BR102022012809A2 - METHOD FOR IMMOBILIZING BACTERIA PROMOTING PLANT GROWTH ON ORGANIC SURFACES - Google Patents
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- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
Abstract
método de imobilização de bactérias promotoras do crescimento de plantas em superfícies orgânicas. a presente invenção refere-se ao processo de imobilização de bactérias vivas em superfícies orgânicas, desde sementes e propágulos vegetais até materiais produzidos a partir de biomassa animal ou vegetal. o processo descrito proporciona a manutenção da viabilidade das células imobilizadas em uma superfície orgânica por períodos prolongados, e a liberação lenta e gradual das células imobilizadas a partir da hidratação da superfície orgânica tratada. a invenção está baseada na mistura de polímeros orgânicos (amido e gelatina) e compostos nutrientes com uma suspensão de células bacterianas vivas, como por exemplo, células de bactérias promotoras do crescimento de plantas. o processo descrito resulta em um material filmogênico passível de aplicação sobre diferentes superfícies orgânicas. o material filmogênico adicionado de células bacterianas vivas (bacterizado) pode ser acrescentado de outros compostos bioativos e nutrientes, sem prejuízo à viabilidade das células bacterianas adicionadas. materiais biodegradáveis utilizados em práticas agrícolas, sementes e outros propágulos vegetais podem ser submetidos ao processo de imobilização de bactérias descrito, em substituição aos produtos equivalentes convencionais que requerem aplicação no momento de plantio/uso dos insumos. o processo descrito diminui a manipulação destes insumos e os requerimentos de mão-de-obra, e aumenta a eficácia da ação promotora de crescimento exercida pela bactéria adicionada.method of immobilizing bacteria that promote plant growth on organic surfaces. The present invention relates to the process of immobilizing live bacteria on organic surfaces, from seeds and plant propagules to materials produced from animal or plant biomass. The process described provides the maintenance of the viability of cells immobilized on an organic surface for prolonged periods, and the slow and gradual release of immobilized cells from the hydration of the treated organic surface. The invention is based on the mixture of organic polymers (starch and gelatin) and nutrient compounds with a suspension of live bacterial cells, such as plant growth-promoting bacteria cells. The described process results in a film-forming material that can be applied to different organic surfaces. the film-forming material added from live bacterial cells (bacterized) can be added with other bioactive compounds and nutrients, without compromising the viability of the added bacterial cells. biodegradable materials used in agricultural practices, seeds and other plant propagules can be subjected to the bacteria immobilization process described, replacing conventional equivalent products that require application at the time of planting/use of inputs. The described process reduces the handling of these inputs and labor requirements, and increases the effectiveness of the growth-promoting action exerted by the added bacteria.
Description
[01] Bactérias promotoras do crescimento de plantas constituem um grupo microbiano diversificado, com capacidade natural de desenvolver interações e associações de longo prazo com diferentes espécies de plantas, e que apresentam como característica principal a capacidade de estimular o crescimento, a nutrição, a produtividade e a tolerância contra estresses bióticos e abióticos (Zuluaga et al. 2021). Várias espécies de BPCP são exploradas comercialmente como bioinsumos voltados a diferentes espécies agrícolas, desde espécies arbóreas até grãos e cereais. De maneira geral, os insumos biológicos contendo BPCP são aplicados sobre as sementes, no momento do plantio, ou adicionados ao solo onde estas sementes serão dispostas (http://www.anpii.org.br/artigos/). Este processo é crítico para que a máxima eficácia da interação entre BPCP e a planta inoculada seja alcançada, uma vez que as BPCP são organismos vivos mantidos nas embalagens dos produtos comerciais estão em condições ambientais controladas, mas quando ocorre sua aplicação sobre sementes ou sobre o solo há exposição das BPCP às condições ambientais existentes no ambiente de uso. Sementes tratadas com agroquímicos, solos muito ácidos ou secos, exposição à temperaturas elevadas, entre outros fatores podem diminuir a viabilidade das células inoculantes e consequentemente, diminuir de sua capacidade de colonizar a planta inoculada, o que reduz ou elimina os efeitos benéficos pretendidos (Embrapa, 2017).[01] Bacteria that promote plant growth constitute a diverse microbial group, with a natural capacity to develop long-term interactions and associations with different species of plants, and which have as their main characteristic the ability to stimulate growth, nutrition, productivity and tolerance against biotic and abiotic stresses (Zuluaga et al. 2021). Several BPCP species are commercially exploited as bioinputs for different agricultural species, from tree species to grains and cereals. In general, biological inputs containing BPCP are applied to the seeds, at the time of planting, or added to the soil where these seeds will be placed (http://www.anpii.org.br/artigos/). This process is critical so that the maximum effectiveness of the interaction between BPCP and the inoculated plant is achieved, since BPCP are living organisms kept in the packaging of commercial products and are under controlled environmental conditions, but when applied to seeds or the BPCP is exposed to the environmental conditions existing in the environment of use. Seeds treated with agrochemicals, very acidic or dry soils, exposure to high temperatures, among other factors, can reduce the viability of the inoculant cells and consequently, reduce their ability to colonize the inoculated plant, which reduces or eliminates the intended beneficial effects (Embrapa , 2017).
