BR112012029355B1

BR112012029355B1 - sistema à base de ácido nucleico para propagar informações e método para melhorar sistema de computação molecular à base de ácido nucleico

Info

Publication number: BR112012029355B1
Application number: BR112012029355-9A
Authority: BR
Inventors: Daniel J. Kleinbaum
Original assignee: Emerald Cloud Lab, Inc.
Priority date: 2010-05-27
Filing date: 2011-03-25
Publication date: 2021-07-06
Also published as: US20110294687A1; US20140114585A1; EP3699828A1; WO2011149584A2; SG10201504130XA; RU2012155205A; JP6363984B2; RU2603746C2; BR112012029355A2; IL223130A; WO2011149584A3; SG185695A1; JP2018152080A; JP5848337B2; US20210034944A1; JP2013530459A; US8630809B2; EP2577534A4; CN102971736B; JP2017182102A

Abstract

SISTEMA À BASE DE ÁCIDO NUCLEICO PARA PROPAGAR INFORMAÇÕES E MÉTODO PARA MELHORAR SISTEMA DE COMPUTAÇÃO MOLECULAR À BASE DE ÁCIDO NUCLEICO. Um método para melhorar um sistema de computação molecular à base de ácido nucleico inclui (A) identificar um sistema de computação composto de (i) uma estrutura de ácido nucleico que inclui um domínio duplex incompletamente emparelhado por base, (ii) pelo menos uma molécula de deslocamento de polinucleotídeo que pode ligar com a estrutura de ácido nucleico em condições de hibridização, de modo que a estrutura de ácido nucleico sofra uma transição no estado de energia devido a uma reação de migração de ramo envolvendo o domínio duplex, e (iii) uma molécula de polinucleotido de choque que compete com a molécula de deslocamento de polinucleotido para ligação com a estrutura de ácido nucleico em condições de hibridização, mas não pode produzir uma reação de migração de ramo envolvendo o domínio duplex; então (B) reconfigurar pelo menos uma da molécula de deslocamento e da estrutura de ácido nucleico, respectivamente, para incorporar uma modificação química relativa a uma primeira molécula de referência que compreende nucleosídeos naturais e tem o mesmo conteúdo de sequência que a molécula de deslocamento ou a estrutura (...).

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

[0001] Este Pedido reivindica prioridade do Pedido provisório US 61/349.012, depositado em 27 de maio de 2010, cuja totalidade do conteúdo é aqui incorporada por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Os computadores de nanoescala podem potencialmente ser realizados utilizando moléculas. Esses computadores podem ser adequados para resolver certos problemas de computação. Em particular, computadores empregando biomoléculas podem ser compatíveis com ambientes biológicos e podem, potencialmente, ser usados para complexos diagnósticos de doenças ou mesmo tratamentos.

[0003] A capacidade de traduzir uma sequência de ácido nucleico para outra pode ser empregada para construir portas lógicas e redes com ácidos nucleicos. Estas portas e redes são movidas por dois eventos: hibridização e deslocamento de fita. Ambos os eventos são em geral termodinamicamente favoráveis, isto é, envolvem uma transição de um estado de energia mais alto para um mais baixo. Assim, ambos os eventos podem ocorrer espontaneamente em um sistema.

[0004] A hibridização envolve alongamentos de fita simples livres de ácidos nucléicos. Por conseguinte, uma rede de ácido nucleico pode ser regulada pela disponibilidade destas fitas livres.

[0005] Um “evento sequestrante” permite que certas sequências fiquem disponíveis condicionalmente para o resto da rede. Tais eventos capacitam a construção de tradutores que convertem uma sequência de ácido nucleico de fita simples em sequência de ácido nucleico de fita simples diferente. Estes tradutores são a base sobre a qual os operadores lógicos básicos, tal como AND, NOT, OR, NAND, NOR, XOR e XNOR, podem ser construídos com ácidos nucleicos. A partir destes e de outros componentes de lógica, redes maiores podem ser construídas que incluem componentes tais como amplificadores. Como resultado, estes eventos de tradução são importantes para o processamento de informação com ácidos nucleicos e a computação molecular.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] De acordo com um aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para melhorar um sistema de computação molecular à base de ácido nucleico. O método inclui: (A) identificar um sistema de computação compreendido de (i) uma estrutura de ácido nucleico que inclui um domínio duplex incompletamente emparelhado por base, (ii) pelo menos uma molécula de deslocamento de polinucleotídeo que pode ligar-se com a referida estrutura de ácido nucleico sob condições de hibridização, de modo que a estrutura de ácido nucleico sofra uma transição em estado de energia devido a uma reação de migração de ramo envolvendo o domínio duplex e (iii) uma molécula de polinucleotídeo de choque que compete com a molécula de deslocamento de polinucleotídeo para ligação da estrutura de ácido nucleico sob as condições de hidridização, mas que não pode produzir uma reação de migração de ramo envolvendo o domínio duplex; então, (B) reconfigurar pelo menos uma da molécula de deslocamento e da estrutura de ácido nucleico, respectivamente, para incorporar uma modificação química relativa a uma primeira molécula de referência que compreende nucleosídeos naturais e tem o mesmo conteúdo de sequência que a molécula de deslocamento ou a estrutura de ácido nucleico, conforme seja o caso. A modificação acima mencionada faz que a ligação da molécula de deslocamento e da estrutura de ácido nucleico tenha uma energia livre de hibridização diferindo daquela de uma primeira ligação de referência entre a molécula de deslocamento ou a estrutura de ácido nucleico e a primeira molécula de referência, de modo que a reação de migração de ramo é facilitada em relação à primeira ligação de referência. Após ou em lugar da etapa (B) está uma etapa (C) de reconfigurar pelo menos uma da molécula de choque e da estrutura de ácido nucleico, respectivamente, para incorporar uma modificação química em relação a uma segunda molécula de referência que compreende nucleosídeos naturais e tem o mesmo conteúdo de sequência que a molécula de choque ou a estrutura de ácido nucleico, conforme seja o caso. A modificação faz que a ligação da molécula de choque e da estrutura de ácido nucleico tenha uma energia livre de hibridização diferindo daquela de uma segunda ligação de referência entre a molécula de choque ou a estrutura de ácido nucleico e a segunda molécula de referência, de tal modo que a ligação da molécula de choque é impedida em relação à segunda ligação de referência.

