BR112012025121B1

BR112012025121B1 - kit para detecção de vírus do papiloma humano

Info

Publication number: BR112012025121B1
Application number: BR112012025121-0A
Authority: BR
Inventors: Maria Luisa Villahermosa Jaen; Ana Isabel Moraga Quintanilla
Original assignee: Genomica S.A.U.
Priority date: 2010-03-24
Filing date: 2010-04-28
Publication date: 2021-01-05
Also published as: WO2011116797A1; CA2793993A1; ES2372840B1; EP2550372B1; MX2012010039A; BR112012025121B8; BR112012025121A2; ES2372840A1; EP2550372A1; DK2550372T3; CA2793993C

Abstract

KIT PARA DETECÇÃO DE VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO. A presente invenção baseia-se em uma sonda de DNA que permite a detecção específica do tipo 33 do vírus papiloma humano (HPV), enquanto evita a detecção não-específica do tipo 31 de HPV. Além disso, a presente invenção refere-se a um microssistema de sondas de DNA, que contém a sonda da presente invenção, a um kit para a detecção de HPV que compreende tal microssistema, bem como ao uso de sonda de DNA acima mencionada, microssistema ou kit, que compreende a sonda de DNA, para a detecção de HPV presente em uma amostra.

Description

Antecedentes da Invenção

Vírus do Papiloma Humano (HPV) é um dos agentes 5 étiòlógícos de câncer do colo do útero (colo do útero), sendo o agente causador da doença sexual mais frequente em mulheres (Bosch et al., 1995, J. Natl. Cancer Inst., 87: 796-802). Nos últimos anos, a infecção por HPV foi determinada como sendo a principal causa de câncer do colo 10 do útero e da neoplasia do colo do útero intra-epitelial (Walboomers et al., 1999, J. Path., 189:12-19, Bosch et al., 2002, J. Clin. Pathl., 55:244-265).

Cerca de 30 tipos de HPV são transmitidos sexualmente e produzem infecção anogenital, esses tipos qúe estão sendo 15 classificados em dois grupos de risco de acordo com a sua associação com o câncer do colo do útero (Dunne et al., 2007, MMA, 297(8); Munoz et al., 2003, N. Engl J. Med., 348(6):518-527): altos e baixos grupos oncõgênicos, respectivamente. Uma identificação precisa dos tipos de HPV 20 que causam uma infecção é um problema principal quando o tratamento médico mais adequado é para ser determinado.

De todos os tipos de HPV, os que apresentam a taxa de malignidade mais elevada são os tipos 16, 18, 31 e 33 (Berkhof et al., 2006, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. , 15 (7):1268-73). Além disso, todas as evidências epidemiológicas apontam para a existência de uma relação direta entre esses tipos de HPV e o desenvolvimento do câncer do colo do útero (LARC Monographs on the evaluation 5 of carcinogenics risk to humans. Human Papillomaviruses. Vol. 90. Lyon: Internacional Agency for Research on Cancer, 2007).

Outros estudos indicam que os tipos de HPV 31 e 33 são, juntamente com os tipos 16 e 18, alguns dos tipos mais 10 abundantes nos casos de HSIL (alto grau de lesões intraepiteliais escamosas) e SCC (carcinoma de células escamosas do colo do útero) (Clifford et al., 2003, British Journal of Cancer 89, 101-105).

As técnicas moleculares mais sensiveis e mais 15 frequentemente utilizadas para a detecção do HPV são baseadas na Reação em Cadeia de Polimerase ou PCR; as duas reações de consenso de PCR mais comumente utilizadas são as chamadas MY-PCR, e a sua variante PG-MY, que contém o conjunto de iniciadores de amplificação MY11, MY09 e HMB01 20 (Manos et al., 1989, Cancer Cells, 7:209-214., Hildesheim et al., 1994, J. Infect. Dis., 169:235-240; Gravitt et al., 2000, J. Clin. Microbiol., 38 (1): 357-361), bem como a uma chamada GP-PCR, que contém o conjunto de iniciadores GP5 + /GP6+ (de Roda et al., 1995, J. Gen. Virol., 76:1057- 1062, Jacobs et al., 1995, J. Clin. Microbiol., 33:901-905; Jacobs et si., 1997, J. Clin. Microbiol., 35:791-795).

Uma vez que a presença dó HPV foi detectada em uma amostra por meio de uma reação de amplificação, a 5 necessidade de descrever surge. Várias técnicas têm sido utilizadas com este fim, tais como a sequenciação de DNA, a análise com enzimas de restrição e, finalmente, as técnicas que se baseiam nã hibridizaçâo dos produtos de PCR com sondas complementares imobilizadas em superficies 10 diferentes (Jacobs et al., 1995, J. Clin. Microbiol., 33:901-905).

