BR112012006417B1 - bactérias gram-negativas modificadas para uso como vacinas - Google Patents

Abstract

bactérias gram-negativas modificadas para uso como vacinas. a invenção se refere a bactérias gram-negativas compreendendo um gene inativado codificando a glicosiltransferase envolvida na síntese do núcleo do lps da referida bactéria gram-negativa, em que o gene inativado resulta na síntese de um lps compreendendo um núcleo modificado. estas cepas têm uma virulência atenuada, mas induzem uma imunidade humoral suficiente para garantir a vacinação do hospedeiro.

Description

“BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS MODIFICADAS PARA USO COMO VACINAS.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção se refere em geral ao campo das bactérias Gram-negativas modificadas para uso como vacinas. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Bactérias Gram-negativas são aquelas bactérias que não retêm corante violeta cristal no protocolo de coloração de Gram. Muitas espécies de bactérias Gram-negativas são patogênicas, o que significa que elas podem causar doença em um organismo hospedeiro. Esta capacidade patogênica está

geralmente associada	a certos	componentes	das	paredes	de
células Gram-negativas, em	particular,	à	camada	de
lipopolissacarídeo	(também	conhecido	como	LPS	ou
endotoxina).

O LPS é um componente principal da membrana externa de bactérias Gram-negativas que contribui grandemente para a integridade estrutural das bactérias e protege a membrana de certos tipos de ataque químico. O LPS também aumenta a carga negativa da membrana celular e ajuda a estabilizar a estrutura geral da membrana. O LPS é uma endotoxina e induz uma forte resposta dos sistemas imunológicos de animais normais. O LPS é adicionalmente um pirogênio exógeno (composto externo indutor de febre). O LPS compreende três partes: cadeias laterais de polissacarídeos (O), um núcleo de polissacarídeo e lipídeo A.

O lipídeo A contém ácidos graxos incomuns (por exemplo, ácido hidróxi-mirístico) e é incorporado na membrana externa, enquanto o resto do LPS se projeta a partir da superfície. O lipídeo A é um dissacarídeo com várias caudas de ácido graxo que alcançam a membrana. Quando as células bacterianas são lisadas pelo sistema imune, fragmentos de membrana contendo o lipídeo A são liberados na circulação, causando febre, diarreia e possível choque endotóxico fatal (também chamado de choque séptico).

A cadeia lateral de polissacarídeo é referida como o antígeno-O da bactéria. A cadeia lateral O (antígeno-O) é uma cadeia de polissacarídeo que se estende a partir do núcleo de polissacarídeo. A composição da cadeia lateral O varia entre diferentes cepas de bactérias Gram-negativas. As cadeias laterais O são facilmente reconhecidas pelos anticorpos do hospedeiro, no entanto, a natureza da cadeia pode ser facilmente modificada por bactérias Gram-negativas para evitar a detecção.

O oligossacarídeo do núcleo contém açúcares incomuns (por exemplo, KDO, ceto-desoxioctulosonato e heptose), mas pouco se sabe sobre o seu papel. Em particular, seu papel na virulência nunca foi estudado diretamente.

Numerosos mutantes de LPS que induzem imunidade humoral a lipopolissacarídeo (LPS) foram propostos como potenciais vacinas. No entanto, mutantes de LPS puros ou bactérias que expressam mutantes de LPS são geralmente considerados muito tóxicos para serem utilizados como vacinas, em particular, em virtude de seus fortes efeitos adversos, e existe assim uma necessidade de novas vacinas que apresentem uma virulência atenuada e induzam uma imunidade humoral suficiente para garantir a vacinação do hospedeiro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os inventores descobriram que, ao modificar uma estrutura particular do núcleo do LPS de bactérias Gramnegativas, é possível obter cepas que possuem uma virulência atenuada, mas que induzem uma imunidade humoral suficiente para assegurar a vacinação do hospedeiro. Com efeito, os inventores descobriram que determinadas glicosiltransferases envolvidas na síntese do núcleo do LPS possuem um papel fundamental na virulência de bactérias Gram-negativas. Quando pelo menos uma dessas glicosiltransferases é inativada, o LPS modificado sintetizado pelas bactérias Gram-negativas induz uma forte resposta imune do hospedeiro e a sua vacinação. Além disso, os inventores ainda demonstraram que a administração de um LPS produzido por bactérias Gram-negativas a um hospedeiro, em que pelo menos uma das referidas glicosiltransferases é 5 inativada, induz uma resposta imune não específica e pode, assim, ser utilizado como um adjuvante para estimular o sistema imunológico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Um objeto da invenção diz respeito a uma vacina compreendendo uma bactéria Gram-negativa que carrega um gene inativado que codifica uma glicosiltransferase envolvida na síntese do núcleo do LPS da referida bactéria Gram-negativa, em que a referida glicosiltransferase é selecionada do grupo que compreende as glicosiltransferases 15 que possuem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou

SEQ ID NO: 21, ou homólogas das mesmas que possuem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, particularmente pelo menos 60%, mais particularmente pelo menos 70%, mais particularmente pelo menos 80% de 20 identidade com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 21, e em que o referido gene inativado que codifica uma glicosiltransferase envolvida na síntese do núcleo do LPS das referidas bactérias Gram-negativas resulta na síntese de um LPS possuindo um núcleo modificado.

Os inventores demostraram que a glicosiltransferase que possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 é uma glicosiltransferase envolvida na síntese de uma estrutura ramificada particular do núcleo do LPS de Brucella abortus. Esta glicosiltransferase foi chamada de BABLpcC pelos inventores. Em particular, os inventores demostraram que, contrariamente a todos os mutantes do núcleo de LPS descritos até o momento, que induzem a deleção do núcleo e da cadeia O do LPS (Gonzales e col.; PLOS one, Julho de 2008, vol.3, edição 7, e2760), as bactérias Gram-negativas mutantes, de acordo com a invenção, apresentam um LPS que carece de parte do núcleo, mas mantêm uma cadeia O intacta. Estes resultados evidenciam que Brucella abortus possui um núcleo de LPS ramificado, o que era desconhecido até o momento (ver Figura 10, que fornece uma estrutura proposta do núcleo do LPS de Brucella abortus). Sem querer estar vinculado a uma teoria, acredita-se que esta estrutura ramificada do núcleo do LPS nas bactérias do tipo selvagem é importante para evitar o reconhecimento pela imunidade inata. Por conseguinte, os mutantes de bactérias Gramnegativas, de acordo com a invenção, desencadeiam uma resposta imune mais intensa e protetora e, portanto, constituem vacinas muito promissoras.

Além da BABLpcC de Brucella abortus, os inventores também mostraram que existem glicosiltransferases homólogas em outros organismos. Como resultado, é altamente plausível que a estrutura particular do núcleo do LPS de Brucella abortus exista em outro organismo. Os inventores 5 demonstraram ainda que estas proteínas homólogas possuem uma sequência de aminoácidos que apresenta um elevado percentual de identidade com a SEQ ID NO: 1, de pelo menos 60%, particularmente de pelo menos 70%, mais particularmente de pelo menos 80%.

Exemplos de glicosiltransferases envolvidas na síntese do núcleo do LPS e que possuem um elevado percentual de identidade com BABLpcC são apresentadas na tabela a seguir:

Organismo	SEQ ID NO:	% de identidade com a SEQ ID NO: 1
Bartonella quintana	2	65
Bartonella tribocorum	3	64
Bartonella bacilliformis	4	61
Ochrobactrum anthropi	5	85
Ochrobactrum intermedium	6	85
Agrobacterium tumefaciens	7	63

Bartonella henselae

22

69

Portanto, em uma concretização particular, a invenção também diz respeito a uma vacina compreendendo uma bactéria Gram-negativa, de acordo com a invenção, em que a referida sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60%, particularmente pelo menos 70%, mais particularmente pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 1, é selecionada do grupo que compreende SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 22.

Além da glicosiltransferase da SEQ ID NO: 1, os inventores mostraram que outra glicosiltransferase, que possui a sequência da SEQ ID NO: 21, também está envolvida na síntese da estrutura ramificada do núcleo do LPS de uma bactéria Gram-negativa, Brucella abortus. Os inventores também mostraram que existem glicosiltransferases homólogas em outros organismos, tal como anteriormente descrito para BABLpcC. Os inventores demonstraram ainda que estas proteínas homólogas possuem uma sequência de aminoácidos que apresenta um percentual de identidade com a SEQ ID NO: 21 de pelo menos 50%, particularmente de pelo menos 60%, mais particularmente de pelo menos 62%.

Exemplos de glicosiltransferases envolvidas na síntese do núcleo do LPS e possuindo um percentual de identidade com a SEQ ID NO: 21 de pelo menos 50%, particularmente de pelo menos 60%, mais particularmente de pelo menos 62% são apresentadas na tabela a seguir:

Organismo	SEQ ID NO:	% de identidade com a SEQ ID NO: 21
Ochrobactrum anthropi	23	62
Ochrobactrum intermedium	24	62
Agrobacterium radiobacter	25	57

Em outra concretização particular, a invenção também diz respeito às vacina compreendendo bactérias Gramnegativas, de acordo com a invenção, em que um gene que codifica uma proteína envolvida na síntese do polissacarídeo O do LPS é inativado. Com efeito, além da inativação de genes que codificam glicosiltransferases envolvidas na síntese da estrutura ramificada do núcleo do LPS, é interessante inativar genes envolvidos na síntese do polissacarídeo O do LPS. Tal mutante duplo, carecendo da estrutura ramificada do núcleo e carecendo parcialmente ou totalmente da cadeia O, é útil para distinguir animais que são vacinados com o mesmo e animais que estejam infectados com a bactéria Gram-negativa de ocorrência natural (tipo selvagem), conforme explicado a seguir na descrição.

