BR112012024477B1 - Métodos para determinar a presença de um marcador biológico luminescente produtor de fóton - Google Patents

Abstract

métodos para determinar a presença de um marcador biológico luminescente produtor de fóton a presente invenção refere-se a um método para determinar a presença de um marcador biológico produtor de fóton em uma célula, tecido ou organismo de interesse. o método baseia-se na fluorescência por excitação não ligada de luminescência (fuel) e compreende as etapas de a) fornecer condições adequadas para o marcador biológico para produzir pelo menos um primeiro fóton por luminescência; b) fornecer um par de sondas fuel superior (fpp-u) disposto em proximidade à célula, tecido ou organismo, em que o pelo menos um primeiro fóton da etapa a) excita o fpp-u, o qual emite pelo menos um segundo fóton. o fpp-u pode ser selecionado a partir do grupo de pontos quânticos, nanotubos de carbono, proteínas fluorescentes, nanocristais de diamante e metaloporfirinas. este método é caracterizado em que dito marcador biológico e dito fpp-u não estão ligados e em que cada um dentre o pelo menos um segundo fóton (s) são de um comprimento de onda mais longo do que cada um dentre o pelo menos um primeiro fóton (s).

Description

“MÉTODOS PARA DETERMINAR A PRESENÇA DE UM MARCADOR BIOLÓGICO LUMINESCENTE PRODUTOR DE FÓTON” Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a um novo método para desviar para o vermelho um sinal óptico de um marcador biológico. Em particular, a presente invenção se refere a um mecanismo de excitação entre um marcador biológico luminescente e um fluoróforo. O presente Pedido de Patente também se refere aos kits para implantar um método de acordo com a presente invenção e o uso de um fluoróforo não ligado para produzir um fóton que é desviado para o vermelho em comparação a um fóton produzido por um marcador biológico.

Antecedentes da Invenção [002] O uso de marcadores biológicos que produzem um sinal óptico revolucionou diversos aspectos das ciências da vida e em particular, permitiu a observação em tempo real de fenômenos in vivo como endocitose, desenvolvimento embrionário, infecção, desenvolvimento de tumor e sinalização de cálcio. De modo crescente, essas mesmas tecnologias são também usadas para visualizar mais e mais processos biológicos e farmacêuticos in situ em uma célula alvo, tecido isolado ou organismos completos.

[003] Existem essencialmente três mecanismos para gerar um sinal óptico com base na emissão de luz usando um marcador biológico: 1. Bioluminescência. 2. Quimioluminescência. 3. Fluorescência.

[004] A bioluminescência é a produção e emissão de luz por um organismo vivo ou um fragmento do mesmo como uma enzima. A bioluminescência é uma forma de ocorrência natural de quimioluminescência (consulte abaixo), em que a energia é liberada por uma reação química na forma de emissão de luz. O trifosfato de adenosina (ATP) é envolvido na maioria das reações bioluminescentes, e então, em geral, reações bioluminescentes ocorrem in vivo.

[005] A quimioluminescência é a emissão de luz como o resultado de uma reação química. A mesma é diferente da bioluminescência, visto que os componentes da reação química não ocorrem necessariamente in vivo.

[006] A fluorescência é a emissão de luz por uma substância que absorveu radiação de um comprimento de onda diferente. Na maioria dos casos, a absorção de luz em um determinado comprimento de onda induz a emissão de luz com um comprimento de onda mais longo. A molécula fluorescente é geralmente chamada de um fluoróforo e nenhuma reação química é envolvida na emissão de luz após a excitação.

[007] Ao tomar o exemplo de bioluminescência, o uso de organismos que foram geneticamente modificados com genes que encodificam sondas bioluminescentes como aquorina ou várias luciferases permite a visualização não invasiva de muitos processos biológicos em organismos vivos e modelos pequenos de animal (1-3). O imageamento de bioluminescência é altamente sensível em razão de sinais que podem ser opticamente detectados em organismos intactos, como camundongos, em razão de níveis muito baixos de bioluminescência intrínseca de tecidos de mamíferos (4). As sondas bioluminescentes, como aquorina (5, 6) ou a enzima luciferase (bactérias, vaga-lume, Cypridina (7) ou Renilla (8)), foram incorporadas em células hospedeiras ou patógenos para imageamento bioluminescente. Essas ferramentas foram aplicadas a estudos que abrangem de infecção e desenvolvimento de tumor a sinalização de cálcio. Contudo, a maioria desses marcadores biológicos emite luz na região azul-verde-amarela (400 a 650 nm) do espectro de cor (9), que sobrepõe os espectros de absorção maiores de tecidos de mamíferos e, em particular, os espectros de absorção de oxiemoglobina, desoxiemoglobina e melanina, diminuindo então, a eficácia da detecção (1, 10). Em razão da presença desses absorvedores, um desafio maior de imageamento óptico in vivo é o alcance de níveis mais altos de sensibilidade por desenvolver sondas ópticas que emitem luz no vermelho ao espectro de próximo a infravermelho (NIR) (650 a 900 nm), que é apenas fracamente absorvido em tecidos de mamíferos vivos.

[008] Até mesmo com esses inconvenientes, o uso dessa tecnologia foi prontamente aplicado somente aos experimentos que envolvem modelos como pequenos roedores tanto anestesiados quanto não anestesiados/em movimento livre (21). Como indicado acima, em modelos de roedores pequenos (e mais geralmente, em mamíferos), a presença de várias hemoglobinas e tecidos, que são prontamente absorvidos na região azul-amarela do espectro de cor, reduz a capacidade de excitação e detecção de fluoróforos, ou monitoramento do sinal luminescente produzido por células e bactérias modificadas se o mesmo estiver no mesmo espectro.

[009] O esforço significante para aprimorar o número de fótons detectáveis de uma fonte bioluminescente levou ao desenvolvimento de uma vasta matriz de novas e/ou sondas bioluminescentes e técnicas aprimoradas que aumentam o número de fótons emitidos na região vermelha do espectro de cor (>650 nm). Não foi provada muita dificuldade em projetar fluoróforos ou proteínas fluorescentes que são tanto excitadas quanto emitidas no vermelho - próximo a infravermelho (NIR) (22).

[010] Contudo, o alcance de um desvio para vermelho semelhante à emissão bioluminescente, foi provado ser mais difícil. Um método para o estabelecimento do desvio para vermelho desejado foi feito para desenvolver variações de luciferase que podem ser emitidas nessa parte da parte de NIR do vermelho do espectro de luz. Contudo, a maioria dos mutantes/mutações desenvolvidas até agora foi levada a emissões na região amarelo-verde (9) e foi apenas um pequeno exemplo da produção bioluminescente vermelha bem sucedida (11), em que tais proteínas modificadas de NIR do vermelho geralmente produzem significantemente menos sinal do que as versões de amarelo-verde não modificadas.

[011] Dada a dificuldade em produzir bioluminescência da NIR vermelha, o esforço significante foi então usado para a criação de metodologias aplicáveis para produzir um desvio para vermelho nos fótons emitidos usando a Transferência de Energia de Ressonância de Bioluminescência (BRET) (13). Diversos grupos já demonstraram o sucesso dessa técnica que utiliza luciferases ligadas a QDs (8) ou outros fluoróforos (7) com grandes desvios de Stokes.

[012] Nesses métodos anteriores, trabalhadores investigaram a BRET ao conjugar um variante de 8 mutações de Renilla reniformis em um ponto quântico, com o R. reniformis que atua como o doador de energia e pontos quânticos (QDs) como o receptor de energia, alcançando então, um pico de emissão em 655 nm do QD após a transferência de energia (8). Mais recentemente, uma luciferase Cypridina biotinilada foi conjugada em um derivado de indocianina fluorescente de vermelho mais distante, que fornece um pico de emissão em 675 nm (7). Contudo, na BRET, o doador e receptor deve estar em íntima proximidade (menos do que 10 nm (12 a 15)) visto que o mesmo envolve uma transferência de energia não radiativa do doador luminescente ao receptor.

[013] O uso de BRET foi altamente bem sucedido, mas pode ser difícil de implantar, visto que várias técnicas sintéticas devem ser utilizadas para conjugar as luciferases doadoras ao receptor QD ou outro fluoróforo para alcançar a transferência de energia da ressonância desejada. A necessidade de ligar o marcador biológico a um QD ou outro receptor de emissão de fóton “vermelho”, pode tornar o marcador biológico menos eficiente como um meio de visualização ‘in vivo’ de uma célula, tecido ou organismo. Isso pode ser o resultado da interferência com a função ou capacidade de o marcador biológico produzir um sinal e/ou de se mover livremente de modo a estar associado com esse alvo, conforme apropriado.

Descrição da Invenção [014] Nesse pedido de patente, os inventores apresentam uma alternativa para a transferência de energia de ressonância (RET) que não exige que as fontes de doador e receptor que estão em proximidade celular íntima ainda possam fornecer o desvio para vermelho desejado nos fótons emitidos do marcador biológico. Esse fenômeno, chamado de Fluorescência por Excitação não ligada de Luminescência (FUEL), é diferente de RET em razão do doador e receptor não precisarem estar em proximidade molecular e a FUEL poder ocorrer em distâncias substancialmente maiores (mícron(s) ou outro).

[015] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção foi fornecido um método para determinar a presença de um marcador biológico produtor de fóton em uma célula, tecido ou organismo de interesse que compreende as etapas de: a) fornecer condições adequadas para um FPP-L produzir pelo menos um primeiro fóton; b) fornecer um FPP-U disposto em proximidade à dita célula, tecido ou organismo, em que dito pelo menos um primeiro fóton da etapa a) excita dito FPP-U, que emite pelo menos um segundo fóton; dito método é caracterizado pelo fato de que dito FPP-L e dito FPP-U não estão ligados e em que cada um do dito pelo menos um segundo fóton (s) é de energia mais baixa do que cada um do dito pelo menos um primeiro fóton (s).

