ES2372840A1 - Kit para la detección del virus del papiloma humano. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se basa en una sonda de ADN que permite la detección específica del tipo 33 del virus del papiloma humano (VPH), al mismo tiempo que evita la detección inespecífica del tipo 31 de VPH.Asimismo, la presente invención está relacionada con un microarray de sondas de ADN que contiene la sonda de la presente invención, con un Kit de detección de HPV que comprende dicho microarray, así como con el uso de la sonda de ADN, del microarray o del kit que la contienen, para la detección del tipo 33 de VPH en una muestra.
Description
Kit para la detección del virus del papiloma
humano.
El virus del papiloma humano (VPH) es uno de los
agentes etiológicos del cáncer de cérvix (cuello de útero) y produce
la enfermedad de transmisión sexual más común entre mujeres (Bosch
et al., 1995, J. Natl. Cancer Inst., 87:
796-802). En los últimos años se ha determinado que
la infección con el VPH es la principal causa de cáncer de cuello de
útero y de neoplasia cervical intraepitelial (Walboomers et
al., 1999, J. Path., 189:12-19; Bosch
et al., 2002, J. Clin. Pathl., 55:
244-265).
Cerca de 30 tipos de VPH se transmiten por medio
del contacto sexual, y producen infección anogenital, clasificándose
en dos grupos de riesgo según su asociación con el cáncer de cuello
de útero (Dunne et al., 2007, JAMA, 297(8);
Muñoz et al., 2003, N. Engl. J. Med., 348(6):
518-527): Tipos de alto y bajo riesgo oncogénico.
Una correcta identificación de los tipos de VPH causantes de la
infección es fundamental para poder determinar el tratamiento médico
adecuado.
De entre todos los tipos de VPH, los que
presentan la tasa de malignicidad más elevada son el 16, 18, 31 y 33
(Berkhof et al., 2006, Cancer Epidemiol Biomarkers
Prev., 15(7): 1268-73). Además, todas las
evidencias epidemiológicas apuntan a que existe una relación directa
entre estos tipos de VPH y el desarrollo del cáncer de cuello de
útero (IARC Monographs on the evaluation of carcinogenics risk to
humans. Human Papillomaviruses. Vol. 90. Lyon: International Agency
for Research on Cancer, 2007).
Otros estudios indican que los tipos 31 y 33
son, junto con los tipos 16 y 18, de los más abundantes en casos de
HSIL (high-grade squamous intraepithelial lesions) y
SCC (squamous cell carcinoma of the cervix) (Clifford et al.,
2003, British Journal of Cancer 89,
101-105).
Las técnicas moleculares más empleadas y más
sensibles para la detección de VPH están basadas en la Reacción en
Cadena de la Polimerasa o PCR; Las dos reacciones de PCR consenso
más comunes empleadas son las llamadas MY-PCR y su
variante PG-MY, que contienen el conjunto de
cebadores de amplificación MY11, MY09 y HMB01 (Manos et al.,
1989, Cancer Cells, 7:209-214.; Hildesheim
et al., 1994, J. Infect. Dis., 169:
235-240; Gravitt et al., 2000, J. Clin.
Microbiol., 38(1): 357-361), y la llamada
GP-PCR, que contiene el conjunto de cebadores
GP5+/GP6+ (de Roda et al., 1995, J. Gen. Virol.,
76:1057-1062; Jacobs et al., 1995, J.
Clin. Microbiol., 33: 901-905; Jacobs et
al., 1997, J. Clin. Microbiol.,
35:791-795).
Una vez que se ha detectado la presencia de VPH
mediante una reacción de amplificación, se crea la necesidad de
tiparlo; Para ello se han utilizado a lo largo del tiempo diferentes
técnicas que van desde la secuenciación, pasando por el análisis con
enzimas de restricción, y finalmente técnicas basadas en la
hibridación de los productos de PCR con sondas complementarias
depositadas en diferentes superficies (Jacobs et al., 1995,
J. Clin. Microbiol., 33: 901-905).
Un método de diagnóstico y tipado de VPH
fundamental dentro del estado de la técnica, es el descrito
en
WO2007017699. En él se lleva a cabo una reacción de amplificación PCR basada en los cebadores MY-PCR, seguida de tipado mediante hibridación del producto de PCR con un microarray de sondas específicas para una gran variedad de tipos de VPH, tanto de alto como de bajo riesgo oncogénico.