Um meio de diagnóstico e definição do HPV é descrito no documento WO 2007/017699. De acordo com este método, uma reação de amplificação por PCR com base em iniciadores MY- 15 PCR é realizada, seguida pela definição através de hibridizaçâo do produto de PCR com um microssistema de sondas tipo especificas para uma grande variedade de tipos de HPV, tanto de alto e baixo risco oncogênico.

Métodos descritos na técnica dependem da utilização de 20 sondas especificas para a detecção de tipos específicos do HPV. Por conseguinte, deve ser assegurado que as sondas utilizadas para a detecção hibridizam especificamente com o tipo de HPV alvo e hibridizaçâo cruzada para tipos nâo- específicos que devem ser evitados. No entanto, como se mostra no presente documento, quando se utiliza sondas conhecidas na técnica, a hibridizaçâo cruzada ocorre, não sendo este comportamento baseado nas razões de sequência. Especificaménte, as sondas destinadas â detecção específica 5 do genótipo 33 do HPV mostraram hibridizaçâo cruzada para o tipo 31 do HPV.

A invenção aqui descrita é destinada a atenuar as deficiências do estado da técnica.

Sumário da Invenção

A invenção se refere ao fornecimento de uma sonda de ácido nucléico que compreende ou consiste na sequência CTGTCACTAGTTACTTGTGTGCA (5'-3') (SEQ ID NO 3). Como explicado mais adiante no presente documento, as sondas para a detecção do tipo 33 de HPV conhecidas na técnica mostram hibridizaçâo ao tipo 31 de HPV, assim conduzindo a falsos positivos. Os inventores verificaram surpreendentemente que a sequência de ácido nucléico como definida na SEQ ID NO 3 é apenas a sonda de um conjunto de sondas de características similares que hibridiza 20 especificãmènte para o tipo 33 de HPV e não hibridiza de forma cruzada ao tipo 31 de HPV, ou a outros genótipos com uma sequência similar. Assim, a sonda como definida na SEQ ID NO 3 fornece uma solução para o problema de hibridizaçâo não-específica de uma sonda destinada para a detecção do tipo 33 de HPV para o tipo 31 de HPV,

Com a sonda de ácido nucléico, como definida na SEQ ID NO 3, ver também a Tabela 1), a hibridização não-específica 5 para o genótipo 31 do HPV é evitada, assim como a hibridização não-específica para outros genótipos de HPV de uma sequência similar. Ao mesmo tempo, a hibridização especifica do tipo 33 de HPV é atingida.

Outras sondas recém-concebidas que foram concebidas 10 seguindo os mesmos critérios como aqueles para a concepção dé sonda da SEQ ID NO 3 (em particular, as sondas de SEQ ID NOs 4 a 7 da Tabela 1) , também não apresentaram hibridização não-específica para o tipo 31 de HPV, como mostrado pelas sondas de controle das SEQ ID NOs 1 e 2. No 15 entanto, surpreehdentemente, a capacidade de detectar o tipo 33 de HPV foi perdida em si nessas sondas. Tabela 1

As razões para o fracasso das SEQ ID Nos 4 a 7 para detectar especificamente o tipo 33 de HPV não são conhecidas. No entanto, a observação de que o genótipo 33 5 de HPV não pode ser detectado com estas não se deve às sequências das sondas. Os inventores mostraram em análises in silico que estas sondas são perfeitamente complementares à sequência de DNA do tipo 33 de HPV (Figura 2).

Além disso, a sonda da SEQ ID NO 3 da presente 10 invenção, assim como as sondas das SEQ ID Nos 4 a 7, todas partilham algumas características muito similares, em particular, com relação ao comprimento da sonda (número de nuçleotídeo, N° nt), bem como temperatura de fusão (Mt) , porcentagem GC e outros parâmetros termodinâmicos. 15 Portanto, não era de esperar, nem em conta do alinhamento da sequência da Figura 2, nem em contã das características das sondas recém-concebidas (1), que apenas a sonda que impediria a hibridizaçâo não-espeçífica ao tipo 31 de HPV, bem como a hibridizaçâo não-específica a outros 20 tipos de HPV de uma sequência similar, mas especificamente detectaram O tipo 33 de HPV, seria a sonda da SEQ ID NO 3 da presente invenção (CTGTCACTAGTTACTTGTGTGCA). Assim, surpreendentemente, os inventores descobriram que a sonda da SEQ ID NQ 3 pode ser utilizada para detectar especificamente o HPV 33 sem hibridizaçâo cruzada com outros tipos de HPV.