Exemplos de genes que codificam uma proteína envolvida na síntese do polissacarídeo O do LPS são wboB, wboA, wbkE, wbkA, gmd, per, wzm, wzt, wbkB, wbkC, wbkF e wbkD (Gonzales 5 e col.; PLOS one, Julho de 2008, vol.3, edição 7, e2760) .

Suas SEQ IDs são fornecidas na tabela a seguir:

Nome do gene	Função proteica prevista	SEQ ID de aminoácidos
wboB	Manosil (perosaminil) transferase	8
wboA	Manosil (perosaminil) transferase	9
wbkE	Manosil (perosaminil) transferase	10
wbkA	Manosil (perosaminil) transferase	11
gmd	GDP-manose desidratase	12
per	Perosamino sintetase	13
wzm	Transportador ABC	14
wbkF	Undecaprenil- glicosiltransferase	15
wbkD	Epimerase/desidratase	16
wzt	Transportador ABC	26

wbkB	Sintetase	27
wbkC	Formiltransferase	28

Por conseguinte, em uma concretização da invenção, a referida proteína envolvida na síntese do polissacarídeo O do LPS é então selecionada do grupo que compreende as proteínas que possuem a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO:	8,	SEQ	ID NO: 9, SEQ ID NO: 10,	SEQ	ID NO:	11,	SEQ	ID
NO:	12,	SEQ	ID NO: 13, SEQ ID NO: 14	, SEQ	ID NO:	15,	SEQ	ID
NO:	16,	SEQ	ID NO: 26, SEQ ID NO:	27 e	SEQ ID	NO:	28	ou

homólogas das mesmas que possuem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 50%, particularmente pelo menos 60%, mais particularmente pelo menos 70%, ainda mais particularmente pelo menos 80% e mais particularmente pelo menos 90% de identidade com uma sequência de aminoácidos

selecionada	do	grupo que	compreende	SEQ	ID	NO	: 8,	SEQ	ID
NO:	9, SEQ ID NO: 10, SEQ	ID NO:	11,	SEQ	ID	NO	: 12,	SEQ	ID
NO:	13, SEQ	ID	NO: 14, SEQ	ID NO:	15,	SEQ	ID	NO	: 16,	SEQ	ID
NO:	26, SEQ	ID	NO: 27 e	SEQ ID	NO:	28.	A	escolha	de	um
percentual	de	identidade de	pelo	menos	50%	não	é

arbitrária: este percentual de identidade foi observado pelos inventores para as sequências homólogas das SEQ ID NO: 8-16, 26-28 na cepa particular de Yersinia enterocitica

O:9.

Em uma concretização particular da invenção, a referida proteína envolvida na síntese do polissacarídeo O do LPS é uma perosamino sintetase que possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 ou um homólogo da mesma tendo uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13. Este elevado percentual de identidade (de pelo menos 90%) é tipicamente encontrado nas cepas do gênero Brucella.

De acordo com a invenção, por gene inativado entende-se um gene que codifica tanto uma proteína não funcional ou nenhuma proteína. De acordo com a invenção, a inativação de um gene pode ser efetuada pelos vários métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica. Exemplos de métodos para a inativação de um gene são o knock out e, particularmente, a mutagênese dirigida ou a recombinação homóloga, como descrito em Conde-Alvarez R. e col., Cell Microbiol 2006 Agosto;8(8):1322-35. Um método particular para inativar um gene de acordo com a invenção é descrito na seção experimental.

Em outra concretização particular da invenção, as bactérias Gram-negativas de acordo com a invenção são selecionadas do grupo que compreende as bactérias do gênero Brucella, Bartonella, Ochrobactrum e Agrobacterium.

Em uma concretização particular, a invenção é dirigida a uma bactéria do gênero Brucella, em que a referida glicosiltransferase é selecionada do grupo que compreende as glicosiltransferases que possuem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 21, ou homólogas das mesmas que possuem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, particularmente pelo menos 70%, mais particularmente pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 21.

Espécies particulares do gênero Brucella, de acordo com a invenção, são Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella ovis, Brucella pinnipedialis, Brucella ceti, Brucella microti e Brucella canis.

Espécies particulares do gênero Ochrobactrum, de acordo com a invenção, são Ochrobactrum anthropi e Ochrobactrum intermedium.

A invenção ainda diz respeito, em particular, a uma vacina compreendendo a bactéria Ochrobactrum anthropi, em que a referida glicosiltransferase, de acordo com a invenção, é selecionada do grupo que compreende as glicosiltransferases que possuem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 62% de identidade com a SEQ

ID NO: 21.

A invenção ainda diz respeito, em particular, a uma vacina compreendendo a bactéria Ochrobactrum intermedium, em que a referida glicosiltransferase de acordo com a invenção é selecionada do grupo que compreende as glicosiltransferases que possuem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 62% de identidade com a SEQ ID NO: 21.

Espécies particulares do gênero Bartonella, de acordo com a invenção, são Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bartonella tribocorum, Bartonella bacilliformis.

A invenção também diz respeito, em particular, a uma bactéria Bartonella henselae, em que a referida glicosiltransferase de acordo com a invenção é selecionada do grupo que compreende as glicosiltransferases que possuem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 69% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

A invenção também diz respeito, em particular, a uma vacina compreendendo a bactéria Bartonella quintana, em que a referida glicosiltransferase de acordo com a invenção é selecionada do grupo que compreende as glicosiltransferases que possuem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 65% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

A invenção diz respeito ainda, em particular, a uma vacina compreendendo a bactéria Bartonella tribocorum, em que a referida glicosiltransferase de acordo com a invenção é selecionada do grupo que compreende as glicosiltransferases que possuem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 64% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

A invenção também diz respeito, em particular, a uma vacina compreendendo a bactéria Bartonella bacilliformis, em que a referida glicosiltransferase de acordo com a invenção é selecionada do grupo que compreende as glicosiltransferases que possuem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 61% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

Espécies particulares do gênero Agrobacterium, de acordo com a invenção, são Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium radiobacter.

A invenção refere-se, assim, em particular, a uma vacina compreendendo a bactéria Agrobacterium tumefaciens, em que a referida glicosiltransferase de acordo com a invenção é selecionada do grupo que compreende as glicosiltransferases que possuem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 63% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

A invenção ainda diz respeito, em particular, a uma vacina compreendendo a bactéria Agrobacterium radiobacter, em que a referida glicosiltransferase de acordo com a invenção é selecionada do grupo que compreende as glicosiltransferases que possuem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 57% de identidade com a SEQ ID NO: 21.

Tal como aqui utilizado, o percentual de identidade de sequência se refere às comparações entre sequências de aminoácidos e é determinado por comparação de duas sequências perfeitamente alinhadas ao longo de uma janela de comparação, em que a porção da sequência de aminoácidos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em relação à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. O percentual pode ser calculado através da determinação do número de posições nas quais o resíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas as sequências para originar o número de posições correspondentes, divisão do número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicação do resultado por 100 para fornecer o percentual de identidade de sequência. Alternativamente, o percentual pode ser calculado através da determinação do número de posições nas quais tanto o resíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas as sequências ou um resíduo de aminoácido esteja alinhado com uma lacuna para originar o número de posições

correspondentes	, divisão	do	número de	posições
correspondentes	pelo número	total	de posições na	janela de
comparação e	multiplicação	do	resultado por	100 para

fornecer o percentual de identidade de sequência. As pessoas versadas na técnica observam que existem muitos algoritmos estabelecidos disponíveis para alinhar duas sequências. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, pela busca por método da similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. ScL EUA 85:2444, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin GCG) ou por inspeção visual (ver, de modo geral, Current Protocols in Molecular

Biology, F. M. Ausubel e col., eds., Current Protocols, uma joint venture entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)). Exemplos de algoritmos que são adequados para determinar o percentual de identidade de sequência e a similaridade de sequências são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul e col., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403410 e Altschul e col., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402, respectivamente. O software para a realização de análises BLAST está disponível ao público através do sítio eletrônico do National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve, primeiramente, a identificação de pares de sequência de pontuação alta (HSPs), através da identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que tanto correspondem ou satisfazem alguma pontuação limite com valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é referido como o limite de pontuação de palavra da vizinhança (Altschul e col., supra). Estes acertos iniciais de palavras da vizinhança agem como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos que os contenham. Os acertos de palavras são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência, tão longe quanto a pontuação de alinhamento cumulativo possa ser aumentada. Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é utilizada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acertos de palavras em cada direção é interrompida quando: a pontuação do alinhamento cumulativo diminui pela quantidade X a partir do seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos com pontuação negativa; ou a terminação de qualquer sequência é atingida. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTP (para sequências de aminoácidos) utiliza como padrões um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff, 1989, Proc Natl Acad Sci EUA 89: 10915). Exemplos de determinação de alinhamento de sequência e % de identidade de sequência podem empregar os programas BESTFIT ou GAP no pacote de software Wisconsin GCG (Accelrys, Madison WI), utilizando parâmetros padrão fornecidos.

A invenção também diz respeito às aplicações terapêuticas dos mutantes Gram-negativos, de acordo com a invenção. Em particular, a invenção se refere a bactérias Gram-negativas, de acordo com a invenção, para uso em um método para tratamento do corpo humano ou animal.

Em outro aspecto, a invenção se refere a vacinas que compreendem uma bactéria Gram-negativa de acordo com a invenção.

De fato, os inventores demonstraram que as bactérias de acordo com a invenção podem ser utilizadas como vacinas vivas.

A invenção refere-se então ao uso da bactéria Gramnegativa, de acordo com a invenção, para vacinação do corpo humano ou animal contra uma doença causada pelo tipo selvagem da referida bactéria Gram-negativa.

A invenção também se refere a um uso para o tratamento, em particular vacinação, de um indivíduo contra uma doença causada por uma bactéria Gram-negativa, o referido método compreendendo a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da referida bactéria Gram-negativa modificada, de acordo com a invenção.

