BR102018009263A2 - molécula de ácido nucleico cry1da códon-otimizada, construção de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, célula vegetal, planta transgênica, método para transformar uma célula, método para produzir uma planta transgênica, método de controle de pragas invertebradas de plantas de cultivo e usos da molécula de ácido nucleico - Google Patents
molécula de ácido nucleico cry1da códon-otimizada, construção de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, célula vegetal, planta transgênica, método para transformar uma célula, método para produzir uma planta transgênica, método de controle de pragas invertebradas de plantas de cultivo e usos da molécula de ácido nucleico Download PDFInfo
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Abstract
a presente invenção se refere a novas moléculas de ácido nucleico códon-otimizadas cry1da a partir de uma sequência de gene isolado da bactéria bacillus thuringiensis. estas moléculas são utilizadas para a produção de construções de ácido nucléico, vetores e células hospedeiras, permitindo a produção de plantas transgênicas, tais como milho, resistentes a pragas invertebradas, tais como insetos da ordem lepidoptera, particularmente spodoptera frugiperda (noctuidae, lepidoptera) e diatrea saccharalis (crambidae, lepidoptera). também são objetos da presente invenção células vegetais e a plantas transgênicas compreendendo as moléculas ou as construções da invenção. em especial, as plantas transgênicas, de acordo com a presente invenção, são capazes de controlar as lagartas das mencionadas espécies que se tornaram resistentes às plantas contendo o gene cry1f. ainda, a presente invenção refere-se a um método para transformar uma célula, a um método de controle de pragas invertebradas de plantas de cultivo e aos usos das moléculas ou das construções de ácido nucleico para a produção de plantas transgênicas e para o controle de pragas invertebradas.
Description
“MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO CRY1DA CÓDON-OTIMIZADA, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, CÉLULA VEGETAL, PLANTA TRANSGÊNICA, MÉTODO PARA TRANSFORMAR UMA CÉLULA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA, MÉTODO DE CONTROLE DE PRAGAS INVERTEBRADAS DE PLANTAS DE CULTIVO E USOS DA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO”
Campo da Invenção [001] A presente invenção se refere a novas moléculas de ácido nucleico códon-otimizadas crylDa a partir de uma sequência de gene isolado da bactéria Bacillus thuringiensis. Estas moléculas são utilizadas para a produção de construções de ácido nucléico, vetores e células hospedeiras, permitindo a produção de plantas transgênicas, tais como milho, resistentes a pragas invertebradas, tais como insetos da ordem Lepidoptera, particularmente Spodoptera frugiperda (Noctuidae, Lepidoptera) e Diatrea saccharalis (Crambidae, Lepidoptera). Também são objetos da presente invenção células vegetais e plantas transgênicas compreendendo as moléculas ou as construções da invenção. Em especial, as plantas transgênicas, de acordo com a presente invenção, são capazes de controlar as lagartas das mencionadas espécies que se tornaram resistentes às plantas contendo o gene cry1F. Ainda, a presente invenção refere-se a um método para transformar uma célula, a um método de controle de pragas invertebradas de plantas de cultivo e aos usos das moléculas ou das construções de ácido nucleico para a produção de plantas transgênicas e para o controle de pragas invertebradas.
Antecedentes da Invenção [002] Avanços consistentes em técnicas de engenharia genética têm possibilitado o desenvolvimento de plantas de importância comercial transgênicas, contendo genes heterólogos de interesse, os quais conferem
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2/53 características desejáveis a tais plantas. Dentre os genes de interesse podem ser citados genes que conferem às plantas resistência a herbicidas, a estresses ambientais e a pragas invertebradas, por exemplo.
[003] No contexto de genes que codificam proteínas que são úteis para o controle de pragas invertebradas, pode ser citado o gene cry, oriundo da bactéria Gram positiva Bacillus thuringiensis (Bt). Tal bactéria, de ocorrência natural em diversos habitats, incluindo solo, filoplano, resíduos de grãos, poeira, água, matéria vegetal e insetos, possui a característica inata de formar cristais proteicos durante a fase estacionária e/ou de esporulação. Os cristais proteicos ou delta-endotoxinas, representando de 20 a 30% da proteína total da célula (Boucias & Pendland, 1998), possuem propriedades inseticidas específicas e podem ter várias formas, tais como: bipiramidal, esférica, retangular, cuboide e irregular. Os cristais bipiramidais apresentam uma maior frequência de toxicidade do que os cristais com outros formatos, possuindo particular atividade contra lepidópteros.