Além disso, embora a sonda da SEQ ID NO 3 seja muito similar à sonda de controle dè SEQ ID NO 2 e apenas carece 5 de 2 nt na extremidade 5' e 5 nt na extremidade 3' (ver as Tabelas 1 e 2) , que, no entanto, não apresenta a hibridizaçâo cruzada para o tipo 31 de HPV, como mostrado pela sonda de controle.

Os inventores da presente invenção verificaram que 10 pequenas variações do comprimento da sequência da sonda da SEQ ID NO 3, em particular, as variações de 1, 2, 3 ou mais nucleotideos, afetaram as características funcionais da sonda da SEQ ID NO 3 em um modo muito relevante.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção 15 corresponde, assim, a uma sonda de ácido nucléico que Compreende ou consiste na sequência CTGTCACTAGTTACTTGTGTGCA (5 » 3 ’) (SEQ ID NO 3) .

Outro aspecto da presente invenção é o uso da sonda de ácido nucléico que compreende ou consiste na sequência 20 CTGTCACTAGTTACTTGTGTGCA (5’-> 3’) (SEQ ID NO 3) para a realização da detecção específica do tipo 33 de HPV.

A sonda de ácido nucléico da presente invenção pode ser composta dentro de um microssistema de sondas de DNA, em que as sondas para a detecção específica de um ou mais tipos de HPV podem estar presentes, e cujo último efeito pode ser a detecção e definição do HPV presente em uma amostra.

Outro aspecto da invenção refere-se a um método 5 confiável para a detecção específica e/ou identificação do tipo 33 de HPV em uma amostra clínica que compreende o uso de uma sonda de ácido nucleiçp que compreende ou consiste na sequência CTGTCACTAGTTACTTGTGTGCA (51— 3') (SEQ ID NO 3) . 10 Ainda outro aspecto da presente invenção é um kit para a detecção de um ou mais tipos de HPV, o kit que compreende um microssistema que compreende a sonda de ácido nucléico que compreende ou contém a sequência CTGTCACTAGTTACTTGTGTGCA (5'- 3') (SEQ ID NO 3). 15 Outro aspecto da presente invenção refere-se a um ensaio para a detecção e definição do HPV, o ensaio que compreende a realização de uma reação de amplificação de ácido nucléico em uma amostra para amplificar um ou mais das sequências alvo de HPV, obtendo-se oligonucleotídeos de 20 filamento único, permitindo oligonucleotídeos de filamento único para hibridizar com um ou mais tipos específicos de sondas de HPV, em que um ou mais tipos específicos de sondas de HPV compreendem uma sonda de ácido nucléico que compreende ou consiste na sequência CTGTCACTAGTTACTTGTGTGCA (51—» 3') (SEQ ID NO 3). Em uma modalidade, o ensaio é para a detecção do tipo 33 de HPV, e compreende uma sonda de ácido nucléico que compreende ou consiste na sequência CTGTCACTAGTTACTTGTGTGCA (5’-, 3'j (SEQ ID NO 3) somente. Em 5 outra modalidade, Outras sondas como conhecidas na técnica podem ser utilizadas em combinação com SEQ ID NO 3.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 A Figura 1 mostra o alinhamento da sequência entre as 10 sequências de DNA dos tipos 31 e 33 de HPV. Dentro desta figura, a posição que corresponde às sequências com a qual as sondas 33A2-AS e 33B1 (concebido para a detecção especifica do tipo 33 de HPV) hibridizam, está indicada. A posição correspondente às sequências com que as sondas 31B5 15 e 31A-AS (concebido para a detecção especifica do tipo 31 de HPV) hibridizam, também é indicada.

Figura 2 Alguns exemplos representativos das análises in silico das sondas das SEQ ID NOs 3 a 7, e as sequências das bases 20 de dados de GenBahk são exibidos.

Figura 3 A visualização da hibridizaçâo entre o produto de amplificação correspondente a uma amostra positiva para o tipo 31 e negativa para o tipo 33, e (i) um microssistema que continha as sondas originais 33B1-AS e 33A2 para a detecção do tipo 33 (painel A), ou (ii) um microssistema que continha a sonda de acordo com a presente invenção, CTGTCACTAGTTACTTGTGTGCA (5'-> 3'), 5 para a detecção do tipo 33 (painel B).

As sondas para a detecção do tipo 31, que estão contidas no interior de ambos os microssistemas, são sondas 31A-AS e 31B5.

Tanto o microssistema de painel A, e o microssistema 10 de painel B, compreendem marcadores de posição, que estão rodeados por quadrados, bem como sondas para a detecção de controle de amplificação de DNA, designada por "ADN".