[0007] A invenção também proporciona, em outro de seus aspectos, um sistema que inclui (A) uma estrutura de ácido nucleico que compreende um domínio duplex incompletamente emparelhado por base; (B) pelo menos uma molécula de deslocamento de polinucleotídeo para efetuar ligação com a estrutura de ácido nucleico sob condições de hibridização, de modo que a estrutura de ácido nucleico sofra uma transição em estado de energia devido a uma reação de migração de ramo envolvendo o domínio duplex; e (C) pelo menos uma molécula de choque de polinucleotídeo capaz de ligar com a estrutura de ácido nucleico sob condições de hibridização, de modo que a estrutura de ácido nucleico e a molécula de choque sejam ligadas e previnam a ligação da molécula de deslocamento de polinucleotídeo. Pelo menos uma da molécula de deslocamento e da estrutura de ácido nucleico, respectivamente, tem uma modificação química em relação a uma molécula de referência que compreende nucleosídeos naturais e tem o mesmo conteúdo de sequência que a molécula de deslocamento ou a estrutura de ácido nucleico, como seja o caso. A modificação faz que a ligação tenha uma energia livre de hibridização diferindo daquela de uma ligação de referência entre a molécula de deslocamento ou a estrutura de ácido nucleico e uma molécula de referência, de tal forma que a reação de migração de ramo é facilitada em relação à ligação de referência. Além disso ou em alternativa, pelo menos uma da molécula de choque e da estrutura de ácido nucleico, respectivamente, tem uma modificação química em relação a uma molécula de referência que compreende nucleosídeos naturais e tem o mesmo conteúdo de sequência que a molécula de deslocamento ou a estrutura de ácido nucleico, como seja o caso. A modificação faz que a ligação tenha uma energia livre de hibridização diferindo daquela de uma ligação de referência entre a molécula de deslocamento ou a estrutura de ácido nucleico e uma molécula de referência, de tal forma que a ligação da molécula de choque é impedida em relação à ligação de referência.

[0008] Ainda noutro aspecto, é proporcionado um sistema para propagar informação. O sistema inclui uma primeira molécula e uma segunda molécula configurada para ligar com a primeira molécula. Pelo menos uma da primeira molécula e da segunda molécula, respectivamente, tem uma modificação química em relação a uma molécula de referência que tem o mesmo conteúdo de sequência que a primeira molécula ou a segunda molécula, como seja o caso. A modificação faz que a ligação tenha uma energia livre diferente daquela de uma ligação de referência entre a molécula de referência e a primeira ou a segunda molécula, de tal modo que pelo menos uma das seguintes seja realizada no sistema: uma probabilidade de uma ligação produtiva é elevada ou uma probabilidade de uma ligação improdutiva é reduzida.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0009] A Figura 1A ilustra uma implementação sequestrante em fase sólida de um tradutor de ácido nucleico, em que a seção individual (A, B, etc.) representa alongamentos de oligonucleotídeos de comprimento e sequência arbitrária.

[0010] A Figura 1B ilustra como uma implementação sequestrante em fase sólida de um tradutor de ácido nucleico sequestra alongamentos de oligonucleotídeos.

[0011] Figura 2A ilustra uma implementação sequestrante de “chave de dedo” de um tradutor de ácido nucléico. Mais uma vez, seções individuais representam alongamentos de oligonucleotídeos de comprimento e sequência arbitrária.

[0012] A Figura 2B ilustra como uma implementação sequestrante de “chave de dedo” de um tradutor de ácido nucleico sequestra alongamentos de oligonucleotídeos.

[0013] A Figura 3A mostra um sistema de três tradutores de ácido nucleico sequestrados em chave de dedo. As reações mostradas são todas reações de deslocamento de fita que prosseguem por meio do mesmo mecanismo de migração de ramo que na Figura 2A.

[0014] A Figura 3B mostra um sistema com os mesmos oligonucleotídeos que são mostrados na Figura 3A, mas, em vez de reações de deslocamento de fita, “choques” de chave de dedo são mostrados, onde a chave de dedo é ligada por uma sequência que não pode produzir uma reação de deslocamento de fita. Este evento de ligação ocupa a chave de dedo de modo que a fita desejada não pode ligar.

[0015] A Figura 3C ilustra diferentes arquiteturas para estruturas de ácido nucleico incompletamente emparelhado por base incluindo: (a) terminal, (b) alça interna, e (c) e (d) complexo de múltiplas partes.

[0016] A Figura 4 apresenta uma representação esquemática de como, no sistema de tradutores de ácido nucleico mostrado na Figura 3A, o equilíbrio pode ser deslocado para favorecer reações de deslocamento de fita dobre choques de chave de dedo substituindo os alongamentos de oligonucleotídeos por modificações químicas que aumentam a afinidade de ligação e/ou os alongamentos de oligonucleotídeos com modificações que reduzem a afinidade de ligação.

[0017] A Figura 5 mostra estruturas de espinha dorsal modificadas para análogos de ácido nucleico, em que “B” representa uma nucleobase arbitrária e (a) mostra uma estrutura de fosfodiéster natural encontrada em DNA, (b) mostra ácidos nucleicos peptídicos, (c) mostra ácidos nucleicos peptídicos de guanidínio, (d) mostra L-serina derivada de gama-PNAs e (e) mostra fosforodiamidatos (aqui com um açúcar morfolino).

[0018] A Figura 6 ilustra estruturas de açúcar modificadas para análogos de ácido nucleico, em que “B” representa uma nucleobase arbitrária e (a) mostra um açúcar desoxirribose natural encontrado em DNA, (b) mostra morfolinos (c) mostra ácidos nucleicos travados e (d) mostra derivado de RNA modificado por flúor.

[0019] A Figura 7 ilustra estruturas de nucelobase modificadas para os análogos de ácido nucleico metilcitosina (a), diaminopurina (b), fenoxazina (c) e grampo-G (d).

[0020] A Figura 8 ilustra um ensaio cinético de fluorescência para indicar a mudança de taxa de reação devida a uma modificação química de acordo com a invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0021] Várias abordagens, tal como sequestro em fase sólida, sequestro de chave de dedo, troca de chave de dedo, podem ser usadas para traduzir sequências de ácido nucleico para construir operadores lógicos e redes. Estas três abordagens particulares, descritas em mais detalhes a seguir, são exemplificadas através de geometrias que utilizam reações de migração de ramo de três vias mediadas por chave de dedo. Mecanismos adicionais são possíveis para reações de migração de ramo, no entanto, incluindo, mas, sem limiitação, a migração de ramo de quatro vias, a migração acelerada de quatro vias e a migração complexa de múltiplas fitas.

[0022] Assim, embora as modalidades que se seguem sejam descritas utilizando migração de ramo de três vias para fins de ilustração, a presente invenção contempla portas lógicas de DNA e redes construídas para utilizar outras vias de migração de ramo. Por outro lado, as modalidades da invenção podem ser aplicadas a qualquer reação de migração de ramo.

[0023] O sequestro em fase sólida utiliza separar fisicamente as sequências/fitas relevantes no espaço utilizando contas, nanopartículas ou superfícies para fazê-lo. Esta abordagem emprega princípios de isolamento de sítio que foram utilizados extensivamente no contexto de química orgânica. Em geometrias de sequestro em fase sólida, quando estes eventos de deslocamento ocorrem, podem ser controlados regulando se as fitas necessárias estão na solução ou na fase sólida do sistema.

