BR112012001151B1

BR112012001151B1 - composição para aplicação tópica

Info

Publication number: BR112012001151B1
Application number: BR112012001151A
Authority: BR
Inventors: John Sabrina
Original assignee: Chemisches Laboratorium Dr Kurt Richter Gmbh
Priority date: 2010-04-12
Filing date: 2010-06-29
Publication date: 2020-02-04
Also published as: CA2769678C; CA2769678A1; US20120189651A1; AU2010350888A1; WO2011127994A1; AU2010350888B2; US9549957B2; BR112012001151A2

Abstract

complexo de substância ativa e formulação compreendendo o complexo de substância ativa a presente invenção refere-se a um complexo de substância ativa de extratos de poria cocos e phragmites kharka, formulações compreendendo dito complexo de substância ativa assim como ao uso das formulações da invenção para o fortalecimento, manutenção e restauração mais rápida da integridade epidérmica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO PARA APLICAÇÃO TÓPICA.

[001] A presente invenção refere-se a um complexo de substância ativa de extratos de Poria cocos e Phragmites kharka (também Phragmites karka), as formulações compreendendo dito complexo de substância ativa assim como ao uso das formulações da invenção para o fortalecimento, manutenção e restauração mais rápida da integridade epidérmica.

[002] Poria cocos é um fungo sólido (Polyporaceae) também conhecido como Fu Ling, Tuckahoe, Indian Bread (pão indiano) ou Hoelen. Ele cresce preferivelmente na raiz do pinheiro onde ele é cultivado entre julho e outubro e apresenta um micélio branco extremamente duro, o que leva ao seu nome. Poria cocos foi usado de diversas formas na Medicina Tradicional Chinesa (TCM) e em outras escolas de medicina do extremo oriente por um longo período. A ele é atribuído efeitos imunológicos, anti-inflamatórios e anticancerígenos. Tradicionalmente, ele também é usado para o tratamento de insônia, como diurético, para o balanço de eletrólitos, para o avigoramento do baço e como tônico para os órgãos internos. Ele também é chamado de medicine or mushroom of immortality.

[003] Phragmites kharka pertence às gramíneas (Poaceae) e geralmente é designada de junco. Ela é uma gramínea alta que cresce em terras úmidas que é nativa em regiões tropicais da terra e foi usada de várias maneiras, por exemplo, para a colmagem e para a purificação de água. Suas propriedades farmacológicas são conhecidas há muito tempo. Desse modo, Phragmites kharka é usada na medicina tradicional para o tratamento de febre, tosse e até câncer. A North American Navajo Indians usou Phragmites para o tratamento de doenças da pele.

Preparação do complexo de substância ativa

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2/23 [004] O complexo de substância ativa da invenção compreende uma combinação dos extratos de Poria cocos e Phragmites kharka em que os extratos compreendem extratos aquosos, glicólicos ou alcoólicos. Neste contexto, a extração com água ou tampões tais como PBS (salina fosfato-tamponada) ou tampão de Sorensen é preferida.

[005] A extração deve ocorrer com um pH de 2 a 9, preferivelmente com um pH de 4,5, e sob uma temperatura entre 40°C e 100°C, preferivelmente sob 80°C. A extração pode ser realizada por 1 a 24 horas, preferivelmente por 2 a 4 horas.

[006] De acordo com a invenção, o extrato de Poria cocos e o extrato de Phragmites kharka podem ser produzidos por extração combinada ou separada.

[007] Preferivelmente, o extrato produzido por extração combinada ou os extratos produzidos por extração separada, em seguida à sua combinação, são submetidos a purificação/separação por centrifugação, decantação, filtração e/ou particularmente preferivelmente por ultrafiltração (preferivelmente com um CUT-off de 100 kDa). Os extratos podem ser preferivelmente submetidos à maturação conjunta que dura entre 2 a 10 dias, mais preferivelmente 4 dias.

[008] Em uma concretização particularmente preferida Poria cocos e Phragmites kharka são submetidos à extração separada sob as condições acima, os extratos resultantes são combinados e em seguida submetidos à separação conforme acima descrito, particularmente por ultrafiltração (cut-off de 100 kDa).

[009] Para o componente Poria cocos, todo o fungo é usado para a extração, inclusive com relação ao componente Phragmites kharka toda a planta, isto é, com rizomas e folhas, é usada como material de partida para a extração. Neste contexto, o material de planta pode ser fresco, seco ou secado a frio.

[0010] A razão entre material de planta e agente de extração é

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3/23 preferivelmente 10% (p/p) e particularmente preferivelmente 2 a 5% (p/p).

Sumário da preparação do complexo de substância ativa [0011] Extração aquosa em água, solução glicólica, tampão (PBS,

Sorensen) pH entre 2 a 9, preferivelmente 4,5 duração de extração: 1 a 24 hs, preferivelmente 2 a 4 hs temperatura: 40 a 100°C, preferivelmente 80°C preferivelmente extração separada dos componentes preferivelmente separação por ultrafiltração (100 kDa) [0012] Em uma outra concretização, a presente invenção provê formulações que compreendem o complexo de substância ativa da invenção.