Sinais que correspondem aos sinais de hibridização dos tipos 31 e 33 de HPV são também indicados nesta figura.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção irá agora ainda ser descrita. Nas seguintes passagens, os diferentes aspectos da invenção são definidos em maiores detalhes. Cada aspecto assim definido pode ser combinado com qualquer outro aspecto ou aspectos, 20 a menos que expressamente indicados ao contrário. Em particular, qualquer característica indicada como sendo preferida ou vantajosa pode ser combinada com qualquer outra característica ou características indicadas como sendo preferidas ou vantajosas.

Como se mostra no exemplo 1, as sondas direcionadas contra o tipo 33 de HPV, e que são conhecidas na técnica também hibridizam de forma cruzada para o tipo 31 de HPV. A fim de resolver o problema dá hibridizaçâo não-específica 5 de uma sonda destinada a detectar o tipo 33 de HPV para o genótipo 31 de HPV, novas sondas foram designadas para a detecção do tipo 33 de HPV. 0 programa Oligo 6 (Molecular Biology Insights, Inc.) foi usado com este propósito. As sondas eram de um tamanho menor do que as sondas conhecidas 10 na técnica (ver, por exemplo 1, Tabela 2) , tinham um teor de Guanidina/Citosina (G/C) de 40-60%, em uma temperatura de fusão (Mt), com um valor máximo de 15°C acima da temperatura de hibridizaçâo.

As sondas de DMA resultantes são mostradas na Tabela 1.5 1. SEQ ID NO 3 foi mostrado para hibridizãr especificaménte pata o tipo 33 de HPV e não mostrou hibridizaçâo cruzada a outros tipos de HPV, incluindo o 31 de HPV.

Consequentemente, a invenção refere-se a uma sonda de ácido nucléico que compreende ou consiste nã sequência 20 CTGTCACTAGTTACTTGTGTGCA (5'- 3') (SEQ ID NO 3). Como mostrado aqui, esta sonda pode ser utilizada nos métodos e kits da presente invenção sozinha ou em combinação com outras sondas que são as sondas específicas para a detecção de outros tipos de HPV. Tais sondas são conhecidas na técnica, por exemplo, a partir de WO 2007/017699, aqui incorporado por referência.

De preferência, as sondas específicas de pelo menos 5, 10, 15, 2Q, 25, 30, 35, 40, ou 42 tipos de HPV são 5 utilizadas nos métodos e kits da presente invenção, qüe são de preferência selecionados a partir de tipos 6, 11, 16, 18, 26, 30, 31, 32, 33, 34/64, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 81, 82, 83, 84, 85 e 89 de HPV. De 10 preferência, até um total de 35 diferentes tipos de HPV são detectados de acordo com as diferentes modalidades da invenção.

A sequência de ácido nucléico da SEQ ID NO 3 pode ainda compreender uma etiqueta. 15 O termo sequência de ácido nucléico preferível refere- se a uma sequência de DNA ou uma molécula de DNA possuindo a sequência como mostrado aqui. Esta sequência pode ser usada como uma sonda para detectar o HPV de acordo com a invenção. 20 Em uma modalidade preferida da presente invenção, a sonda é imobilizada em um microssistema. Este microssistema pode também compreender outras sondas de HPV conhecidas na técnica. Os suportes que podem ser utilizados e a tipologia de microssistema podem variar, uma seleção sendo feita entre os microssistemas de alta e baixa densidade em um suporte de cristal (CLART® Technology, mostrado, por exemplo, no documento WO 2007/017699) , ou em um suporte líquido (Luminex Tecnology), mas também entre 5 microssistemas de nitrocelulose (Lipa Technology) , e com uma tecnologia de rotulaçâo diferente, tais como rotulação com fluorescência ou precipitação de compostos diferentes (Bodrossy & Sessitsch, 2.004, Current Opinion in Microbiology, 7(3):245-254) . Em uma modalidade preferida da 10 presente invenção, o microssistema tem uma ou mais sondas de ácido nucléico imobilizadas em um suporte de plástico, em particular, em um suporte de poliestireno.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, o microssistema compreende uma ou mais sondas de ácido 15 nucléico concebidas para a detecção do tipo 33 (Tabela 1), de preferência, a sonda da SEQ ID NO 3. 0 microssistema pode ainda compreender uma ou mais sondas para a detecção de um ou mais tipos diferentes de HPV, de preferência até um total de 35 diferentes tipos de HPV, assim como sondas 20 para a detecção de um ou mais controles. Alguns exemplos de sondas selecionáveis são os descritos no WO 2007/017699. O microssistema pode ainda compreender um ou mais marcadores de posição, que de preferência são as sondas rotuladas de biotina.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, o microssistema pode ser parte de uma lâmina ou um recipiente de reação. 0 último pode estar na forma de. um tubo de. reação individual, ou na forma de uma cavidade dentro de um 5 conjunto de cavidades de reação, que pode ser na forma de tiras de cavidades ou de placas. Este último pode ser constituído por cavidades independentes, cada uma dos quais compreende um microssistema, e que também pode ser organizada sob a forma de tiras de cavidades. 10 Deste modo, os microssistemas da presente invenção podem ser constituídos por um tubo de reação individual, em uma tira de cavidades, cada uma das cavidades compreende um microssistema, bem como na forma de uma placa de cavidades. De preferência, a tira de cavidades contém 8 cavidades, e a 15 placa de cavidades está na forma de uma placa de microtitulo. Na modalidade mais preferida, a placa de microtítulo é feita de 96 cavidades. Cada uma das cavidades da tira e da placa compreende um microssistema.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, o 20 microssistema de sonda é imobilizado em um suporte sólido. Este suporte sólido pode estar contido em um recipiente de reação, que pode ser um tubo de reação individual, ou ser uma cavidade pertencente a uma tira de cavidades de reação, ou a uma placa de cavidades. De acordo com outra modalidade da presente invenção, o suporte sólido sobre o qual o microssistema é imobilizado, é o fundo do próprio vaso de reação. 0 recipiente de reação pode estar em qualquer um dos formatos mencionados acima (um tubo de reação 5 individual, ou uma cavidade dentro de um conjunto de cavidades de reação, que pode ser ná fôrma de tiras de cavidades ou de placas).