No contexto da invenção, o termo tratar ou tratamento, tal como aqui utilizado, significa reverter, aliviar, inibir o progresso de, ou prevenir o distúrbio ou condição à qual tal termo se aplica.

Tal como aqui utilizado, indivíduo se refere a um ser humano ou animal que possa se beneficiar da administração de uma bactéria Gram-negativa, tal como aqui descrita.

Por uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma bactéria Gram-negativa, tal como descrita anteriormente, entende-se uma quantidade suficiente para tratar a doença, em uma razão risco/benefício razoável, aplicável a qualquer tratamento médico.

Uma vacina é aqui definida como um agente biológico que é capaz de fornecer uma resposta protetora em um animal ao qual a vacina foi administrada e é incapaz de causar uma doença grave. A vacina estimula a produção de anticorpos ou imunidade celular contra o agente patogênico causador da doença; a administração da vacina resulta, assim, em imunidade à doença.

De acordo com a invenção, por um tipo selvagem entende-se uma bactéria Gram-negativa em que os genes descritos anteriormente estão ativos.

Se desejado, as vacinas vivas, de acordo com a invenção, podem conter um adjuvante. Exemplos de compostos e composições adequados com atividade adjuvante são bem conhecidos na técnica. Além disso, as sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos para aplicações farmacêuticas ou de diagnóstico, em particular imunomoduladores, tais como linfocinas, interferons ou citocinas, podem ser incorporadas na vacina.

Uma vacina, de acordo com a invenção, pode ser preparada por métodos convencionais, tais como aqueles normalmente utilizados para as vacinas atenuadas vivas disponíveis comercialmente.

A vacina pode ser administrada por inoculação ou injeção intramuscular, intradérmica, subcutânea ou intranasal em uma quantidade que é eficaz para proteger os animais contra desafio por uma cepa virulenta de bactéria Gram-negativa. Esta quantidade pode variar de acordo com o animal a ser inoculado, levando em consideração o tamanho e o peso do animal. A vacina, de acordo com a invenção, compreende uma dosagem eficaz do mutante de bactéria Gramnegativa como o componente ativo, isto é, uma quantidade suficiente de mutante de bactéria Gram-negativa que irá induzir imunidade nos animais vacinados contra um desafio pela bactéria Gram-negativa virulenta. Imunidade é aqui definida como a indução de um nível significativamente maior de proteção em uma população de animais contra a mortalidade e sintomas clínicos após a vacinação, em comparação com um grupo não vacinado. Em particular, a vacina, de acordo com a invenção, previne uma grande proporção de animais vacinados contra a ocorrência de sintomas clínicos da doença e mortalidade.

Ao prover um paciente (humano ou animal) com vacinas de bactérias vivas, a dosagem de bactérias administradas irá variar dependendo de fatores, tais como a via de administração, a espécie do paciente, idade, peso, altura, sexo, condição médica geral, histórico médico anterior, etc. Em geral, é desejável prover o receptor com uma dosagem das bactérias acima que está na faixa de cerca de 10⁵ ufc/kg a 108 ufc/kg (peso corporal do paciente), embora uma dosagem inferior ou superior possa ser administrada.

Além do mutante de bactéria Gram-negativa, a invenção também podem incluir vacinas de combinação que compreendem uma cepa de vacina capaz de induzir proteção contra outro agente patogênico.

Em uma concretização particular da invenção, as bactérias Gram-negativas da invenção pertencem ao gênero Brucella. Nesta concretização, a invenção refere-se àquelas bactérias Gram-negativas para uso em um método para tratamento de brucelose no corpo humano ou animal. Na verdade, brucellae são parasitas intracelulares facultativos que infectam uma variedade de mamíferos e possuem um grande impacto na saúde humana e animal em todo o mundo. Estas bactérias Gram-negativas carecem de fatores de virulência típicos e comportam-se como parasitas furtivos que evitam a detecção através da imunidade inata no início da infecção, retardando assim uma resposta celular adaptativa e tornando possível que este agente patogênico alcance nichos intracelulares protegidos. Esta capacidade não está relacionada a uma indução de citocinas regulatórias, tal como IL-10, mas sim à falha de receptores de reconhecimento de agentes patogênicos de imunidade inata (PRRs) para identificar as moléculas de superfície de Brucella que normalmente levam os padrões moleculares cognatos associados a agentes patogênicos (PAMP) (BarqueroCalvo E e col. (2007) PLoS ONE 2: e631) e, em particular, os LPS dessas cepas. Foi demonstrado pelos inventores que as cepas da invenção, que carecem de uma porção particular do núcleo do LPS, induzem uma forte resposta imune e são, portanto, adequadas para uso como vacina contra brucelose.

Conforme descrito anteriormente, em uma concretização particular, a invenção também diz respeito a vacinas compreendendo bactérias Gram-negativas que não possuem a estrutura ramificada do núcleo e carecem parcialmente ou totalmente da cadeia O. Estas bactérias mutantes duplas são úteis para distinguir os animais que são vacinados com as referidas bactérias mutantes duplas e os animais que são infectados com as bactérias Gram-negativas do tipo selvagem.

Assim, a invenção diz respeito a um método para determinar a infecção por bactérias Gram-negativas em um

4 animal, compreendendo a etapa de examinar uma amostra obtida do referido animal quanto à presença ou ausência de anticorpos reativos aos epítopos imunodominantes (C, C/Y, A e M ou combinações dos mesmos) da cadeia O (Alton, G.G. e col. 1988, Techniques for the brucellosis laboratory INRA, Paris, França; Gall, D. e col. 2004, Rev. Sci. Tech. 23:989-1002). A amostra do animal utilizada neste método pode ser qualquer amostra na qual os referidos anticorpos possam ser detectados, por exemplo, uma amostra de sangue, soro ou tecido.

A presença ou a ausência de anticorpos pode ser detectada por qualquer imunoensaio conhecido por uma pessoa versada na técnica. A concepção deste imunoensaio pode variar. Por exemplo, o imunoensaio pode ser baseado em competição ou reação direta. Além disso, os protocolos podem utilizar suportes sólidos ou podem utilizar material celular. A detecção do complexo antígeno-anticorpo pode envolver a utilização de anticorpos marcados; os marcadores podem ser, por exemplo, enzimas, moléculas fluorescentes, quimioluminescentes, radioativas ou corantes. Métodos adequados para a detecção dos epítopos mencionados acima na amostra incluem, por exemplo, o ensaio de imunoabsorção ligado à enzima (ELISA), testes de imunofluorescência e análise de Western blot.

Em outro aspecto, a invenção diz respeito a um lipopolissacarídeo isolado obtenível de uma bactéria Gramnegativa, de acordo com a invenção. De fato, os inventores descobriram que os LPS modificados produzidos pelas bactérias Gram-negativas, de acordo com a invenção, estimulam uma produção inespecífica de citocinas, em particular, de IL 12 e TNFa, por células dendríticas (Figura 6B) no camundongo.

O LPS pode ser extraído das bactérias Gram-negativas, de acordo com a invenção, seguindo qualquer método conhecido por uma pessoa versada na técnica, como por exemplo, o método descrito em Garin-Bastuji B e col. (1990) J Clin Microbiol 28: 2169-2174; Leong D e col. (1970)

Infection and Immunity 1: 174-182; e Velasco, J., J. A. Bengoechea, K. Brandenburg, B. Lindner, U. Seydel, D. González, U. Zãhringer, E. Moreno, e I. Moriyón. 2000. Brucella abortus and its closes phylogenetic relative, Ochrobactrum spp., differ in outer membrane permeability and cationic peptide resistance. Infect. Immun. 68:32103218.

Como um resultado, em uma concretização, o LPS modificado, de acordo com a invenção, pode ser utilizado em um método para estimular o sistema imunológico do corpo humano ou animal.

Em outra concretização, a invenção diz respeito a um adjuvante que compreende um lipopolissacarídeo, de acordo com a invenção.

Além disso, a invenção diz respeito a uma vacina que compreende um antígeno e um adjuvante, em que o referido adjuvante compreende um lipopolissacarídeo, de acordo com a invenção. De acordo com esta concretização, o LPS, de acordo com a invenção, melhora a resposta imune induzida pelo antígeno compreendido na vacina.

Em outra concretização da invenção, o LPS, de acordo com a invenção, é conjugado com uma molécula transportadora, a fim de aumentar a sua imunogenicidade. Assim, a invenção diz respeito a um conjugado que compreende um lipopolissacarídeo obtenível de uma bactéria Gram-negativa, de acordo com a invenção, ligado a uma molécula transportadora. De acordo com esta concretização, o conjugado de LPS/transportador induz uma resposta imune específica contra o LPS e pode, assim, ser utilizado como uma vacina. Exemplos não limitativos de moléculas transportadoras são as proteínas transportadoras, tais como o toxóide tetânico ou o toxóide da difteria.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção serão revelados nos seguintes exemplos e figuras, que devem ser considerados como ilustrativos e não limitativos do escopo da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: A BABAlpcC possui um defeito no núcleo de LPS.

SDS-PAGE de extratos de fenol-água e análise de Western blot de extratos de SDS-proteinase K de LPS de cepas BABparental (Ba wt-LPS), BABAlpcC (Ba LpcC-LPS) e BABAlpcCplpcC (Ba LpcC-compl-LPS). Os Moabs (anticorpos monoclonais) utilizados foram Cby-33H8 (para epítopo C/Y da cadeia O) e A68/24D08/G09.

Figura 2: Estado agregado de Ba wt-LPS e Ba LpcC-LPS. (A), tamanho de agregados das frações principal e secundária de LPS em dependência da concentração medida por dispersão de luz. (B), determinação da concentração crítica de agregados por emissão de fluorescência de NPN (o aumento na fluorescência causado pela partição de NPN nos agregados começa em 10 pg/ml para ambos Ba wt-LPS e Ba LpcC-LPS). Os mesmos valores foram obtidos para frações menores.