[0013] Preferivelmente, as formulações da invenção são na forma de formulações para aplicação tópica na pele na forma de um creme (o/a ou a/o), um unguento, uma pasta, loção (emulsão o/a e a/o), emulsão múltipla (a/o/a ou o/a/o), uma solução (oleosa, alcoólica ou aquosa), uma dispersão (hidrodispersão ou lipodispersão), um bastão, espuma ou gel.

[0014] As formulações da invenção podem ser formuladas de forma per se conhecida pelo versado na técnica com os agentes comuns e excipientes, conforme descrito por exemplo em Bauer et al., Pharmazeutische Technologie, 5^th ed., Govi-Verlag Frankfurt, 1997; Rudolf Voigt, Pharmazeutische Technologie, 9^th ed. Deutscher Apotheker Verlag Stuttgart, 2000.

[0015] As formulações da invenção contêm entre 1% (a/a) a 10% (a/a), mais preferivelmente 2% (a/a) a 5% (a/a) e particularmente preferivelmente entre 3% (a/a) do complexo de substância ativa da invenção.

[0016] De acordo com a presente invenção, o complexo de subs

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4/23 tância ativa da invenção também pode ser combinado em combinação com outros extratos de plantas ou substâncias ativas que apresentam um efeito anti-inflamatório ou um efeito protetor ou restaurador da barreira epidérmica.

[0017] A presente invenção também se refere ao uso das formulações da invenção para a manutenção da função de barreira da epiderme assim como na terapia e profilaxia de condições epidérmicas que exigem o fortalecimento e/ou manutenção da barreira epidérmica e cuidado anti-inflamatório e de condições epidérmicas que envolvem disfunção da barreira epidérmica. Desse modo, a presente invenção refere-se particularmente a formulações para uso tópico com condições epidérmicas que exigem o fortalecimento e/ou manutenção da barreira epidérmica e tratamento anti-inflamatório tais como:

• pele atópica (neurodermite [dermatite atópica], eczema atópico, eczema endogenoso), • psoríase • iquitiose, • condições gerais de pele seca (xerodermia), por exemplo causada por o envelhecimento geral da pele, o hormônios assim como alterações patológicas tais como diabete, o influencia exógena tais como higiene diária e a exposição a água, sindets, sabão, produtos químicos, cosméticos, desinfetantes entre outros, o condições climáticas (UV, ar seco, água do mar etc.), assim como o efeitos colaterais de medicamentos.

[0018] A invenção compreende ainda o uso da formulação para o tratamento de processos inflamatórios da pele, particularmente com

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5/23 reações alérgicas, reações fototóxicas, queimadura de sol e queratose actinica, inflamações do couro cabeludo (pityriasis simplex capitis, pityriasis oleosa), dermatite seborreica, rosacea e com processos que induzem a liberação de histamina tais como ferrões de inseto ou picadas e prurido.

[0019] Somente uma barreira epidérmica intacta protege contra perda transepidérmica excessiva de água, contribuindo assim para a resistência da pele em relação a agentes irritantes.

[0020] Dano da barreira epidérmica pode resultar em valores elevados de perda de água transepidérmica (valores TEWL), reações inflamatórias e uma penetração aumentada de substâncias exógenas e/ou organismos que causam o processo inflamatório (liberação de radicais livres ou endotoxinas).

[0021] Além disso, queratinócitos basais expressam citoquinas pro-inflamatórias causam mais dano celular e, acabam prejudicando ainda mais a barreira epidérmica.

[0022] Desse modo, o objeto da presente invenção é prover um produto que fortaleça a epiderme e ao mesmo tempo apresente um efeito anti-inflamatório e que contribua para a resiliência da pele e, assim, evite ou minimize as condições mencionadas resultantes da pele estressada.

[0023] A aplicação das formulações da invenção resulta inter alia em complexão da pele melhorada assim como em um valor TEWL reduzido.

[0024] O valor TEWL refere-se à quantidade de água que é derramada através do estrato córneo da pele por hora e cm². Desse modo, alterações na perda de água transepidérmica fornece informação sobre a eficácia da função de barreira da pele. Além disso, após aplicação das formulações de acordo com a invenção, irritações da pele, eritemas e pruridos são reduzidos.

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6/23 [0025] Além disso, a tolerância aumentada da pele com respeito à radiação UV e outros fatores de estresse exógenos tais como estresse osmótico e reações fotoalérgicas é obtida in vitro.

[0026] Testes In vivo demonstram que o complexo de substância ativa apresenta um efeito vantajoso sobre células epidérmicas que foram expostas à luz UV. Além disso, in vitro, ele reduz bastante a perda de energia e viabilidade das células e regula eficientemente para baixo a produção de citocinas pró-inflamatórias. Neste contexto, o complexo de substância ativa da invenção mostrou redução significativamente acelerada de eritemas inflamatórios causados por radiação UV. Além disso, o complexo de substância ativa in vivo mostrou um efeito significativamente aumentado mesmo em comparação com o controle positivo contendo maleato de dimetindeno anti-histamínico.

[0027] Verificou-se que o complexo de substância ativa da invenção é capaz de compensar os efeitos fototóxicos da hipericina, um fotoalérgeno conhecido, sobre viabilidade celular. Após o tratamento com hipericina e radiação UV, o complexo de substância ativa da invenção reduz a produção de TNF-α e IL-8, dois dos mais importantes mediadores pró-inflamatórios que são conhecidos por causar irritações na pele.