[016] FUEL envolve o uso de um Par de sondas de FUEL (FPP) que consiste em dois componentes: o FPP inferior (FPP-L) e o FPP superior (FPP-U), ou aquele que pode ser o marcador biológico.

[017] Por exemplo, um parasita identificado por RFP pode ser introduzido às células identificadas por GFP suscetíveis e infecção de célula estudada. Nesse caso, um FPP-L, como um QD, que está também presente no sistema é estudado por emitir fótons que excitam RFP levando à emissão de fótons adicionais do RFP que podem ser detectados. Então, o marcador biológico é o parasita identificado, mas o mesmo é também o FPP-U.

[018] Alternativamente, as células identificadas por GFP podem ser o FPP-L fornecido com condições que causam a emissão de fótons, como uma fonte interna ou externa de luz excitante, esses fótons de GFP então excitam o FPP-U disposto em proximidade às células, em que os fótons do FPP-U são então detectados.

[019] Nos dois casos, a presença de um marcador biológico é detectada usando FUEL.

[020] O FPP-L pode ser o marcador biológico luminescente, esse marcador biológico pode ser, mas não está limitado a, um bioluminescente, quimioluminescente ou fluoróforos/ sondas fluorescentes que incluem proteínas fluorescentes. O FPP-U é também uma molécula luminescente que pode ser, mas não está limitado a, fluoróforos/sondas fluorescentes que incluem pontos quânticos, proteínas fluorescentes, nanotubos de carbono, nanodiamantes ou metaloporfirinas.

[021] É necessário que o espectro de emissão do FPP-L supere o espectro de excitação do FPP-U para assegurar uma produção adequada de fótons desviados para o vermelho.

[022] De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, a pluralidade de FFPs intermediários pode ser interposta em uma cascata de excitação e emissão de fóton entre o marcador biológico e o FPP-U final que produz o fóton observado. Em particular, então, a presente invenção refere-se a um conjunto de FPPs, cada dos quais tem um espectro de excitação que sobrepõe com o espectro de emissão do membro anterior na cascata e por sua vez, produz um fóton que está no espectro de excitação do próximo membro na cascata.

[023] De acordo com esse aspecto da invenção foi fornecido um método de ‘cascata’ para determinar a presença de um marcador biológico luminescente produtor de fóton em uma célula, tecido ou organismo de interesse que compreende as etapas de: a) fornecer condições adequadas para um primeiro FPP para produzir pelo menos um primeiro fóton; b) fornecer um segundo FPP disposto em proximidade a dita célula, tecido ou organismo, em que dito pelo menos um primeiro fóton da etapa a) excita dito segundo FPP, que emite pelo menos um segundo fóton; em que a etapa b) é repetida pelo menos mais uma vez, em que para cada etapa adicional, um FPP adicional é disposto em proximidade à dita célula, tecido ou organismo, diferente do dito primeiro ou segundo FPP, em que dito FPP adicional é especificamente excitado por pelo menos um fóton emitido na etapa anterior e, por sua vez, emite pelo menos o fóton adicional; em que em uma etapa final, dito fóton adicional é detectado; dito método é caracterizado em que a dita pluralidade de FPPs não está ligada e em que cada um do dito pelo menos um fóton (s) é de um comprimento de onda mais longo do que cada um do dito pelo menos um fóton (s) da etapa anterior.

[024] Em uma realização preferida desse método, dito marcador biológico é dito primeiro ou dito segundo FPP.

[025] Qualquer um dos recursos específicos detalhado no presente documento em relação às propriedades do FPP-Ls ou FPP-Us são aplicáveis à pluralidade de FPP usada nesse método de ‘cascata’.

[026] Esse método considera o uso de FPP-Us que são suficientemente excitados por fótons emitidos por um marcador biológico, como uma bactéria bioluminescente, como um meio de aprimorar a detecção não invasiva do marcador biológico in vivo. Pontos quânticos são nanocristais (10 a 40 nm em tamanho) que consistem em um material de núcleo semicondutor (por exemplo, CdSe) e um revestimento de polímero anfifílico covalentemente modificado com um polietileno glicol funcionalizado (PEG) ou outro revestimento externo (16). QDs têm um espectro de absorbância caracteristicamente amplo, e ainda um perfil de emissão estreito para aproximadamente todos os comprimentos de onda de excitação aplicáveis (17), com eficiências quânticas na faixa de 60 a 85% (18, 19).

[027] Os nanotubos de carbono são alótropos de carbono com uma estrutura cilíndrica e são membros da família estrutural de fulereno. Nanotubos de única parede podem ter um diâmetro de aproximadamente 1 nm. Nanotubos de carbono têm um grande desvio de Strokes que podem ser excitados começando em cerca de 600 nm enquanto emitem mais de 900 nm (28).

[028] As proteínas fluorescentes são de uso muito comum. A proteína verde fluorescente, inicialmente purificada de Aequorea victoria, é agora comumente clonada em muitas células e animais. Uma profusão de derivados foi desenvolvida para quase todo o comprimento de onda de excitação e emissão. Essas proteínas podem ter uma grande eficiência quântica, mas, em geral, não têm grandes desvios de Strokes.

[029] Nanocristais de diamante, ou nanodiamantes, são produzidos de materiais de diamante que têm um alto teor de nitrogênio. Esses diamantes ricos em nitrogênio são irradiados com elétrons de alta energia que criam centros de vacância de nitrogênio negativamente carregados. Os diamantes irradiados são então recozidos em altas temperaturas para aprimorar os centros. Esses materiais podem ter um tamanho nominal de 100 nm, com uma absorção centralizada em 560 nm, e emissão eficiente em 700 nm. Eles são reportados como tendo uma eficiência quântica que se aproxima de 1, são inertes química e biologicamente, e as soluções químicas de superfície podem ser realizadas nos mesmos (29, 30).

[030] As metaloporfirinas, em particular, platina, paládio, ruténio e porfirina têm diversas propriedades interessantes. Elas são comumente excitáveis em 400 nm ou menos, enquanto emitem comprimentos de onda de mais do que 650 nm. Muitas metaloporfirinas têm uma faixa de excitação secundária entre 500 a 550 nm. As metaloporfirinas listadas acima são também sensíveis a oxigênio de modo que sua intensidade luminescente e as taxas de decadência de tempo de vida são uma função da concentração de oxigênio local (31 a 33).

[031] No presente Pedido de Patente, os termos “energia de um fóton” e “comprimento de onda de um sinal de luz”, são usados para descrever vários aspectos do fóton/sinal emitido pelo FPP-L e FPP-U. Visto que a radiação eletromagnética é considerada como sendo tanto uma partícula (fóton) quanto uma onda eletromagnética, o mesmo fóton/onda terá, então, um valor de energia bem como um comprimento de onda. O relacionamento entre esses diferentes valores é direto e, geralmente falando, quanto mais baixa é a energia de um fóton, maior é o comprimento de onda. Então, quando é declarado que o segundo fóton produzido pelo FPP-U é de energia mais baixa do que o primeiro fóton produzido pelo FPP-L, é também verdadeiro/pode alternativamente ser declarado, que o comprimento de onda do segundo fóton é maior do que o comprimento de onda do primeiro fóton.

[032] De acordo com o presente pedido de Patente, o marcador biológico pode ser o FPP-L do FPP usado para desviar para o vermelho o sinal óptico usando FUEL. Alternativamente, o marcador biológico pode ser o primeiro em uma série de FPPs que, ultimamente, por meio de uma série de excitações intermediárias conduzem ao desvio para vermelho do sinal óptico.

[033] As referências ao marcador biológico podem então ser uma referência ao FPP-L ou ao primeiro em uma série de FPPs. Alternativamente, o marcador biológico pode ser o FPP-U em que o mesmo é excitado por um FPP-L presente no sistema que é estudado ou, alternativamente, o mesmo pode ser um FPP em uma cascata de FPPs.

[034] De acordo com a presente invenção, o termo “in vitro” refere-se a qualquer mistura ou solução de células, tecidos, organismos ou outros materiais derivados de um organismo vivo ou morto, em combinação com soluções químicas, reagentes sob condições predefinidas.

[035] De acordo com a presente invenção, o termo “in vivo” refere-se a qualquer operação realizada usando qualquer mistura ou solução de células, tecidos, organismos ou outros materiais derivados de um organismo vivo ou morto, em combinação com soluções químicas, reagentes sob condições predefinidas quando realizado sob um animal intacto.

[036] De acordo com a presente invenção, as condições adequadas para permitir que o marcador biológico produza pelo menos um fóton irão variar dependendo do marcador biológico selecionado. Por exemplo, no caso de um biomarcador biológico bioluminescente como luciferase, é necessário induzir/permitir a expressão dessa enzima e então fornecer condições de modo que a enzima possa produzir um sinal de luz ou in vivo, em vitro ou in situ fornecendo, se necessário, todos os reagentes de componente que a luciferase pode precisar usar. Igualmente, para um marcador biológico quimioluminescente, é necessário que todos reagentes de componente necessários para a reação estejam presentes ou no caso de um marcador biológico fluorescente, é necessário que uma fonte de luz de excitação adequada esteja presente.

[037] De acordo com a presente invenção, o marcador biológico pode estar no interior da célula alvo, tecido ou organismo; ou disposto sob algumas ou todas as superfícies do mesmo; ou tanto sobre quanto sob a superfície desses alvos.

[038] De acordo com a presente invenção, o FPP-U está próximo à célula alvo, tecido ou organismo e pode, em particular, ser localizado nessas estruturas e/ou sob sua superfície e/ou estão no meio, ao redor dessas estruturas, em condições em que a RET não ocorre. Em particular, o FPP-U deve estar perto o suficiente do marcador biológico de modo que os fótons produzidos pelo marcador biológico possam excitar o FPP-U, que por sua vez, pode produzir pelo menos um segundo fóton.