WO2007017699. En él se lleva a cabo una reacción de amplificación PCR basada en los cebadores MY-PCR, seguida de tipado mediante hibridación del producto de PCR con un microarray de sondas específicas para una gran variedad de tipos de VPH, tanto de alto como de bajo riesgo oncogénico.
Estudios llevados a cabo con muestras reales a
las que se sometió al método de detección de WO2007017699, revelaron
que se producían hibridaciones inespecíficas del amplificado
correspondiente al genotipo 31 de VPH sobre la sonda correspondiente
al 33. De este modo, muestras que aparentemente contenían tanto el
genotipo 31 como el 33 de VPH, cuando se analizaban mediante
nested-PCR y/o secuenciación, resultaban contener
sólo el tipo 31.
Las secuencias de las sondas originales para
detección del producto de PCR correspondiente al tipo 33 son:
El análisis de los alineamientos entre el
genotipo 31 y las sondas correspondientes al genotipo 33 no
justificaba la hibridación cruzada que se observaba en la realidad
entre ambos (Figura 1), al no presentar una identidad entre las
secuencias que hiciera obvia para un experto en la materia la
existencia de una posible hibridación; Por ese motivo, la
información técnica de que se disponía no aportaba ninguna
indicación acerca de cómo resolver el problema de la hibridación
cruzada.
Había, por tanto, que resolver el problema de la
hibridación inespecífica del genotipo 31 con la sonda
correspondiente al 33.
La solución a ese problema la aportó la sonda de
ADN según la reivindicación Nº 1, la sonda de secuencia SEQ ID NO
3.
Con la sonda de ADN según la reivindicación Nº 1
(Sonda de secuencia SEQ ID NO 3, Tabla 2), se ha conseguido evitar
la hibridación inespecífica con VPH del tipo 31, así como
hibridaciones inespecíficas con otros tipos de VPH de secuencia
similar, al mismo tiempo que se consigue una hibridación específica
con VPH de tipo 33.
Con otras sondas de nuevo diseño, diseñadas
siguiendo el mismo criterio que para el diseño de la sonda de
secuencia SEQ ID NO 3 (Sondas de secuencias SEQ ID NO 4, SEQ ID NO
5, SEQ ID NO 6, y SEQ ID NO 7 de la Tabla 2), se conseguía evitar la
hibridación inespecífica de VPH del tipo 31 que tenía lugar con las
sondas originales de secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2, pero se
perdía la capacidad para detectar el propio VPH de tipo 33.
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El hecho de que con las sondas de secuencias SEQ
ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, y SEQ ID NO 7 no se consiga
detectar VPH de tipo 33 no es debido a motivos de secuencia, dado
que un análisis in silico arroja datos de una perfecta
complementariedad entre dichas sondas y la secuencia de ADN de HPV
de tipo 33 (Figura 2).
Además, tanto la sonda de secuencia SEQ ID NO 3
de la presente invención, como las sondas de secuencias SEQ ID NO 4,
SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, y SEQ ID NO 7, presentan unas
características similares entre sí, tanto en cuanto a longitud
(número de nucleotidos, nt), como a parámetros como el de la
Temperatura de Melting (Tm), porcentaje de GC, y otros parámetros
termodinámicos.
Por tanto, nada hacía evidente, ni a la vista de
los alineamientos de la Figura 2, ni a la vista de las
características de las distintas sondas de nuevo diseño (Tabla 2),
que la única sonda que conseguiría evitar la hibridación
inespecífica del tipo 31, y de otros tipos de VPH de secuencia
similar, y a la vez fuera capaz de detectar el propio tipo 33, sería
la sonda de secuencia SEQ ID NO 3 de la presente invención.