[0028] Existe evidência tanto in vitro como in vivo, que o complexo de substância ativa apresenta um efeito significativo sobre homeostase epidérmica e sobre a função de barreira epidérmica. Em estudos in vivo o complexo de substância ativa da invenção mostra até resultados melhores do que o controle positivo, o potente farmacêutico 5% de pantenol em lanolina.

[0029] Além disso, observou-se que o complexo de substância ativa da invenção apresenta um efeito positive em queratinócitos que foram expostos a estresse osmótico através de intensa regulação para baixo da produção de mediadores pró-inflamatórios.

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7/23 [0030] Conforme ilustrado nas figuras de 1 a 7, o complexo de substância ativa da invenção, que consiste em dois componentes, mostra um efeito super-aditivo com relação ao fortalecimento, manutenção e restauração mais rápida de integridade epidérmica.

[0031] Desse modo, pode-se verificar que o complexo de substância ativa da invenção in vitro apresenta um efeito sobre os seguintes parâmetros das células após radiação UV:

Teste in vitro [0032] Em todos os testes descritos e nas figuras de 1 a 7, R1 = extrato Phragmites kharka, R2 = extrato Poria cocos e R3 = complexo de substância ativa de Phragmites kharka e Poria cocos de acordo com a invenção, células que foram tratadas apenas com meio serviram como controle.

1. Redução de expressão UV-induzida e TN-alfa (ensaio TNFalfa) [0033] Luz UV e outros fatores que podem desencadear uma inflamação cutânea produzem a expressão de TNF-alfa (fator de necrose tumoral), a mais importante citocina pró-inflamatória. TNF-alfa controla tanto processos inflamatórios locais como sistêmicos por indução de ciclooxigenase-2 (COX-2) e prostaglandina E2 (PGE2). Isos induz à expressão de substância P (SP), um neuropeptídeo sensorial que é responsável pela sensação de dor e, além disso, estimula TNF-alfa novamente. Isso ilustra a necessidade de inibir ou minimizar a TNFalfa, que está na base da cascata de citocina, durante um processo inflamatório.

[0034] Além da sensação de dor, as consequências de uma inflamação dérmica, no entanto, são vermelhidão e inchaço, que enfraquece a função de barreira da pele. Com eritema cutâneo UV-induzido, existe também dano ao DNS diretamente induzido por radiação UVB, que,por um lado leva a uma expressão TNF-alfa e, por outro, também

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8/23 aumenta o número de células apoptóticas. Isso, por sua vez, pode levar a um prejuízo drástico do processo de diferenciação das queratinócitos e, assim, a uma formação prejudicada do estrato córneo.

[0035] Devido à sua capacidade em proteger a homeostase epidérmica contra tais influências de maneira eficaz em combinação com sua extraordinária tolerabilidade, o complexo de substância ativa de acordo com a invenção é perfeitamente adequado para fortalecer, manter e restaurar a integridade epidérmica.

TNF-alfa após radiação UV - procedimento:

[0036] Queratinócitos humanos foram incubados sob 37°C e 5% de CO2 em meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM); Biochrom, F0415) que foi suplementado com 5% de FCS (Foetal Calf Serum; Biochrom, S 0115 - inativado pelo calor) e L-glutamina (Biochrom, K 0282).

[0037] Antes de atingir a fase de crescimento estacionário, as células foram tripsinizadas, incluindo pré-tratamento com uma solução EDTA (ácido etilenodiamonotetracético, Biochrom, L2113, 1:20 in

PBS). Após detemrinação do número de células, uma suspensão celular foi preparada e semeada em uma placa de microtitulação de 96 cavidades (MTP; TPP, 92696) com um número de células de 3 x 10⁴ células/cavidade.

[0038] As amostras a serem examinadas, R1 - R3, foram diluídas em meio e adicionadas às células das concentrações correspondentes. As placas forma incubadas por 72 hs sob 37°C e 5% de CO2.

[0039] Decorrido este intervalo, o meio foi removido e as células foram lavadas com PBS (solução salina fosfato-tamponada, sem Mg²⁺e Ca²⁺; Biochrom, L1825).

[0040] Para a radiação UV subsequente, as células foram cobertas com 50 μl PBS/cavidade e receberam radiação com 2 J/cm² UVA + 0.2 J/cm² UVB por meio de uma lâmpada UV que simula o espectro da luz

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9/23 solar natural (Dr. Honle, SOL 500).

[0041] Após incubação repetida das células sob 37°C e 5% de

CO2 por 18 hs, a luminescência TNF-alfa ELISA foi realizada (R&D Systems, QTA00B).

[0042] As placas de microtitulação foram centrifugadas em 250 x g por 10 minutos e os sobrenadantes do meio foram cuidadosamente transferidos para a placa de microtitulação revestida com anti-TNF-alfa + diluente de ensaio, sem absorver os detritos de células precipitados. Os sobrenadantes de células a serem examinados foram incubados por 3 horas sob temperatura ambiente durante agitação. Em seguida, as placas foram incubadas com o 2^o anticorpo (anti-TNF-alfa-POD) por 2 hs sob temperatura ambiente no agitador. Após adição do reagente Glo, foi feita uma incubação de dez minutes da placa, protegida contra de luz, sob temperatura ambiente.

