão ou neurônios danificados/comprometidos sem atividade significante contra células normais e, assim, efeitos colaterais não desejados, mesmo potencialmente nocivos. 20 A presente invenção provê agora agente(s) específico(s) e tolerável(is) ca- paz(es) de atravessar a barreira hematoencefálica e atingir áreas de lesão, comprometimento ou dano para conferir proteção, com efeitos minimos não desejados em neurônios motores.

A invenção em geral provê parceiros de Iigação específica, es- 25 pecialmente anticorpos que demonstram se ligar a neurônios, com aplicação como agentes neuroprotetores para uso ern diagnóstico, monitoramento, melhora e tratamento de doenças e condições em que neurônios ou células nervosas estejam comprometidos, incluindo condições neurodegenerativas, morte e lesão de células nervosas.

Os anticorpos da presente invenção pos- 30 suem certas qualidades únicas e notáveis que os tornam especialmente ú- teis e aplicáveis em neuroproteção e/ou neuroregeneração e no diagnóstico e na terapia para doenças e condições neurológicas.

Os novos anticorpos da invenção, especialmente anticorpos recombinantes, são demonstrados neste relatório descritivo que cruzam a barreira hematoencefálica com eficiência e sem qualquer modificação, que protegem neurônios da morte celular e que são direcionados a lesões neurais e a sÍtios cIe lesão no sistema nervoso 5 central. Os anticorpos melhoram a função de nervos e mantêm axônios em modelos animais de lesão axonal crônica e desmielinização. Os anticorpos exibem toxicidade mínima em animais e não exacerbam condições autoimu- nes, conforme avaliado em modelos animais. A invenção em geral provê parceiros de ligação específica, es- lO pecialmente anticorpos que demonstram se Iigar a neurônios, com aplicação como agentes terapêuticos, isoladamente ou em combinação com outros ou alternativos agentes neuroativos para melhora e o tratamento de doenças e condições em que neurônios ou células nervosas estejam comprometidos, ^ incluindo condições neurodegenerativas, morte e lesão de células nervosas.

. 15 Este pedido de patente comprova a capacidade e a atividade terapeutica- mente relevante de anticorpos da presente invenção, incluindo lgM12, em modelos animais de doenças ou déficits neurológicos. Especificamente, es- tudos fornecidos neste relatório descritivo demonstram a capacidade e a ati- vidade em um modelo TMEV, em um modelo animal reconhecido de doença 20 do neurônio motor, especialmente ALS, e fornece estudos em modelos de lesão na medula espinhal. São providas composições para uso na melhora ou no tratamento de qualquer uma de tais doenças ou na prevenção de Ie- são a nervos ou na proteção de nervos em situações de comprometimento ou risco de comprometimento. 25 Estudos anteriores com IgM12 e lgM42 demonstraram que o an- ticorpo derivado do soro se liga a neurônios do sistema nervoso central, dá sustentação à extensão de neuritos em substrato revestido com anticorpo e suprime a inibição da extensão de neuritos de mielina do sistema neNoso central em estudos in vitro (VVarrington A et al (2004) J Neuropath Exp Neu- 30 rol 63(5):461-473). Estudos de sHlgM12 injetado em animais TMEV mostra- ram atividade noturna espontânea aumentada, contudo, os títulos do vÍrus não foram avaliados nos animais e possÍveis efeitos antivirais não puderam ser determinados (Rodrigues M et al (2009) Neuro/ogy 72:1269-1276). Os estudos aqui descritos fornecem a sequência completa do anticorpo 12 e do anticorpo 42 inteiramente humanos, bem como do rHlgM42 recombinante.

Estudos demonstrando efeitos neuroprotetores notáveis e terapeuticamente 5 relevantes destes anticorpos derivados do soro e recombinantes em animais e modelos com animais de doença, bem como sua Iigação específi- ca/direcionamento a sÍtios de lesão neural são fornecidos abaixo.

Anticorpos, composições e métodos terapêuticos mAbs humanos autorreativos se enquadram na classificação de 10 autoanticorpos naturais humanos (NatAbs) (Cohen I.R. (2007) J Autoimmun 29:246-249). NatAbs fazem parte de nosso repertório de imunoglobulinas humanas (Cohen, I.R., and M.

Schwartz (1999) journal of neuroimmuno/ogy 100:111-114), são naturalmente produzidas a partir de nossos genes, nor- . malmente sem mutações somáticas e podem ter como função estimular pro- 15 cessos celulares ou remover reslduos de células (Lutz, HU (2007) J Auto- . immun 29:287-294). NatAbs reagem contra antigenos próprios, ao passo que Abs convencionais reagem contra antígenos exógenos.

NatAbs são de afinidade relativamente baixa, normalmente poIirreativos e são com frequên- cia lgMs.

O mecanismo de ação destas lgMs humanas parece ser similar, 20 atuando através de microdomínios de membrana.

NatAbs são por definição polirreativos, por conseguinte, identificar o antlgeno pertinente para uma função específica in vivo pode representar um desafio.

Sem estar preso à teoria, é atualmente entendido que estas lgMs se ligam a microdomínios de membrana que se reticulam com moléculas sobre a superfície celular.

Molé- 25 culas não normalmente no contexto são reunidas montando um complexo de sinalização (Rodriguez, M., A.

E.

Warrington, and L.

R.

Pease (2009) Neuro- /ogy 72:1269-1276). Dessa forma, moléculas terapêuticas foram identificadas pelo rastreamento de anticorpos monoclonais (mAbs) humanos autorreativos a 30 partir do soro de indivíduos que carregam os rnAbs em alta concentração sem doença mediada por Ab.

Tais mAbs são testados quanto à ligação à superfície de células do sistema nervoso sem levar em conta antígeno.

Os mAbs são testados depois quanto à habilidade para modular um modelo de doença.

Esse método para identificar mAbs com eficácia biológica é diferen- te da metodologia comumente empregada pelo setor farmacêutico (Rodri- guez, M., A.

E.

Warrington, and L.

R.

Pease (2009) Neuro/ogy 72:1269-

5 1276). Foi demonstrado que certas IgMs humanas podem promover a remie- linização (Warrington AE et al (2000) Proc Natl Acad Scl U S A 97:6820- 6825). Por exemplo, uma de tais IgMs é rHlgM22 monoclonal humana re- combinante que promove a remielinização (Mitsunaga YB et al (2002) Faseb j 16:1325-1327). O anticorpo rHlgM22 liga-se a oligodendrócitos e a mielina

10 e promove a remielinização do sistema nervoso central em modelos de MS induzida por vírus e toxina (Warrington AE et al (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97:6820-6825; Bieber AJ et al (2002) G/ia 37:241-249). A remielinização da medula espinhal é induzida após uma dose baixa única de rHlgM22 (War- . rington AE et al (2007) j Neurosci Res 85:967-976). 15 É notável que um tratamento intraperitoneal (i-p-) com uma mo- . lécula de curta existência (meia-vida estimada de 15 horas em camundon- gos) promova reparo máximo do tecido dentro de 5 semanas em um modelo de MS com pouco reparo inerente espontâneo.

Depois de injeção periférica, rHlgM22 atravessa a barreira hematoencefálica (BBB) e se acumula dentro

20 de lesões no cérebro e na medula espinhal de camundongos com desmieli- nização. rHlgM22 marcado com esfera de ferritina foi detectado em lesões in vivo por MRI (Pirko I et al (2004) Faseb J 18:1577-1579). Um anticorpo lgM adicional do soro humano com capacidade remielinizante, sHlgM46, e seu equivalente recombinante rHlgM46, foi tam- 25 bém descrito.

Os anticorpos derivados do soro sHlgM22 e sHlgM46, e suas versões recombinantes, e métodos para remielinização estão descritos, por exemplo, em WO 0185797. O anticorpo rHlgM22 e métodos destes são a- brangidos, por exemplo, pelas Patentes US 7 473 423 e 7 807 166. A invenção provê autoanticorpos humanos, incluindo anticorpos 30 monoclonais e especialmente anticorpos recombinantes, que demonstram atividade na promoção, na estimulação, na proteção e/ou na regeneração de neurônios no sistema nervoso central.

Em um aspecto da invenção, estes anticorpos, incluindo seus fragmentos, demonstram atividade em neuropro- teção, preservação e regeneração neuronal e axonal na prevenção ou redu- ção de morte de célula nervosa mediada por lesão no sistema nervoso cen- tral.

Os anticorpos podem ser aplicados no tratamento ou na melhora de do-

5 enças ou condições, ou na prevenção ou redução de déficits em células ner- vosas e de morte ou apoptose de células nervosas associadas com doenças ou condições, especialmente quando nervos são danificados, lesados ou de outra forma comprometidos.

As condições ou doenças para uso ou aplicação dos anticorpos da invenção incluem situações nas quais a perda de estrutu- lO ra, função ou sobrevida de neurônios está envolvida ou associada, incluindo lesão ou trauma cerebral, lesão na medula espinhal (SCl), lesão em nervo, lesão na cabeça, condições em que o suprimento sanguíneo ao cérebro está reduzido ou comprometimento, doenças infecciosas do cérebro, doenças ^ neurodegenerativas.

Exemplos destas doenças ou condições incluem lesão . 15 na medula espinhal (SCl), esclerose lateral amiotrófica (ALS), esclerose múl- tipla (MS), doença de Alzheimer, acidente vascular cerebral, doença de Par- kinson, doença de Huntington, anóxia pré-natal/isquemia perinatal e/ou para- lisia cerebral, encefalopatia, mielopatia e doenças do neurônio motor.

Os agentes neuromoduladores ou anticorpos da invenção pos- 20 suem uma ou mais das seguintes características: protegem e/ou estabilizam neurônios; se direcionam a sítios no sistema nervoso ou de dano, compro- metimento ou lesão de células nervosas; e/ou bloqueiam a morte celular, por exemplo, morte celular induzida por peróxido de hidrogênio.

A invenção pro- vê anticorpos monoclonais que se ligam a neurônios da invenção e que são 25 capazes de promover a extensão de neuritos e de proteger neurônios de danos para fins diagnósticos e terapêuticos no sistema nervoso central.

Es- pecificamente, são providos anticorpos recombinantes, em que os referidos anticorpos reconhecem e são capazes de se ligar a neurônios, incluindo neurônios corticais, neurônios do hipocampo, células granulares do cerebelo 30 e células ganglionares da retina.

A presente invenção provê anticorpo(s) exemplar(es) ou seu(s) fragmento(s), anticorpo 12 e anticorpo 42, especialmente lgM12 ou lgM42 humanas derivadas do soro ou recombinantes. Em um aspecto específico adiciona!, o anticorpo da invenção compreende a sequência de aminoácidos do anticorpo 12 ou 42, incluindo conforme especificadas na Figura 5 e/ou Figura 6. O anticorpo lgM12 recombinante da presente invenção compreen- 5 de a sequência da cadeia pesada variável (SEQ ID NO: 1) e a da cadeia le- ve variável (SEQ ID NO: 11) conforme especificadas na Figura 5. O anticor- po lgM42 recombinante da presente invenção compreende a sequência da cadeia pesada variável (SEQ ID NO: 17) e a da cadeia leve (SEQ ID NO: 27) conforme especificadas na Figura 6. Em um aspecto da invenção, é provido 10 um anticorpo recombinante ou sintético que se Iiga a neurônios que compre- ende as sequências variáveis de regiões CDR apresentadas nas Figuras 5 e

6. O anticorpo 12 compreende as sequências de CDRs da cadeia pesada: CDRI GGSVSLYY (SEQ ID NO:31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO:32) e CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO:33), e as sequências de CDRs da ca- . 15 deia Ieve: CDRI QSISSY (SEQ IDNO: 34), CDR2 AAS (SEQ (D NO:35) e CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO:36), conforme especificadas na Figura 5. O anticorpo 42 compreende as sequências de CDR da cadeia pesada: CDRI GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ÍD NO:38) e CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO:39), e as sequências de CDRS da ca- 20 deia leve: CDRI QGlG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO:41) e C- DR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42), conforme especificadas na Figura 6. Painéis de anticorpos recombinantes ou de seus fragmentos, in- cluindo fragmentos Fab ou bibliotecas de apresentação em fagos, que sejam capazes de reconhecer neurônios, especialmente neurônios humanos, po- 25 dem ser rastreadas para várias propriedades, ou seja, afinidade, isotipo, es- tabilidade, etc. De interesse particular são anticorpos que imitam a atividade dos anticorpos exemplares lgM12 e lgM42 e que tenham a capacidade para se ligar a neurônios e de protegê-los contra morte celular ou lesão, tal como, por exemplo, morte celular mediada por peróxido. Tais anticorpos podem ser 30 rapidamente identificados e/ou rastreados em ensaios de ligação específica e atividade. Anticorpos recombinantes, que compreendam a região de liga- ção a antígeno ou as regiões CDR da cadeia pesada e/ou da Ieve dos pre-

sentes anticorpos lgM12 e/ou IgM42, podem ser gerados e rastreados quan-

to à atividade.

Em geral,Fas regiões CDR, compreendendo sequências de ami- noácidos substancialmente conforme apresentadas como as regiões CDR

5 da Figura 5 e 6, estarão incluídas em uma estrutura que permita a ligação das regiões CDR à superficie ou na superfície de neurônios e, especialmen- te, a neurônios de mamíferos, especialmente neurônios humanos, de maca- co, babuíno, rato e/ou camundongo. "Substancialmente conforme apresen- tadas", neste relatório descritivo, significa que as sequências de regiões va-

lO riáveis e/ou especialmente as sequências de CDR da invenção serão idênti- cas ou altamente homólogas às regiões especificadas da Figura 5 e 6. Por "altamente homóloga", é contemplado que somente poucas substituições, de preferência de 1 e 8, preferivelmente de 1 a 5, preferivelmente de 1 a 4 ou de 1 a 3 ou 1 ou 2 substituições podem ser efetuadas na sequência da regi-

. 15 ão variável e/ou nas sequências de CDR.

O termo "substancialmente con- forme apresentadas" inclui substituições de aminoácidos especialmente conseNadoras que não afetam de modo substancial ou significante a especi- ficidade e/ou a atividade dos presentes anticorpos.

As substituições podem ser efetuadas na sequência da região

20 variável fora das CDRS de modo a reter as sequências de CDRS.

Por conse- guinte, alterações na sequência da região variável ou sequências alternati- vas não homólogas ou embutidas da região variável podem ser introduzidas ou utilizadas, de tal modo que as sequências de CDRs sejam mantidas e o restante da sequência da região variável possa ser substituido.

Alternativa-

25 mente, as substituições podem ser efetuadas especificamente nas CDRs.

As sequências de CDR dos anticorpos da presente invenção estão apresenta- das e descritas neste relatório e incluídas na Figura 5 e 6. O anticorpo 12 compreende as sequências de CDR da cadeia pesada: CDRI GGSVSLYY (SEQ ID NO:31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO:32) e CDR3 ARSA-

30 SIRGWFD (SEQ ID NO:33), e as sequências de CDR de cadeia leve CDRI QSISSY (SEQ IDNO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO:35) e CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO:36), conforme especificadas na Figura 5. O anticorpo 42 com-

preende as sequências de CDR da cadeia pesada: CDRI GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO:38) e CDR3 VRRSGPDRNSS- PADF (SEQ ID NO:39), e as sequências de CDR de cadeia leve CDRI QGlG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO:41) e CDR3 QKYNSAPRT 5 (SEQ ID NO: 42), conforme especificadas na Figura 6. Anticorpos da inven- ção com substituições como acima e contempladas são selecionados para manterem as atividades e a especificidade comensuradas com os anticorpos exemplares, incluindo os anticorpos lgM12 e IgM42 e tendo as caracteristi- cas conforme apresentadas neste relatório descritivo e nas reivindicações.

10 A estrutura para carregar as CDRs da invenção será geralmente de uma sequência de cadeia pesada ou leve de anticorpo ou parte substan- cial desta nas qual as regiões CDR estão situadas em locais corresponden- tes à região CDR de domínios variáveis VH e VL naturais de anticorpos codi- - ficados por genes rearranjados de imunoglobulinas. As estruturas e os locais , 15 de domínios variáveis de imunoglobulinas podem ser determinados por refe- rência a Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of /mmuno/ogica/ lnterest. 4 edição. Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos, 1987, e suas atualizações, disponlvel atualmente na Internet (immuno.bme. nwu.edu). Os domínios variáveis podem ser derivados a partir de qualquer 20 Íinhagem gerrninativa ou domínio variável humano rearranjado, ou pode ser um dominio variável sintético com base em sequências de consenso de do- mínios variáveis humanos conhecidos. As sequências derivadas de CDRs da invenção, conforme definidas no parágrafo precedente, podem ser intro- duzidas em um repertório de domínios variáveis desprovidos de regiões 25 CDR, utilizando a tecnologia do DNA recombinante. Por exemplo, Marks et al (Bio/Techno/ogy, 1992, 10:779-783) descrevem métodos para produzir repertories de domínios variáveis de anti- corpos nos quais primers de consenso no sentido ou adjacentes à extremi- dade 5' da área do domínio variável são utilizados em conjunto com prlmers 30 de consenso para a terceira região framework (arcabouço) dos genes de VH humanos para fornecer um repertório de domínios variáveis VH desprovidos de CDR/CDRs. Marks et al descrevem ainda o modo como este repertório pode ser combinado com uma CDR de um anticorpo em particular. O reper- tório pode ser exibido depois em um sistema hospedeiro adequado, tal como o sistema de apresentação em fagos de WO92/01047, de modo que mem- bros adequados de ligações específicas possam ser selecionados. Um re- 5 pertório pode consistir em algo a partir de 10' membros individuais para ci- ma, por exemplo, de 106 a 108 ou 1010 membros. Técnicas análogas de em- baralhamento (shufí'/ing) ou combinatórias são também descritas por Stem- mer (Nature, 1994, 370:389-391), que descreve a técnica em relação a um gene de j3-lactamase, mas obseNa que a abordagem pode ser empregada 10 para geração de anticorpos. Uma alternativa adicional é gerar novas regiões VH ou VL inclu- indo as sequências derivadas de CDR da invenção por meio de mutagênese randômica de, por exemplo, os genes VH ou VL de Abs para gerar mutações rr no domínio variável inteiro. Tal técnica é descrita por Gram et al (1992, Proc.

4 15 Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580), que empregou PCR propensa a erros. Outro método qLle pode ser utilizado é direcionar a mutagênese para regiões CDR de genes VH ou VL. Tais técnicas são descritas por Barbas et al, (1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813) e por Schier et al (1996, J. Mol. Biol. 263:551-567). Todas as técnicas citadas acima são conhecidas 20 como tais na área à qual pertencem. O técnico no assunto será capaz de empregar tais técnicas para obter membros de Iigação específica da inven- ção empregando a metodologia rotineira na técnica. Uma parte substancial de um domínio variável de uma imuno- globulina compreenderá ao menos as três regiões CDR, juntamente com 25 suas regiões intervenientes de arcabouço. De preferência, a parte incluirá ao menos cerca de 50% da primeira ou da quarta região de arcabouço, ou am- bas, os 50% sendo os 50% em C-terminal da primeira região de arcabouço e os 50°6 em N-terminal da quarta região de arcabouço. Resíduos adicionais podem, na extremidade N-terminal ou C-terminal da parte substancial do 30 domínio variável, ser aqueles que não estejam normalmente associados com as regiões de domínios variáveis naturais. Por exemplo, a construção de membros de ligação específica da presente invenção efetuada por técnicas do DNA recombinante pode resultar na introdução de resíduos em N ou C- terminal que são codificados por ligadores introduzidos para facilitar a clona- gem ou outras etapas de manipulação.

Outras etapas de manipulação inclu- em a introdução de ligadores para unir domínios variáveis da invenção para

5 promover sequências de proteínas inclu indo cadeias pesadas de imunoglo- bulinas, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de d/abodies) ou proteínas marcadas conforme provido neste relatório descritivo e/ou co- nhecido pelos técnicos no assunto.

Embora em um aspecto preferido da invenção anticorpos re-

lO combinantes compreendendo um par de domínios de ligação com base em sequências substancialmente apresentadas nas Figuras 5 e/ou 6 sejam pre- feridos, domínios únicos de ligação com base em quaiquer uma destas se- quências formam aspectos adicionais da invenção.

No caso dos domínios de - iigação com base na sequência substancialmente apresentada na Figura 5

, 15 e/ou 6, tais domínios de ligação podem ser utilizados como agentes de dire- cionamento para neurônios do sistema nervoso central, especialmente para sÍtios de dano ou lesão a nervos, por ser sabido que domínios VH de imuno- globulinas são capazes de ligar antígenos alvo em uma maneira específica.

Membros de Iigação específica da presente invenção podem

20 compreender ainda regiões constantes de anticorpos ou partes destas.

Por exemplo, anticorpos recombinantes com base nas sequências de VH e VL das Figuras 5 e 6 podem ser anexados em suas extremidade C-terminal a domlnios constantes de cadeias leves de anticorpos, incluindo cadeias Ck ou CÀ humanas, de preferência cadeias CÀ, incluindo domínios constantes

25 que são distintos ou variantes dos respectivos domínios constantes apresen- tados na Figura 5 ou 6. Do mesmo modo, anticorpos recombinantes com base nas sequências das Figuras 5 ou 6 podem ser anexados em sua ex- tremidade C-terminaí a toda ou parte de uma cadeia pesada de imunoglobu- lina derivada de qualquer isotipo de anticorpo, por exemplo, lgG, lgA, lgE,

30 lgD e IgM, e qualquer uma das subclasses de isotipos, especialmente lgGl, lgG2b e lgG4, e depois testados para afirmar ou determinar atividade e ca- pacidade comparável e/ou adequada.

IgM é o isotipo preferido.

Os anticorpos, ou quaisquer de seus fragmentos, podem ser conjugados ou fundidos por recombinação a qualquer toxina celular, bacteri- ana ou outra, por exemplo, exotoxina de Pseudomonas, ricina ou toxina dif- térica. A parte da toxina utilizada pode ser a toxina inteira ou qualquer domí- 5 nio em particular da toxina. Tais moléculas anticorpo-toxina têm sido utiliza- das com êxito para direcionamento e terapia de diferentes tipos de câncer, ver, por exemplo, Pastan, Biochem Biophys Acta. 1997 Oct 24;1333(2):C1-6; Kreitman et al., N Engl J Med. 2001 Jul 26;345(4):241-7; Schnell et al., Leu- kemia. 2000 jan;14(1):129-35; Ghetie et al., Mol Biotechnol. 2001 10 jul;18(3):251-68. Multímeros bi e triespecíficos podem ser formados por as- sociação de diferentes moléculas de SCFV, e planejados como reagentes de reticulação para o recrutamento de células T para tumores (imunoterapia), redirecionamento viral (terapia genética) e como reagentes de aglutinação

É de hemácias (imunodiagnóstico), ver, por exemplo, Todorovska et al., J lm- . 15 munol Methods. 2001 Feb 1;248(1-2):47-66; Tomlinson et al., Methods En- zymol. 2000;326:461-79; McCall et al., j /mmuno/. 2001 May 15;166(10): 6112-7. Anticorpos da invenção podem ser marcados com uma marca- ção detectável ou funcional. Marcações detectáveis incluem, entre outras, 20 radiomarcações tais como os isótopos 3H, 1'Ç, 32p, 35S, 36çj, 51Cr, 5'ÇO, 58Co, 59Fe, 9Oy, 121j, 124j, 125j, 131j, 111|n, 117L u, 211At, 198Au, 67Cu, 225Ac, 213Bi, 9'Tc e '"Re, os quais podem ser ligados a anticorpos da invenção utilizando a química convencionaf conhecida na técnica de imagem de anticorpos. Marcações incluem também marcações fluorescentes (por exemplo, fluores- 25 ceína, rodamina, Vermelho do Texas) e marcações utilizadas convencional- mente na técnica para imagem por MRÍ-CT. Adicionalmente, estão incluídas marcações por enzimas tais como peroxidase do rábano, Í3-g|ucoronidase, |3-galactosidase, urease. Entre as marcações, estão incluídos ainda grupos químicos, tais como biotina, que podem ser detectados por meio da ligação 30 a um grupo cognato específico detectável, por exemplo, avidina marcada. Marcações funcionais incíuem substâncias destinadas a serem direcionadas ao sitio de comprometimento, dano ou lesão para conferir proteção ou para

ZIKPG causar destruição do tecido neural.

Tais marcações funcionais incluem fár- macos citotóxicos como 5-fluorouracila ou ricina e enzimas como carboxi- peptidase ou nitroredutase bacteriana, as quais são capazes de converter pró-fármacos em fármacos ativos no local.

São contemplados imunoconju-

5 gados ou proteínas de fusão dos anticorpos da presente invenção, em que os anticorpos e seus fragmentos são conjugados ou Iigados a outras molé- culas ou agentes, e incluem ainda membros de Iigação conjugados a um agente de ablação química, toxina, imunomodulador, citocina, agente citotó- xico, agente quimioterápico ou fármaco.

Quando marcações radioativas são

10 utilizadas, procedimentos conhecidos atualmente disponíveis para contagem podem ser utilizados para identificar e quantificar os membros de ligação específica.

Quando a marcação é uma enzima, a detecção pode ser conse- guida por quaisquer técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroes- . pectrofotométricas, amperométricas ou gasométricas conhecidas na área à

. 15 qual pertencem.

Modelos animais in vivo de complicações que resultam em dano ao sistema nervoso central, incluindo lesão ou dano a células neNosas, ou de condições neurodegenerativas podem ser utilizados pelo técnico no as- sunto para promover ou adicionalmente rastrear, avaliar e/ou estimar os an-

20 ticorpos ou seus fragmentos da presente invenção, variantes destes ou combinações destes, ou de combinações com outros anticorpos reativos no sistema nemoso central.

Tais modelos animais incluem, entre outros, mode- los de condições ou doenças associadas com dano, comprometimento, alte- ração, morte, lesão ou degeneração de células nervosas.

Os modelos inclu-

25 em os que simuiam aspectos de acidente vascular cerebral, lesão cerebral, isquemia, MS, doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Par- kinson, demência, encefalite, meningite, ALS ou doença do neurônio motor.

Modelos de acidente vascular cerebral utilizando oclusão da artéria cerebral média em primatas, tais como babuínos, macacos ou símios são conhecidos 30 na técnica e podem ser adequados (Young A et al (1997) Stroke 28:1471- 1476; del Zoppo GJ et al (1986) Stroke 17:1254-1265; Marshall and Ridley (1996) Neurodegeneration 5:275-286). Modelos de MS, tais como pelo

TMEV, são conhecidos e aqui descritos e utilizados.

Modelos com camun- dongos SOD para ALS e doença do neurônio motor são conhecidos e aqui descritos e utilizados (Gurney ME et al (1994) Science 264:1772-1775). Os anticorpos, seus fragmentos e anticorpos recombinantes

5 compreendendo as sequências de regiões variáveis de acordo com a inven- ção podem ser utilizados em métodos de tratamento, prevenção ou diagnós- tico do corpo humano ou animal, tal como um método de neuroproteção em um mamífero, o qual compreende administrar ao referido mamífero uma - quantidade eficaz dos anticorpos, de seus fragmentos e de anticorpos re-

lO combinantes da invenção.

Anticorpos recombinantes ou seus fragmentos compreendendo as sequências da região de domínios de CDR de acordo com a invenção podem ser utilizados em tais métodos.

Os agentes da in- venção, especialmente anticorpos recombinantes ou seus fragmentos po- , dem ser utilizados como agentes neuroprotetores em métodos para preven- . 15 ção, tratamento ou melhora de lesão, dano ou comprometimento a neNos e complicações que possam, venham a poder ou que efetivamente resultem em dano ao sistema nervoso central.

Os métodos da invenção são aplicá- veis quando a perda de estrutura, função ou sobrevida de neurônios está envolvida ou associada, incluindo lesão ou trauma cerebral, lesão na medula

20 espinhal (SCl), lesão a nervos, lesão na cabeça, condições nas quais o su- primento sanguíneo ao cérebro está reduzido ou comprometido, doenças infecciosas do cérebro, doenças neurodegenerativas.

Exemplos de tais do- enças ou condições para tratamento, prevenção ou melhora de acordo com os métodos da invenção incluem lesão na medula espinhal (SCI), esclerose

25 lateral amiotrófica (ALS), esclerose múltipla (MS), doença de Alzheimer, aci- dente vascular cerebral, doença de Parkinson, doença de Huntington, anóxia pré-natal/isquemia perinatal e/ou parafisia cerebral, encefalopatia, mielopatia e doenças do neurônio motor.

A presente invenção provê métodos para tratar ou melhorar do-

30 enças ou condições em mamíferos quando nervos estão comprometidos, lesados ou danificados ou situações nas quais nervos ou neurônios estão suscetíveis ou em risco de comprometimento, lesão ou dano, os quais com-

preendem administrar um anticorpo recombinante ou anticorpo inteiramente humano ou seu fragmento, selecionado a partir de IgM12 e lgM42. Os méto- dos da invenção podem compreender a administração de mais de um anti- corpo ou fragmento, incluindo combinações dos anticorpos IgM12 e 42. Em 5 mais um de tais métodos, um ou mais do anticorpo lgM12 e/ou do anticorpo lgM42 podem ser combinados com outro anticorpo ativo no sistema nemoso central, incluindo especialmente um ou mais dos anticorpos rHlgM22 e/ou rHIgM46. As combinações de anticorpos podem ser administradas coletiva- mente ou em série, e em vários momentos e várias quantidades ou concen- lO trações. Por conseguinte, o anticorpo 12 e/ou 42 podem ser administrados em combinação com o anticorpo 22 e/ou 46, por administração combinada ou em série, separada por um curto intervalo de tempo ou periodo mais lon- go de tempo, incluindo por horas, dias ou semanas. O anticorpo 12 elou 42

F podem ser especialmente administrados em combinação com o anticorpo 22 . 15 e/ou 46 (sHlgM22, rHlgM22, sHlgM46 ou rHlgM46), por administração com- binada ou em série para o tratamento de melhora de uma doença ou condi- ção que envolva neurodegeneração e incluindo, especificamente, desmieli- nização. Em um de tais métodos, o anticorpo 12 e/ou 42 é administrado em combinação com o anticorpo 22 e/ou 46, por administração combinada ou 20 em série para o tratamento de melhora de uma doença ou condição desmie- linizante, incluindo especificamente a esclerose múltipla (MS). As sequên- cÍas variáveis da cadeia pesada e da leve do anticorpo lgM22 são apresen- tadas na SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44 respectivamente. As sequências variáveis da cadeia pesada e da leve do anticorpo lgM46 são apresentadas 25 na SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 46 respectivamente. Um ou mais do anti- corpo lgM12 e/ou do anticorpo lgM42 podem ser combinados com um ou mais anticorpos remielinizantes compreendendo (a) regiões CDRs da cadeia pesada variável com a sequência SSGMH para CDRI, a sequência V(I)ISYDGSRKYYADSVKG para CDR2 e a sequência GVTGSPTLDY para 30 CDR3, e regiões CDRS da cadeia leve variável com a sequência SGSSS- NIGNNFVS para CDRI, a sequência DITKRPS para CDR2 e a sequência G(E)TWDSSLSAV V para CDR3: ou (b) regiões CDRS da cadeia pesada variável com a sequência SGFTFSSYW para CDRI, a sequência IKKDG- SEK para CDR2 e a sequência ARPNCGGDCYLPWYFD para CDR3, e re- giões CDRS da cadeia leve variável com a sequência QSVLYSSNNKNY pa- ra CDRI, a sequência YVVAS para CDR2 e a sequência QQYYNTPQA para 5 CDR3. Os anticorpos da presente invenção podem ser administrados a uma paciente que necessita de tratamento por qualquer via adequada, inclu- indo por injeção intraperitoneal, introdução na corrente sanguínea ou no jj- quido cefatorraquidiano (CSF) ou diretamente no sÍtio da lesão ou do com- lO prometimento.

Uma vantagem especial dos anticorpos exemplares da pre- sente invenção é que estes atravessam a barreira hematoencefálica (BBB) e podem, portanto, atingir o sistema nervoso central mesmo quando adminis- trados por via i.p.. A dose precisa dependerá de uma série de fatores, inclu- ¥ sive se o anticorpo destina-se ao diagnóstico ou ao tratamento, o tamanho, a , 15 extensão e o local da lesão, a natureza precisa do anticorpo (se anticorpo inteiro, fragmento, diabody, etc.) e a natureza de qualquer marcação detec- tável ou funcional anexada ao anticorpo.

Quando um radionuclídeo é utiliza- do para terapia, uma dose única máxima adequada pode ser em torno de 45 mCi/m2 até no máximo em torno de 250 mCi/m'. A dose preferível está no

20 intervalo de 15 a 40 mCi, com a faixa mais preferida da dose de 20 a 30 mCi ou de 10 a 30 mCi.

Tal terapia pode requerer reposição da medula óssea ou de células-tronco.

Anticorpos não conjugados (nakem clinicamente aprova- dos são geralmente administrados em quantidades na ordem de mg, com doses para adultos de 20 a 2000 mg de proteína por dose, 20 a 1500 mg de 25 proteína por dose, ou de 20 a 1000 mg de proteína por dose, ou de 20 a 500 mg de proteína por dose, ou de 20 a 100 mg de proteína por dose.

Anticor- pos monoclonais injetáveis cIinicamente aprovados são administrados em quantidades de mg, 3-5 mg/kg, 5-1Omg/kg por dose, 300-400 mg/dose, 300- 500 mg/dose (Newsome BW and Ernstoff MS (2008) Br J C/in Pharmacol 30 66(1):6-1 9; herceptin.net, tysabri.net, avastin.net, remicade.com). É notável que o anticorpo remielinizante lgM22 tenha demonstrado ser eficaz em do- ses significativamente mais baixas comparativamente, no intervalo de µg, e ser capaz de atravessar a BBB e ser ativo no sistema nervoso central mes- mo com uma dose única do anticorpo (WO 2004/110355; Warrington AE et al (2007) J Neurosci Res 85(5):967-976). O anticorpo lgM12 recombinante, conforme aqui demonstrado, possui atividade terapeuticamente relevante em

5 modelos animais mediante uma dose única i.p. na faixa de µg.

Dessa forma, a administração dos anticorpos da presente invenção, em dose única ou do- ses múltiplas e/ou periódicas, no intervalo de µgs por dose ou doses de µg/kg, ou em baixo mg por dose (100 µg-1 mg, menos de 1 mg, 1 mg-5 mg, 1 mg-lO mg, 5 mg-15 mg, 10 mg-20 mg por dose), pode ser aplicável e efi-

lO caz.