Además, la sonda de secuencia SEQ ID NO 3 es muy
similar a la sonda original de secuencia SEQ ID NO 2 (ver Tablas 1 y
2), y sin embargo, a diferencia de ella, no se produce hibridación
de la misma con VPH de tipo 31.
Los inventores de la presente invención han
comprobado que ligeras variaciones en la longitud de la sonda de
secuencia SEQ ID NO 3, en particular, variaciones de 1, 2, 3 o más
nucleotidos, afectan de manera significativa a las características
funcionales de la sonda de secuencia SEQ ID NO 3.
Un primer aspecto de la presente invención
consiste pues en la sonda de ADN de secuencia SEQ ID NO 3.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de dicha sonda de ADN para llevar a cabo la detección del tipo 33 de
VPH.
La sonda de la presente invención puede
encontrarse formando parte de un microarray de sondas de ADN, el
cual puede contener sondas específicas para la detección de uno o
más tipos de VPH, y cuya finalidad es la detección y el tipado de
VPH presente en una muestra.
Otro aspecto de la presente invención es un Kit
para la detección de uno o más tipos de VPH, que contiene un
microarray que a su vez contiene la sonda de ADN de secuencia SEQ ID
NO 3.
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Figura
1
La figura 1 muestra un alineamiento de las
secuencias de ADN correspondientes a los tipos 31 y 33 de HPV. En
ella se señala la posición en la que hibridan las sondas de
secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2, diseñadas para detección
específica del tipo 33. Asimismo, se indica la posición en la que
hibridan las sondas de secuencias SEQ ID NO 8 y SEQ ID NO 9,
específicas para la detección de VPH de tipo 31.
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Figura
2
Ejemplos representativos del análisis in
silico de la identidad entre las sondas de secuencias SEQ ID NO
3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, y SEQ ID NO 7, y las
secuencias de las bases de datos del GenBank.
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Figura
3
Visualización de la hibridación de un mismo
amplificado correspondiente a una muestra, positiva para el tipo 31
y negativa para el tipo 33, con un microarray que contiene las
sondas originales de secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 para
detección del tipo 33 (panel A) y con un microarray que contiene la
sonda según la presente invención, de secuencia SEQ ID NO 3, para
detección del tipo 33 (panel B). Las sondas para detección del tipo
31 presentes en el microarray son las sondas de secuencias SEQ ID NO
8 y SEQ ID NO 9.
Tanto el microarray del panel A como del B,
incluyen marcadores de posición, que se muestran rodeados por un
cuadrado, así como sondas para la detección de los controles de
amplificación de ADN, que se indican con la reseña "ADN". En la
Figura se indican, además, las señales correspondientes a los tipos
31 y 33.
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Con el fin de resolver el problema de la
hibridación inespecífica del genotipo 31 con la sonda
correspondiente al 33 se diseñaron nuevas sondas de detección para
el tipo 33. Para ello se empleó el programa Oligo 6 (Molecular
Biology Insights, Inc). Se seleccionaron sondas de un tamaño menor a
las ya existentes (ver Tabla 1), pero manteniendo un contenido en
Guaninas/Citosinas (G/C) de entre el 40-60%, y una
temperatura de melting (Tm) cuyo valor máximo fuera de 15ºC por
encima de la Temperatura de Hibridación.
El resultado fueron las sondas de ADN de la
Tabla 2.
En una realización particular de la presente
invención, las sondas de ADN se inmovilizan en un microarray. Los
soportes empleados y la tipología de los microarrays pueden ser
variados, pudiendo tratarse de microarrays de alta o baja densidad
en soporte de cristal (Tecnología CLART®, mostrada por ejemplo en
WO2007017699), o soporte líquido (Tecnología Luminex) hasta
macroarrays de nitrocelulosa (Tecnología Lipa); y con diferente
tecnología de mareaje como la fluorescencia o la precipitación de
distintos compuestos (Bodrossy & Sessitsch, 2004, Current
Opinión in Microbiology, 7(3):
245-254).