[0043] A luminiscência foi medida em um leitor de microplaca (Labsystems, Fluoscan Ascent FL). Os valores RLU obtidos (unidades de luminescência relativa) correspondem à quantidade do TNF-alfa expressado. As células que não haviam sido tratadas com R1, R2, R3 serviram como controles. Os valores RLU dessas células de controle foram fixados em valor 100%. Conforme ilustrado na figura 1, o complexo de substância ativa de acordo com a invenção (R3) apresentou um efeito redutor significativo no TNF-alfa, que era dose-dependente, embora os componentes individuais tenham causado apenas uma redução irrelevante, e até nem isso.

2. Redução de expressãoIL-8 UV-induzida [0044] Interleucina-8 é uma das citocinas inflamatórias primárias estimulada principalmente por TNF-alfa e interleucina-1, que por sua vez é expressada por fatores exógenos tais como UV, infecções, isquemia, tratamento de ferida após traumas, reações fototóxicas e fotoalérgicas, respectivamente estresse osmótico e outros por uma plu

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10/23 ralidade de tipos de células. Ela desempenha um papel crucial em inflamações imune-relacionadas em que ela ativa neutrófilos e leva-os até a fonte da inflamação onde eles desencadeiam a intensificação do recrutamento quimiotático dos neutrófilos pela secreção IL-8. Portanto, ela é uma citocina-chave para processos inflamatórios, que podem levar a condições inflamatórias crônicas no caso de não haver uma intervenção.

Interleucina-8 após radiação UV - procedimento:

[0045] Queratinócitos humanos foram incubados sob 37°C e 5% de CO2 no meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM); Biochrom, F0415) que foi suplementado com 5% de FCS (Foetal Calf Serum; Biochrom, S 0115 - inativado pelo calor) e L-glutamina (Biochrom, K 0282).

[0046] Antes de atingir a fase de crescimento estacionária, as células foram tripsinizadas, sendo incluído pré-tratamento com uma solução EDTA (ácido etilenodiaminotetracético, Biochrom, L2113, 1:20 in PBS). Após determinação do número de células, uma suspensão cellular foi preparada e semeada em uma placa de microtitulação de 96 cavidades (MTP; TPP, 92696) com um número de células de 3 x 10⁴ células/cavidade.

[0047] As amostras a serem examinadas, R1 - R3, foram diluídas no meio e adicionadas às células nas concentrações correspondentes. As placas foram incubadas por 72 horas sob 37°C e 5% de CO2.

[0048] Decorrido esse prazo, o meio foi removido e as células foram lavadas com PBS (solução salina fosfato-tamponada, sem Mg²⁺ e Ca²⁺; Biochrom, L1825).

[0049] Para a subsequente radiação UV, as células foram revestidas com 50 μl PBS/cavidade e radiadas com 2 J/cm² UVA + 0.2 J/cm²UVB por meio de uma lâmpada UV que simula o espectro da luz solar natural (Dr. Honle, SOL 500).

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11/23 [0050] Após outra incubação das células sob 37°C e 5% de CO2 por 18 hs, a luminescência de interleucina-8 ELISA foi realizada (R&D Systems, Q8000B).

[0051] As placas de microtitulação foram centrifugadas sob 250 x g por 10 minutos e os sobrenadantes do meio foram cuidadosamente transferidos para a placa de microtitulação com anti-IL-8 + diluente de ensaio, sem absorção dos detritos de células precipitados. Os sobrenadantes de células a serem examinados foram incubados por 2 hs sob temperatura ambiente durante agitação. Em seguida, as placas foram incubadas com o 2^o anticorpo (anti-IL-8-POD) por 3 hs sob temperatura ambiente no agitador. Após adição do reagent Glo-reagente, ma incubação de dez minutes da placa, protegida contra luz, foi feita sob temperatura ambiente.

[0052] Luminescencia foi medida em um leitor de microtitulação (Labsystems, Fluoscan Ascent FL). Os valores RLU obtidos (Relative Luminescence Units) correspondem à quantidade da interleucina-8 expressada. Células que não foram pré-tratadas com R1, R2, R3 servem como controles. Os valores RLU dessas células de controle ajustadas como valor 100%.

[0053] O complexo de substância ativa de acordo com a invenção (R3) reduziu a expressão da interleucina-8 de forma dose-dependente e significativa e numa extensão muito maior do que os componentes individuais do complexo de substância ativa (vide também Figura 2).

3. Redução da expressão IL-8 após estresse hiperosmótico [0054] No caso de estresse de célula hiperosmótico, o processo de inflamação também ocorre pela ativação das quinases mitógenoativadas (MAPKs) que inclui ERK (extracellular signal-regulated kinase) e quinase c-Jun N-terminal (JNK). Essas quinases ativadas induzem fatores de transcrição nuclear (NF-kappa B, AP-1) para secretar mediadores pro-inflamatórios.

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12/23 [0055] Danos celulares a nível de DNS que são causados por mecanismos inflamatórios devido a estresse osmótico não estão sujeitos a mecanismos de reparo de DNS como é o caso com danos a DNS UV-induzidos. A possibilidade de reparar esses danos é mais limitada. Desse modo, existe a necessidade de uma substância ativa eficaz que também seja capaz de impeder ou reduzir danos celulares deste tipo. Interleucina-8 após estresse hiperosmótico - procedimento:

[0056] Queratinócitos foram incubados sob 37°C e 5% de CO2 no meio Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; Biochrom, F0415) que foi suplementado com 5% de FCS (fetal calf serum; Biochrom, S0115 - inativado pelo calor) e L-glutamina (Biochrom, K0282).