Em uma modalidade preferida da presente invenção, as sondas de DNA do microssistema são imobilizadas no suporte 10 sólido por meio da presença de um grupo amina na extremidade 5' da sonda de DNA.

A fim de determinar os subtipos de HPV que estão presentes dentro de uma amostra, em uma modalidade preferida dos aspectos da presente invenção, a amostra é 15 submetida à amplificação antes da hibridização com as sondas tipo específicas. A reação de amplificação é preferencialmente PCR. Oligonucleotídeos de filamento único podem ser obtidos por desnaturação de qualquer um dos oligonucleotídeos de filamento duplo presentes, por 20 exemplo, por aquecimento. Oligonucleotídeos de filamento único são preferivelmente permitidos para hibridizar sob condições rigorosas; tais condições serão entendidas por aqueles versados na técnica, mas preferivelmente incluem incubação de oligonucleotídeos desnaturados a 55°C com o objetivo, em um tampão que compreende 1 x SSC. Cada tubo de amplificação contém todos os reagentes necessários para a realização de uma amplificação de DMA. Em uma modalidade preferida da presente invenção, o tubo de reação contém os 5 nucleotideos (dNTPs), enzima polimerase Taq, MgCl∑, tampão de enzima e uma mistura de iniciadores (de preferência, rotulados com biotina) , que são específicos para a amplificação de até 35 subtipos de HPV, de acordo com a literatura (Manos et al. , 1989, Cancer Cells, 7:209-214; 10 Hildesheim et al., 1994, J. Infect Dis., 169: 235-240). A estratégia baseia-se no fato de que a região a ser amplificada é altamente conservada entre os diferentes tipos de HPV a serem detectados, e sobre a utilização de iniciadores degenerados que são adequados para a 15 amplificação dos subtipos acima mencionados.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, o sistema usado para a detecção dos produtos de amplificação é baseado na precipitação de um produto insolúvel naqueles pontos do microssistema, em que a hibridizaçâo dos produtos 20 de amplificação com suas sondas específicas ocorre. Durante PCR, os produtos de amplificação são rotulados com biotina, quer devido ao fato de um ou mais dos iniciadores serem rotulados com biotina em sua extremidade 5', quer devido à incorporação dos nucleotideos rotulados com biotina. Após a amplificação, os produtos de amplificação são hibridizados com suas sondas específicas complementares que são imobilizadas em manchas concretas e conhecidas do microssistema. Em seguida, a incubação com um conjugado de 5 estreptavidina-peroxidase ocorre. 0 conjugado se liga através da sua porção estreptavidina com a biotina dos produtos de amplificação (que são, eles próprios ligados às suas sondas especificas), e a atividade de peroxidase resulta na aparição de um produto insolúvel, na presença do 10 substrato TMB (3,3'5,5'-tetrametilbenzidina) , que precipita nas manchas do microssistema em que a hibridizaçâo ocorre. Alternativamente, o-Dianisidina pode ser utilizada como substrato, bem como qualquer outro substrato possível qué produz o mesmo efeito. A presente invenção admite qualquer 15 Outra forma possível de rotulagem dos produtos de amplificação, bem como de visualização da sua hibridizaçâo com as sondas de DNA correspondentes.