[0024] A Figura 1A mostra uma configuração básica de sequestrante em fase sólida para um tradutor - um componente que permite a um sistema substituir uma sequência de ácido nucleico por outra. Aqui, a fita A’-X’ (em que A e X representam cada um alongamento de oligonucleotídeos de comprimento e sequência arbitrária e X’ e A’ representam seus respectivos complementos inversos) é ligada a um suporte sólido e é inicialmente hibridizada com Y-B-X, formando uma estrutura de ácido nucleico na forma de um duplex incompletamente emparelhado por base que pode funcionar como um tradutor. Nesta configuração, a fita Y-B-X é sequestrada em fase sólida e não pode interagir com o resto do sistema. No entanto, na presença da fita X-A, denominada como uma “molécula de deslocamento de polinucleotídeo”, a fita Y-B-X pode ser deslocada a partir do suporte sólido e exposta à fase de solução do sistema, enquanto a fita X-A é ligada ao suporte. Esta operação envolve duas etapas, a primeira das quais é a hibridização de sequências complementares A e A’ (muitas vezes denominadas como ligação de chave de dedo). Na segunda etapa, a região X da fita X-A se liga à região X’ de A’-X’, deslocando a região X de Y-B-X e liberando esta fita em solução enquanto deixa X-A ligada ao suporte sólido (esta etapa é muitas vezes denominada como uma reação de migração de ramo). Este processo de duas etapas efetivamente permite a tradução de uma fita X- A livre em uma fita Y-B-X livre.

[0025] A Figura 1B mostra um sistema que tem uma fita de entrada X-A interagindo com um duplex incompletamente emparelhado por base, “Tradutor 1”. A saída inclui um duplex completamente emparelhado por base, A’-X’/X-A que é considerado um produto de “resíduo” e uma fita de saída Y-B-X que é denominada como “Saída 1” e pode ser utilizada como “Entrada 2” em uma reação seguinte. “Entrada 2” interage com “Tradutor 2” e produz a “Saída 2” e outro produto de resíduo. Nesta Figura, a região B da fita Y-B-X ilustra o sequestro de sequências nesta rede. No início, Y-B-X não pode hibridizar com a região B’ do Tradutor 2 porque ambos estão isolados em diferentes suportes sólidos. Quando a Entrada 1 se liga ao Tradutor 1 e libera Y- B-X em solução, Y-B-X pode, então, interagir com Tradutor 2. Portanto, a capacidade de Y-B-X e Tradutor 2 interagirem é condicional à presença da Entrada 1.

[0026] As fitas ligadas a uma superfície sólida interagem de forma extremamente lenta com fitas em outra superfície sólida devido a efeitos estéricos. Consequentemente, as fitas na fase de solução são os únicos componentes que podem interagir com os operadores de fase sólida.

[0027] O sequestro de chave de dedo e a troca de chave de dedo são abordagens diferentes que usam interações de emparelhamento semelhantes, mas com diferentes geometrias. Ambas podem realizar as mesmas operações como tradutores de fase sólida, mas funcionam mantendo alongamentos de sequência ligados em um duplex. Assim como no tradutor de fase sólida, um evento de deslocamento pode liberar a sequência de interesse. Para ambas as geometrias de chave de dedo, todas as fitas podem estar em solução em conjunto, por consequência do que os eventos de deslocamento são regulados pela disponibilidade de chaves de dedo, isto é, alongamentos curtos de sequências de ácido nucleico de fita simples que proporcionam um ponto de partida para um evento de deslocamento.

[0028] A Figura 2 mostra um tradutor sequestrado em chave de dedo semelhante àquele da Figura 1A, mas com base em chave de dedo em vez de sequestro em fase sólida. Neste exemplo, a região A’ do tradutor é a chave de dedo que liga a fita de entrada e permite que a reação de deslocamento de fita prossiga.

[0029] A Figura 2B mostra um sistema à base de chave de dedo tendo uma fita de entrada A-X-B interagindo com um duplex incompletamente emparelhado por base, “Tradutor 1”. A saída inclui um produto de resíduo, isto é, um duplex completamente emparelhado por base, B’-X’-A’/A-X-B, e “Saída 1” fita X-B-Y-C que pode ser usada como “Entrada 2” em uma reação posterior. A “Entrada 2” interage com o “Tradutor 2” e produz a “Saída 2” e outro produto de resíduo. Nesta figura, a região B de X-B-Y-C é sequestrada no Tradutor 1 por ser hibridizada a uma região B’ complementar e, portanto, incapaz de interagir com a região B’ do Tradutor 2. A capacidade de X-B-Y-C interagir com o Tradutor 2 é condicional à presença da Entrada 1 (A-X- B) no sistema.

[0030] As geometrias chave de dedo têm o potencial de ser muito úteis, mas sua utilização até a data de hoje tem sido limitada pela taxa na qual um sistema contendo tais geometrias de chave de dedo podem propagar informações. Isto é devido a limitações inerentes, presentes nas atuais abordagens sequestradas de chave de dedo, o que as desacelera abaixo de uma escala de tempo biologicamente útil. Esses gargalos cinéticos são resultado de reações improdutivas, denominadas aqui como choques de “chave de dedo” que ocorrem quando uma chave de dedo é ligada por uma molécula tendo uma sequência complementar ou “fita de choque” que não pode produzir uma reação de deslocamento.

[0031] A Figura 3A mostra um sistema de três tradutores de ácido nucleico sequestrados em chave de dedo muito similares àquele da Figura 2A. Se todas as três fitas estão em solução em conjunto, no entanto, existem outros eventos de ligação que podem ocorrer. A Figura 3B ilustra alguns dos eventos de ligação não produtivos ou choques que podem ocorrer. Ao envolver uma “molécula de choque de polinucleotídeo”, esses eventos não levam a uma reação de deslocamento, mas podem retardar o sistema, porque a incidência de uma fita de choque bloqueia as fitas de ligação que pode produzir uma reação de deslocamento.

[0032] As chaves de dedo podem ser mantidas curtas para mitigar o efeito destes choques no sistema: quanto menor a chave de dedo for mais rápida a taxa de associação/desassociação da sequência complementar pode ser. Assim, chaves de dedo de cinco ou seis nucleotídeos de comprimento são comuns porque, para estes comprimentos, se um evento de ligação não produtiva ocorrer, o tempo gasto no estado de fita dupla “de choque” é curto. Esta abordagem cria o gargalo cinético acima mencionado, no entanto, porque o evento de ligação produtiva é limitado pelos mesmos parâmetros termodinâmicos; daí a fita de entrada do mesmo modo não se liga fortemente a estas chaves de dedo. Por conseguinte, o deslocamento desejado nem sempre ocorre, quando a fita de entrada correta se liga, uma vez que ela necessita estar no estado ligado tempo suficiente para iniciar a reação de deslocamento. A utilização de chaves de dedo curtas aumenta, assim, a quantidade de tempo necessária para uma determinada operação ocorrer e produzir uma saída. Dito de outra maneira, a reação de deslocamento não pode ocorrer antes da ocorrência de muitos eventos de ligação, tanto por fitas de choque quanto por fitas desejadas. Esta ineficiência limita a utilidade do sistema retardando a propagação das informações para escalas de tempo que são demasiado longas para serem úteis.