[0057] Antes de atingir a fase de crescimento estacionária, as células foram tripsinizadas, o que incluiu o pré-tratamento com uma solução EDTA (ácido etilenodiaminotetracético, Biochrom, L2113; 1:20 in PBS). Após determinação do número de células, as células foram suspensas e esta suspensão de células foi semeada em uma placa de microtitulação de 96 cavidades (MTP; TTP, 92696) com um número de células de 3 x 10⁴ células/cavidade.

[0058] As amostras a serem examinadas R1 - R3 foram diluídas no meio e adicionadas às células nas concentrações desejadas. As places foram incubadas por 72 hs sob 37°C e 5% de CO2.

[0059] Decorridos esse periodo, o meio foi removido e as células foram lavadas com PBS (solução salina fosfato-tamponada, sem Mg²⁺e Ca²⁺; Biochrom, L1825).

[0060] Em seguida, as células foram incubadas com diferentes doses de R1 - R3 no meio hiperosmolar durante 30 minutos e por 12 horas. O meio hiperosmolar foi ajustado por meio de cloreto de sódio (Merck, 1064041000) a 400 mOsm utilizando-se um osmômetro (Roebling, Digital Microosmometer Type 5R).

[0061] Decorridos períodos de incubação das células sob 37°C e

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5% de CO2 , foi feita uma luminescência de interleucina-8 ELISA (R&D Systems, Q8000B) .

[0062] As placas de microtitulação foram centrifugadas a 250 x g durante 10 minutos e os sobrenadantes do meio foram cuidadosamente transferidos para a placa de microtitulação revestida com anti-IL-8 + diluente de ensaio, sem absorção dos detritos de células precipitados. Os sobrenadantes celulares foram incubados por 2 horas sob temperatura ambiente durante agitação.

[0063] Em seguida, as placas foram incubadas com o 2^o anticorpo (anti-IL-8-POD) por 3 horas sob temperatura ambiente no agitador. Após adição do reagente Glo, uma incubação de dez minutos da placa, protegida contra luz, foi feita sob temperatura ambiente.

[0064] A luminescência foi medida em um leitor de microplaca (Labsystems, Fluoscan Ascent FL). Os valores obtidos RLU (Relative Luminescence Units) correspondem ao conteúdo de interleucina -8 expressada. Células que não foram tratadas previamente com R1, R2, R3 servem como controle. Os valores RLU dessas células de controle foram fixados em valor 100%.

[0065] Nesses estudos também o complexo de substância ativa da invenção reduziu expressão IL-8significativamente e de maneira dosedependente. Os componentes individuais inibiram a expressão IL-8 em uma extensão muito menor (vide também figura 3).

4. Redução da expressão IL-8 fototóxico-dependente [0066] Reações fotoalérgicas ou fototóxicas podem ser desencadeadas por substâncias fotosensibilizadoras. Um exemplo é a hipericina da Hypericum perforatum (St John's wort). Os componentes danificadores atualmente dessas substâncias são radicais livres que se formam sob a influência da luz. Estes são eilicitores da condição inflamatória que é manifesta pela expressão das citocinas pró-inflamatórias (por exemplo. IL-8).

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Interleucina-8 após reação fototóxica - procedimento:

[0067] Queratinócitos humanos foram incubados sob 37°C e 5% de CO2 no meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Biochrom, F0415) suplementados com 5% de FCS (Fetal Calf Serum; Biochrom, S0115 - inativado pelo calor) e L-glutamina (Biochrome, K0282).

[0068] Antes de atingir sua fase de crescimento estacionária, as células foram tripsinizadas, o que incluiu um pré-tratamento com uma solução EDTA (ácido etilenodiaminaotetracético, Biochrom, L2113; 1:20 in PBS). Após determinação do número de células, as células foram suspensas e esta suspensão de células foi semada em uma placa de microtitulação de 96 cavidades (MTP; TTP, 92696) com um número de células de 3 x 10⁴ células/cavidade.

[0069] As amostras a serem examinadas R1 - R3 foram diluídas em um meio e adicionadas nas concentrações desejadas. As placas foram incubadas por 72 hs sob 37°C e 5% de CO2.

[0070] Decorrido esse período, o meio foi removido e as células foram lavadas com PBS (solução salina fosfato-tamponada, sem Mg²⁺e Ca²⁺; Biochrom, L1825).

[0071] Em seguida, as células foram tratadas com diferentes doses de R1 - R3 no meio com e sem 0,5 pM de hipericina (Sigma, 56690). Em seguida foi feita radiação UV a 0,25 J/cm² UVA + 0.025 J/cm² UVB por meio de uma lâmpada UV que simula o espectro da luz solar natural (Dr. Honle, SOL 500).

[0072] Após uma outra incubação das células sob 37°C e 5% de

CO2 por 18 hs, a luminescência de interleucina-8 ELISA (R&D Systems, Q8000B) foi feita.