Uma dose para um tratamento único de um paciente adulto pode ser proporcionalmente ajustada para crianças e lactentes, além de ajustada para outros formatos de anticorpo, em proporção, por exemplo, ao peso molecu- lar.

Os tratamentos podem ser repetidos em intervalos diários, duas vezes Kf por semana, semanalmente ou mensalmente, a critério do médico.

Uma van-

, 15 tagem dos anticorpos exemplares é que estes atravessam a BBB e são dire- cionados a sÍtios de dano ou lesão, assim facilitando o uso de doses mais baixas e potencialmente em menor número para alcançar os efeitos ade- quados.

Composições farmacêuticas e terapêuticas 20 Os anticorpos ou fragmentos da presente invenção serão nor- malmente administrados na forma de uma composição farmacêutica, a qual pode compreender pelo menos um componente além do(s) anticorpo(s) ou fragmentos da invenção.

Por conseguinte, composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para uso de acordo com a presente in- 25 venção, podem compreender além de ingrediente ativo, um excipiente far- maceuticamente aceitável, veículo, tampão, estabilizante ou outros materiais bem conhecidos pelos técnicos no assunto.

Tais materiais não devem ser tóxicos, nem interferir com a eficácia do ingrediente ativo.

A natureza precisa do veículo ou de outro material dependerá da via de administração, a qual 30 pode ser oral ou por injeção, por exemplo, intravenosa, ou por deposição em um sÍtio tumoral.

Composições farmacêuticas para administração oral podem es-

tar em forma de comprimido, cápsula, pó ou líquida. Um comprimido pode compreender um veículo sólido tal como gelatina ou um adjuvante. Compo- sições farmacêuticas líquidas compreendem geralmente um veículo líquido tal como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sin- 5 tético. Solução salina fisiológica, solução de dextrose ou de outro sacarídeo ou glicóis, tais como etilenoglicol, propilenoglicol ou polietilenogHcol, podem ser incluídos. Para injeção intravenosa ou injeção no local de acometimento, o ingrediente ativo pode estar na forma de uma solução aquosa aceitável para via parenteral que seja livre de pirógenos e com pH, isotonicidade e 10 estabilidade adequados. Os técnicos no assunto serão bem capazes de pre- parar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotônicos tais como cloreto de sódio para injetáveis, solução de Ringer para injetáveis, so- lução de Ringer com iactato para injetáveis. Conservantes, estabilizantes,

V tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, conforme . 15 necessário. Uma composição pode ser administrada isoladamente ou com- binada com outros tratamentos, substâncias terapêuticas ou agentes, seja simultaneamente ou em sequência dependendo da condição a ser tratada. Composições compreendendo combinações de um ou mais anticorpos re- 20 combinantes ou seus fragmentos conforme aqui descritas são contempla- das. Adicionalmente, a presente invenção contempla além de incluir compo- sições compreendendo o anticorpo ou seu fragmento, que são descritos nes- te relatório, e outros agentes ou substâncias terapêuticas tais como agentes ou substâncias terapêuticas neuroprotetores, agentes anti-inflamatórios, a- 25 gentes moduladores da Iiberação de neurotransmissores, ligantes ou agonis- tas ou antagonistas de neuroreceptores, agentes do canal de cálcio, modu- ladores imunes ou outros anticorpos reativos no sistema nervoso central. Composições compreendendo combinações de um ou mais anticorpos re- combinantes ou seu fragmento conforme aqui descritos são contempladas. 30 Outros tratamentos ou agentes terapêuticos podem incluir a administração de doses adequadas de fármacos para o alívio de dor, tais como fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (por exemplo, aspirina, paracetamol, ibu-

profeno ou cetoprofeno) ou opiáceos tais como morfina, ou antieméticos.

Além disso, a composição pode ser administrada com moduladores imunes, tais como interleucinas, fator de necrose tumoral (TNF) ou outros fatores de crescimento, fatores estimuladores de colônias, citocinas ou hormônios, tais 5 como dexametasona, que estimulam a resposta imune e a redução ou elimi- nação de células cancerosas ou tumores.

A composição pode ser adminis- trada também ou pode incluir combinações juntamente com outros anticor- pos reativos no sistema nervoso central, incluindo especialmente anticorpos remielinizantes, entre estes rHlgM22 e/ou rHIgM46. 10 A presente invenção contempla ainda composições terapêuticas úteis na prática dos métodos terapêuticos desta invenção.

Uma composição terapêutica desse tipo inclui, em mistura, um excipiente (veículo) farmaceuti- camente aceitável e um ou mais de um anticorpo, polipeptídeo análogo des- v te ou seu fragmento, conforme aqui descrito, como ingrediente ativo.

Em

. 15 uma concretização preferida, a composição compreende um antlgeno capaz de modular a ligação específica do presente membro de ligação/anticorpo com uma célula alvo.

O preparo de composições terapêuticas ou farmacêuti- cas que contêm anticorpos, poIipeptídeos ou fragmentos ativos como ingre- dientes ativos é bem entendido na técnica.

Tipicamente, tais composições 20 são preparadas como injetáveis, seja em soluções ou suspensões Iíquidas.

Contudo, formas sóIidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção podem ser também preparadas.

O preparado pode ser também emulsionado.

O ingrediente terapêutico ativo é frequentemente mis- turado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis 25 com o ingrediente ativo.

Os excipientes adequados são, por exemplo, água, soIução salina, dextrose, glicerol, etanol ou os similares e combinações des- tes.

Adicionalmente, se desejado, a composição pode conter quantidades mínimas de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsi- onantes, agentes para o tamponamento do pH que intensificam a eficácia do 30 ingrediente ativo.

Um anticorpo ou fragmento ativo pode ser formulado para a composição terapêutica em forma de sais neutralizados farmaceuticamen- te aceitáveis.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adição ácida (formados com os grupos amino livres do polipeptídeo ou da molécula do anticorpo) e que são formados com sais inorgânicos tais como, por e- xemplo, ácido clorídrico ou fosfórico, ou sais orgânicos tais como ácido acé- tico, oxálico, tartárico, mandélico e os similares. Os sais que se formam a 5 partir dos grupos contendo carboxila livre podem ser derivados também a partir de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, po- tássio, amônio, cálcio ou férrico, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína e as similares. As composições terapêuticas contendo o anticorpo ou fragmento 10 ativo são convencionalmente administradas por via intraperitoneal ou intra- venosa, como por injeção de uma dose unitária, por exemplo. O termo "dose unitária", quando utilizado em referência a uma composição terapêutica da presente invenção, refere-se a unidades fisicamente distintas como dose

V unitária para seres humanos, cada unidade contendo uma quantidade prede- . 15 terminada de material ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico, em associação com o diluente necessário, ou seja, carreador ou veículo. As composições são administradas em maneira compatível com a formulação da dose e em quantidade terapeuticamente eficaz. A quantida- de a ser administrada depende do indivíduo que será tratado, a capacidade 20 do sistema individual para utilizar o ingrediente ativo e o grau desejado de capacidade de ligação a neurônios ou a extensão da lesão neural. As quan- tidades precisas de ingrediente ativo que necessitam ser administradas de- pendem do juízo médico e são peculiares a cada indivíduo. Esquemas ade- quados para administração inicial e administração de acompanhamento são 25 também variáveis, e podem inciuir uma administração inicial seguida por do- ses repetidas em intervalos de uma ou mais horas, dias, semanas ou meses por uma injeção subsequente ou outra administração. Alternativamente, é cogitada a infusão ou a administração contínua suficiente para manter con- centrações apropriadas e suficientes no sangue, no sistema nervoso central 30 ou no sítio da terapia desejada. O momento da administração pode variar e pode ser determina- do pelo técnico no assunto ou pelo médico, com base nos ensinamentos do relatório descritivo, os parâmetros clínicos do paciente ou ind ivíduo, o status ou a gravidade da condição ou doença ou o grau ou a natureza de Iesão, envolvimento ou comprometimento neural. Por conseguinte, a melhora em função neural ou a proteção intensificada de neurônios, por exemplo, contra 5 morte ou comprometimento, podem ser realçadas pela administração preco- ce no início ou na manifestação clínica de uma doença, de modo a minimizar a extensão do dano ou comprometimento neurológico. Em um aspecto, o momento da administração é coordenado com avaliações da função neuro- lógica, a determinação do status e/ou outras avaliações cllnicas de modo a 10 minimizar ou aliviar a progressão de doença do comprometimento ou dano neurológico. Ensaios diaqnósticos A presente invenção diz respeito também a uma variedade de

W ' aplicações diagnósticas, incluindo métodos para detectar ou determinar da- , 15 no, Iesão ou comprometimento de células nervosas. Os anticorpos e frag- mentos da invenção podem ser utilizados para avaíiar, quantificar, direcionar e/ou visualizar neurônios, in vitro ou in vivo. Os presentes anticorpos, inclu- indo seus fragmentos, e fármacos que modulam a produção ou a atividade dos membros de Iigação específica, anticorpos e/ou suas subunidades po- 20 dem possuir certas aplicações diagnósticas e podem, por exemplo, ser utili- zados para a finalidade de detectar e/ou medir condições ou doenças envol- vendo comprometimento, degeneração, dano ou morte de neurônios. Os anticorpos e seus fragmentos marcados, incluindo radiomarcados, são úteis em técnicas diagnósticas in vitro e em técnicas de radioimagem in vivo e em 25 radioimunoterapia. No caso de imagem in vivo, os anticorpos ou fragmentos da presente invenção podem ser conjugados a um agente de imagem em vez de a um ou mais radioisótopos, incluindo, entre outros, agente de con- traste para ressonância magnética, em que, por exemplo, uma molécula do anticorpo é carregada corn um grande número de íons paramagnéticos atra- 30 vés de grupos quelantes. Exemplos de grupos quelantes incluem EDTA, por- firinas, poliaminas, éteres corona e polioximas. Exemplos de Íons paramag- néticos incluem gadolínio, ferro, manganês, rênio, európio, lantânio, hólmio e érbio.

Em um aspecto adicional da invenção, anticorpos e seus fragmentos radiomarcados, especiaimente radioimunoconjugados, são úteis em radioi- munoterapia, em particular como anticorpos radiomarcados parã terapia ce- lular.

Em ainda outra aspecto, os membros radiomarcados da ligação espe-

5 cÍfica, em particular anticorpos e seus fragmentos, são úteis em técnicas cirúrgicas radioimunoguiadas, em que estes podem identificar e indicar a presença e/ou o local de neurônios comprometidos ou danificados ou os SÍ- tios de lesão nervosa, durante ou após a cirurgia para o direcionamento a tais células ou para removê-las ou para transplantar ou administrar células a

10 estes sÍtios especificos.

A radioimunoterapia (RAIT) foi introduzida na cllnica e demons- trou eficácia utilizando vários imunoconjugados de anticorpos.

O anticorpo humanizado hMN-14 marcado com 131j anti-antigeno carcinoembrionário (an- . ti-CEA) foi avaliado em câncer colorretal (Behr TM et al (2002) Cancer

,. 15 94(4Suppl):1373-81) e o mesmo anticorpo marcado com 9Oy foi avaliado em carcinoma medular da tireoide (Stein R et al (2002) Cancer 94(1):51-61). A radioimunoterapia utilizando anticorpos monoclonais foi também avaiiada e relatada para linfoma não Hodgkin e câncer pancreático (Goldenberg DM (2001) Crit Rev Oncol Hematol 39(1-2):195-201; Gold DV et al (2001) Crit

20 Rev Oncol Hematol 39 (1-2) 147-54). Métodos de radioimunoterapia com anticorpos específicos estão descritos também nas Patentes U.S. 6 306 393 e 6 331 175. A cirurgia radioimunoguiada (RlGS) foi também introduzida na cIínica e demonstrou eficácia e utilidade, inclusive utilizando anticorpos anti- CEA e anticorpos direcionados contra antígenos associados a tumores (Kim

25 JC et al (2002) lnt J Cancer 97(4):542-7; Schneebaum S et al (2001) World J Surg 25(12):1495-8; Avital S et al (2000) Cancer 89(8):1692-8; Mclntosh DG et al (1997) Cancer Biother Radiophann 12 (4):287-94)- Os anticorpos radiomarcados e seus fragmentos são úteis em técnicas diagnósticas in vitro e em técnicas de radioimagem in vivo.

Os anti-

30 corpos e seus fragmentos, especialmente radioimunoconjugados, são úteis em radioimunoterapia, em particular como anticorpos radiomarcados para reparo de lesão nervosa, recuperação neurodegenerativa, terapia para cân-

cer ou tumor do sistema neNoso central ou, alternativamente, para ablação de tecido nervoso ou de neurônios danificados em certas situações. Em um aspecto in vivo, o anticorpo ou seu fragmento de Iigação a neurônios é mar- q - cado e administrado ao animal antes, durante ou depois da cirurgia ou de " 5 uma técnica cirúrgica, incluindo técnica estereotática ou minimamente inva- siva, para fins de localizar lesão nervosa ou para avaliar restos de tecido % neural danificado ou lesado. Em um de tais aspectos, os membros radiomar- cados da ligação específica, especialmente anticorpos e seus fragmentos, são úteis em técnicas cirúrgicas radioimunoguiadas, em que estes são ca- lO pazes de identificar e indicar a presença e/ou o local de células nervosas ou neurônios ou tecido nervoso comprometidos, danificados, lesados ou em vias de morrer antes, durante ou após a cirurgia para direcionar, identificar ou remover tais células.

V As aplicações diagnósticas dos anticorpos e seus fragmentos da . 15 invenção incluem aplicações in vitro e in vivo bem conhecidas e padrão para o técnico no assunto e baseiam-se na presente descrição. Ensaios e kits diagnósticos para estimativa e avaliação in vitro de neurônios ou do tecido nervoso podem ser utilizados para diagnosticar, avaliar e monitorar amostras de pacientes, incluindo as conhecidas por apresentarem ou suspeitas de 20 apresentarem condições ou doenças neurológicas nas quais células nervo- sas estão comprometidas, danificadas ou lesadas, ou para deteminar a ex- tensão de morte ou lesão celular ou de um tumor ou câncer do sistema ner- voso central, incluindo em uma amostra de um paciente ou indivíduo. A es- timativa e avaliação do status de doença neurológica são úteis também para 25 determinar a adequação de um paciente para um estudo clínico de um fár- maco ou para a administração de um determinado agente neuroterapêutico ou quimioterápico ou um anticorpo da presente invenção, inclusive suas combinações, em comparação a um agente ou anticorpo diferente. A presente invenção inclui um sistema de ensaio que pode ser 30 preparado na forma de kit de teste para a análise quantitativa da extensão da presença de, por exemplo, neurônios danificados, comprometidos ou le- sados ou para quantificar neurônios em uma amostra. O sistema ou kit de teste pode compreender um componente marcado, preparado por uma das técnicas radioativas ou enzimáticas aqui discutidas por acoplamento de uma marcação ao anticorpo, e um ou mais reagentes imunoquímicos adicionais, m

- um destes ao menos estando livre ou outros imobilizados a serem determi- · 5 nados ou seu(s) parceiro(s) de ligação- Em uma concretização adicional desta invenção, kits de teste comerciais adequados para uso por um especialista médico podem ser pre- parados com base no precedente para determinar o status de neurônios em uma amostra.

De acordo com as técnicas de testes discutidas acima, uma

10 cIasse de tais kits conterá pelo menos o anticorpo marcado ou seu parceiro de ligação, por exemplo, um anticorpo que lhe seja específico, e orientações, evidentemente, dependendo do método selecionado, por exemplo, "competi- tivo", "sanduíche" "DASP" e os similares.

Os kits podem conter também rea- . gentes periféricos como tampões, estabilizantes, etc. . 15 Consequentemente, um kit de teste pode ser preparado para a demonstração da presença ou a determinação do status de neurônios, com-

preendendo: (a) uma quantidade predeterminada de ao menos um compo- nente reativo imunoquimicamente marcado, obtido por fixação direta ou indi-

20 reta do presente anticorpo ou fragmento ou de um parceiro de ligação que lhe seja específico a uma marcação detectável; (b) outros reagentes; e (C) instruções para uso do referido kit.

Um kit de teste pode ser preparado para a demonstração da

25 presença de lesão, dano ou comprometimento de células nervosas, compre- endendo: (a) uma quantidade predeterminada de ao menos um compo- nente reativo imunoquimicamente marcado, obtido por fixação direta ou indi- reta do presente anticorpo ou fragmento ou de um parceiro de ligação que

30 lhe seja específico a uma marcação detectável; (b) outros reagentes; e (c) instruções para uso do referido kit.

Ácidos nucleicos A presente invenção provê ainda um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo, especialmente um anticorpo recombinante, especial- n

- mente um anticorpo inteiramente humano da presente invenção.

Ácido nu- ' 5 cleico inclui DNA e RNA.

Em um aspecto preferido, a presente invenção pro- vê um ácido nucleioo que codifica um poIipeptídeo da mvenção como defini- do acima, incluindo um polipeptídeo conforme especificado nas Figuras 5 ou 6, ou que é capaz de codificar as regiões CDR deste.

A presente invenção provê também construções na forma de

10 plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou de expressão que compre- endem pelo menos um polinucleotídeo como acima.

A presente invenção provê também uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções como acima.

Um ácido nucleico codificador de qualquer > anticorpo ou fragmento conforme providos forma um aspecto da presente

. 15 invenção, assim como forma um método de produção do membro de ligação específica, cujo método compreende a expressão codificada pelo ácido nu- cleico.

A expressão pode ser convenientemente obtida pela cultura em con- dições apropriadas de células hospedeiras recombinantes contendo o ácido nucleico.

Após a produção pela expressão, um membro de ligação específi-

20 ca pode ser isolado e/ou purificado por meio de qualquer técnica adequada e depois utilizado conforme apropriado.

Anticorpos e moléculas de ácido nucleico codificador e vetores de acordo com a presente invenção podem ser providos isolados e/ou purifi- cados, por exemplo, de seu ambiente natural, em forma substancialmente

25 pura ou homogênea ou, no caso de ácido nucleico, livre ou substancialmente livre de ácido nucleico ou genes que originam uma sequência codificadora de polipeptídeo além daquela com a função necessária.

O ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode compreender DNA ou RNA e pode ser total ou parcialmente sintético. 30 Sistemas para clonagem e expressão de um poIipeptídeo em uma variedade de d iferentes células hospedeiras são bem conhecidos.

Célu- las hospedeiras adequadas incluem sistemas bacterianos, células de mamí-

feros, de leveduras e de baculovírus. Linhagens celulares mamíferas dispo- níveis na técnica para a expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células de ovário do hamster chinês, células HeLa, células renais de cria de ^ hamster, células cancerosas, células de câncer de ovário e muitas outras.

' 5 Um hospedeiro bacteriano comum preferido é E.co/i. A expressão de anti- corpos e de fragmentos de anticorpos em células procarióticas tais como de E.coli está bem estabelecida na técnica. Vetores adequados podem ser es- colhidos ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, in- cluindo sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de 10 poliadenilação, sequências intensificadoras, genes marcadores e outras se- quências conforme apropriado. Vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo, "fago" ou fasgemídeo, conforme apropriado. Para detalhes adicio- nais, ver, por exemplo, Mo/ecu/ar Cloning: a Laboratory Manual: 2 edição, » Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicás . 15 conhecidas e protocolos para manipulação de ácido nucleico, por exemplo, sobre preparo de construções de ácidos nucleicos, mutagênese, sequenci- amento, introdução de DNA em células e expressão de genes e análise de proteínas, estão descritos detalhadamente em Short protoco/s in Mo/ecu/ar Bio/ogy, segunda edição, Ausubel et al. eds., john Wiley & Sons, 1992. Os 20 conteúdos de Sambrook et al. e de Ausubel et al. são aqui incorporados por referência neste pedido de patente. Consequentemente, um aspecto adicional da presente invenção provê uma célula hospedeira contendo ácido nucleico conforme aqui descri- to. Ainda outro aspecto adicional provê um método que compreende introdu- 25 zir tal ácido nucleico em uma célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, as técnicas adequa- das podem incluir transfecção com fosfato de cálcio, DEAE-Dextrano, eletro- poração, transfecção mediada por lipossoma e transdução utilizando retroví- rus ou outro vírus, por exemplo, Vaccinia ou, para células de insetos, bacu- 30 lovírus. Para células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluir transformação com cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção utilizando bacteriófagos. A introdução pode ser seguida por causar ou permitir a ex-

pressão do ácido nucleico, por exemplo, cultivando células hospedeiras em condições para a expressão do gene. A presente invenção também provê um método que compreende utilizar uma construção como informada acima

P em um sistema de expressão para que seja expresso um membro de ligação ' 5 específica ou polipeptídeo conforme acima. Outra característica desta invenção é a expressão das sequên- cias de DNA descritas neste relatório. Como é bem conhecido na técnica, sequências de DNA podem ser expressas ligando-as operativamente a uma sequência de controle de expressão em um vetor de expressão apropriado e 10 empregando este vetor de expressão para transformar um hospedeiro unice- lular apropriado. Uma grande variedade de combinações hospedeiro/vetor de expressão pode ser empregada para expressar as sequências de DNA desta invenção. Vetores de expressão úteis, por exemplo, podem ser consti- - tuídos por segmentos de sequências de DNA cromossomal, não cromosso- . 15 mal e sintético. Vetores adequados incluem derivados do SV40 e plasmí- deos bacterianos conhecidos, por exemplo, os plasmídeos de E. co/i col El, pCRl, pBR322, pMB9 e seus derivados, plasmídeos tais como RP4; DNAS de fagos, por exemplo, os inúmeros derivados do fago À, por exemplo, NM989, e DNA de outros fagos, por exemplo, M13 e DNA de fita simples de 20 fatos filamentosos; pIasmídeos de leveduras tais como o plasmídeo 2u ou seus derivados; vetores úteis em células eucarióticas, tais como vetores ú- teis em células de insetos ou de mamíferos; vetores derivados de combina- ções de plasmídeos e DNAS de fagos, tais como pIasmídeos que foram mo- dificados para empregar DNA de fagos ou outras sequências de controle de 25 expressão; e os similares. Qualquer uma de uma ampla variedade de se- quências de controle de expressão - sequências que controlam a expressão de uma sequência de DNA com o qual estejam operativamente ligadas - po- de ser utilizada nestes vetores para expressar as sequências de DNA desta invenção, Tais sequências úteis de controle da expressão incluem, por e- 30 xemplo, os promotores precoces ou tardios do SV40, CMV, Vaccinia, do po- lioma ou do adenovírus, o sistema lac, o sistema Up, o sistema TAC, o sis- tema TRC, o sistema LTR, as regiões operadora principal e promotora do fago À, as regiões de controle da proteína fd da pelagem, o promotor para a enzima 3-fosfoglicerato quinase ou outras glicohticas, os promotores da fos- fatases ácidas (por exemplo, Pho5), os promotores dos fatores de acasala- b mento-O de leveduras e outras sequências conhecidas por controlar a ex- ' 5 pressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou de seus vÍrus e várias de suas combinações. Uma grande variedade de células hospedeiras unicelulares é útil também para expressar as sequências de DNA desta invenção. Estes hos- pedeiros podem incluir hospedeiros eucarióticos e procarióticos bem conhe- lO cidos tais como cepas de E. co/i, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungos tais como leveduras e células animais tais como células CHO, YB/20, NSO, SP2/0, Rl.l, B-W e L-M, células renais de macaco verde africano (por exemplo, COS 1, COS 7, BSCI, BSC40 e BMTIO), células de insetos (por - exemplo, Sf9) e células humanas e de plantas em cultura de tecidos.

. 15 Será entendido que nem todos os vetores, sequências de con- trole de expressão e hospedeiros funcionam igualmente bem para expressar as sequências de DNA desta invenção. Nem todos os hospedeiros funcional igualmente bem com o mesmo sistema de expressão. Contudo, um técnico no assunto será capaz de selecionar os apropriados vetores, sequências de 20 controle de expressão e hospedeiros sem que precise de experimentação excessiva para obter a expressão desejada e sem se afastar do âmbito des- ta invenção. Ao ser selecionada uma sequência de controle de expressão, uma variedade de fatores será normalmente considerada. Estes incluem, por exemplo, a força relativa do sistema, sua capacidade de ser controlado e 25 sua compatibilidade com a sequência de DNA ou o gene específico a serem expressos, especialmente no que diz respeito a possÍveis estruturas secun- dárias. Hospedeiros unicelulares adequados serão selecionados por consi- deração de, por exemplo, sua compatibilidade com o vetor escolhido, suas características de secreção, sua habilidade em dobrar proteínas corretamen- 30 te e suas necessidades quanto à fermentação, bem como a toxicidade ao hospedeiro do produto codificado pelas sequências de DNA a serem expres- sas e a facilidade para purificação dos produtos da expressão. Considerando estes e outros fatores, um técnico no assunto será capaz de construir uma variedade de combinações vetor/sequência de controle de expressão/hos- , pedeiro que expressarão as sequências de DNA desta invenção em fermen- tação ou em cultura animal em grande escala.

" 5 Uma sequência de DNA codificadora de um anticorpo ou de seu fragmento pode ser preparada sinteticamente em vez de clonada. A sequên- cia de DNA pode ser desenhada com os códons apropriados para a sequên- cia de aminoácidos do membro de ligação específica. Em geral, serão sele- cionados códons preferidos para o hospedeiro pretendido se a sequência for 10 utilizada para expressão. A sequência completa é montada a partir de oIigo- nucleotídeos sobrepostos, preparados por métodos padrão e dispostos em uma sequência completa de codificação. Ver, por exemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al., Science, 223:1299 (1984): Jay et al., J. Biol. . Chem., 259:6311 (1984). Sequências sintéticas de DNA permitirão a cons- . 15 trução conveniente de genes que expressarão análogos de membros de Ii- gação específica ou "muteínas". Alternativamente, DNA codificadores de muteínas podem ser produzidos por mutagênese sÍtio-dirigida de genes nati- vos ou cDNAS dos membros de ligação específica, e as muteínas podem ser produzidas diretamente por meio de sÍntese convencional de polipeptídeos.

20 A invenção pode ser entendida melhor por referência aos Exem- plos não limitantes a seguir, os quais são fornecidos como exemplares da invenção. Os exemplos seguintes são apresentados visando ilustrar mais completamente as concretizações preferidas da invenção e não devem ser de maneira alguma interpretados, contudo, como limitação à amplitude do 25 âmbito da invenção. Exemplos A invenção pode ser entendida melhor por referência aos Exem- plos não limitantes a seguir, os quais são fornecidos como exemplares da invenção. Os exemplos seguintes são apresentados visando ilustrar mais 30 completamente as concretizações preferidas da invenção e não devem ser de maneira alguma interpretados, contudo, como limitação à amplitude do âmbito da invenção.

Exemplo 1: ldentificação de autoanticorpos naturais (NatAbs) gue se liqam às próprias células do sistema nervoso lgMs humanas séricas naturais que se ligam a neurônios foram r identificadas por rastreamento do banco de soro da Clínica Mayo, o qual · 5 contém mais de 140.000 amostras coletadas ao longo de 45 anos, para can- didatos com alto pico monoclonal de lgG ou IgM (acima de 10 mg/mL no sangue) e, depois, testando o soro quanto a anticorpos que se ligavam a cortes do córtex cerebral e do cerebelo (31). Em seguida, estas IgMs foram purificadas a partir de amostras positivas e ainda testadas para 1) ligação à 10 superfície de neurônios primários isolados 2) como substratos para o apoio à extensão de neuritos 3) a capacidade para proteger neurônios da apoptose frente a moléculas estressoras. Esse protocolo de rastreamento tem como base aquele utilizado para identificar lgMs humanas que se ligam a oligo- dendrócitos e promovem a remielinização em modelos de MS (22, e confor-

P 15 me descrito no documento WO 0185797). O reconhecimento da superfície de tecidos ou células apropriados parece ser uma importante característica para definição de lgMs terapêuticas. Duas novas lgMs humanas distintas que se ligam a neurônios derivadas do soro foram identificadas (sH1gM12 e sHlgM42). Certas caracte- 20 rísticas destes anticorpos derivados do corpo estão Iistadas na Tabela 1. sHlgM12 e sHlgM42 derivados do soro demonstraram inicialmente in vitro apoiar a extensão de neuritos, bem como o potente substrato Iaminina e anular a inibição do crescimento de neuritos por mielina do sistema nervoso central (23). 25 Estudos adicionais demonstraram que sHlgM12 derivada do so- ro melhora a função espontânea em camundongos infectados pelo TMEV, conforme avaliada por atividade noturna espontânea média por hora em ca- mundongos (21). Ao contrário de NatAbs lgM previamente identificados (sHlgM22 e sHlgM46), nem sHlgM12, nem sHlgM42 promovem a remielini- 30 zação da medula espinhal.

Tabela 1 - IgMs terapêuticas humanas lgM humana Promove a Apoia a exten- Liga-se a oIi- Liga-se a ) remielinização I são de neuritos godendrócitos neurônios I sHlgM12 ! não I sim rtão sim sHlgM42 não sim não sim sim não EIÁÊ"U sim não não não Frequentemente, supõe-se que autoanticorpos sejam patogêni- cos. Em contraste, como aqui demonstrado, os autoanticorpos contra neurô- nios (sHlgM12 e sHlgM42 e anticorpos recombinantes que os têm como ba- 5 se) não matam neurônios. Em vez disso, estas lgMs protegem os neurônios contra morte, promovem a extensão de neuritos, aumentam NAA in vivo, protegem axônios in vivo no modelo TMEV e melhoram a função noturna espontânea de camundongos doentes pelo TMEV.

F Os anticorpos que se ligam a neurônios, lgM12 e lgM42, visam 10 neurônios com lesões no sistema nervoso central, podendo ser aplicados para reverter perda neuronal e/ou melhorar os efeitos de Iesão ou doença neuronal. lgMs humanas que se ligam a neurônios representam uma nova classe de agentes terapêuticos com aplicação única para várias doenças e condições que envolvem neurodegeneração, lesão ou morte de neurônios.

15 Tais doenças incluem, entre outras, MS, lesão na medula espinhal, ALS, doença de Alzheimer, lesão cerebral traumática, eventos vasculares cere- brais ou acidente vascular cerebral. Estas lgMs humanas foram minimamen- te antigênicas quando administradas por via sistêmica a animais. ldentificação e caracterização de lgMs humanas que se ligam à 20 superfície de múltiplos tipos de neurônios vivos: Amostras de soro com altas concentrações de lgG ou lgM (>10 mg/mL) foram rastreadas quanto à presença de Ab que se liga a camadas neuronais em cortes de tecido vivo do sistema nervoso central (córtex e ce- rebelo). Dos 152 soros testados, 17 soros humanos foram positivos em cor- 25 tes de tecidos (23). Os anticorpos sHlgM12 e sHlgM42 ligam-se à superfície de uma grande variedade de neurônios que marcam simultaneamente com marcado- res neuronais neurofilamento ou B Ill tubulina.

Estes incluem células granula- res do cerebelo (23), neurônios corticais, neurônios do hipocampo, neurô- nios de biopsia do lobo temporal humano (Figura 1) e células ganglionares

5 da retina (dados não mostrados). rHIgM12 cora o soma, neuritos e cones de crescimento de neurônios do hipocampo (dados não mostrados). Essa reati- vidade cruzada sugere que as lgMs humanas podem atuar em células do sistema nervoso central afetadas em uma série de condições/doenças neu- rológicas, tais como MS, esclerose amiotrófica lateral ou acidente vascular

10 cerebral.

Esses dados indicam que a ligação de sHlgM12 ou sHlgM42 à superfície de neurônios é dependente de carboidratos.

O tratamento de neu- rônios com sialidase tratamento em cultura eliminou a ligação das duas lgMs humanas à superfície celular, enquanto que bloquear a sÍntese de esfingoli-

. 15 pídios com Fumonisina Bl ou retirar proteínas vinculadas a GPl com PIPLC não eliminou a ligação de lgMs (23). Os gangliosídeos são candidatos para antígenos destas lgMs humanas.

Em experimentos de marcação conjunta, rHIgM12 é localizado em conjunto com GMl sobre a membrana neuronal (videoExemplo11eaFigura21C). 20 Embora compartilhem certas características funcionais, tais co- mo suscitar o crescimento de neuritos, sHlgM12 e sHlgM42 realmente de- monstram diferenças e cada um é um anticorpo singular. lsso é evidente em estudos de ligação e de imunofluorescência; estes marcam a superfície de células granulares do cerebelo em padrões distintos.

Em estudos de imuo-

25 fluorescência de células granulares do cerebelo de ratos em cultura, os pa- drões de marcação da membrana neuronal pelo uso destes dois anticorpos são distintos (Figura 2). Áreas pequenas da membrana de neuritos são liga- das por sHlgM12 resultando em padrão pontilhado.

Áreas maiores da mem- brana de neuritos são ligadas por sHlgM42 resultando em um padrão mais 30 segmentado.

Exemplo 2: lçjMs humanas proteçjem neurônios corticais da morte induzida por peróxido lgMs humanas promotoras de remielinização demonstraram pro- teger oligodendrócitos em cultura contra a ativação de caspase 3 induzida por peróxido 3 (33), um marcador de apoptose ativa.

Como apresentado neste relatório descritivo, sHlgM12 ou sHlgM42 foram avaliadas em protoco-

5 los análogos.

A sHlgM12 ou a sH(gM42, respectivamente, e peróxido foram adicionados junto a culturas de neurônios corticais primários de camundon- gos e o grau de ativação da caspase 3 foi analisado 24 horas mais tarde (Fi-

gura 3)- 0 tratamento de neurônios cultivados com rHIgM12 resultou em

10 proteção de 80% da ativação de caspase 3. O tratamento de neurônios com sHlgM42 foi protetor também com aproximadamente 40% de ativação de caspase 3. Esses resultados foram significativamente diferentes (P"O,O1) quando comparados a uma IgM humana de controle, que resultou em menos .. de 10% de proteção contra ativação da caspase 3. 15 Dessa forma, a ligação de sHlgM12 ou sHlgM42 a neurônios * protegeu os neurônios corticais da morte celular induzida por peróxido.

As- sim, quando um indutor ou agente de danos (ou morte) a células nervosas foi fornecido, IgM12 e lgM42 preveniram de modo independente e significan- te os danos (ou morte) de ocorrerem. 20 ExemÊl|o 3: Anticorpos recombinantes derivados de sHlqM12 Duas formas recombinantes de sHlgM12 foram construídas.

Ca- da uma utilizou o mesmo vetor de expressão que havia sido previamente utilizado para a cadeias pesada e a leve do anticorpo lgM22 recombinante (rHlgM22) (22, 28, WO0185797). O vetor inclui um gene dHfR selecionável

25 expresso sob o controle do promotor do SV40. Uma forma de anticorpo lgM12 recombinante parcialmente humano com uma cadeia J de camun- dongo foi inicialmente construída como segue e, posteriormente, produzido o anticorpo em células F3B6 da linhagem do hibridoma humano/camundongo.