Figura 3: BABAlpcC mostra um aumento da sensibilidade à ação mortal de soro normal que se relaciona com o defeito do LPS. (A), sobrevida de BAB-parental, BABAlpcC, BABTn5::per e BABTn5::bvrR após a incubação em soro não imune durante 90 min. Os dados são a média ± erro padrão de três medições simultâneas (os resultados mostrados são representativos de três experimentos independentes), (B), transição de fase de gel para líquido cristalino (βθα) das cadeias de hidrocarbonetos de Ba wt-LPS e Ba LpcC-LPS, na presença ou ausência de soro humano normal. A posição do pico de vibração de alongamento simétrico dos grupos metileno vs(CH₂) versus a temperatura é representada graficamente.

Figura 4: BABAlpcC mostra o aumento da sensibilidade a peptídeos bactericidas policatiônicos que se relaciona com o defeito do LPS. (A), CIMs determinadas pelo teste-E (colistina) ou pelo método de diluição em série (polimixina B, poli-L-ornitina, poli-L-lisina). Os resultados apresentados são representativos de três experimentos em que BAB-parental, BABAlpcC foram ensaiados simultaneamente; (B), transição de fase de gel para líquido cristalino (βθα) das cadeias de hidrocarbonetos de Ba wt-LPS e Ba LpcC-LPS na presença ou ausência de polimixina B a uma razão molar de LPS:PMB de 1:0,1. A posição do pico de vibração de alongamento simétrico dos grupos metileno vs(CH2) versus a temperatura é representada graficamente.

Figura 5: BABAlpcC é atenuada em células dendríticas, mas não em macrófagos. (A), cinética de sobrevida intracelular e replicação de BAB-parental, BABAlpcC e BABAlpcC-plpcC em BMDM (painel à esquerda) ou BMDC (painel à direita) (um mutante virB10::Gm atenuado em ambos os tipos de células está incluído como referência; cada ponto representa a média ± erro padrão de poços em triplicata de um experimento representativo [foram realizados três experimentos independentes]), (B), imagens confocais de BMDCs infectadas com GFP de BAB-parental ou GFP de BABAlpcC (cinza claro) marcadas com Moabs tanto para calnexina ou LAMP I (ambos em cinza escuro), 24 horas após a infecção. Figura 6: BABAlpcC estimula uma liberação de citocinas comparativamente aumentada em BMDC infectadas, que é acompanhada pela atividade dependente de TLR4 do Ba LpcCLPS. (A), níveis de citocina nos sobrenadantes (24 h de incubação) de infectados (painel esquerdo) de BMDC estimulada por LPS (painel direito) obtida a partir de camundongos TLR do tipo selvagem (B), níveis de citocina nos sobrenadantes (24 h de incubação) de BMDC estimulada por LPS obtida a partir de camundongos inativados para TLR. Os códigos para as bactérias e LPSs são aqueles utilizados no texto. Os valores correspondem à média ± erro padrão de pelo menos três experimentos independentes.

Figura 7: Ba LpcC-LPS mostra uma ligação comparativamente aumentada a h-MD2.

Figura 8: BABAlpcC estimula uma maturação de células dendríticas. A Figura mostra os percentuais de BMDCs infectadas tanto com BAB-parental, BABAlpcC ou S.

typhimurium que contêm DALIS.

Figura 9: BABAlpcC atenuado em camundongos. Os gráficos mostram a cinética de infecção nos baços (painel esquerdo) e os pesos dos baços (painel direito) de camundongos inoculados com BAB-parental ou BABAlpcC (cada ponto representa a média ± erro padrão [n = 5] do logaritmo de UFC). Os gráficos da vacina de referência de B. abortus S19 e do BABTn5::per deficiente em cadeia O obtido em um experimento independente são adicionadas como referência.

Figura 10: Representação proposta do núcleo de LPS de Brucella. Nesta representação, a estrutura ramificada do núcleo é representada com duas unidades de açúcar (alfa-DManp e beta-D-GlcpN). O núcleo está ligado ao lipídeo A por meio de uma unidade de açúcar Kdo I, ao passo que está ligado à cadeia O através de uma alfa-D-Glcp. Esta representação é fornecida somente com um propósito de compreensão e não vincula os inventores a qualquer teoria, uma vez que a estrutura exata do núcleo ainda é desconhecida até o momento.

Figura 11: Análise de regressão da cinética de depuração do baço de BABAlpcC e da sua cepa parental. As equações de regressão correspondentes (y = -0,27 x + 6,81 [R = 0,77] e y 0 -0,07 x + 6,85 [0,95]) preveem um tempo de depuração de

25,2 e 93,8 semanas para BABAlpcC e BAB-parental, respectivamente. Cada ponto representa a média ± erro padrão do logaritmo de UFC nos baços de cinco animais. EXEMPLOS

Na seguinte descrição, todos os experimentos de biologia molecular para os quais nenhum protocolo detalhado é dado são realizados de acordo com protocolos padrão. MATERIAL E MÉTODOS

Cepas bacterianas e condições de crescimento. As cepas bacterianas e os plasmídeos utilizados são listados na Tabela 1:

TABELA 1 - Cepas bacterianas e plasmídeos

Cepa/plasmídeos	Características relevantes	Referência/Fonte
Brucella abortus
B. abortus 2308	Tipo selvagem, virulenta, biotipo 1, S-LPS
BAB-parental	mutante espontâneo NaIR da cepa B.	(Sangari e Agüero
	abortus 2308	1991)
BABAlpcC	BAB-parental. lpcCk16 . 308	Esse trabalho
BABAlpcC-plpcC	BABAlpcC abrigando o plasmídeo plpcC	Este trabalho
BABTn5::per	2308 NaIR per::Tn5; LPS bruto	Monreal e col. 2003)
virB10::Gm	2308 NaIR GmR, mutante apolar de virB10	(Sieira e col. 2000)
BAB-Tn5::bvrR	BAB-parental bvrR::Tn5, S-LPS;	(Mutante 65.21 em
	totalmente atenuado; sensível ao	Sola-Landa e col.
	soro normal	1998)

GFP de BAB- parental	BAB-parental abrigando pBBR1MCS-2 GFP KmR	Este trabalho
GFP de BABAlpcC	BABAlpcC abrigando pBBR1MCS-2 GFP KmR	Este trabalho
B. abortus S19		Dr. J.M. Blasco, C.I.T.A. Gobierno Aragón.
E. coli
S17-1	Cepa de acoplamento com o plasmídeo RP4 inserido no cromossomo	(Simon e col. 1983)
Top10 F'	F - laclq Tn 10 (Tetr) mcrA A(mrrhsdRMS-mcrBC) 80lacZAM15 AlacX74 recA1 alaD139 Δ (ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG	Invitrogen
Plasmídeos
pCR2.1	Vetor de clonagem	Invitrogen
pJQK	Derivado de pJQ200KS+; KmR; GmS	(Scupham e Triplett 1997)
pRH001	Derivado de pMR10 KmR; CmR	(Hallez e col. 2007)
PRCI-23	1019 pb de DNA cromossômico de BABparental contendo o alelo de deleção de IpcC, gerado por PCR e clonado em pCR2.1	Este trabalho
PRCI-26	Fragmento BamHl-Xbal de pRCLI-23 clonado nos sítios correspondentes de pJQK	Este trabalho

pDONR201 BMEI0509	DNA cromossômico de B. melitensis contendo o gene IpcC completo, gerado por PCR e clonado em pDONR201 (Invitrogen)	(Dricot e col. 2004)
plpcC	fragmento attL1-attL2 de pDONR201- BMEI0509 clonado nos sítios attR1attR2 de pRH001	Este trabalho
GFP de pBBR1MCS-2	derivado de pBBR1MCS-2 expressando o gene gfp-mut3 sob o controle do promotor de ausência	Dr. J.P. Gorvel, INSERM-CNRS, Marseille, França

As bactérias foram rotineiramente cultivadas em caldo de soja tríptica padrão ou ágar simples ou suplementado com canamicina a 50 μg/ml, e/ou nalidíxico a 25 μg/ml, e/ou 5 sacarose a 5%. Todas as cepas foram armazenadas em leite desnatado a -80°C.

Extração e caracterização de LPS. A extração de LPS de células inteiras através do protocolo de SDS-proteinase K foi realizado como descrito anteriormente (Garin-Bastuji B 10 e col., (1990) J Clin Microbiol 28: 2169-2174). Além disso, o LPS foi obtido por precipitação com metanol da fase fenólica de um extrato fenol-água (Leong D e col. (1970) Infection and Immunity 1: 174-182). Esta fração (10 mg/ml em NaCl 175 mM, NaN3 0,05%, Tris-HCl 0,1 M [pH 7,0]) foi 15 então purificada por digestão com nucleases (50 μg/ml cada

de DNase-II	tipo V e	RNase-A	[Sigma], 30	min a	37°C)	e três
vezes com	proteinase K (50	pg/ml, 3	horas	a 55	°C) , e
ultracentri	fugada (6	h, 100	.000 x g)	(Aragon V	e col.
(1996) J	Bacteriol	178:	1070-1079).	Lipídeos	livres
(lipídeos	de ornitina e	fosfolipídeos)	foram	então
removidos	por uma	extração	quádrupla	com	clorofórmio-
metanol (2:	1 [v/v]).	(Velasco	J e col.	(2000)	Infect Immun

68: 3210-3218).

