BR102020021170A2 - Composição, formulações orais e uso - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a uma composição e formulações orais na forma de verniz compreendendo princípios ativos de origem natural. É um objeto adicional da presente invenção o uso para preparo de um medicamento para o controle de biofilmes, hipersensibilidade e erosão dentária. A área de aplicação da presente invenção é a odontológica.

Description

COMPOSIÇÃO, FORMULAÇÕES ORAIS E USO Campo da invenção

[001] A presente invenção se refere a uma composição e formulações orais na forma de verniz compreendendo princípios ativos de origem natural. É um objeto adicional da presente invenção o uso para preparo de um medicamento para o controle de biofilmes, hipersensibilidade e erosão dentária.

[002] A área de aplicação da presente invenção é a odontológica.

Fundamentos da invenção:

[003] A cárie dentária, patologia biofilme-dependente de maior destaque na população, tem alta prevalência e severos danos causados ao sistema estomatognático (Pitts et al., 2017). Basicamente, a patogênese da cárie envolve diferentes grupos de bactérias sendo relevante a presença de estreptococos do grupo mutans e lactobacilos, os quais predominantemente produzem ácido lático e são responsáveis pela instalação e desenvolvimento da lesão cariosa, respectivamente (Struzycka, 2014).

[004] Uma vez que a adesão inicial de Streptococcus mutans é dependente da sacarose, substrato oriundo da dieta, para formação do biofilme cariogênico (Pitts et al., 2017), a utilização de formulações capazes de alterar a produção de polissacarídeos pode impedir o acúmulo de microrganismos acidogênicos na superfície do dente (Bowen et al., 2018).

[005] Considerados fontes abundantes de compostos bioativos, os produtos naturais e seus derivados são indicados atualmente como a estratégia mais bem-sucedida no desenvolvimento de agentes terapêuticos (Castilho et al., 2007; Pereira et al., 2016). Por esta razão, compostos naturais têm sido largamente explorados na indústria farmacêutica em busca de protocolos terapêuticos com excelente atividade antimicrobiana e seguros para a saúde (Newman & Cragg, 2016; Guo, 2017) . Flavonóides compreendem um extenso grupo de fenólicos metabólitos secundários amplamente disponíveis em plantas e alimentos, cuja estrutura química inclui dois anéis de fenol ligados por meio de três carbonos (Koes, 1994).

[006] Os flavonóides exibem vasta gama de propriedades biológicas, incluindo efeito antibacteriano, antiprotozoário, anti-inflamatório, antioxidante, estrogênico e atividades vasculares (Crozier et al., 2009). Dentre os diversos flavonoides citados na literatura, destaca-se a quercetina (3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone) potente antioxidante e anti-inflamatório (Guan et al., 2012; Oršolic et al., 2013; Napimoga et al.,2013).

[007] O trans-trans-farnesol (tt-farnesol, 3,7,11-trimethyl-2,6,10-dodecatrien-1-ol), por sua vez, é um álcool sesquiterpeno encontrado em óleos essenciais de frutas cítricas, usado na indústria cosmética devido ao aroma (Koo et al., 2002b). Biologicamente, este terpenóide promove a inibição de produção de ácidos e síntese de glucanos por S. mutans (Koo et al., 2003, 2005), além de aparentemente modificar a permeabilidade e fluidez da membrana celular bacteriana, reduzindo desta forma, a secreção de GTFs (Koo, Jeon, 2009) . Além da atividade antimicrobiana do tt-farnesol (Castilho et al., 2019), atividades anti-inflamatória e antitumoral também são relatadas na literatura (Jung et al., 2018).

[008] Por outro lado, a teobromina (3,7-dimethylxanthine), composto pertencente à família das xantinas, tem importante participação no processo de remineralização dentária, atuando como moderador da dissolução de cálcio, fosfato e magnésio (Amaechi et al., 2013) . Esta característica inerente à teobromina, tem grande valia em processos iniciais de cárie (lesões de mancha branca), uma vez que pode otimizar a redução da perda mineral do esmalte durante o desafio cariogênico (Amaechi et al., 2013) .

[009] Na odontologia, géis e vernizes dentários são estratégias amplamente utilizadas para a aplicação tópica de fluoreto com a finalidade de controlar a cárie dentária (Mishra et al., 2017). Preparados em bases alcoólicas, geralmente, estas formulações são preparadas em base alcoólica, o que faz com que quando aplicadas nas superfícies dos dentes, tenham secagem bastante rápida, apresentando forte adesão à estrutura do dente, possibilitando a liberação contínua e lenta do princípio ativo (Cardoso et al., 2014) . Outra vantagem deste veículo é o fato de depender menos da colaboração do paciente (Mishra et al., 2017) .

[0010] Apesar do considerável corpo de evidência científica em relação ao potencial antimicrobiano dos compostos de origem natural, ainda não foi desenvolvido um veículo de administração efetivo, que dependa menos da colaboração do paciente, seja seguro e capaz de manter níveis salivares adequados do ativo antimicrobiano na cavidade bucal, reduzindo o metabolismo e crescimento de microrganismos cariogênicos e que ao mesmo tempo apresentasse potencial remineralizante.

[0011] Em função das propriedades biológicas dos compostos naturais, a caracterização de formulações para o controle da cárie dentária, e remineralização das lesões iniciais, contendo diferentes princípios ativos, é uma alternativa relevante na Odontologia. No entanto, o emprego de novos materiais preventivos a base de compostos bioativos deve envolver não somente a capacidade de inibir microrganismos cariogênicos como também a habilidade de ser biologicamente aceitável e tão seguro quanto os produtos comercialmente disponíveis.