O vetor do anticorpo lgM12 recombinante (PAD12) foi construido

30 inserindo o CDNA da região variável da cadeia pesada com uma sequência líder proveniente da base de dados de nucleotídeos e o cDNA da cadeia le- ve completa com uma sequência líder anexada obtida do banco de dados de nucleotldeos em maneira similar à descrita previamente (6), utilizando os primers descr'itos abaixo. O vetor está retratado na Figura 4 A sequência da cadeia pesada e da leve utilizada para o anticorpo lgM12 humano recombi- . nante, com regiões variáveis e constantes anotadas, é mostrada na Figura 5.

- 5 Os primers utilizados para construir o rHlgM12VH e juntá-lo por extensão sobreposta (Horton RM et al (1989) Gene 77:61-68) a uma se- quência líder com um intron (letras minúsculas) proveniente base de dados (M29812) são como segue: (1) 5' primer com sÍtio BspEI: TCC GGA CGG TCC GGG A 10 (2) TCC GGA CGG TCC G ggacctcct gtgcaagaac atgaaacatc tgtggttctt ccttctcctg gtggcagctc ccagatgtga gtatctcagg gatccagaca (3) cagg gatccagaca tggggatatg ggaggtgcct ctgatcccag ggctcactgt gggtctctct gttcacaggg gtcctgtccc aggtgcagct gcaggagtcg ggcccaggac . (4) 3' primer com sÍtio PAC I: CCTTAATTAAGACCTGG AGAGGCCATTC . 15 TTACCTGAG GAGACGGTGACCAGGGTTC Os primers utilizados para construir o rHIgM12Vk e juntá-lo por extensão sobreposta (soe) à sequência líder proveniente da base de dados (Ietras minúsculas; acesso X59312) são como segue: (1) 5'-Ck primer para soe lym 12 Vk a Ck: CGA ACT GTGGCT GCA C 20 (2) 3' Ck pr/mer com Xho 1: CCGCTCGAGTATCTAACACTCTCCCCTGTT (3) 5' Lym 12 Vk com Nhe I: AGCATTACTAGCTAGCTC AAGACTCAGCC TGGAC atggaca tgagggtccc cgctcagctc ctggggctcc tgctactctggctccgag gtgc- caga tgt GAC ATC CAG ATG ACC CA O vetor com os genes sintéticos do anticorpo foram introduzidos 25 em células F3B6 do hibridoma por eletroporação e amplificação com meto- trexato (MTX) conforme descrito previamente (6). Resumidamente, 8 milhões de células do heterohibridoma F3B6 camundongo/humano (Ameiican Type Cu/ture Col/ection: ATCC) foram in- cubadas com 10 µg do vetor PAD12 linearizado com Bgl ll por 10 minutos 30 em 800 µL em meio sem soro, quando então foram eletroporadas a 0·2 V em um Biorad Gene pu|serTM (Biorad, Hercules, CA, USA). Após 10 minutos de incubação em gelo, as células foram diluídas para 24 mL em RPMÍ-1640 contendo soro bovino fetal iO°/o (FC) (Gibco, Carlsbad, CA, EUA), semeadas em placas com 24 cavidades e incubadas a 37 °C; 48 horas mais tarde, as células contendo vetor foram selecionadas com metotrexato 1 µM (Calbio- chem, La Jolla, CA, EUA). Depois de um período de incubação de 2 sema- 5 nas, as colônias foram transferidas para uma nova placa e deixadas que crescessem até a confluência.

Nesse ponto, o sobrenadante foi coIhido e analisado por ensaio imunoenzimático (ELISA) quanto à presença de lgM humana.

Colônias positivas foram selecionadas ainda durante o período de 2 meses com doses crescentes de metotrexato, variando de 1 µM a 200 µM. 10 Nessa maneira, foram geradas células que produziam mais de 10 µg/mL de IgM.

O primeiro anticorpo recombinante construído como acima não é inteiramente humano.

Para gerar uma forma completamente humana, célu- . Ias CHO (GibcoBRL cat. n° 11619) foram cotransfectadas com vetor que , 15 codificava a cadeia pesada e feve recombinante sob o controle de um pro- motor EIA e uma construção capaz de expressar a cadeia J humana em pCl (Promega). As células foram selecionadas com doses crescentes de meto- trexato em mistura de 50/50 de PowerChol e IMDM com 1O°/o de clone cósmico, e dois clones que produzissem a maior quantidade de anticorpo, 20 conforme medido por ELISA, foram subclonados.

Os subclones foram ex- pandidos e os frascos foram congelados invertidos.

As duas formas recom- binantes de lgM12 mantêm a Iigação a neurônios e o caráter de eficácia in vÍVO da lgM isolada do soro, mas sua meia-vida é mais curta em camundon- gos (o que pode dever-se a diferenças em glicosilação). 25 Um procedimento similar e comparável foi utilizado para constru- ir o anticorpo HlgM42 recombinante no vetor comparável.

A sequência da cadeia pesada e da leve do anticorpo lgM42 humano, com as regiões variá- veis e constantes anotadas, é mostrada na Figura 6. Exemplo 4: Dose periférica única de rHlgM12 melhorou a função neurolóqica 30 em modelo TMEV de esclerose múltipla (MS) Em vista do fato de que rHIgM12 protegeu neurônios primários em cultura e de que a deficiência no modelo TMEV de MS se correlaciona com perda de axônios (2), o tratamento de camundongos infectados pelo TMEV com rHlgM12 foi utilizado para avaliar a capacidade de retardar a progressão de déficits neurológicos. * Grupos de 5 camundongos aos 90 dias após a infecção pelo

" 5 TMEV, o ponto no qual axônios começam a s ser perdidos, foram tratados com uma dose única de 100 µg de rHlgM12 ou uma ÍgM humana de contro- le.

Cinco camundongos infectados foram selecionados aleatoriamente de cada grupo, e os registros funcionais anteriores ao tratamento foram utiliza- dos para assegurar que a atividade basal não fosse diferente entre os gru- lO pos.

Os camundongos foram acompanhados em grupos 3 dias consecutivos durante várias semanas utilizando caixas de atividade (34, 35). Alterações em comportamento noturno são medidas sensíveis do déficit neurológico em doença mediada pelo TMEV.

Caixas de atividade são caixas transparentes de acrílico com feixes de infravermelho em Iados opostos criando uma grade

, 15 através da área delimitada que registra todos os movimentos horizontais e verticais.

A sensibilidade do ensaio reflete a habilidade para mensurar eleva- ção do corpo sobre as patas traseiras e o caminhar.

Em camundongos infec- tados pelo TMEV, as patas traseiras se tornam rígidas e a elevação do corpo sobre as patas traseiras é reduzida- Contudo, o andar espontâneo pela gaio-

20 la não é gravemente afetada.

É mais fácil para camundongos com as patas traseiras rigidas caminhar do que se erguer e mesmo camundongos com a doença avançada podem ser extremamente ativos durante a noite.

Cada grupo de tratamento foi reunido aleatoriamente e mantido em caixas de atividade por 72 horas antes do tratamento e, depois, por 72

25 horas cada semana depois do tratamento.

As interrupções médias do feixe por hora foram calculadas para atividade horizontal e vertical sobre 12 horas, a partir de 18h até 6h, durante o período de análise de 72 horas.

Não houve diferenças entre os grupos de tratamento em atividade diurna horizontal ou vertical, que era tipicamente abaixo de 600 interrupções/h já que camundon-

30 gos dormem.

Contudo, um aumento em atividade noturna horizontal espon- tânea, quando comparada à sua basal anterior ao tratamento, foi registrado no grupo tratado com rHlgM12 (P"O,O1, da y à 7' semana) (Figura 7). Uma lgM humana de controle que não se liga a células não melhorou a atividade. Ao contrário do efeito visto com sHlgM12 derivada de soro, e agora novamente com o anticorpo rlgM12 recombinante, em um estudo simi- . lar, o anticorpo sHlgM42 humano não alterou a atividade noturna de camun- " 5 dongos infectados pelo TMEV sob as mesmas condições. Parâmetros alter- nativos de administração para sHlgM42 no mesmo formato de ensaio produ- ziram resultados diferentes e mais positivos sobre a atividade noturna. Uma possivel explicação para uma melhora em função é que as IgMs efetivas interferem com cargas virais, o que resulta em menos doença. 10 Esta não parece ser a explicação, contudo. Camundongos com doença crô- nica pelo TMEV foram tratados com uma dose única de rFIlgM12, sHlgM42 ou de lgMs controle, o cérebro e a medula espinhal foram cdhidos 5 sema- nas mais tarde e depois o nível de transcritos genômicos de RNA do TMEV

F RNA foram medidos por PCR com uma sonda para ViralProtein2. Os trans- , 15 critos virais não eram diferentes entre os grupos (P"O.O1) (dados não mos- trados). Exemplo 5: Níveis de NAA dentro do tronco cerebral de camundonqos com doença da medula espinhal - Um marcador não invasivo substituto de pre- servação de axônios por toda a medula espinhal 20 NAA é um metabólito associado com função neuronal (36, 37)- NAA é o segundo aminoácido mais abundante no cérebro e está quase que exclusivamente restrito a neurônios. A preservação de níveis de NAA no tronco cerebral é uma medida da saúde global de axônios da medula espi- nhal, validada pelo grupo dos presentes inventores utilizando o modelo 25 TMEV em camundongos (8). Quando axônios em níveis mais baixos da me- dula espinhal são danificados, as células do tronco cerebral morrem, redu- zindo NAA. Os níveis de NAA medidos por MRS refletem primariamente a densidade de neurônios. NAA é expresso em outras células neurais, mas a expressão primária de NAA é em neurônios. Estudos do perfil por MRS de 30 células purificadas do sistema nervoso central indicam que a amplitude do sinal de NAA predomina em neurônios, ao passo que a amplitude do sinal de NAA de oligodendrócitos ou astrócitos foi 5% e 10% do sinal dos neurônios,

respectivamente (38). A fim de avaliar mais profundamente a habilidade de sHlgM12 e

V lgM42 em melhorar a atividade em camundongos por preservar a função de axônios, um ensaio de imagem não invasivo e a morfologia tradicional foram · 5 utilizados para avaliar axônios da medula espinhal. O traçado retrógrado foi utilizado para demonstrar disfunção de axônios da medula espinhal após a desmielinização em doença mediada pelo TMEV (5). Uma redução drástica da marcação retrógrada dos axônios em nível torácico para núcleos do tron- co cerebral foi medida. O tronco cerebral é onde residem muitos dos corpos 10 celulares que projetam longos tratos de axônios ao Iongo do comprimento da medula espinhal. Posteriormente, os níveis de N-acetil aspartato (NAA) no tronco cerebral foram avaliados por espectroscopia por ressonância magné- tica (MRS) em camundongos infectados pelo TMEV (Figura 8) utilizando um ? protocolo previamente relatado (8).

. 15 Foi observada uma redução em NAA do tronco cerebral ao longo do tempo em camundongos com a doença induzida pelo TMEV (Figura 9). Os níveis de NAA decresceram ao longo dos primeiros 45 dias de infecção e permaneceram deprimidos até 270 dias após a infecção. Em camundongos SJL infectados com TMEV, a extensão de desmielinização da medula óssea 20 atingiu um platô em 90 dias após a infecção (39). É neste momento que a perda de axônios é notável por histologia neste modelo (2). Por conseguinte, NAA é uma medida sensível de disfunção de axônios. Após a última aquisição por MRS, amostras de axônios foram sistematicamente coletadas de 6 áreas de substância branca de aparência 25 normal dentro de uma seção transversal da medula espinhal em nível de T6. Este nível foi escolhido porque fornecia uma representação global da perda de axônios de múltiplas lesões desmielinizadas distribuídas aleatoriamente por toda a medula espinhal (39). Foi constatado que havia 3,5% menos axô- nios em camundongos SJL infectados pelo TMEV no Dia 270, quando com- 30 parados a controles não infectados (p"O,OO1). Foi demonstrado existir uma correlação positiva entre níveis de NAA no tronco cerebral e contagens de axônios ao nível de T6 da medula espinhal (r=0,823) (8).

Uma dose única de lgM humana que se liga a neurônios preserva níveis de NAA no tronco cerebral e em axônios na medula espinhal: A habilidade de lgMs humanas que se ligam a neurônios em al- . terar níveis de NAA ou contagens de axônios em camundongos infectados " 5 pelo TMEV foi avaliada. Dessa forma, foi constatado que quando camun- dongos infectados pelo TMEV, no início da queda de axônios da medula es- pinhal (90 dias após a infecção, foram tratados com uma dose única de 100 µg de lgMs capazes de se ligar a neurônios, sHlgM12 ou sHlgM42, a densi- dade de axônios mielinizados na substância branca normal da medula espi- lO nhal torácica era maior quando medida 10 semanas mais tarde. Grupos de 10-15 camundongos aos 90 dias após a infecção fo- ram tratados com uma dose única de 100 µg de sHlgM12, sHlgM42, IgM humana de controle ou soIução salina (Figura 10). Antes do tratamento e 5 e

P 10 semanas mais tarde, cada camundongo foi colocado em um pequeno , 15 túnel de magneto e imagens por MRS foram coletadas no tronco cerebral. Na 10a semana, os camundongos foram sacrificados, as medulas espinhais coletadas, impregnadas em plástico e seções transversais cortadas ao nível de T6, coradas com parafenilamindiamina para visualizar bainhas de mielina, 6 imagens por seção foram coletadas, abrangendo 400.000 µm de substân- 20 cia branca de aparência normal e os axônios foram contados automatica- mente. Nos grupos tratados com qualquer uma das duas lgMs capazes de se ligarem a neurônios (sHlgM12, sHlgM42), os níveis de NAA estavam au- mentados em 5 e em 10 semanas mais tarde, quando comparados a níveis anteriores ao tratamento. Camundongos tratados com lgM controle apresen- 25 taram tendência mais baixa e camundongos tratados com solução salina, os níveis permaneceram constantes. Os niveis de NAA dos grupos tratados com sHlgM12 e sHlgM42 aumentaram para 9,13 e 9,3 mM, respectivamente, cada um destes bem abaixo dos níveis de 12,0 mM de camundongos não infectados. Quando a- 30 xônios no nível de T6 foram comparados entre os grupos de tratamento (Ta- bela 2), camundongos tratados com sHlgM12 ou sHlgM42 continham mais axônios do que o grupo tratado com solução salina (17.303 e 17.771 axô-

nios, quando comparados a 15.198 axônios, P=O,008 e P<O,OO1), mas me- nos do que o número de camundongos contados em camundongos não in- fectados (21.284 axônios). b Esses resultados indicarn que cada um dos anticorpos sHlgM12 · 5 e rHlgM12 melhorou a função por preservação de axônios, conforme evi- denciado no modelo TMEV. Embora o anticorpo sHlgM42 preservasse axô- nios no modelo TMEV, alterações demonstráveis na avaliação de atividade noturna não foram observadas no teste inicial. Após estudos de determina- ção de dose, foi constatado que sHlgM42 também aumenta a atividade no 10 teste de atividade noturna.

O uso de MRS do tronco cerebral para avaliar o status de axô- nios em modelos de doença de medula espinhal em camundongos valida ainda mais a presente invenção; dessa forma, NAA no tronco cerebral serve r como excelente desfecho para uso em estudos clínicos destes anticorpos 15 humanos. ^ Camundongos tratados com sHlgM42 e sHlgM12 com níveis melhorados de NAA continham também mais axônios na medula espinhal torácica média. Grupos de 10-15 camundongos SJL infectados pelo TMEV foram tratados com uma dose única de 100 µg de rHIgM22, sHlgM42, 20 sHlgM12, sHlglVl39 de controle e solução salina aos 90 dias após a infecção- Dez semanas depois do tratamento, as medulas espinhais foram retiradas e uma seção na região torácica média foi corada com PPD para visualizar mie- lina. Seis áreas abrangendo 400.000 µm2 de substância branca foram cole- tadas como amostra de cada camundongo, e o número de axônios mielini- 25 zados foi contado (1). Na Tabela 6, é apresentada a média do número abso- luto de axônios mielinizados por seção transversal em T6 ± SEM.

Tabela 2 - Tratamento com IgMs capazes de se ligarem a neurônios preser- va contagens de axônios na medula espinhal Traíâmento Número médio de axôriios em T6 Comparação sHlgM42 j17.771 ±436 I p<O,OO1 sHlgM12 I 17.303 í 505 m I p=O,008 lgM controle j15.508 ±627 Solução salina !15.198Ê484 I p=0,701 ~ Camundongos não infectados I 21.284 :È 829

Exemplo 6: lqMs capazes de se liçjarem a neurônios preservam axôn ios sem promover a remielinização

% Diversas lgMs humanas (por exemplo, sHlgM22 e sHlgM46) que se ligam a oligodendrócitos e promovem a remielinização (22, 40, 41) foram

" 5 identificadas.

Como mostrado abaixo, IgMs que se ligam a neurônios melho- ram os números e a função de neurônios, porém sem remielinização óbvia.

Sem estar preso à teoria, entende-se que o mecanismo de ação deva-se à ativação direta de axônios (proteção, extensão de neuritos) e/ou por ativação do sistema imune inato ou adaptativo para secretar fatores que protegem 10 neurônios.

Os resultados apresentados acima demonstram claramente que os anticorpos exercem um efeito direto sobre axônios/neurônios.

Dentro das mesmas medulas espinhais nas quais a preservação e/ou novo crescimento de axônios, mediados por sHlgM12 e sH(gM42, foram medidos, a desmieli- . nização, a remielinização e a inflamação em nível global não foram diferen-

, 15 tes entre os grupos de tratamento (Figura 11). Esses atributos foram quantificados pelo grau dos quadrantes de 10 seções transversais da medula espinhal (6) representando amostras ao longo do comprimento da medula espinhal.

O grupo tratado com rHIgM22 (controle positivo) mostrou o aumento esperado em remielinização, ao passo 20 que camundongos tratados com sHlgM12 e sHlgM42 continham pouca re- mielinização da medula espinhal- Dessa forma, déficits neurológicos no mo- delo TMEV foram melhorados (por exemplo, IgM12) sem exigirem remielini- zação significante; além do mais, a remielinização não é necessária para preseNação e/ou novo crescimento de axônios dentro do prazo de tempo 25 examinado.

Exemplo 7: Meia-vida sérica de rHlqM12 (com cadeia J humana) e sHlqM42 A fim de determinar a meia-vida de lgMs humanas, rHlgM12 (com cadeia J humana) e sHlgM42, 100 µg de rHlgM12 que contém a ca- deia J humana ou 100 µg de sHlgM42 em 200 µL de solução salina foram 30 injetados nas veias do rabo de camundongos CD-l normais (Figura 12). Em intervalos definidos (15 minutos, 1, 4, 8, 24, 48 horas), foi coIetado sangue de grupos de 3 camundongos por punção cardíaca.

O soro foi coletado e analisado quanto à presença da cadeia mu de lgM humana, por meio de en- saio ELISA do tipo sanduíche. Para rHlgM12, a meia-vida entre a primeira coIeta, em 15 minu- . tos, e a coleta em 8 horas foi de 3,8 horas. Para sHlgM42, a meia-vida entre " 5 a primeira coleta, em 15 minutos, e a coleta em 24 horas foi de 20,5 horas. Esses valores incluem a meia-vida da rHIgM22 promotora da remielinização, cuja meia-vida em camundongos é de 15 horas (29) e em coelhos de 90 ho- ras. A meia-vida foi calculada com as fórmulas: kelim = (|n(Cpico)-|n(Cbaixa))/tintervalo e t1/2 = 0,693/ke|im- 10 Exemplo 8: lçjMs monoclonais humanas radiomarcadas atravessam a barrei- ra hematoencefálica Tem sido frequentemente aceito que lgMs com peso molecular próximo de 1 milhão podem ser grandes demais para cruzar a barreira he- . matoencefálica (BBB) a partir da circulação e assim penetrarem o sistema , 15 nervoso central (42, 43). Há certa evidência, contudo, que algumas lgMs efetivamente atravessam a BBB. A distribuição em tecidos de rHlgM12 marcada com "S em ca- mundongos SJL normais e infectados pelo TMEV foi medida (Figura 13). 50 µg de rHlgM12 (1 x107 cpm) foram administrados por via i.p. Os camundon- 20 gos foram perfundidos com soÍução salina 4 ou 24 horas depois, os tecidos colhidos agudamente, triturados e dissolvidos em líquido de cintilação- O cérebro e a medula espinhal de camundongos não infectados continham a radiomarcação nos dois momentos. O sistema neNoso central de camun- dongos infectados pelo TMEV continha duas vezes mais radiomarcação no 25 momento de 4 horas que os camundongos não infectados - esse valor au- mentou para 4x pelas 24 horas. Foi constatado também que rHlgM12 (com e sem a cadeia J humana) e sHlgM42 são capazes de atravessar a BBB em camundongos normais e nos SAMP8, que representam o modelo de doença de Alzheimer.

30 Dessa forma, lgMs humanas marcadas com 125j são injetadas por i.v., e os cérebros coletados duas horas mais tarde. Cada um destes anticorpos acu- mula-se nos cérebros de camundongos normais e de doentes. Estes anti-

corpos revertem também o comprometimento cognitivo no modelo de doen- ça de Alzheimer em camundongos, seja a lgM Iiberada por injeção intrace-

H rebral ou i.v. Exemplo 9: IçjMs humanas gue se liqam a neurônios liberadas por via intra- " 5 peritoneal penetram lesões desmielinizadas da medula espinhal e localizam axônios positivos para neurofilamentos O estudo da lgM de camundongo promotora da remiçlinização, SCH94.03, marcada com isótopo, por Hunter (44) utilizou a autorradiografia para demonstrar radiomarcação localizada in vivo na medula espinhal de 10 camundongos infectados pelo TMEV, especificamente para células que e- ram ultraestruturalmente identificadas como oligodendrócitos. Estudos simi- lares de autorradiografia com 3'S rHlgM12 foram realizados. Utilizando a imunocitoquímica tradicional, foram detectadas IgMs humanas que se ligam 0 a neurônios dentro de lesões da medula espinhal (Figura 14).

4 15 Dessa forma, 1,0 mg de rHlgM12 (com cadeia j humana), de sHlgM42 ou de uma lgM humana comercial de controle (Jackson lmmuno Research) foram administrados por via intraperitoneal a camundongos infec- tados pelo TMEV com desmielinização crônica. Quatro horas depois, os ca- mundongos foram perfund idos com paraformaldeído, as medulas espinhais 20 congeladas foram cortadas longitudinalmente e imunocoradas para a pre- sença da cadeia mu de IgM humana. Em camundongos que receberam rHlgM12 ou sHlgM42, a cadeia mu humana foi localizada em lesões desmie- linizadas em tratos paralelos, sugerindo fibras de axônio. A IgM humana con- trole não foi encontrada dentro de lesões ou na medula não lesada. Por con- 25 seguinte, ficou claro que lgMs humanas que se ligam a neurônios, rHlgM12 ou sHlgM42, atravessam a BBB em camundongos infectados pelo TMEV. Seções adjacentes da medula espinhal foram então imunomar- cadas com Abs anti-neurofilamento (NF) (SMI-32 e 34, Sternberger), seguido pelo Abs secundário fluorescente anticadeia mu humana-FITC e anti-TRITC 30 de camundongo. A microscopia confocal demonstrou que rHlgM12 e sHlgM42 colocalizaram axônios NF+ dentro de Iesões, em faixas paralelas de fibras e como feixes de fibras de axônios cortados na extremidade (Figura

15). Exemplo 10: rHlqM12 ou sHlçjM42 não exacerbam EAE induzida pelo peptí- deo MOG quando fornecidos no início da doença . A fim de abordar preocupações de que administrar IgMs de Iiga- " 5 ção autorreativas no sistema neNoso central a animais com autoimunidade ativa poderia exacerbar a doença, os efeitos de rHlgM12 e sHlgM42 foram testados em camundongos com EAE. Grupos de 10 camundongos C57BL6 com EAE induzida pelo peptídeo MOG (200 µg) receberam uma dose única de 100 µg de rHlgM12, sHlgM42, IgM humana de controle ou solução salina 10 por via intravenosa. Os camundongos eram tratados individualmente quando atingiam a pontuação clínica de 1 (rabo hesitante). Os camundongos eram então acompanhados por um investigador cego em relação aos grupos de tratamento que registrava os pesos e classificava as pontuações clínicas em m dias alternados até que os camundongos atingissem 28 dias após a imuni- . 15 zação ou se tornassem moribundos. Não houve diferenças entre grupos de tratamento em pesos ou pontuações clínicas médias (Figura 16, P=O,14). Adicionalmente, 10 seções transversais da medula espinhal, abrangendo toda a medula espinha de ca- da camundongo, foram classificadas em código cego quanto à presença de 20 inflamação meníngea e desmielinização em cada quadrante da medula es- pinhal (6)- Não houve diferenças no percentual de quadrantes com inflama- ção meningea (P=0,825) ou desmielinização (P=0,766) entre os grupos de tratamento (Figura 17). Por conseguinte, foi constatado que uma dose única de IgMs humanas que se ligam a neurônios, eficazes em proteger axônios 25 no modelo TMEV, não agravam déficits cIínicos causados por EAE, acele- ram a progressão do déficit ou aumentam a patologia da medula espinhal.

Referências

1. Howe, C. L., J. D. Adelson, and M. Rodriguez. 2007. Absence of perforin expression confers axonal protection despite demyelination.

30 Neurobiol Dis 25:354-359.

2. McGavern, D. B., P. D. Murray, C. Rivera-Quinones, J. D. Schmelzer, P. A. Low, and M. Rodriguez. 2000. Axonal loss results in spinal cord atrophy, electrophysiological abnormalities and neurological deficits fol- lowing demyelination in a chronic inflammatory model of multiple sclerosis.

P Brain 123 Pt3:519-531.

3. jones, M. V., T. T. Nguyen, C. A. Deboy, J. W. Griffin, K. A.

· 5 Whartenby, D. A. Kerr, and P. A. Calabresi. 2008. Behavioral and pathologi- cal outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis.

joumal of neuroimmunology.

4. Rodriguez, M., E. OIeszak, and J. Leibowitz. 1987. Theiler's murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus.

10 Crit Rev Immunol 7:325-365.

5. Ure, D. R., and M. Rodriguez. 2002. Preservation of neuro- logic function during inflammatory demyelination correlates with axon sparing in a mouse model of multiple sclerosis. Neuroscience 111:399-411.

W

6. Mitsunaga, Y., B. Ciric, V. Van Keulen, A. E. Warrington, M.

, 15 Paz Soldan, dence A. j. Bieber, that a human M. Rodriguez, antibody derived fromand L. R.serum patient Pease. can2002. Direct promote evi- myelin repair in a mouse model of chronic-progressive demyelinating disease. Faseb j 16:1325-1327.

7. Van Keulen, V. P., B. Ciric, S. Radhakrishnan, K. L. Heckman, 20 Y. Mitsunaga, K. lijima, H. Kita, M. Rodriguez, and L. R. Pease. 2006. lm- munomodulation using the recombinant monoclonal human B7-DC cross- linking antibody rHlgM12. Clin Exp lmmunol 143:314-321.

8. Denic, A., A. Bieber, A. Warrington, P. K. Mishra, S. Macura, and M. Rodriguez. 2009. Brainstem (1)H nuclear magnetic resonance (NMR) 25 spectroscopy: Marker of demyelination and repair in spinal cord. Annals of neuro/ogy 66:559-564.

9. Duncan, I. D. 1996. Glial cell transplantation and remyelination of the central nervous system. Neuropathol Appl Neurobiol 22:87-100.

10. Fernandez, M., A. Giuliani, S. Pirondi, G. D'lntino, L.

30 Giardino, L. Aloe, R. Levi-Montalcini, and L. Calza. 2004. Thyroid hormone administration enhances remyelination in chronic demyelinating inflammatory disease. Proc Natl Acad Sci U S A 101:16363-16368.

11. Craig, C. G., V. Tropepe, C. M. Morshead, B. A. Reynolds, S. Weiss, and D. van der Kooy. 1996. ln vivo growth factor expansion of endog- enous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci 16:2649-2658. 5 12. Rodriguez, M. 2007. Effectors of Demyelination and Remyelination in the CNS: lmplications for Multiple Sclerosis. Brain Pathol 17:219-229.

13. Pitt, D., P. Werner, and C. S. Raine. 2000. Glutamate excitotoxicity in a model of multiple sclerosis. Nat Med 6:67-70. 10 14. Okuda, Y., S. Sakoda, H. Fujimura, and T. Yanagihara. 1997. Nitric oxide via an inducible isoform of nitric oxide synthase is a possible fac- tor to eliminate inflammatory cells from the central nervous system of mice with experimental allergic encephalomyelitis. Journal of neuroimmuno/ogy ¥ 73:107-116.

. 15 15. Waxman, S. G. 2002. Sodium channels as molecular targets in multiple sclerosis. J Rehabil Res Dev 39:233-242.

16. lrvine, K. A., and W. F. Blakemore. 2008. Remyelination pro- tects axons from demyelination-associated axon degeneration. Brain 131:1464-1477. 20 17. Linker, R. A., M. Maurer, S. Gaupp, R. Martini, B. Holtmann, R. Giess, P. Rieckmann, H. Lassmann, K. V. Toyka, M. Sendtner, and R. Gold. 2002. CNTF is a major protective factor in demyelinating CNS disease: a neurotrophic cytokine as modulator in neuroinflammation. Nat Med 8:620-

624. 25 18. Chang, A., W. W. Tourtellotte, R. Rudick, and B. D. Trapp.

2002. Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclero- sis. NEng/jMed346:165-173.

19. McTigue, D. M., R. Tripathi, and P. Wei. 2006. NG2 colocalizes with axons and is expressed by a mixed cell population in spinal 30 cord lesions. j Neuropathol Exp Neurol 65:406-420.

20. Franklin, R. J., G. L. Hinks, R. H. Woodruff, and M. T. O'Leary. 2001. What roles do growth factors play in CNS remyelination?

Prog Brain Res 132:185-193.

21. Rodriguez, M., A. E. Warrington, and L. R. Pease. 2009. ln-

H vited Article: Human natural autoantibodies in the treatment of neurologic disease. Neuro/ogy 72:1269-1276.

· 5 22. Warrington, A. E., K. Asakura, A. J. Bieber, B. Ciric, V. Van Keulen, S. V. Kaveri, R. A. Kyle, L. R. Pease, and M. Rodriguez. 2000. Hu- man monoclonal antibodies reactive to oligodendrocytes promote remyelination in a model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A 97:6820-6825. 10 23. Warrington, A. E., A. J. Bieber, V. Van Keulen, B. Ciric, L. R. Pease, and M. Rodriguez. 2004. Neuron-binding human monoclonal antibod- ies support central neNous system neurite extension. J Neuropathol Exp Neurol 63:461-473. » 24. Radhakrishnan, S., L. T. Nguyen, B. Ciric, D. Flies, V. P. Van . 15 Keulen, K. Tamada, L. Chen, M. Rodriguez, and L. R. Pease. 2004. lmmuno- therapeutic potential of B7-DC (PD-L2) cross-linking antibody in conferring antitumor immunity. Cancer Res 64:4965-4972.

25. Cohen, I. R. 2007. Biomarkers, self-antigens and the immu- nological homunculus. J Autoimmun 29:246-249. 20 26. Cohen, I. R., and M. Schwartz. 1999. Autoimmune mainte- nance and neuroprotection of the central nervous system. Joumal of neuroimmuno/ogy 100:111-114.

27. Lutz, H. U. 2007. Homeostatic roles of naturally occurring an- tibodies: an oveNiew. J Autoimmun 29:287-294. 25 28. Bieber, A. J., A. Warrington, K. Asakura, B. Ciric, S. V. Kaveri, L. R Pease, and M. Rodriguez. 2002. Human antibodies accelerate the rate of remyelination following lysolecithin-induced demyelination in mice. Gl/a 37:241-249.

29. Warrington, A. E., A. J. Bieber, B. Ciric, L. R. Pease, V. Van 30 Keulen, and M. Rodriguez. 2007. A recombinant human lgM promotes myelin repair after a single, very low dose. J Neurosci Res 85:967-976.

30. Pirko, 1., B. Ciric, J. Gamez, A. J. Bieber, A. E. Warrington, A.

J. Johnson, D. P. Hanson, L. R. Pease, S. I. Macura, and M. Rodriguez.

2004. A human antibody that promotes remyelination enters the CNS and decreases lesion load as detected by T2-weighted spinal cord MRI in a virus- induced murine model of MS. Faseb J 18:1577-1579.

F 5 31. Warrington, A. E., and S. E. Pfeiffer. 1992. Proliferation and differentiation of 04+ oligodendrocytes in postnatal rat cerebellum: analysis in unfixed tissue slices using anti-glycolipid antibodies. J Neurosci Res 33:338-353.

32. Ciric, B., V. Van Keulen, M. Paz Soldan, M. Rodriguez, and 10 L. R. Pease. 2004. Antibody-mediated remyelination operates through mech- anism independent of immunomodulation. Journal of neuroimmuno/ogy 146:153-161.

33. Howe, C. L., A. J. Bieber, A. E. Warrington, L. R. Pease, and

B M. Rodriguez. 2004. Antiapoptotic signaling by a remyelination-promoting . 15 human antimyelin antibody. Neurobiol Dis 15:120-131.

34. Rivera-Quinones, C., D. McGavern, j. D. Schmelzer, S. F. Hunter, P. A. Low, and M. Rodriguez. 1998. Absence of neurological deficits 'bllowing extensive demyelination in a class l-deficient murine model of mul- tiple sclerosis. Nature medicine 4:187-193. 20 35. McGavern, D. B., L. Zoecklein, K, M. Drescher, and M. Ro- driguez. 1999. Quantitative assessment of neurologic deficits in a chronic progressive murine model of CNS demyeiination. Exp Neurol 158:171-181.

36. De Stefano, N., P. M. Matthews, L. Fu, S. Narayanan, J. Stanley, G. S. Francis, J. P. Antel, and D. L. Arnold. 1998. Axonal damage 25 correlates with disability in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis. Results of a longitudinal magnetic resonance spectroscopy study. Brain 121 ( Pt 8):1469-1477.

37. Tourbah, A., C. Linnington, C. Bachelin, V. Avellana-Adalid, H. Wekerle, and A. Baron-Van Evercooren. 1997. lnflammation promotes 30 survival and migration of the CG4 oligodendrocyte progenitors transplanted in the spinal cord of both inflammatory and demyelinated EAE rats. J Neumsci Res 50:853-861.