Os LPS foram analisados em géis de poliacrilamida a 15 ou 18% (razão de acrilamida/metileno-bisacrilamida de

37,5:1) em Tris-HCl-glicina e corados pelo método do periodato-prata alcalina (Tsai CM e col. (1982) Anal

Biochem 119: 115-119). Para Western blots os géis foram eletrotransferidos sobre lâminas de nitrocelulose (Schleicher & Schuell GmbH, Dassel, Alemanha), bloqueados com leite desnatado a 3% em salina tamponada com fosfato (PBS) 10 mM com Tween 20 a 0,05% de um dia para outro e lavados com PBS-Tween 20 0,05%. Os soros imunes foram diluídos no mesmo tampão e, depois da incubação de um dia para outro à temperatura ambiente, as membranas foram lavadas novamente. Imunoglobulinas ligadas foram detectadas com imunoglobulina de cabra anti-camundongo conjugada com peroxidase (Nordic) e 4-cloro-1-naftol-H2O2. Anticorpos monoclonais (Moabs) utilizados neste estudo foram Cby-33H8 (Ingenasa, Madrid, Espanha), que reconhece o epítopo C/Y de cadeia O, e A68/24D08/G09, A68/24G12/A08 e A68/3F03/D5, que reconhecem epítopos do núcleo (Bowden RA e col. (1995) Infection and Immunity 63: 3945-3952). O marcador de LPS do núcleo interno, ácido 3-Desoxi-D-mano-2-octulosônico (Kdo) foi determinado por colorimetria pelo método do ácido tiobarbitúrico utilizando Kdo puro e desoxirribose como os padrões, com as modificações descritas anteriormente (DíazAparicio E e col. (1993) J Clin Microbiol 31: 3136-3141; Díaz-Aparicio E e col. (1993) J Clin Microbiol 31: 31363141).

Determinação do tamanho do agregado e da concentração de agregação crítica de LPS. O tamanho do agregado de LPSs foi determinado por dispersão dinâmica da luz. Suspensões de LPS de matéria-prima foram preparadas a 1 mg/ml em água deionizada purificada por osmose reversa e submetidas a três ciclos de aquecimento a 56°C e arrefecimento a 4°C para homogeneizá-las. No dia da utilização, diluições em série na faixa de 1 a 500 pg/ml foram preparadas e filtradas através de membranas Durapore® (PVDF) de baixa ligação proteica de 0,45 pm imediatamente antes da medição. As medições de dispersão de luz foram realizadas em um aparelho DynaPro a 37°C utilizando-se um laser de 825 nm e um ângulo de dispersão de 90⁰. Os dados foram analisados pelo método de regularização no software Dynamics V6.

A concentração de agregação crítica de LPS foi determinada por fluorescência em estado estacionário utilizando-se N-fenil-1-naftilamina (NPN), uma sonda fluorescente hidrofóbica, cujo rendimento quântico aumenta em ambientes hidrofóbicos. NPN (500 μΜ em acetona) foi adicionada em 1 ml de água para a obtenção de NPN a uma concentração final de 15 μΜ em uma cubeta de quartzo de 1 centímetro óptico. Em seguida, volumes diferentes de uma matéria-prima de LPS foram adicionados (de 1 μg/ml a 100 μg/ml, concentração final). A fluorescência foi medida (excitação, 350 nm; varredura de emissão, 380nm-600nm) em um aparelho Edinbugrh FLS920 a 37°C.

Determinação da fluidez de cadeia acila de LPS. A transição das cadeias acila de LPS de um estado bem ordenado (fase gel) para um estado fluido (fase líquida cristalina) a uma temperatura lipídeo-específica (Tc) foi determinada por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier. Uma banda vibracional específica, a vibração de alongamento simétrico dos grupos metileno vs(CH2) em torno de 2.850 cm^-1, foi analisada, uma vez que a sua posição de pico é uma medida do estado de ordem (fluidez) das cadeias acila (Brandenburg K e col. (1997) Biochim Biophys Acta 1329: 183-201). As medições foram realizadas em um aparelho

Bruker IFS 55 (Bruker, Karlsruhe, Alemanha) , como descrito anteriormente (Brandenburg K e col. (1997) Biochim Biophys Acta 1329: 183-201). Para assegurar a homogeneidade, suspensões de LPS foram preparadas em HEPES 2,5 mM (pH 7,2) à temperatura ambiente, incubadas a 56°C durante 15 minutos, agitadas e arrefecidas a 4°C. Esta etapa de aquecimento/arrefecimento foi repetida três vezes e as suspensões foram armazenadas a 4°C durante várias horas antes da análise. As suspensões de LPS (teor de água, 90%) foram analisadas em cubetas de CaF2 com espaçadores de Teflon de 12,5 pm e, para cada medição, 50 interferogramas foram acumulados, transformados por transformada de Fourier e convertidos em espectros de absorbância. As medições foram obtidas em varreduras de aquecimento contínuo (2°C/min) entre 10°C e 60°C. Para testar o efeito do complemento, os experimentos foram realizados na presença de soro humano normal. O efeito da polimixina B foi avaliado de forma similar em diferentes razões molares de LPS:polimixina B (ver Resultados) e utilizando-se um PM médio de 11800 para LPS de B. abortus (determinado por SDSPAGE com LPS de Yersinia enterocolitica O:8 como padrão).

Manipulações de DNA. O DNA cromossômico e o plasmídeo foram extraídos com Qiaprep spin Miniprep (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) e kit de Isolamento de DNA Microbiano Ultraclean (Mo Bio Laboratories), respectivamente. Quando necessário, o DNA foi purificado a partir de géis de agarose utilizando-se o kit de extração Qiack Gel (Qiagen) . O sequenciamento de DNA foi realizado pelo Servicio de Secuenciación de CIMA (Centro de Investigación Médica Aplicada, Pamplona, Espanha). Os iniciadores foram sintetizados pela Sigma-Genosys Ltd. (Haverhill, Reino Unido). As pesquisas por homologias de DNA e de proteína foram realizadas utilizando-se o NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e o servidor EMBL do European

Bioinformatics

Institute (http://www.ebi.ac.UK/ebi_home.html). Além disso, os dados da sequência foram obtidos a partir do sítio eletrônico do The Institute for Genomic Research em http://www.tigr.org.

As sequências genômicas de B. melitensis 16M, B. abortus e B. suis foram analisadas utilizando-se o banco de dados do grupo de bioinformática do URBM (http://www.serine.urbm.fundp.ac.be/~seqbruce/GENOMES/Bruce lla_melitensis).

Construção do mutante apolar lpcC de B. abortus (BABAlpcC).

O mutante de deleção in-frame BABAlpcC foi construído por sobreposição de PCR utilizando-se DNA genômico de B. abortus 2308 como molde de DNA. Os iniciadores foram concebidos com base na sequência disponível dos genes correspondentes em B. abortus 2308. Para a construção do mutante IpcC, primeiramente foram gerados dois fragmentos de PCR: os oligonucleotídeos lpcC-F1(5'CTGGCGTCAGCAATCAGAG -3', SEQ ID NO: 17) e lpcC-R2 (5'GTGCAACGACCTCAACTTCC -3'; SEQ ID NO: 18) foram utilizados para amplificar um fragmento de 476 pb incluindo os códons 1 a 16 da ORF de lpcC, bem como 424 pb à montante do códon de iniciação de IpcC, e os oligonucleotídeos IpcC- F3 (5' GGAAGTTGAGGTCGTTGCACACGCCATCGAACCTTATCTG -3'; SEQ ID NO: 19) e lpcC-R4 (5'- CGGCTATCGTGCGATTCT -3'; SEQ ID NO: 20) foram utilizados para amplificar um fragmento de 453 pb, incluindo os códons 308 a 354 da ORF de IpcC e 320 pb à jusante do códon de parada de IpcC. Ambos os fragmentos foram ligados pela sobreposição de PCR utilizando-se os oligonucleotídeos lpcC-F1 e lpcC-R4 para a amplificação e as regiões complementares entre lpcC-R2 e lpcC-F3 para a sobreposição. O fragmento resultante, contendo o alelo de deleção de lpcC, foi clonado em pCR2.1 (Invitrogen) para gerar o plasmídeo pRCI-23, sequenciado para assegurar a manutenção da região de leitura e, subsequentemente, subclonado nos sítios BamHI e Xbal do plasmídeo suicida pJQK (Scupham AJ e col. (1997) Gene 202: 53-59). O plasmídeo mutante resultante (pRCI-26) foi introduzido em B. abortus 2308 por conjugação. A primeira recombinação (integração do vetor suicida no cromossomo) foi selecionada por resistência a Nal e Kan, e a segunda recombinação (excisão do plasmídeo mutante, levando à construção do mutante por troca alélica) foi selecionada por resistência a Nal e sacarose e sensibilidade à Kan. As colônias resultantes foram rastreadas por PCR com iniciadores IpcCF1 e lpcC-R4, que amplificam um fragmento de 929 pb no mutante e um fragmento de 1805 pb na cepa parental. A mutação gerada resulta na perda de 82% da ORF de IpcC, e a cepa mutante foi chamada de BABAlpcC.

Complementação de BABAlpcC. Levando-se em consideração que as sequências de LpcC de B. melitensis e B. abortus são idênticas, foi utilizado o ORFeoma de B. melitensis construído com a Gateway cloning Technology (Invitrogen) para complementação (Dricot A e col. (2004) Genome Res 14:

2201-2206).	O clone que carrega	o	lpcC	de B. melitensis	foi
extraído e	o DNA	contendo	a	ORF	correspondente	foi
subclonado	em pRH001	(Hallez R	e	col.	(2007) Appl Environ

Microbiol 73: 1375-1379) para produzir o plasmídeo plpcC. Para complementar a mutação do lpcC, o plasmídeo plpcC foi introduzido no mutante BABAlpcC por acoplamento com E. coli S17-1 e os conjugantes que abrigam plpcC (designado como BABAlpcCplpcC) foram selecionados através de plaqueamento da mistura de combinaçãoacoplamento em placas de TSA-Nal

Kan, que foram incubadas a 37°C durante 3 dias.