De preferência, o tubo de amplificação da presente invenção inclui todos os componentes necessários para a 20 realização de uma extração de DNA e de controle de amplificação.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, o tubo de amplificação contém dois iniciadores, CFTR-F4 e CFTR-R5, qüe amplificam, um fragmento do gene C.FRT humano (Regulador de Transmembrana de Fibrose Cística), de um comprimento de 892 pares de base, que constitui o controle de extração de DNA genômico. Este controle é necessário para a confirmação de um resultado negativo verdadeiro, em 5 que informa da presença de DNA do paciente na amostra, embora tenha havido nenhuma amplificação de qualquer tipo de HPV. Estes mesmos iniciadores também amplificam uma região de 1202 pares de base de um plasmídeo recombinante, o qual foi construído na base do plasmídeo pBSK 10 (pBluescript® II SK(+), Stratagene), e inserido em um pGEM- T (sistema de vetor fácil pGEM-T, Promega), de modo a constituir o controle de amplificação do tubo. Esta construção é, portanto, também contida dentro da mistura de reação de PCR. 15 Este controle permite distinguir entre os casos de inibição da reação de PCR, e aqueles em que não houve DNA presente nã amostra. A reação de amplificação será sempre desequilibrada para fragmentos curtos de DNA, favorecendo assim a amplificação de HPV. Assim, de acordo com os 20 métodos e kits dã invenção, uma ou mais sequências de controle podem também ser detectadas; por exemplo, uma sonda imobilizada no suporte sólido que não hibridiza com a sequência alvo a partir de qualquer tipo de HPV. A sonda pode ser para uma sequência genômica humana alvo; o ensaio pode então compreender a amplificação da sequência humana alvo a partir da amostra e detectar se ocorreu a amplificação. Um controle adicional pode ser introduzido usando sequências rotuladas não-específicas imobilizadas no 5 suporte sólido; detecção da rotulação pode garantir que o rótulo está a funcionar corretamente. Um controle mais adicional pode ser fornecido através da inclusão de uma sequência de amplificação de controle que pode ser amplificada pelos mesmos iniciadores como o alvo humano, 10 mas que será detectado por um oligonucleotídeo diferente sobre o suporte sólido. Este controle garante que a amplificação está funcionando corretamente. Ã mistura de amplificação do ácido nucléico utilizado de acordo com os métodos e kits da invenção pode 15 compreender ós iniciadores de consenso do HPV, tais como MY09 e MY11; e opcionalmente HMB01; iniciadores para amplificar uma sequência humana alvo; e uma sequência de amplificação de controle alvo incluindo as sequências que correspondem a porções de flanqueamento da sequência humana 20 alvo, tal que a amplificação de ambas as sequências alvo irá ocorrer utilizando os mesmos iniciadores. 0 kit pode também incluir instruções para a sua utilização.

Com as sondas da Tabela 1, a hibridizaçâo não- específica do produto de amplificação correspondente ao tipo 31 de HPV, e a sonda correspondente ao tipo 33 de HPV, que teve lugar quando o microssistema continha as sondas originais das SEQ ID NOs 1 e 2, foram evitadas. No entanto, com as sondas das SEQ ID NOs 4 a 7, a capacidade de ligar o 5 tipo 33 de HPV em si foi perdida. A razão para isto é desconhecida, mas isso não è devido a uma falta de complementaridade entre as sequências destas sondas e a sequência do produto de amplificação correspondente ao tipo 33 de HPV (Figura 2). Somente a sonda que cumpre o objetivo 10 de eliminar a hibridização não-específica entre o produto de amplificação correspondente ao tipo 31 de HPV e a sonda correspondente ao tipo 33 de HPV, enquanto conservando a capacidade de detectar o tipo 33 de HPV em si, é a sonda da SEQ ID NO 3 da Tabela 1. Um aspecto da presente invenção é 15 um kit para a detecção de um ou mais tipos de HPV, o kit compreendendo um microssistema que compreende ou contém uma sonda de ácido nucléico que compreende ou consiste na sequência CTGTCACTAGTTACTTGTGTGCA (5'-> 3') para a detecção do tipo 33 de HPV. Este kit, bem como o microssistema em 20 si, constituem possíveis aplicações industriais da presente invenção.