[039] De acordo com a presente invenção, o marcador biológico e FPP-U não são covalentemente, ou por qualquer outro meio, ligados uns aos outros, o que significa que eles não estão associados entre si na célula alvo, tecido ou organismo em uma maneira em que RET pode ocorrer.

[040] De acordo com o presente pedido de Patente, um marcador biológico pode ser qualquer molécula bioluminescente, fluorescente ou quimioluminescente, composto, enzima ou outra estrutura que produz fótons de uma natureza definida. Por exemplo, um Escherichia coli bioluminescente (denotada como RT57) (20) que carrega um plasmídeo que expressa o operon luxCDABE que compreende genes que encodificam produtos bioluminescentes com uma emissão centralizada em 480 nm foram usados em alguns dos exemplos detalhados no presente documento para excitar pontos quânticos tanto em condições in vitro quanto in vivo.

[041] Como indicado acima, os inventores mostraram agora que BRET não é uma etapa necessária no desvio para vermelho da saída de um marcador biológico. Por exemplo, na Tabela 1, no presente documento, o uso do filtro Cy5.5, foi observado durante uma emissão significante do FPP-U, QD705 foi observado com bactérias bioluminescentes, RT57 e QD705 foram deixados juntos, um aumento substancial ainda foi encontrado com aproximadamente 3 cm na distância total, que inclui 10 mm de Ágar, separando os dois componentes (6,10 ± 1,79 vs. 2,21 ± 1,00) resultando em FUEL. A Figura 4 mostra o fenômeno FUEL em uma distância muito maior, em que a transferência de energia de ressonância pode ocorrer.

[042] Essa comparação indica que (1) bactérias bioluminescentes podem excitar QDs a partir de uma distância substancial e (2) tais condições BRET intencionais não são necessárias para alcançar a excitação eficiente do FPP-U. A probabilidade de BRET ocorrer quando a fonte luminescente e as sondas fluorescentes não estão ligadas juntas é mínima na melhor das hipóteses, dado o tamanho relativo do emissor de fóton e o fluoróforo em comparação ao volume geral em que eles estão contidos. Dessa forma, o fato de que existem mais fótons vermelhos quando as bactérias luminescentes e QD705 estão em proximidade é mais provável em razão do número de fótons aumentado disponível para excitar o FPP-U. Em outras palavras, o fluxo de fóton observado é maior quanto mais perto o FPP-U está do marcador biológico, e em que existe um aumento na probabilidade de excitação de FPP-U pelos fótons emitidos pelo marcador biológico.

[043] Por outro lado, quanto maior é a distância entre o FPP-L e FPP-U, mais baixa é a probabilidade de excitação, o que explica a diminuição em fótons vermelhos. Dadas as distâncias de excitação substanciais (pm - cm, Figuras 3 a 6), a excitação do FPP-U é um processo radiativo e não envolve a interação dipolo-dipolo necessária para RET.

[044] O método descrito no presente documento apesar de descrito com referência particular a bioluminescência, pode ser estendido a outros sistemas de transferência de energia radiativa como fluorescência ou quimioluminescência.

[045] A falta de um contato direto entre o marcador biológico e o FPP-U que está produzindo o sinal detectado, pode, sob inspeção inicial, ser argumentada para indicar que existe uma falta de especificidade no método de FUEL, mas, como é mostrado nas Figuras 3 a 6 e na Tabela 1, a presença de um absorvedor (nesse caso, vermelho congo) demonstra a dependência de distância entre o marcador biológico e FPP-U. Então, FUEL pode identificar a presença de bactérias bioluminescentes em uma localização específica ou, potencialmente, a interação entre uma bactéria e uma célula “rotulada”. Além disso, a partir das Figuras 3, 4, 7, um indivíduo pode interferir na detecção dessas bactérias que podem ocorrer em um título mais baixo em razão do desvio para vermelho nos fótons do FPP-U, aumentando a sensibilidade geral da imagem de bioluminescência.

[046] No presente pedido de Patente, os inventores também apresentem um conjunto de experimentos in vivo, que foram realizados para determinar a viabilidade de FUEL sob condições experimentais típicas. Como é visto a partir das Figuras 9 e 10 e Tabelas 3 e 4, forte evidência existe declarando que o fenômeno de FUEL pode ser prontamente utilizado. Contudo, a eficácia e utilidade de FUEL para imageamento de bioluminescência é amplamente dependente do FPP-U.

[047] Os inventores consideram QDs como sendo adequados para o uso em um curto prazo do FPP-U, de acordo com a tecnologia de FUEL descrita no presente documento, em que existem muitas razões para utilizar QDs para o imageamento de bioluminescência que incluem, espectro de absorção ampla, espectro de absorção estreita, desvio de Strokes significante e uma eficiência quântica que se aproxima de 1. Os QDs devem estar presentes nos hospedeiros ou no alvo no momento da medida(s). No caso da Figura 9, os camundongos foram imageados imediatamente após a injeção (controles mostraram que não existiu nenhuma difusão significante em diversas horas podendo alterar a quantificação de bactérias, pontos quânticos ou sua interação de FUEL).

[048] Portanto, os inventores demonstraram que não é necessário usar BRET para fótons bioluminescentes de desvio para vermelho para o vermelho mais profundo opticamente desejável ou NIR. Uma excitação não ligada de luminescência pode e ocorre entre um marcador biológico, como bactérias bioluminescentes e um FPP-U chamado de um QD, com essa transferência que ocorre em distâncias substanciais, se nenhum absorvedor bioluminescente estiver presente.

[049] Os inventores mostraram que o uso de FUEL pode aumentar substancialmente o número de fótons vermelhos tanto em aplicações in vitro quanto in vivo, aumentando então, a sensibilidade do imageamento bioluminescente.

[050] De acordo com aspectos adicionais da presente invenção, então o marcador biológico é bioluminescente.

[051] Uma profusão de moléculas bioluminescentes está agora sendo rotineiramente usada para rotular, isolar e monitorar os vários componentes de células, vírus e materiais relacionados. Exemplos incluem aquorina ou enzimas produtoras de fótons como um produto da reação que eles catalisam como luciferases de vários organismos. Todos os marcadores bioluminescentes e variantes podem ser usados como o FPP-L de acordo com o presente pedido de Patente.

[052] Alternativamente, o marcador biológico é quimioluminescente.

[053] Alternativamente, o marcador biológico é fluorescente.

[054] Em particular o marcador biológico emite fótons com um comprimento de onda menor do que 650 nm.

[055] Mais particularmente, o marcador biológico emite fótons com um comprimento de onda de 400 a 650 nm [056] Em particular, o FPP-U emite fótons com um comprimento de onda mais longo do que o comprimento de onda dos fótons emitidos pelo FPP-L.

[057] Em particular, o FPP-U emite fótons com um comprimento de onda de 650 a 900 nm.

[058] Embora as faixas de emissão específica sejam fornecidas para o FPP-L e FPP-U, esses componentes não estão necessariamente limitados por faixas de comprimento de onda, o recurso técnico chave é que cada FPP-L tem um mais curto do que seu FPP-U, visto que o espectro de emissão do FPP-L sobrepõe o espectro excitação/absorção do FPP-U e que em geral, o fóton emitido pelo marcador biológico (se FPP-L ou FPP-U) é mais facilmente detectado.

[059] De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, o marcador biológico e/ou FPP-U pode ser apresentado como cópias únicas ou múltiplas na célula, tecido ou organismo que é trabalhado.

[060] De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, o método compreende determinar a presença de pelo menos dois marcadores biológicos produtores de fóton em uma célula, tecido ou organismo; em que cada um dos pelo menos dois marcadores biológicos emite fótons em uma faixa de não sobreposição de comprimentos de onda que excitam pelo menos um dos dois subconjuntos do dito FPP-U que emite pelo menos um fóton, em que o pelo menos um fóton emitido por cada subconjunto de FPP-U está em uma faixa de não sobreposição de comprimentos de onda.

[061] Assim como a utilização de FUEL para transduzir o sinal de um único tipo de marcador biológico, deve também ser possível transduzir diversos sinais de não sobreposição de diversos marcadores biológicos por fornecer diferentes subconjuntos de FPP-Us. Além disso, cada um desses subtipos de FPP-U emite sinais de não sobreposição para permitir que os diferentes sinais biológicos diferentes sejam visualizados.

[062] De acordo com esse aspecto particular da presente invenção, os diferentes subconjuntos de FPP-Us podem ser o mesmo tipo de molécula ou alternativamente, eles podem ser de diferentes tipos de moléculas. Em uma realização preferida, um subconjunto do FPP-U é um QD e os outros subconjuntos é uma nanotubo de carbono.

[063] Em particular, os FPP-Us compreendem o meio para direcioná-los a porções específicas da dita célula, tecido ou organismo.

[064] Uma variedade de meios está disponível para direcionar uma molécula ou composto particular a uma localização intra ou extracelular, que inclui sinais de localização nuclear, célula que penetra peptídeos, anticorpos e aptâmeros. A combinação de tal componente com o FPP-U deve então permitir que o FPP-U seja posicionado em uma localização ideal de modo a receber (se presente) os fótons do marcador biológico e transformar os mesmos em um sinal detectável.

[065] Em particular, o marcador biológico pode ser livre ou associado com um componente da célula alvo, tecido ou organismo. Por exemplo, o marcador biológico pode ser parte de uma proteína de fusão.

[066] Em particular, o FPP-U é disposto dentro da célula, tecido ou organismo.

[067] Alternativamente, o FPP-U é disposto fora da célula, tecido ou organismo.

[068] Alternativamente, o FPP-U é disposto dentro e fora da célula, tecido ou organismo.

[069] Ao usar os mecanismos específicos listados acima para posicionar um FPP-U dentro ou fora de uma célula, tecido ou organismo de interesse, ou simplesmente por cronometrar a etapa de visualização de modo a permitir que o FPP-U difunda completamente ao alvo, o presente método permite, conforme apropriado, o posicionamento do FPP-U de modo a elucidar melhor o sinal produzido pelo marcador biológico.