[02] A imobilização de células em matrizes poliméricas vem sendo utilizada como uma estratégia para garantir a manutenção da viabilidade dos microrganismos no ambiente, uma vez que oferecem proteção física, química e biológica e podem ainda proporcionar uma liberação lenta e gradual das células microbianas imobilizadas e fornece suporte nutricional aos microrganismos. Em comparação com formulações contendo BPCP não imobilizadas, as formulações contendo células imobilizadas em matrizes poliméricas apresentam maior vida útil de prateleira e maior eficácia de utilização devido à manutenção de elevadas populações microbianas por períodos prolongados e pela proteção contra condições ambientais desfavoráveis (Bayat; Hassanshahian; Cappello, 2015). Entretanto, não existe um método universal aplicado à imobilização de BPCP; é preciso considerar características relacionadas aos microrganismos utilizados e ao processo pretendido, bem como as características de transporte, armazenamento e aplicação para escolha de uma matriz polimérica adequada (Pilkington et al., 1998; Zur et al. 2016). Em adição, a aplicação pretendida possui influência no método de imobilização de células microbianas pois define a viabilidade econômica do processo (Wang et al., 2005). Os métodos tradicionais de imobilização de células compreendem técnicas baseadas em características naturais dos microrganismos imobilizados, que incluem formação de biofilmes e adesão ou adsorção em suporte sólido; técnicas artificiais de imobilização de células, que incluem encapsulação ou engaiolamento do microrganismo em uma matriz porosa com auxílio de agentes ligantes; e técnicas de agregação de células, como a floculação, que pode ser natural ou artificial (Covizzi et al., 2007).[02] The immobilization of cells in polymeric matrices has been used as a strategy to ensure the maintenance of the viability of microorganisms in the environment, as they offer physical, chemical and biological protection and can also provide a slow and gradual release of immobilized microbial cells and provides nutritional support to microorganisms. Compared to formulations containing non-immobilized BPCP, formulations containing cells immobilized in polymeric matrices have a longer shelf life and greater effectiveness of use due to the maintenance of high microbial populations for prolonged periods and protection against unfavorable environmental conditions (Bayat; Hassanshahian; Cappello, 2015). However, there is no universal method applied to BPCP immobilization; it is necessary to consider characteristics related to the microorganisms used and the intended process, as well as the transport, storage and application characteristics to choose a suitable polymeric matrix (Pilkington et al., 1998; Zur et al. 2016). In addition, the intended application influences the method of immobilizing microbial cells as it defines the economic viability of the process (Wang et al., 2005). Traditional cell immobilization methods comprise techniques based on natural characteristics of immobilized microorganisms, which include biofilm formation and adhesion or adsorption on solid support; artificial cell immobilization techniques, which include encapsulation or caging of the microorganism in a porous matrix with the aid of binding agents; and cell aggregation techniques, such as flocculation, which can be natural or artificial (Covizzi et al., 2007).
[03] Técnicas de imobilização de células microbianas em suportes sólidos aparecem como uma opção importante para aplicações agrícolas que objetivam interações positivas entre plantas e microrganismos. Estas técnicas podem ser utilizadas para imobilização de células sobre sementes e outros materiais de propagação (estacas e mudas, por exemplo), recipientes de cultivo (vasos e outros recipientes), plantas jovens etc. Os materiais utilizados para a imobilização das células microbianas precisam ser atóxicos e biodegradáveis, apresentar eficiência e versatilidade para uso com diferentes tipos celulares, condições de solo e clima, e manter suas características durante o ciclo de vida do inoculante. Para aplicações agrícolas e ambientais, as técnicas de imobilização precisam fornecer abrigo temporário para as estirpes de BPCP selecionadas, garantir a manutenção da viabilidade das células imobilizadas durante o ciclo de vida dos bioprodutos e proporcionar sua liberação no ambiente em que se espera sua atividade promotora de crescimento de plantas (Bashan et al., 2014).[03] Techniques for immobilizing microbial cells on solid supports appear as an important option for agricultural applications that aim for positive interactions between plants and microorganisms. These techniques can be used to immobilize cells on seeds and other propagation materials (cuttings and seedlings, for example), cultivation containers (pots and other containers), young plants, etc. The materials used to immobilize microbial cells must be non-toxic and biodegradable, be efficient and versatile for use with different cell types, soil and climate conditions, and maintain their characteristics throughout the life cycle of the inoculant. For agricultural and environmental applications, immobilization techniques need to provide temporary shelter for selected BPCP strains, ensure the maintenance of the viability of immobilized cells during the life cycle of the bioproducts, and provide for their release into the environment in which their disease-promoting activity is expected. plant growth (Bashan et al., 2014).