Sensibilidade a fagos de Brucella, corantes, antibióticos e peptídeos policatiônicos bactericidas. As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de polimixina B, poli-Lornitina, poli-L-lisina, colistina, penicilina, doxiciclina, claritromicina, eritromicina, rifampicina, fucsina básica, safranina e tionina foram determinadas em meio de Müller-Hinton através de procedimentos padrão. A sensibilidade aos fagos de Brucella brutos (R/C)específicos e S (Wb, Iz) foi medida testando-se a lise de bactérias expostas a diluições seriadas de 10 vezes realizadas a partir de um teste de diluição de rotina de matéria-prima de fago (Alton GG e col. (1988) Techniques for the brucellosis laboratory. Paris, França: INRA).

Sensibilidade à ação bactericida de soro não imune.

Bactérias que crescem exponencialmente foram ajustadas para 10⁴ UFC/ml em solução salina e dispensadas em triplicata em placas de microtitulação (45 pl por poço) contendo soro bovino normal fresco (90 pl/poço). Após 90 min de incubação a 37°C, caldo de infusão de cérebro e coração foi dispensado (200 pl/poço), misturado com a suspensão bacteriana e 100 pl foram plaqueados em ágar de soja tríptica. Os resultados foram expressos como o percentual da UFC média em relação ao inóculo.

Multiplicação intracelular. Células da medula óssea foram isoladas do fêmur de camundongos fêmea C57B1/6 com 7-8 semanas de idade, TLR4^-/- (Hoshino K e col. (1999) J Immunol 162: 3749-3752) ou TLR9-/- (Hemmi H e col. (2000) Nature 408: 740-745) e diferenciadas tanto em células dendríticas (BMDCs) ou macrófagos (BMDM), como descrito por Inaba e col. ou De Chastellier e col. (Inaba K e col. (1992) J Exp Med 176: 1693-1702; Inaba K e col. (1992) J Exp Med 176: 1693-1702; De Chastellier C e col. (1993) Infect Immun 61: 3775-3784), respectivamente. As infecções foram realizadas através de centrifugação das bactérias sobre as células diferenciadas (400 x g durante 10 min a 4°C; bactérias: proporção de células de 20:1 para BMDCs ou 50:1 para BMDM), seguido por incubação a 37°C durante 15 minutos (BMDM) ou 30 min (BMDCs) sob uma atmosfera de CO2 a 5%. As células foram tanto extensivamente lavadas (BMDM) ou suavemente lavadas (BMDCs) com meio para remover bactérias extracelulares e incubadas em meio suplementado com 100 pg/ml de gentamicina durante 1 h para matar bactérias extracelulares. Depois disso, a concentração de antibiótico foi reduzida para 20 pg/ml. Para monitorar a sobrevida intracelular de Brucella, as células infectadas foram lisadas com Triton X-100 a 0,1% (v/v) em H₂0 (BMDCs) ou após lavagem em PBS (BMDM) e diluições em série dos lisados foram rapidamente plaquedas em placas de ágar de soja tríptica para enumerar UFCs.

Ensaios de imunofluorescência. BMDCs foram cultivadas em lamínulas de vidro e inoculadas com bactérias, tal como descrito acima. Em diferentes momentos após a inoculação (ver os Resultados), as lamínulas foram fixadas com paraformaldeído a 3% em pH 7,4 a 37°C durante 15 min e lavadas três vezes com PBS. As lamínulas foram processadas por coloração de imunofluorescência, tal como anteriormente descrito (Celli J e col. (2003) J Exp Med 198: 545-556) . Resumidamente, as células foram permeabilizadas com saponina a 0,1% e incubadas com anticorpos primários. Após várias lavagens, os anticorpos primários foram revelados com os anticorpos secundários apropriados. Os anticorpos primários utilizados para a microscopia de imunofluorescência foram: anti-B. abortus de vaca; anticamundongo LAMP1 ID4B de rato (Developmental Studies Hibridoma Bank, National Institute of Child Health and Human Development, Universidade de Iowa), anti FK2 de camundongo (Biomol) e Moab anti-calnexina (gentilmente cedido pelo Dr. D. Williams, da Universidade de Toronto). Em todos os experimentos, BMDCs foram marcadas utilizandose um anticorpo contra um epítopo citoplasmático conservado encontrado em subunidades β de MHC-II I-A (Lelouard H e col. (2002) Nature 417: 177-182), que não produz marcação significativa com BMDM e também foram marcadas com um anticorpo anti-CD11c (Biolegend), confirmando que elas são DCs (Salcedo SP e col. (2008) PLoS Pathogens 4: e21). As amostras foram analisadas sob um microscópio de epifluorescência Leica DMRBE para análise quantitativa, ou um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss LSM 510 para aquisição de imagem.

Medição de citocinas. Ensaios de imunoabsorção ligados a enzima (ELISA) do tipo “Sanduíche (AbCys, Paris, França) foram utilizados para detectar IL-12 (p40/p70) e TNFa nos sobrenadantes de BMDCs 24 horas após a infecção (ver acima) ou após o estímulo com 10 pg/ml do LPS adequado de diferentes cepas de Brucella ou 100 ng/ml de E. coli ATCC 35218 obtida pelo procedimento fenol-água e purificados adicionalmente pelo método fenol-água-desoxicolato. Para o último objetivo, um caldo de 1 mg/ml em água estéril livre de pirogênio foi preparado, brevemente sonicado e esterilizado por autoclavagem. Antes da utilização, o caldo foi aquecido a 56°C durante 15 minutos e depois arrefecido até a temperatura ambiente.

Ligação de LPS a hMD-2 por ELISA competitivo. O ELISA para determinação de ligação de LPS a hMD-2 foi realizado em placas de 96 poços (imunoplaca NUNC F96 cert. Maxi-Sorp).

Anti-hMD2 de frango (GenTel) (5 pg/ml) em Na₂CO3 50 mM (pH 9,6) foi utilizado para revestir a placa de microtitulação a 4°C de um dia para outro. Sítios de ligação em excesso foram bloqueados com BSA a 1% em tampão de PBS 10 mM (pH 7,2) durante 1 h à temperatura ambiente e rinsados três vezes com o mesmo tampão. Durante a etapa de bloqueio, hMD2 (0,75 μΜ) foi pré-incubado com LPS 0 μΜ a 8 μΜ a 37°C e, como controle negativo, o LPS também foi pré-incubado na ausência de hMD2. Estas soluções pré-incubadas foram adicionadas à placa, que foi então incubada durante 1 h a 37°C. Após rinsagem, hMD-2 não ligado ao LPS foi detectado por incubação com 0,1 μg/ml de anti h-MD2 de camundongo (clone 9B4 e-Bioscience) em tampão PBS 10 mM a 37°C durante 1 h, seguido de incubação com 0,1 μg/ml de IgG anticamundongo de cabra conjugado com peroxidase (Santa Cruz), também em tampão PBS a 37°C durante 1 h. Após lavagem da placa, ABTS (Sigma) foi adicionado, a reação foi interrompida com SDS a 1% depois de 15 min e a absorbância a 420 nm foi medida utilizando-se um aparelho Mithras LB940 (Berthold Technologies).

Ensaio de virulência em camundongos. Experimentos de infecção foram realizados como descrito em Conde-Alvarez, R. e col., 2006, Cell. Microbiol. 8:1322-1335. Para cada cepa, 30 camundongos foram inoculados por via intraperitoneal com 0,1 ml de inóculo contendo 5,8 x 10⁴ (controle parental) e 4,9 x 10⁴ (BABAlpcC) UFC/camundongo e o número de UFC nos baços (n = 5) foi determinado em 1, 2, 4, 6, 8 e 12 semanas após a inoculação. A identidade dos isolados de baço foi confirmada por PCR em vários pontos durante o processo de infecção. Os dados individuais foram normalizados por transformação logarítmica e a média e o desvio padrão de log de UFC/baço foram calculados. As comparações estatísticas foram realizadas pelo teste de Diferenças Mínimas Significativas Protegidas de Fisher. Uma infecção adicional foi realizada sob as mesmas condições, mas incluindo BABAlpcC abrigando plpcC. O número de UFC nos baços foi determinado 8 semanas após a inoculação.

Estudos de proteção em camundongos. Três grupos de 10 camundongos cada foram inoculados subcutaneamente com 3,9 x 10⁴ UFC de BABAlpcC, 1,3 x 10⁵ de B. abortus S19 por camundongo ou solução salina estéril como controle. Quatro semanas após a vacinação, cada grupo foi desafiado por injeção intraperitoneal de 3,6 x 10⁴ UFC de B. abortus virulento por camundongo. Para diferenciar o desafio da cepa de vacina, a GFP de BAB-parental (Tabela 1) foi utilizada, tirando-se vantagem da sua resistência à canamicina (em experimentos preliminares, a virulência de GFP de BAB-parental foi medida e verificou-se ser idêntica

7 a do BAB-parental) . Duas e seis semanas mais tarde, os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical e a UFC da cepa de desafio nos baços foi determinada em ágar de soja tríptica suplementado com canamicina (ver acima). A média ± DP do log de UFC por baço foi calculada e comparações estatísticas foram feitas como descrito acima. As doses de vacina e do desafio, vias e intervalos de desafio foram escolhidos com base em evidências anteriores (Grillo MJ e col. (2000) Biologicals 28: 119-127; Stevens MG e col. (1995) Infection and Immunity 63: 264-270). RESULTADOS

Construção e características de um mutante IpcC de B. abortus. Para analisar o papel da ORF BAB1_1522 na síntese de LPS de Brucella, construiu-se um mutante apolar {BABAlpcC), fazendo-se uma deleção interna no quadro da região de codificação para os aminoácidos 17 a 307. Para testar se a mutação induziu modificações no envelope celular ou alterações no padrão de permeabilidade característico de Brucella (Martínez de Tejada G e col. (1993) J Bacteriol 175: 5273-5275), comparou-se a sensibilidade da cepa BAB-parental e do mutante BABAlpcC com fagos de Brucella S e R, corantes (fucsina, tionina e safranina) e antibióticos hidrofóbicos (eritromicina, rifampicina) e hidrofílicos (penicilina, doxiciclina, claritromicina). Ambas as cepas comportaram-se de forma semelhante em todos os testes realizados e, além disso, mostraram taxas de crescimento semelhantes (dados não mostrados).