[070] De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, o marcador biológico (FPP-L) e seu par (FPP-U) podem ser associados uns com os outros, como componentes de uma molécula maior, porém, o FPP-L e FPP-U não são associados uns com os outros de modo a permitir que RET ocorra.

[071] De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, foi fornecido um kit para realizar o método de acordo com a presente invenção, que compreende pelo menos: pelo menos um FPP-U de acordo com a presente invenção; e instruções para a realização do método de acordo com a presente invenção em que o pelo menos um FPP-U tem um espectro de excitação que sobrepõe o espectro de emissão de um marcador biológico e então, quando disposto em proximidade ao marcador biológico em um sistema estudado, emitirá fótons por meio do mecanismo de FUEL que por sua vez, pode ser detectado.

[072] Em particular, de acordo com esse aspecto da presente invenção, o kit pode compreender pelo menos um marcador biológico de acordo com a presente invenção.

[073] Em particular, o kit ainda compreende um composto que absorve os fótons produzidos pelo dito marcador biológico.

[074] Ao fornecer um absorvedor dos fótons produzidos pelo marcador biológico, o usuário do kit ao realizar o método pode controlar a distância entre o marcador biológico e FPP-U que permitirá que o FPP-U seja excitado, dada a presença do absorvedor, em que haverá uma redução nessa distância como uma função de sua concentração. Uma profusão de possíveis absorvedores é conhecidas para todo comprimento de onda de emissão concebível do marcador biológico e todos os absorvedores são abrangidos pelo presente pedido de Patente.

[075] De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, foi fornecido um kit para realizar o método de acordo com a presente invenção, que compreende: pelo menos um FPP-L, de acordo com a presente invenção; e instruções para a realização do método de acordo com a presente invenção [076] Em que o pelo menos um FPP-L tem um espectro de emissão que sobrepõe o espectro de excitação de um marcador biológico e então, quando disposto em proximidade ao marcador biológico em um sistema estudado, fará com que o marcador biológico emita fótons por meio do mecanismo de FUEL que por sua vez pode ser detectado.

[077] De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, foi fornecido um kit que compreende uma pluralidade de FPPs com espectros de emissão e excitação de sobreposição sequencial que podem ser usados em um sistema de FPP de cascata como detalhado no presente documento.

[078] De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, foi fornecido o uso de FPP-U, por exemplo, QDs não ligados, para determinar a presença de um marcador biológico produtor de fóton em uma célula, tecido ou organismo de interesse em que FUEL ocorre entre o marcador biológico e QDs não ligados, que levam a um desvio para vermelho do sinal emitido pelo marcador biológico.

[079] De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, foi fornecido o uso de FPP-L, para produzir um fóton e determinar a presença de um marcador biológico em uma célula, tecido ou organismo de interesse em que FUEL ocorre entre o FPP-L e o marcador biológico, que leva a um desvio para vermelho do sinal.

[080] Para um melhor entendimento da invenção e para mostrar como o mesmo pode ser transportado em efeito, será agora mostrado como forma de exemplo apenas, realizações específicas, métodos e processos de acordo com a presente invenção com referência aos desenhos anexos em que: - Figura 1: Espectros de Absorção e Emissão de Diferentes Elementos do Experimento. A. Espectro de emissão de RT57, espectro de excitação e emissão de QD705, e o espectro de absorção de vermelho congo. A região fragmentada (///) indica a sobreposição espectral entre a emissão de RT57 e a excitação de QD705. B. Espectros de absorção de pulmão, sangue e fígado de camundongo. - Figura 2. Excitação não ligada de QD705 usando E. coli. Bioluminescente. A água fisiológica (Coluna 1), RT57 (Coluna 2), QD705 (Coluna 3), e uma mistura de RT57 e QD705 (Coluna 4) foram aliquotadas em tubos Eppendorf de 1,5 ml separados e a luminescência resultante é observada sob conjunto de filtros Open e Cy5.5 (Linhas 1 e 2, respectivamente) com o ajuste de tempo de exposição em 5 s. sob o conjunto de filtro Open, níveis semelhantes de luminescência foram observados tanto para RT57 quanto para RT57+QD705, enquanto nenhuma luminescência foi observada para os dois controles. Um aumento substancial no número de fótons foi observado para a mistura RT57+QD705 como comparado ao RT57 sozinho quando observado sob um conjunto de filtro Cy5.5. A presença do QD705 foi confirmada por excitação de fluorescência usando um tempo de exposição de 0,25 s (Linha 3). - Figura 3: Configuração experimental para a Determinação de Dependência de Distância de FUEL. A. Diagrama esquemático que mostra o posicionamento de placas e a localização de RT57 e o QD705. As distâncias entre as bactérias e QD705 são indicadas. B. Fotografia das configurações de placa da Condição 1 (quatro placas de ágar) e Condição 2 (duas placas de Ágar e duas placas de CRAgar). - Figura 4: Experimento de crescimento durante a noite para a Condição 2. A. Curva de crescimento durante a noite de bactérias bioluminescentes sob a Condição 2. B. Exemplo da imagem de ponto da última vez para a Condição 2. C. Comparação de Colunas 2, 3 e 4 com a Coluna 1 que mostra o aprimoramento dos fótons detectáveis. - Figura 5: A dependência de distância do feito de FUEL. Uma alíquota de E.coli bioluminescente (não visível: alíquota coberta por um pedaço de papel preto) é colocada entre dois frascos preenchidos com ou QD705 (Esquerdo) ou água (Direito) em distâncias crescentes e a luminescência resultante detectada. Intensidades de luminescência normalizadas a partir do efeito de FUEL como uma função de distância. A dependência de distância do efeito de FUEL foi repetida em triplicado usando três diferentes culturas bacterianas. - Figura 6. Excitação de distância de QD705 usando RT57. Uma alíquota de estoque de RT57 foi colocada no centro de uma placa de Petri. Alíquotas de QD705 foram colocadas em intervalos crescentes de 0,5 cm (centro para centro) do RT57 até uma distância de trabalho total de 2 cm. (A) A luminescência resultante sob o conjunto de filtro Cy5.5. (B) Verificação de localizações de alíquota de QD705 usando excitação de fluorescência. (C) Emissão de QD705 decrescente como uma função de distância do RT57. - Figura 7: Aumento em geração de fóton vermelho a partir da adição de QD705 foi apurado usando diversas condições experimentais que foram estabelecidas usando dois frascos de quartzo do tipo tandem separadas por um pedaço de papel preto. Uma janela pequena foi cortada no papel para permitir que os fótons bioluminescentes passem. - Figura 8. Detecção de luminescência aprimorada através de amostras de ex vivo. A luminescência de três misturas distintas de RT57+QD705 foi observada através de MWB, fígado homogeneizado, ou pulmão homogeneizado, e normalizado pela luminescência observada a partir do RT57 sozinho sob as mesmas condições. Enquanto um aumento no número de fótons observados foi encontrado para a mistura sob o conjunto de filtro Open (Esquerdo), um aumento bastante considerável no número de fótons vermelhos foi observado sob o conjunto de filtro Cy5.5 (Direito). - Figura 9: Exemplo in vivo de aprimoramento de fóton detectável na presença de QD705. Imagens foram adquiridas em conjuntos de filtro Open, 610LP, e Cy5.5 após injeção intramuscular na coxa de bactéria e bactéria + QD705. - Figura 10: Demonstração in vivo de FUEL. Duas diferentes pérolas de Ágar foram inseridas subcutaneamente na coxa Esquerdo e Direito de um camundongo fêmea. Cada pérola consistia em uma agarose+núcleo de RT57. Uma segunda camada ou de agarose ou de uma mistura de QD705 em agarose foi adicionada ao núcleo de pérola, criando o controle ou pérola de FUEL, respectivamente. Os camundongos foram então colocados no sistema de imageamento e vistos ventralmente e dorsalmente, através tanto de conjuntos de filtro Open quanto de QD705. Como pode ser visto, um aprimoramento de fóton vermelho limitado é observado quando os camundongos são vistos ventralmente sob o conjunto de filtro Open. Em razão da presença de apenas uma fina camada de pele, apenas um efeito de FUEL limitado foi esperado. Contudo, o efeito de FUEL é facilmente observado sob o filtro QD705. Os camundongos foram então girados de modo que qualquer luminescência de pérola tenha que passar através da coxa inteira do camundongo antes de alcançar o detector. Nesse caso, a potência de FUEL é facilmente observada em um aumento significante no número total de fótons observados, tanto nos conjuntos de filtro Open quanto em QD705. - Figura 11: Uma representação esquemática de modelo de FUEL in vivo. O E.coli bioluminescente radia luz em todas as direções. Na falta de QD705, alguns dos fótons emitidos serão absorvidos por quaisquer refrescantes (por exemplo, hemoglobina) que estão presente in vivo. Quando o QD705 está em próximo ao RT57, alguns dos fótons emitidos serão incidentes sob o QD705, induzindo um evento fluorescente que produz fótons desviados para o vermelho que são insuficientemente absorvidos pelos mesmos refrescantes. A produção aumentada de fótons vermelhos leva a um sinal de luminescência vermelha aumentada e especificidade para todo o imageamento animal.

[081] Será agora descrito como forma de exemplo um modo específico implantado pelos inventores. Na seguinte descrição, numerosos detalhes específicos são apresentados para fornecer um entendimento completo. Será aparente, contudo, a elementos versados na técnica, que a presente invenção pode ser praticada sem limitação a esses detalhes específicos. Em outros exemplos, métodos e estruturas bem conhecidas não foram descritos de modo a não a confundir desnecessariamente a descrição.