[04] A imobilização celular é uma abordagem biotecnológica ativamente utilizada na preparação e formulação de inoculantes com potencial parcialmente inexplorado. Após um período de 15 anos de pesquisa intensiva sobre vários modelos de células imobilizadas de BPCV, ainda há falta de processos inovadores para a formulação de produtos de fertilização do solo (Bashan et al., 2014; Vassilev et al., 2020). Neste contexto, métodos de imobilização que utilizem matrizes poliméricas de origem natural como o amido e a gelatina, em conjunto com polímeros de origem microbiana naturalmente produzidos durante o período de produção de biomassa celular (induzidos a uma elevada expressão por meio de formulações do meio de crescimento), permitem alcançar características desejáveis para imobilização de células em suportes sólidas. Estas características incluem o baixo custo das formulações, a facilidade de escalonamento dos processos de produção, atoxidade dos componentes utilizados, proteção dos microrganismos imobilizados contra condições ambientais adversas, manutenção da viabilidade celular por longos períodos. A imobilização de BPCP em suportes biodegradáveis capazes de modificar o perfil funcional e nutritivo do solo, durante o processo de mineralização (decomposição) destes materiais, pode levar ao menor requerimento de fertilizantes químicos industriais pelos cultivos agrícolas comerciais, e consequentemente, promover impactos positivos na sustentabilidade de ecossistemas e na segurança alimentar e econômica da população brasileira.[04] Cell immobilization is a biotechnological approach actively used in the preparation and formulation of inoculants with partially unexplored potential. After a period of 15 years of intensive research on various BPCV immobilized cell models, there is still a lack of innovative processes for formulating soil fertilization products (Bashan et al., 2014; Vassilev et al., 2020). In this context, immobilization methods that use polymeric matrices of natural origin such as starch and gelatin, together with polymers of microbial origin naturally produced during the period of cellular biomass production (induced to a high expression through formulations of the growth), allow achieving desirable characteristics for cell immobilization on solid supports. These characteristics include the low cost of the formulations, the ease of scaling up production processes, non-toxicity of the components used, protection of immobilized microorganisms against adverse environmental conditions, maintenance of cell viability for long periods. The immobilization of BPCP on biodegradable supports capable of modifying the functional and nutritional profile of the soil, during the mineralization (decomposition) process of these materials, can lead to a lower requirement for industrial chemical fertilizers by commercial agricultural crops, and consequently, promote positive impacts on the sustainability of ecosystems and the food and economic security of the Brazilian population.
[05] WO2012055000A1 (27/10/2010); compreende imobilização de BPCV em fibra de coco com adição de nutrientes e fatores de crescimento microbiano, adjuvantes como carboximetilcelulose, goma arábica, alginato de sódio e de agentes osmóticos, reguladores e solução tampão. A patente utiliza o método de imobilização por adsorção, seguida de aplicação de materiais poliméricos sobre os biofilmes microbianos para reforço da imobilização. Esta patente difere do presente pedido de proteção intelectual, que não utiliza os adjuvantes nem os agentes. A composição da formulação é substancialmente diferente do pedido de proteção intelectual apresentado. O método de preparo descrito é substancialmente diferente do método descrito neste pedido de patente.[05] WO2012055000A1 (27/10/2010); comprises immobilization of BPCV on coconut fiber with the addition of nutrients and microbial growth factors, adjuvants such as carboxymethylcellulose, gum arabic, sodium alginate and osmotic agents, regulators and buffer solution. The patent uses the adsorption immobilization method, followed by the application of polymeric materials on microbial biofilms to reinforce immobilization. This patent differs from the present application for intellectual protection, which does not use adjuvants or agents. The composition of the formulation is substantially different from the intellectual protection application presented. The described preparation method is substantially different from the method described in this patent application.
[06] PI 1004766-2 (05/11/2010); utiliza o amido como substrato de transformação por células microbianas imobilizadas em suportes sólidos, com a imobilização de células microbianas realizada pela técnica de adsorção.[06] PI 1004766-2 (05/11/2010); uses starch as a substrate for transformation by microbial cells immobilized on solid supports, with the immobilization of microbial cells carried out using the adsorption technique.
[07] BR 13 2012 029862 6 (23/11/2012); refere-se à imobilização de BPCV por adsorção, em espumas de biocompósito (amido, bagaço de cana-de açúcar e nutrientes) produzido por extrusão. A invenção descreve o suporte sólido que terá células microbianas imobilizadas pelo processo de adsorção. A composição da formulação é substancialmente diferente do pedido de proteção intelectual apresentado. O método de preparo descrito é substancialmente diferente do método descrito neste pedido de patente.[07] BR 13 2012 029862 6 (23/11/2012); refers to the immobilization of BPCV by adsorption, in biocomposite foams (starch, sugar cane bagasse and nutrients) produced by extrusion. The invention describes the solid support that will have microbial cells immobilized by the adsorption process. The composition of the formulation is substantially different from the intellectual protection application presented. The described preparation method is substantially different from the method described in this patent application.
[08] BR 10 2017 006046 2 A2 (23/03/2017); descreve uma matriz polimérica constituída por amido, gelatina e álcool polivinílico, glicerol e minerais de argila (montmorilonita). A matriz polimérica é definida para aplicação sobre sementes de importância agrícola. A composição da formulação é substancialmente diferente do pedido de proteção intelectual apresentado - o pedido de patente BR 10 2017 006046 2 A2 contém em sua composição álcool polivinílico (0,01 a 33%) e montmorilonita (nanoargila sódica não modificada a 0,2g/100g de polímero), que estão ausentes no pedido de proteção intelectual encaminhado por este formulário. O método de preparo descrito é substancialmente diferente do método descrito neste pedido de patente (os polímeros componentes da formulação ref. à patente BR 10 2017 006046 2 A2 são preparados separadamente e misturados para formar a matriz polimérica final).[08] BR 10 2017 006046 2 A2 (03/23/2017); describes a polymeric matrix consisting of starch, gelatin and polyvinyl alcohol, glycerol and clay minerals (montmorillonite). The polymeric matrix is defined for application on agriculturally important seeds. The composition of the formulation is substantially different from the intellectual protection application presented - the patent application BR 10 2017 006046 2 A2 contains in its composition polyvinyl alcohol (0.01 to 33%) and montmorillonite (unmodified sodium nanoclay at 0.2g/ 100g of polymer), which are absent in the intellectual protection request sent using this form. The described preparation method is substantially different from the method described in this patent application (the component polymers of the formulation referred to in patent BR 10 2017 006046 2 A2 are prepared separately and mixed to form the final polymeric matrix).