[0073] As placas de microtitulação foram centrifugadas a 250 x g durante 10 minutos e os sobrenadantes do meio foram cuidadosamente transferidos para a placa de microtitulação revestida com anti-L-8 +diluente de ensaio, sem absorção dos detritos de células precipita

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15/23 dos. Os sobrenadantes a serem examinados por 2 horas sob temperatura ambiente durante agitação. Em seguida, as placas foram incubadas com o 2^o anticorpo (anti-IL-8-POD) por 3 horas sob temperatura ambiente no agitador. Após a adição do reagente Glo, uma incubação de dez minutos da placa, protegida contra luz, foi feita sob temperatura ambiente.

[0074] A luminescência foi medida em um leitor de microplaca (Labsysems, Fluorscan Ascent FL). Os valores RLU obtidos (Relative Luminescence Units) correspondem ao conteúdo de interleucina-8 expressada. As células que não foram tratadas previamente com R1, R2, R3 servem como controle. Os valores RLU dessas células de controle foram fixados em valor 100%.

[0075] O complexo de substância ativa da invenção (R3) também inibiu a expressão fototóxico-dependente de interleucina-8 em uma forma dose-dependente. Os componentes individuais do complexo de substância ativa causaram apenas uma inibição irrelevante da expressão (vide também figura 4).

5. Redução da formação de E-caderina solúvel [0076] Caderinas são moléculas de adesão célula-celula.

[0077] Caderinas epiteliais (E-caderinas) pertencem ao grupo de caderinas clássicas que são essenciais para a arquitetura da epiderme já que elas ocorrem em desmosomas assim como nas junções de adesão.

[0078] Funções de E-caderina como a âncora de transmembrana que é ligada ao citoesqueleto de actina da célula (complexo Ecaderina/catenina).

[0079] Mecanismos diferentes regulam a resistência de adesão desse complexo. Assim, uma fosforilação de beta-catenina (induzida por MMPs [estromelisina-1, matrilisina]) danifica esse complexo e, portanto, acarreta a perda de integridade epidérmica.

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16/23 [0080] A destruição da ligação intracelular desse complexo libera o fragmento de E-caderina ectodomaina de 80 kDa.

[0081] Esse fragmento de E-caderina causa a separação de células epiteliais in vitro e, além disso, contribui para o desenvolvimento de cânceres da pele epidérmicos (progressão tumoral).

[0082] A formação das camadas epidérmicas é uma propriedade essencial da derme.

[0083] Desse modo, disfunções da estrutura epidérmica são serios danos com relação à barreira e função protetora da pele.

[0084] Conforme demonstrado a seguir, verificou-se surpreendentemente que o complexo de substância ativa da invenção (R3) apresenta um efeito positivo na degradação do complexo Ecaderina/cateinina devido à danificação.

Formação de fragmento de E-caderina - sE-caderina após radiação UV - procedimento:

[0085] Queratinócitos humanos foram incubados sob 37°C e 5% de CO2 no meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Biochrom, F0415) que foi suplementado com 5% de FCS (Fetal Calf Serum); Biochrom, S0115 - inativado pelo calor) e L-glutamina (Biochrom, K0282).

[0086] Antes de atingir a fase de crescimento estacionário, as células foram tripsinizadas o que incluiu um pré-tratamento com uma solução EDTA (ácido etilenodiaminotetracético; Biochrom, L2113, 1:20 in PBS). Após a determinação do número de células, as células foram suspensas e a suspensão de células foi semeada em uma placa de microtitulação de 96 cavidades (MTP; TPP, 92696) com um número de células de 3 x 10⁴ células/cavidade.

[0087] As amostras a serem examinadas R1 - R3 foram diluídas em um meio e adicionadas às células nas concentrações desejadas. As placas foram incubadas por 72 hs sob 37°C e 5% de CO2.

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17/23 [0088] Após o período de incubação, o meio foi removido e as células foram lavadas com PBS (solução salina fosfato-tamponada, sem Mg²⁺ e Ca²⁺; Biochrom, L1825).

[0089] Para subsequente radiação UV, as células foram revestidas com 50 pl de PBS por cavidade e radiadas sob 1 J/cm² + 0,1 J/cm² e 2 J/cm² UVA + 0,2 J/cm² UVB por meio de uma lâmpada UV que simula o espectro da luz solar natural (Dr. Honle, SOL 500).

[0090] Após uma outra incubação das células sob 37°C e 5% de

CO2 por 18 hs, a sE-caderina ELISA (R&D Systems, DCADE0) foi realizada.

[0091] As placas de microtitulação foram centrifugadas a 250 x g por 10 minutos e os sobrenadantes do meio foram cuidadosamente transferidos para a placa de microtitulação revestida com anti-sEcaderina + diluente de ensaio, sem absorção dos detritos de célula precipitados. Os sobrenadantes de células a serem examinados foram incubados sob temperatura ambiente por 2 horas durante agitação. Em seguida, as placas foram incubadas com o 2^o anticorpo(anti-sEcaderina POD) sob temperatura ambiente por 2 horas no agitador. Após a adição do reagente Glo, uma incubação de dez minutos da placa, protegida contra luz, foi feita sob temperatura ambiente.

[0092] A luminescência foi medida em um leitor de microplaca (Labsystems, Fluoscan Ascent FL). Os valores obtidos RLU (Relative Luminescence Units) correspondem ao conteúdo de interleucina-8 expressada. As células que não foram tratadas previamente com R1, R2, R3 servem como controle. Os valores RLU desses controles foram fixados em valor 100%.