[0012] Em adição, o custo econômico da formulação, a funcionalidade dela, além da abrangência de sua utilização e a possibilidade de recomendação também em serviços de políticas de saúde pública são fatores primordiais para a indicação de novas terapias.

[0013] Deste modo, a caracterização de géis, vernizes, soluções e orabase contendo combinações de bioativos, pode ser uma alternativa eficaz para o controle da cárie dentária. Ainda, deve-se enfatizar que, a combinação de flavonoides, terpenos e xantinas em uma única formulação resulta em uma formulação potencialmente favorável tanto à inibição do crescimento de microrganismos cariogênicos, quanto ao controle da perda mineral dentária e erosão dentária além da diminuição da hipersensibilidade.

[0014] A presente invenção é uma alternativa ao tratamento de patologias bucais biofilme-dependentes, lesões não cariosas, bem como opção ao controle da intoxicação aguda e sistêmica pelo fluoreto disponível nos produtos odontológicos, e, principal terapia para controle da cárie e remineralização dentária. Assim, com a liberação lenta e controlada de bioativos, a invenção diminui a toxicidade dos bioativos nos sítios bucais, com a vantagem de apresentar maior efetividade antimicrobiana do que o fluoreto. Ainda, a invenção possibilita a manutenção da homeostase do microbioma bucal, pois seus ativos atuam como agentes bacteriostáticos quando empregados em baixas concentrações, fator importante para indivíduos imunossuprimidos e, portanto, sujeitos a colonização microbiana e infecções recorrentes.

Estado da Técnica

[0015] O documento de patente BR112014031734-8 se refere a uma composição de cuidado oral, compreendendo teobromina isolada, ou um sal ou sal duplo desta, ou um co-cristal, compreendendo teobromina, uma fonte de cálcio e uma fonte de fosfato, de modo que a referida composição possibilitou a redução da sensibilidade oral. Os usos da referida invenção incluem o tratamento de sensibilidade ou hipersensibilidade dentinária, e a obstrução eficaz de túbulos dentinários, de modo que a referida obstrução auxilia na prevenção do desenvolvimento de cárie, bem como para tratar as lesões instaladas de cárie, além da erosão. O documento cita ainda a possibilidade de utilizar tais composições em vernizes ortodônticos e pediátricos, como forma de apresentação da presente tecnologia em questão. Também não foram evidenciados o uso dos outros agentes ativos quercetina e tt-farnesol, embora o potencial da teobromina para resolver os problemas de hipersensibilidade dentária e para prevenir e tratar a cáries sejam satisfatórios. No entanto, o mecanismo de ação não necessariamente está ligado ao impedimento da formação e controle de biofilmes, pelo menos não de maneira direta.

[0016] Diferentemente, as composições da presente invenção diferem das composições de BR112014031734-8 na forma de apresentação e componentes ativos. Enquanto a presente invenção se apresenta na forma de verniz, BR112014031734-8 contém dentifrícios. Além disso, a presente invenção contém somente compostos naturais como ativos, enquanto BR112014031734-8 associa teobromina, a uma fonte de cálcio e uma fonte de fosfato, que atuam como coadjuvantes no processo de obliteração dos túbulos dentinários. Assim, embora a efetividade de diferentes concentrações de teobromina tenha sido sugerida em BR112014031734-8, o efeito direto e isolado deste composto não foi evidenciado, mas sim, o efeito em associação com o cálcio e fosfato, sendo que a atividades destes íons na hipersensibilidade é evidenciada em diversos estudos (Cummins, 2010) .

[0017] Além do controle da sensibilidade dentinária, constituída pela obliteração dos túbulos dentinários, por meio da associação de diferentes compostos com efeitos sinérgicos, a presente formulação apresenta também o controle da formação de biofilmes microbianos e de biofilmes maduros simples e multiespécies, fator imprescindível para controle de diversas patologias bucais. A apresentação da composição (verniz) desta invenção favorece a adesão à superfície, liberação lenta do ativo prolongando o efeito do tratamento e controle da ingestão do produto pelo paciente, além de ter uso profissional e, portanto, controlado.

[0018] O documento de patente US 2004/0057908 se refere a uma composição oral e os usos da mesma, sendo que a composição oral compreende um carreador organolepticamente adequado, e uma quantidade de um terpenóide e um flavonóide dispersos no carreador que é eficaz para prevenir ou tratar cárie dentária, formação de placa dentária, gengivite, candidíase, estomatite dentária, ulceração aftosa ou infecções fúngicas. O terpenóide em questão é preferencialmente tt-farnesol e o flavonóide, a apigenina, mas pode ser a quercetina. O documento apresenta dados que revelam uma atividade antimicrobiana da referida composição para Streptococcus mutans e cita a possibilidade de atividade antimicrobiana para bactérias do gênero Lactobacillus. Contudo, apesar do documento apresentar alguns dos efeitos técnicos, principalmente relativos à atividade antimicrobiana para o controle de biofilmes, este não cita a presença de teobromina na composição.