[004] O mecanismo de ação das proteínas Cry envolve, de forma geral, a solubilização dos cristais no intestino médio das larvas de insetos, a ação de proteases sobre as pro-toxinas, a aderência das toxinas ativas aos receptores do intestino médio e a inserção de ditas toxinas ativas na membrana apical celular, criando canais de íons ou poros (citólise).
[005] Uma vantagem que advém do uso das proteínas Cry é a atividade destas contra várias espécies de insetos, sendo consideradas seguras em relação a outros organismos, tais como os mamíferos. Outra vantagem é a relativa especificidade em relação aos insetos-praga das diferentes culturas. Atualmente são reconhecidos diversos genes cry. Os genes cry1, cry2 e cry9 são geralmente ativos contra lepidópteros; os genes cry2, cry4A, cry10, cry11, cry 17, cry 19, cry24, cry25, cry27, cry29, cry30, cry32, cry39 e cry40 são geralmente ativos contra dipteros; os genes cry3, cry7 e cry8 são geralmente
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3/53 ativos contra coleópteros; e os genes cry5, cry12, cry13 e cry14 são geralmente ativos contra nematódeos.
[006] As formulações à base de Bt disponíveis no mercado representam uma alta porcentagem das vendas dos biopesticidas e têm sido usadas há mais de 40 anos para o controle de pragas das ordens Lepidoptera e Diptera. A produção das primeiras plantas transgênicas contendo genes cry não apresentou resultados satisfatórios. De forma geral, os níveis de expressão dos genes nativos eram inferiores aos necessários para promover uma proteção adequada contra as espécies alvo em campo. Esta baixa concentração de proteínas Cry se deveu, entre outros fatores, a uma incompatibilidade entre os códons da espécie doadora do gene (bactéria Bt) e da espécie receptora do gene (plantas de interesse).
[007] Sabe-se que diferentes espécies utilizam códons preferenciais, em frequência particular, para a codificação de proteínas, e estas variações de códons, no contexto de transgenia, podem afetar negativamente a expressão gênica (Gustafsson, 2004). Por exemplo, em milho, o códon AAG é utilizado preferencialmente em relação ao códon AAA para o aminoácido lisina (Liu,
2009). Devido a esta característica singular entre diferentes grupos de organismos, a inserção de genes cry nativos de B. thuringiensis em plantas leva à baixa expressão da proteína Cry de interesse.
[008] Além disso, genes bacterianos possuem um baixo conteúdo de C+G, contrastando com os genes de plantas (Cambei & Gowri, 1990; Murray et al., 1989). As sequências nucleotídicas bacterianas, ricas em A+T, podem ser reconhecidas por plantas como sítios de “splice” (Liu, 2009), sinais de poliadenilação (Joshi, 1987; Diehn et al., 1998) ou elementos de desestabilização do RNA, tais como ATTTA (Ohme-Takagi et al., 1993). Portanto, para aumentar a expressão de um gene cry oriundo da bactéria Bt no organismo receptor, o gene deve ser “recodificado”, não apenas para adequá
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Io aos códons preferenciais de aminoácidos, mas também de forma a aproximá-lo do conteúdo de G+C do organismo receptor.
[009] A manipulação genética de genes cry pode se tornar uma forma promissora de melhorar a eficiência e a relação custo/beneficio de bioinseticidas e de plantas transgênicas expressando estes genes. Diferentes isolados de Bt podem mostrar uma amplitude muito grande na atividade tóxica contra a mesma espécie alvo, sendo que um isolado pode ser muito ativo contra uma espécie e virtualmente inativo contra outra (Jarret & Burges, 1982). Algumas combinações de proteínas Cry demonstraram, inclusive, toxicidade sinérgica em relação aos lepidópteros. Estes autores relataram que em bioensaios houve sinergismo entre as proteínas CrylAa e CrylAc, enquanto que a mistura de CrylAa e CrylAb mostrou antagonismo em relação ao controle de Lymantria dispar.
[010] Considerando a diversidade de respostas obtidas pela combinação de proteínas inseticidas Cry e insetos praga, bem como a importância do controle de tais insetos em plantas de cultura, torna-se de particular relevância o estudo que visa à melhor elucidação das características decisivas para a obtenção de efeitos inseticidas satisfatórios, bem como o que objetiva ao desenvolvimento de novas plantas transgênicas resistentes aos insetos.