[09] BR 10 2019 013058 0 (24/06/2019); descreve um processo de imobilização de células microbianas em uma matriz polimérica formada por amido e alginato de potássio. A invenção não prevê aplicação para imobilização de células sobre suportes sólidos. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação.[09] BR 10 2019 013058 0 (06/24/2019); describes a process of immobilizing microbial cells in a polymeric matrix formed by starch and potassium alginate. The invention does not foresee application for immobilizing cells on solid supports. The invention does not use gelatin in its formulation.
[010] BR 10 2020 012831 (A2) (04/01/2022); descreve um processo de imobilização de enzima (lipase) em base polimérica contendo os biopolímeros quitosana e amido. A invenção não prevê aplicação para imobilização de células sobre suportes sólidos. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação.[010] BR 10 2020 012831 (A2) (04/01/2022); describes an enzyme (lipase) immobilization process on a polymeric base containing the biopolymers chitosan and starch. The invention does not foresee application for immobilizing cells on solid supports. The invention does not use gelatin in its formulation.
[011] JPS63294783A (01/12/1988); descreve um processo de imobilização de células em duas etapas, com uma primeira etapa de mistura de uma cultura de células bacterianas e um agente gelificante, e uma segunda etapa onde um material solúvel também gelificante é adicionado. A invenção não prevê aplicação para imobilização de células sobre suportes sólidos. A composição da formulação é substancialmente diferente do pedido de proteção intelectual apresentado.[011] JPS63294783A (01/12/1988); describes a two-step cell immobilization process, with a first step of mixing a bacterial cell culture and a gelling agent, and a second step where a soluble material that is also gelling is added. The invention does not foresee application for immobilizing cells on solid supports. The composition of the formulation is substantially different from the intellectual protection application presented.
[012] JPH035401A (11/01/1991); descreve um método de imobilização de células microbianas em suporte sólido, utilizando gelatina e ágar como agentes imobilizantes. A invenção não utiliza amido na composição de sua formulação. O método de imobilização descrito é substancialmente diferente do método descrito neste pedido de patente. A formulação de imobilização de células microbianas descrita é substancialmente diferente da formulação descrita no pedido de patente.[012] JPH035401A (01/11/1991); describes a method of immobilizing microbial cells on a solid support, using gelatin and agar as immobilizing agents. The invention does not use starch in its formulation. The described immobilization method is substantially different from the method described in this patent application. The described microbial cell immobilization formulation is substantially different from the formulation described in the patent application.
[013] US5595893A (19/06/1992); descreve um suporte sólido formado por uma mistura de materiais poliméricos sintéticos e materiais naturais, para uso como suporte na imobilização de células microbianas. A invenção descreve o suporte sólido que terá células microbianas imobilizadas pelo processo de adsorção. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação. A invenção utiliza o amido como componente acessório da formulação. O método de preparo descrito é substancialmente diferente do método descrito neste pedido de patente.[013] US5595893A (06/19/1992); describes a solid support formed by a mixture of synthetic polymeric materials and natural materials, for use as a support in the immobilization of microbial cells. The invention describes the solid support that will have microbial cells immobilized by the adsorption process. The invention does not use gelatin in its formulation. The invention uses starch as an accessory component of the formulation. The described preparation method is substantially different from the method described in this patent application.
[014] RO123027B1 (30/07/2010); descreve um processo de imobilização de células microbianas em compósitos orgânicos (matriz biopolimérica) como suporte sólido, por adição de suspensão de células microbianas em uma matriz gelificante (amido, p. ex.). A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação.[014] RO123027B1 (07/30/2010); describes a process for immobilizing microbial cells in organic composites (biopolymeric matrix) as a solid support, by adding a suspension of microbial cells in a gelling matrix (starch, for example). The invention does not use gelatin in its formulation.
[015] US 2012/0270735 A1 (22/04/2011); trata da imobilização de BPCV utilizando quitina coloidal adicionada à suspensão de células bacterianas, talco (filossicato de magnésio), matéria orgânica mineralizada (vermicomposto, produzido por anelídeos) e esterco bovino. Esta patente difere do presente pedido de proteção intelectual, que não utiliza a quitina nem os materiais utilizados como suporte. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação. A invenção não utiliza amido na composição de sua formulação. A composição da formulação é substancialmente diferente do pedido de proteção intelectual apresentado. O método de preparo descrito é substancialmente diferente do método descrito neste pedido de patente.[015] US 2012/0270735 A1 (04/22/2011); deals with the immobilization of BPCV using colloidal chitin added to the suspension of bacterial cells, talc (magnesium phyllossicate), mineralized organic matter (vermicompost, produced by annelids) and cattle manure. This patent differs from the present application for intellectual protection, which does not use chitin or the materials used as support. The invention does not use gelatin in its formulation. The invention does not use starch in its formulation. The composition of the formulation is substantially different from the intellectual protection application presented. The described preparation method is substantially different from the method described in this patent application.