[0019] Diferentemente, da presente invenção o documento US 2004/0057908 conjectura o efeito antimicrobiano de terpenos e flavonoides contra diferentes espécies de microrganismos bucais. No entanto, o documento avaliou apenas o efeito antimicrobiano do terpeno tt-farnesol e do flavonoide apigenina, sem analisar os demais compostos de origem natural exaustivamente citados ao longo do documento. Na presente invenção foram testados diferentes classes e composições químicas; dentre eles os compostos tt-farnesol, apigenina, naringenina, quercetina, liquiritigenina e 7-epiclusianona na inibição de diferentes microrganismos oriundos da cavidade bucal ou não (E.coli, S. aureus, S. epidermidis, S. aureus MRSA, S. parassanguinis, S. mutans, C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, L. casei, L. acidophylus, A. naeslundii), sem encontrar efeito satisfatório ou surpreendente de alguns dos compostos. Em sua maioria, os compostos não apresentaram atividade antimicrobiana ou a mesma foi insignificante contra as espécies testadas, sendo que nenhum deles apresentou atividade inibitória contra todas as espécies. Os compostos tt-farnesol, apigenina, naringenina e quercetina isolados e apresentados em concentrações inferiores a 10% não apresentam efeito inibitório de microrganismos orais e, portanto, não possuem efeito esperado, como previsto no documento US 2004/0057908. Desta forma, fica evidente que, embora a atividade antimicrobiana dos compostos pareça previsível, nem todos eles se comportam da mesma forma quando empregados isoladamente ou quando utilizados em diferentes concentrações e/ou apresentações.

[0020] Portanto, os compostos isolados têm propriedades distintas; nem todos são inibidores de formação de biofilme ou demonstram atividade antimicrobiana em bactérias e leveduras. Além disso, o documento US 2004/0057908 prevê a atuação dos compostos na enzima glicosiltranferase (GTF) produzida pelo S. mutans, enzima responsável pela adesão do biofilme desta espécie às superfícies, sendo este um mecanismo de ação completamente diferente daquele encontrado em Candidas, onde ocorre ruptura da parede e membrana celular da levedura e inibição da formação de hifas por meio do sistema de autoindução quorum sensing. Esse mecanismo de ação não foi verificado no documento US 2004/0057908 e, portanto, as indicações de terapia do US 2004/0057908 são equivocadas e não foram validadas pelos autores. Ainda, concentrações inferiores daquelas citadas na presente invenção, bem como o uso isolado dos compostos, não são terapias efetivas em biofilmes bacterianos e de leveduras. Fica evidente assim, que o documento US 2004/0057908 generaliza o uso dos compostos naturais, levando a entender que os mesmos são capazes de tratar qualquer patologia existente na cavidade bucal e em qualquer concentração, o que é uma informação completamente inconsistente. Contudo, o documento US 2004/0057908 não prevê a aplicação dos tratamentos em crianças, usuárias de chupeta ou aparelhos ortodônticos, superfícies favoráveis à formação de biofilmes assim como também não prevê a possibilidade de uso como terapia para candidíase invasiva (forma sistêmica e disseminada da doença), comum e extremamente perigosa em neonatos, além de outras patologias com manifestações sistêmicas, tanto odontológicas quanto médicas, como endocardite bacteriana.

[0021] A presente invenção claramente difere com relação ao estado da arte 1) na composição, 2) na apresentação, 3) na finalidade terapêutica e, por fim, 4) na segurança biológica.

[0022] A presente invenção tem como mecanismo de ação principais, a modulação do biofilme microbiano (tt-farnesol + quercetina), como terapia alternativa ao tratamento com antimicrobianos/antibióticos convencionais, evitando a colonização por diferentes cepas e mais virulentas. US 2004/0057908 que tem enfoque na morte celular, o que a longo prazo pode favorecer a modificação do microbioma bucal e o favorecimento de outras doenças ou disbioses. Ainda, a composição da invenção descreve também o uso de teobromina como agente antioxidante, cuja segurança foi confirmada in vivo.

[0023] O artigo científico intitulado "Comparison Of Fluoride And The Novel Anti-Caries Agent Theobromine On Initial Enamel Caries: An In Vitro Study" de Gündoğar et. al. (2019) se refere ao uso de uma teobromina na composição como agente anti-cáries bem como agente remineralizante e o estudo foi projetado para comparar o efeito de remineralização de diferentes doses de teobromina e flúor em lesões de cárie iniciais usando um modelo de ciclagem de pH in vitro. A concentração de teobromina mais eficaz que protege contra a cárie ainda não está clara, então várias doses foram testadas em estudos anteriores. A dose mais alta de teobromina (500 mg / L) corresponde ao nível médio de teobromina no pó de cacau comercial e representa o limite superior da solução de teobromina na água. Soluções contendo 200 mg / L e 500 mg / L de teobromina foram preparadas e avaliadas quanto à sua eficácia. Um aumento estatisticamente significativo no valor de microdureza superficial foi observado em ambos os grupos de flúor e teobromina e assim fica evidente que a teobromina pode ser uma alternativa ao flúor em produtos comerciais para remineralização dentária, estando enquadrado em um dos objetivos da presente invenção. No entanto, o estudo não engloba todos os agentes ativos da tecnologia em questão, apesar de comprovar efeitos de remineralização e de controle de biofilmes.

[0024] O referido artigo demonstra o papel remineralizador de esmalte pela teobromina. No entanto, a concentração ideal para este propósito não está clara. Foram utilizadas soluções contendo altas doses de teobromina (200 e 500 mg/L) as quais poderiam ser tóxicas para seres humanos. Idealmente, os ativos em formulações devem ser apresentados em μg/mL a fim de serem utilizadas doses farmacológicas não tóxicas e seguras para a saúde.