[0033] De acordo com um aspecto da presente invenção, em virtude de modificação química da estrutura do ácido nucleico e/ou da molécula de deslocamento de polinucleotídeo, as interações produtivas são facilitadas. Isso torna possível encadear portas lógicas individuais juntas em redes de tamanho arbitrário para aplicações biológicas. Mais especificamente, é fornecido um enfoque para determinar como desfavorecer interações de choque e favorecer interações produtivas sem alterar o conteúdo de informação das sequências.

[0034] De acordo com a invenção, estas abordagens melhoram a termodinâmica de ligação para a fita desejada e/ou desfavorecem a termodinâmica para as fitas de choque, tudo sem alterar o teor da sequência. Em particular, utilizando estruturas quimicamente modificadas, a energia livre de Gibbs (ΔG) para a reação de hibridização dese-jada entre um oligonucleotídeo desejado e seu complemento de DNA ou RNA é reduzida e/ou o ΔG da interação de choque é aumentado. Em um nível molecular, estes correspondem, respectivamente, a uma ligação mais apertada (afinidade de ligação mais alta) de reação de hidridização desejada e a uma ligação menos apertada (afinidade de ligação mais baixa) para fitas de choque resultando da modificação das estruturas

[0035] O anterior desloca o equilíbrio para eventos de ligação desejados a chave de dedo em direção ao estado duplex (ligado), criando uma melhor chance para a reação de deslocamento ocorrer sem afetar o equilíbrio de ligação entre as fitas de chave de dedo de choque. O último desfavorece a ligação de fita(s) de choque, fazendo estas interações favorecem o estado não ligado. Estas duas modificações podem ser utilizadas separadamente ou em conjunto, a fim de favorecer a ligação da fita desejada e desfavorecer a ligação da(s) fita(s) de choque.

[0036] As modalidades de acordo com a invenção aproveitam o fato de que a taxa de reação de qualquer deslocamento de fita mediado por chave de dedo está relacionada com o favorecimento termodinâmico das duas fitas de ácido nucleico ou complexos sendo ligados. Ao fazer estas termodinâmicas mais favoráveis para eventos de ligação não de choque e/ou menos favoráveis para eventos de ligação de choque, pode- se conduzir o sistema em direção a reações de deslocamento produtivas. Isto acelerará a taxa à qual a informação é propagada para o ponto em que ela pode ser utilizada em escalas de tempo biologicamente relevantes. A abordagem da invenção aqui descrita faz isso através de modificações químicas em alongamentos de oligonucleotídeos no sistema.

[0037] Em virtude dessa modificação química da estrutura de ácido nucleico e/ou da molécula de polinucleotídeo, de acordo com a invenção, é alargada a faixa de concentração eficaz sobre a qual a reação é ótima. Isto acontece porque a percentagem de ácido nucleico em um duplex a uma dada temperatura é uma função da concentração e do ΔG da reação de hibridização. Assim, quanto mais concentrado um conjunto de oligonucleotídeos complementares é, tanto mais alta a percentagem de formação de duplex e, quanto mais baixo (mais favorável) o ΔG é, tanto mais alta a percentagem de formação de duplex. Alterar o ΔG para uma interação dada, por conseguinte, altera o duplex percentual a uma dada concentração. Baixar o ΔG (isto é, fazendo a interação mais favorável) significa que haverá uma mais alta percentagem de duplex a uma dada concentração, enquanto aumentar o ΔG (fazendo a interação menos favorável) significa que haverá uma percentagem mais baixa de duplex na mesma concentração. Este efeito aumenta a faixa de concentração ótima na qual estas reações podem ser usadas na prática, pois duplexes desejados podem ser formados em concentrações mais baixas e duplexes indesejáveis não serão formados em concentrações mais altas, em relação a um conjunto de referência de oligonucleotídeos não modificados.

[0038] Estes enfoques se aplicam a qualquer geometria de reação mediada por chave de dedo, incluindo, mas sem limitação, as reações de migração de ramo de 3 vias discutidas acima. Arquiteturas diferentes podem ser usadas para duplex incompletamente emparelhado por base onde ramificações ou alças estão localizadas em diferentes pontos na estrutura (ver a Figura 3C, por exemplo). A orientação das ramificações ou alças não é baseada na direcionalidade da fita. Assim, estas estruturas podem incluir (a) uma estrutura terminal, (b) uma alça interna ou (c) e (d) um complexo de múltiplas partes ou quaisquer outras arquiteturas possíveis para um duplex incompletamente emparelhado por base.

[0039] Estas estruturas de ácido nucleico podem traduzir uma sequência de “entrada” ativa (o polinucleotídeo de deslocamento) em uma sequência de “saída” ativa (o polinucleotídeo que é liberado).

[0040] As estruturas de ácido nucleico chamadas “tradutores” acima podem estar no seu mínimo termodinâmico respectivo, isto é, elas são as estruturas mais estáveis que o conjunto específico de sequências de ácido nucleico pode formar. Estas estruturas podem ser formadas por tratamento térmico das duas ou mais fitas de ácido nucleico individuais. Por exemplo, todas as fitas podem ser misturadas em conjunto, aquecidas bem acima do ponto de fusão de qualquer estrutura a formar e, em seguida, lentamente resfriadas. Isto permite que as fitas hibridizem no estado de energia mais baixo possível (mínimo termodinâmico).

[0041] Este procedimento pode ser o mesmo para ácidos nucleicos naturais, como DNA e RNA, ácidos nucleicos com estruturas modificadas, açúcares ou bases e para quimeras compostas de ácidos nucleicos naturais e modificados.

[0042] A incorporação seletiva de modificações químicas específicas pode favorecer a ligação de fitas capaz de reações de deslocamento produtivas sobre eventos de ligação de choque de chave de dedo. Por exemplo, a Figura 4 mostra as mesmas fitas das Figuras 3A e 3B. No entanto, se determinados alongamentos de ácidos nucleicos são substituídos por análogos modificados quimicamente que melhoram a termodinâmica de ligação, a cinética para choques desloca em favor das reações de deslocamento. Por exemplo, se o alongamento “B” de oligonucleotídeos na fita X-B-Y-C (circulada com uma linha sólida) tem uma afinidade de ligação mais alta para B’ do que o alongamento “B’’ de oligonucleotídeos na fita A-X-B, o equilíbrio se desloca a favor da reação de deslocamento de fita produtiva, o que aumenta a probabilidade ou a frequência com que esta reação ocorre. Ambos os B’s têm a mesma sequência de emparelhamento de base Watson-Crick, mas a interação entre X-B-Y-C e a chave de dedo B’ é mais favorável devido a modificações químicas.

[0043] Da mesma forma, se certos alongamentos de ácidos nucleicos são substituídos por análogos que desfavorecem a ligação, o equilíbrio se deslocará para longe dos choques também. Por exemplo, se “B” na fita A-X-B (circulada com uma linha tracejada) tem uma ligação mais baixa para B’ do que para B’’ em X-B-Y-C, então, o equilíbrio se deslocará para longe do choque de chave de dedo, melhorando a cinética para uma reação de deslocamento de fita.