O mutante BABAlpcC possui um defeito no núcleo de LPS. Para analisar o efeito da mutação IpcC na estrutura do LPS, esta molécula foi extraída utilizando-se o protocolo desenvolvido para S-LPS de Brucella (Leong D e col. (1970) Infection and Immunity 1: 174-182). Este protocolo inclui uma partição fenol-água, seguida por uma primeira digestão com nucleases e proteinase K e, em seguida, ultracentrifugação, uma etapa que permite a recuperação de mais de 70% do LPS purificado no sedimento. Em seguida, o LPS é liberado dos fosfolipídeos e lipídeos de ornitina por extração com solvente. No entanto, quando este método foi aplicado a BABAlpcC, o rendimento foi de apenas 32% daquele obtido com a cepa parental, um resultado que poderia ser devido tanto a uma quantidade reduzida de LPS em BABAlpcC ou a uma falha do protocolo padrão para produzir o LPS quantitativamente. A primeira possibilidade foi descartada medindo-se o teor total de LPS bacteriano usando o método de extração de SDS-proteinase K seguido por Western blot com Moab anti-cadeia O Cby-33H8 (especificidade C/Y) (Figura 1). Quando o protocolo clássico foi reexaminado, verificou-se que o sobrenadante da ultracentrifugação continha uma quantidade inesperada de um material. Por análise de SDS-PAGE e Kdo, este material era semelhante ao S-LPS obtido em quantidades menores no sedimento da etapa de ultracentrifugação (não mostrado). Estes resultados sugeriram um estado de agregação diferente nos S-LPSs parental e BABAlpaC, uma possibilidade testada pela medição do tamanho dos agregados por dispersão de luz dinâmica. Para ambos os S-LPSs parental e BABAlpaC, os agregados nas frações de sobrenadante tiveram uma razão média de aproximadamente 100 nm, enquanto que aqueles no sedimento foram de aproximadamente 150 nm em concentrações acima de 100 pg/ml (Figura 2). Isto, no entanto, não diz respeito a uma diferença na concentração crítica de agregados desses LPSs (10 pg/ml), conforme mostrado por fluorimetria (Figura

2). Estes resultados demonstraram que as frações principais dos LPSs de BABAlpaC e BAB-parental diferiam no tamanho de agregados.

As análises de SDS-PAGE e de Western blot mostraram que, como esperado, a cepa parental continha LPS do tipo selvagem consistindo em ambas as frações S e R (Figura 1) . No entanto, embora não houvesse alteração no teor total de S-LPS, os extratos de LPS de BABAlpaC tinham quantidade menor de R-LPS e com um padrão de migração diferente. Esta particularidade, que foi observada tanto no sobrenadante (não mostrado) quanto nas frações de sedimento (Figura 1), foi confirmada pela falta de reatividade dos Moabs antinúcleo (Figura 1) com LPS obtido de BABAlpcC pelo procedimento de SDS-proteinase K. Além disso, quando o plasmídeo plpcC (que codifica o gene IpcC) foi introduzido no BABAlpcC, a reatividade do Moab foi restaurada (Figura 1). Estes resultados indicam que o LpcC é necessário para a síntese normal do LPS de núcleo, mas não para a montagem e a incorporação da cadeia O. Salvo indicação em contrário, os estudos descritos abaixo foram realizados com as frações principais de cada uma das bactérias (doravante referidas como Ba wt-LPS e Ba-LpcC-LPS).

É necessário um núcleo de LPS intacto para a resistência de B. abortus à ação bactericida de peptídeos policatiônicos e soro normal. S brucellae são resistentes à ação bactericida do soro normal e esta resistência foi atribuída à cadeia O (Eisenschenk FC e col. (1999) Vet Microbiol 68: 235-244). No entanto, alguns mutantes R de B. melitensis e B. ovis (uma espécie naturalmente R de Brucella) foram relatados por serem resistentes ao soro (David Gonzalez, CaroHenandez, Fernandez-Prada), sugerindo que o núcleo de LPS também pode ser importante. Para avaliar esta possibilidade, BABAlpcC, BABTn::5per, BABTn::5bvrR (Tabela

1) e BAB-parental foram incubados em soro normal durante 90 minutos e testados quanto à viabilidade. Como pode ser visto na Figura 3, BABAlpcC foi mais sensível do que a cepa BAB-parental, mas não tanto quanto o mutante bvrR. Além disso, a comparação com BABTn::5per mostrou que o núcleo era tão importante quanto a cadeia O nesta propriedade.

O envolvimento do defeito no Ba LpcC-LPS no aumento da sensibilidade ao soro de BABAlpcC foi testado. Para este fim, examinou-se a fluidez da cadeia acila do lipídeo A de Ba wt-LPS e Ba LpcC-LPS na presença de soro, uma vez que este parâmetro aumenta após a ligação de moléculas aos agregados de LPS (Brandenburg K e col. (2005) Biophys J 88: 1845-1858). Como é mostrado na Figura 3, a transição β θ α que marca a passagem da fase cristalina para a fase fluida ocorreu na faixa de 30 a 40°C para o Ba wt-LPS, com uma Tc de 37°C na ausência de soro. Surpreendentemente, o Ba LpcCLPS apresentou um perfil de fluidez muito diferente, com uma Tc entre 45 e 55°C e com uma fluidez de cadeia acila abaixo da Tc mais restrita do que o Ba wt-LPS, indicando que os agregados estavam na fase cristalina a temperaturas fisiológicas. Apesar desta maior rigidez, os agregados de Ba LpcC-LPS foram claramente afetados pela presença de soro normal, enquanto que aqueles de Ba wt-LPS não foram (Figura

3). Estes resultados sugerem que a ausência de parte do núcleo pode estar descobrindo alvos do complemento e estão de acordo com a sensibilidade ao soro das bactérias.

Brucella também é resistente a peptídeos policatiônicos bactericidas (Martínez de Tejada G e col. (1995) Infect Immun 63: 3054-3061; Freer E e col. (1996) J Bacteriol 178: 5867-5876), uma propriedade relacionada, principalmente, à baixa carga negativa nas seções de LPS do núcleo e do lipídio A (Velasco J e col. (2000) Infect Immun 68: 3210-3218). Para avaliar se o defeito do núcleo em BABAlpcC afetou essa propriedade, foi examinada a sensibilidade à polimixina B, colistina, poli-L-lisina e poli-L-ornitina. Os resultados demonstraram uma maior sensibilidade de BABAlpcC a todos estes agentes (Figura 4). Como nos experimentos de sensibilidade ao soro, o Ba LpcCLPS foi testado para a ligação policatiônica, medindo-se a fluidez da cadeia acila. A Figura 4 mostra que a polimixina B aumentou a fluidez do Ba LpcC-LPS.

É necessário um núcleo de LPS intacto para que B. abortus evite a fusão de lisossomos e se multiplique em células dendríticas. BABAlpcC foi testado quanto à sua capacidade de se multiplicar em macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) e em células dendríticas (BMDCs) em comparação com BAB-parental. O comportamento em BMDM de ambas as bactérias foi semelhante mostrando assim, nenhuma atenuação do mutante nessas células (Figura 5). Em contraste, o mutante virB atenuado utilizado como controle falhou em se multiplicar. Em BMDCs, no entanto, BABAlpcC e BAB-parental apresentaram um comportamento diferente. Enquanto BABparental não foi destruído e foi capaz de se multiplicar, BABAlpcC diminuiu significativamente tanto imediatamente após a infecção (Figura 5A) ou depois de 24 horas (não mostrado), dependendo do experimento, embora não na mesma extensão que o controle virB. A complementação do BABAlpcC com o plasmídeo plpcC restaurou a capacidade de se multiplicar nestas células.

A localização intracelular em BMDC foi determinada por microscopia confocal (Figura 5B). Vinte e quatro horas após a infecção, BAB-parental estava presente em elevado número em BMDCs, enquanto que as células infectadas com BABAlpcC estavam quase livres das mesmas. Além disso, a maioria das bactérias BAB-parental foram colocalizadas com o marcador de retículo endoplasmático calnexina, mas não com o marcador lisossomal LAMP-1. Em contraste, o mutante BABAlpcC estava em vacúolos positivos para LAMP-1, aparentemente incapazes de estabelecer um compartimento derivado de retículo endoplasmático. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que uma maior proporção de bactérias mutantes foram degradadas logo após a captação, o que mostra que o núcleo de LPS tem um papel na resistência de B. abortus à morte por células dendríticas.

A deficiência de núcleo de LPS aumenta a secreção de TNFa e IL-12 por células dendríticas infectadas por B. abortus. A infecção por Brucella é caracterizada por uma baixa indução de mediadores pró-inflamatórios e inflamatórios, incluindo TNFa, IL1beta, IL-6, IL-10 e IL-12, e o LPS é uma moléculachave neste baixo reconhecimento pela imunidade inata (Barquero-Calvo E e col. (2007) PLoS ONE 2: e631) . Portanto, era de interesse estudar a produção de TNFa e IL12 por BMDCs infectadas com BAB-parental e com BABAlpcC e observar se os resultados foram reproduzidos por estímulo com os LPSs. Os resultados mostraram que o mutante induziu uma produção mais forte de ambas as citocinas, que foi acompanhada pela capacidade de Ba LpcC-LPS de estimular a secreção de ambas as citocinas (Figura 6). Além disso, os experimentos em BMDCs obtidas a partir dos mutantes de TLR adequados demonstraram que os efeitos foram dependentes de TLR4 e, por conseguinte, diretamente atribuíveis ao LPS (Figura 6). Além disso, observou-se que a fração secundária de LPS nos sobrenadantes dos extratos de BAB-parental produziu resultados semelhantes aos obtidos com o Ba wtLPS, mas a fração de sedimento correspondente ao Ba LpcCLPS não conseguiu estimular quantidades elevadas de qualquer citocina (não representado).