[0025] Diferentemente, a presente invenção apresenta três diferentes ativos com diferentes propriedades farmacológicas, os quais associados, apresentam efeitos sinérgicos e potentes, utilizando-se, no entanto, concentrações reduzidas dos compostos, diminuindo assim, a possibilidade de efeitos adversos além de reduzir também os custos finais da formulação. Ainda a presente invenção tem indicações diversas (terapias orais), com possibilidade de efeito sistêmico indireto para tratamento de outras patologias não localizadas na cavidade bucal.

[0026] O artigo de revisão científica intitulado "Natural Oral Care In Dental Therapy: Current And Future Prospects " de Chauhan et. al. (2020) cita a aplicação de diversos componentes provenientes de produtos naturais, dentre eles a teobromina, quercetina e tt-farnesol, justamente para tratamento e terapias dentárias, de modo a evidenciar a utilização destes agentes ativos, sem, no entanto, abordar algum artigo que contenham os referidos três componentes em associação. No entanto, na tecnologia em questão, não foram apresentados testes bem definidos para a comprovação de efeito sinérgico, de modo que os efeitos técnicos podem estar associados aos efeitos de cada agente ativo em separado.

[0027] Compostos isolados apresentam propriedades biológicas distintas daquelas presentes em extratos provenientes de plantas ou frutos, onde diversos compostos naturais estão presentes em quantidades variadas. Isso significa que, apesar de alguns compostos apresentarem efeito antimicrobiano ou remineralizador, não necessariamente estes efeitos foram provenientes de um único componente químico. Ainda, a associação de diferentes compostos de origem natural pode inibir ou potencializar o efeito de um determinado bioativo. Por esta razão, muitas terapias são baseadas no emprego de compostos isolados. Como relatado anteriormente, diferentes flavonoides, incluindo naringenina e quercetina e liquiritigenina foram testados isoladamente em concentrações inferiores a 10%, sem efetividade significativa na inibição de microrganismos orais.

[0028] Compostos de origem natural podem apresentar toxicidade aos tecidos quando apresentados na forma isolada, uma vez que altas doses são necessárias para se atingir as propriedades farmacológicas desejáveis. A presente invenção não demonstrou toxicidade sistêmica aguda em modelo invertebrado (in vivo). Ainda, a quantidade e qualidade de compostos naturais e seus derivados em plantas e frutos varia de acordo com a região de plantio, clima e forma de cultivo. Assim, uma mesma espécie de planta disponibilizada em biobancos de diferentes estados, apresenta variações em suas propriedades farmacológicas. A presente invenção utiliza compostos já sintetizados, garantindo assim, a padronização dos ensaios e resultados obtidos, garantindo assim as atividades biológicas encontradas, o que não é observado em estudos com extratos.

[0029] O artigo científico "Activity Of Quercetin And Kaemferol Against Streptococcus Mutans Biofilm" de Zeng et. al. (2019) avaliou a atividade antimicrobiana de quercetina e kaemferol (da mesma família do farnesol) em relação a um biofilme de Streptococcus mutans. Os referidos compostos demonstraram atividades anti-biofilme quando comparados ao controle negativo. Eles são capazes de reduzir o peso seco do biofilme, a proteína total, as células viáveis medidas por unidade formadora de colônia (CFU), e a formação de glucanos insolúveis e solúveis. O referido artigo avalia ainda a concentração inibitória mínima (MIC) de quercetina e kaemferol contra S. mutans ATCC 25175 por meio de um ensaio de microdiluição, que avalia tanto a influência de uma concentração que evita a formação e uma concentração que reduz a quantidade microbiana. Os resultados demonstram uma efetividade significativa dos referidos agentes ativos na eliminação de biofilmes, sendo um dos efeitos técnicos principais da tecnologia em questão, de modo que as similaridades de ativos se evidenciam, apesar de não haver citação a teobromina como um agente ativo.

[0030] Diferentemente, da presente invenção o artigo citado utiliza altas doses de ativos (16 mg/ml quercetina; 2; 8 mg/ml kaemferol), aplicadas 8x/dia, para controle de biofilme monoespécie (somente S. mutans) . Os compostos utilizados são provenientes de extratos, os quais conhecidamente exibem diferenças importantes na quantidade e qualidade de ativos dependendo da região, clima e forma de cultivo da planta. Assim, a origem dos ativos determina se estes são mais ou menos eficazes. Portanto, o referido artigo utiliza soluções contendo altas doses de compostos naturais, aplicadas várias vezes ao dia, para atingir o efeito antimicrobiano desejado e as quais podem gerar toxicidade local ou sistêmica em humanos.

[0031] A presente invenção apresenta três diferentes ativos com diferentes propriedades farmacológicas, os quais associados, apresentam efeitos sinérgicos e potentes, utilizando-se, no entanto, concentrações reduzidas dos compostos, diminuindo assim, a possibilidade de efeitos adversos além de reduzir também os custos finais da formulação. Na presente invenção, um único tratamento (1x/dia) das formulações foi eficaz na inibição de formação de biofilmes monoespécies e também na modulação de biofilmes multiespécies, como aqueles encontrados na cavidade bucal. A invenção tem indicações diversas como terapias orais, com possibilidade de efeito terapêutico sistêmico indireto em patologias com origem em outros sítios do corpo humano.