[0044] Ambas as abordagens aceleram a velocidade à qual uma rede de ácido nucleico pode processar sinais, porque ambas aumentam do tempo de residência da fita desejada na chave de dedo em relação ao tempo de residência da fita ou das fitas de choque. Isto proporciona uma chance melhor de que a reação de deslocamento de fita ocorra num determinado período de tempo e, portanto, aumenta a velocidade à qual a rede avalia uma determinada entrada ou conjunto de entradas. Estas modificações não foram anteriormente utilizadas para facilitar ou desfavorecer reações de deslocamento, para construir portas lógicas de DNA significativas e redes ou para propagar informações.

[0045] Há muitas modificações de ácido nucleico bem caracterizadas que podem ser utilizadas de acordo com modalidades da invenção para melhorar ou reduzir as propriedades termodinâmicas de ligação a DNA ou RNA naturais. Estes incluem alterações na estrutura, açúcar ou nucleobase do oligonucleotídeo. Estas modificações também podem ser utilizadas separadamente ou em conjunto entre si; isto é, o uso de uma estrutura modificada não exclui a utilização de uma nucleobase modificada na mesma fita.

[0046] Os análogos de estrutura de ácido nucleico podem ser usados para melhorar a ligação de fitas capazes de produzir uma reação de deslocamento. Há inúmeros análogos diferentes que poderiam ser utilizados, todos os quais oferecem afinidades de ligação mais apertadas a DNA e RNA do que ácidos nucleicos naturais. Estes análogos incluem, mas, sem limiitação, aqueles com estruturas não carregadas (ácidos nucleicos peptídicos ou fosforodiamidatos), estruturas com carga positiva (ácidos nucleicos peptídicos de guanidínio) e grupos de ligação a hidrogênio que permitem a pré-organização (ácidos nucleicos peptídicos gama).

[0047] As estruturas gerais para certos análogos são mostradas na Figura 5. Estes análogos todos melhoram a termodinâmica de reações de hibridização de ácido nucleico, permitindo a ligação de chave de dedo mais apertada e, por conseguinte, o deslocamento mais rápido. Ao utilizar estes análogos em locais específicos da rede lógica, as reações de deslocamento desejadas podem ser fortemente favorecidas em comparação com as interações de choque, acelerando, deste modo, a taxa de processamento de informação.

[0048] A utilização de anéis de açúcar modificados também pode alterar a termodinâmica de ligação a DNA ou RNA para um oligonucleotídeo. Os análogos mais amplamente utilizados são morfolinos, ácidos nucleicos travados (LNAs) e derivados de LNA. Outros açúcares modificados estão documentados na literatura que também poderiam produzir um resultado semelhante em termos de alterar a ligação termodinâmica. Ilustrativos destes são açúcares com modificações nas posições 1’, 2’, 3’ ou 4’ e açúcares com diferentes átomos usados em lugar do oxigénio do anel de ciclopentano de ribose. Estes análogos são ilustrados na Figura 6.

[0049] As modificações de nucleobase também podem ser utilizadas para alcançar o mesmo efeito que análogos de estrutura e açúcar; a saber, alterar a termodinâmica de reações de hibridização específicas. Estas bases incluem metilcitosina, diaminopurina, G- grampo e fenoxazina (Figura 7), todos os quais melhoram a afinidade de ligação de uma fita para seu complemento inverso. Outra oportunidade que existe com modificação de nucleobase envolve bases pseudo complementares. Esta classe de análogos de bases forma pares de bases fracas entre si, mas forma pares de bases fortes com bases padrões. Um par desses é 2-aminoadenina (nA) e 2-tiotimina (sT). Estas bases poderiam ser utilizadas para favorecer uma ligação de fita, embora desfavorecendo outra, um exemplo de aumentar a probabilidade de um evento de ligação produtiva, embora diminuindo a probabilidade de um choque ao mesmo tempo.

[0050] Outra modificação química que poderia ser usada para alterar a termodinâmica de interações de ligação é a incorporação de polímeros carregados, tal como quitosana, a qual demonstrou na literatura acelerar a velocidade de reações de deslocamento. No entanto, uma vez que estes polímeros aceleram reações não especificamente, eles teriam que ser utilizados em conjugação com uma das outras modificações mencionadas acima, para permitir discriminação entre eventos de ligação desejados e indesejados.

[0051] Diferentes abordagens podem ser utilizadas para sintetizar as moléculas com as modificações químicas discutidas acima. Por exemplo, a química da estrutura pode ser levada em consideração da concepção das moléculas modificadas. Química da estrutura é o que é usado para juntar monômeros individuais em uma fita mais longa. Modificações que envolvem a nucleobase ou o açúcar, mas que mantêm a estrutura de fosfodiéster natural do DNA/RNA, podem ser sintetizadas através de química de fosforamidato padrão, como empregada para monômeros naturais. Ilustrações destes métodos encontram-se, por exemplo, em Beaucage, S. e R. Iyer, Tetrahedron 48: 2223 (1992), em Brown, D. M. A, “Brief history of oligonucleotide synthesis”, 20 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (Protocols of Oligonucleotides and Analogs) 1-17 (1993), em Reese, Colin B., Organic & Biomolecular Chemistry 3: 3851 (2005), e em Iyer, R. P., e S. L. Beaucage, “7.05. Oligonucleotide synthesis” 7 COMPREHENSIVE NATURAL PRODUCTS CHEMISTRY (DNA and Aspects of Molecular Biology) 105-52 (1999), cujos conteúdos respectivos são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[0052] Se a estrutura está sendo mudada em uma modificação particular, será empregada química diferente. Tal química de modificação é geralmente conhecida na literatura científica. Assim, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) e seus derivados dependem de ligações amida para ligar os monômeros individuais juntos. Em vez de utilizar química da fosforamidito, por conseguinte, as fitas destes monômeros são feitas com condições de formação de ligação amida e os reagentes de acoplamento como HBTU. Uma exploração dos métodos utilizados para fazer oligonucleotídeos PNA ou similares a PNA pode ser encontrada, por exemplo, em F. Beck, “Solid Phase Synthesis of PNA Oligomers”, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY SERIES (Peptide Nucleic Acids), Humana Press, http://www.springerlink.com/content/ mr571738x7t65067/.

[0053] Outro enfoque de modificação de estrutura envolve oligonucleotídeos quiméricos. Estes são fitas de oligonucleotídeo que contêm químicas de estrutura diferentes na mesma molécula. Por exemplo, se alguém precisava de uma fita que era metade estrutura PNA e metade estrutura DNA, seria preciso uma maneira de juntar essas duas químicas de estrutura diferentes. Fazer estas fitas quiméricas também é geralmente conhecido na arte. No exemplo acima de uma quimera PNA/DNA, a diferença nas químicas pode ser superada usando DNA modificado ou monômeros PNA. Para DNA, a hidroxila protegida por 5’-dimetoxitritil (DMT) é substituída por uma amina protegida por monometoxitritil (MMT) que pode reagir com o ácido carboxílico de um PNA após desproteção. Para PNA, o nitrogênio N- terminal protegido é substituído por uma hidroxila protegida por DMT que pode reagir com o grupo fosforamidito no DNA após desproteção. Estas abordagens são mais descritas em E. Uhlmann, et al., Angew. Chem. (Int'l ed.) 37: 2796-823 (1998), por exemplo.