Una realización particular de la presente
invención consiste en un microarray de sondas de ADN inmovilizadas
sobre soporte de plástico, en particular, de poliestireno.
En una realización particular de la presente
invención, el microarray contiene una o más sondas de ADN diseñadas
para la detección del tipo 33 (Tabla 2). El microarray puede
contener además una o más sondas para la detección de uno o más
tipos diferentes de VPH, hasta un total de 35 tipos diferentes de
HPV, así como sondas para detección de uno o más controles. Algunos
ejemplos de sondas posibles son los recogidos en WO2007017699. El
microarray puede contener además, uno o más marcadores de posición,
los cuales preferiblemente son sondas biotiniladas.
En una realización particular de la presente
invención, el microarray de la presente invención puede estar
contenido en un portaobjetos o en un tubo de reacción. Este último
puede presentarse en distintos formatos, que incluyen desde tubos
individuales de reacción, a conjuntos de tubos de reacción
dispuestos en forma de tiras o placas. Estas últimas están
compuestas por pocillos independientes, cada uno de los cuales
contiene un microarray, y que, a su vez, pueden organizarse en tiras
de pocillos.
De este modo, los microarrays de la presente
invención pueden estar contenidos en un tubo de reacción individual,
así como en tiras de tubos, cada una de los cuales contiene un
microarray, así como en placas de pocillos.
Preferiblemente cada tira de tubos contiene 8
tubos de reacción, y cada placa de pocillos es del tipo microtiter
plate, preferiblemente compuesta por 96 pocillos.
\newpage
En una realización particular, el microarray de
la presente invención está inmovilizado en un soporte sólido. Dicho
soporte sólido puede estar contenido en un tubo de reacción, el cual
puede ser individual, o formar parte de una tira de tubos de
reacción, o bien estar contenido en un pocillo dentro de una placa
de pocillos. Según otra realización de la presente invención, el
soporte sólido en que se inmoviliza el microarray es el propio fondo
del tubo de reacción o pocillo. El tubo de reacción y el pocillo
pueden estar en cualquiera de los formatos arriba mencionados (tubo
de reacción individual, o miembro de una tira de tubos de reacción,
o bien pocillo dentro de una placa de pocillos, individuales o
dispuestos en tiras de pocillos).
En una realización particular de la presente
invención, las sondas de ADN del microarray se inmovilizan en el
correspondiente soporte sólido gracias a la presencia de un grupo
amino en el extremo 5' de la sonda de ADN.
Para realizar el análisis de subtipos de VPH
presentes en una muestra, en una realización particular de la
presente invención la muestra es amplificada mediante la técnica de
PCR, previamente a la hibridación con las sondas específicas de
tipo.
Cada tubo de amplificación contiene todos los
reactivos necesarios para realizar una amplificación a partir del
ADN. En una realización particular, el tubo de reacción contiene
nucleótidos (dNTPs), enzima Taq polimerasa, MgCl_{2}, buffer de la
enzima y una mezcla de cebadores -marcados con biotina- específicos
para la amplificación de hasta 35 subtipos de VPH basados en la
bibliografía (Manos et al., 1989, Cancer Cells,
7:209-214; Hildesheim et al., 1994, J.
Infect. Dis., 169: 235-240). La estrategia
radica en que la región a amplificar está altamente conservada y se
emplean estos cebadores que contienen las degeneraciones que
contemplan los diferentes subtipos a detectar.
En una realización particular de la presente
invención, el sistema de detección de los productos amplificados de
una muestra se basa en la precipitación de un producto insoluble en
aquellas zonas del microarray en las que se produce la hibridación
de los productos amplificados con las sondas específicas. Durante la
PCR, los productos amplificados se marcan con biotina bien debido a
que los diferentes cebadores están marcados con esta molécula en su
extremo 5', bien debido a la incorporación de nucleótidos marcados
con biotina. Después de la amplificación, estos productos se
hibridan con sus respectivas sondas específicas a las que son
complementarias, que están inmovilizadas en zonas concretas y
conocidas del microarray. Después se incuba con un conjugado de
estreptavidina-peroxidasa. El conjugado se une a
través de la estreptavidina con la biotina presente en los productos
amplificados (que a su vez se encuentran unidos a sus sondas
específicas) y la actividad peroxidasa provoca la aparición de un
producto insoluble en presencia del sustrato TMB
(3,3'5,5'-tetrametilbenzidina), que precipita sobre
las zonas del microarray en las que tiene lugar la hibridación.