38. Manganas, L. N., X. Zhang, Y. Li, R. D. Hazel, S. D. Smith, M. E. Wagshul, F. Henn, H. Benveniste, P. M. Djuric, G. Enikolopov, and M.

PK Maletic-Savatic. 2007. Magnetic resonance spectroscopy identifies neural progenitor cells in the live human brain. Science 318:980-985.

- 5 39. McGavern, D. B., P. D. Murray, and M. Rodriguez. 1999. Quantitation of spinal cord demyelination, remyelination, atrophy, and axonal loss in a model of progressive neurologic injury. j Neurosci Res 58:492-504.

40. Asakura, K., D. J. Miller, L. R. Pease, and M. Rodriguez.

1998. Targeting of lgMkappa antibodies to oligodendrocytes promotes CNS 10 remyelination. J Neurosci 18:7700-7708.

41. Asakura, K., D. J. Miller, K. Murray, R. Bansal, S. E. Pfeiffer, and M. Rodriguez. 1996. Monoclonal autoantibody SCH94.03, which pro- motes central nervous system remyelination, recognizes an antigen on the a surface of oligodendrocytes. J Neurosci Res 43:273-281. . 15 42. Kozlowski, G. P., I. Sterzl, and G. Nilaver. 1992. Localization patterns for immunoglobulins and albumins in the brain suggest diverse mechanisms for their transport across the blood-brain barrier (BBB). Prog Brain Res 91:149-154.

43. Banks, W. A. 2008. Developing drugs that can cross the 20 blood-brain barrier: applications to Alzheimer's disease. BMC Neurosci 9 Suppl 3:S2.

44. Hunter, S. F., D. J. Miller, and M. Rodriguez. 1997. Monoclo- nal remyelination-promoting natural autoantibody SCH 94.03: pharmacoki- netics and in vivo targets within demyelinated spinal cord in a mouse model 25 of multiple sclerosis. J Neurol Sci 150:103-113.

45. Banks, W. A., S. A. Farr, j. E. Morley, K. M. Wolf, V. Geylis, and M. Steinitz. 2007. Anti-amyloid beta protein antibody passage across the blood-brain barrier in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease: an age-related selective uptake with reversal of learning impairment. Exp Neurol 30 206:248-256.

46. Schenk, D., R. Barbour, W. Dunn, G. Gordon, H. Gra jeda, T. Guido, K. Hu, J. Huang, K. johnson-Wood, K. Khan, D. Kholodenko, M. Lee,

Z. Liao, I. Lieberburg, R. Motter, L. Mutter, F. Soriano, G. Shopp, N. Vasquez, C. Vandevert, S. Walker, M. Wogulis, T. Yednock, D. Games, and P. Seubert. 1999. lmmunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer- .. disease-like pathology in the PDAPP mouse. Nature 400:173-177.

" 5 47. Bard, F., C. Cannon, R. Barbour, R. L. Burke, D. Games, H. Grajeda, T. Guido, K. Hu, J. Huang, K. Johnson-Wood, K. Khan, D. Kholodenko, M. Lee, I. Lieberburg, R. Motter, M. Nguyen, F. Soriano, N. Vasquez, K. Weiss, B. Welch, P. Seubert, D. Schenk, and T. Yednock. 2000. Peripherally administered antibodies against amyloid beta-peptide enter the 10 central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease. Nat Med 6:916-919.

48. Mikami, Y., M. Toda, M. Watanabe, M. Nakamura, Y. Toya- ma, and Y. Kawakami. 2002. A simple and reliable behavioral analysis of * locomotor function after spinal cord injury in mice. Technical note. J . 15 Neurosurg 97:142-147.

49. Mikami, Y., H. Okano, M. Sakaguchi, M. Nakamura, T. Shimazaki, H. J. Okano, Y. Kawakami, Y. Toyama, and M. Toda. 2004- lm- plantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis 20 and functional recovery. j Neurosci Res 76:453-465.

50. Gilgun-Sherki, Y., H. Panet, V. Holdengreber, R. Mosberg- Galili, and D. Offen, 2003. Axonal damage is reduced following glatiramer acetate treatment in C57/bl mice with chronic-induced experimental autoim- mune encephalomyelitis. Neurosci Res 47:201-207. 25 51. Genain, C. P., B. Cannella, S. L. Hauser, and C. S. Raine.

1999. ldentification of autoantibodies associated with myelin damage in mul- tiple sclerosis. Nat Med 5:170-175.

52. Genain, C. P., M. H. Nguyen, N. L. Letvin, R. Pearl, R. L. Da- vis, M. Adelman, M. B. Lees, C. Linington, and S. L. Hauser. 1995. Antibody 30 facilitation of multiple sclerosis-like lesions in a nonhuman primate. J Chh lnvest 96:2966-2974.

53. Lennon, V. A., D. M. Wingerchuk, T. J. Kryzer, S. J. Pittock,

C. F. Lucchinetti, K. Fujihara, I. Nakashima, and B. G. Weinshenker. 2004. A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple m sclerosis. Lancet 364:2106-2112.

54. Rodriguez, M., W. E. Kames, J. D. Bartleson, and A. A.

- 5 Pineda. 1993. Plasmapheresis in acute episodes of fulminant CNS inflamma- tory demyelination. Neumlogy 43:1100-1104.

55. Herrero-Herranz, E., L. A. Pardo, R. Gofd, and R. A. Linker.

2008. Pattern of axonal injury in murine myelin oligodendrocyte glycoprotein induced experimental autoimmune encephalomyelitis: implications for multi- lO ple scIerosis. Neurobiol Dis 30:162-173.

56. Yednock, T. A., C. Cannon, L- C. Fritz, F. Sanchez-Madrid, L. Steinman, and N. Karin. 1992. Prevention of experimental autoimmune en- oephalomyelitis by antibodies against alpha 4 beta 1 integrin. Nature 356:63- .

66. « 15 57. Kanwar, J. R., J. E. Harrison, D. Wang, E. Leung, W. Mueller, N. Wagner, and G. W. Krissansen. 2000. Beta7 integrins contribute to demy- elinating disease of the central nervous system. journal of neuroimmuno/ogy 103:146-152.

58. Warrington, A. E., and M. Rodriguez. 2008. Remyelination- 20 promoting human IgMs: developing a therapeutic reagent for demyelinating disease. Curr Top Microbiol /mmuno/ 318:21 3-239.

59. jaffe, J. D., H. Keshishian, B. Chang, T. A. Addona, M. A. Gillette, and S. A. Carr. 2008. Accurate inclusion mass screening: a bridge from unbiased discovery to targeted assay development for biomarker verifi- 25 cation. Mol Ce// Proteomics 7:1952-1962.

60. Keshishian, H., T. Addona, M. Burgess, E. Kuhn, and S. A. Carr. 2007. Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution. Mol Cell Proteomics 6:2212-2229. 30 Exemplo 11: Anticorpo lqM humano rHIqM12 promove a formação de axô- nios e interaçje com balsas lipídicas para atingir microtúbulos O anticorpo sHlgM12 promoveu o crescimento de neuritos em neurônios granulares primários do cerebelo em cultura. Neste exemplo, o uso de neurônios do hipocampo primários, rHIgM12, inteiramente humano com cadeia J humana demonstrou promover a formação de axônios. ¥ rHlgM12 liga-se a membranas dos neurônios e induz o agrupamento de co- . 5 lesterol e do gangliosídeo GMl. Além disso, o rH!gM12 ligado à membrana distribui-se em dois grupos, um associado com domínios de balsas lipídicas e o outro com o grâ- nulo insolúvel do detergente rico em citoesqueleto. Agregados de rHlgM12 se colocalizam sobre microtúbulos, mas não sobre actina filamentosa depois 10 da extração com detergente. Estudos de coimunoprecipitação demonstraram que rHlgM12 e í33-tubu|jna existem em um complexo. Esses resultados indi- cam que rHlgM12 especifica a formação de axônios ao aglomerar domínios Gl de membrana para sinalizar o citoesqueleto de microtúbulos.

L Os neurônios desenvolvem axônios mediante a regulação do " . 15 crescimento de neuritos (Barnes and Polleux, 2009). O citoesqueleto dos neurônios, que inclui actina filamentosa (F-actina) e microtúbulos, desempe- nha um papel fundamental no crescimento de neuritos e no descobrimento de cones de crescimento. O anticorpo derivado do soro pode não ser adequado para estu- 20 dos em escalas maiores, especialmente se não puder ser produzido em quantidade e precisar ser isolado para cada uso do paciente que produz o anticorpo, portanto, a geração de uma forma recombinante que demonstra atividade e capacidade comparáveis é vantajosa. Este estudo demonstrou que o anticorpo IgM12 humano recombinante e inteiramente humano 25 (rHlgM12) promoveu a formação de axônios e assim direcionou a polariza- ção neuronal em neurônios cultivados do hipocampo. rHIgM12 agrupa os domínios da membrana neuronal contendo colesterol e o gangliosídeo GMl. O fracionamento por gradiente de densidade de sacarose indi- cou que rHlgM12 ligado à membrana neuronal separa-se em dois grupos, 30 um associado com a fração mais leve resistente ao detergente, a qual con- tém caveolina-l, e a outra com o grânulo rico em citoesqueleto. A extração com detergente de neurônios vivos demonstrou que rHIgM12 está associado com microtúbulos. rHlgM12 também se coimunoprecipitou com [33-tubulina.

Considerado em conjunto, é entendido que rHlgM12 se liga a domínios de membrana associados com microtúbulos.

Quando presente como substrato . sobre uma superfície, rHlgM12 promove a ancoragem de microtúbulos sobre

. 5 a membrana dos neurônios, facilitando o crescimento de neuritos e a forma- ção de axônios. lgM 12 humana recombinante (rHIgM12): rHlgM12 foi expressa em células CHO (GibcoBRL, cat. nQ 11619). Plasmídeos expressando as sequências de codificação da cadeia pesada e da leve para o anticorpo com 10 expressão predominante no soro do paciente 12 com macroglobulinemia de Waldenstrom foram transfectados junto com um transgenes da cadeia J hu- mana em células CHO-S.

Como resultado, células CHO foram selecionadas ' com doses crescentes de metotrexato e um clone estável que produzia o anticorpo, conforme medido por ELISA, foi subclonado e expandido.

O anti- " 15 corpo rHlgM12 proveniente do sobrenadante da cultura foi purificado por cromatografia para 97°/o conforme medido pela análise por HPLC.

Cultura celular e ensaio de crescimento de neuritos.

Neurônios primários do hipocampo foram preparados a partir de camundongos FVB.

Neurônios embrionários do hipocampo do Dia 15 foram dissociados em trip- 20 sina-EDTA, semeados sobre substratos de poli-D-lisina (PDL), PDL com la- minina ou rHIgM12 revestidos sobre uma camada fina de membrana de ni- trocelulose presa a lamínulas de vidro e cultivados em Meio Neurobasal con- tendo 2% (V/v) de B27. O crescimento de neuritos foi analisado 12 horas de- pois que os neurônios foram semeados.

Os neurônios foram fixados com 25 paraformaldeído 4°6 e corados com anticorpo anti-f33-tubuHna.

Actina fila- mentosa (F-actina) foi marcada com faloidina de Vermelho do Texas, e nú- cIeos com DAPL O comprimento dos neuritos foi medido utilizando o soibva- re Neuron J, processado com Excel (Microsoft) e analisado estatisticamente com Prism (GraphPad). Neurônio em estágio 3 foi definido como um neurô- 30 nio com múltiplos neuritos nos quais o neurito mais longo (Dotti et al., 1988), determinado como axônio por coloração com Taul, era pelo menos duas vezes o comprimento do segundo neurito mais longo.

Taul estava assime-

tricamente enriquecido na parte distal do axônio.

Em contraste, neurônios em estágio 2 apresentavam múltiplos neuritos simétricos. lmunocoloração, imunoprecipitação e fracionamento por gradien- te de densidade de sacarose de neurônios primários cultivados: Neurônios

. 5 do hipocampo cultivados in vitro (DlV) por um a três dias foram permeabili- zados com Triton X-lOO 0,2°6 após fixação com paraformaldeído 4%, segui- do por imunocoloração.

As imagens foram coletadas com microscópio Olympus em posição vertical e processadas com Photoshop (Adobe). A dis- tribuição de rHlgM12 foi determinada por ultracentrifugação em gradiente 10 não contínuo de sacarose.

Resumidamente, foi permitido que rHlgM12 se ligasse a neurônios corticais DlV7 vivos a 4 °C por 30 minutos e, em segui- da, foi lisado em tampão de lise gelado (Tris.HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150

· mM, EDTA 1 mM, Triton X-IOO 1°/0 e coquetel de inibidores de proteases) por 30 minutos.

Os lisados neuronais foram misturados com volume igual de " 15 sacarose 100% (p/v). A mistura foi transferida para um tubo de centrífuga, e 8 mL de sacarose 35% e 3,5 mL de sacarose 5% foram sobrepostos em se- quência.

Depois de centrifugação a 2X105 g por 20 horas a 4 °C, seis frações (2 mL de cada) foram coletadas a partir do topo do gradiente.

Cada fração e o grânulo foram dissolvidos em tampão SDS-amostra e submetido à análise 20 por Westem B/otting.

Para coimunoprecipitação de rHlgM12 com proteína do citoes- queleto, neurônios corticais DlV7 vivos foram tratados com rHlgM12 a 4 °C por 30 minutos e lisados em tampão de lise contendo NP-40 0,5%. rHlgM12 foi capturado por esferas de agarose de proteína L, e j33-tubulina por resina 25 com proteínas G (Thermo). Para marcação dupla, neurônios vivos foram co- rados com rHlgM12 em gelo e permeabilizados com Triton X-lOO 0,2% após a fixação.

A extração e a fixação dos neurônios vivos foi realizada em tam- pão contendo Pipes 60 mM, Hepes 25 mM, EGTA 5 mM, MgC|21 mM, para- formaldeído 4°/0 e Triton X-lOO 0,1%. 30 Anticorpos e outros reagentes neste exemplo: Anti-j33-tubulina (Promega); anti-actina, EDTA, poli-D-lisina, metil-B-cic|odextrina e filipina (Sigma); anti-Tau1, anti-caveolina-l e anti-receptor da transferrina (Millipo-

re); faloidina do Vermelho do Texas, toxina colérica subunidade B, Meio Neurobasal e B27 (lnvitrogen); comprimido de inibidores de proteases (Ro- che). lgM humana recombinante, rHlgM12, Promoveu a formação de 5 axônios: A fim de entender mais profundamente o efeito da lgM sobre a diferenciação de neurônios e os mecanismos moleculares subjacentes, os ensaios de crescimento de neuritos foram realizados com neurônios cultiva- dos do hipocampo utilizando uma rHlgM12 recombinante.

Neurônios do hi- lO pocampo passam por três estágios de diferenciação para formar um axônio (Dotti et al., 1988). Múitiplos processos iniciam a partir do corpo celular.

Um dos neuritos em rápido crescimento se diferencia no axônio, os outros em

"' dendritos mais tarde, o que pode ser identificado pela distribuição diferenci- ada de Taul e MAP2, respectivamente (Lewis et al., 1989; (Kanai and Hiro- " 15 kawa, 1995). Foi constatado que rHlgM12, quando apresentada como subs- trato, promoveu substancialmente a diferenciação de neurônios.

Dentro de 12 horas depois da semeadura, os neurônios do hipocampo em crescimento com rHlgM12 desenvolveram múltiplos neuritos, e um destes era muito mais longo quando comparado aos vizinhos.

Por outro lado, neurônios semeados 20 com poli-D-lisina (PDL) apresentaram múltiplos neuritos simétricos (Figura 18 A, B). Depois de ser medido o comprimento dos neuritos, foi constata- do que neurônios semeados em rHlgM12 (n=86), quando comparado a PDL (n=74), apresentavam comprimento total de neuritos significativamente mais 25 Iongo (195,8 µm contra 150,7 µm, p=O,0056) (Figura 18C). O comprimento mais longo de neurito era mais do que o dobro (117,1 µm contra 51,8 µm, p"O,OOO1) (Figura 18D), mas nenhum diferença significante no segundo neu- rito mais longo (38,7 µm contra 33,3 µm, p=O,0782) (Figura 18E) foi encon- trada.

Neurônios em crescimento em rHlgM12 carregavam menos neuritos 30 primários (2,9 contra 4,1, p<O,OOO1) (Figura 18F), e a maioria destes era com fenótipo de neurônio do estágio 3 (72°/o em rHlgM12 contra 18% em PDL) (Figura 18G). Esses resultados indicaram que rHlgM12 promoveu a diferenciação de neurônios quando apresentado como substrato.

O aspecto característico da diferenciação de neurônios é o cres- cimento de axônio polarizado e sua separação de dentritos.

Foi observado que rHIgM12 promoveu a extensão de neuritos, com um neurito significati-

,. 5 vamente mais íongo.

Para verificar mais detalhadamente se estes neuritos mais longos dos neurônios em estágio 3 se desenvoiviam em axônios, os neurônios do hipocampo semeados em diferentes substratos foram corados com anticorpos anti-taul e MAP2 (Figura 19). A coloração com Taul foi fra- ca em neurônios cultivados em PDL (Figura 19A, D), mas muito mais forte 10 em neurônios semeados em POL-laminina (Figura 19B, E) ou rHlgM12 (Fi- gura 19C, F). Laminina é um substrato cIássico para diferenciação de neurô- nios e formação de axônios (Chen et al., 2009) e foi utilizado como controle

" positivo.

Comparando a intensidade de taul de neurônios cultivados em " 15 PDL (Figura 19D), a distribuição de taul estava assimetricamente enriqueci- da na parte distal do neurito mais Íongo e muito maior em neurônios semea- dos em PDL-laminina (Figura 19E) ou rHIgM12 (Figura 19F). Por outro Iado, MAP2 corou a parte proximal de todos os neuritos (Figura 19A2-C2). Esse resultado indicou que os neuritos mais longos dos neurônios em estágio 3 20 cultivados em rHlgM12 e em laminina eram axônios.

Esses estudos demons- tram que rHlgM12 dá sustentação ao crescimento de neuritos de múltiplos tipos de neurônios e que rHlgM12 direciona a fomação de axônios. rHlqM12 induziu o aqrupamento de microdomínios da membrana neuronal Neurônios do hipocampo em crescimento em rHIgM12 como 25 substrato intensificaram a diferenciação (Figura 18 e 19). Contudo, não foi obseNado que rHlgM12 induzia o crescimento de neuritos quando rHlgM12 era aplicado aos meios do banho (dados não mostrados). Essa observação sugeriu que rHlgM12, para exercer sua função, precisa ser apresentado co- mo molécula da matriz extracelular.

A fim de entender mais as interações 30 entre membrana do neurônio e rHIgM12, neurônios vivos foram primeira- mente tratados com rHlgM12, depois fixados e duplamente corados com filipina ou toxina colérica subunidade B (CTB), que liga colesterol ou o gan-

gliosídeo Gl, respectivamente (Shogomori and Futerman, 2001). rHlgM12, CTB e filipina marcaram uniformemente as superfícies celulares dos neurô- nios controle não tratados (Figura 20A). Por outro lado, o tratamento com h rHlgM12 a 37°C induziu a reorganização de membranas neuronais em 30

. 5 minutos (Figura 20B, C). Primeiramente, rHlgM12 agregou-se em estruturas similares a "placas" (Figura 20B1, Cl) na membrana, o que não foi observa- do em neurônios não tratados (Figura 20A) ou neurônios tratados com um anticorpo lgM de controle que não se liga à membrana de neurônios (dados não mostrados)- Em segundo lugar, agrupamentos de colesterol (Figura 10 20B2) e de GMl (Figura 20C2) formaram-se sobre membranas neuronais no corpo celular, na haste de neuritos e no cone de crescimento.

Em terceiro lugar, o rHlgM12 agregado colocalizou-se com o colesterol (Figura 20B3) ou

- GMl (Figura 20C3) agrupados, especialmente no domínio central do cone de crescimento (Figura 20B-C, alta ampliação), mas não na periferia do cone " 15 de crescimento.

Esses resultados indicaram que rHlgM12 aplicado em ba- nho induziu o rearran jo na membrana neuronal, ainda que não sustentasse a extensão de neuritos/axônios.

É possível que rHlgM12, quando apresentado como substrato, possa recrutar moléculas da membrana para sÍtios de con- tato da membrana neuronal com rHIgM12 e resulte em sinalização direcio- 20 nada. rHlqM12 liqou balsas iipidicas Estudos bioquímicos com base em extração com detergente não iônico em condições frias foram utilizados para demonstrar a existência de balsas lipídicas que contêm colesterol e glicoesfingolipídio (Chichili and 25 Rodgers, 2009). Contudo, a informação morfológica sobre balsas lipídicas é limitada porque o tamanho em nanoescala está além da resolução do mi- croscópio de luz (Lingwood and Simons, 2010). A observação de que rHlgM12 induz agrupamento na membrana e que sua localização coincide com a de domínios de membrana contendo colesterol e GMl (Figura 20) 30 levantou a possibilidade de que rHlgM12 associa-se com domínios de balsas lipidicas.

Considerando que membranas neuronal são ricas em colesterol e glicoesfingolipídio, que possuem temperaturas de fusão (Tm) muito mais altas (Samsonov et al., 2001), diminuir a temperatura da membrana para abaixo da Tm pode facilitar a visualização de balsas lipídicas e suas molécu- . las associadas que são mais dinâmicas a 37°C.

A fim de testar essa hipóte-

. 5 se, neurônios vivos são resfriados para 4°C, seguido por coloração com rHIgM12. Ao contrário de neurônios fixados a 37°C, em que rHlgM12 ligou- se uniformemente (Figura 21A), a 4°C, rHlgM12 marcou estruturas pontilha- das muito maiores.

Adicionalmente, os cones de crescimento neuronal retra- Íram (Figura 21B). 10 O fato de que balsas lipídicas são domínios de membrana de- pendentes de colesterol e de que a depleção de colesterol rompe suas estru- turas (Chichili and Rodgers, 2009) foi aproveitado como vantagem.

Neurô-

' nios cultivados do hipocampo foram primeiramente tratados com metikj3- ciclodextrina (Mj3cD) para esgotar as reservas de colesterol (Ko et al., 2005) " 15 e depois resfriados para 4°C, seguido por coloração com rHIgM12 e CTB depois da fixação. rHlgM12 ligou-se a estruturas pontilhadas em membranas neuronais depois da depleção do colesterol e colocalizou-se com GMl mar- cado com CTB (Figura 21C). Considerando que GMl está presente em mi- crodomínios de balsas lipídicas e que rHlgM12 induz o agrupamento de 20 GMl (Figura 20), foi concluído que rHlgM12 liga-se a microdomínios conten- do GMl, que são independentes de colesterol da membrana neurona!. Es- ses experimentos confirmaram que balsas Iipídicas existem como estruturas morfológicas distintas, que estão uniformemente inseridas em membranas (Figura 20A e Figura 21A) ou se agregam para formar domínios maiores (Fi- 25 gura 20B e C, Figura 21B e C). Esses resultados indicam que rHlgM12 se Iiga a molécu1a(s) que transitam entre domínios de balsas e sem balsas de- pendendo das interações biofísicas com outras moléculas.

Foi testada ainda a hipótese de que rHlgM12 se liga a balsas li- pídicas.

Considerando que balsas lipídicas localizam-se dentro das mem- 30 branas resistentes a detergente não iônico (DRM) em temperatura fria (Samsonov et al., 2001), a localização de rHlgM12 foi analisada em lisados de neurônios corticais preparados a 4 °C.

A análise por B/otting dos lisados neuronais com anticorpo secundário anti-lgM humana revelou que rHIgM12 ligado à membrana era encontrado no grânulo e no sobrenadante, enquanto o anticorpo lgM de controle que não liga a neurônios era encontrado somen- . te nos eluados de lavagens (Figura 22A). Essas observações indicaram que

. 5 rHlgM12 se separa em dois grupos, um localizado na fração "solúvel com detergente" no sobrenadante e a outra associada com o grânulo "insolúvel com detergente". Em um segundo experimento, neurônios corticais foram primei- ramente marcados com rHlgM12, depois fracionados por gradiente de den- lO sidade de sacarose a 4 °C.

A análise por B/otting de diferentes frações indi- cou que rHlgM12 localizou-se na fração mais leve que continha também ca- veolina-l, um marcador de balsas lipidicas, mas não na fração sem balsas

· rica em receptor da transferrina (Figura 22B). Contudo, mesmo "neste pro- cesso de fracionamento rigoroso (Triton X-lOO 1% e ultracentrifugação a '" 15 2x105 g), algum rHlgM12 foi detectado no grânulo, o qual contém principal- mente citoesqueleto insolúvel em detergente (Figura 22B). Embora tubulina (Sorice et al., 2009) e actina (Levitan and Gooch, 2007) estejam presentes em balsas lipídicas, somente Í33-tubu|ina foi detectada na balsa e a maioria de actina foi para a fração sem balsas (Figura 22B). Esses dados indicaram 20 a existência de dois grupos de rHlgM12 Iigado à membrana, um presente na basal lipídica e o outro no grânulo. rHlçjM12 associou-se com microtúbulos Os dados dos presentes inventores mostraram que rHlgM12 a- gregado localizou-se nas regiões tais como corpo celular, haste de neuritos 25 e domínio central do cone de crescimento (Figura 20), que são dominadas por microtúbulos (Forscher and Smith, 1988). Em conjunto com o fato de que rHlgM12 ligado à membrana separou-se em frações de balsas lipídicas e do grânulo, ambas das quais continham j33-tubulina (Figura 22B), esses dados sugeriram que rHlgM12 pode estar associado com componente(s) do citoes- 30 queleto.

Para testar essa hipótese, neurônios do hipocampo foram tratados com rHlgM12 para induzir o rearranjo da membrana, depois simultaneamen- te fixados e extraídos a 37 °C com paraformaldeído 4°/0 contendo Triton X-

100 0,1%. Depois da extração, pontos da membrana insolúvel no detergente marcados com rHlgM12 alinharam-se com fascículos de microtúbulos agru- pados na haste de neuritos (Figura 23A2). No cone de crescimento, rHlgM12 h

Iocalizou-se principalmente no domínio central ocupado por microtúbulos

. 5 desfaciculados, mas não na periferia do cone de crescimento rica em F- actina (Figura 23A3 e A4). Esses resultados indicaram que rHlgM12 pode associar-se com microtúbulos.

Foi constatado que rHlgM12 colocalizou-se com GMl (Figura 21C). GMl demonstrou ser ancorado por tubulina da membrana em neurô- lO nios granulares do cerebelo e foi co-purificado (pu// down) por um anticorpo anti-tubulina depois da reticulação (Palestini et al., 2000). Por conseguinte, é provável que rHlgM12 se associe com microdomínios de membrana conten-

· do tubulina.

Para testar esta hipótese mais profundamente, os experirnentos modificados de co'-purificação (pu// down) foram realizados com lisados celu- " 15 Iares de neurônios corticais vivos tratados com rH(gM12 a 4 °C.

Foi consta- tado que rHlgM12 e f33-tubulina coimunoprecipitaram um com outro (Figura 23B), sugerindo que rHlgM12 e Í33-tubu|ina existem como um complexo.

A molécula de IgM possui uma estrutura pentamérica com peso molecular em torno de 900 kOa.

Para descartar a possibilidade de que rHlgM12 se associa 20 com tubulina ou microtúbulos diretamente em Iisados neuronais, ensaios de co-purificação foram realizados com células N2A de neuroblastoma que não se ligam a rHlgM12, mas expressam [33-tubulina (Figura 25A). rHlgM12 nem se associou, nem se apresentou no grânulo.

Foi somente detectado nos so- brenadantes de lisados de células N2A de neuroblastoma (Figura 25B). Em 25 conjunto, esses resultados confirmaram a mediação de balsas lipídicas para a associação entre rHlgM12, seus antígenos e microtúbulos.

Os dados neste relatório descritivo demonstraram que uma lgM recombinante inteiramente humana, rHlgM12, direciona a polarização de neurônios ao promover o crescimento de axônios em neurônios primários 30 cultivados do hipocampo quando apresentados como substrato (Figura 18 e 19). O rHlgM12 agregou-se sobre superfícies de neurônios e induziu o agru- pamento de colesterol e gangliosídeo, GMl (Figura 20). rHlgM12 colocali-

zou-se com GMl (Figura 21). O fracionamento por gradiente de sacarose de lisados de neurônios indicou que rHlgM12 ligado à membrana separou-se em dois grupos: um associado com balsas Iipídicas, o outro com o grânulo (Figura 22). A extração de neurônios vivos com detergente não iônico mos-

- 5 trou ainda que rHIgM12 ligado à membrana colocalizou-se com microtúbulos e foi coimunoprecipitado com j33-tubulina (Figura 23). O precedente indica que rHlgM12 se liga e interage com micro- domínios de balsas lipídicas e indica ainda que domlnios de balsas associa- dos com rHlgM12 transmitem sinalização para microtúbulos.

Como resulta- lO do, rHIgM12 faz a mediação para a estabilização de microtúbulos, o que im- pulsiona o crescimento de axônios.

Este exemplo demonstrou que rHlgM12 promove seletivamente

- o crescimento de axônios de neurônios primários do hipocampo (Figura 18 e 19). " 15 Recentemente, os presentes inventores demonstraram que a lgM humana derivada do soro, sHlgM12, melhorou a função neurológica em um modelo animal de esclerose múltipla que desenvolve extensa degenera- ção e perda axonal (Rodriguez et al., 2009). Esses estudos corroboram o conceito de que HlgM12 exerce sua função ao incentivar o crescimento de 20 axônios.

Neurônios especificam axônios através de um programa intrln- seco controlado que regula a extensão de neuritos.

Um neurônio em desen- volvimento dá inicio a múltiplos neuritos.

Um dos neuritos diferencia-se no axônio, os outros em dendritos.

Os neuritos vizinhos competem entre si.

O 25 neurito mais longo, que é também o único com a taxa mais rápida de exten- são, inicialmente interrompe a extensão simétrica de neuritos para se de- senvolver em axônio, ao passo que os outros neuritos estendem-se muito mais Ientamente e se desenvolvem em dendritos posteriormente (Dotti et al., 1988; Goslin and Banker, 1989). F-actina e microtúbulos são os dois princi- 30 pais citoesqueletos que estão envolvidos em extensão de neuritos e forma- ção de axônios.

Nosso entendimento sobre as especificações do axônio es- tão evoluindo.

Foi considerado que a F-actina, que se localiza na periferia do cone de crescimento, desempenha uma função importante.

Microtúbulos, que dominam a haste de neuritos e estão confinados ao domínio central do cone de crescimento, são considerados secundários à F-actina.

Recente- . mente, os microtúbulos demonstraram desempenhar também uma função

^ 5 fundamental no crescimento de axônios.

Os microtúbulos são capazes de explorar dinamicamente o sistema de redes de actina no cone de crescimen- to, A estabilização de microtúbulos é suficiente para induzir a formação de axônios (Witte and Bradke, 2008). Os resultados dos presentes inventores que rHIgM12 e [33- 10 tubulina co-imunoprecipitaram, que a localização de rHlgM12 coincidiu com a de microtúbulos e que rHIgM12 estava presente no grânulo após extração com detergente corroboram os microtúbulos como participante central.

Além

- disso, os dados forneceram a primeira evidência na técnica de que microtú- bulos interagem diretamente com membranas de neurônios.

Esses achados " 15 apoiam o conceito de que rHlgM12 interage ou se Iiga a uma cascata trans- membrana que transmite sinal extracelular para os microtúbulos.

A proprie- dade dinâmica de microtúbulos para crescer e retrair, por exemplo, nos co- nes de crescimento, os possibilitam a impulsionar o movimento da membra- na de neurônios (Dent and Kalil, 2001). Os microtúbulos estabilizados anco- 20 ram as membranas de neurônios.

A existência de microtúbulos dinâmicos e estabilizados e/ou a transição entre esses dois estados orquestram o pro- cesso de crescimento de neuritos para especificar um axônio.

Dessa forma, lgM12 aumenta a extensão de axônios ao estabilizar os microtúbulos.

Lipídios e proteínas são continuamente incorporados em mem- 25 branas celulares, os quais são depois repartidos em microdomínios, as as- sim chamadas balsas lipídicas.

Balsas da membrana são geralmente defini- das como compartimentos da membrana heterogêneos e dinâmicos em na- noescala (10-200 nm) ricos em esterol e esfingolipídio (Lingwood and Si- mons). 30 Os presentes inventores propõem que rHIgM12 se liga a balsas lipídicas.

Em primeiro lugar, foi observado que rHlgM12 se agregavam sobre membranas de neurônios e induziam o agrupamento de colesterol ou do gangliosídeo GMl (Figura 20). Esses resultados indicam que rHlgM12 se liga a domínios de balsas lipídicas contendo colesterol e GMl.

Pequenas balsas podem interagir com lipídios e/ou proteínas.

As diminutas balsas indi- . viduais podem se estabilizar e fundir-se em plataformas maiores que inte-

. 5 gram sinais e regulam a intensidade e a amplitude de vias de sinalização.

Anticorpos lgM, que possuem uma estrutura pentamérica, podem amplificar sinais por reticulação de antígenos adjacentes (receptores) e/ou reúnem os antígenos próximos o suficiente para aumentar a reticulação ou interação- Dessa forma, os antígenos reticulados e as moléculas de sinalização asso- lO ciadas podem se agrupar.

Em segundo lugar, foi mostrado que rHlgM12 se ligou a pontos muitos maiores em membranas de neurônios quando os neu- rônios do hipocampo foram resfriados para 4 °C (Figura 21). O colesterol e

· esfingolipídios possuem alta temperatura de fusão (Tm). O tratamento de neurônios na temperatura abaixo de Tm pode diminuir a dinâmica da mem- " 15 brana, o que facilita a visualização de balsas Iipídicas agregadas.

Em con- junto com o achado de que rHlgM12 se colocalizou com GMl mesmo depois da depleção de colesterol (Figura 21), esses resultados sugerem que rHlgM12 se liga e interage com moléculas da membrana de neurônios que se colocalizam com GMl.

A identidade precisa não está cIara, embora os 20 achados prévios dos presentes inventores, de que o tratamento com sialida- se de neurônios granulares cultivados do cerebelo de rato aboliu a ligação de sHlgM12, sugeriu que o epítopo ligado ao sHlgM12 é um carboidrato NVarrington et al., 2004). Em terceiro lugar, depois do fracionamento por sa- carose de lisados de neurônios, o rHljjM12 ligado à membrana localizou-se 25 na fração mais leve, a qual continha também o marcador de balsas Iipídicas, caveolina-l.