[0032] Os vernizes contendo produtos naturais apresentam efeito inibitório de biofilmes de espécies cariogênicas com baixo potencial tóxico sistêmico. Assim, os vernizes da presente invenção são alternativas para os produtos comercialmente disponíveis, os quais não apresentam as atividades antimicrobiana e remineralizadora associadas em um único produto.

[0033] A composição da presente invenção teve como vantagem a adesão prolongada desta aos tecidos da cavidade bucal, com liberação localizada e lenta dos bioativos tanto para os tecidos bucais quanto para biofilmes bacterianos e fúngicos que estão se formando ou já formados nos tecidos duros e moles.

Breve descrição da invenção

[0034] A presente invenção se refere a uma composição e formulações orais na forma de verniz compreendendo princípios ativos de origem natural. É um objeto adicional da presente invenção o uso para preparo de um medicamento para o controle de biofilmes, hipersensibilidade e erosão dentária.

[0035] A composição e as formulações compreendem os princípios ativos teobromina, farnesol, quercetina e veículos farmaceuticamente aceitos. Ainda materiais para a formação das características de verniz (textura), sendo os excipientes principais preferencialmente sorbitol, vaselina sólida e polietileno glicol (PEG).

[0036] A composição odontológica compreende:

• - 1,5% a 4,5% de teobromina;
• - 1,5% a 4,5% de farnesol;
• - 1,5% a 4,5% de quercetina;
• - excipientes farmaceuticamente aceitáveis, e
• - veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[0037] Os excipientes da presente invenção serem selecionados dentre:

• - 1% selecionado dentre CMC (carboximetilcelulose) , hidroxietilcelulose, gelatina, gomas, carbomer, preferencialmente gelatina;
• - 0,05% a 0,1%, preferencialmente 0,05% de conservantes selecionados dentre metilparabeno, propilparabeno, etilparabeno, butilparabeno, ácido benzóico, benzoato de sódio, preferencialmente metilparabeno;
• - 3% a 7%, preferencialmente 5%, selecionado dentre glicose, sacarose, manitol, sacarina, ciclamato de sódio, aspartame, preferencialmente sorbitol;
• - 8% a 12%, preferencialmente 10%, selecionada dentre lanolina, parafina, vaselina sólida, preferencialmente vaselina sólida;
• - 20% a 30%, preferencialmente 30%, selecionado Polietileno Glicol (PEG), colofônia, preferencialmente Polietileno Glicol (PEG).

[0038] A formulação odontológica (A) compreende:

• - 1,5% de teobromina;
• - 1,5% de farnesol;
• - 1,5% de quercetina;
• - 1% de gelatina;
• - 0,05% de metilparabeno;
• - 5% de sorbitol;
• - 10% de vaselina sólida;
• - 30% de polietileno glicol (PEG); e
• - água destilada QSP (quantidade suficiente).

[0039] A formulação odontológica (B) compreende:

• - 4,5% de teobromina;
• - 4,5% de farnesol;
• - 4,5% de quercetina;
• - 1% de gelatina;
• - 0,05% de nipagin;
• - 5% de sorbitol;
• - 10% de vaselina sólida;
• - 30% de polietileno glicol (PEG); e
• - água destilada QSP (quantidade suficiente).

Breve descrição das figuras

[0040] A figura 1 apresenta as formulações sob a forma de vernizes da presente invenção.

[0041] A figura 2 apresenta a reativação das bactérias de suas culturas originais em meio BHI.

[0042] A figura 3 apresenta a confirmação do crescimento bacteriano utilizando as formulações sob a forma de vernizes da presente invenção.

[0043] A figura 4 apresenta os tratamentos dos microrganismos com as formulações sob a forma de vernizes da presente invenção.

[0044] A figura 5 apresenta a confirmação da inibição da formação de biofilme utilizando as formulações sob a forma de vernizes da presente invenção.

[0045] A figura 6 apresenta a diluição seriada dos poços.

[0046] A Figura 7 apresenta o plaqueamento das diluições em BHI ágar.

[0047] A figura 8 apresenta a média e desvio padrão de UFC/mL (log10) de S. mutans, L. acidophilus e L. casei após tratamento dos biofilmes utilizando as formulações sob a forma de vernizes da presente invenção (ANOVA e Tukey; p<0,05).

[0048] A figura 9 apresenta a avaliação de toxicidade das formulações sob a forma de vernizes da presente invenção em Galleria mellonella (ANOVA e Tukey; p<0,05).

Descrição detalhada da invenção

[0049] A presente invenção se refere a uma composição e formulações orais na forma de verniz compreendendo princípios ativos de origem natural. É um objeto adicional da presente invenção o uso para preparo de um medicamento para o controle de biofilmes, hipersensibilidade e erosão dentária.

[0050] A quantidade dos ativos teobromina, quercetina e tt-farnesol podem variar entre 1,5 a 4,5 % de cada componente em relação à composição total.

[0051] A composição compreende ainda materiais para a formação das características de verniz (textura), sendo os excipientes principais preferencialmente sorbitol, vaselina sólida e polietileno glicol (PEG).