Alternativamente, se puede usar como sustrato
o-Dianisidina, o sustratos que produzcan el mismo
efecto. La presente invención admite cualquier otra forma de mareaje
de los amplificados y de visualización de la hibridación de los
mismos con sus correspondientes sondas de ADN.
Preferiblemente, el tubo de amplificación de la
presente invención incluye reactivos para llevar a cabo un control
de extracción de ADN y de amplificación. En una realización
particular de la presente invención, el tubo de amplificación
también contiene dos cebadores, CFTR-F4 y
CFTR-R5 que amplifican un fragmento del gen CFRT
humano (acrónimo del inglés Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator,
"regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis
quística") de un tamaño de 892 pares de bases, que constituye el
control de extracción de ADN genómico, el cual es necesario para la
confirmación de un verdadero resultado negativo, ya que nos informa
de la presencia de ADN del paciente en la muestra, aunque no haya
habido amplificación de ningún tipo de VPH. Estos mismos cebadores
también amplifican una región de 1202 pares de bases de un plásmido
recombinante que ha sido construido, a partir del plásmido pBSK
(pBluescript® II SK(+), Stratagene) e insertado en
pGEM-T(pGEM-T easy vector
system, Promega) para que sea el control de amplificación del tubo,
por lo tanto este plásmido está inserto en la mezcla de reacción de
la PCR. Este control nos permitirá distinguir entre los casos de
inhibición de la reacción de PCR y aquéllos en los que no se
encontró ADN en la muestra. La reacción de amplificación estará
desplazada siempre hacia los fragmentos más pequeños favoreciendo la
amplificación de VPH frente al resto.
Con las sondas de la Tabla 2, se consiguió
eliminar la hibridación inespecífica del amplificado correspondiente
a VPH de tipo 31 con la sonda correspondiente al tipo 33, que tenía
lugar cuando el microarray contenía las sondas originales de
secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2. Sin embargo, con las sondas de
secuencias SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, y SEQ ID NO 7, se
perdía la capacidad para detectar el propio VPH de tipo 33, por
motivos que se desconocen, pero que no se deben a una falta de
complementariedad entre las secuencias de las sondas y la secuencia
del amplificado de VPH 33 (Figura 2).
La única sonda, pues, que cumple el doble
propósito de eliminar la hibridación inespecífica del amplificado
correspondiente a VPH de tipo 31 con la sonda correspondiente al
tipo 33, y de detectar el propio VPH de tipo 33, es la sonda de
secuencia SEQ ID NO 3 de la Tabla 2 (sonda según la reivindicación
Nº 1 de la presente invención).
Un aspecto fundamental de la presente invención
es un Kit para la detección de uno o más tipos de VPH, que contiene
un microarray que a su vez contiene la sonda de ADN de secuencia SEQ
ID NO 3 para la detección de VPH de tipo 33. Este kit, así como el
propio microarray, constituyen una posible aplicación industrial de
la presente invención.
\newpage
El kit de la presente invención puede además
contener, además de la sonda de ADN de secuencia SEQ ID NO 3 para
detección del tipo 33 de VPH, al menos una de las sondas de
secuencias SEQ ID NO 8 y SEQ ID NO 9 para detección de VPH del tipo
31.