[016] CN106636060A (10/05/2017); descreve um processo de imobilização de células microbianas em uma matriz polimérica formada por álcool polivinílico, alginato de sódio, carvão ativado, casca de crustáceos em pó, kieselguhr e amido. A invenção não prevê aplicação para imobilização de células sobre suportes sólidos. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação.[016] CN106636060A (05/10/2017); describes a process of immobilizing microbial cells in a polymeric matrix formed by polyvinyl alcohol, sodium alginate, activated carbon, powdered crustacean shells, kieselguhr and starch. The invention does not foresee application for immobilizing cells on solid supports. The invention does not use gelatin in its formulation.
[017] WO2017114999A1 (06/07/2017); descreve um processo de imobilização de células microbianas em resíduos orgânicos (aparas de madeira) como suporte sólido, por adsorção seguida de cobertura por uma camada de amido gelificado. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação. A invenção é específica para aplicações na indústria de produção de vinhos.[017] WO2017114999A1 (06/07/2017); describes a process of immobilizing microbial cells on organic waste (wood chips) as a solid support, by adsorption followed by coverage by a layer of gelled starch. The invention does not use gelatin in its formulation. The invention is specific for applications in the wine production industry.
[018] CN107821893A (23/03/2018); descreve um processo de imobilização de células microbianas em uma matriz polimérica formada por alginato de sódio. A invenção não prevê aplicação para imobilização de células sobre suportes sólidos. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação.[018] CN107821893A (03/23/2018); describes a process for immobilizing microbial cells in a polymeric matrix formed by sodium alginate. The invention does not foresee application for immobilizing cells on solid supports. The invention does not use gelatin in its formulation.
[019] CN109439646A (08/03/2019); descreve um material orgânico para imobilização de microrganismos, cuja composição contém amido. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação. A invenção utiliza o amido como componente acessório da formulação. O método de preparo descrito é substancialmente diferente do método descrito neste pedido de patente.[019] CN109439646A (03/08/2019); describes an organic material for immobilizing microorganisms, whose composition contains starch. The invention does not use gelatin in its formulation. The invention uses starch as an accessory component of the formulation. The described preparation method is substantially different from the method described in this patent application.
[020] JP2019103459A (27/06/2019); descreve um processo de imobilização de células microbianas em matriz orgânica (grafite) como suporte sólido, por adição de suspensão de células microbianas em uma matriz gelificante (amido) e uma resina (álcool polivinílico). A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação.[020] JP2019103459A (06/27/2019); describes a process for immobilizing microbial cells in an organic matrix (graphite) as a solid support, by adding a suspension of microbial cells in a gelling matrix (starch) and a resin (polyvinyl alcohol). The invention does not use gelatin in its formulation.
[021] A presente invenção descreve uma metodologia de imobilização de células vivas em suportes orgânicos sólidos, como sementes, péletes, suportes para o crescimento de plantas (vasos e tubetes), raízes de plantas, frutos e outros alimentos, e qualquer outra superfície orgânica de interesse. O processo descrito utiliza materiais poliméricos naturais e biodegradáveis, adicionados de substâncias nutrientes aos microrganismos imobilizados. Ocorre em duas etapas, onde uma solução adesiva contendo as células microbianas vivas garante a imobilização destas células sobre uma superfície orgânica, e uma segunda etapa onde um revestimento sacrificante de umidade com base em um filme de amido-gelatina que recobre a solução adesiva para garantir a viabilidade e sobrevivência das células microbianas imobilizadas na matriz orgânica, por longos períodos. Este revestimento sacrificante de umidade possui a função exclusiva de manter hidratadas a solução adesiva e as células imobilizadas por esta solução, de modo a garantir a funcionalidade deste biosistema por períodos prolongados de armazenamento em prateleira. Dentre as características positivas da tecnologia descrita, compreendem o uso de soluções poliméricas naturais, biodegradáveis e solúveis que possibilitam seu uso sobre qualquer superfície orgânica; a rapidez do processo de imobilização, a liberação continuada das células imobilizadas quando expostas à elevada umidade, a função protetora e nutricional da matriz polimérica adesiva que proporciona uma rápida ativação e multiplicação das células imobilizadas quando são mobilizadas para o ambiente.[021] The present invention describes a methodology for immobilizing living cells on solid organic supports, such as seeds, pellets, plant growth supports (vases and tubes), plant roots, fruits and other foods, and any other organic surface of interest. The described process uses natural and biodegradable polymeric materials, added with nutrient substances to immobilized microorganisms. It occurs in two stages, where an adhesive solution containing live microbial cells ensures the immobilization of these cells on an organic surface, and a second stage where a moisture-sacrificing coating based on a starch-gelatin film covers the adhesive solution to ensure the viability and survival of microbial cells immobilized in the organic matrix for long periods. This moisture-sacrificing coating has the exclusive function of keeping the adhesive solution and the cells immobilized by this solution hydrated, in order to guarantee the functionality of this biosystem for prolonged periods of storage on the shelf. Among the positive characteristics of the technology described, they include the use of natural, biodegradable and soluble polymeric solutions that enable their use on any organic surface; the speed of the immobilization process, the continued release of immobilized cells when exposed to high humidity, the protective and nutritional function of the adhesive polymeric matrix that provides rapid activation and multiplication of immobilized cells when they are mobilized into the environment.