Considerados em conjunto, esses resultados apoiam a hipótese de que rFIlgM12 se Iiga a balsas lipídicas.

Cascatas de sinais, desde o folheto externo de membranas de neurônios ao citoesqueleto intracelular, são centrais para a especificação 30 para axônio.

Agregados de rHIgM12 se distribuíram na haste de neuritos e no domínio central do cone de crescimento (Figura 20), os quais são domi- nados por microtúbulos, mas não por actina filamentosa (Figura 23). Alguns íWàkW dos agregados de rHIgM12 eram insolúveis no detergente e se localizaram em feixes fasciculados de microtúbulos após a extração com detergente (Fi- gura 23A). Essas observações indicam a existência de outro grupo de molé- . culas ligadas ao rHlgM12, as quais podem ser diferentes daquela associada

. 5 a balsas lipídicas.

O estudo de fracionamento com sacarose confirmou ainda que existe um grupo de moléculas associadas ao rHIgM12 que se localizam no grânulo insolúvel no detergente (Figura 22B), o qual pode ser o grupo que se localizou com microtúbulos conforme detectado na Figura 23A.

Esses resultados demonstraram que algum rHlgM12 associa-se 10 com componente(s) do citoesqueleto, possivelmente microtúbulos.

O achado de que rHlgM12, que se associou com moléculas "solúveis no detergente" no sobrenadante (Figura 22A & Figura 23B), era coimunoprecipitado com Í33-tubu|ina (Figura 23B) indica que molécula(s) ligada(s) a rHlgM12 e [33- ' tubulina pode(m) existir como complexo em balsas lipídicas.

Entretanto, não

" 15 é provável que rHlgM12 interaja com j33-tubulina diretamente porque o rHlgM12 não co-purificou j33-tubulina em células N2A de neuroblastoma às quais rH1gM12 não se Iiga (Figura 25). Dessa forma, rHIgM12 associado ao citoesqueleto e a balsas lipídicas liga-se a moléculas que se localizam nas vizinhanças de tubulina.

Esse conceito é reforçado mais pelas observações 20 de que rHlgM12 se colocalizou com GMl (Figura 21C), e que GMl foi copu- rificado por um anticorpo antitubulina após uma reação de reticulação (Pa- lestini et al., 2000). As moléculas ligadas a rHlgM12 nos domínios de balsas lipídi- cas podem ser incorporadas constantemente nos citoesqueletos durante o 25 processo de crescimento de neuritos e extensão de axônios.

Essa hipótese é apoiada pelos achados de que, na região do cone de crescimento, rHlgM12 agregou-se no domínio central (Figura 3 e 6A) e foi insolúvel no detergente a 37°C (Figura 23A). Considerados em conjunto, é revelado que HlgM12 se liga e afeta a dinâmica de balsas lipídicas que fazem a mediação 30 da sinalização de HlgM12 para os microtúbulos.

Se a F-actina está envolvida na sinalização induzida por rHlgM12 não está claro.

Uma série de linhas de evidências indica que a acti-

na e proteínas de ligação à actina estão associadas com balsas lipídicas (Levitan and Gooch, 2007). Filamentos de actina e microtúbulos interagem ativamente em movimento celular coordenado (Rodriguez et al., 2003) que € inclui também neurônios.

Por conseguinte, é provável que a actina desem- 5 penhe também uma função na sinalização induzida por rHIgM12. junto com j33-tubulina, uma quantidade de actina foi copurificada por rHlgM12 (Figura 26B). Dessa forma, rHIgM12 Iiga balsas lipídicas que contêm actina e $3- tubulina.

Contudo, pontos marcados com rHIgM12 permaneceram no limi- lO te do cone de crescimento, enquanto que redes de F-actina retraíram da pe- riferia do cone de crescimento quando os neurônios foram tratados a 4 °C (Figura 26A). Depois do fracionamento por gradiente de sacarose, a actina

L locaiizou-se principalmente na fração sem balsas, e somente uma pequena quantidade de actina foi detectada no grânulo insolúvel no detergente (Figu- " 15 ra 22B). Essas observações indicam que F-actina é muito dinâmica e que a maioria é despolarizada em condições frias e/ou por extração com detergen- te.

Por conseguinte, a actina pode estar envolvida na sinalização mediada pelo rHlgM12. Os presentes inventores concluem que a IgM humana rHlgM12 20 liga-se e reorganiza balsas lipidicas, e que microtúbulos são um dos alvos em sentido descendente. rHlgM12 promove a extensão de axônios somente quando apresentada como substrato.

Como substrato, rHlgM12 foi imobili- zado e restringido em sua interação com a membrana neuronal.

O rHlgM12 imobilizado pode ter criado um gradiente de sinais através das membranas 25 neuronais, conforme frequentemente observado em sinalização induzida por morfogênio (Schmitt et al., 2006). Por outro lado, a aplicação em banho de rHlgM12 pode somente faciiitar o agrupamento aleatório de balsas lipídicas (Figura 20) e pode não ser suficiente para romper o crescimento assimétrico de neuritos e aumentar a formação de axônios.

Resumidamente, os resulta- 30 dos dos presentes inventores apoiam o modelo proposto na Figura 24. Membranas de neurônios contêm microdomínios de balsas e sem balsas.

Existem dois grupos de domínios de balsas, um dos quais está associado com microtúbulos (Figura 24A). 2) rHlgM12 liga-se e agrupa domínios de balsas, o que promove a estabilização de microtúbulos e a ancoragem na membrana (Figura 24B). 3) No cone de crescimento, o agrupamento de bal- sas induzido por rHIgM12 pode aumentar a transição de periferia do cone 5 central para domínio central, rompendo o crescimento simétrico de neuritos para especificar a formação de axônios (Figura 24C). Referências Allen JA, Halverson-Tamboli RA, Rasenick MM (2007) Lipid raft microdomains and neurotransmitter signalling.

Nat Rev Neurosci 8:128-140. 10 Bames AP, PoIleux F (2009) Establishment of axon-dendrite po- larity in developing neurons.

Annu Rev Neurosci 32:347-381. Chen ZL, Haegeli V, Yu H, Strickland S (2009) Cortical deficien-

" cy of laminin gammal impairs the AKT/GSK-3beta signaling pathway and Ieads to defects in neurite outgrowth and neuronal migration.

Dev Biol " 15 327:158-168. Chichili GR, Rodgers W (2009) Cytoskeleton-membrane interac- tions in membrane raft structure.

Cell Mol Life Sci 66:2319-2328. Conde C, Caceres A (2009) Microtubuie assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.

Nat Rev Neurosci 10:319-332. 20 de Anda FC, Pollarolo G, Da Silva JS, Camoletto PG, Feiguin F, Dotti CG (2005) Centrosome localization determines neuronal polarity.

Na- ture 436:704-708. Dent EW, Kalil K (2001) Axon branching requires interactions be- tween dynam ic microtubules and actin filaments.

J Neurosci 21:9757-9769. 25 Dent EW, Callaway JL, Szebenyi G, Baas PW, Kalil K (1999) Reorganization and. movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.

J Neurosci 19:8894-8908. Dotti CG, Sullivan CA, Banker GA (1988) The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.

J Neurosci 8:1454-1468. 30 Forscher P, Smith SJ (1988) Actions of cytochalasins on the or- ganization of actin filaments and microtubules in a neuronal growth cone.

J Cell Biol 107:1505-1516.

GosIin K, Banker G (1989) Experimental observations on the de- velopment of polarity by hippocampal neurons in cuiture. j Cell Biol 108:1507-1516. b Herdegen T, Skene P, Bahr M (1997) The c-jun transcription 5 factor--bipotential mediator of neuronal death, suNiva| and regeneration. Trends Neurosci 20:227-231. Higginbotham HR, Gleeson JG (2007) The centrosome in neu- ronal development. Trends Neurosci 30:276-283. Kanai Y, Hirokawa N (1995) Sorting mechanisms of tau and 10 MAP2 in neurons: suppressed axonal transit of MAP2 and Iocaliy regulated microtubule binding. Neuron 14:421-432. Ko M, Zou K, Minagawa H, Yu W, Gong JS, Yanagisawa K, " Michikawa M (2005) Cholesterol-mediated neurite outgrowth is differently regulated between cortical and hippocampal neurons. J Biol Chem ' 15 280:42759-42765. Levitan I, Gooch KJ (2007) Lipid rafts in membrane-cytoskeleton interactions and control of cellular biomechanics: actions of oxLDL. Antioxid Redox Signal 9:1519-1534. Lewis SA, lvanov IE, Lee GH, Cowan NJ (1989) Organization of 20 microtubules in dendrites and axons is determined by a short hydrophobic zipper in microtubule-associated proteins MAP2 and tau. Nature 342:498-

505. Lingwood D, Simons K Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science 327:46-50. 25 Niethammer P, Delling M, Sytnyk V, Dityatev A, Fukami K, Schachner M (2002) Cosignaling of NCAM via iipid rafts and the FGF recep- tor is required for neuritogenesis. j Cell Biol 157:521-532. Palestini P, Pitto M, Tedeschi G, Ferraretto A, Parenti M, Brunner j, Masserini M (2000) Tubulin anchoring to glycolipid-enriched, detergent- 30 resistant domains of the neuronal pIasma membrane. J Biol Chem 275:9978-

9985. Rodriguez M, Warrington AE, Pease LR (2009) lnvited Article:

Human natural autoantibodies in the treatment of neurologic disease.

Neu- rology 72:1269-1276- Rodriguez OC, Schaefer AW, Mandato CA, Forscher P, Bement b

WM, Waterman-Storer CM (2003) Conserved microtubule-actin interactions

K 5 in cell movement and morphogenesis.

Nat Cell Biol 5:599-609. Samsonov AV, Mihalyov I, Cohen FS (2001) Characterization of cholesterol-sphingomyelin domains and their dynamics in bilayer mem- branes.

Biophys J 81:1486-1500. Schmid RS, Maness PF (2008) Ll and NCAM adhesion mole- lO cules as signaling coreceptors in neuronal migration and process outgrowth.

Curr Opin Neurobiol 18:245-250. Schmitt AM, Shi j, Wolf AM, Lu CC, King LA, Zou Y (2006) Wnt-

" Ryk signalling mediates medial-lateral retinotectal topographic mapping.

Na- ture 439:31-37. ' 15 Segal RA (2003) Selectivity in neurotrophin signaling: theme and variations.

Annu Rev Neurosci 26:299-330. Shogomori H, Futerman AH (2001) Cholera toxin is found in de- tergent-insoluble rafts/domains at the cell surface of hippocampa) neurons but is internalized via a raft-independent mechanism.

J Biol Chem 276:9182- 20 9188. Sorice M, Matarrese P, Tinari A, Giammarioli AM, Garofalo T, Manganelli V, Ciarlo L, Gambardella L, Maccari G, Botta M, Misasi R, Malorni W (2009) Raft component GD3 associates with tubulin following CD95/Fas ligation.

Faseb J 23:3298-3308. 25 Warrington AE, Bieber AJ, Van Keulen V, Ciric B, Pease LR, Ro- driguez M (2004) Neuron-binding human monoclonal antibodies support cen- tral nervous system neurite extension.

J Neuropathol Exp Neurol 63:461-473. Witte H, Bradke F (2008) The role of the cytoskeleton during neuronal poIarization.

Curr Opin Neurobiol 18:479-487. 30 Witte H, Neukirchen D, Bradke F (2008) Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.

J Cell Biol 180:619-632. Exemplo 12: Ensaios com biossensor óptico à base de nanoporos para anticorpos monoclonais humanos benéficos para lesão na medula espinhal A proteção de axônios e seu reparo após lesão na medula espi- nhal (SCl) tem grande potencial como estratégia eficaz para prevenir a perda y de neurônios motores e a deficiência permanente.

A proteção de neurônios

. 5 foi conseguida por meio de fatores tróficos direcionados para prevenir danos e para promover o reparo de axônios após a ocorrência de lesão.

Essas mo- léculas foram identificadas predominantemente utilizando estratégias de se- leção com base em sistemas in vitro que se centram em direcionar peque- nas moléculas que atuam como fatores neurotróficos. 10 Anticorpos monoclonais autorreativos naturais demonstram fun- ções benéficas em células do sistema nervoso central com o uso de múlti- plos modelos de lesão e doença.

A promoção mediada por anticorpos de

" sobrevida de neurônios, regeneração de axônios e recuperação funcional foi demonstrada in vivo utilizando a IgM monoclonal de camundongos, IN-I " 15 (Bregman 1995; Caroni and Schwab 1988). Resultados similares foram obti- dos com a imunização de homogenatos da medula espinhal (SCH) antes de danos ao sistema nervoso central (Ellezam 2003; Huang 1999). Com base em dados obtidos pelos presentes inventores de anti- corpos humanos que se ligam a neurônios, incluindo lgM12 e o anticorpo 20 remielinizante IgM22, foi revelado que interações de anticorpos monoclonais que protegem os axônios contra danos ao promoverem a sobrevida e a fun- ção de neurônios, e benéficas para tratar lesão e/ou doença no sistema ner- voso central, tais como SCl, são dependentes de interações na bicamada lipídica-proteínas na superflcie da membrana plasmática em condições pato- 25 lógicas/fisiológicas.

Anticorpos humanos que promovem a sobrevida de neurônios após lesão ou danos aos nervos (por exemplo, na SCl) ou que protegem neurônios de lesão ou morte, em cada situação resultando em preseNação da função neurológica, são avaliados, caracterizados e/ou identificados utili- 30 zando tecnologias que mantêm as bicamadas lipÍdico-proteínas na superfície da membrana plasmática em condições patológicas/fisiológicas.

Neste estudo, foi deteminada a cinética da interação de ligação

WKHÊ na superficie dos anticorpos monoclonais humanos utilizando sensores de ressonância plasmônica de superfície (SPR) na bicamada lipídica-proteínas.

Os anticorpos monoclonais humanos são caracterizados ou identificados . utilizando a ligação em lesões na medula espinhal de cortes de tecido ex

. 5 vivo de roedores após lesão na medula espinhal.

Em seguida, o modelo de lesão por esmagamento da medula espinhal em roedor é utilizado para ava- liar mais detalhadamente a habilidade de anticorpos humanos em promover sobrevida de neurônios, extensão de neuritos ou remielinização in vivo resul- tando em redução da patologia e função neurológica melhorada. 10 Um novo sensor de bicamada lipídica para SPR torna possÍvel caracterizar por meio de uma tecnologia rápida, sem marcação a cinética e a afinidade de ligação de proteínas de superfície4ipídios por anticorpos IgMs

'h· humanos benéficos.

Esta tecnologia com sensor de ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi desenvolvida com base em arranjos periódicos de " 15 nanoporos em películas metálicas combinadas com bicamada lipídica plana fisiológica.

A tecnologia SPR permitiu a caracterização rápida, sem marca- ção da cinética e afinidade de ligação de anticorpos lgMs com antígenos pertinentes.

A cinética de ligação é importante para quantificar pequenas di- 20 ferenças que siNam de justificativa para selecionar moléculas líderes duran- te o desenvolvimento e determinar o impacto da administração e da potência de uma molécula terapêutica in vivo.

A SPR tornou-se um padrão reconheci- do em ambientes industriais e acadêmicos, nos quais tipicamente é caracte- rizada a interação molecular entre um par de parceiros de ligação que são 25 soIúveis.

Contudo, a tecnologia está somente começando a ser adaptada às necessidades de antígenos ligados à membrana.

O substrato de ouro utili- zado na detecção de SPR não propicia a formação de Iipídios suportados em membrana.

Além do mais, proteínas de membrana em contato direto com a superfície do ouro frequentemente perdem sua funcionalidade.

Entre- 30 tanto, o desenvolvimento da nova tecnologia para detecção com arquitetura de nanoporos, utilizando uma película fina de ouro perfurada com arranjos periódicos de nanoporos, superou esses desafios (ver, por exemplo, a Figu-

ra 27). Cada nanoporo está assentado sobre um substrato de vidro e forma uma cavidade diminuta para confinar lipídios suportados em membranas,

P enquanto que a película de ouro em volta desenvolve efeitos de SPR para monitorar dinamicamente a ligação de moléculas sobre a membrana (Figura - 5 27B). Arranjos de nanoporos integrados em uma pelicula de ouro oferecem uma geometria única, já que uma bicamada lipídica fina pode ser suspensa sobre os nanoporos ao mesmo tempo em que mantendo a estabilidade me- cânica e sendo envolvida por um tampão em ambos os lados (Figura 27B). As proteínas de membrana podem ser assim integradas sem di- lO ficuldade com a capacidade para detecção por SPR de arranjos de nanopo- ros de ouro, mantendo sua funcionalidade em um ambiente que mais proxi- mamente simula seu estado natural. Além disso, proteínas de membrana " integradas na bicamada lipídica independente são faciimente acessadas de ambos os lados, tornando essa abordagem mais atraente para estudar o ' 15 mecanismo pelo qual a ligação de antígeno-anticorpo sobre a superfície da célula resulta em sinalização celular (Figura 27B). Esse sensor de SPR para bicamada lipídica proporciona uma tecnologia rápida, sem marcação que é utilizada para a avaliação, a identificação e a caracterização da cinética e afinidade de ligação de proteínas de superfÍcie-lipÍdios de anticorpos lgMs 20 húmanos terapêuticos. Essa pIataforma sensora caracteriza a cinética e afinidade de li- gação de proteínas de superfície-lipidios de anticorpos lgMs terapêuticos para testes em um modelo animal de lesão na medula espinhal. Os presen- tes inventores caracterizaram extensamente certos anticorpos lgMs identifi- 25 cados pela ligação à superfície "viva" não fixada de tecido e células do cere- belo no sistema nervoso central. Estes anticorpos ÍgMs (exemplificados por lgM22 e lgM46) estimularam o fluxo de cálcio in vitro e promoveram a remie- linização in vivo. Com base nos mesmos critérios, anticorpos humanos foram identificados por rastreamento de amostras no banco de soro com disprotei- 30 nemia na Clínica Mayo. Outros anticorpos lgMs humanos (exemplificados neste relatório descritivo por lgM12 e lgM42) Iigam-se à superfície de neurô- nios e promoveram o crescimento de neuritos e preveniram a morte de neu-

rônios in v/tm.

Os anticorpos que se ligam a neurônios exibiram imunorreativi- dade específica para células, estruturas do sistema nervoso central de pato- logia de lesão e doença utilizando seções corticais "vivas" não fixadas obti- 5 das de múltiplos modelos de lesão e doença do sistema nervoso central em camundongos.

Anticorpos monoclonais humanos naturais demonstraram poten- cializar funções biológicas benéficas em células do sistema nervoso central de múltiplos modelos de lesão e doença.

Os anticorpos monoclonais huma- lO nos ligam-se à superfície de uma grande variedade de neurônios em cultura, incluindo neurônios do cerebelo, corticais, ganglionares da retina e da medu- la espinhal (por exemplo, os anticorpos humanos lgM12 e IgM42). Estes an-

- ticorpos induzem a extensão de neuritos de neurônios do sistema nervoso central (Figura 28) e anulam a inibição de mielina do sisterna nervoso central " 15 sobre o crescimento de neuritos (Warrington et al. 2004)- Os estudos in vitro demonstram a ligação de anticorpos mono- clonais humanos na superfície da membrana plasmática de neurônios.

A Iigação característica é uniforme a 0° C, enquanto rearranjos da superfície formam estruturas pontilhadas a 15° C (Figura 29). A Iigação na superfície 20 celular é característica de agrupamentos de microdomínios de membrana associados com moléculas de sinalização que iniciam cascatas de sinais (Howe et al. 2004). Os anticorpos monoclonais humanos penetram o tecido da me- dula espinhal e se acumulam em sÍtios danificados 4 horas depois da admi- 25 nistração intravenosa (Figura 30). A imunocitoquímica realizada em cortes obtidos em vibrátomos da medula espinhal detecta IgM humana dentro de lesões após administração de anticorpos que se ligam a neurônios, mas não depois da administração de uma lgM humana de controle.

Camundongos com doença crônica da medula espinhal (camundongos infectados pelo 30 TMEV) receberam 0,5 mg de sHlgM42 por via intraperitoneal, as medulas espinhais foram removidas 4 horas mais tarde e a presença de lgM humana detectada em cortes transversais da medula espinhal (Figura 30). Áreas com

Iesão da medula espinhal de um camundongo que recebeu sHlgM42 de- monstram que fibras paralelas se ligam à anti-lgM humana marcada com fluorescência (Figura 30A). Áreas com lesão da medula espinhai de um ca- . mundongo que recebeu uma lgM humana controle não contêm lgM humana

- 5 (Figura 30B). Anticorpos monoclonais humanos foram identificados utilizando ensaios de função biológica para avaliar amostras do banco de soros com disproteinemia da CIínica Mayo.

As amostras de soro, 115.000 coletadas durante 40 anos, contêm altas concentrações de anticorpos monoclonais de 10 pacientes com gamapatia monoclonal.

Os presentes inventores sintetizaram e testaram a lgM 22 humana recombinante, que possui atividade promotora de remielinização em modelos animais (Mitsunaga 2002; Warrington 200O)- r Em uma concretização, este Exemplo gera anticorpo monocional com qualidade GMP útil para aplicações terapêuticas, prognósticas, diagnós- " 15 ticas e/ou profiláticas em condições de degeneração de nervos, lesão e/ou danos a neNos, tais como na SCl humana, ou em condições desmielinizan- tes que expõem neurônios do sistema nervoso central.

Esses estudos caracterizam mais detalhadamente e avaliam an- ticorpos IgMs humanos que promovem a sobrevida de neurônios após SCl 20 traumática, resultando em preservação da função neurológica.

Testes com- portamentais e mensurações morfológicas de números de axônios após SCl são avaliados, e as diferenças entre preservação endógena e a mediada por anticorpos da função neurológica são determinadas.

Tratamentos com os anticorpos que protegem e estendem os axônios, quando comparados a 25 controles de anticorpos, após SCI são utilizados para caracterizar diferenças de preservação da função neurológica para atividades específicas mediadas por anticorpos.

Vesiculas da membrana contendo a bicamada proteína da membrana plasmática-lipidios são isoladas de células em condições fisioló- 30 gicas.

Nanoporos dos sensores de SPR são revestidos com preparados de microvesículas de membranas isoladas de neurônios, glia, sinaptossoma e de mielina de sistema nervoso central e tecidos com Iesão na medula espi-

nhal.

Amostras de soro com anticorpos humanos monoclonais e amostras de anticorpos recombinantes são rastreadas para determinar a cinética de liga- ção para tipos específicos de membrana.

Anticorpos humanos monoclonais que se Iigam especificamente

- 5 à membrana plasmática na superfície de células e tecidos "vivos" não con- gelados, não fixados em condições fisiológicas, conforme confirmado por sensores de SPR, são testadas quanto à Iigação específica utilizando teci- dos patológicos "vivos" não congelados, não fixados após SCl.

Anticorpos monoclonais humanos que demonstram ligação a lesões da medula espinhal 10 são ainda caracterizados quanto à aplicabilidade e a atividade em tratamen- to após SCl no roedor.

Desenho do protocolo.

Lesão por compressão é gerada ao nível

" de T9 em fêmeas de camundongo C57BL/6J de dez semanas de idade (18- 22 g) (jackson Laboratories) utilizando um grampo modificado para forma- " 15 ção de aneurisma (grampo FEJOTA para camundongos, força de fechamen- to de 3 g ou 8 g). Esse modelo de SCI inclui não só um impacto inicial, mas também uma fase persistente de compressão que promove cavitação micro- cÍstica, degeneração de axônios e astrogliose robusta, todos estes represen- tando marcos da SCI traumática humana (Joshi and Fehlings 2002). Testes 20 comportamentais utilizando a Escala de Classificação Locomotora de Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) para ratos e a Escala de Basso para Locomoção de Camundongos (BMS) são determinados após a SCI para avaliar os défi- cits neurológicos.

A técnica está retratada na Figura 31. Cortes de tecido vivo não congelado, não fixado ex vivo são en- 25 tão preparados a partir de Iesões patológicas após a Iesão por compressão da medula espinhal em roedores.

A imunorreatividade da ligação de anticor- pos IgMs humanos é rastreada por coloração imunofluorescente (IF) dos cortes mantidos em condições fisiológicas.

Camundongos são tratados agudamente após uma lesão por 30 compressão da medula espinhal, incluindo rHlgM12 e sHlgM42 ou rHlgM42, administrados por via intraperitoneal.

A habilidade dos anticorpos humanos em promover a preservação de axônios ou o reparo do tecido é mensurada.

Testes comportamentais utilizando a escala BBB e BMS são realizados em intervalos regulares durante o período de 5 semanas após a SCl.

Uma dose única de 0,5 mg do anticorpo humano é administrada por via i.p. aos camun- . dongos 30 minutos depois da SCl.

Grupos de camundongos (15 camundon-

- 5 gos) recebem anticorpos humanos que promovem proteção de neurônios, crescimento de neuritos, anticorpos humanos de controle que não se ligam a células ou controle.

Os camundongos são acomodados individualmente em gaiolas durante a noite uma vez por semana em caixas automáticas de ativi- dades com infravermelho (Mikami et al. 2002), e a elevação espontânea do 10 corpo sobre as patas traseiras, uma medida de deficiência das patas trasei- ras, e a atividade horizontal são registradas (Accuscan lnc, Ohio). Pontua- ções tradicionais de BBB são também coletivamente coletadas semanatmen-

· te.

As avaliações funcionais são realizadas em código cego.

O corante Fluoro-Gold e Fast Blue é administrado 4 semanas " 15 depois do tratamento na medula espinhal de quatro camundongos no nível torácico inferior.

Uma semana mais tarde, os camundongos são perfundidos e os cérebros e as medulas espinhais removidos.

Corpos celulares marca- dos de maneira retrógrada no núcleo reticular, vestibular e vermelho do tron- co cerebral são contados nos grupos por microscopia fluorescente (Ure and 20 Rodriguez 2002). O número de corpos celulares marcados no tronco cere- bral (corte em vibrátomo) reflete o nível de axônios funcionais por toda a medula espinhal.

A imunocitoquímica para o acúmulo de proteína j3 amiloide é realizada em cortes transversais de tecido, obtidos a cada 1 mm ao Iongo da medula espinhal.

O número de agregados de j3 amiloide em um corte re- 25 flete transporte comprometido de axônios e disfunção de axônios naquele nível.

Cinco semanas depois da lesão, os demais camundongos são perfundidos, com formaldeÍdo/glutaraldeÍdo, e as medulas espinhais removi- das.

Cada outro bloco de 1 mm compreendendo lesão da medula espinhal é 30 impregnado em pIástico araldite, cortado (1 micra) e corado com parafenile- no para visualizar axônios preseNados com mielina em volta.

A área do cor- te transversal com lesão, o número de axônios preservados e a infiltração da lesão por célutas imunes são mensurados utilizando o sofhvare Microsuite (OIympus). A frequência de axônios é medida e comparada entre os grupos (McGavern et al. 2000; Rodriguez et al. 1987). Todas as análises são efetu- adas em amostras codificadas e cegas, sem o conhecimento do grupo expe- 5 rimental. Axônios preservados são expressos como o número de axônios preseNados/mm2 de Iesão. A comparação pareada de dados entre grupos experimentais e controle utiliza o teste Rank Su/n (Soma dos POStOS) de Mann-Whitney. Referências 10 Rodriguez M, Warrington AE, Pease LR. Human Natural Autoan- tibodies in the Treatment of Neurologic Disease. Neuro/ogy 2009; 72: 1269-

1276.

· lm H, Lesuffleur A, Lindquist NC, Oh SH. Plasmonic nanoholes in a multichannel microarray format for parallel kinetic assays and differential " 15 sensing. Analytical Chemistry. 2009;81:2854-2859 Maynard JA, Lindquist NC, Sutherland JN, LesuffleurA, Warring- ton AE, Rodriguez M, and Oh S-H. Next generation SPR technology of membrane-bound proteins for ligand screening and biomarker discovery. J Biotech 2009; 4(11):1542-1558 20 Nagpal P, Lindquist NC, Oh SH, Norris DJ. Ultrasmooth pat- temed metals for plasmonics and metamaterials. Science. 2009;325:594-

597. Bieber AJ, Warrington A, Asakura K, Ciric B, Kaveri SV, Pease LR, Rodriguez M. 2002. Human antibodies accelerate the rate of 25 remyelination following lysolecithin-induced demyelination in mice. Glia 37(3):241-249. Bregman BS, Kunkel-8agden E, Schnell L, Dai HN, Gao D, Schwab ME. 1995. Recovery from spinal cord injury mediated by antibodies to neurite growth inhibitors. Nature 378(6556):498-501. 30 Caroni P, Schwab ME. 1988. Antibody against myelin-associated inhibitor of neurite growth neutralizes nonpermissive substrate properties of CNS white matter, Neuron 1(1):85-96.

Corse AM, Bilak MM, Bilak SR, Lehar M, Rothstein JD, Kuncl RW. 1999. Preclinical testing of neuroprotective neurotrophic factors in a model of chronic motor neuron degeneration. Neurobiol Dis 6(5):335-346.

N Ellezam B, Bertrand J, Dergham P, Mckerracher L. 2003. Vac- 5 cination stimulates retinal ganglion cell regeneration in the adult optic nerve. Neurobiol Dis 12(1):1-10. Estevez AG, Spear N, Manuel SM, Radi R, Henderson CE, Barbeito L, Beckman JS. 1998. Nitric oxide and superoxide contribute to mo- tor neuron apoptosis induced by trophic factor deprivation. J Neurosci 10 18(3):923-931. Festoff BW, Ameenuddin S, Arnold PM, Wong A, Santacruz KS, Citron BA. 2006. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhib- v its caspase protease expression early after spinal cord injury. j Neurochem 97(5):1314-1326. " 15 Hemendinger RA, Armstrong EJ, 3rd, Persinski R, Todd J, Mougeot JL, Volvovitz F, Rosenfeld J. 2008. Huperzine A provides neuroprotection against several cell death inducers using in vitro model sys- tems of motor neuron cell death. Neurotox Res 13(1):49-61.Howe CL, Bieber AJ, Warrington AE, Pease LR, Rodriguez M. 2004. Antiapoptotic signaling by 20 a remyelination-promoting human antimyelin antibody. Neurobiol Dis 15(1):120-131. Huang DW, Mckerracher L, Braun PE, David S. 1999. A thera- peutic vaccine approach to stimulate axon regeneration in the adult mamma- lian spinal cord. Neuron 24(3):639-647, 25 Joshi M, Fehlings MG. 2002. Development and characterization of a novel, graded model of cIip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 1. Clip design, behavioral outcomes, and histopathology. J Neurotrauma 19(2):175-190. McGavern DB, Murray PD, Rivera-Quinones C, Schmelzer JD, 30 Low PA, Rodriguez M. 2000. Axonal loss results in spinal cord atrophy, elec- trophysiological abnomalities and neurological deficits following demye- lination in a chronic inflammatory model of multiple sclerosis. Brain 123 Pt

3:519-531. McTigue DM, Tripathi R, Wei P. 2006. NG2 colocalizes with ax- ons and is expressed by a mixed cell population in spinal cord lesions. J

P Neuropathol Exp Neurol 65(4):406-420.

- 5 Mikami Y, Toda M, Watanabe M, Nakamura M, Toyama Y, Ka- wakami Y. 2002. A simple and reliable behavioral analysis of Iocomotor func- tion after spinal cord injury in mice. Technical note. J Neurosurg 97(1 Suppl):142-147. Mitsunaga Y, Ciric B, Van Keulen V, Warrington AE, Paz Soldan 10 M, Bieber AJ, Rodriguez M, Pease LR. 2002. Direct evidence that a human antibody derived from patient serum can promote myelin repair in a mouse model of chronic-progressive demyelinating disease. Faseb j 16(10):1325- - 1327. Pannu R, Christie DK, Barbosa E, Singh l, Singh AK. 2007. Post- " 15 trauma Lipitor treatment prevents endothelial dysfunction, facilitates neuroprotection, and promotes locomotor recovery following spinal cord inju- ry. j Neurochem 101(1):182-200. Pirko I, Ciric B, Gamez J, Bieber AJ, Warrington AE, johnson AJ, Hanson DP, Pease LR, Macura SI, Rodriguez M. 2004. A human antibody 20 that promotes remyelination enters the CNS and decreases lesion load as detected by T2-weighted spinal cord MRI in a virus-induced murine model of MS. Fasebj 18(13):1577-1579. Rodriguez M, Lennon VA, Benveniste EN, Merrill JE. 1987. Remyelination by oligodendrocytes stimulated by antiserum to spinal cord. J 25 Neuropathol Exp Neurol 46(1):84-95. Warrington AE, Asakura K, Bieber AJ, Ciric B, Van Keulen V, Kaveri SV, Kyle RA, Pease LR, Rodriguez M. 2000. Human monoclonal anti- bodies reactive to oligodendrocytes promote remyelination in a model of mul- tiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A 97(12):6820-6825. 30 Warrington AE, Bieber AJ, Ciric B, Pease LR, Van Keulen V, Ro- driguez M. 2007. A recombinant human lgM promotes myelin repair after a single, very Iow dose. J Neurosci Res 85(5):967-976.

Warrington AE, Bieber AJ, Van Keulen V, Ciric B, Pease LR, Ro- driguez M. 2004. Neuron-binding human monoclonal antibodies support cen- tral nervous system neurite extension. J Neuropathol Exp Neurol 63(5):461- .

473.

- 5 Exemplo 13: Modelo de esclerose múltipla - Avaliação de dose:resposta Anticorpos ÍgM são avaliados quanto à sua habilidade em pro- mover melhora funcional e aumentar os processos de remielinização, cres- cimento de neuritos ou mabos em um modelo de esclerose múltipla em ca- mundongos. O modelo envolve o uso do picornavírus VÍrus da Encefalomieli- 1O te Murina de Theiler (TMEV) para induzir lesões desmielinizantes progressi- vas, crônicas, persistentes do sistema nervoso central com características similares às encontradas na MS humana, utilizando um método similar ao de · Warrington et al., 2007. Camundongos machos e fêmeas (aproximadamente 8 semanas, " 15 linhagem SJL/J) são injetados com o vÍrus da encefalomielite murina de Theiler (2 x 105 unidades formadoras de placas da cepa de Daniel, 10 IIL por via cérebro-ventricular). Foi permitido aos camundongos que se recupe- rassem por um período de 6 meses antes da randomização para o tratamen- to. Os camundongos foram então examinados quanto à condição da peta- 20 gem, a marcha e o reflexo de endireitamento e designados aleatoriamente para os grupos de tratamento (como indicado nas tabelas sobre o tratamen- to). Os camundongos foram depois tratados com uma única in jeção intrave- nosa de veículo (solução salina normal) ou anticorpo lgM humano recombi- nante (0,025 a 2,5 mg/kg). A função neurológica é monitorada em 2 sema- 25 nas, 1 mês e 2 meses após o tratamento. Os desfechos funcionais incluíam pontuação com base em con- dição da pelagem, marcha e desempenho no cilindro giratório (Rotarod). Pa- ra o aspecto da pelagem, a pontuação é como segue: sem doença (0); alte- rações mínimas na pelagem (1); pelagem emaranhada (2); incontinência e 30 pelagem manchada (3). As alterações em atividades são quantificadas em uma caixa automática de atividades. Além disso, a marcha é analisada utili- zando aquisição digital de marcha (DigiGait) utilizando velocidades do andar

" 90 cm/s.