[0052] A composição odontológica compreende:

• - 1,5% a 4,5% de teobromina;
• - 1,5% a 4,5% de farnesol;
• - 1,5% a 4,5% de quercetina;
• - excipientes farmaceuticamente aceitáveis; e
• - veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[0053] Os excipientes da composição podem ser selecionados dentre:

• - 1% selecionado dentre CMC (carboximetilcelulose), hidroxietilcelulose, gelatina, gomas, carbomer, preferencialmente gelatina;
• - 0,05% a 0,1%, preferencialmente 0,05% de conservantes selecionados dentre metilparabeno, propilparabeno, etilparabeno, butilparabeno, ácido benzóico, benzoato de sódio, preferencialmente metilparabeno;
• - 3% a 7%, preferencialmente 5%, selecionado dentre glicose, sacarose, manitol, sacarina, ciclamato de sódio, aspartame, preferencialmente sorbitol;
• - 8% a 12%, preferencialmente 10%, selecionada dentre lanolina, parafina, vaselina sólida, preferencialmente vaselina sólida;
• - 20% a 30%, preferencialmente 30%, selecionado Polietileno Glicol (PEG), colofônia, preferencialmente Polietileno Glicol (PEG); e
• - água destilada QSP (quantidade suficiente).

[0054] A formulação odontológica (A) compreende:

• - 1,5% de teobromina;
• - 1,5% de farnesol;
• - 1,5% de quercetina;
• - 1% de gelatina;
• - 0,05% de metilparabeno;
• - 5% de sorbitol;
• - 10% de vaselina sólida;
• - 30% de Polietileno Glicol (PEG); e
• - água destilada QSP (quantidade suficiente).

[0055] A formulação odontológica (B) compreende:

• - 4,5% de teobromina;
• - 4,5% de farnesol;
• - 4,5% de quercetina;
• - 1% de gelatina;
• - 0,05% de nipagin;
• - 5% de sorbitol;
• - 10% de vaselina sólida;
• - 30% de Polietileno Glicol (PEG); e
• - água destilada QSP (quantidade suficiente).

[0056] Os efeitos técnicos da presente invenção são o controle de biofilmes, remineralização dentária, hipersensibilidade, inibição da erosão dentária, apresentando um efeito sinérgico, e com testes de comprovação de inibição antimicrobiana de Streptococcus mutans, Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus casei.

[0057] A composição da presente invenção também poderia ser utilizada para preparação de um medicamento para tratar infecções da cavidade bucal, bem como endocardite bacteriana e candidíase invasiva.

Exemplos Caracterização dos vernizes e compostos naturais utilizados

[0058] Foram escolhidos três diferentes compostos ativos para a caracterização das composições da presente invenção de verniz: tt-farnesol (C15H26O), quercetina (C15H10O7) e teobromina (C7H8N4O2)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), utilizados em duas formulações com diferentes concentrações (Tabela 1). Uma formulação compreendendo verniz sem os compostos foi utilizado como controle.

Determinação do efeito antimicrobiano dos vernizes sobre biofilme cariogênico

[0059] Os materiais foram separados e esterilizados devidamente para evitar e diminuir os riscos de contaminação.

[0060] Foram reativadas colônias de Streptococcus mutans UA 159, Lactobacillus acidophilus ATCC IAL 523 e Lactobacillus casei ATCC 193 provenientes do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba.

[0061] Os biofilmes de monocultura de S. mutans, L. acidophillus e L. casei foram formados em placas de microtitulação de 24 poços (Costar) e incubados a 37 °C e 5 % de CO2 por 24 h (Castilho et al., 2013).

[0062] Após este período, foram adicionados 200 mL de meio Brain Heart Infusion (BHI) suplementado com 1% de sacarose e aproximadamente 0,2 mL de cada verniz (experimental e controle) foram adicionados aos poços utilizando-se um aplicador descartável (microbusch) e então a placa foi incubada a 37 °C por 24h a 5% CO2.

[0063] Como controle positivo foi utilizado digluconato de clorexidina a 0,2 % enquanto que poços inoculados apenas com meio de cultura foram utilizados como controle negativo. Após este período, alíquotas de 100 μL foram retiradas dos poços e diluídas em séries decimais de 10-1 a 10-6 e então 10 μL de cada diluição foram inoculados em triplicata em placas de BHI agar. As colônias foram contadas e o número de bactérias viáveis foi determinado em unidade formadora de colônia (UFC/mL). Todos os ensaios foram realizados de forma independente e em triplicata.

Toxicidade das formulações da presente invenção no modelo invertebrado Galleria mellonella

[0064] Foram utilizadas 20 larvas para cada grupo, com peso médio entre 0,2 e 0,3 g, sem ou com poucos sinais de melanização, divididas aleatoriamente entre os grupos A-compostos 1, 2 e 3; B- compostos 1, 2 e 3; C- sem compostos; D- solução salina a 0,9 %.

[0065] Em seguida, 0,02 mL de cada formulação em verniz foram injetadas na hemocele de cada larva através da última proleg esquerda delas e utilizando seringa Insulina BD UltraFine 30UI. As larvas foram então incubadas em ambiente escuro a 37 °C. A sobrevivência das larvas foi registrada em intervalos de 6 h durante 72 h. Neste período, as larvas que não exibiram movimentos ao toque e apresentaram altos níveis de melanização foram consideradas mortas.

Análise estatística

[0066] A análise dos dados foi conduzida utilizando-se o software estatístico Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc., 2014) ao nível de significância de 0,05. Diferenças entre a viabilidade do biofilme formado e a toxicidade dos vernizes foram verificadas por análise de variância seguido de teste post hoc de Tukey. O nível de significância de 5% foi estabelecido para todos os testes.