Exemplo 1: Materiais e Métodos Reagentes Comuns [082] O E. coli bioluminescente que carrega o plasmídeo que expressa o operon lux (pUC18-mini-Tn7T-Gm-lux referido como RT57) é descrito em Choi et al. (20) e é observado como RT57 por toda a parte. Os pontos quânticos não direcionados de Qtracker 705 foram adquiridos a partir de Invitrogen e mantidos no escuro em 4°C até o uso (observado como QD705). Para preparar as placas de Agar, 25 ml de ágar estéril morno foram adicionados a uma placa de Petri de 10 cm sob condições estéreis e deixadas resfriar. Vermelho congo (Sigma) foi preparado como 1 % de p/v em H2O estéril. Agarose de baixo ponto de fusão (Lonza, França) foi usado para construção de pérola. Solução salina fisiológica normal (0,9% de NaCl, referido como PS) foi preparada domesticamente e foi usada para todas as diluições. Para o vermelho congo + placas de Ágar (CRAgar), 4 ml de 1% de p/v de vermelho congo (Sigma) em H2O estéril foram adicionados a 400 ml de ágar estéril morno para uma concentração de corante final de 0,01% em Ágar. A solução foi bem misturada e então 25 ml foram adicionados a uma placa de Petri de 10 cm e deixada resfriar. Os pratos resultantes contêm uma camada de Ágar ou CRAgar 5 mm de espessura. Após o Ágar e CRAgar ser solidificado, as placas preparadas foram invertidas e armazenadas em 4 °C até serem usadas. Para todos os experimentos animais, camundongos fêmea de seis semanas de idade Balb/c (Janvier, França) foram usados.

Preparação de Bactérias [083] No dia antes de imageamento, uma cultura durante a noite do RT57 foi estabelecida. Na manhã seguinte, o OD600 foi adquirido e quando necessário, chapeado, dependendo da diluição apropriada realizada para alcançar uma concentração final de 1.000 bactérias/5 pl de solução salina. As bactérias foram então chapeadas dependendo da orientação desejada (geralmente uma matriz de 3 x 4 de 5 pl de alíquotas).

Excitação de Distância Longa de QD705 [084] A fita preta foi usada para criar duas janelas ópticas de 2 mm x 3 mm em um frasco descartável de volume reduzido (Ratiolab, Alemanha), com as duas janelas situadas em faces opostas do frasco, e localizadas perto, porém, longe, da base. Esse frasco modificado foi preenchido com 1 ml de estoque de RT57 de uma cultura durante a noite, coberto por um pedaço de papel preto, e colocado no sistema de imageamento Ivis. O papel preto inibiu a observação da bioluminescência de RT57. Dois frascos de volume reduzido não modificado foram preenchidos com ou 1 ml de PS, ou 1 ml da solução de QD705 previamente descrita, foram então colocados sobre ou ao lado do frasco modificado contendo RT57 de modo que os três frascos sejam axialmente alinhados e em uma distância de 10 mm entre os frascos central e exterior (face a face). A luminescência resultante foi observada para os conjuntos de filtro Open e QD705. Após aquisição, a distância entre os dois frascos não modificados e o frasco central foi aumentada por 5 mm, e a luminescência foi observada. Isso foi repetido até uma separação total de 30 mm para três diferentes culturas bacterianas.

[085] Em um experimento alternativo, uma alíquota de 5 pl de RT57 de estoque foi colocada no centro de uma placa de Petri vazia. Começando em uma distância de 5 mm (centro para centro) das bactérias, alíquotas de 2 pl de QD705 foram colocadas irradiando para fora, aumentando em 5 mm os intervalos até uma distância total de 2 cm. A placa foi imageada para 300 s usando o conjunto de filtro QD705 específico. Uma imagem de fluorescência foi adquirida para verificar a localização de QD705.

Aumento em Geração de Fóton Vermelho a Partir da Adição de QD705.

[086] Múltiplas condições experimentais foram estabelecidas usando dois frascos de quartzo do tipo tandem (tabela de inserção da Figura 7, PS: solução salina fisiológica; QD705: solução de QD705; RT57: E.coli bioluminescente; CR: Vermelho congo) separados por um pedaço de papel preto. Uma janela pequena foi cortada no papel para permitir que os fótons bioluminescentes passem. O papel também forneceu uma separação física entre os dois frascos assegurando que nenhum contato físico possa ocorrer entre o QD705 e o RT57. Para cada condição, a intensidade luminescente foi observada sob os dois os conjuntos de filtro RT57 e QD705 específicos (observados como 480 e QD705 respectivamente), com cada condição realizada em triplicado.

Aquisição Espectral [087] Um espectrômetro de trajetória dupla UV/Vis de Perkin- Elmer com uma largura de fenda 1 nm e ajustado em uma taxa de varredura de 480 nm/min foi usado para adquirir os espectros de absorção para o vermelho congo, sangue, fígado, e pulmão do camundongo completo (Figura 1). Água estéril foi usada como referência. Para cada aquisição, 1 ml de cada analito foi adicionado a um frasco de plástico de 1 ml com um comprimento de trajetória de 1 cm. O espectro de emissão de bioluminescência de RT57 foi gravado com um espectrofluorímetro PTI Quanta-Master QM4CW (PTI, Lawrenceville, NJ) usando um frasco de quartzo de comprimento de trajetória de 1 cm termoestatizado em 25 °C. A luminescência foi gravada de 400 a 750 nm com 5 nm de larguras de fenda. Os espectros de excitação e emissão de QD705 foram adquiridos com 5 nm de larguras de fenda.

IMAGEAMENTO IN VITRO DE BIOLUMINESCÊNCIA

[088] Um sistema de imageamento de animal completo IVIS 100 (Xenogen Corporation, Caliper Life Sciences, Alameda, CA) equipado com um CCD resfriado e uma roda de filtro foi usado para adquirir todas as imagens bioluminescentes. Os filtros usado foram um 610 de passagem longa (610LP) e um Cy5.5 de passagem de banda (695 nm a 770 nm, também referido como o Filtro QD705). Um local na roda de filtro foi mantido vazio para detecção de luz total, denominado conjunto de filtro Open. Para cada experimento, o CCD foi resfriado em -105 °C e a caixa preta foi aquecida em 37 °C. A menos que declarado de outra forma, as configurações de aquisição para o software Living Image (Xenogen) versão 3.1 foram ajustadas como o seguinte: tempo de aquisição de 5 minutos para todos os conjuntos de três filtros, 8x bin, campo de visão C (20 cm), e f-stop 1. No caso de um experimento curso de tempo, uma sequência de imagem foi estabelecida de modo que as imagens de Open, 610LP, e Cy5.5 sejam adquiridas sequencialmente e então seguidas por um atraso de 45 minutos criando um ciclo de imagem de uma hora. Esse ciclo foi deixado repetir até desejado.

Excitação de Distância de Pontos Quânticos Usando Bactérias Bioluminescentes não Ligadas [089] Duas diferentes condições foram estabelecidas para medir o efeito de distância na produção de fóton de RT57-QD705, com a Condição 1 que envolve quatro placas de Ágar e a Condição 2 usando duas placas de Ágar e duas placas de CRAgar (Figura 3). Antes da disposição das bactérias e QD705, as placas exigidas foram removidas do armazenamento de 4 °C, deixadas amornar em temperatura ambiente, e verificadas para contaminação. Para a Condição 1, doze alíquotas de 5 pl da solução bacteriana foram pipetadas em uma matriz de 3 linhas por 4 Colunas (3 x 4) em uma placa de Ágar com gentamicina em uma concentração final de 50 pg/ml. As gotículas de bactérias, contendo 1.000 células cada, foram deixadas acomodar no Ágar (Placa 1). Uma segunda placa de Ágar foi colocada de lado até a construção final da pilha de placa (Placa 2). Três alíquotas de 2 pl de QD705 foram então pipetadas na terceira placa de Ágar (Placa 3) de modo que, quando empilhadas no topo da placa contendo as bactérias (Placa 1), cada alíquota de QD705 deve ser verticalmente alinhada com cada alíquota de bactérias para a Coluna 3. Um segundo conjunto de alíquotas de QD705 foi colocado na quarta placa de Ágar (Placa 4) com cada alíquota alinhada com as bactérias correspondentes da Coluna 4 na Placa 1. Finalmente, após assegurar que as bactérias foram acomodadas no Agar, uma alíquota de 2 pl de QD705 foi adicionada diretamente em cada alíquota bacteriana localizada na Coluna 2 na Placa 1. As placas foram invertidas e empilhadas em ordem com a Placa 1 no fundo, então, a Placa 2 vazia, seguida pelas placas 3 e 4. A pilha foi então colocada no Ivis 100 e a sequência de imagem iniciada. Para a Condição 2, o mesmo procedimento foi seguido, exceto as placas 2 e 3 que consistiam em CRAgar ao invés de Agar. A altura total de placa foi medida como sendo de 14 mm com uma profundidade de Ágar ou CRAgar de 5 mm (Figura 3). A distância total entre o RT57 e a alíquota de QD705 correspondente foi como a seguir: 0 mm para a Coluna 2, 28 mm para a Coluna 3, e 42 mm para a Coluna 4.

Excitação Não Ligada de QD705 [090] Para determinar se o RT57 bioluminescente foram capazes de excitar o QD705 sem a necessidade de ligação física, uma série de tubos Eppendorf de 1,5 ml foi preparada. O primeiro tubo incluiu 10 pl de estoque bacteriano diluído até 100 pl usando solução salina fisiológica (PS). Um segundo tubo foi preparado usando 10 pl de estoque bacteriano, 4 pl de QD705, e 86 pl de PS. Dois controles luminescentes foram estabelecidos com o primeiro incluindo 4 pl de QD705 diluídos até 100 pl e o segundo consiste em 100 pl PS apenas. Todos os quatro tubos foram gentilmente misturados por pipeta para criar soluções homogêneas e colocadas no sistema de imageamento separadores plásticos pretos com separadores plásticos pretos colocados entre cada tubo para minimizar cruzamento de sinal. A bioluminescência resultante foi observada para 5 s sob os dois conjuntos de filtro. A presença de QD705 foi confirmada usando imageamento de fluorescência.