Os desfechos quantitativos da análise de marcha incluem largura de apoio e duração, comprimento da passada e frequência, ângulo da pata bern como balanço, freada e duração da propulsão.

As alterações na marcha e desde o período basal são quantificadas.

O desempenho no cilindro giratório 5 (uma medida de coordenação sensorial e de equilíbrio é avaliada pela habi- Iidade do animal em sobre uma haste giratória) é quantificado como a quan- tidade de tempo que os animais permanecem sobre o equipamento giratório durante uma série de provas.

Na conclusão do experimento, os animais são sacrificados por 10 superexposição a CO2. Os cérebros e as medulas espinhais são removidos para avaliação de 1) grau de mielinização (análise com microscópio eletrôni- co de tecido dissecado, impregnado em parafina e fixado com paraformalde-

- Ído/glutaraldeido) e 2) crescimento de neuritos (verificação da densidade de neuritos por avaliação estereológica). " 15 Na primeira concretização, os anticorpos humanos recombinan- tes são administrados isoladamente em três níveis de dose, conforme indi- cado na Tabela 3A e Tabela 3B.

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Neste exemplo, os anticorpos recombinantes lgM12, lgM 42, IgM22 e lgM46 revelam cada um produzir melhoras estatisticamente significantes dependentes da dose em vários desfechos sensório-motores, incluindo con- . dição da pelagem, parâmetros da marcha e escore no cilindro giratório (p "

- 5 0,05) para cada desfecho em comparação ao tratamento com veículo.

Ani- mais tratados com veículo produziram déficits estáveis em vários desfechos sensório-motores, incluindo condição da pelagem, parâmetros da marcha e pontuação no cilindro giratório no perlodo de 6 meses da lesão pelo TMEV.

Alterações significantes dependentes da dose em desfechos sensório- lO motores sobre o intervalo da dose de 0,025-2,5 mg/kg, em que X representa melhora, são encontradas para cada Ab, com aumento de melhora X em desfechos sensório-motores na dose baixa, aumento maior de melhora X em

· desfechos sensório-motores com 0,25 mg/kg e melhora ainda maior X+++ em desfechos sensório-motores na dose de 2,5 mg/kg.

Essa tendência é " 15 observada para tamanhos de grupos de 12 animais com poder em nível de 0,8 e nível alfa de 0,05. Por conseguinte, cada um dos anticorpos lgM12, IgM 42, lgM22 e IgM46 produz melhoras estatisticamente significantes de- pendentes da dose em vários desfechos sensório-motores, incluindo condi- ção da pelagem, parâmetros da marcha e pontuação no cilindro giratório (p 20 < 0,05 para cada desfecho), quando comparados ao tratamento com veículo.

Não foram encontradas distinções em melhora com base no sexo.

Neste Exemplo, lgM12 e lgM42 demonstraram produzir aumen- tos estatisticamente significantes dependentes da dose em crescimento de neuritos em cortes do cérebro e da medula espinhal de camundongos infec- 25 tados pelo TMEV, conforme avaliado por estereologia, em comparação a controles tratados com veículo.

Alterações significantes dependentes da do- se sobre o intervalo da dose de 0,025-2,5 mg/kg, em que X representa me- lhora, são encontradas para cada Ab, com aumento de melhora X em cres- cimento de neuritos na dose baixa, aumento maior de melhora X+ em cres- 30 cimento de neuritos com 0,25 mg/kg e aumento ainda maior em crescimento de neuritos X+++ na dose de 2,5 mg/kg.

Essa tendência é observada para tamanhos de grupo de 12 animais com poder em nível de 0,8 e nível alfa de

0,05. lgM22 e lgM46 demonstraram produzir aumentos estatistica- mente significantes dependentes da dose em remielinização em cortes do 4 cérebro e da medula espinhal de camundongos infectados pelo TMEV, con- - 5 forma avaliado por estereologia, em comparação a controles tratados com veículo. Alterações significantes dependentes da dose em remielinização sobre o inteNalo da dose de 0,025-2,5 mg/kg, em que X representa melhora, são encontradas para cada Ab, com aumento de melhora X em remieliniza- ção na dose baixa, aumento maior de melhora X+ em remielinização com 10 0,25 mg/kg e aumento ainda maior em remielinização X+++ na dose de 2,5 mg/kg dose. Essa tendência é observada para tamanhos de grupo de 12 animais com poder em nível de 0,8 e nível alfa de 0,05.

- Exemplo 14: Modelo de esclerose múltipla - Combinações de Ab Neste experimento, várias combinações de proporções fixas de " 15 dose de anticorpos lgMs recombinantes são examinadas quanto à melhora do resultado neurológico no modelo TMEV de MS conforme descrito no e- xemplo anterior. Seis meses depois da exposição ao TMEV, o tratamento com combinações de IgMs recombinantes é iniciado em camundongos. Nes- ta série de estudos, os camundongos recebem apenas veículo ou várias 20 combinações de lgMs, em uma administração intravenosa única (mistura). Os desfechos sensório-motores são monitorados confome acima. A mielini- zação e o crescimento de neuritos são avaliados para examinar as altera- ções produzidas pelas combinações de anticorpos. As combinações em ava- liação são mostradas na Tabela 4A e Tabela 4B.

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ímm)â Neste Exemplo, as combinações de anticorpos recombinantes de lgM12 + !gM42, IgM22 + lgM46, IgM12 + lgM22, lgM12 + lgM46, lgM42 + lgM22, and lgM42 -f lgM46 produziram melhoras estatisticamente significati- . vas dependentes da dose em vários desfechos sensório-motores, incluindo 5 condição da pelagem, parâmetros da marcha e pontuação no cilindro girató- rio, quando comparadas ao tratamento com veículo (p < 0,05 para cada des- fecho em comparação ao tratamento com veículo). Não foram encontradas distinções em melhora com base no sexo. Além disso, o grau de melhora em desfechos sensório-motores 10 com cada uma destas combinações é supra-aditiva (exibindo sinergismo) em maneira estatisticamente significante dependente da dose, em comparação às melhoras aditivas previstas para cada um dos anticorpos isoladamente.

· Mais uma vez, não foram encontradas distinções em melhora com base no sexo. " 15 Além de produzir melhoras estatisticamente significantes depen- dentes da dose em vários desfechos sensório-motores, incluindo condição da pelagem, parâmetros da marcha e pontuação no cilindro giratório, quando comparada ao tratamento com veículo (p " 0,05 para cada desfecho em comparação ao tratamento com veículo), a combinação de lgM12+IgM42 20 aumentou significativamente o crescimento de neuritos em comparação a controles com veículo (p < 0,05). O grau de crescimento de neuritos é supra- aditivo, em comparação ao efeito aditivo de cada anticorpo administrado iso- ladamente. Por conseguinte, entende-se que estes anticorpos suscitam o crescimento por mecanismos d istintos de ação; esse dado é compatível com 25 os respectivos padrões distintos de ligação destes anticorpos ao tecido neu- ral. Além de produzir melhoras estatisticamente significantes depen- dentes da dose em vários desfechos sensório-motores, incluindo condição da pelagem, parâmetros da marcha e pontuação no cilindro giratório, quando 30 comparada ao tratamento com veículo (p " 0,05 para cada desfecho em comparação ao tratamento com veículo), a combinação de lgM22 + IgM 46 produziu um aumento significante em mielinização quando comparada a controles tratados com veículo (p " 0,05). Além disso, o grau de remieliniza- ção é supra-aditivo quando comparado ao efeito aditivo previsto de lgM22 ou lgM46 administrado isoladamente.

Sem estar preso à teoria, entende-se que . este efeito seja resultante de atividade parácrina.

Dessa forma, quando neu-

. 5 rônios em crescimento e oligodendrócitos em crescimento estão cada um presente, as células suscitam respectivamente produção parácrina que afeta positivamente o outro tipo de célula em avaliação.

Além de produzir melhoras estatisticamente significantes depen- dentes da dose em vários desfechos sensório-motores, incluindo condição 10 da pelagem, parâmetros da marcha e pontuação no cilindro giratório, quando comparada ao tratamento com veículo (p " 0,05 para cada desfecho em comparação ao tratamento com veículo), a combinação de lgM12 + lgM 22 produz um aumento significante em mielinização, bem como em crescimento de neurônios, quando comparada a controles tratados com veículo na medu- " 15 la espinhal com lesão (p " 0,05). Além disso, o grau de crescimento de neu- rônios e de remielinização é supra-aditivo quando comparado ao efeito de lgM12 ou IgM22, respectivamente, administrados isoladamente nas doses utilizadas neste experimento.

Sem estar preso à teoria, entende-se que este efeito seja resultante de atividade parácrina.

Dessa forma, quando neurônios 20 em crescimento e oligodendrócitos em crescimento estão cada um presente, as células suscitam respectivamente produção parácrina que afeta positiva- mente o outro tipo de célula em avaliação.

Além de produzir melhoras estatisticamente significantes depen- dentes da dose em vários desfechos sensório-motores, incluindo condição 25 da pelagem, parâmetros da marcha e pontuação no cilindro giratório, quando comparada ao tratamento com veículo (p " 0,05 para cada desfecho em comparação ao tratamento com veículo), a combinação de lgM12 + lgM 46 produz um aumento significante em mielinização bem como em crescimento de neurônios, quando comparada a controles tratados com veículo na medu- 30 la espinhal com lesão (p " 0,05). Além disso, o grau de crescimento de neu- rônios e de remielinização é supra-aditivo quando comparado ao efeito de lgM12 ou lgM46, respectivamente, administrados isoladamente nas doses utilizadas neste experimento.

Sem estar preso à teoria, entende-se que este efeito seja resultante de atividade parácrina.

Dessa forma, quando neurônios em crescimento e oligodendrócitos em crescimento estão cada um presente, &

as células suscitam respectivamente produção parácrina que afeta positiva-

. 5 mente o outro tipo de célula em avaliação.

Além de produzir melhoras estatisticamente significantes depen- dentes da dose em vários desfechos sensório-motores, incluindo condição da pelagem, parâmetros da marcha e pontuação no cilindro giratório, quando comparada ao tratamento com veículo (p " 0,05 para cada desfecho em 10 comparação ao tratamento com veículo), a combinação de lgM22 + lgM 42 produz um aumento significante em mielinização bem como em crescimento de neurônios, quando comparada a controles tratados com veículo na medu- la espinhal com lesão (p " 0,05). Além disso, o grau de crescimento de neu- rônios e de remielinização é supra-aditivo quando comparado ao efeito de " 15 IgM22 ou lgM42, respectivamente, administrados isoladamente nas doses utilizadas neste experimento.

Sem estar preso à teoria, entende-se que este efeito seja resultante de atividade parácrina.

Dessa forma, quando neurônios em crescimento e oligodendrócitos em crescimento estão cada um presente, as células suscitam respectivamente produção parácrina que afeta positiva- 20 mente o outro tipo de célula em avaliação- Além de produzir melhoras estatisticamente significantes depen- dentes da dose em vários desfechos sensório-motores, incluindo condição da pelagem, parâmetros da marcha e pontuação no cilindro giratório, quando comparada ao tratamento com veículo (p < 0,05 para cada desfecho em 25 comparação ao tratamento com veículo), a combinação de lgM46 + lgM 42 produz um aumento significante em mielinização bem como em crescimento de neurônios, quando comparada a controles tratados com veículo na medu- la espinhal com lesão (p " 0,05). Além disso, o grau crescimento de neurô- nios e de remielinização é supra-aditivo quando comparado ao efeito de 30 lgM46 ou IgM42, respectivamente, administrados isoladamente nas doses utilizadas neste experimento.

Sem estar preso à teoria, entende-se que este efeito seja resultante de atividade parácrina.

Dessa forma, quando neurônios em crescimento e oligodendrócitos em crescimento estão cada um presente, as células suscitam respectivamente produção parácrina que afeta positiva- mente o outro tipo de célula em avaliação. 0

Exemplo 15: Modelo de lesão na medula espinhal Model 5 Anticorpos IgMs foram avaliados quanto à sua habilidade em promover melhora funcional e aumentar os processos de remielinização, crescimento de neuritos ou ambos em um modelo de lesão na medula espi- nha) em ratos.

O modelo envolve comprimir lateralmente a medula espinhal entre as lâminas de fórceps modificado para lamínulas, em que a largura da 10 lamina do fórceps é de 2,5 mm, para uma separação previamente definida das lâminas para 0,9 mm por um período de 15 segundos.

A lesão resultante possui características similares às encontradas na SCl humana (Gruner et aL, 1995). Ratos machos e fêmeas (aproximadamente 200-225 g, Long " 15 Evans) são submetidos à cirurgia para produzir uma Iesão na medula espi- nhal conforme descrito acima.

O tratamento com anticorpos lgMs recombi- nantes ou com veículo é fornecido por via intravenosa 10 minutos depois da cirurgia.

A função locomotora das patas traseiras e a marcha são avaliadas por um período de 12 semanas utilizando a escala BBB de classificação da 20 Iocomoção (ver, por exemplo, Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC, Ander- son DK, Faden Al, Gruner JA, Holford TR, Hsu CY, Noble LJ, Nockels R, Perot PL, Salzman SK, Young W- (1996) MASC/S eva/uation of open he/d locomotor scores." Ehects of experience and teamwork on re/iabi/ity.

Joumal of Neurotrauma, 13:343-359; Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. (1995) 25 A sensitive and reliab/e locomotor rating sca/e for open field testing in rats.

Journal of Neurotrauma, 12:1-21) Os ratos são testados em 1, 3, 5, 7 e 10 dias e, depois, semanalmente, após a SCI por 9-12 semanas em diante, as alterações na escala BBB desde o período basal são quantificadas.

Na conclusão do experimento, os animais são sacrificados por 30 superexposição a CO2. Os cérebros e as medulas espinhais são removidos para avaliação de 1) grau de mielinização (análise por microscopia eletrônica de tecido dissecado impregnado em plástico e fixado com paraformaldeí-

do/glutaraldeído) e 2) crescimento de neuritos (verificação da densidade de neuritos por avaliação estereológica). Exemplo 16: Uso de anticorpos individuais em modelo de Iesão na medula espinhal Neste experimento, anticorpos humanos recombinantes são ad- ministrados isoladamente em três níveis de dose conforme indicado na Ta- bela 5A e Tabela 5B.

Tabela 5A. Resumo de grupos de tratamento e desfechos - anticorpos lgMs recombinantes individuais ):'à7:'-Ê':*°3j'2"")'ui'i|?':!D:í;!'3|'!°)'))I:';í'í:::':j'))|i^-?'Ê;'?'!ʶt4zj'):|µ^":?í' =):=à): Veículo NA 0 I Pontuação na I Mielinização por EM (solução salina) I escala BBB I Crescimento de neuritos por I estereologia lgM12 . . ' Crescimento de " 0,025 " " i Pontuação na - ! Mielinização por.EM,. . ',,' . . l neufitos 0,25 I escala BBB j Crescimento de neui'itos por . ' .' · 2,5'0 ] ' í estereologia ' ' IgM42 " Crescimento de 0,025 Pontuaç-ão na Mieíinização por EM neuritos 0,25 escala BBB Crescimer]to de neuritos por lgM22 I Rerr|iejirjização . 2,50 0,025 Pontuação na estereoíogia Mielinização por EM . ., 0,25 . escala BBB ' Crèscimento de neuiitos por ' '2,50 · " " """" esteieologia' ""- · ' ' ' '" . tgM46 Remielinização " 0,025 ' Pontuação na Mielinização por EM 0,25 escala BBB Crescimento de neuritos por 2,50 . este.re.oiogia Tabela 5B. Resumo de resultados por grupos de tratamento jm" ~4 " ·'i"êh —— "' "" ="'"'" "" ;:—~——m

Y " "g#: À7 ' ' 1Fwr=m=4Hwi " " :"" " 1% ' ' lkdL1L3m u> m " : '"íg"'f"""' § "". "" êT yQAeAjrôj '"=T'? = , " 2"&¥:,;'"'=" """D |*.'"_~" :-:)^Lj%m7"'. S "-fZÁ' qL:G"':'u:4 "eeq?Tj,,)',2"g'"ã . ' ) (*) X indica melhora, X+ indica mais melhora e X++ indica ainda mais melhora. Os valores da pontua- ção de melhora são relativos à administração de um dado anticorpo. Assim, X+ é uma melhora maior que X para aqueie mesmo Ab. A rnelhora X para um Ab não é necessariamente igual ao valor de X para outro Ab; o valor de X+ de um Ab não é necessariamente igual ao valor de X+ de outro Ab, e o valor de X+++ de um Ab não é nec=ssariamente igual ao valor de X+++ de outro Ab.

Neste exemplo, os anticorpos recombinantes lgM12, IgM 42,

lgM22 e lgM46 revelaram cada um produzir melhoras estatisticamente signi- ficantes dependentes da dose em função locomotora das patas traseiras com parâmetros melhorados da escala BBB (p " 0,05 para cada desfecho 4 em comparação ao tratamento com veículo). Animais tratados com veículo 5 produziram uma pontuação estável na escala BBB, dentro de 6 semanas, de um nível moderado de lesão na medula espinhal.

Alterações significantes de- pendentes da dose em pontuação na escaía BBB sobre o inteNa|o da dose de 0,025-2,5 mg/kg, em que X representa melhora, são encontradas para cada Ab, com aumento de melhora X em nível da escaia BBB na dose baixa, au- lO mento maior de melhora X+ na escala BBB com 0,25 mg/kg e melhora ainda maior na escala BBB X+++ na dose de 2,5 mg/kg.

Essa tendência é obseNa- da para tamanhos de grupo de 12 animais com poder em nível de 0,8 e nível alfa de 0,05. Por conseguinte cada um dos anticorpos lgM12, lgM 42, lgM22 e lgM46 produziram melhoras significantes dependentes da dose em função " 15 locomotora das patas traseiras com escala BBB melhorada (" 0,05 para cada desfecho) em comparação ao tratamento com veículo.

Não foram encontra- das distinções com base no sexo. lgM12 e lgM42 demonstram produzir aumentos significantes de- pendentes da dose em crescimento de neuritos em cortes do cérebro e da 20 medula espinhal de camundongos infectados pelo TMEV, conforme avaliado por estereologia, em comparação a controles tratados com veículo.

Altera- ções significantes dependentes da dose em crescimento de neuritos sobre o intervalo da dose de 0,025-2,5 mg/kg, em que X representa melhora, são encontradas para cada Ab, com aumento de melhora X em crescimento de 25 neuritos na dose baixa, aumento maior de melhora X+ em crescimento de neuritos com 0,25 mg/kg e aumento ainda maior em crescimento de neuritos X+++ na dose de 2,5 mg/kg.

Essa tendência é observada para tamanhos de grupo de 12 animais com poder em nível de 0,8 e nível alfa de 0,05. lgM22 e lgM46 demonstram produzir aumentos significantes de- 30 pendentes da dose em remielinização em cortes do cérebro e da medula espi- nhal de camundongos infectados pelo TMEV, conforme avaiiado por estereolo- gia, em comparação a controles tratados com veículo.

Alterações significantes dependentes da dose em remielinização sobre o intervalo da dose de 0,025-2,5 mg/kg, em que X representa melhora, são encontradas para cada Ab, com au- mento de melhora X em remielinização na dose baixa, aumento maior de me- lhora X+ em crescimento de neuritos com 0,25 mg/kg e aumento ainda maior 5 em remielinização com 0,25 mg/kg e aumento ainda maior em remielinização X+++ na dose de 2,5 mg/kg. Essa tendência é observada para tamanhos de grupo de 12 animais com poder em nível de 0,8 e nível alfa de 0,05.

Exemplo 17: Lesão na medula espinhal - combinações de anticorpos Neste Exemplo, várias combinações de proporções fixas de do- lO se de anticorpos lgMs recombinantes são examinadas quanto à melhora do resultado neurológico no modelo de lesão na medula espinhal, conforme des- crito no Exemplo 14 acima. Dessa forma, o tratamento intravenoso com com- binações de anticorpos IgMs (em misturas) ou veículo controle é fornecido 10 minutos depois da lesão. Os desfechos locomotores são monitorados como acima. Além disso, a mielinização e o crescimento de neuritos são avaliados para examinar as alterações produzidas por combinações de anticorpos. As combinações avaliadas são mostradas na Tabela 6A e Tabela 6B.

Tabela 6A. Resumo de grupos de tratamento - combinações de anticorpos lgMs recombinantes £-,="'"' &- ê' -. u " dem S1Ós«---- #NNêEae7a0s.«Ê z"AgaÜã"""'""" """" ' -: jg " a "%sr.T % = ' ' "" ' A . - ' '-- -" . ~- . -. . Veículo NA 0 Pontuação na Mielinização pdi" EM I (solução I I I escala BBB I Crescimento de neuri- l salina) I I I l tos por estereobgia I 1gMÀ'2 ¥ ""1 ¢[êsciiiièntõ?dé :nèur'r:·.:'-'|- :.r.-....-0i25.::---\-==i-- Ê?óntuaçãã a=.|=Míê1jHme0,.p.QF:£MÊ ii-"."1 fl.gM42 ". .' |'.tõs"'t grésc|m"éntõ-dè'?""|"'j?zfjs'·.Q;25".".'";-.i'"'1"'e2mlâ-BBB?á-!:' :.j rêsamêij!à'aêyiè'Úngà è,;j " """ l :n'eürItos"'.', -'...,:'. '".: 'i" '" "'""' 'í '"' """ ::-c. == 1,'-2·:-' " "' "'":-,··.,?·:::.; ....;:.".;:. " "' ""'': ".'..' '"""' :i .Iü. """-'"-:'·"·:'.::::'".:""::::, ':·:.:,.,'- '.· ..'.' '- ..". 7'.-'·' ..--'·'-"j F" Xi"';.;.." " lAQ$--p.or,egem|ogja.,t!F#-bs '. ' '-=-- - ·'- -'- ' - "T* . " ·1 :"p ! lgM'22" I Remielinização " I 0,25 I Pontuação na I Mie|inizaçãD por EM I IgM46 I Remielinização I 0,25 I escala BBB I Crescimerito de neuri- l os por estereologia ®M12 +' Crescimento de neuri- ' 0,25 Pontuação'na Mieiinização por EM . '" I lgM22 "" '. l tos + Remielinização. ,. I. . ,.,0,25 ' . I .ès!ca|a BBB. "'.""" I 'Crescimento de neuri'". ·.| "- " " I tÒS Poi'"eStèreojDgià ' " " i lgMi2 + ) Crescimento de neuri- ) 0,25 I Pontuação na I Mielinização por EM I lgM46 I tos + Remielinização I 0,25 I escala BBB I Crescimento de neuri- l tos por estereologia lgM42 + Crescimento de neuri- 0,25 ' " Pontuação na Mielinização por EM I lgM22 ! tos + Remieíinização I 0,25 I escala BBB I Crescimento de neuri- tos por estereobgia IgM42 + Crescimento de 0,25 Pontuação na Mieiinização por EM I lgM46 I neuritos + Remie.- I 0,25 I escala BBB I Crescimento de neuri- I I linização i ! I tos por estereologia é )g'):'!)|'i'i)!ii,!'l')'"" ai 3 0 A &í@

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Neste experimento, cada uma das combinações de anticorpos recombinantes lgM12 + lgM42, lgM22 + lgM46, lgM12 + lgM22, lgM12 + (gM46, IgM42 + lgM22 e lgM42 + lgM46 demonstrou produzir melhoras esta·- tisticamente significantes dependentes da dose em função das patas trasei- 5 ras (desfechos locomotores) conforme encontrada por parâmetros da escala BBB.

Não foram encontradas distinções em melhora com base no sexo.

Além disso, cada uma das combinações demonstrou melhorar a função locomotora em maneira supra-aditiva (ou seja, sinérgica), quando comparadas a melhoras de cada um dos anticorpos isoladamente na mesma 10 dose.

Mais uma vez, não foram encontradas distinções em melhora com ba- se no sexo.

Além de produzir melhoras estatisticamente significantes, de-

" pendentes da dose em vários desfechos sensório-motores, incluindo condi- ção da pelagem, parâmetros da marcha e pontuação no cilindro giratório, " 15 quando comparada ao tratamento com veículo (p " 0,05 para cada desfecho em comparação ao tratamento com veículo), a combinação de IgM12+lgM42 aumentou significativamente o crescimento de neuritos em comparação a controles com veículo (p " 0,05). O grau de crescimento de neuritos é supra- aditivo quando comparado ao efeito aditivo de cada anticorpo administrado 20 isoladamente.

Por conseguinte, entende-se que estes anticorpos suscitam crescimento por mecanismos distintos de ação; esse dado é compatível com os respectivos padrões distintos de ligação destes anticorpos ao tecido neu- ral.

Além de produzir melhoras estatisticamente significantes, de- 25 pendentes da dose em vários desfechos sensório-motores, incluindo condi- ção da pelagem, parâmetros da marcha e pontuação no cilindro giratório, quando comparada ao tratamento com veículo (p < 0,05 para cada desfecho em comparação ao tratamento com veículo), a combinação de lgM22 + lgM 46 produziu um aumento significante em mielinização em comparação a 30 controles com veículo (p " 0,05). Além disso, o grau de remielinização é su- pra-aditivo quando comparado ao efeito aditivo previsto de IgM22 ou lgM46, respectivamente, administrados isoladamente.

Sem estar preso à teoria, en-

tende-se que este efeito seja resultante de atividade parácrina. Dessa forma, quando neurônios em crescimento e oÍigodendrócitos em crescimento estão µ cada um presente, as células suscitam respectivamente produção parácrina que afeta positivamente o outro tipo de célula em avaliação.

- 5 Além de produzir melhoras estatisticamente significantes, de- pendentes da dose em vários desfechos sensório-motores, incluindo cond j- ção da pelagem, parâmetros da marcha e pontuação no cilindro giratório, quando comparada ao tratamento com veículo (p < 0,05 para cada desfecho em comparação ao tratamento com veiculo), a combinação de IgM12 + lgM 10 22 produz um aurnento significante em mielinização, bem como em cresci- mento de neurônios, quando comparada a controles tratados com veículo na medula espinhal com lesão (p " 0,05). Além disso, o grau de crescimento de " neurônios e remielinização é supra-aditivo quando comparado ao efeito adi- tivo previsto de IgM12 ou lgM22, respectivamente, administrados isolada- " 15 mente nas doses utilizadas neste experimento. Sem estar preso à teoria, entende-se que este efeito seja resultante de atividade parácrina. Dessa forma, quando neurônios em crescimento e oligodendrócitos em crescimento estão cada um presente, as células suscitam respectivamente produção pa- rácrina que afeta positivamente o outro tipo de célula em avaliação. 20 Além de produzir melhoras estatisticamente significantes, de- pendentes da dose em vários desfechos sensório-motores, incluindo condi- ção da pelagem, parâmetros da marcha e pontuação no cilindro giratório, quando comparada ao tratamento com veículo (p " 0,05 para cada desfecho em comparação ao tratamento com veícub), a combinação de lgM12 + lgM 25 46 produz um aumento significante em mielinização, bem como em cresci- mento de neurônios quando comparada a controles tratados com veículo na medula espinhal com lesão (p " 0,05). Além disso, o grau de crescimento de neurônios e remielinização é supra-aditivo quando comparado ao efeito adi- tivo previsto de lgM12 ou lgM46, respectivamente, administrados isolada- 30 mente nas doses utilizadas neste experimento. Sem estar preso à teoria, entende-se que este efeito seja resultante de atividade parácrina. Dessa forma, quando neurônios em crescimento e oligodendrócitos em crescimento estão cada um presente, as células suscitam respectivamente produção pa- rácrina que afeta positivamente o outro tipo de célula em avaliação.

Além de produzir melhoras estatisticamente significantes, de- . pendentes da dose em vários desfechos sensório-motores, incluindo condi-

- 5 ção da pelagem, parâmetros da marcha e pontuação no cilindro giratório, quando comparada ao tratamento com veículo (p < 0,05 para cada desfecho em comparação ao tratamento com veículo), a combinação de lgM22 + lgM 42 produz um aumento significante em mielinização, bem como em cresci- mento de neurônios quando comparada a controles tratados com veículo na 10 medula espinhal com lesão (p " 0,05). Além disso, o grau de crescimento de neurônios e remielinização é supra-aditivo quando comparado ao efeito adi- tivo previsto de IgM22 ou lgM42, respectivamente, administrados isolada-

- mente nas doses utilizadas neste experimento.

Sem estar preso à teoria, entende-se que este efeito seja resultante de atividade parácrina.

Dessa " 15 forma, quando neurônios em crescimento e oligodendrócitos em crescimento' estão cada um presente, as célutas suscitam respectivamente produção pa- rácrina que afeta positivamente o outro tipo de célula em avaliação.

Além de produzir melhoras estatisticamente significantes, de- pendentes da dose em vários desfechos sensório-motores, incluindo condi- 20 ção da pelagem, parâmetros da marcha e pontuação no cilindro giratório, quando comparada ao tratamento com veículo (p < 0,05 para cada desfecho em comparação ao tratamento com veículo), a combinação de lgM46 + lgM 42 produz um aumento significante em mielinização, bem como em cresci- mento de neurônios quando comparada a controles tratados com veiculo na 25 medula espinhal com lesão (p " 0,05). Além disso, o grau de crescimento de neurônios e remielinização é supra-aditivo quando comparado ao efeito adi- tivo previsto de lgM46 ou lgM42, respectivamente, administrados isolada- mente nas doses utilizadas neste experimento.

Sem estar preso à teoria, entende-se que este efeito seja resultante de atividade parácrina.

Dessa 30 forma, quando neurônios em crescimento e oligodendrócitos em crescimento estão cada um presente, as células suscitam respectivamente produção pa- rácrina que afeta positivamente o outro tipo de célula em avaliação.

Exemplo 18: Anticorpo recombinante rHlqM12, uma lçjM humana que se Iiçja a neurônios e proteqe axônios da medula espinhal Os presentes inventores demonstraram que um anticorpo huma- no natural do soro, sHlgM12, liga-se a neurônios in vitro e promove o cres-

, 5 cimento de neuritos.

Uma forma recombinante foi gerada, rHlgM12, com propriedades idênticas.

A injeção intracerebral com o vÍrus da encefalomieli- te murina de Theiler (TMEV) em linhagens de camundongos suscetíveis pro- voca doença desmielinizante crônica com perda axonal progressiva e dis- função neurológica similar à de formas progressivas de esclerose múltipla. 10 Tratar este modelo com anticorpos da classe lgM que se ligam a oligoden- drócitos melhora a remielinização do sistema neNoso central (Warrington et al (2007) j Neurosci Res 85:967-976). Por outro lado, o anticorpo monoclo-

" nal humano derivado do soro (sHlgM12) que se liga a neurônios promove o crescimento robusto de neuritos no mesmo grau que laminina, e reduz os ' 15 efeitos inibidores de mielina do sistema nervoso central sobre o crescimento de neuritos (Warrington et al (2004) J Neuropatho/ Exp Neurol 63(5):461- 473). Mais recentemente, uma forma recombinante de sHlgM12 humano foi gerada (rH|gM12) com propriedades biológicas idênticas, conforme descrito acima.

A fim de estudar os efeitos de rHlgM12 sobre a integridade axonal da 20 medula espinhal, foi realizada a marcação retrógrada, uma técnica que se baseia em axônios anatomicamente contínuos e funcionalmente preserva- dos.

Métodos Marcação retrograde: Após camundongos serem anestesiados, 25 a laminectomia dorsal foi realizada nas vértebras torácicas inferiores (T1O- 11). A medula espinhal foi seccionada em duas partes no lado direito, e o Iocal da hemissecção foi preenchido com uma solução estéril de Fluoro-Gold 4%. Uma semana depois da cirurgia, os camundongos foram sacrificados, e os cérebros removidos.

Cortes em série (40 mm de espessura) do tronco 30 cerebral foram obtidos e o corte a cada quatro secções foi analisado.

Neurô- nios grandes fluorescentes brilhantes foram contados sob a ampliação de 20Ox em 16 fatias do tronco cerebral.

Resultados O modeb TMEV oferece uma plataforma para o desenvolvimen- to de estratégias que promovem a neuroproteção e previnem a perda de a- . xônios.

Estágios iniciais da doença incluem inflamação e desmielinização;

. - 5 estágios tardios manifestam-se com perda de axônios e déficits funcionais.

Conforme detalhado nos exemplos anteriores, rHlgM12 penetra a medula espinhal e Iocaliza-se em axônios neurofilamento+ (NF) depois de uma única injeção i.p. de 1 mg, como confirmado por imagens confocais (Figura 15). rHlgM12 também colocalizou em corte transversal feixes de fibras NF+ (Fi- lO gura 15D). Em estudos animais, rHlgM12 melhora o número de neurônios marcados de modo retrógrado do tronco cerebral. rHlgM12 ou solução salina foram administrados a camundongos SJL aos 90 dias após a infecção (dpi)-

- A cirurgia da medula espinhal para marcação retrógrada foi realizada 9 se- manas depois do tratamento.

Uma semana após a cirurgia, os camundongos " 15 foram sacrificados e neurônios marcados por fluorescência foram quantifica- dos em cortes seriados do tronco cerebral. rHlgM12 melhora o número de neurônios marcados de modo retrógrado do tronco cerebral, em comparação ao controle com solução salina (dados não mostrados). Por conseguinte, camundongos tratados com rHlgM12 apresentaram mais neurônios marca- 20 dos de modo retrógrado do tronco cerebral em comparação a controles tra- tados com solução salina.

Exemplo 19: Uma dose única de anticorpo monoclonal humano que se liqa a neurônios melhora a atividade espontânea em um modelo murino de des- mielinização 25 O laboratório dos presentes inventores demonstrou que um anti- corpo humano natural do soro, sHlgM12, liga-se a neurônios in vitro e pro- move o crescimento de neuritos.