[0067] Os dados representativos sobre a inibição do biofilme formado das espécies S. mutans, L. acidophilus e L. casei são mostrados na Figura 8, evidenciando a diminuição significativa de células viáveis dos microrganismos cariogênicos. Biofilmes das espécies S. mutans, L. acidophilus e L. casei mostraram-se suscetíveis a ambas as formulações nas diferentes concentrações de bioativos (A e B), quando comparados ao controle negativo (clorexidina - CHX) e ao grupo sem tratamento.

[0068] Para a espécie S. mutans, as formulações A e B tiveram resultados equivalentes ao controle negativo (CHX), diferindo estatisticamente do grupo controle (C) . Significativa inibição da formação de biofilme também foi observada para as espécies L. acidophilus e L. casei (p<0,05). Com exceção das espécies S. mutans e L. acidophilus, maior efeito antibiofilme foi observado para a formulação B, a qual diferiu estatisticamente da formulação A e demais controles. Como esperado, o controle negativo CHX inibiu completamente a formação de biofilme das espécies. Em contrapartida, o número de células de biofilme das espécies cariogênicas testadas após o tratamento com a formulação controle (C) não sofreu alteração.

[0069] Quando verificada a toxicidade das formulações em modelo in vivo de G. mellonella, baixa toxicidade sistêmica aguda foi observada. As formulações A (n=2) e B (n=3) afetaram a sobrevivência das larvas somente 36 h após o tratamento, sendo que outras mortes foram observadas para o grupo B após 54h (n=2)(p<0,05). Tanto a formulação controle (sem compostos) quanto o veículo utilizado como controle positivo (salina 0,9 %), não afetaram a viabilidade das larvas durante as 72h de observação. Os dados referentes à toxicidade das formulações estão demonstrados na Figura 9.

[0070] As formulações tiveram como princípio a adesão prolongada destas às superfícies duras dos dentes, com liberação lenta de bioativos com conhecida atividade farmacológica para controle de lesões cariosas. Uma vez que os compostos não foram capazes de inibir o crescimento microbiano quando utilizados isoladamente, testou-se a associação destes mesmos compostos em duas diferentes concentrações maiores do que as concentrações mínimas inibitórias para S. mutans. Sabe-se que S. mutans é um dos colonizadores pioneiros no biofilme dentário, responsável pela aderência de novas células microbianas na superfície dental por meio de adesinas encontradas ao longo de sua membrana superficial (Marsh, 2007) . Após adesão inicial, ocorre multiplicação das espécies e formação de colônias bacterianas resultando no desenvolvimento de biofilme, o qual se torna maduro, favorecendo desta forma, a agregação e prevalência de novas espécies e mais agressivas (Marsh, 2007).

[0071] Foram observados que as formulações (A e B) apresentaram atividade inibitória de formação de biofilme da espécie S. mutans, inibindo completamente a formação de biofilme e assim, caracterizando o potencial bactericida das formulações contra esta espécie. Considerando que S. mutans contribui consideravelmente para a formação de biofilme e propicia condições favoráveis à colonização de microrganismos estes resultados são extremamente relevantes para o controle de novas lesões cariosas.

[0072] Embora a formulação A tenha menor concentração dos princípios ativos, seu desempenho foi similar à formulação B, evidenciando que baixas concentrações de associações antimicrobianas podem ser medidas terapêuticas eficazes e relevantes para a prática clínica do ponto de vista do custo dos vernizes e do potencial tóxico em humanos. O gênero Lactobacillus, gram positivo anaeróbio facultativo, tem participação na progressão da doença em função de características acidogênicas e acidúricas (Leites, 2005), sendo necessário um agente colonizador inicial para se aderirem à superfície e aos sítios retentivos (Maltz, 2012).

[0073] As formulações A e B também inibiram a formação de biofilmes de L. acidophilus e L. casei, porém, não completamente como para a espécie S. mutans. Desta forma, a terapia com as formulações da presente invenção pode ser ferramenta tanto para a inibição da formação do biofilme como para o controle de sua maturação, atuando indiretamente no controle da instalação e progressão das lesões.

[0074] Em adição, a atuação como agente bacteriostático das formulações da presente invenção impede a sucessão e colonização bacteriana por espécies mais virulentas. Um estudo envolvendo modelos animal e clínico mostrou que uma única aplicação por 3 dias consecutivos de um verniz a base de própolis foi capaz de reduzir colônias de S. mutans da saliva por um período de até 3 dias (Luca, 2015) . Com a presente invenção, foi realizado uma única aplicação das formulações, assim, acredita-se que o efeito inibitório da presente invenção possa ser potencializado se aplicado por dias consecutivos ou semanalmente pois ocorreria a liberação gradual e contínua dos compostos na cavidade bucal. Comparando as formulações da presente invenção com o verniz de própolis observamos que ambos agem sobre o S. mutans porém cada um apresentou um resultado. O verniz de própolis não teve efeito inibitório sobre a espécie estudada como as formulações da presente invenção apenas reduziu o número de bactérias na superfície dental e gerou um efeito sobre as lesões cariosas. Contudo as formulações A e B efetivamente agiram sobre a inibição da formação de biofilme, com isso há benefícios diretos sobre a doença cárie, podendo até reduzir e controlar consideravelmente este problema mundial.