[0093] O complexo de substância ativa da invenção (R3) reduz significativamente a expressão de fragmento de E-caderina - sEcaderina de maneira dose-dependente. Os componentes individuais do complexo da substância ativa, porém, apresentam na melhor das

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18/23 hipóteses um efeito inibidor irrelevante (vide também figura 5).

6. Impedância após radiação UV [0094] Para avaliar a integridade epidérmica a nível celular, foi utilizado o método de sensoriamente de impedância elétrica do substrato de célula (ECIS).

[0095] ECIS é um método não invasivo que permite observar comportamento celular em tempo real e fazer predições com relação ao comportamento de crescimento, adesão celular, micro-movimento de células, alterações morfológicas e, finalmente, propriedades de função de barreira.

[0096] Este método é baseado na descoberta de que células representam resistência elétrica (impedância) e cada alteração em volume, forma e magnitude da contatos célula/célula apresenta um efeito mensurável na impedância. Esta resistência é chamada de impedância.

[0097] Células saudáveis foram semeadas em um chip sobre o qual elas formam uma monocamada confluente sobre um eletrodo. Após a formação de desmosomas e zônulas de aderência (juncos aderentes), é possível determinar alterações na impedância, que não são causadas por uma diminuição no número celular mas por alterações morfológicas (contatos célula-célula), por meio de danos, por exemplo. danos por UV). Isso é possível através de um período de observação em tempo real que se inicia antes de iniciar os danos até várias horas após ter sido concluído os danos. Como no caso de dano moderado, não é possível presumir que existam células necróticas nos primeiros minutos até 1 hora (isso também poderia ser melhor identificado a partir da ausência de regeneração e valores estáveis de impedância), as alterações na integridade da camada celular (relva) neste período de observação antecipado. Portanto, esta metodologia é bastante adequada para tirar conclusões com respeito à integridade das camadas

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19/23 metabolicamente ativas da epiderme.

[0098] Conforme os resultados de teste mostram, após um período de observação de aproximadamente 20 hs com uma radiação de 3 J, pode-se verificar também que os valores das células tratadas com os componentes individuais do complexo de substância ativa estão ao nível das células de controle (R2) e bastante acima de (R1), respectivamente, (porém, abaixo do valor inicial). Surpreendentemente, as células que haviam sido tratadas com o complexo de substância ativa com o complexo de substância ativa da invenção mostraram valores ligeiramente acima do valor inicial antes da radiação.

[0099] A elevada perda de impedância das células de controle e das células tratadas com R1 e R2 pode ser explicada pela possível iniciação de apoptose. Dentro de um período de tempo comparável, este dano não pode ser observado nas células tratadas com o complexo de substância ativa. Porém, o aumento de integridade epidérmica é particularmente evidente durante os primeiros 30 minutos após o dano.

[00100] As células de controle assim como as células tratadas com os componentes individuais R1 e R2 estão quase no mesmo nível, embora as células tratadas com o complexo de substância ativa da invenção (R3) foram capazes de manter um nível de impedância mais elevado já durante o processo de danificação.

[00101] Portanto, com R3, o valor inicial de impedância (100%) é novamente atingido 30 minutos após a radiação UV.

[00102] Em contrapartida, o controle R1 e R2 estão ainda aproximadamente 25% abaixo do valor inicial em um ponto comparável no tempo.

[00103] Os resultados acima são evidentes pelo fato de o complexo de substância ativa da invenção (R3) ser capaz de aumentar significativamente a integridade epidérmica na pele (vide figuras 6a e 6b).

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Medição de impedância após radiação UV - procedimento:

[00104] Queratinócitos humanos foram incubados sob 37°C e 5% de CO2 no meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Biochrom, F0415) que foi suplementado com 5% de FCS (Fetal Calf Serum); Biochrom, S0115 - inativado pelo calor) e L-glutamina (Biochrom, K0282).

[00105] Antes de atingir a fase de crescimento estacionário, as células foram tripsinizadas o que incluiu um pré-tratamento com uma solução EDTA (ácido etilenodiaminotetracético; Biochrom, L2113, 1:20 in PBS). Após a determinação do número de células, as células foram suspensas e a suspensão de células foi semeada em um chip eletrodo (IBIDI, 8E 10) com um número de células de 3 x 10⁴ células/cavidade.

[00106] Os testes foram incubados sob 37°C e 5% de CO2 por 72 hs até ter sido formada uma monocamada confluente. Amostras R1 R3 a serem analisadas foram diluídas a uma concentração de 1,5 % em meio sem FCS por 24 hs e adicionadas às células.

[00107] Após este período, o chip foi conectado ao dispositivo de medição ECIS. Após ter atingido uma curva de impedância relativamente constante (5 h), foi feita radiação UV a 3 J/cm2 UVA + 0.3 J/cm2 UVB por meio de uma lâmpada UV que simula o espectro da luz solar natural (Dr. Honle, SOL 500).

[00108] O chip foi conectado ao dispositivo de medição também durante o período de radiação de forma que o registro contínuo de dados foi assegurado. Os dados foram registrados por mais 20 hs.