[0054] Todas essas modificações, quer utilizadas individualmente ou em conjunto uma com a outra, podem afetar as condições termodinâmicas de interações específicas em uma rede de ácido nucleico arbitrária, de modo que a ligação de fitas desejadas ou complexos é favorecida sobre interações de choque sem alterar o conteúdo de sequência . Todas estas interações podem se aplicar a qualquer reação de migração mediada por ramo, quer elas sejam migrações de ramo de 3 vias, tal como sequestro em fase sólida, sequestro de chave de dedo ou troca de chave de dedo, ou sejam migrações de ramo que ocorrem por outros mecanismos, por exemplo, migração de ramo de quatro vias, migração de ramo acelerada de quatro vias ou migração complexa de múltiplas fitas.

[0055] De acordo com algumas modalidades, a cinética das moléculas quimicamente modificadas para reação de migração de ramo melhorada pode ser testada. Uma abordagem é medir a melhoria que diferentes modificações fornecem na aceleração ou no retardo da reação de migração de ramo versus um polinucleotídeo natural utilizando um ensaio de cinética de fluorescência (ver Figura 8, por exemplo). Aqui, a estrutura de tradutor tem um extintor em uma fita e um fluoróforo na outra. Na ausência da fita de deslocamento, a fluorescência do fluoróforo é extinta proporcionando uma linha de base para a reação. Quando a molécula de deslocamento, que pode ser modificada nas regiões de chave de dedo e/ou não chave de dedo, é adicionada ao tradutor, ela deslocará a fita com o extintor e, ao fazê-lo, produz um sinal fluorescente. Portanto, a taxa de fluorescência “ligada” no sistema indica a cinética da reação de deslocamento. Este ensaio pode ser tornado mais complexo, exigindo um maior circuito para avaliar antes que uma reação de deslocamento produtor de fluorescência final ou fitas de choque pudessem ser adicionados para competir com a fita de deslocamento para a chave de dedo.

[0056] Os enfoques de acordo com a invenção também podem ser aplicados a quaisquer moléculas, naturais ou artificiais, que são adequadas para propagar informação, desde que uma primeira molécula e uma segunda molécula estejam envolvidas, com a última configurada para ligar com a primeira. Pelo menos uma da primeira e da segunda moléculas, respectivamente, tem uma modificação química em relação a uma molécula de referência que tem o mesmo conteúdo de sequência que a primeira molécula ou a segunda molécula, como seja o caso. A modificação faz que a ligação tenha uma energia livre diferente daquela de uma ligação de referência entre a molécula de referência e a primeira ou a segunda moléculas, de modo que pelo menos um dos seguintes é realizado no sistema: uma probabilidade de uma ligação produtiva é elevada; ou uma probabilidade de uma ligação improdutiva é reduzida.

[0057] De acordo com a invenção, como indicado acima, um processo de etapas múltiplas pode ser empregado para atingir uma rede de ácido nucleico melhorada. Isto implicaria examinar a rede inteira de tradutores de ácido nucleico em consideração, incluindo quaisquer interações de choque e, em seguida, identificar os alongamentos de sequência que precisam ser modificados, a fim de melhor facilitar eventos de deslocamento e minimizar choque.

[0058] Com respeito a qualquer dada reação de deslocamento de fita, estas modificações podem ser feitas na molécula de deslocamento desejada, na molécula de choque ou em ambas. Isto é assim porque, para qualquer tradutor ou porta lógica com uma chave de dedo disponível, haverá uma competição entre a molécula de deslocamento desejada e qualquer molécula de choque para ligar a chave de dedo. Além disso, aumentando a capacidade da molécula de deslocamento de ligar a chave de dedo em relação à molécula de choque se aumentará a velocidade à qual a reação de deslocamento ocorre. Assim, aumentando a capacidade da molécula de deslocamento de se ligar (abaixando o ΔG de ligação) ou diminuindo a capacidade da(s) molécula(s) de choque de se ligar (elevando o ΔG de ligação) terá o efeito de aumentar a velocidade da reação. Uma vez que ambas estas mudanças em ΔG podem ser realizadas através de modificações químicas, de acordo com a invenção, é importante quando considerar quais alongamentos de sequência modificar que se explore a possibilidade de modificar a molécula de deslocamento sozinha, a molécula de choque sozinha e ambas juntas.

[0059] De acordo com modalidades da invenção, dois parâmetros que podem ser variados nesta análise são (i) as constantes de velocidade para a interação entre quaisquer dois oligonucleotídeos, e (ii) o comprimento das chaves de dedo para todos os oligonucleotídeos na rede. O parâmetro anterior seria ditado pela composição química do oligonucleotídeo e o ΔG de suas interações com outros oligonucleotídeos. O último parâmetro seria o número de nucleotídeos na região de chave de dedo da sequência em consideração.

[0060] As constantes de velocidade cinética necessárias para modelar uma rede de ácido nucleico podem ser calculadas a partir do ΔG de hibridização entre quaisquer dois oligonucleotídeos. Para as bases naturais e muitas das modificações, estes valores, que vêm de parâmetros vizinhos mais próximos, foram relatados na literatura. Se eles já não forem conhecidos, eles podem ser determinados experimentalmente através de análise de Van’t Hoff de dados de temperatura de fusão, calorimetria de varredura diferencial ou calorimetria de titulação isotérmica. Cada um destes métodos daria os parâmetros termodinâmicos para a interação de ácido nucleico em causa, que podem então ser usados para determinar o ΔG da reação a qualquer temperatura. O valor do ΔG então seria usado para determinar a constante de equilíbrio (Keq) da interação. A constante de equilíbrio seria proporcional à razão de constantes de velocidade; portanto, se poderia utilizar constantes conhecidas para resolver para a constante de taxa cinética necessária para uma dada reação.

[0061] Assim, o conjunto completo de constantes de velocidade seria obtido para as modificações em consideração para utilização em uma rede lógica de ácido nucleico junto com os comprimentos para todas as chaves de dedo. Com esta informação, o sistema poderia ser modelado para determinar o comportamento do curso de tempo da rede, e também para determinar onde modificações específicas poderia ser utilizadas para otimizar as reações de deslocamento produtivas em relação a interações de choque. Além disso, o comprimento de regiões de chave de dedo específicas poderia ser variado no modelo. A rede seria otimizada variando modificações em locais específicos e simulando as reações na rede com chaves de dedo de comprimento diferente. Estes cálculos seriam empregados para determinar a modificação ótima e o comprimento de chave de dedo para cada componente que produz o comportamento de curso de tempo mais favorável da rede.

[0062] A rede também poderia ser otimizada mudando experimentalmente as modificações e os comprimentos de chave de dedo e, então, estudando o comportamento de curso de tempo no laboratório, em oposição a simular o comportamento com um modelo matemático.