Además del microarray, el kit de la presente
invención puede contener una mezcla de reactivos para la
amplificación del ADN presente en una muestra y/o reactivos para la
visualización de la hibridación entre el producto amplificado y las
sondas del microarray.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos que se muestran son sólo
ilustrativos de la presente invención, sin que los aspectos técnicos
contenidos en ellos puedan constituir una limitación del alcance de
dicha invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron 30 muestras clínicas donde estaban
representados los siguientes resultados: muestras positivas sólo
para el genotipo 31, muestras positivas sólo para el genotipo 33,
muestras con resultado previo positivo para el genotipo 31 y 33 pero
cuyo resultado para el genotipo 33 constituía un falso positivo de
la técnica, y muestras con coinfección real.
Para ello, se llevó a cabo la extracción de ADN
de cada una de las muestras, se sometió el material extraído de cada
una de las muestras a una amplificación mediante PCR, y se hibridó
una parte de cada amplificado con un microarray en que estaban
presentes las sondas originales de secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID
NO 2 (Tabla 1) para detección de VPH de tipo 33, y otra parte de
cada amplificado con un microarray que contenía la sonda de
secuencia SEQ ID NO 3 de la presente invención (Tabla 2).
Alternativamente, se emplearon microarrays que contenían una o más
sondas de secuencias SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, y SEQ ID
NO 7, (Tabla 2), los cuales dieron un resultado negativo para la
muestra positiva para el tipo 33 de VPH (datos no mostrados).
Finalmente, se llevó a cabo la detección de la
presencia del producto insoluble en aquellas zonas del microarray en
las que se había producida la hibridación de los productos
amplificados con sondas del microarray.
Cada tubo de amplificación contenía todos los
reactivos necesarios para realizar una amplificación a partir del
ADN. En concreto, nucleótidos (dNTPs), enzima Taq polimerasa,
MgCl_{2}, buffer de la enzima y una mezcla de cebadores -marcados
con biotina- específicos para la amplificación de hasta 35 subtipos
de VPH basados en la bibliografía (Manos et al., 1989,
Cancer Cells, 7:209-214; Hildesheim et
al., 1994, J. Infect. Dis., 169:
235-240).
A modo de control, el tubo de amplificación
también contiene dos cebadores, CFTR-F4 y
CFTR-R5 que amplifican un fragmento del gen CFRT
humano (acrónimo del inglés Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator,
"regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis
quística") de un tamaño de 892 pares de bases, que constituye el
control de extracción de ADN genómico, el cual es necesario para la
confirmación de un verdadero resultado negativo, ya que nos informa
de la presencia de ADN del paciente en la muestra, aunque no haya
habido amplificación de ningún tipo de VPH. Estos mismos cebadores
también amplifican una región de 1202 pares de bases de un plásmido
recombinante que ha sido construido, a partir del plásmido pBSK
(pBluescript® II SK(+), Stratagene) e insertado en
pGEM-T(pGEM-T easy vector
system, Promega) para que sea el control de amplificación del tubo,
por lo tanto este plásmido está inserto en la mezcla de reacción de
la PCR. Este control nos permitirá distinguir entre los casos de
inhibición de la reacción de PCR y aquéllos en los que no se
encontró ADN en la muestra. La reacción de amplificación estará
desplazada siempre hacia los fragmentos más pequeños favoreciendo la
amplificación de VPH frente
al resto.
al resto.
La visualización de la hibridación
amplificado-sonda se llevó a cabo mediante
incubación con un conjugado de
estreptavidina-peroxidasa, el cual se une a través
de la estreptavidina con la biotina presente en los productos
amplificados (que a su vez se encuentran unidos a sondas del
microarray). La actividad peroxidasa provoca la aparición de un
producto insoluble en presencia del sustrato TMB
(3,3'5,5'-tetrametilbenzidina), que precipita sobre
las zonas del microarray en las que tiene lugar la hibridación.
La visualización de los dos microarrays
correspondientes a una misma muestra se llevó a cabo en
paralelo.