[022] O micro-organismo utilizado para o processo de imobilização descrito a seguir constitui uma bactéria promotora do crescimento de plantas - BPCP, já de uso comercial consagrado no Brasil e registrada no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento para uso em diversas culturas agrícolas. Este microrganismo é identificado como pertencente à espécie Azospirillum brasilense, estirpe Ab-V5, e constitui uma bactéria Gram-negativa utilizada como modelo para a validação do processo de imobilização em superfície orgânica descrito neste pedido de proteção intelectual. O processo desenvolvido e descrito a seguir não se limita à imobilização da espécie bacteriana descrita, e pode ser aplicado para a imobilização de qualquer espécie bacteriana em qualquer superfície orgânica sólida.[022] The microorganism used for the immobilization process described below is a plant growth-promoting bacterium - BPCP, already in established commercial use in Brazil and registered with the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply for use in various agricultural crops . This microorganism is identified as belonging to the species Azospirillum brasilense, strain Ab-V5, and constitutes a Gram-negative bacterium used as a model for validating the immobilization process on an organic surface described in this application for intellectual protection. The process developed and described below is not limited to the immobilization of the described bacterial species, and can be applied to the immobilization of any bacterial species on any solid organic surface.
[023] A biomassa celular de Azospirillum brasilense Ab-V5 utilizada no processo de imobilização foi obtida após seu cultivo em meio de cultura MCA4 por 72 h a 28°C e agitação orbital de 180 rpm. A cultura celular obtida foi utilizada para o preparo de uma suspensão adesiva na densidade de 1 x 10A9 células por mL. A composição da suspensão adesiva é produzida a partir da mistura dos seguintes componentes e respectivas quantidades:[023] The cellular biomass of Azospirillum brasilense Ab-V5 used in the immobilization process was obtained after cultivation in MCA4 culture medium for 72 h at 28°C and orbital shaking at 180 rpm. The cell culture obtained was used to prepare an adhesive suspension at a density of 1 x 10A9 cells per mL. The composition of the adhesive suspension is produced from a mixture of the following components and their respective quantities:
[024] Solubilização de goma xantana (0,05 a 1%, p/v) em mistura de glicerol (10 a 30%, v/v) em água destilada a 70 °C sob agitação, por 10 a 60 min. Após a obtenção de uma solução homogênea, a solução é resfriada a 60 °C e ainda sob agitação, é adicionada dos seguintes nutrientes: K2HPO4 (0,5 a 2%, p/v), KH2PO4 (0,2 a 2%, p/v), sacarose/açúcar cristal (0,2 a 2%, p/v), maltose (0,2 a 2%, p/v), extrato de levedura (0,05 a 1%, p/v), NH4NO3 (0,05 a 1%, p/v), MgSO4 (0,05 a 1%, p/v), polivinil-pirrolidona (0,01 a 1%, p/v), NaCl (0,001 a 0,1%, p/v), EDTA férrico (0,5 a 5 mM, concentração final) e solução de micronutrientes* (0,5 a 5%, v/v). Após a incorporação dos nutrientes à suspensão adesiva e com a solução mantida sob agitação a 60 °C, é feita a adição de amido (obtido de qualquer fonte; 2 a 20%, p/v) gradualmente e o ajuste do pH da solução adesiva para o valor de pH = 6,8. A solução adesiva deve ser esterilizada por calor úmido (autoclave a 121° C e pressão de 1 atm por 15 min) e resfriada a temperatura ambiente. A solução adesiva preparada como indicado acima é adicionada de células vivas de microrganismos (1 x 10A3 a 1 x 10A10 células mL-1 solução adesiva).[024] Solubilization of xanthan gum (0.05 to 1%, w/v) in a mixture of glycerol (10 to 30%, v/v) in distilled water at 70 °C under stirring, for 10 to 60 min. After obtaining a homogeneous solution, the solution is cooled to 60 °C and while still stirring, the following nutrients are added: K2HPO4 (0.5 to 2%, w/v), KH2PO4 (0.2 to 2%, w/v), sucrose/crystal sugar (0.2 to 2%, w/v), maltose (0.2 to 2%, w/v), yeast extract (0.05 to 1%, w/v ), NH4NO3 (0.05 to 1%, w/v), MgSO4 (0.05 to 1%, w/v), polyvinyl-pyrrolidone (0.01 to 1%, w/v), NaCl (0.001 to 0.1%, w/v), ferric EDTA (0.5 to 5 mM, final concentration) and micronutrient solution* (0.5 to 5%, v/v). After incorporating the nutrients into the adhesive suspension and with the solution kept under stirring at 60 °C, starch (obtained from any source; 2 to 20%, w/v) is gradually added and the pH of the adhesive solution is adjusted. for pH value = 6.8. The adhesive solution must be sterilized by moist heat (autoclave at 121° C and 1 atm pressure for 15 min) and cooled to room temperature. The adhesive solution prepared as indicated above is added with live cells of microorganisms (1 x 10A3 to 1 x 10A10 cells mL-1 adhesive solution).