[0063] Dada uma rede totalmente otimizada, os oligonucleotídeos necessários poderiam ser sintetizados com química de fosforamidito padrão, ou com o(s) enfoque(s) relatado(s) na literatura para modificações específicas. Qualquer tradutor ou estrutura de porta que consiste em mais do que um oligonucleotídeo poderia ser construído misturando em conjunto os oligonucleotídeos individuais e depois recozendo-os, primeiro aquecendo a mistura até acima da temperatura de fusão de todos os duplexes possíveis e, em seguida resfriando-a lentamente. Isto faria que os oligonucleotídeos hibridizassem, formando a estrutura mais estável que o conjunto específico de sequências de ácido nucleico pode adotar. Estas estruturas podem, então, ser purificadas antes de serem utilizadas na rede. Uma vez que todos os tradutores, portas e outros componentes são concebidos, sintetizados e recozidos, a rede pode ser aplicada ao sistema de ensaio alvo, diagnóstico ou biológico.

[0064] Embora modalidades particulares da presente invenção tenham sido discutidas, elas são meramente ilustrativas e não restritivas da invenção. Uma revisão deste Relatório Descritivo tornará muitas variações da invenção evidentes para os especialistas no campo da invenção. O escopo completo da invenção deve ser determinado com referência tanto às Reivindicações abaixo, juntamente com a sua faixa completa de equivalentes, quanto ao Relatório Descritivo com essas variações. Publicações Citadas

[0065] As seguintes publicações podem auxiliar a compreensão ou a prática das modalidades da invenção. Cada publicação citada é incorporada por referência na sua totalidade. (1) Picuri, J. M.; Frezza. B. M.; Ghadiri, M. R. J Am Chem Soc2009. /.?/, 9368-77. (2) Li, Q.; Luan, G.; Guo, Q.; Liang, J. Nucleic Acids Res2002, 30,E5. (3) Zhang, D. Y.; Turberfield, A. J.; Yurke, B.; Winfree, E. Science2007, 318,1121-5. (4) Frezza, B. M.; Cockroft, S, L.; Ghadiri, M. R, J Am Chem Soc2007, 129, 14875-9. (5) Voclckcr, N. 11.; Guckian, K. M.; Saghatclian, A.; Ghadiri, M. R. Small2008, 4,427-31. (6) Yashin, R.; Radchenko, S.; Stojanovic, M. N../Am Chem Soc2007,129, 15581-4. (7) Seelig, G.; Soloveichik, D.; Zhang, D. Y.; Winfree, E. Science2006. 314,1585-8. (X) Zhang, D. Y.; Winfree, E. J Am Chem Soc2009. 131,17303-14. (9) Biswas, I.; Yamamoto, A.; Hsieh, P.J Mol Biol1998, 279, 795-806. (10) Panyutin, I. G.; Hsieh, P.J Mol Bio!1993. 230,413-24. (11) Panyutin, I. G.; Hsieh, P. Proc Natl Acad Sci USA1994, 91, 2021-5. (12) Maugh. T. H„ 2nd Science1982, 217, 719-720. (13) Tajima, T.; Nakajima, A. Journal of the. American Chemical Society2008. 130, 10496-7. (14) Voit, B. Angew Chem Int Ed Engl2006, 45,4238-40. (15) Kahan, M.; Gil, B.; Adar, R.; Shapiro, E. Physica D-Nonlinear Phenomena2008. 237,11651172. (16) Nielsen, P. E.; Egholm, M. Curr Issues Mol Biol1999. /, 89-104. (17) Dragulcscu-Andrasi, A.; Zhou, P ; He, G.; Ly, D. H. Chem Commun (Camb)2005, 244-6. (18) Sahu, B.; Chenna, V.; Lathrop, K. L.; Thomas, S. M.; Zon, G.; Livak. K. J.; Ly, D. H. J Org Chem INF), 74,1509-16. (19) Zhou, P.; Wang, M.; Du, L.; Fisher, G. W.; Waggoner. A.; Ly, D. H. J Am Chem Soc2003, 125,6878-9. (20) Dragulcscu-Andrasi, A.; Rapireddy, S.; Frezza, B. M.; Gayathri, C.; Gil, R. R.; Ly, D. H. J Am Chem Soc2006, 128,10258-67. (21) Frcicr, S. M.; Altmann, K. H. Nucleic Acids Research1997, 25,4429-4443. (22) Braasch. D. A.; Corey, D. R. Chemistry &Biology2001, 8, 1-7. (23) Summerton, J.; Weller, D. Antisense &Nucleic Acid Drug Development1997, 7, 187-195. (24) Ortega, J. A.; Blas, J. R.; Orozco, M.; Grandas, A.; Pedroso, E.; Robles, J. Org Lett2007. 9, 4503-6. (25) Kutyavin, I. V.; Rhinehart, R. L.; Lukhtanov, E. A.; Gorn, V. V.; Meyer, R. B., Jr.; Gamper, H. B„ Jr. Biochemistry1996, 35,11170-6. (26) Lee, D.; Singha, K.; Jang, M. K.; Nah, J. W.; Park, I. K.; Kim, W. J. Mol Biosyst2009. 5, 391-6. (27) Patente dos EUA No. 7.538.202. (28) Publicação do pedido de patente dos EUA. No. (29) Publicação do pedido de patente dos EUA. No. 2007/0072215. (30) Publicação do pedido de patente dos EUA. No. 2009/0191546.

Claims

1. Método Para Incorporar Modificações Químicas em Moléculas de Ácido Nucleico em Reação de Deslocamento de Fita Para Favorecer Interações Produtivas e Desfavorecer Interações de Choque, caracterizado por que: (1) identifica moléculas de ácido nucleico em uma reação de deslocamento de fita que compreende (i) uma fita de ácido nucleico de entrada compreendendo um primeiro fragmento (A) e um segundo fragmento (B); (ii) um duplex alvo de ácido nucleico incompletamente emparelhado por base compreendendo uma primeira fita e uma segunda fita, em que a primeira fita compreende um primeiro fragmento (B’) e um segundo fragmento (A’), a segunda fita compreende um primeiro fragmento (B) e um segundo fragmento (C), e o duplex alvo compreende uma região duplex formada por pares de bases entre B e B’e duas regiões de fita simples, A’ e C e em que a fita de entrada pode ligar-se à primeira fita do duplex alvo sob condições de hibridação para invocar uma reação de deslocamento da fita para produzir um duplex de saída formado entre a fita de entrada (A - B) e a primeira fita do duplex alvo (B’ - A’), e (iii) um duplex de choque de ácido nucleico incompletamente emparelhado por base compreendendo uma primeira fita e uma segunda fita, em que a primeira fita compreende um primeiro fragmento (C’) e um segundo fragmento (B’), a segunda fita compreende um primeiro fragmento (C) e um segundo fragmento (D), e o duplex de choque compreende uma região duplex formada pelo emparelhado por base entre C e C’ e duas regiões de fita simples B’ e D, em que a segunda fita do duplex alvo pode se ligar à primeira fita do duplex de choque sob condições de hibridação para invocar uma reação de deslocamento de fita para produzir um duplex de saída formado entre a segunda fita do duplex alvo (B - C) e a primeira fita do duplex de choque (C’ - B’) e em que o segundo fragmento (B) da fita de entrada pode se ligar à região de fita simples B’ do duplex de choque sob condições de hibridação; e então, (2) sintetiza, em uma solução aquosa, variantes das moléculas de ácido nucleico identificadas na reação de deslocamento da fita que difere desta última por (i) uma incorporação no primeiro fragmento (B) da segunda fita do duplex alvo, uma primeira modificação química que causa a ligação com o segundo fragmento (B’) da primeira fita do duplex de choque para ter uma energia livre de hibridização reduzida e/ou (ii) uma incorporação no segundo fragmento (B) da fita de entrada, uma segunda modificação química que faz com que a ligação com o segundo fragmento (B’) da primeira fita do duplex de choque tenha uma energia livre de hibridação aumentada, de modo que o primeiro fragmento (B) da segunda fita do duplex alvo, em comparação com o segundo fragmento (B) da fita de entrada, liga-se ao segundo fragmento (B’) da primeira fita do duplex de choque para formar uma região duplex mais estável, em que as variantes desfavorecem a hibridação entre a fita de entrada e o duplex de choque, em que a primeira ou segunda modificação química é selecionada a partir do grupo que consiste em (i) substituir a estrutura de açúcar-fosfodiéster dos referidos nucleotídeos por uma estrutura de pseudo peptídeo, (ii) modificar a fração de açúcar dos referidos nucleotídeos e (iii) substituir um análogo para a base nitrogenosa de pelo menos um dos referidos nucleotídeos.