[0075] Geralmente, os vernizes são preparados em base alcoólica, o que faz com que quando aplicados nas superfícies dos dentes, tenham secagem bastante rápida, apresentando uma forte adesão à estrutura do dente possibilitando uma liberação contínua e lenta do princípio ativo (Cardoso et al., 2014) . Essas propriedades dos vernizes melhoram os resultados e sua manutenção no meio bucal pode ser por um tempo prolongado devido a sua liberação lenta que mantém sua eficácia por horas e os danos são amenizados. Uma vez confirmada a atividade antimicrobiana dos vernizes, posteriormente, a toxicidade aguda foi então avaliada na tentativa de caracterizar formulações eficazes e seguras para a saúde. A toxicidade de vernizes fluoretados como os vernizes de tetrafluoreto de titânio comparado e fluoreto de sódio já foi explorada e evidencia potencial citotóxico em fibroblastos após 24h da aplicação, sendo que a toxicidade dos vernizes é dependente da concentração de fluoreto e tempo de tratamento (Oliveira, 2015). Na presente invenção, foi utilizado o modelo de hospedeiro experimental alternativo G. mellonella, que embora ainda seja um estudo pré-clínico, possui menos limitações do que um estudo com cultura de células in vitro. Neste modelo, podemos sustentar que as formulações tiveram baixa toxicidade às larvas ou que as concentrações dos compostos eram muito baixas para comprometer o desenvolvimento delas, uma vez que não houve grande número de mortes em curto prazo. Apesar do efeito antimicrobiano relevante da baixa toxicidade das formulações contendo produtos naturais, estudos adicionais e sistematicamente estruturados são recomendados para melhor elucidar o papel das formulações da presente invenção na patogênese da cárie dentária.

[0076] Assim, as formulações da presente invenção apresentam efeito inibitório de biofilmes de espécies cariogênicas com baixo potencial tóxico sistêmico.

[0077] A relevância do uso da composição e das formulações contendo bioativos, de origem natural ou sintéticos, da presente invenção associado a um ou mais ingredientes farmaceuticamente aceitáveis se fundamenta na premissa de expressiva redução de biofilmes de microrganismos cariogênicos após tratamento com uma única dose da composição. Além disso, as formulações são seguras do ponto de vista tóxico, com base na baixa toxicidade sistêmica de organismos vivos, sem efeitos colaterais. As formulações aqui descritas foram testadas em diferentes modelos microbiológicos e utilizando diferentes microrganismos, com significativo efeito inibitório em todos eles.

[0078] Ainda, a toxicidade da composição e das formulações foram verificadas em modelo invertebrado de Galleria mellonella. As formulações contendo os bioativos teobromina, farnesol e quercetina e, opcionalmente um ou mais adjuvantes farmacêuticos ativos ou não, ou outros compostos bioativos derivados de produtos naturais podem ser empregados em formulações de uso odontológico e médico com finalidade antimicrobiana, remineralizadora e anti-erosiva.

Claims (7)

1. Composição odontológica caracterizada por compreender:

   • - 1,5% a 4,5% de teobromina;
   • - 1,5% a 4,5% de farnesol;
   • - 1,5% a 4,5% de quercetina;
   • - excipientes farmaceuticamente aceitáveis; e
   • - veículos farmaceuticamente aceitáveis.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato dos excipientes poderem ser selecionados dentre:

   • - 1% selecionado dentre CMC (carboximetilcelulose), hidroxietilcelulose, gelatina, gomas, carbomer, preferencialmente gelatina;
   • - 0,05% a 0,1%, preferencialmente 0,05% de conservantes selecionados dentre metilparabeno, propilparabeno, etilparabeno, butilparabeno, ácido benzóico, benzoato de sódio, preferencialmente metilparabeno;
   • - 3% a 7%, preferencialmente 5%, selecionado dentre glicose, sacarose, manitol, sacarina, ciclamato de sódio, aspartame, preferencialmente sorbitol;
   • - 8% a 12%, preferencialmente 10%, selecionada dentre lanolina, parafina, vaselina sólida, preferencialmente vaselina sólida;
   • - 20% a 30%, preferencialmente 30%, selecionado Polietileno Glicol (PEG), colofônia, preferencialmente Polietileno Glicol (PEG); e
   • - água destilada QSP (quantidade suficiente).
3. Formulação odontológica caracterizada por compreender:

   • - 1,5% de teobromina;
   • - 1,5% de farnesol;
   • - 1,5% de quercetina;
   • - 1% de gelatina;
   • - 0,05% de metilparabeno;
   • - 5% de sorbitol;
   • - 10% de vaselina sólida;
   • - 30% de Polietileno Glicol (PEG); e
   • - água destilada QSP (quantidade suficiente).
4. Formulação odontológica caracterizada por compreender:

   • - 4,5% de teobromina;
   • - 4,5% de farnesol;
   • - 4,5% de quercetina;
   • - 1% de gelatina;
   • - 0,05% de metilparabeno;
   • - 5% de sorbitol;
   • - 10% de vaselina sólida;
   • - 30% de Polietileno Glicol (PEG); e
   • - água destilada QSP (quantidade suficiente).
5. Uso da composição conforme definido nas reivindicações de 1 a 2, caracterizado por ser no preparo de um medicamento para o controle de biofilmes, hipersensibilidade e erosão dentária.
6. Uso da formulação conforme definido na reivindicação 3, caracterizado por ser no preparo de um medicamento para o controle de biofilmes, hipersensibilidade e erosão dentária.
7. Uso da formulação conforme definido na reivindicação 4, caracterizado por ser no preparo de um medicamento para o controle de biofilmes, hipersensibilidade e erosão dentária.

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