O núcleo de LPS de B. abortus modula o reconhecimento por MD2. As bactérias que transportam LPSs clássicos são reconhecidas pelo sistema CD-14-MD2 TLR4, que desencadeia uma cascata de sinais que levam à produção de citocinas. Neste reconhecimento, MD2 desempenha um papel crítico e há evidências de que ele interage com LPSs clássicos através da seção do núcleo e do lipídeo A (Gruber A e col. (2004) J Biol Chem 279: 28475-28482; Ohto U e col. (2007) Science 316: 1632-1634) . No entanto, sabe-se que mutações de TLR4 não afetam o curso de infecções por Brucella (BarqueroCalvo E e col. (2007), PLoS ONE 2: e631; Lapaque N e col. (2006) Cellular Microbiology 8: 401-413) e que o LPS de Brucella ativa fracamente o sistema TLR4-MD2 (Duenas AI, e col. (2004) Int Immunol 16: 1467-1475). Uma vez que BABAlpcC induziu de forma anormal altos níveis de citocinas em comparação com BAB-parental, foi interessante estudar a interação de Ba LpcC-LPS com MD2. Para este propósito, um ELISA competitivo com hMD-2 e um anticorpo que reconhece hMD2 livre, mas não o hMD2 ligado ao LPS, foi utilizado (Gradisar H e col. (2007) J Leukoc Biol 82: 968-974; Gradisar H e col. (2007) J Leukoc Biol 82: 968-974) . Em conformidade com a baixa indução de citocinas in vivo, Ba wt-LPS não inibiu a ligação do anticorpo ao hMD2 em nenhuma das concentrações testadas. Em contraste, Ba LpcC-LPS inibiu a ligação a 40 μg/ml ou em concentrações mais elevadas, um valor que, embora claramente diferente daquele do LPS de S. enteritidis, partiu daquele do Ba wt-LPS (Figura 7). Neste caso, as frações secundárias dos extratos de LPS de ambos BAB-parental e BABAlpcC reproduziram estes resultados, embora não tão claramente para o último. Estes resultados demonstram que o núcleo de LPS de B. abortus contribui para o baixo reconhecimento de LPS de Brucella por MD2.

A inibição da maturação de células dendríticas por B. abortus requer um núcleo de LPS intacto. Em resposta aos produtos microbianos, as células dendríticas passam por um processo de maturação, que inclui a formação de grandes agregados de proteínas poliubiquitinadas, denominadas estruturas induzidas do tipo agressoma de células dendríticas (DALIS). Acredita-se que as DALIS contenham proteínas deformadas e componentes do sistema de ubiquitina, sugerindo que a ubiquitinação de proteínas deformadas ocorre nessas estruturas. Sugeriu-se que o armazenamento de proteínas auto deformadas durante a infecção pode permitir a apresentação eficiente de peptídeos a partir de proteínas microbianas externas.

Brucella interfere na maturação das células dendríticas, uma capacidade que deve favorecer o estabelecimento da infecção (Salcedo SP e col. (2008) PLoS Pathogens 4: e21). Para analisar se a atenuação da BABAlpcC em BMDC foi acompanhada por um defeito neste interferência, a formação de DALIS foi examinada utilizando um Moab FK2 que reconhece proteínas ubiquitinadas (Fujimuro M (1994) FEBS Lett 349: 173-180). Como pode ser visto na Figura 8, o mutante BABAlpcC induziu um maior número de DALIS do que a cepa parental. Para relacionar este efeito à estrutura de Ba LpcC-LPS, estimulou-se a BMDC obtida a partir de camundongos do tipo selvagem, inativados em TLR4 ou TLR9 (como um controle) (dados não mostrados). Para o Ba wt-LPS, DALIS não foram observadas em nenhum tipo de células dendríticas. Em contraste, Ba LpcC-LPS induziu a formação de DALIS em células inativadas para TLR9, mas não em células inativadas para TLR4, demonstrando, assim, o envolvimento do Ba LpcC-LPS na indução da maturação de células dendríticas.

É necessário um núcleo de LPS intacto para a virulência de B. abortus em camundongos. BABAlpcC foi incapaz de se multiplicar em BMDCs, sugerindo que este mutante pode ser atenuado no modelo de camundongo. Para testar esta hipótese, camundongos BALBc foram infectados por via intraperitoneal com BAB-parental e BABAlpcC e a cinética de multiplicação bacteriana no baço e os pesos dos baços foram comparados (Figura 9) . BABAlpcC mostrou atenuação significativa (P = 0,0002) da quarta semana em diante. Na sexta semana, UFC/baço de BAB-parental foi superior em dois logs, e esta diferença não se alterou em momentos posteriores. A esplenomegalia aumentou de maneira semelhante para ambas as bactérias até a quarta semana. No entanto, enquanto que o aumento do baço atingiu um máximo na semana 8 para BAB-parental, ele começou a diminuir após a semana 4 para o BABAlpcC. Em um experimento independente, as UFC do baço da cepa complementada BABAlpcC-plpcC e da cepa de BAB-parental (média e desvio padrão de log de UFC 6,74 ± 0,25 e 6,35 ± 0,31, respectivamente) não foram significativamente diferentes (P = 0,15) no momento testado (oitava semana). Além disso, ambas foram significativamente diferentes da UFC obtida para BABAlpcC neste experimento (4,04 ± 0,49; P <0,001). Estes resultados indicaram claramente que um núcleo de LPS intacto é necessário para a virulência total de B. abortus em camundongos.

Proteção em camundongos. A infecção em BMDC desencadeou uma forte resposta de IL12, o que é anormal em brucelose de camundongo e pode resultar em uma resposta protetora de Thl. Esta possibilidade foi consistente com a esplenomegalia observada porque o aumento do baço se correlaciona com os níveis de IFN-γ e IL12 em brucelose de camundongo (Zhan Y e col. (1993) Infection and Immunity 61: 4899-4901; Zhan Y e col. (1995) Infection and Immunity 63: 1387-1390) e ambas as citocinas são decisivas na geração de uma resposta imune eficaz para Brucella (Baldwin CL e col. (2002) Vet Microbiol 90: 367-382). Curiosamente, embora os animais inoculados com BABAlpcC eventualmente eliminassem a infecção (Figura 11), a esplenomegalia produzida por BABAlpcC não só era maior do que a gerada pelo mutante BABTn5::per, mas também consistentemente maior do que aquela induzida pela vacina de referência B. abortus S19 (Figura 9). Por estas razões, foi avaliada a proteção contra B. abortus virulenta induzida por vacinação com BABAlpcC. Como é mostrado na Tabela 2, quando os baços foram examinadas duas semanas após o desafio, os animais vacinados com BABAlpcC continham um número significativamente menor de UFC/baço da cepa de desafio em relação ao controle de solução salina (P <0,001). Além disso, o número de UFC/baço da cepa de desafio também foi significativamente mais baixo (P = 0,025) nos camundongos vacinados com BABAlpcC do que naqueles vacinados com S19. As diferenças entre camundongos vacinados com BABAlpcC e com solução salina aumentou seis semanas após o desafio e, neste momento, a imunidade conferida pela vacinação com S19 diminuiu completamente (Tabela 2).

TABELA 2. Proteção contra a infecção por B. abortus em

BALB/c fornecida pela vacinação com BABAlpcC ou B. abortus

S19

	X log10 UFC no baço	± DP de B. abortus
	virulenta na semana pós-desafio
Vacina	2	6
BABAlpcC	1,25 ± 0,71 a, b	0,81 ± 0,25 a, c
S19	3,47 ± 1,06 b	5,27 ± 0,35 d
Solução Salina	5,42 ± 0,51	5,49 ± 0,12

0,001.

b

C d

^a

P	versus	solução	salina <
P	versus	S19 < 0,	05.
P	versus	S19 < 0,	001.
P	versus	solução	salina >

Ao longo deste pedido

0,05 (não significativo).

várias referências descrevem o estado da técnica ao qual este invenção pertence. As revelações destas referências são aqui incorporadas como referência na presente descrição.

Claims (8)

REIVINDICAÇÕES

1. Vacina caracterizada pelo fato de compreender uma bactéria do gênero Brucella compreendendo um gene inativado que codifica uma glicosiltransferase envolvida na síntese do núcleo do LPS da referida bactéria, em que a referida glicosiltransferase é selecionada do grupo compreendendo as glicosiltransferases que possuem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.: 1 ou seu homólogo, e em que o referido gene inativado que codifica uma glicosiltransferase envolvida na síntese do núcleo do LPS da referida bactéria resulta na síntese de um LPS que possui um núcleo modificado.

2/2

2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1,

caracterizada pelo fato de que o dito homólogo uma sequência de aminoácido estabelecida pela SEQ ID NO: 1.

3. Vacina, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,

caracterizada pelo fato de que um gene que codifica uma

proteína envolvida na síntese do O-polissacarídeo do LPS é inativado.

4. Vacina, de acordo com a reivindicação 3,

caracterizada pelo fato de que a referida proteína envolvida na síntese do O-polissacarídeo do LPS é selecionada do grupo compreendendo de proteínas tendo as

sequencias de aminoácido das SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ

ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID

NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:26, SEQ ID

NO:27 and SEQ ID NO:28 ou seus homólogos.

Petição 870190083344, de 26/08/2019, pág. 11/21

5. Vacina, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a referida proteína envolvida na síntese do O-polissacarídeo do LPS é uma perosamina sintetase possuindo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO;13 ou um seu homólogo.

6. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a referida bactéria do gênero Brucella é selecionada a partir do grupo de bactérias das espécies Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella ovis, Brucella pinnipedialis, Brucella ceti, Brucella microti e Brucella canis.

7. Uso de uma bactéria do gênero Brucella caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Uso de uma bactéria do gênero Brucella caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para tratamento de brucelose.