Uma forma recombinante foi gerada, rHIgM12, com propriedades idênticas.

A injeção intracerebral com o vÍrus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV) em linhagens de camundongos 30 suscetíveis resulta em doença desmielinizante crônica com perda axonal progressiva e disfunção neurológica similar às formas progressivas de escle- rose múltipla.

A fim de estudar os efeitos de rHlgM12 sobre a função motora de camundongos infectados pelo TMEV, a atividade noturna espontânea foi monitorada durante muitas semanas.

O comportamento noturno é uma me- dida sensível da função neurológica de roedores, pois a ocorrência de alte- . rações máximas na atividade é esperada no período de monitoramento nor-

- 5 malmente ativo durante a noite.

Camundongos são colocados em caixas de atividade, oito dias antes do tratamento, para coletar a atividade espontânea basal.

Depois do tratamento, a atividade em cada grupo foi continuamente registrada durante 8 semanas.

Um período longo de 8 semanas foi escolhido para o monitoramento por dois motivos: (1) os presentes inventores demons- lO traram previamente que a remielinização induzida pela lgM está presente em torno de 5 semanas após o tratamento, e (2) a doença desmielinizante indu- zida pelo TMEV nesta linhagem progride muito Ientamente.

Em virtude dos longos de observação e grandes conjuntos de dados, as diferenças entre os grupos de tratamento podem ser difíceis de serem reconhecidas estudando " 15 os registros originais não fiitrados.

A fim de delinear claramente as altera- ções nos dados originais com alta flutuação, os presentes inventores aplica- ram três métodos diferentes: (1) binagem, (2) aplicação de filtros Gaussianos (GF) passa-baixa e (3) ajuste polinomial.

Com o uso de cada um dos três métodos, os presentes inventores mostraram que, em comparação ao trata- 20 mento com lgM controle e com solução salina, o tratamento precoce com rHlgM12 induziu a melhora na função motora horizontal e vertical, enquanto que o tratamento tardio melhorou somente a atividade horizontal. rHlgM12 não alterou a atividade de camundongos normais, não infectados.

Este estu- do apoia a hipótese de que o tratamento com uma lgM que se liga a neurô- 25 nios não só protege neurônios in vitro, mas também influencia a melhora motora funcional. lntrodução O monitoramento prolongado e a análise da função neurológica em modelos de doenças em roedores permanece um desafio.

O comporta- 30 mento noturno é uma medida da função neurológica de roedores, pois a o- corrência de alterações máximas na atividade é esperada no período de monitoramento normalmente ativo durante a noite [1]. Contudo, em modelos animais de doenças lentamente progressivas, o monitoramento do desem- penho frequentemente prolonga-se por muitas semanas.

Os presentes in- ventores relataram previamente que o anticorpo que liga a oligodendrócitos (rHlgM22) intensificou a remielinização por voíta de 5 semanas após o tra-

- 5 tamento [2]- Considerado em conjunto que a evolução da doença e o reparo é um processo lento e para assegurar que qualquer flutuação em atividade fosse levada em conta, a atividade prolongada foi monitorada com a mesma densidade de amostragem utilizada em monitoramento de curto prazo. lsso criou grandes conjuntos de dados com alta flutuação (Figura 32 A,C)- A fim 10 de delinear claramente as alterações após o tratamento e recuperar tendên- cias gerais em atividade em longo prazo, foi comparado o uso de binagem de dados, filtragem Gaussiana e ajuste polinomial utilizando um programa

- denominado Mathematica (VVolfram Research, lnc.). a injeção intracerebral com o vÍrus da encefalomielite murina de " 15 Theiler (TMEV) em linhagens de camundongos suscetíveis resulta em doen- ça desmielinizante crônica com disfunção neurológica progressiva similar às formas progressivas de esclerose múltipla [3]. Tratar este modelo com anti- corpos da classe de lgM que se liga a oligodendrócitos melhora a remielini- zação do sistema nervoso central [4]. Por outro lado, um anticorpo monoclo- 20 nal humano derivado do soro (sHlgM12) que se liga a neurônios promove o crescimento robusto de neuritos no mesmo grau que laminina, e reduz os efeitos inibidores de mielina do sistema nervoso central sobre o crescimento de neuritos [5]. Mais recentemente, uma forma recombinante de sHlgM12 humano foi gerada (rHlgM12) com propriedades biológicas idênticas.

Os 25 presentes inventores mostraram previamente que rHIgM12 possui meia-vida de 3,6 horas, mas ainda cruza a barreira hematoencefálica e se liga a teci- dos nervosos (observação não publicada). A fim de estudar os efeitos de rHlgM12 sobre a atividade de camundongos infectados pelo TMEV, a ativi- dade espontânea foi monitorada durante diversas semanas utilizando caixas 30 de atividade AccuScan (Accuscan lnstruments, lnc., Columbus, OH). O perí- odo de monitoramento relativamente longo de 8 semanas foi escolhido por dois motivos: (1) a remielinização induzida por está presente em torno de 5 semanas após o tratamento e (2) a doença desmielinizante induzida pelo TMEV nesta linhagem progride muito lentamente em comparação aos mode- los de EAE puramente autoimune de MS [6]. Em decorrência dos Iongos pe- ríodos de observação, em comparação aos estudos previamente publicados (Tabela 7), identificar alterações por inspeção visual de dados não proces- sados comprovou ser difícil.

Tabela 7 - Extensão do monitoramento da atividade espontânea em estudos publicados em comparação a este estudo Extensão da sessão registrada de ativi- Publicação dade locomotora Mikami et al. 2002, 2004 [14, 15] 10 minutos (10 minutos de habituação) Melnick and Dow-Edwards 2001 [16] 60 minutos (sem habituação) Chen et al 2005 [17] 30 minutos (sem habituação) Torres-Reveron and Dow-Edwards 2006 [18] 60 minutos (20 miriutos de habituação) Zhu eta/2007 j17] 60 minutos (sem habituação) Li et al 2009 [20] 3 horas (1 hora de habituação) Rivera-Quinones et al. 1998: McGavern etal. 1999 3 dias (sem habituação) Este estudo 64 dias (8 dias de habituação)

Materiais e métodos: Camundongos: Camundongos SJL/J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) foram acomodados e criados nas instalações para cuidados de animais da Clínica Mayo, Os protocolos para os animais foram aprovados pelo Comitê lnstitucional para Cuidados e Uso de Animais da CIínica Maio.

Modelo de desmielinização com o vÍrus de Theiler: A doença desmielinizante foi induzida em fêmeas de 6 a 8 semanas por injeção intra- cerebral de TMEV.

Uma agulha calibre 27 liberou 10 Dl contendo 2,0 x 105 unidades formadoras de pIacas da cepa Daniel do TMEV.

A incidência resul- tante de infecção foi >98% com raras fatalidades.

Todos os animais desen- volveram encefalite leve, que se resolveu dentro de 2 semanas.

A saúde os animais agravou durante os 6-8 meses seguintes com doença desmielinizan- te crônica da medula espinhal.

A íesão e perda de axônios teve início três meses depois da injeção, correlacionando-se com disfunção neurológica [3]. Tratamento com anticorpos: camundongos SJL (não infectados, 45 e 90 dias após a infecção) foram tratados com uma única dose intraperito- neal de 200 µg de anticorpos (rHlgM12 ou isotipo lgM de controle) dissolvidos em 0,5 mL de PBS.

O terceiro grupo foi tratado apenas com 0,5 mL de PBS.

Monitoramento da atividade espontânea: A atividade Iocomotora espontânea foi registrada com sistema Digiscan para campo aberto (OF)

A (Omnitech Electronics; Columbus, OH) e o sohware Versamax, v.4.12-1AFE (Accuscan lnstruments, lnc., Columbus, OH). O sistema consistia em seis - 5 gaiolas de acrílico (40 x 40 x 30,5 cm) apoiadas por uma estrutura de metal que continha dois conjuntos de células fotoelétricas. O dispositivo mede o número de movimentos horizontais e verticais distintos, tabulando o número de interrupções do feixe projetado de infravermelho. Em todas as gaiolas, os camundongos foram expostos a condições ambientais idênticas: (a) livre a- lO cesso a alimentos e água, (b) ciclo claro escuro normal de 12 horas, (C) tem- peratura ambiente de 70°F (21,11 °C). Em cada experimento, animais hipera- tivos e, em ocasiões raras, com sobrepeso eram excluídos e os demais ca- - mundongos foram randomizados. Diversos grupos de 5 camundongos SJL foram colocados no centro de cada gaiola, e a atividade espontânea basal foi " 15 coletada durante o período de 8 dias consecutivos. Depois deste período, três grupos de camundongos com a atividade basal mais similar foram tratados com rH1gM12, anticorpo lgM de controle ou solução salina e, depois, monito- rados durante o período de 8 semanas. Os dados foram coletados como nú- mero de interrupções do feito por blocos de 1 hora. As atividades horizontais e 20 verticais totals foram registradas com o programa Versadat, v.3.02-1AFE (Ac- cuscan lnstruments). Não mais do que 5 animais puderam ser colocados por caixa de atividade, pois este é o número máximo de animais permitido pelo Comitê lnstitucional para Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Análise de dados: Diferenças entre grupos de tratamento podem 25 ser difíceis de serem reconhecidas estudando os registros originais não filtra- dos (Figura 32 A-C). Para recuperar as tendências lentas nos dados originais com alta flutuação, foram aplicados três métodos diferentes: 1) binagem, 2) aplicação de filtro gaussiano (GF) passa-baixa (GF) e 3) ajuste polinomial. A binagem de dados é o método mais simples e substitui um 30 grupo de dados pontuais dentro de um compartimento (bin) selecionado pre- viamente por seu valor médio. No caso deste experimento, foi selecionado um compartimento noturno, visto que a atividade murina atinge o pico à noi-

te.

Por conseguinte, todas as leituras noturrias (12 h/dia) foram substituidas por seu valor médio conforme mostrado nas Figuras 33A, 33B, 35C, 35D, 37C e 37D.

A comparação de grupos pode ser realizada por um teste-t sim- . ples para uma diferença de médias, com um tamanho efetivo de amostra de

- 5 12 horas por tratamento.

Enquanto que estas comparações são simples, o pequeno tamanho da amostra em cada momento resulta em grandes erros padrão, e o uso das comparações estatísticas é limitado.

No global, a bina- gem de dados é um método eficaz para visualizar dados extremos, mas seu uso é iimitado para testes estatísticos. 10 A filtragem gaussiana (GF) (conhecida também como filtragem passa-baixa, suavização de dados ou realce de sensibilidade) é um procedi- mento para reduzir ruídos, comumente empregado na espectroscopia por

" transformada de Fourier e no processamento de imagens [7]. GF, realizada com uma seleção apropriada do alargamento da Gaussiana (GB, em dias) " 15 filtrou flutuações de alta frequência a um nível desejado.

A escolha do filtro é arbitrária e pode ser guiada pela taxa de alterações previstas na atividade.

A GF é um método para suavização utilizando informações de pontos coletados dos dois lados de um valor e ponderando a influência destes pontos de tal modo que a influência esvaneça de acordo com a função Gaussiana.

Em ter- 20 mos computacionais, a GF pode ser aplicada em duas maneiras equivalentes: 1) Transformada de Fourier (FT) dos dados, seguido pela multiplicação com uma função Gaussiana e FT inversa do produto; e 2) convolução direta dos dados com um núcleo (kemef) Gaussiano.

Em pacotes de soRwares de alto nível (Matlab (Mathworks) ou Mathematica (Wolfram)), a função do filtro 25 Gaussiano é disponível com mlnima ou nenhuma programação pelo usuário.

Com a seleção apropriada do GB, o método GF detalhado acima torna possÍ- vel simplificar a visualização de dados altamente complexos e heterogêneos.

Uma Iimitação da GF é que, embora permita a fácil visualização de tendên- cias, as comparações estatísticas são complicadas pela escolha do GB. 30 Para comparação e para dernonstrar um método que permite simplificar a comparação estatística, ajustes polinomiais são aplicados aos dados.

Esses modelos permitiram termos polinomiais até o grau qualquer

(xn), e estimar parâmetros de forma separadamente para cada grupo de tra- tamento (termos de interação). A escolha feita de grau polinomial da 6a or- dem foi arbitrária após serem exploradas várias opções, mas conferiu flexibi- . lidade suficiente para modelar efeitos não lineares ao longo do tempo.

Con-

- 5 siderando que os diferentes grupos de tratamento foram ajustados do modo ideal utilizando ordens polinomiais variadas, foi escolhido permitir flexibilida- de da ordem mais alta.

Os Critérios de Informação de Akaike (AlC) foram utilizados para determinar o "melhor ajuste" de linhas polinomiais entre di- versos dos grupos de tratamento [8]. AlC é um método de comparação de 10 modelos que equilibra o ganho em R2 pelo acréscimo de termos adicionais, mas que penaliza pela supercomplexidade (ou seja, o uso de graus de liber- dade). Em geral, o ajuste da 3q ordem foi suficiente para captar a tendência dos dados e, para alguns casos, o ajuste da 2' ordem ou mesmo o linear foi "melhor" de acordo com AlC.

Contudo, a meta primária era comparar grupos " 15 de tratamento em momentos obseNados.

Tendo em vista o grande número de dados pontuais e porque o ajuste poIinomial não está sendo utilizado pa- ra predizer (ou extrapolar) valores de tratamento fora dos dados observados, o impacto da "sobreparametrização" (ovemtting) nos resultados é mínimo.

Uma vantagem do ajuste polinomial é que a comparação estatís- 20 tica de grupos de tratamento é direta: os tratamentos podem ser compara- dos em momentos especificados utilizando os valores previstos pelo modelo e os respectivos erros padrão.

Comparações pareadas diretas de tratamen- tos podem ser realizadas em intervalos regulares durante todo o período de tempo para determinar quando grupos de tratamento divergiram significati- 25 vamente.

Finalmente, o ajuste polinomial retira meio adicional e ruído de baixa frequência que centra atenção visual na tendência geral sobre todo o período de tempo.

Entretanto, dentro de cada um dos experimentos, alguns grupos de mice apresentavam atividade basal horizontal e vertical um pouco dife- 30 rente (8 dias). Por conseguinte, foram utilizados primeiramente valores Z para padronizar a atividade basal independentemente para cada grupo e, depois, realizada a filtragem Gaussiana ou aplicados ajustes polinomiais a amw estes valores. Análise estatística: A binagem dos dados e a suavização com fil- tro Gaussiano passa-baixa de dados foram realizados utilizando um sistema

N macro constante no programa Mathematica (Wolfram). Macro e instruções - 5 são disponibilizados no endereço: mayoresearch.mayo.edu/mayo/research/ rodriguez _ lab/software.cfm. Modelos de regressão polinomial e compara- ções estatísticas de grupos de tratamento foram realizados utilizando os va- lores previstos para o modelo e os respectivos erros padrão com base na estatística de z (SAS lnstitute, lnc.). Comparações pareadas diretas de tra- lO tamentos foram realizadas para cada dia entre todo o período de tempo, e a significância estatística foi determinada no limiar típico de a = 0,05. Não fo- ram feitos ajustes para comparações múltiplas. Resultados rHIqM12 melhora a atividade horizontal em camundonqos SJL quando for '" 15 em 90 dpi Três grupos de 5 camundongos SJL em 90 dias após a infecção (dpi) foram colocados em caixas de atividade, e a atividade basal foi medida por 8 dias consecutivos. Dois grupos de camundongos foram tratados com uma dose única de 200 µg de rHlgM12 ou um isotipo lgM de controle. O ter- 20 ceiro grupo foi tratado com solução salina. Depois do tratamento, a atividade espontânea foi continuamente registrada durante 8 semanas. Considerando que os dados foram coletados em blocos de 1 hora, foram obtidos aproxi- madamente 900 dados pontuais para cada grupo. Estes dados originais não processados (Figura 32A-C) exibem alta flutuação, de modo que diferenças 25 entre os grupos de tratamento podem ser difíceis de serem reconhecidas. Todos os três métodos (binagem, filtragem gaussiana e ajuste polinomial) revelaram que camundongos tratados com rHlgM12 mostraram melhora em atividade horizontal, enquanto que camundongos tratados com lgM controle e com solução salina não apresentaram alterações na atividade durante o 30 período de 8 semanas (Figura 33A, C e E). Utilizando comparações parea- das diretas dos três tratamentos após o ajuste polinomial, foi determinado que a melhora em função motora horizontal em camundongos tratados com rHlgM12 tornou-se estatisticamente significante no 7q dia após o tratamento (em comparação à lgM controle) e no jjç' dia (em comparação à solução salina) (Figura 34). A melhora observada em atividade noturna horizontal de « animais tratados com rHIgM12 persistiu por aproximadamente 30 dias e de-

· 5 pois retornou aos nlveis basais.

A comparação pareada de grupos de trata- mento com solução salina, contra IgM controle, mostrou significância estatís- tica para os Dias 38-52. Contudo, quando comparadas quanto a grandes diferenças obseNadas entre o grupo de tratamento com rHlgM12 e os con- troles, estas diferenças entre os grupos controle não foram consideradas 10 biologicamente significantes.

Por outro lado, a atividade vertical não mostrou grandes diferenças e foi similar em todos os três grupos (Figura 33B, D, e F). rHlçjM12 melhora a atividade horizontal e vertical em camundonqos SJL quando fornecido em 45 dpi O estudo anterior utilizou a atividade vertical (comportamento de " 15 elevação do corpo sobre as patas traseiras) como leitura primária [1]. Em decorrência da ruptura (dropout) em camundongos cronicamente infectados pelo TMEV, as patas traseiras se tornam progressivamente fracas e rígidas de modo que a elevação do corpo sobre as patas traseiras foi reduzida.

No primeiro experimento deste estudo, quando rHlgM12 foi administrado no 20 momento da desmielinização máxima (90 dpi) e aparecimento de perda axo- nal progressiva, somente a atividade horizontal foi melhorada.

O comporta- mento de elevação do corpo sobre as patas traseiras não foi afetado e foi equivalente em 'todos os três grupos de tratamento.

Por conseguinte, foi le- vantada a hipótese se o tratamento em um momento mais precoce poderia 25 ser mais benéfico.

Em um segundo experimento, grupos de 5 camundongos foram tratados em 45 dpi com uma dose única de 200 µg de rHlgM12, um isotipo lgM de controle ou solução salina.

Um desenho experimental idêntico foi utilizado; a atividade basal foi coletada por 8 dias e atividade após o tra- tamento por 8 semanas.

Neste experimento, iniciado por volta de 2 semanas 30 após o tratamento, camundongos tratados com rHlgM12 mostraram melho- ras claras tanto na atividade horizontal como na vertical.

Esta melhora foi evidente após serem aplicados todos os três métodos: dados calculados em média, aplicação do filtro Gaussiano ou o ajuste polinomial (Figura 35C-H). Camundongos tratados com a IgM controle e com solução salina mostraram níveis similares de atividade até o final do estudo.

Em camundongos trata- . dos com rHlgM12, a melhora em atividade horizontal foi evidente até que o

· 5 final do experimento.

Por outro lado, a melhora em atividade vertical durou aproximadamente 4 semanas e depois caiu para os valores basais.

Compa- rações pareadas diretas dos três tratamentos mostraram que a melhora em função motora horizontal em camundongos tratados com rHIgM12 divergiu significativamente no Dia 13 após o tratamento (em comparação à IgM con- lO trole) e no Dia 9 (em comparação à solução salina) (Figura 36A e C). Do mesmo modo, a função motora vertical em camundongos tratados com rHlgM12 divergiu significativamente no Dia 14 após o tratamento (em com- paração à lgM controle) e no Dia 6 (em comparação à solução salina) (Figu- ra 36B e D). A comparação de grupos tratados com lgM controle - contra " 15 tratados com solução salina não revelou grandes diferenças biológicas para atividade horizontal ou vertical (Figura 36E e F). rHlqM12 não altera a atividade espontânea em camundonqos normais não infectados O tratamento com rHIgM12 nos dois experimentos anteriores re- 20 velou efeito benéfico cIaro em camundongos infectados neurologicamente deficientes.

A fim de excluir a possibilidade de que este anticorpo pudesse apresentar propriedades irritantes e, por conseguinte, suscitar função motora aumentada, foi realizado um experimento similar com camundongos não infectados.

Três grupos de camundongos não infectados com idade corres- 25 pondente foram tratados com rHlgM12, lgM controle ou solução salina.

Em comparação à atividade intensificada em camundongos infectados, rHlgM12, bem como os outros dois tratamentos não induziram qualquer aumento em função motora de camundongos normais (Figura 37). Todos os três grupos mostraram tendência para o declínio em atividade espontânea.

Esse resul- 30 tado indica que nenhum dos anticorpos possui influência sobre aumentar a atividade em camundongos normais.

Discussão

Há uma necessidade fundamental de terapias neuroprotetoras que sejam desenvolvidas para esclerose múltipla, bem como para outras doenças desmielinizantes e neurodegenerativas.

Ainda que existam alguns 4 fármacos anti-inflamatórios que possam levar indiretamente a uma diminui-

· 5 ção em dano axonal durante a doença inflamatória no sistema nervoso cen- tral, não há fármacos que atuem diretamente no nivel de neurônios/axônios.

O principal objetivo da neuroproteção é limitar a disfunção neuronal e tentar manter a integridade funcional de neurônios e axônios.

Por muitos anos, a desmielinização, o marco patológico da MS, foi considerado como causa de 10 déficits neurológicos permanentes.

Está claro agora que a desmielinização é necessária, mas não suficiente para a perda axonal permanente [9]. A des- mielinização somente predispõe axônios desnudos à lesão secundária cau-

" sada por outra citotoxicidade de células T ou a perda do suporte neurotrófico local pela morte de oligodendrócitos [10]. " 15 A observação anterior de que o anticorpo sHlgM12 que se liga a neurônios promovia a extensão robusta de neuritos [5] representa uma res- posta clara benéfica in vitro.

Considerando que a versão recombinante deste anticorpo mostrou propriedades similares in vitro, foi levantada a hipótese se esta versão afetaria a atividade motora de camundongos com doença des- 20 mielinizante induzida pelo TMEV.

A análise da função motora foi realizada monitorando a atividade noturna espontânea.

Primeiramente, camundongos foram tratados no momento de desmielinização máxima e aparecimento de perda axonal (90 dpi). Oito semanas depois do tratamento, rHlgM12 melho- rou somente a atividade motora horizontal, ao passo que a atividade vertical 25 não foi afetada.

Contudo, quando camundongos foram tratados mais preco- cemente na doença (em 45 dpi), rHlgM12 melhorou a atividade horizontal e a vertical.

Na doença crônica induzida pelo TMEV, o comportamento de ele- vação do corpo sobre as patas traseiras (atividade vertical) é afetado mais gravemente, e parece que a degeneração e a perda de axônios, responsá- 30 veis por esta atividade, é irreversível.

Por outro lado, a fase inicial da doen- ça, quando estes axônios não estão irreversivelmente lesados, parece ser o momento ideal para o tratamento. jones et al. utilizaram o modelo EAE e, ao estudarem a ruptura axonal e a função motora, propuseram um paradigma idêntico; o tratamento com fármacos neuroprotetores deve iniciar precoce- mente na doença, mesmo antes do aparecimento de déficits motores [11].

V Em segundo lugar, tendo em vista qLle a melhora funcional ocorre em tomo - 5 de duas semanas após o tratamento e começa a desvanecer aproximada- mente 25-30 dias mais tarde, pode ser que tratamentos repetidos sejam ne- cessários para sustentar a função motora. lnfelizmente nos estudos dos pre- sentes inventores, não foi possÍvel testar doses múltiplas de lgMs humanas por causa da resposta imune em camundongos que resulta em anafilaxia. 10 A2B5 é um anticorpo monoclonal de camundongos que também promove o crescimento de neuritos [5] e representa um provável candidato para testar a administração única em comparação à múltipla sobre o resultado funcional e " sua duração de ação. Finalmente, nenhum dos tratamentos teve efeito sobre a função motora de animais normais não infectados. Independentemente do ' 15 tratamento, todos os grupos de camundongos normais mostraram declínio gradual em atividade espontânea, o que pode ser explicado por habituação ao ambiente. Este declínio de atividade em animais normais torna o aumento em atividade, induzido pelo rHlgM12, de camundongos doenças ainda mais impressionante. 20 Os presentes inventores demonstraram melhora em função mo- tora em um modelo progressivo crônico de doença desmielinizante inflama- tória na qual tem sido em geral muito difícil prevenir o desenvolvimento de déficits neurológicos. Por conseguinte, o anticorpo monoclonal rHlgM12 que se Iiga a neurônios representa um agente terapêutico muito promissor para o 25 tratamento não só de MS humana, mas também de outros transtornos des- mielinizantes ou neurodegenerativos. Adicionalmente, considerando que há exemplos de ataques clinicamente silenciosos de MS [12, 13], os presentes inventores e outros propuseram que compostos neuroprotetores devam ser complementados com agentes imunomoduladores [11]. Os presentes inven- 30 tores propõe que o tratamento combinado de fármacos imunomoduladores e rHlgM12 possa resultar em melhora significante de preservação do sistema nervoso central e reparo após lesão axonal.

Em conjunto, os resultados deste estudo permitem três conclu- sões importantes: 1) o estágio da doença em que o tratamento é fornecido é fundamental (o tratamento precoce é mais benéfico); 2) para manter mais a a função motora melhorada, podem ser necessários tratamentos repetidos e 3) - 5 rHlgM12 não é tóxico, nem afeta a função motora em animais normais, não infectados. Os achados são compatíveis com a hipótese de que um anticor- po recombinante direcionado a neurônios melhora a função neurológica em um modelo de desmielinização axonal crônica. Referências 10 1. McGavern, D.B., et al., Quantitative assessment of neuro/ogic de/ícits in a chronic progress/ve murine model of CNS demye/ination. Exp Neurol,

1999.158(1): p. 171-81.

" 2. Warrington, A.E., et al., Human monoclonal antibodies reactive to oligodendrocytes promote remye/ination in a model of mu/tip/e sc/erosis. Proc " 15 Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(12): p. 6820-5.

3. McGavern, D,B., et al., Axonal loss resu/ts in spinal cord atrophy, e/ectro- physiologica/ abnorma//ties and neuro/ogica/ de/ícits fo//owing demye/ination in a chronic inf/a/nmatoIy model of mu/tjp/e sc/erosis. Brain, 2000. 123 Pt 3: p. 519-31. 20 4. Warrington, A.E,, et al., A /ecombinant human lgM promotes mye/in repair after a sing/e, veiy low dose. J Neurosci Res, 2007. 85(5): p. 967-76.

5. Warrington, A.E., et al-, Neuron-binding human monoc/ona/ antibodies support central nervous system neurite extension. J Neuropathol Exp Neurol,

2004. 63(5): p. 461-73. 25 6. Denic, A., et al., The re/evance of animal mode/s in mu/tiple sc/erosis re- search. Pathophysiology, 2010. 18(1): p. 21-9.

7. Hoch, J.C. and A.S. Stern, NMR Data Processing. 1 ed1996, New York: Wiley- Liss. 230.

8. Akaike, H., A new look at the statistical model identif/'cat/'on. IEEE Transac- 30 tions on Automatic Control, 1974. 19(6): p. 716-723.

9. Howe, C.L., J.D. Adelson, and M. Rodriguez, Absence of perforin expi'es- sion confers axonal protection despite demye/ination. Neurobiol Dis, 2007.

25(2): p. 354-9.

10. Rodriguez, M., A function of mye/in is to protect axons from subsequent 4 injuiy: implications for deficits in mu/tip/e sc/erosis. Brain, 2003. 126(Pt 4): p. 751-2.

- 5 11. Jones, M.V., et al., Behavioral and patho/ogica/ outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encepha/omye/itis. J Neuroimmunol, 2008. 199(1- 2): p. 83-93.

12. jacobs, L., P.R. Kinkel, and W.R. Kinkel, Si/ent brain lesions in patients with iso/ated idiopathic optic neuritis. A clinical and nuc/ear magnetic reso- IO nance imaging study. Arch Neurol, 1986. 43(5): p. 452-5.

13. Pohl, D., et al., Pediatric multip/e sc/erosis.' detection of c/inica//y si/ent lesions by mu/timodal evoked potentia/s. j Pediatr, 2006. 149(1): p. 125-7.

14. Mikami, Y., et al., A simp/e and re/iab/e behavioral ana/ysis of locomotor function aner sp/na/ cord injuíy in mice. Technical note. J Neurosurg, 2002. " 15 97(1 Suppl): p. 142-7.

15. Mikami, Y., et al., /mp/antatbn of dendritic ce/ls in injured adu/t spinal cord resu/ts in activation of endogenous neural stem/progenitor ce//s lead/ng to de novo neurogenes/s and functional recoveiy. j Neurosci Res, 2004. 76(4): p. 453-65. 20 16. Melnick, S.M. and D.L. Oow-Edwards, Di/i'erentia/ behavioral responses to chronic amphetamine in adu/t ma/e and female rats exposed to postnatal coca/ne treatment. Pharmacol Biochem Behav, 2001. 69(1-2): p. 219-24.

17. Shen, H., et al., lnosine reduces ischemic brain in/uíy in rats. Stroke,

2005. 36(3): p. 654-9. 25 18. Torres-Reveron, A. and D.L. Dow-Edwards, Prenatal cocaine dampened behavioral responses to methy/phenidate in ma/e and female ado/escent rats. Neurotoxicol Teratol, 2006. 28(2): p. 165-72.

19. Zhu, N., J. Weedon, and D.L. Dow-Edwards, Oral methylphenidate im- ptoves spatial learning and memory in pre- and periado/escent rats. Behav 30 Neurosci, 2007. 121(6): p. 1272-9.

20. Li, X., et al., Attenuation of basal and cocaine-enhanced locomotion and nuc/eus accumbens dopamine in cannabinoid CBl-receptor-knockout mice.

Psychopharmacology (Berl), 2009. 204(1): p. 1-11.

21. Rivera-Quinones, C., et al., Absence of neuro/ogica/ de/ícits fol/owing extensive demyelination in a c/ass l-dehcient murine model of mu/tip/e sc/e- . rosis. Nat Med, 1998. 4(2): p. 187-93.

- 5 Exemplo 20: Anticorpos monoclonais humanos neuroprotetores para o tra- tamento da doença do neurônio motor ALS A esclerose amiotrófica lateral (ALS) é uma enfermidade neuro- lógica devastadora que afeta primariamente as células do corno anterior e neurônios do trato corticoespinhal. A ALS é uma doença do neurônio motor, 10 caracterizada por degeneração progressiva das células motoras no cérebro e na medula espinhal. As células motoras (neurônios) controlam os múscu- los que possibilitam a um indivíduo se movimentar, falar, respirar e deglutir. " Sem nervos para ativá-los, os músculos se enfraquecem e perdem gradual- mente sua massa. Apesar de pesquisa intensa, a etiologia deste transtorno é " 15 em grande parte desconhecida, e não existem tratamentos eficazes. Genes implicados em uma minoria de pacientes com uma forma genética rara de ALS representam um indício potencial a este transtorno [1]. Uma mutação genética identificada era a mutação Cu/Zn SOD (cobre/zinco superóxido dismutase), que está presente em um pequeno percentual de pacientes com 20 a forma genética da ALS [2]. Aparentemente, pacientes portadores das mu- tações SOD possuem resultados neurológicos muito similares, quando com- parados a pacientes que desenvolvem a doença espontaneamente sem uma mutação genética associada [3]. Essa enzima catalisa superóxido para oxi- gênio e peróxido de hidrogênio. SODl é a forma da enzima associada com 25 ALS. Parece haver um ganho de função de SODl, que afeta o transporte axonal rápido [4]. A frequência da mutação SOD na ALS familiar varia de 12 a 23% e o gene é habitualmente herdado em forma autossômica dominante. ldentificar o gene permitiu o desenvolvimento de modelos ani- mais com características da doença ALS para desenhar e testar novos fár- 30 macos. Considerando que as formas herdadas e não herdadas de ALS são doenças similares, a causa subjacente pode estar relacionada. Por conse- guinte, fármacos que sejam eficazes nos modelos de ALS herdada em ca-

mundongos podem funcionar também em pessoas com as formas aleatórias mais comuns de ALS. A disponibilidade de modelos de camundongos trans- gênicos com genes SODl humanos e as características patológicas da ALS ¢ trouxeram avanços para o desenvolvimento de fármacos para a doença [5].

5 Estes camundongos transgênicos desenvolvem progressiva perda de neurô- nios motores e déficits neurológicos. Tendo em vista que formas herdadas e não herdadas da ALS são clinicamente similares, os defeitos subjacentes em função do neurônio motor podem estar relacionados. Reagentes eficazes em ALS vinculada à mutação SODI podem também auxiliar as formas espo- lO rádicas mais prevalentes de ALS. Atualmente, há somente um fãrmaco no mercado para ALS, o fármaco bloqueador do glutamato Rilutek® (Riluzol comprimidos). Contudo, estudos demonstraram que este fármaco não me- " lhora a qualidade de vida dos pacientes e pode somente prolongar a vida em média por 2 meses. Evidentemente, fármacos mais eficazes são fundamen- " 15 talmente necessários. O laboratório desenvolveu novas terapias para o tratamento de transtornos desmielinizantes e degenerativos do sistema nervoso central (SNC) [6] e identificou uma série de anticorpos monoclonais humanos (mAbs) que se Iigam a oIigodendrócitos [7] ou neurônios [8], os quais de- 20 monstraram induzir reparo no sistema nervoso central. Estes anticorpos fo- ram clonados, sequenciados [9] e produzidos em grandes quantidades em uma instalação que segue as normas de GMP para futuros estudos clínicos

[10]. O anticorpo humano lgM12 recombinante (rHlgM12) é derivado a partir de um anticorpo isolado de um paciente com macroglobulinemia de Wd- 25 denstrom [11]. Este anticorpo identifica especificamente neurônios e axônios do sistema nervoso central [8]. Apesar de ser um anticorpo lgM, lgM12, co- mo mostrado nos Exemplos acima, atravessa a barreira hematoencefálica e se liga especificamente a axônios e neurônios dentro do sistema neNoso central. ln vitro, rHlgM12 Iiga-se a um grande conjunto de neurônios, incluin- 30 do neurônios granulares do cerebeb, neurônios corticais, neurônios do hipo- campo e neurônios das células ganglionares da retina [12]. Experimentos in vitro demonstram que rHlgM12 protege os neurônios da morte celular. O anticorpo monoclonal rHlgM12, admin istrado a pacientes em estágios iniciais da ALS (ambas as formas da doença, a genética e a espontânea), pode atu-

% ar protegendo as células do corno anterior e prevenindo a lesão a axônios, assim retardando o aparecimento de deficiência e melhorando a sobrevida. 5 Resultados Foram realizados experimentos, nos quais camundongos com a mutação G86R hSOD1 [13] (FVBTg SODI G86R Mljwg, Jackson Labs) foram tratados com o anticorpo humano rHlgM12. Os camundongos G86R parecem normais ao nascimento.