[025] A imobilização de células microbianas vivas sobre superfície orgânica utilizando a solução adesiva descrita deve ser realizada como descrito a seguir. Sob condições assépticas (p. ex., em cabine de segurança biológica classe 1) e temperatura ambiente, faz-se a imersão do material na solução adesiva pelo período de 20 a 60 min, seguida de sua emersão e secagem por 30 a 90 min em temperatura ambiente. O material seco e contendo células microbianas imobilizadas vivas segue para uma etapa adicional de revestimento com um material sacrificante de umidade (revestimento secundário) para proteção das células imobilizadas contra a dessecação.[025] The immobilization of live microbial cells on an organic surface using the described adhesive solution must be carried out as described below. Under aseptic conditions (e.g., in a class 1 biological safety cabinet) and at room temperature, the material is immersed in the adhesive solution for a period of 20 to 60 min, followed by its emergence and drying for 30 to 90 min. at room temperature. The dried material containing live immobilized microbial cells goes to an additional step of coating with a moisture sacrificing material (secondary coating) to protect the immobilized cells against desiccation.
[026] O revestimento secundário é obtido pela imersão do material sólido orgânico contendo as células imobilizadas por 20-60 min em solução de amido-gelatina, preparada a partir da mistura de amido obtido de qualquer fonte (2 a 20%, p/v), gelatina (2 a 20%, p/v) e glicerol (0,01 a 2%, p/v). A solução filmogênica sacrificante é produzida a partir da mistura de gelatina obtida de colágeno (2 a 20%), amido obtido de qualquer fonte (2 a 20%, p/v), glicerol (0,01 a 2%, p/v) e água. Estes componentes são mantidos sob agitação a 50-80°C por 30-90 min para a formação de uma solução homogênea, agora denominado de revestimento secundário. Este revestimento secundário sacrificante deve recobrir o material sólido orgânico contendo as células imobilizadas, onde esta etapa pode ser realizada por imersão do material sólido orgânico contendo as células imobilizadas por 20-60 min na solução de revestimento secundário. A aplicação do revestimento secundário sobre o material sólido orgânico contendo células microbianas imobilizadas não se limita ao procedimento de imersão descrito. Após a aplicação do revestimento secundário (por imersão, por exemplo), os materiais são removidos da solução e secos por 30 a 90 min sob temperatura ambiente. Após a secagem, os materiais contendo células microbianas vivas e imobilizadas em sua superfície orgânica são embalados e armazenados sob temperatura ambiente até o momento de seu uso.[026] The secondary coating is obtained by immersing the organic solid material containing the immobilized cells for 20-60 min in a starch-gelatin solution, prepared from a mixture of starch obtained from any source (2 to 20%, w/v ), gelatin (2 to 20%, w/v) and glycerol (0.01 to 2%, w/v). The sacrificing film-forming solution is produced from a mixture of gelatin obtained from collagen (2 to 20%), starch obtained from any source (2 to 20%, w/v), glycerol (0.01 to 2%, w/v ) and water. These components are kept under stirring at 50-80°C for 30-90 min to form a homogeneous solution, now called secondary coating. This sacrificing secondary coating must cover the organic solid material containing the immobilized cells, where this step can be carried out by immersing the organic solid material containing the immobilized cells for 20-60 min in the secondary coating solution. The application of the secondary coating to the solid organic material containing immobilized microbial cells is not limited to the dipping procedure described. After application of the secondary coating (by dipping, for example), the materials are removed from the solution and dried for 30 to 90 min at room temperature. After drying, the materials containing live microbial cells immobilized on their organic surface are packaged and stored at room temperature until use.