Imageamento Bioluminescente Ex vivo [091] Três camundongos fêmea de seis semanas de idade Balb/c foram anestesiados com Cetamina/Xilazina. Para cada camundongo, uma punção cardíaca foi realizada para obter cerca de 1 ml de sangue. O fígado foi removido e colocado em 2 ml de PBS resfriado. Finalmente, os pulmões foram também removidos e colocados em 1 ml de resfriado PBS. Os órgãos foram então homogeneizados usando um homogeneizador mecânico e, junto com o sangue, foram mantidos em gelo até uso adicional. Cada camundongo foi sacrificado por deslocamento do pescoço. Os órgãos foram então homogeneizados usando um homogeneizador mecânico e junto com o sangue, foram mantidos em gelo até uso adicional. Todos os experimentos animais foram feitos de acordo com Regulamentos de Ética Nacional Francesa.

[092] Antes da preparação do camundongo, uma placa de 96 poços de fundo de vidro preto foi alterada de modo que a base da placa possa descansar uniformemente em uma placa de Petri de 10 cm. Um pedaço de papel preto que tinha doze orifícios de 1,5 mm de diâmetro em uma orientação 3 x 4 foi colocado entre uma placa de 96 poços e uma placa de Ágar de modo que os buracos sejam alinhados de maneira apropriada com os poços da placa de 96 poços. Alíquotas de 5 pl de estoque de bactérias foram então pipetadas no Ágar diretamente alinhadas com os buracos e os poços. Após ter tempo para se acomodar, alíquotas de 2 pl de QD705 foram colocadas na segunda e quarta Colunas de bactérias. A configuração foi então colocada no Ivis 100 em 37°C e a bioluminescência foi confirmada. Então, 50 pl de alíquotas de sangue, fígado homogeneizado ou pulmão homogeneizado de cada camundongo foram apropriadamente distribuídas e a sequência de imagem previamente descrita foi adquirida.

Imageamento Bioluminescente In vivo [093] Camundongos fêmeas Balb/c foram anestesiados com isoflurano (2,5%). sob anestésico, camundongos foram injetados intramuscularmente na coxa Esquerdo em uma profundidade de 3 mm com 25 a 50 pl de suspensão bacteriana com ou sem QDs e imageados usando o IVIS 100. Uma imagem de campo claro foi tomada primeiro e seguida por imagens bioluminescentes com os filtros Open, 610LP, e Cy5.5. Imagens foram analisadas usando o software Living Image (v 3.1, Xenogen corp.).

Imageamento de FUEL in vivo Usando “Pérolas” [094] Para demonstrar FUEL in vivo, 2% de pérolas de agarose que consistem em um núcleo baseado em RT57 em camadas por agarose ou uma mistura de agarose e QD705 foram construídas. Brevemente, para criar uma “pérola” individual, 12,5 pl de estoque de RT57 foi misturado com 12,5 μΙ morno de 4% de agarose e pipetadas em parafilme. Após o núcleo de pérola de 25 μΙ ser deixado resfriar, uma mistura ou de 5 μΙ de PS ou de estoque de QD705 de 5 μl e 7,5 μl de 5% de agarose foi pipetada no núcleo de pérola, formando as pérolas de controle e de FUEL, respectivamente. Após a construção das pérolas, três camundongos fêmea de seis semanas de idades Balb/c foram quimicamente anestesiados usando Cetamina/Xilazina. Os membros posteriores, tanto os lados dorsal quanto ventral, de todos os três camundongos foram então raspados usando um barbeador elétrico. Uma pequena incisão foi colocada no interior dos dois membros posteriores, permitindo a disposição subcutânea ou da pérola de controle (RT57) ou de FUEL (RT57 e QD705). Os camundongos foram então colocados no Ivis 100 e a luminescência observada a partir lado ventral para os dois conjuntos de filtro Open e QD705. Os camundongos foram então girados e a luminescência observada a partir do lado dorsal para os dois conjuntos de filtro.

Exemplo 2: Resultados Comparação Espectral [095] Uma plotagem de absorbância UV/Vis normalizada de vermelho congo (CR) sobreposta com o espectro de emissão de bioluminescência do RT57 e o espectro de emissão/excitação do QD705 podem ser vistos na Figura 1A. Como é mostrado, o espectro de excitação do QD705 sobrepõe grandemente a emissão bioluminescente, enquanto a emissão de fluorescência do QD705 foi encontrada como sendo centralizada em 703 nm. Para adquirir um espectro de absorbância útil, o sangue foi diluído 300 vezes em H2O estéril, enquanto o fígado e o pulmão foram diluídos 200 vezes cada um, também em H2O estéril (Figura 1B).

[096] Como pode ser visto a partir das Figuras 1A e 1B, a emissão do QD705 é localizada em uma região de absorção mínima e o espalhamento pelo sangue, fígado, e pulmão durante a emissão bioluminescente do RT57 é grandemente perturbada pelos agentes de espalhamento/absorção. As localizações dessa emissão máxima ilustram grandemente o benefício de desvio para vermelho dos fótons emitidos.

Excitação Não Ligada de QD705 por Bactérias Bioluminescentes em Suspensão [097] Para determinar se E. coli bioluminescente pode excitar QD705 sem a necessidade de qualquer solução química de acoplamento ou ligação, soluções de RT57 e QD705 foram distribuídas sozinhas ou misturadas em tubos separados e a produção resultante de luminescência foi comparada a três controles (RT57 sozinho, QD705 sozinho, e PS) sob dois diferentes conjuntos de filtro de emissão (Open e Cy5.5).

[098] Como pode ser visto a partir da Figura 2, tanto o RT57 quanto o RT57+QD705 emitem fótons na presença do filtro Open. Como esperado, nenhuma luminescência foi observada a partir de controles bioluminescentes (QD705 ou PS sozinho; Colunas 1 e 3, linhas 1 e 2). Na presença de RT57 foi observado sinal bioluminescente robusto comparável da falta de filtros de emissão (Colunas 2 e 4, linha 1), com bactéria sozinha (Coluna 2, linha 1) e com RT57+QD705 (Coluna 4, linha 1).

[099] Contudo, ao fortalecer contraste quando observado através do filtro de emissão Cy5.5, foi observada algumas dez vezes mais de sinal a partir de RT57+QD705 (Coluna 4, linha 2) em comparação com bactérias luminescentes sozinhas (Coluna 2, linha 2), o que sugere que uma presença de QD705 cause um desvio no comprimento de onda da luz emitida, de modo que parte da mesma passe agora através de um filtro de emissão de vermelho profundo. Nenhuma luminescência foi observada a partir dos controles. Isso sugere fortemente que bactérias bioluminescentes sozinhas possam excitar o QD705. Um espectro de emissão de bioluminescência normalizado do RT57 e o espectro de emissão/excitação do QD705 são mostrados (Figura 1). O espectro de excitação do QD705 é sobreposto com a emissão de pico de bioluminescência de RT57 enquanto a emissão de fluorescência do QD705 foi centralizada, como esperado, em 705 nm. Em vista da sobreposição espectral e dos resultados apresentados aqui, a bioluminescência de RT57 sozinha é suficiente para excitar o QD705.

Dependência de Distância da Luciferase Bacteriana - Par de Sondas de FUEL DE QD705 [0100] Um modelo simples que imita absorção óptica de sangue, fígado, e pulmões de camundongo foi desenvolvido para demonstrar a importância de desvio para vermelho dos fótons bioluminescentes por meio de excitação trivial. O pigmento comum vermelho congo (CR) foi encontrado para ter um espectro de absorção que, semelhante ao sangue, fígado, e pulmões, de camundongo sobreposto com o RT57. O CR também exibiu absorbância muito pequena em 705 nm. O efeito do absorvedor, CRAgar, em os fótons detectáveis foi observado por empilhar placas de Ágar e CRAgar acima das alíquotas do RT57 e RT57+QD705 sob duas diferentes condições (Figura 3). Como descrito previamente, três aquisições consecutivas de 5 minutos foram adquiridas usando um diferente conjunto de filtro para duas condições diferentes. A condição 1 incluiu o uso de quatro placas de Ágar padrão enquanto a Condição 2 substituiu as duas placas de Ágar centrais por placas de CRAgar (Figuras 3A e 3B). Experimentos de crescimento foram repetidos em triplicados para cada condição, e foram observados usando o Ivis 100. A Figura 4A mostra o aumento no fluxo de fóton total para a Condição 2 ao longo do tempo enquanto a Figura 4B mostra uma imagem bioluminescente típica adquirida no fim de um experimento de crescimento para a Condição 2. Como pode ser visto, a Coluna 2 (RT57+QD705) é significantemente mais brilhante do que as outras Colunas. Essa diferença pode ser mais claramente observada na Figura 4C. No presente, o fluxo de fóton total para as Colunas 2, 3, e 4 foi normalizado na Coluna 1 (RT57 apenas). Um aumento significante no fluxo de fóton total é observado para a Coluna 2, um pequeno aumento para a Coluna 3, e essencialmente nenhum aumento na Coluna 4.

[0101] Como é visto na Tabela 1, existe um aumento no fluxo de fóton para a Coluna 2 nas duas Condições sob o conjunto de filtro Open. Um aumento semelhante é também observado para a Coluna 3 na Condição 1, enquanto um aumento menor é observado para a Condição 2. Isso pode ser explicado em razão da presença das placas de CRAgar na Condição 2. A placa de CRAgar situada entre a placa 1 e a placa 3 diminui o número de fótons de RT57 disponível para excitar o QD705 que fica na Placa 3. Isso é importante em razão desse efeito sugerir que o QD705 deve estar opticamente disponível ao RT57 para ter o desvio em ocorrência de fótons. A evidência adicional disso é também vista quando a Coluna 4 é comparada à Coluna 1 para a Condição 2. No presente, a razão entre as Colunas é centralizada em cerca de 1, que indica que não existe nenhum aprimoramento quando duas placas de CRAgar estão presentes. Além disso, para a condição 1, um aprimoramento leve é observado até mesmo com duas placas de Ágar entre o RT57 e o QD705 (Coluna 4). Então, sem o absorvedor, não existe nenhuma especificidade para a excitação do QD705. A bactéria podem ser uma distância substancial. Isso não é desejado ao observar a evolução bacteriana em um animal. Sob cada condição e para cada conjunto de filtro, o aprimoramento máximo é observado para a Coluna 2 (RT57+QD705). O aprimoramento aumentado observado para os dois conjuntos de filtro 610LP e Cy5.5 verifica o desvio para vermelho dos fótons bioluminescentes em razão da presença de QD705.