Contudo, a partir de aproximadamente 90- 10 100 dias de idade, os animais sofrem perda acentuada de peso, desenvol- vem atrofia muscular e morrem de insuficiência respiratória dentro de sema- nas da perda abrupta de peso.

LUDOLPH? Em um estudo "cego" randomi- " zado, estes camundongos receberam rHlgM12, purificado de acordo com as normas de GMP, na idade de 55 dias em uma dose única intraperitoneal " 15 (200 µg). Por outro lado, o grupo placebo recebeu solução salina com tam-

pão fosfato (PBS). Alguns camundongos foram deixados sem tratamento para determinar o curso natural da doença sem manipulação humana.

Con- siderando que os dados para os camundongos tratados com PBS e os da- queles sem tratamento eram similares, os grupos foram combinados para as 20 análises estatísticas.

Os camundongos foram randomizados para o trata- mento por um investigador no laboratório dos inventores e foram observados quanto a déficits neurológicos por outro investigador "cego" até que ficassem moribundos.

Os investigadores responsáveis pelo tratamento e outros reali- zando as análises patológicas não tiveram conhecimento sobre o protocolo 25 de randomização até que o código ter sido quebrado.

Os animais foram pesados semanalmente para determinar se o tratamento com os mAbs humanos iriam não só aumentar a sobrevida, mas também retardar o início da perda de peso.

Os resultados foram surpreen- dentes e mostraram aumento significante em sobrevida em animais que re- 30 ceberam rHlgM12 em comparação aos que receberam PBS.

Em média, os investigadores registraram sobrevida aumentada de 25 a 30 dias, o que, de acordo com as curvas de Kaplan-Meier (Figura 38), mostrou significância estatística (P = 0,008). Adicionalmente, camundongos tratados com rHlgM12 sofreram perda de peso menos acentuada (Figura 39), um parâmetro co- mumente estimado na avaliação de progressão da doença em animais [18]- . De acordo com as informações disponíveis aos presentes inventores, esta é

- 5 a primeira demonstração de um anticorpo monoclonal humano inteiramente recombinante direcionado contra neurônios ser eficaz em aumentar a sobre- vida em animais com fenótipo de ALS.

Quando atingiram a fase de moribundos, os animais foram sacri- ficados e perfundidos com o fixador de Trump.

As medulas espinhais foram 10 removidas e cortadas em blocos de 1 mm, que foram impregnados em plás- tico Araldite para cortes com 1 µm de espessura.

Estes cortes foram subme- tidos ao histológico.

Os animais que desenvolveram ALS, provocada pela ' mutação SOD, mostraram degeneração axonal significante nos tratos da substância branca, tal como quando o axônio sofre colapso, feixes espirala- " 15 dos de mielina, relativamente fãceis de serem identificados, se desenvolvem na substância branca da medula espinhal.

Quando o número de feixes espi- ralados (axônios em degeneração) na medula espinhal foi quantificado em cortes torácicos de animais que receberam rHIgM12, em comparação a PBS, foi constatada uma diminuição estatisticamente significante no número 20 de feixes espiralados de mielina em animais tratados pela terapia com anti- corpo monoclonal (Figura 40). Os cortes da medula espinhal foram corados também com um corpo contra NeuN, um marcador que marca especificamente neurônios no sistema nervoso central define muito bem as células do corno anterior, bem 25 como neurônios no corno posterior.

Algumas células do corno anterior foram quantificados no nível torácico da medula espinhal em animais que recebe- ram rHlgM12, quando comparado a PBS (Figura 41, esquerda). Foi consta- tada uma d iferença altamente estatística com aumento no número de células preseNadas do corno anterior em animais que receberam rHlgM12 em com- 30 paração a PBS.

Uma análise similar sobre neurônios nos cornos posteriores revelou também aumento significante nos neurônios de camundongos trata- dos com rHlgM12 (Figura 41, direita).

O anticorpo humano, rHlgM12, liga-se à superfície de muitos ti- pos de neurônios do sistema nervoso central, obtidos a partir de muitas es- pécies, incluindo camundongos, seres humanos (Figura 42), coelhos e pri- . matas. lsso fornece evidência de que a sinalização de neurônios pelo 5 rHlgM12 é preservada em mamíferos, incluindo de camundongos a seres humanos.

Os estudos dos presentes inventores nos camundongos SOD su- gerem que proteger células do corno anterior e do posterior contra a morte pode levar a menos axônios em degeneração na medula espinhal e sobrevi- da aumentada do animal.

Os experimentos descritos acima nos Exemplos 10 anteriores com neurônios corticais em cultura demonstram que o tratamento de neurônios com rHlgM12 é capaz de protegê-los da morte celular (vide a Figura 3). Neurônios corticais cultivados de camundongos neonatos foram " expostos a concentrações muito altas de peróxido de hldrogênio para deter- minar uma concentração na qual 90% dos neurônios morreriam.

Neurônios " 15 expostos ao peróxido de hidrogênio foram tratados ao mesmo tempo com rHlgM12 ou outra lgM humana que não se liga a neurônios.

O tratamento com rHlgM12 resultou na preservação de 80% dos neurônios.

Por outro la- do, o tratamento com uma lgM controle resultou na morte de 90% dos neu- rônios após a exposição ao peróxido de hidrogênio.

Os presentes inventores 20 sugerem a hipótese de que rHlgM12 prolonga a expectativa de vida em ani- mais com ALS ao proteger os neurônios da morte celular.

Anticorpos humanos foram também testados como substratos em placas de cultura de tecido e comparados quanto à habilidade em pro- mover a extensão do processo celular normal de neurônios do cerebelo ou 25 corticais. rHlgM12 e sHlgM42, anticorpos que se Iigam à superfície de neu- rônios, e rHlgM22 e sHlgM39, anticorpos que não se ligam a neurônios, fo- ram comparados à molécula com ação potente sobre o processo que sus- tenta a matriz extracelular, laminina.

O crescimento de neurônios sobre um substrato dos anticorpos humanos rHlgM12 ou sHlgM42 resultou em exten- 30 são surpreendente do crescimento de neurônios, similar à observada com laminina [8]. Este estudo mostrou também que os neurônios comportam-se normalmente na presença de rHlgM12.

Tem sido em geral aceito como dogma que lgMs com peso mo- lecular próximo a 1 milhão são grandes demais para atravessarem a barreira hematoencefálica (BBB) a partir da circulação e penetrarem no sistema ner- voso central [15] [16]. Contudo, há evidências crescentes de que alguns an- 5 ticorpos efetivamente cruzam a BBB.

De acordo com o precedente, foi des- crita a detecção de rHlgM12 dentro da medufa espinhal após injeção perifé- rica. 1,0 mg de rHIgM12 ou de lgM humana de controle foi administrado por via intraperitoneal a camundongos com lesões desmielinízadas na medula espinhal.

Quatro horas depois, os camundongos foram sacrificados e cortes 10 da medula espinhal foram imunocorados para a presença da cadeia mu de lgM humana e anti-neurofilamento.

Em camundongos que receberam rHIgM12, a microscopia confocal demonstrou a cadeia mu humana dentro de " lesões desmielinizadas colocalizadas com anti-neurofilamento, um marcador de axônios, em tratos paralelos e como feixes cortados na extremidade (vide " 15 a Figura 15). lgM humana não foi encontrada dentro de Iesões da medula espinhal de camundongos que receberam uma lgM controle.

Embora os estudos fornecidos sejam em modelos animais, há uma série de aspectos tentadores desses resultados da pesquisa que indi- cam ainda que essa nova abordagem será eficaz em pacientes humanos. 20 De importante, o anticorpo lgM12 aqui descrito e utilizado é um anticorpo monoclonal inteiramente humano.

Como resultado, somente uma dose única deste anticorpo pode ser utilizada em camundongos.

Doses subsequentes fazem com que os animais desenvolvam um resposta imune ao anticorpo resultando em neutralização do rHlgM12 ou na morte do animal em decor- 25 rência de anafilaxia.

Contudo, tendo em vista que estes são anticorpos hu- manos "verdadeiros", pacientes humanos tratados com rHlgM12 provavel- mente não desenvolverão uma resposta imune a estes anticorpos.

Adicio- nalmente, rHlgM12 pode ser potencialmente fornecido em base contínua intermitente a pacientes sem efeitos nocivos ou o desenvolvimento de uma 30 reação de bloqueio ao anticorpo.

Considerando que o rHlgM12 é um autoan- ticorpo humano natural, os efeitos colaterais adversos são improváveis e, por conseguinte, os presentes inventores esperam que a toxicidade desse agente seja mlnima.

Há muita evidência de que rHlgM12 será seguro em seres humanos.

Antes destes resultados positivos no modelo de ALS, a for- ma sérica do anticorpo, sHlgM12, foi testada em diversos modelos de doen- . ça neurológica sem toxicidade, conforme descrito acima neste pedido de

- 5 patente.

Nestes estudos, foi constatado 1) não ter havido aumento em pato- logia do sistema neNoso central em camundongos com desmielinização mediada por vÍrus após uma dose de 1 mg, 2) não ter havido aumento em gravidade de pontuações clínicas em camundongos com EAE ativa depois de uma dose de 200 µg e 3) bioquímica sanguínea e patotogia de tecidos sem 10 alterações em camundongos CD-l normais depois de uma dose de 300 µg.

Ainda assim, é notável que uma dose única a um camundongo em um mo- delo animal reconhecido de ALS fornecesse resultados consideráveis. . rHlgM12 já foi cultivado em uma instalação que segue as nor- mas de GMP de acordo com as diretrizes da FDA, e, em conformidade com " 15 as diretrizes da FDA, linhagens celulares transfectadas estáveis foram gera- das e armazenadas sem quaisquer infecções adventícias.

Estas linhagens celulares foram testadas contra um painel de >50 organismos infecciosos, todos com resultados negativos.

Além disso, as linhagens celulares produ- zem grandes quantidades de anticorpo em cultura de tecido (150 µg/mL). 20 Uma metodologia para purificar rHlgM12 para pureza >97%, sem a presença de vÍrus adventícios, DNA, RNA ou outros materiais exógenos de acordo com as diretrizes da FDA, foram estabelecidas, fornecendo uma base pré- clínica forte para o rHlgM12 em estudo clínico futuro de fase inicial em paci- entes com estágios iniciais de ALS. 25 Estudos em andamento Tendo sido mostrado acima que o anticorpo monoclonal humano recombinante (rHlgM12) consegue prolongar a sobrevida em um modelo transgênico de ALS humana ao prevenir a perda de células do corno anterior e de axônios, existem estudos em andamento para gerar dados pré-clínicos, 30 abrangendo farmacocinética e toxicologia, visando o avanço para um estudo clínico de Fase I em pacientes com ALS.

Estudos ceqos de Ab em comparação a placebo

Um estudo definitivo "cego" controlado por placebo é realizado em duas linhagens de camundongos SOD com o fenótipo de ALS (SODl

F G86R e G93A), testando o anticorpo humano recombinante rHlgM12 em comparação a um anticorpo com isotipo de controle, sHlgM39. A eficácia de - 5 uma dose única de 200 µg do anticorpo humano recombinante, rHlgM12, é testada para reduzir a doença nos modelos de camundongos transgênicos mutantes G86R e G93A SODl [14] (B6 Cg-Tg SODl G93A lGur, Jackson Labs), em comparação a uma dose de 200 µg de um anticorpo humano com isotipo de controle, sHlgM39. O tratamento com o anticorpo ocorre aos 55 10 dias de idade, seguindo a recomendação do ENMC, de tratamento anterior ao aparecimento [18], com resultados para refletir os estudos preliminares que comparavam rHlgM12 a PBS (Figuras 38-41). Os desfechos primários " são sobrevida e prevenção da perda de peso. Cada grupo experimental con- siste em 24 camundongos, número suficiente para detectar uma diferença " 15 com base nos dados acima. Adicionalmente, o sistema nervoso central é examinado em todos os camundongos após o sacrifício para determinar o número de células do corno anterior na medula espinhal torácica média utili- zando uma marcação para NeuN. O número de axônios em degeneração, indicado por feixes espiralados anormais de mielina, é contado. O modelo · 20 com o mutante G93A SODl (B6.Cg-Tg)SOD1G93A)1Gur/j #004435, Jack- son Laboratory) é incluído porque este é o primeiro modelo de base genéti- ca, mais amplamente utilizado e melhor caracterizado de ALS e permite que resultados com rHlgM12 sejam comparados a uma grande base de dados de paradigmas do tratamento. Os camundongos G86R apresentam apare- 25 cimento tardio da doença (7 meses) e progressão rápida, enquanto os ca- mundongos G93A apresentam aparecimento mais rápido (3-4 meses) com progressão mais lenta. Este estudo controla a introdução de uma proteína exógena em camundongos SODl e também aborda conceitos referentes a mecanismo de ação. O caráter de ligação a neurônios de rHlgM12 é funda- 30 mental e uma lgM que não se liga a neurônios não deve melhorar a doença. O desfecho primário neste estudo é sobrevida aumentada (10% ou mais, P<O,05) e perda diminuída de peso (iO°/o ou mais, P<O,05)- A melhora em ao menos uma linhagem de camundongos SODl é considerada um suces- so.

Todos os camundongos são sacrificados no momento em que são inca- pazes de se endireitarem dentro de 15-30 minutos se deitados sobre qual- . quer Iado.

Os desfechos secundários medem o número de axônios em de-

- 5 generação, conforme indicado por feixes espiralados anormais de mielina, e a densidade de células do corno anterior positivas para NeuN no nível torá- cico (T6) da medula espinhal.

São considerados eventos adversos se ca- mundongos tratados com rHlgM12, 1) perdem mais de 20% do peso corpo- ral, quando comparados a controles, 2) desenvolverem crises convulsivas, 3) 10 apresentarem taxa de mortalidade 20% maior do que controles.

Estudo de titulação de dose Após os resultados positivos do estudo acima, um estudo de titu-

" lação de dose (uma dose única de 0, 5, 50, 100 e 250 µg por camundongo, fornecida aos 55 dias de idade) é empreendido para determinar a dose mí- " 15 nima necessária para proteger camundongos SODl da morte.

A espectros- copia por MR do tronco cerebral dos camundongos é utilizada para medir N- acetil aspartato (NAA). Os presentes inventores mostraram em outros mode- los de doença neurológica que NAA no tronco cerebral é um excelente indi- cador substituto da saúde de axônios por toda a medula espinhal [17]. Os

- 20 dados da espectroscopia por MR ajudam a validar NAA como marcador substituto da eficácia de anticorpos em estudos humanos potenciais utilizan- do rHIgM12. Uma dose única de 0, 5, 50, 100 e 250 µg é fornecida por via intraperitoneal aos 55 dias de idade a grupos de 20-24 camundongos SODl.

O desfecho primário e os secundários e os eventos adversos são os mes- 25 mos que os descritos acima com a adição de espectroscopia por RM no tronco cerebral para medir N-acetil-aspartato (NAA). Os dados de espectros- copia por MR são coletados para cada camundongo no dia do tratamento com o anticorpo, aos 100 dias de idade e imediatamente antes do sacrifício, Aumento de 1O°/o (P<O,05) na concentração de NAA no tronco cerebral em 30 qualquer grupo tratado com rHlgM12 no exame do 100g dia ou no final, quando comparado a camundongos tratados com solução salina, é conside- rado melhora.

Estudos farmacocinéticos e BBB Estudos são realizados em camundongos SODI G86R e G93A aos 50-70 dias de idade [18] após uma dose intravenosa única de 200 µg, utilizando um sistema estabelecido de detecção por ELISA que detecta es- 5 pecificamente lgM humana dentro do contexto de imunoglobulina sanguínea de camundongos normais.

A IgM humana é medida no sangue em vários momentos após a administração (0, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 5 dias e 7 dias). Tendo em vista que o volume sanguíneo de camundongos é pequeno (total <1,5 mL), 10 três camundongos são utilizados para cada ponto de coleta.

É proposto que rHlgM12 atue diretamente sobre o sistema nervo- so, cruzando a barreira hematoencefálica após injeção periférica para interagir com neurônios e protegê-los da morte.

É possÍvel, mas improvável, que o an- ticorpo humano não atravesse a barreira hematoencefálica, mas que estimule " 15 aspectos de uma resposta imune, a qual então confere proteção a axônios. ln vivo, o rastreamento de rHlgM12 marcado com 35S é utilizado para abordar completamente essa questão.

Dois níveis de dose de rHlgM12 marcado com 3'S, 250µg e a dose eficaz mínima estabelecida acima, são acompanhados em camundongos SODl aos 50-70 dias de idade.

Após uma dose intraveno-

- 20 sa de rHIgM12 marcado com 35S, o percentual de 35S que cruza a barreira hematoencefálica e é encontrado no parênquima cerebral/da medula espinha! em 4, 8, 24, 48 e 72 horas após a injeção é determinado.

Adicionalmente, o sÍtio de localização de 35S no cérebro/medula espinhal é determinado utilizan- do técnicas já publicadas de autorradiografia [19]. 25 Estudos de meia-vida sérica A cinética no sangue para rHlgM12 é realizada utilizando uma dose de 200 µg na(s) linhagem(ns) SODl na(s) qual(is) rHlgM12 demons- trou eficácia.

O estudo é realizado em grupos de 3 camundongos SODl por momento; 13 pontos de coleta durante 7 dias após a injeção intravenosa. 30 Camundongos SODl são tratados aos 50-70 dias de idade para compreen- der a cinética do anticorpo no momento do tratamento.

Serão determinadas meia-vida sérica, saturação de exposição e a presença de Abs lgM neutrali-

zantes.

Estudos de rastreamento de rHlgM12 marcado isotopicamente (35S) requerem a determinação da dose eficaz mínima descrita acima.

Camun- dongos SODl recebem uma dose intravenosa única de 250 µg e a dose efi- . caz mínima de rHlgM12 (contendo ao menos 1X1O' cpm) [19] aos 50-70 dias

· 5 de idade para abordar se rHlgM12 penetra no sistema nervoso central no momento do tratamento terapêutico.

Em 4, 8, 24, 48 e 72 horas após a inje- ção, tecidos importantes são agudamente removidos, incluindo cérebro, me- dula espinhal, fígado, coração, pulmão, estômago, intestino, músculo, baço, pâncreas.

Uma parte de 150 mg de tecido é retirada, pesada, solubilizada 10 em Solvable (Perkin Elmer) e a cpm determinada em líquido de cintilação (Ultima Gold, Perkin Elmer). rHlgM12 marcado isotopicamente é Iocalizado em cortes da medula espinhal utilizando autorradiografia [19]. Neste experi-

" mento, o desfecho primário é acúmulo do isótopo 35S no cérebro ou na me- dula espinhal de camundongos em 4, 8, 24, 48 e 72 horas depois da injeção " 15 de rHlgM12, em comparação a controles no momento zero.

Aumento de 50% (P<O,05) em contagens de 35S/mg no cérebro inteiro ou na medula es- pinhal inteira em qualquer momento é considerado significante e evidência de que rHlgM12 consegue penetrar no sistema nervoso central.

Para estu- dos de autorradiografia, camundongos recebem rHlgM12 marcado e as me-

- 20 dulas espinhais são removidas em um momento em que rHlgM12 estava aumentado no sistema neNoso central.

Aumento de 50% em grãos de pra- ta/mm' sobre neurônios em cortes da medula espinhal é considerado evi- dência significante de direcionamento do anticorpo in vivo.

Estudos iniciais de toxicidade 25 Experimentos são conduzidos com rHlgM12 para determinar se o anticorpo é tóxico em camundongos CD-l normais e coelhos.

A grupos de 10 camundongos CD-l normais dos dois sexos, é administrada a dose mí- nima eficaz de rHlgM12 determinada acima 1 vez (lX), 10 vezes (lOX) e 20 vezes (20X) ou solução salina por via intravenosa uma vez ou diariamente 30 por 7 dias.

Duas semanas mais tarde, sangue e tecidos são coletados por necropsia "total" e analisados.

Os cortes de tecidos de todos os principais órgãos são examinados de modo "cego" por um patologista veterinário com especialização em avaliações de toxicologia. O sangue é caracterizado por parâmetros de bioquímica e hematologia para o painel habitual de rastrea- mentos de toxicologia, incluindo estudos no sangue de enzimas hepáticas, . enzimas cardíacas, eletrólitos e efeitos sobre grupo hematológico. Estudos - 5 de exposição idêntica são realizados em uma espécie diferente de roedores; dois coelhos de cada sexo são testados a cada dose. Adicionalmente, estu- dos de reatividade cruzada em tecidos, utilizando rHIgM12, são realizados para determinar se o anticorpo se liga a quaisquer outros tecidos ou órgãos. Um painel de cortes de tecido impregnado em parafina de camundongo, 10 coelho, primata e de ser humano (Zymed) é imunomarcado com rHlgM12 ou uma lgM humana de controle. A intensidade e as estruturas ligadas dentro de cada tecido são visualizadas e comparadas à marcação por rHlgM12 e ' pela IgM controle de fatias de tecido vivo cortadas com fatiador de tecidos

[7], pois isso simula mais proximamente a situação in vivo. Além disso, a " 15 Iigação de rHlgM12 e de um anticorpo controle é testada em tecido humano congelado e de primate, de acordo com a seção de toxicologia preliminar de um pedido de autorização de Novo Fármaco em lnvestigação à FDA. Os estudos de reatividade cruzada em tecidos fornece indícios quanto aos ór- gãos que devem ser especialmente monitorados durante estudos de exposi- - 20 ção em camundongos e coelhos. Liqação a tecidos Após a determinação da eficácia, estes estudos abordam a liga- ção a tecidos alvo e aos não considerados alvos. Arranjos de tecidos dispo- níveis comercialmente (Zymed) e cortes de tecido humano e de macaco cy- 25 nomolgus (Charles River) são imunomarcados com 10 µg/mL de rHlgM12 e da lgM humana de controle, sHlgM39. A intensidade da marcação é compa- rada utilizando imagens digitais. A ligação de rHlgM12 a arranjos de tecidos impregnados em parafina e a cérebro e medula espinhal humana e de pri- mata é comparada à ligação do anticorpo observada em fatias de cerebelo 30 vivo de camundongos. A ligação do anticorpo a fatias de cerebelo vivo, um ensaio padrão de potência, foi utilizado, e o primeiro rastreamento no qual a forma sérica de rHlgM12 foi identificada.

Referências citadas

1. Gurney, M.E., et al., Mutant CuZn superoxide dismutase in motor neuron b. disease. J lnherit Metab Dis, 1998. 21(5): p. 587-97.

2. Morrison, B.M. and J.H. Morrison, Amyotrophic /atera/ sc/erosis associated - 5 with mutations in superoxide dismutase: a putative mechanism of degenera- t/on. Brain Res Rev, 1999. 29(1): p. 121-35.

3. Siddique, T., D. Nijhawan, and A. Hentati, Fami/ia/ amyotrophic /atera/ scleros/s. J Neural Transm Suppl, 1997. 49: p. 219-33.

4. Cluskey, S. and D.B. Ramsden, Mechanisms of neurodegeneration in am- lO yotroph/c /atera/ sc/erosis. Mol Pathol, 2001. 54(6): p. 386-92.

5. Turner, B.J. and K. Talbot, Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent mode/s of mutant SODl-mediated fan)i/ia/ ALS. Prog Neurobiol, 2008. 85(1): " p. 94-134.

6. Bieber, A.J., et al., Humoral autoimmunity as a mediator of CNS repair. " 15 Trends Neurosci, 2001. 24(11 Suppl): p. S39-44.

7. Warrington, A.E., et al., Human monoc/ona/ antibodies reactive to o/igodendrocytes promote remye/ination in a model of mult(p/e sc/erosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(12): p. 6820-5.

8. Warrington, A.E., et al., Neuron-binding human monoc/ona/ antibodies - 20 support central nervous system neurite extension. J Neuropathol Exp Neurol,

2004. 63(5): p. 461-73.

9. Ciric, B., et al., C/ona/ evo/ution in Wa/denstrom macrog/obu/inemia high- /ights functional role of B-ce// receptor. Blood, 2001. 97(1): p. 321-3.

10. Mitsunaga, Y., et al., Direct evidence that a human antibody derived from 25 patient serum can promote mye/in repa/r in a mouse model of chronic- progressive demye/inating disease. Faseb J, 2002. 16(10): p. 1325-7.

11. Rodriguez, M., A.E. Warrington, and L.R. Pease, lnvited artic/e: human natural autoantibod/es in the treatment of neuro/ogic d/sease. Neurology,

2009. 72(14): p. 1269-76. 30 12. Wright, B.R., et al., Ce//u/ar mechanisms of central nervous system repair by natural autoreactive monoc/ona/ antibodies. Arch Neurol, 2009. 66(12): p. 1456-9.

13. Bruijn, LJ., et al., ALS-linked SODl mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapid/y progressive disease with SODl-containing inc/usions. Neuron, 1997.18(2): p. 327-38. 14, Gurney, M.E., et al., Motor neuron degeneration in mice that express a · 5 human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science, 1994. 264(5166): p- 1772-5.

15. Banks, W.A., Deve/oping drugs that can cross the b/ood-brain bariier: app/ications to A/zheimets d/sease. BMC Neurosci, 2008. 9 Suppl 3: p. S2.

16. Kozlowski, G.P., I. Sterzl, and G. Nilaver, Loca//zation patterns for 10 immunog/obu/ins and a/bumins in the brain suggest diverse mechanisms for the/r transport across the blood-brain barrier (BBB). Prog Brain Res, 1992. 91: p. 149-54.

17. Denic, A., et al., Brainstem 1H nuc/ear magnetic resonance (NMR) spec- troscopy: marker of demye/ination and repair in spinal cord. Ann Neuro!, " 15 2009. 66(4): p. 559-64.

18. Ludolph, A.C., et al., Guide/ines for the prec/inica/ in vivo eva/uation of pharmaco/ogical active drugs for ALS/MND: report on the 142nd ENMC in- temational workshop. Amyotroph Lateral Scler, 2007. 8(4): p. 217-23.

19. Hunter, S.F., D.J. Miller, and M. Rodriguez, Monoclonal remye/ination- · 20 promoting natural autoantibody SCH 94.03: phannacokinetics and in vivo targets within demye//nated sp/na/ cord in a mouse model of mult(p/e sc/ero- sis. J Neuroi Sci, 1997. 150(2): p. 103-13. Esta Ínvenção pode ser concretizada em outras formas ou exe- cutada em outras maneiras sem, no entanto, se desviar de seu espírito ou 25 de suas características essenciais. A presente invenção deverá, por conse- guinte, ser considerada conforme em todos os aspectos ilustrados e não res- tritivos, o âmbito da invenção sendo indicado pelas Reivindicações anexa- das, e todas as alterações que se enquadrarem dentro do significado e da variação de equivalência destinam-se a ser abrangidas pela invenção. 30 Por todo este relatório descritivo, várias referências são citadas, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente.

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo lgM humano isolado, ou seu fragmento, que se liga especificamente a neurônios e os protege contra morte celular e que não . promovem a remielinização, em que o anticorpo ou fragmento compreende a · 5 seguinte sequência: (a) as sequências de aminoácidos de domínios CDR da cadeia pesada variável, CDRI GGSVSLYY (SEQ ID NO:31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO:32) e CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO:33), e as sequências de CDRs da cadeia leve variável, CDRI QSISSY (SEQ IDNO: 34), CDR2 10 AAS (SEQ ID NO:35) e CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO:36), conforme a- presentadas na Figura 5; ou (b) as sequências de aminoácidos de domíriios CDR da cadeia " pesada variável, CDRI GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO:38) e CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO:39), e as se- " 15 quências de CDRs da cadeia leve variável, CDRI QGlG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO:41) e CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42), con- forme apresentadas na Figura 6, para uso em tratar ou melhorar doenças ou condições em mamíferos nas . quais nervos estão comprometidos, lesados ou danificados ou estão em ris- - 20 co dessas ocorrências.

2. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1, que com- preende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável apresenta- da na SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácidos da cadeia leve variável apresentada na SEQ ID NO: 11 ou por compreender a sequência de amino- 25 ácidos da cadeia pesada variável apresentada na SEQ ID NO: 17 e a se- quência de aminoácidos da cadeia leve variável apresentada na SEQ ID NO:

27.

3. Anticorpo isolado ou seu fragmento de acordo com a reivindi- cação 1, que compreende as sequências de aminoácidos de domínios CDR 30 da cadeia pesada variável, CDRI GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO:38) e CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO:39), e as sequências de CDRs da cadeia Ieve variável, CDRI QGlG

(SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO:41) e CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42).

4. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 3, que com- . preende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável apresenta- · 5 da na SEQ ID NO: 17 e a sequência de aminoácidos da cadeia leve variável apresentada na SEQ ID NO: 27, conforme apresentado na Figura 6.

5. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1, 3 ou 4, que é um anticorpo recombinante rHlgM42.

6. Anticorpo isolado ou fragmento de acordo com a reivindicação 3, que é um anticorpo ou fragmento de anti- lO corpo que compreende uma região variável da cadeia pesada e da cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das se- quências de aminoácidos SEQ ID NO: 17 e 27, ou variantes destas altamen- te homólogas, em que as referidas variantes retêm a atividade de ligação a neurônios e neuroprotetora. " 15

7. Anticorpo isolado ou fragmento de acordo com a reivindicação 1, que compreende as sequências de aminoácidos de domínios de CDRS da cadeia pesada variável, CDRI GGSVSLYY (SEQ ID NO:31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO:32) e CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO:33), e . as sequências de CDR da cadeia leve variável, CDRI QSISSY (SEQ IDNO: · 20 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO:35) e CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO:36).

8. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 7, que compreende ainda uma sequência de cadeia j humana-

9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 8, que a cadeia j compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15. 25

10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7 ou 8, que com- preende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável apresenta- da na SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácidos da cadeia leve variável apresentada na SEQ ID NO: 11.

11. Anticorpo recombinante isolado de acordo com a reivindica- 30 ção 1, 7, 8 ou 10, que é o anticorpo recombinante rHlgM12.

12. Anticorpo isolado ou fragmento de acordo com a reivindica- ção 7, que é um anticorpo completamente humano ou um fragmento deste b3h' anticorpo, caracterizado por compreender uma região variável da cadeia pe- sada e da cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 1 e 11, ou variantes destas altamente homólogas, em que as referidas variantes retêm a ativida- 5 de de ligação a neurônios e neuroprotetora.

13. Anticorpo isolado ou seu fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, para o uso em lesão da medula espinhal (SCl), lesão cerebral traumática (TBI), esclerose amiotrófica lateral (ALS), esclerose múltipla (MS), doença de Alzheimer, acidente vascular cerebrd, 10 doença de Parkinson, doença de Huntington, anóxia pré-natal/isquemia peri- natal, paralisia cerebral, encefalopatia, mielopatia ou doenças do neurônio motor. .

14. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1, formula- do para o uso em tratar ou melhorar doenças ou condições em mamíferos " 15 nas quais os neNos do sistema nervoso central estão comprometidos, lesa- dos ou danificados ou estão em risco dessas ocorrências, em combinação com um anticorpo capaz de induzir remielinização.

15. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 14, em que o anticorpo capaz de induzir remielinização em combinação é selecionado a · 20 partir de lgM22 e lgM46.

16. Anticorpo de acordo com a reivindicação 15, em que o anti- corpo capaz de induzir remielinização em combinação compreende a se- quência da região variável da cadeia pesada e da leve apresentada na SEQ ID NO: 43 e 44, ou compreende a sequência da região variável da cadeia 25 pesada e da leve apresentada na SEQ ID NO: 45 e 46.

17. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, marcado com uma marcação detectável ou funcional.

18. Anticorpo de acordo com a reivindicação 17, em que a mar- cação é uma enzima, um parceiro de Iigação especifica, um ligante, um co- 30 rante, ou etiqueta fluorescente e/ou um elemento radioativo.

19. Ácido nucleico isolado, que compreende uma sequência co- dificadora de um anticorpo ou fragmento como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

20. Método para preparar um anticorpo ou fragmento como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, que compreende expressar . o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 17, em condições que ocasi- 5 onem a expressão do referido anticorpo ou fragmento, e recuperar o anticor- po ou fragmento.

21. Composição farmacêutica, quecompreende um anticorpo ou fragmento como definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 12 e um veículo, carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável. 10

22. Kit para o tratamento ou a melhora de lesão, dano ou morte de células nervosas em um animal sujeito, que compreende uma forma de apresentação farmacêutica da composição farmacêutica como definida na ^ reivindicação 21 e uma forma de apresentação farmacêutica separada que compreende um ou mais agentes neuroativos ou terapêuticos adicionais, " 15 agente anti-inflamatório, agente modulador da liberação de neurotransmisso- res, ligante ou agonista ou antagonista de neuroreceptores, agente do canal de cálcio, imunomodulador ou outro anticorpo reativo no sistema neNoso central.

23. Kit de acordo com a reivindicação 22, em que o outro anti- · 20 corpo reativo no sistema nervoso central é um anticorpo capaz de induzir remielinização selecionado a partir de lgM22 e/ou lgM46.

24. Método para detectar a presença ou a extensão de lesão, morte ou danos a neNos em um mamífero sofrendo de uma doença, condi- ção ou complicação que resulta em dano ao sistema nervoso central, que 25 compreende: A. contatar uma amostra biológica de um mamífero, no qual a presença de lesão, morte ou dano a nervos é suspeito, com o anticorpo ou fragmento como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 em condições que permitam a ocorrência de ligação do referido anticorpo ou 30 fragmento a neurônios na referida amostra; e B. detectar se a Iigação ocorreu entre o referido neurônio da re- ferida amostra e o anticorpo ou determinar a quantidade de ligação que o-

correu com os referidos neurônios da referida amostra e o anticorpo; em que a detecção da ligação indica a presença de lesão, morte ou dano a células nervosas na referida amostra e a quantidade de ligação indica a quantidade relativa de lesão, morte ou dano a células nervosas.

25. Método para estabelecer como alvo e para determinar lesão, morte ou dano a neurônios, ou a células em risco dessas ocorrências no sis- tema nervoso central de um mamífero, que compreende administrar ao refe- rido mamífero uma quantidade marcada capaz de ser detectada do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e determinar a quantidade marcada e/ou a sua localização no sistema nervoso central do referido mamífero.