[027] O presente pedido de proteção intelectual descreve um processo para a imobilização de células bacterianas vivas que pode ser aplicado sobre diferentes matrizes orgânicas sólidas. A técnica descrita é baseada no engaiolamento do microrganismo sobre uma matriz orgânica, com auxílio de uma solução adesiva cuja base da formulação compreende um biopolímero orgânico natural, o amido geleificado. Esta base adesiva é adicionada de compostos nutrientes e compostos de proteção celular, em adição à uma suspensão de células vivas contendo uma ou mais espécies microbianas em elevada densidade de população. Após a imobilização de células microbianas em uma superfície orgânica, o material contendo as células imobilizadas é adicionado de um segundo revestimento sacrificante, que proporciona proteção das células imobilizadas contra a dessecação, e assim garante a viabilidade dos microrganismos imobilizados por períodos prolongados de armazenamento em prateleira. Este processo foi utilizado para imobilização do microrganismo promotor do crescimento de plantas Azospirillum brasilense, uma bactéria Gram-negativa registrada no MAPA para uso como bioinsumo em diversas culturas agrícolas. O processo de imobilização deste microrganismo sobre uma superfície sólida orgânica foi realizado sobre um biocompósito moldado por injeção para exemplificar a eficiência e viabilidade do processo descrito, que não se limita à aplicação sobre este tipo de matriz sólida orgânica. O processo de imobilização descrito proporcionou a manutenção da viabilidade da bactéria promotora do crescimento de plantas Azospirilum brasilense estirpe Ab-V5, em elevadas densidades de população, por mais de 56 dias de armazenamento sob condição ambiente (condição de prateleira), como apresentado na Figura 1 e gráfico 1. A mobilização das células microbianas nestes suportes foi avaliada por meio de sua imersão em água pura e em um substrato úmido, formado por areia com 30% de umidade, onde a liberação gradual das células imobilizadas foi observada. Quando imersa em água, a matriz orgânica contendo células imobilizadas proporcionou a completa liberação das células imobilizadas em 3 horas de imersão do material bacterizado, e promoveu a multiplicação continuada dos microrganismos mobilizados após 6 horas de imersão, como resultado do consumo dos nutrientes componentes da solução ligante pelos microrganismos. Quando imersos em substrato úmido, a liberação de células foi mais gradual e continuada, com liberação parcial das células imobilizadas após 24 horas de contato com o substrato úmido, como observado na Tabela 1.[027] The present intellectual protection application describes a process for the immobilization of live bacterial cells that can be applied to different solid organic matrices. The described technique is based on caging the microorganism in an organic matrix, with the aid of an adhesive solution whose formulation base comprises a natural organic biopolymer, gelled starch. This adhesive base is added with nutrient compounds and cell protection compounds, in addition to a suspension of living cells containing one or more microbial species at a high population density. After immobilization of microbial cells on an organic surface, the material containing the immobilized cells is added with a second sacrificial coating, which provides protection of the immobilized cells against desiccation, and thus guarantees the viability of the immobilized microorganisms for prolonged periods of shelf storage. . This process was used to immobilize the plant growth-promoting microorganism Azospirillum brasilense, a Gram-negative bacterium registered with MAPA for use as a bioinput in various agricultural crops. The immobilization process of this microorganism on a solid organic surface was carried out on an injection molded biocomposite to exemplify the efficiency and viability of the described process, which is not limited to application on this type of organic solid matrix. The described immobilization process maintained the viability of the plant growth-promoting bacterium Azospirilum brasilense strain Ab-V5, at high population densities, for more than 56 days of storage under ambient conditions (shelf conditions), as shown in Figure 1 and graph 1. The mobilization of microbial cells on these supports was evaluated by immersing them in pure water and in a humid substrate, formed by sand with 30% humidity, where the gradual release of the immobilized cells was observed. When immersed in water, the organic matrix containing immobilized cells provided the complete release of the immobilized cells within 3 hours of immersion from the bacterized material, and promoted the continued multiplication of mobilized microorganisms after 6 hours of immersion, as a result of the consumption of the nutrient components of the solution. ligand by microorganisms. When immersed in a moist substrate, cell release was more gradual and continuous, with partial release of immobilized cells after 24 hours of contact with the moist substrate, as seen in Table 1.
[028] Gráfico 1. Sobrevivência de Azospirillum brasilense Ab-V5 imobilizadas em matriz orgânica moldada por injeção (pedido de patente BR1020180072269, 10/04/2018) e mantidas em condições de bancada (70% UR; 28 °C). As contagens foram baseadas no crescimento de microrganismos em meio de cultivo, após tempos variados de armazenamento sob condições de bancada. [028] Graph 1. Survival of Azospirillum brasilense Ab-V5 immobilized in an injection-molded organic matrix (patent application BR1020180072269, 04/10/2018) and maintained under bench conditions (70% RH; 28 °C). Counts were based on the growth of microorganisms in culture medium after varying times of storage under bench conditions.
[029] Tabela 1. Mobilização de células de Azospirillum brasilense Ab-V5 após diferentes tempos de imersão em água ou substrato úmido (areia, 30% umidade). As células bacterianas foram imobilizadas em matriz orgânica moldada por injeção (pedido de patente BR1020180072269, 10/04/2018) na concentração de 1,0 x 109 células por grama de matriz orgânica. As contagens foram baseadas no crescimento de microrganismos em meio de cultivo nos diferentes tempos de imersão da matriz orgânica. [029] Table 1. Mobilization of Azospirillum brasilense Ab-V5 cells after different times of immersion in water or moist substrate (sand, 30% humidity). The bacterial cells were immobilized in an injection molded organic matrix (patent application BR1020180072269, 04/10/2018) at a concentration of 1.0 x 109 cells per gram of organic matrix. The counts were based on the growth of microorganisms in the culture medium at different times of immersion of the organic matrix.
[030]Figura 1 – Micrografias de MEV da morfologia de A. brazilense Ab-V5 imobilizadas em matriz orgânica moldada por injeção (pedido de patente BR1020180072269, 10/04/2018) e mantidas em condições de bancada (70% UR; 28 °C). Após armazenamento de 7 dias (a - surperfície; b – fratura) e de 56 dias (a - surperfície; d – fratura).[030] Figure 1 – SEM micrographs of the morphology of A. brazilense Ab-V5 immobilized in an injection-molded organic matrix (patent application BR1020180072269, 04/10/2018) and kept under bench conditions (70% RH; 28 ° W). After storage for 7 days (a - surface; b – fracture) and 56 days (a - surface; d – fracture).
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