Tabela 1. Dependência de Distância de Excitação de QD705 com RT57 Bioluminescente.* *Cada Coluna foi normalizada para a Coluna 1 da Condição correspondente, n = 24.

[0102] Contudo, ao procurar na razão de aprimoramento da Tabela 1, um indivíduo não deve assumir que o conjunto de filtro Cy5.5 é ideal em razão de muito menos fótons serem atualmente detectados em razão a passagem de banda. Esse filtro é muito mais específico para a emissão do QD705. Enquanto o 610LP permite que muitos fótons alcancem o CCD diferente de Cy5.5, ele é ainda menor do que o Open. Dessa forma, enquanto a razão de aprimoramento é menor, o número de fótons detectado é muito maior. Com o conjunto de filtro Open, um indivíduo alcança uma sensibilidade aumentada, adquirindo os fótons emitidos do QD705 e qualquer RT57 não absorvido e não espalhado, durante o uso do 610LP ou do Cy5.5 permitindo uma especificidade aumentada ao QD705.

[0103] Em um conjunto adicional de experimentos, uma alíquota de E.coli bioluminescente (não visível: coberto por um pedaço de papel preto) foi colocada entre dois frascos preenchidos ou com QD705 (Esquerdo) ou com água (Direito) em distâncias crescentes e a luminescência resultante é observada ou sob o conjunto de filtro Open ou QD705 específico. Como observado sob os dois conjuntos de filtro, a luminescência do QD705 diminui como uma função de distância enquanto nenhuma luminescência é observada a partir da água sozinha. Os resultados são mostrados na Figura 5A. Esses resultados ilustram que (1) na falta de qualquer refrescante, o efeito de FUEL pode ocorrer em distâncias substanciais e (2) o efeito de FUEL ocorre por um processo de radiação de luz, visto que não existe nenhuma conexão física entre a fonte bioluminescente e o relator fluorescente.

[0104] Intensidades de luminescência normalizadas foram calculadas como uma função de distância. A dependência de distância do efeito de FUEL foi repetida em triplicado usando três diferentes culturas bacterianas. A luminescência resultante para o conjunto de filtro QD705 foi normalizada ao valor mais intenso, que ocorreu em uma distância de 1 cm (Topo). Como pode ser visto na Figura 5B, a variação nas intensidades normalizadas foi bastante insignificante. Uma curva polinomial foi ajustada na intensidade luminescente com acordo significativo.

Aumento em Geração de Fóton Vermelho a Partir da Adição de QD705.

[0105] Múltiplas condições experimentais foram estabelecidas usando dois frascos de quartzo do tipo tandem separados por um pedaço de papel preto. Essas condições são mostradas de maneira esquemática na Figura 7, em que em PS: solução salina fisiológica; QD705: solução de QD705; RT57: E.coli bioluminescente; CR: vermelho congo.

[0106] Uma janela pequena foi cortada no papel para permitir que os fótons bioluminescentes passem. O papel também forneceu uma separação física entre os dois frascos assegurando que nenhum contato físico possa ocorrer entre o QD705 e o RT57. Para cada condição, a intensidade luminescente foi observada tanto sob o conjunto de filtro RT57 quanto de QD705 específico (observados como 480 e QD705 respectivamente), com cada condição realizada em triplicado.

[0107] Como pode ser visto, na falta de QD705 (controle de condição), poucos fótons vermelhos foram observados. Contudo, aproximadamente um aumento de 8 vezes na produção de fóton vermelho foi observado por simples adição do QD705 à trajetória óptica (condição 1). Na presença de um absorvedor, o CR (condição 2), esse aumento se mantém o mesmo, ilustrando o aprimoramento de contraste poderoso em razão do efeito de FUEL na presença de um absorvedor. Além disso, quando o absorvedor é colocado entre a fonte bioluminescente e o QD705 (condição 3), a produção de fóton total é reduzida dramaticamente e a produção de fóton vermelho é semelhante ao Controle, indicando que o efeito de FUEL não está mais ocorrendo. Isso também realça a especificidade de FUEL, portanto, visto que o FPP-L e FPP-U devem estar em íntima proximidade na presença de um absorvedor, mas não necessariamente em proximidade molecular. Como forma de controle positivo, valores semelhantes foram observados na falta de QD705, e na presença de CR (condição 4), verificando que a perda do efeito de FUEL na condição 3 aconteceu em razão da absorbância de luz azul de CR entre as bactérias e o QD.

Transmissão de Fóton Através de Amostras ex vivo [0108] Antes da injeção em camundongos de QDs e bactérias, em triplicado de três diferentes camundongos, MWB (sangue total de camundongo), fígado homogeneizado e pulmão homogeneizado foram usados para simular condições in vivo. No presente, uma placa de Ágar com RT57 e RT57+QD705 foi preparada conforme descrito previamente. Um pedaço de papel preto contendo um orifício foi colocado em uma placa de Ágar de modo que o orifício seja alinhado de maneira apropriada com as alíquotas de RT57 e RT57+QD705. Finalmente, uma placa de 96 poços preta foi colocada no topo do papel preto e placa de Ágar.

[0109] Como pode ser visto na Figura 8 e Tabela 2, na presença de MWB sob o filtro Open, o RT57+QD705 teve um aumento de aproximadamente 4 vezes o fluxo de fóton total comparado às bactérias sozinhas. Contudo, um aumento mínimo no fluxo de fóton total foi observado para o fígado e pulmões. Em contraste, a razão foi dramaticamente aumentada ao usar o filtro Cy5.5 que verifica a excitação resultante de QD705 em um aumento substancial em produção de fóton vermelho. Os resultados desse experimento in vitro sugerem fortemente que a presença do QD705 desvie para vermelho os fótons de RT57 longe da absorção máxima de MWB, aumentando então, o número total de fótons detectáveis.

Tabela 2. Transmissão de Fóton Aprimorada na Presença de Sangue e Tecido.* *A transmissão aprimorada através de cada absorvedor foi normalizada ao número de fótons detectado a partir do RT57 sozinho, n = 3.

Evidência de Excitação de QD in vivo Usando Bactérias Bioluminescentes [0110] Para demonstrar as capacidades dessa técnica, uma prova in vivo de experimento de princípio foi realizada. O QD705 e uma suspensão bacteriana foram sequencialmente injetados na coxa de um camundongo sob anestésico. Um segundo camundongo foi injetado com bactérias sozinhas e foi usado como um controle para a produção de bioluminescência padrão. A produtividade de bioluminescência de cada camundongo foi coletada simultaneamente sob os três diferentes conjuntos de filtro (Figura 9). Como pode ser visto, um aumento da bioluminescência medida foi observado para o QD705 injetado no camundongo sob cada conjunto de filtro. A Tabela 3 exibe o desvio significante nos fótons detectados quando o QD705 está presente.

Tabela 3. Demonstração de Excitação de QD705 in vivo.

[0111] Como pode ser visto a partir da Tabela 3, apenas 25% dos fótons bioluminescentes detectados são maiores do que 610 nm para as bactérias bioluminescentes sozinhas. Ainda mais notável é que menos do que 10% dos fótons bioluminescentes ocorrem no conjunto de filtro Cy5.5. Existe uma diferença dramática quando o QD705 é sequencialmente injetado com o RT57. No presente, aproximadamente 70% dos fótons detectados estão acima de 610 nm e 60% ocorrem no conjunto de filtro Cy5.5 (695 a 770 nm). Além disso, quando o aprimoramento em fótons detectáveis é calculado, um aumento semelhante no número de fótons detectados é observado para todos três conjuntos de filtro para os conjuntos de dados in vivo (Tabela 3) e in vitro (Tabela 1) quando QD705 está presente.

Tabela 4. Aprimoramento da Transmissão de Fóton em uma Injeção na Coxa de Camundongo.

Excitação Não Convencional Longa de QD705 a Partir de RT57 [0112] Visto que a luminescência de RT57 causou emissão de QD705 sob condições em solução, em que nenhuma solução química covalente foi aplicada, é sugerido que o mecanismo do fenômeno detectado não seja explicado pelo mecanismo de BRET (caracteristicamente não-radiativo) constrangido pelo critério de proximidade molecular íntima.

[0113] Em vez disso, foi levantado que a possibilidade de uma excitação-emissão radiativa foi responsável. Para testar essa ideia foi examinada posteriormente a capacidade de luminescência RT57 para excitar alíquotas de QD705 em distâncias macroscópicas. Em uma série de experimentos, foi colocado RT57 de estoque de 5 pl no centro das placas de Petri. Alíquotas (2 pl) de QD705 foram então colocadas na placa de Petri, em distâncias radiais crescentes para fora do centro, aumentando em incrementos 5 mm em uma distância total de 2 cm (ou seja, distância entre RT57 e QD705, centro para centro; Figura 6A). A luminescência resultante foi então observada para 300 s sob o conjunto de filtro Cy5.5 apenas em razão de sua especificidade para a emissão de QD705, e a localização de QD705 verificou o uso de imageamento de fluorescência (Figura 6B). Como pode ser visto, a intensidade da emissão de QD705 subsequente diminuiu como uma função de distância do RT57 bioluminescente. Contudo, a emissão do QD705 foi prontamente detectada até uma distância de 2 cm (Figura 6C).