En la figura 3 se muestra un ejemplo
representativo de la visualización de la hibridación de un mismo
amplificado correspondiente a una muestra, positiva para el tipo 31
y negativa para el tipo 33, con un microarray que contiene las
sondas originales de secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 para
detección del tipo 33 (panel A) y con un microarray que contiene la
sonda según la presente invención, de secuencia SEQ ID NO 3, para
detección del tipo 33 (panel B). Las sondas para detección del tipo
31 son las sondas de secuencias SEQ ID NO 8 y SEQ ID NO 9. Tanto el
microarray del panel A como del B, incluyen marcadores de posición,
que se muestran rodeados por un cuadrado, así como sondas para la
detección de los controles de amplificación, que se indican con la
reseña "ADN". En la Figura se indican, además, las señales
correspondientes a los tipos 31 y 33.
\newpage
Con el fin de evaluar la funcionalidad de la
sonda y microarray de la presente invención en el marco de un
sistema de detección que permita la identificación adicional de
otros tipos diferentes de VPH, se llevó a cabo el análisis de 310
muestras reales en las que estuviese representado un gran número de
genotipos diferentes de VPH, con un kit que comprende un microarray
en que está presente: la sonda de secuencia SEQ ID NO 3 de la
presente invención para detección de VPH de tipo 33, las sondas de
secuencias SEQ ID NO 8 y SEQ ID NO 9 para la detección de VPH de
tipo 31, y sondas específicas para cada uno de los otros genotipos
de VPH detectados.
En la tabla 3 se muestra el resultado obtenido
para los distintos genotipos, así como los parámetros diagnósticos
de especificidad y sensibilidad para cada genotipo.
\vskip1.000000\baselineskip
<110> GENOMICA S.A.U.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Kit para la detección del virus del
papiloma humano.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P201000392
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> P201000392
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2010-03-24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 33B1-AS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 33A2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
T33A2.1-A-AR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
T33B1.2-A-AR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
T33B1.3-A-AR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
T33B1.4-A-AR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
T33B1.5-A-AR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 31A-AS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 31B5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
Claims (7)
1. Sonda de ADN de secuencia SEQ ID NO 3.
2. Uso de la sonda de ADN de secuencia SEQ ID NO
3 para llevar a cabo la detección del tipo 33 de VPH.
3. Microarray de sondas para detección de uno o
más tipos de VPH, caracterizado en que el microarray contiene
la sonda de ADN de secuencia SEQ ID NO 3.
4. Microarray según la reivindicación 3, que
contiene, además de la sonda de ADN de secuencia SEQ ID NO 3 para
detección de VPH de tipo 33, al menos una de las sondas de
secuencias SEQ ID NO 8 y SEQ ID NO 9, para detección de VPH del tipo
31.
5. Kit para la detección de uno o más tipos de
VPH, que contiene un microarray de acuerdo con la reivindicación
3.
6. Kit de detección según la reivindicación 4,
en el cual el microarray contiene, además de la sonda de ADN de
secuencia SEQ ID NO 3 para detección del tipo 33 de VPH, al menos
una de las sondas de secuencias SEQ ID NO 8 y SEQ ID NO 9, para
detección de VPH del tipo 31.
7. Kit de detección según las reivindicaciones 4
y 5, que contiene, además del microarray de sondas, una mezcla de
reactivos para la amplificación del ADN presente en la muestra a
analizar y/o reactivos para la visualización de la hibridación entre
el producto amplificado y las sondas del microarray.
Priority Applications (7)
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Citations (1)
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| KR100702415B1 (ko) * | 2006-03-03 | 2007-04-09 | 안웅식 | 올리고 핵산 탐침 비드 어레이를 이용한 인유두종바이러스검출 키트 및 방법 |
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- 2010-03-24 ES ES201000392A patent/ES2372840B1/es not_active Expired - Fee Related
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JIN Y. ET AL "Development and clinical application of male human papillomavirus genotyping by membrane DNA chip" Zhonghua Nankexue Zazhi (2008), 14(2), pág. 106-109. Página 107, tabla 1 * |
| YANG G. ET AL., "The development and clinical application of human papillomavirus genotyping by DNA chip" Zhonghua Liuxingbingxue Zazhi (2006), 27(1), pág. 47-49. Página 48 tabla1. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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