2. Método Para Incorporar Modificações Químicas em Moléculas de Ácido Nucleico em Reação de Deslocamento de Fita Para Favorecer Interações Produtivas e Desfavorecer Interações de Choque, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que que as variantes compreendem a primeira modificação química.

3. Método Para Incorporar Modificações Químicas em Moléculas de Ácido Nucleico em Reação de Deslocamento de Fita Para Favorecer Interações Produtivas e Desfavorecer Interações de Choque, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as variantes compreendem a segunda modificação química.

4. Método Para Incorporar Modificações Químicas em Moléculas de Ácido Nucleico em Reação de Deslocamento de Fita Para Favorecer Interações Produtivas e Desfavorecer Interações de Choque, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a primeira ou segunda modificação química compreende substituir a estrutura de açúcar-fosfodiéster dos referidos nucleotídeos por uma estrutura de pseudo peptídeo na qual é incorporado um grupo funcional de guanidínio.

5. Método Para Incorporar Modificações Químicas em Moléculas de Ácido Nucleico em Reação de Deslocamento de Fita Para Favorecer Interações Produtivas e Desfavorecer Interações de Choque, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a primeira ou segunda modificação química compreende substituir um análogo de citosina tricíclico pela base nitrogenosa de pelo menos um dos referidos nucleotídeos.

6. Método Para Incorporar Modificações Químicas em Moléculas de Ácido Nucleico em Reação de Deslocamento de Fita Para Favorecer Interações Produtivas e Desfavorecer Interações de Choque, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a primeira ou segunda modificação química compreende introduzir um heteroátomo na posição 2’ da referida fração de açúcar.

7. Método Para Incorporar Modificações Químicas em Moléculas de Ácido Nucleico em Reação de Deslocamento de Fita Para Favorecer Interações Produtivas e Desfavorecer Interações de Choque, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a reação de migração de ramo compreende um deslocamento de fita mediado por chave de dedo.

8. Sistema Molecular à Base de Ácido Nucleico, para realizar uma reação de migração de fita, conforme pleiteado na Reivindicação 1, caracterizado por que: (i) uma fita de ácido nucleico de entrada compreende um primeiro fragmento (A) e um segundo fragmento (B); (ii) um duplex alvo de ácido nucleico incompletamente emparelhado por base, compreendendo uma primeira fita e uma segunda fita, em que a primeira fita compreende um primeiro fragmento (B’) e um segundo fragmento (A’), em que a segunda fita compreende um primeiro fragmento (B) e um segundo fragmento (C) e o duplex alvo compreende uma região duplex formada pelo emparelhamento por base entre B e B’ e duas regiões de fita simples, A’ e C e em que a fita de entrada pode ligar-se à primeira fita do duplex alvo sob condições de hibridação para invocar uma reação de migração da fita para produzir um duplex de saída formado entre a fita de entrada (A - B) e a primeira fita do duplex alvo (B’-A’); e (iii) um duplex de choque de ácido nucleico incompletamente emparelhado por base, compreendendo uma primeira fita e uma segunda fita, em que a primeira fita compreende um primeiro fragmento (C’) e um segundo fragmento (B’), em que a segunda fita compreende um primeiro fragmento (C) e um segundo fragmento (D) e o duplex de choque compreende uma região duplex formada pelo emparelhamento por base entre C e C’ e duas regiões de fita simples B’ e D, em que a segunda fita do duplex alvo pode se ligar à primeira fita do duplex de choque sob condições de hibridação para invocar uma reação de migração de fita para produzir um duplex de saída formado entre a segunda fita do duplex alvo (B - C) e a primeira fita do duplex de choque (C’ - B’) e em que o segundo fragmento (B) da fita de entrada pode se ligar à região de fita simples B’ do duplex de choque sob condições de hibridação, em que o primeiro fragmento (B) da segunda fita do duplex alvo compreende uma primeira modificação química, em relação a um ácido nucleico natural, que faz com que a ligação com o segundo fragmento (B’) da primeira fita do duplex de choque tenha uma energia livre de hibridação diminuída e/ou o segundo fragmento (B) da fita de entrada compreende uma segunda modificação química, em relação a um ácido nucleico natural, que faz com que a ligação com o segundo fragmento (B’) da primeira fita do duplex de choque tenha uma energia livre de hibridação aumentada. de modo que o primeiro fragmento (B) da segunda fita do duplex alvo, em comparação com o segundo fragmento (B) da fita de entrada, se ligue ao segundo fragmento (B’) da primeira fita do duplex de choque para formar uma região duplex mais estável, em que a primeira ou a segunda modificação química é selecionada a partir do grupo que consiste em (i) substituir a estrutura de açúcar-fosfodiéster dos referidos nucleotídeos por uma estrutura de pseudo peptídeo, (ii) modificar a fração de açúcar dos referidos nucleotídeos e (iii) substituir um análogo para a base nitrogenosa de pelo menos um dos referidos nucleotídeos.

9. Sistema Molecular à Base de Ácido Nucleico, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que a primeira ou a segunda modificação química compreende substituir a estrutura de açúcar- fosfodiéster dos referidos nucleotídeos por uma estrutura de pseudo peptídeo na qual é incorporado um grupo funcional de guanidínio.

10. Sistema Molecular à Base de Ácido Nucleico, de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por que a primeira ou a segunda modificação química compreende substituir um análogo de citosina tricíclico pela base nitrogenosa de pelo menos um dos referidos nucleotídeos.

11. Sistema Molecular à Base de Ácido Nucleico, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que a reação de migração de fita compreende um deslocamento de fita mediado por chave de dedo.