Uso de FUEL para Aprimorar Detecção de Sinal in vivo [0114] Bactérias de E. coli bioluminescentes foram suspensas em uma esfera 50 pl de 2% de agarose solidificada foram subcutaneamente implantadas na coxa Esquerdo interna de um camundongo BALB/c. Outras esferas de bactéria de 50 pl em agarose foram preparadas e revestidas com uma camada de pontos quânticos de 10 pl tendo um comprimento de onda de emissão no vermelho em 705 nm. Essa segunda esfera foi subcutaneamente implantada na mesma coxa direita interna do camundongo.

[0115] Quando estão na presença das bactérias, os pontos quânticos são excitados e desviam a luz bioluminescente de um comprimento de onda de 480 nm a 705 nm. A luminescência de 480 nm das bactérias é visível nas duas pernas sem um filtro no lugar (Figura 10) e as intensidades das duas pernas são aproximadamente equivalentes. Quando um filtro Cy5.5 é aplicado (695 a 770 nm), a luz das bactérias é bloqueada da vista e apenas a fluorescência dos pontos quânticos excitados pode ser vista a partir da Direito coxa (Figura 10).

[0116] A pele do camundongo é bastante fina e prontamente percorrível por luz. Contudo, quando o camundongo é virado, as emissões das bactérias e pontos quânticos devem atravessar a musculatura que absorve altamente a luz e se espalha a partir da perna antes de alcançar o detector. Ao contrario da luz azul das bactérias, a luz vermelha não é tão suscetível à absorção por cromóforos de tecido como hemoglobina, oxihemoglobina, melanina, lipídios, e água. A luz desviada da esfera contendo ponto quântico na coxa Direito é aproximadamente quatro vezes mais intensa do que a luz que vem da esfera apenas com bactérias na coxa Esquerdo quando nenhum filtro está no lugar (Figura 10). Quando o filtro Cy5.5 é aplicado, a emissão da perna Direito é mais do que vinte e duas vezes maior do que aquela da perna Esquerdo (Figura 10).

O Mecanismo de FUEL

[0117] Os inventores então mostraram que misturas em bactérias bioluminescentes de suspensão podem excitar QDs em razão da sobreposição espectral significante entre o pico de emissão bioluminescente, com o espectro de absorção amplo do QD705, em que o fenômeno é evidente pelo desvio para vermelho paradoxal de outra forma de bioluminescência bacteriana caracteristicamente azul.

[0118] Na medida em que o mesmo efeito é qualitativamente esperado, se esse sistema fosse modificado de modo a permitir que BRET ocorra, esse certamente não seria o caso das condições descritas no presente documento pelas seguintes razões. Primeiro, o fenômeno ocorre em suspensão, na falta de soluções químicas covalentes, tornando improvável que as porções químicas fotônicas estejam em proximidade molecular suficientemente próxima para alcançar BRET. Segundo, o fenômeno é eficientemente reproduzido sob condições em que porções químicas são fisicamente separadas por distâncias macroscópicas, mais características de excitação-emissão radiativa.

[0119] Os inventores demonstraram que o efeito de FUEL pode ocorrer em distâncias de milímetros, desordenadamente mais do que pode ser alcançado por qualquer processo de transferência de energia intermolecular. É interessante então, que o desvio para vermelho resultante da emissão fóton seja fortemente propagado através de tecido preparado in vitro. Nesse caso, a propagação insuficiente de luz de bactérias sozinhas acontece em razão de um comportamento biofotônico característico de luz azul, ou seja, alto espalhamento e absorbância em tecido. Ao contrário, os inventores mostraram que FUEL à base de QDL rende fótons luminescentes vermelhos através de um filtro Cy5.5 e mostraram que é essa propriedade que rende uma ordem de aprimoramento de magnitude de detecção de luz na presença de tecido in vitro, visto que a luminescência desviada para o vermelho experimenta espalhamento e absorção mínimo em comparação à luz azul-verde. Uma representação esquemática de FUEL é mostrada na Figura 11.

[0120] As propriedades de FUEL então têm o potencial a ser particularmente vantajoso para aplicações e para experimentos e técnicas realizadas in vivo como disseminação bacteriana ou interações patógeno hospedeiras e respostas. Talvez de maneira surpreendente, é evidente que a presença de um absorvedor óptico como sangue ou tecido atualmente aumenta a especificidade de FUEL, portanto, visto que as bactérias bioluminescentes devem estar perto dos QDs, mas não necessariamente na distância molecular que é equivalente à BRET. Os fótons desviados para o vermelho de FUEL têm mais capacidade de passar através do sangue e tecidos, com o máximo aprimoramento significante em MWB.

[0121] Com base no fenômeno e propriedades reportadas no presente documento, FUEL tem aplicação particular de valor para experimentos e técnicas realizadas in vivo.

[0122] Os inventores demonstraram a capacidade do E.coli bioluminescente excitar QDs em distâncias substanciais, criando um desvio para vermelho nos fótons detectados através de um processo que eles denominaram FUEL. Os fótons são desviados para longe das regiões de alta absorção de hemoglobina (em suas várias formas) e tecidos, para a região opticamente transparente de 700 a 900 nm. Um aumento significante no número de fótons detectáveis é observado quando QD705 está presente sob condições ex vivo.

[0123] Além disso, os inventores mostraram FUEL como sendo diferente de BRET, visto que as distâncias de trabalho mostradas aqui são muito maiores (pm - cm) do que condições de BRET aceitas (< 10 nm). Finalmente, os inventores alcançaram um desvio nos fótons emitidos sem o uso de quaisquer soluções químicas de acoplamento.

[0124] FUEL pode ser usada como uma técnica complementar à BRET. Ao usar BRET, um indivíduo pode observar interações de proteína específica, que é um nível de resolução que não é prontamente necessário para o imageamento de bioluminescência de animal total. Contudo, FUEL tem uma resolução espacial maior na escala de órgãos individuais, que é mais relevante para BLI de animal total. Como tal, as duas técnicas, ao compartilhar princípios semelhantes, têm aplicações e escalas de operação vastamente diferentes. Além disso, é sugerido que o efeito de FUEL possa ser aplicado a ajustes in vivo.

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Reivindicações

Claims (13)

1. MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA DE UM MARCADOR BIOLÓGICO LUMINESCENTE PRODUTOR DE FÓTON, em uma célula, tecido ou organismo de interesse, caracterizado por compreender as etapas: (a) fornecer condições adequadas para dito marcador biológico produzir pelo menos um primeiro fóton; (b) fornecer um Par de Sondas de Fluorescência por Excitação não ligada de Luminescência Superior (FPP-U) disposto em proximidade a dita célula, tecido ou organismo, em que dito FPP-U é selecionado do grupo que consiste em pontos quânticos, nanotubos de carbono, proteínas fluorescentes, nanodiamantes e metaloporfirinas, e em que dito pelo menos um primeiro fóton da etapa (a) excita dito FPP-U, que emite pelo menos um segundo fóton; (c) detectar dito pelo menos um segundo fóton; e em que, no dito método, dito marcador biológico e dito FPP-U não estão ligados um ao outro e em que cada um do dito pelo menos um segundo fóton é de um comprimento de onda mais longo do que cada um do dito pelo menos um primeiro fóton.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito marcador biológico ser bioluminescente.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito marcador biológico ser quimioluminescente.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito marcador biológico ser fluorescente.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo dito marcador biológico emitir fótons com um comprimento de onda menor do que 650 nm.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo dito FPP-U emitir fótons com um comprimento de onda mais longo do que dito marcador biológico.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo dito FPP-U emitir fótons com um comprimento de onda de 650 a 900 nm.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender determinar a presença de pelo menos dois marcadores biológicos produtores de fóton em uma célula, tecido ou organismo; em que cada um dos ditos pelo menos dois marcadores biológicos emitem fótons em uma faixa de não sobreposição de comprimentos de onda, que excitam pelo menos um dentre pelo menos dois subconjuntos do dito FPP-U, o qual cada um emite pelo menos um fóton, em que dito pelo menos um fóton emitido por cada um do dito subconjunto do dito FPP-U está em uma faixa de não sobreposição de comprimentos de onda.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo dito FPP-U compreender um meio para direcionar o mesmo às porções específicas da dita célula, tecido ou organismo.

10 . MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo dito FPP-U ser disposto dentro da dita célula, tecido ou organismo.

11 . MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo dito FPP-U ser disposto fora da dita célula, tecido ou organismo.

12 . MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo dito FPP-U ser disposto dentro e fora da dita célula, tecido ou organismo.

13 . MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA DE UM MARCADOR BIOLÓGICO LUMINESCENTE PRODUTOR DE FÓTON, em uma célula, tecido ou organismo de interesse, caracterizado por compreender as etapas: (a) fornecer condições adequadas para uma primeira sonda de um Par de Sondas para Fluorescência por Excitação não ligada de Luminescência (FPP) para produzir pelo menos um primeiro fóton; (b) fornecer um segundo FPP disposto em proximidade a dita célula, tecido ou organismo, em que dito pelo menos um primeiro fóton da etapa a) excita dito segundo FPP, que emite pelo menos um segundo fóton; em que a etapa (b) é repetida pelo menos mais uma vez, em que, para cada etapa adicional, um FPP adicional é disposto em proximidade à dita célula, tecido ou organismo, diferente do dito primeiro ou segundo FPP, que é especificamente excitado por pelo menos um fóton emitido na etapa anterior e que, por sua vez, emite pelo menos um fóton adicional; em que, em uma etapa final, dito pelo menos um fóton adicional é detectado; em que dito marcador biológico é tanto dito primeiro ou dito segundo FPP, e em que cada um dos FPPs é um fluoróforo ou uma sonda fluorescente; e em que, no dito método, dita pluralidade de FPPs não está ligada uma a outra e em que cada um do dito pelo menos um fóton(s) é de um comprimento de onda mais longo do que cada um do dito pelo menos um fóton(s) da etapa anterior.