7. Impedimento de células apoptóticas após radiação UV [00109] Para a determinação de células apoptótiicas, foi utilizado um teste de citotoxicidade da Roche. Este teste LDH (Roche; 11644793) é baseado no princípio de que a enzima LDH (lactato dehidrogenase), que está presente no citosol de células intactas, é descarregada no espaço extracelular (sobrenadante).

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21/23 [00110] A quantidade emitida de LDH devido ao ingress de células em apoptose pode ser determinado por meio deste teste fotométrico e é, assim, uma medida para o presente dano da membrana celular e também para o número de células apoptóticas.

[00111] Queratinócitos humanos foram incubados sob 37°C e 5% de CO2 no meio Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM); Biochrom, F0415) o que foi suplementado com 5% de FCS (Foetal Calf Serum; Biochrom, S 0115 - inativado pelo calor) e L-glutamina (Biochrom, K 0282).

[00112] Antes de atingir a fase de crescimento estacionário, as células foram tripsinizadas, o que incluiu um pré-tratamento com uma solução EDTA (ácido etilenodiaminotetracético, Biochrom, L2113, 1:20 in PBS). Após determinação do número de células, uma suspensão de célula foi preparada e semeada em uma placa de microtitulação de 96 cavidades (MTP; TPP, 92696) com um numero de células de 3 x 10⁴células/cavidade.

[00113] As amostras a serem examinadas, R1 - R3, foram diluídas em meio e adicionadas às células nas concentrações correspondentes. As placas foram incubadas por 72 hs sob 37°C e 5% de CO2.

[00114] Decorrido esse período, o meio foi removido e as células foram lavadas com PBS (solução salina fosfato-tamponada, sem Mg²⁺e Ca²⁺; Biochrom, L1825).

[00115] Para a subsequente radiação UV, as células foram revestidas com 50 ql PBS/cavidade e radiadas com 1 J/cm² UVA + 0,1 J/cm²UVB por meio de uma lâmpada UV que simula o espectro de luz solar natural (Dr. Honle, SOL 500).

[00116] Após a incubação das células sob 37°C e 5% de CO2 por 18 hs, a luminescência de interleucina-8 ELISA foi realizada (R&D Systems, Q8000B).

[00117] As placas de microtitulação foram centrifugadas a 250 x g

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22/23 por 10 minutos e os sobrenadantes do meio foram cuidadosamente transferidos para a nova placa de microtitulação, sem absorção de detritos de células precipitados. Após adição da mistura de reação (diaforase/NAD + iodina lactato de tetrazólio/sódio), incubação da placa por 30 minutos, protegida contra luz, foi feita sob temperatura ambiente. [00118] Absorção foi medida em um leitor de microplaca (Fynex, MRX) a 480 nm, comprimento de onda de referência 630 nm. Os valores OD obtidos correspondem à quantidade liberada de enzima LDH e, assim, ao número de células apoptóticas e/ou danificadas. Células que não haviam sido previamente tratadas com R1, R2, R3 serviram como controle. Os valores OD dessas células de controle foram fixados em valor 100%.

[00119] O resultado desse teste mostra que tanto o tratamento com os componentes individuais como com o complexo de substância ativa de acordo com a invenção resulta em uma redução de células apoptóticas em comparação às células de controle.

[00120] Com a dose aumentada de radiação UV, este resultado é ainda observável, mesmo se o número de células apoptóticas tiver aumentada em sua totalidade.

[00121] Em ambos os testes, porém, o complexo de substância ativa de acordo com a invenção (R3) obteve um efeito claramente melhor do que os componentes individuais (R1 e R2) separadamente, ou a adição meramente calculada dos valores de teste de R1 e R2 (vide também figura 7).

[00122] Portanto, o complexo de substância ativa de acordo com a invenção a partir de ambos os extratos mostra um superefeito com relação à redução da expressão de citocinas pró-inflamatórias (IL-8, TNF-α) em vários modelos de teste (estresse osmótico, radiação UV, reações fotoalérgicas) e fortalecimento da integridade epidérmica, conforme pode ser determinado devido à redução da degradação de E

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23/23 caderina e um regeneração mais rápida da integridade epidérmica. Devido à sua capacidade em proteger a homeostase epidérmica de maneira eficaz em combinação com sua boa tolerância, o complexo de substância ativa de acordo com a invenção é perfeitamente adequado para fortalecer, e restaurar a integridade epidérmica.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição para aplicação tópica, caracterizada pelo fato de que compreende um complexo de substância ativa de extratos de Poria cocos e Phragmistes kharka, em que a composição contém uma quantidade eficaz de cada um e contém entre 1% (p/p) e 10% (p/p) do complexo de substância ativa, e em que a substância ativa está na forma de uma emulsão, um bastão, uma espuma ou um gel.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os extratos compreendem extratos aquosos ou alcoólicos.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o extrato de Poria cocos e o extrato de Phragmites kharka são produzidos por extração combinada ou separada.
4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o extrato produzido por extração combinada ou os extratos produzidos por extração separada, subsequentes à sua combinação, são submetidos à purificação/separação por centrifugação, decantação, filtração e/ou particularmente preferivelmente por ultrafiltração.
5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a composição contém entre 2% (p/p) a 5% (p/p) do complexo de substância ativa.
6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a composição contém 3% do complexo de substância ativa.