O kit de acordo com a presente invenção podem ainda compreender pelo menos uma sonda selecionada a partir de 31A-AS (TGTAGTATCACTGTTTGCAATTGCAGCACA (5'— 3'), SEQ ID NO 8) e 31B5 (AGAACCTGAGGGAGGTGTGGTCAATCCAAA (5'-» 3'), SEQ ID NO 9) para a detecção do tipo 31 de HPV- Outras sondas que podem formar parte do kit são descritas na técnica, por exemplo, em WO 2007/017699. 5 Na sequência do microssistema, o kit da presente invenção pode compreender uma mistura de reagentes para a amplificação do DNA presente em uma amostra e/ou reagentes para a visualização da hibridizaçâo entre o produto de amplificação e as sondas do microssistema.

EXEMPLOS

Os exemplos que são fornecidos meramente abaixo ilustram a presente invenção. De modo algum os aspectos técnicos neles contidos limitam o escopo da invenção.

EXEMPLO 1

Estudos realizados com amostras reais que foram submetidas ao método de detecção de WO 2007/017699, revelaram que uma hibridizaçâo não-específica ocorreu entre ò produto de amplificação do genótipo 31 de HPV e a sonda do tipo específica correspondente ao genótipo 33 de HPV. 20 Assim, quando testados através de PCR aninhado e/ou sequenciamento de DNA, as amostras que pareciam conter ambos os genótipos 31 e 33 de HPV, de fato não continham apenas o tipo 31 de HPV.

As sequências das sondas conhecidas na técnica (ver WO 2007/017699) para a detecção do produto de PCR do tipo 33 de HPV são: Tabela 2

*Mt: Temperatura de fusão

EXEMPLO 2

Um total de 30 amostras clinicas foi analisado, em que o seguinte tipo de amostras foi representado: 10 (i) Amostras que continham o genótipo 31, (ii) amostras que continham o genótipo 33, fiii), amostras em que os resultados anteriores proporcionaram um resultado positivo tanto para os genótipos 31 e 33, mas em que o resultado positivo correspondente ao genótipo 33 constituia 15 um positivo falso da técnica, e (iv) amostras com uma co- infecção real de ambos os tipos 31 e 33. Com esta finalidade, a extração do DNA de cada amostra foi realizada, e o material extraido foi submetido à amplificação por PCR. Uma parte do produto de amplificação 20 foi hibridizada a um microssistema, em que as sondas originais das SEQ ID NOs 1 e 2 (Tabela 2) estão presentes para a detecção do tipo 33 de HPV; Outra parte do produto de amplificação foi hibridizada a um microssistema que continha a sonda da SEQ ID NO 3 da presente invenção (Tabela 1) . Alternativamente, microssistemas que continham 5 uma ou mais das sondas das SEQ ID NOs 4 a 7 (Tabela 1) foram utilizados; estes microssistemas forneceram um resultado negativo no caso de amostras que continham o tipo 33 de HPV (dados não-mostrados) . Finalmente, a presença do produto insolúvel naqueles pontos do microssistema em que a 10 hibridizaçâo entre os produtos de amplificação e ás sondas do microssistema tinham ocorrido, foi detectada.

Cada tubo de reação continha todos os reagentes que eram necessários para a realização de amplificação de DNA. Em particular, os nucleotídeos, (dNTPs), enzima polimerase 15 Taq, MgCl2, tampão de enzima e uma mistura de iniciadores (rotulada com biotina), que são específicos para a amplificação de até 35 subtipos de HPV, de acordo com a literatura (Manos et al., 1989, Cancer Cells, 7:209-214; Hildesheim et al., 1994, J. Infect. Dis., 169: 235-240). 20 Como um controle, o tubo de amplificação contém também dois iniciadores, CFTR-F4 e CFTR-R5, que amplificam um fragmento do gene CFRT humano (Regulador de Transmembrana de Fibrose Cística), de um comprimento de 892 pares de base, o que constitui o controle de extração de DNA genômico. Este controle é necessário para a confirmação de úm resultado negativo verdadeiro, em que informa da presença de DNA do paciente na amostra, embora tenha havido nenhuma amplificação de qualquer tipo de HPV. Estes mesmos 5 iniciadores também amplificaram uma região de 1202 pares de base de um plasmídeo recombinante, os quais foram construídos a partir do plasmídeo pBSK (pBluescript® II SK(+), Stratagene), e inseridos em um pGEM-T (sistema de vetor fácil pGEM-T, Promega), de modo a constituir o 10 controle de amplificação do tubo. Esta construção é, portanto, também contida dentro da mistura de reação de PCR. Este controle permite distinguir entre os casos de inibição da reação de PCR, e aqueles em que não houve DNA presente na amostra. A reação de amplificação será sempre 15 desequilibrada para fragmentos de DNA curtos, favorecendo assim a amplificação de HPV.

Visualização do híbrido constituído entre o produto de amplificação e a sonda, foi realizada através de incubação com um conjugado estreptavidina-peroxidase. O conjugado se 20 liga através da sua porção estreptavidina com a biotina dos produtos de amplificação (que são, eles próprios ligados às suas sondas específicas). A atividade de peroxidase resulta na aparição de um produto insolúvel, na presença do substrato TMB (3,3'5,5'-tetrametilbenzidina), que precipita nas manchas do microssistema, em que a hibridizaçâo ocorre.

A visualização dos dois microssistemas correspondentes a uma mesma amostra foi realizada em paralelo. 5 A Figura 3 mostra um exemplo representativo da visualização da hibridizaçâo do produto de amplificação correspondente a uma amostra, positiva para o tipõ 31 de HPV, e negativa para o tipo 33 de HPV, e um microssistema que contém sondas originais 33B1-AS e 33A2 para a detecção 10 do tipo 33 (painel A), e com um microssistema contendo a sonda CTGTCACTAGTTACTTGTGTGCA (5'-^ 3') de acordo com a presente invenção, para a detecção do tipo 33 (painel B) . As sondas utilizadas para a detecção do tipo 31 de HPV são sondas 31A-AS e 31B5. Ambos os microssistemas de painéis A 15 e B compreendem marcadores de posição, que estão rodeados por quadrados, bem como sondas para a detecção de controle de amplificação de DNA, designada por "DNA". Sinais que correspondem aos sinais de hibridizaçâo de tipos 31 e 33 de HPV são também indicados nesta figura.

EXEMPLO 3

A fim de avaliar a funcionalidade da sonda e microssistema da presente invenção dentro dé um sistema de detecção que ainda permite a identificação de outros tipos de HPV diferentes, um conjunto de 310 amostras reais, incluindo amostras que compreenderam um grande número de diferentes genótipos de HPV, foram analisados com um kit que compreendeu um microssistema contendo sonda da SEQ ID NO 3 da presente invenção para a detecção do tipo 33 de 5 HPV, as sondas das SEQ ID NOs 8 e 9 para a detecção do tipo 31 de HPV, e sondas que eram específicas para os outros tipos de HPV a serem detectados.

A Tabela 3 mostra o resultado obtido para os diferentes genótipos, bem como os parâmetros de diagnóstico 10 de especificidade e sensibilidade correspondentes a cada genótipo. Tabela 3. Análises dos parâmetros de diagnóstico do Kit para a detecção de diferentes genótipos de HPV, com base na utilização de um microssistema de sondas que contém as 15 sondas das SEQ ID NOs 3, 8 e 9 da presente invenção. A coluna 1 indica o genótipo que é analisado. Colunas 2 e 3 exibem os valores de sensibilidade e especificidade, respectivamente,

Claims

1. Uso de uma sequência de ácido nucléico caracterizado pelo fato de consistir da CTGTCACTAGTTACTTGTGTGCA (5'-3') (SEQ ID N° 3) para detecção específica do tipo 33 de HPV.

2. Kit para a detecção de um ou mais tipos de HPV em uma amostra, o kit caracterizado pelo fato de que compreendendo um microssistema compreendendo uma ou mais sondas para a detecção de um ou mais tipos de HPV, em que o microssistema compreende uma sonda consistindo em CTGTCACTAGTTACTTGTGTGCA (5 '^ 3') (SEQ ID N° 3), em que o kit compreende ainda uma mistura de reativos para a amplificação do DNA presente na amostra a ser analisada, em que os reativos compreendem nucleotídeos (dNTPs), enzima polimerase Taq, MgCl2, enzima tampão e uma mistura de primers que são específicos para a amplificação de até 35 subtipos de HPV.

3. Kit, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o microssistema ainda compreende pelo menos uma sonda selecionada das sondas da sequência TGTAGTATCACTGTTTGCAATTGCAGCACA (5'^3') (SEQ ID N° 8) e AGAACCTGAGGGAGGTGTGGTCAATCCAAA (5'^3') (SEQ ID N° 9) para a detecção do HPV do tipo 31.

4. Kit, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o microssistema ainda compreende sondas para a detecção específica de pelo menos HPV do tipo 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, ou 42.

5. Método para a detecção específica do HPV do tipo 33 caracterizado pelo fato de que compreende amplificar uma amostra de DNA, obtendo oligonucleotídeos de filamento único a partir do referido produto de amplificação, e permitindo os referidos oligonucleotídeos de filamento único para hibridizar a um ácido nucleico consistindo da CTGTCACTAGTTACTTGTGTGCA (5'-3') (SEQ ID N° 3).