[011] Em estudos anteriores, isolados de Bt foram testados contra Spodoptera frugiperda ou lagarta do cartucho in vitro, sendo realizada a caracterização molecular daqueles mais eficientes. O isolamento de cepas de Bt foi confirmado por meio de microscópio de contraste de fase, pela observação dos cristais proteicos. Bioensaios para avaliação da toxicidade das cepas de Bt foram então realizados pela exposição de larvas de dois dias de idade, criadas em dieta artificial, a uma suspensão de esporos e cristais. As lagartas (25 larvas/bioensaio/cepa) foram acondicionadas em recipientes plásticos descartáveis (50 mL) a uma temperatura de 27 °C, umidade relativa de 70%, e
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5/53 fotofase de 14 h/10 h. As cepas foram consideradas eficientes quando a mortalidade foi superior a 75%.
[012] A literatura menciona que 13 sorovariedades de B. thuringiensis foram testadas em larvas de S. frugiperda e relata que os serovars (sv) galleriae, aizawai e tolworthi causaram mortalidade acima de 90%. Estes dados foram parcialmente confirmados pelos resultados obtidos no laboratório da Embrapa Milho e Sorgo, onde a sv tolworthi matou acima de 95%. Entretanto, as sv galleriae e aizawai não causaram mortalidade acima de 15%. Bohorova et al. (1996) testaram mais de 400 cepas contra as principais pragas da cultura do milho e, os resultados mostraram que 99% dos isolados causaram mortalidade abaixo de 50%. Estes números são importantes porque mostram a dificuldade em se encontrar isolados de Bt eficientes no controle da lagarta do cartucho. Esta dificuldade em controlar lagartas de S. frugiperda com as proteínas Cry é confirmada por Baum (1999), que afirma poder haver variação dentro do mesmo gênero.
[013] Atualmente, a Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) é uma das técnicas moleculares mais usadas na caracterização de cepas de B. thuringiensis (Carozzi et al. 1991, Cerón et al. 1994, Cerón et al. 1995, Bravo et al. 1998, Valicente et al. 2000). Dentre as cepas mais eficientes da coleção da Embrapa Milho e Sorgo, a maioria dos isolados apresentou os genes crylAb e cry1E, algumas os genes cry1B, cry1D, crylFb e apenas uma cepa até o momento o cry1C (Valicente et al. 2000, Valicente 2003). Bravo et. al 1998, fizeram uma caracterização de genes cry de uma coleção mexicana de B. thuringiensis e encontraram que os genes cry1D e cry1C foram os mais tóxicos para lagartas de S. frugiperda e S. exígua.
[014] Para a produção de plantas transgênicas, tais como, por exemplo, milho transgênico Bt, são necessários três requisitos básicos: (i) regeneração in vitro do tecido vegetal que será transformado; (ii) a metodologia para a inserção do
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6/53 gene cry no genoma da planta e, (iii) a construção gênica, com genes cry e marcadores de seleção.
[015] O desenvolvimento de técnicas de culturas de células e tecidos aliado à tecnologia do DNA recombinante tem ampliado consideravelmente o potencial de utilização dos métodos de cultura in vitro para a produção de plantas de milho transgênicas. Como parte desse processo, o estabelecimento de sistemas de regeneração de plantas a partir de células somáticas, constitui-se em um pré-requisito de fundamental importância. A metodologia mais utilizada para regeneração do milho in vitro é a embriogênese somática, a qual tem a vantagem de produzir uma estrutura bipolar que pode, teoricamente, ser germinada e regenerada em um só passo.
[016] Em particular, no milho, a regeneração de plantas via embriogênese somática pode ocorrer a partir de calos do Tipo I ou Tipo II (Armstrong & Green, 1985). Os calos do Tipo I são compactos, amarelos ou brancos e normalmente capazes de regenerar plantas, os calos descritos como do Tipo II são macios, friáveis e altamente embriogênicos. As culturas formadoras de calos do Tipo II crescem rapidamente, podem ser mantidas por um longo período de tempo e formam um grande número de embriões somáticos facilmente regeneráveis (Vasil, 1987).
[017] Embora calos do Tipo II sejam os mais eficientes na produção de plantas transgênicas de milho, calos do Tipo I podem também ser utilizados. A ocorrência de calos embriogênicos friáveis do Tipo II não é tão comum, apenas um número limitado de genótipos de milho é capaz de expressar este fenótipo em meio de cultivo, notadamente a linhagem A188 (Armstrong & Green, 1985) e o híbrido Hill (Armstrong et al. 1991).
[018] Com o avanço da metodologia do cultivo in vitro e, particularmente, com alterações na composição dos meios de cultura e nas relações e doses dos reguladores de crescimento, passou a ser possível a regeneração de um
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7/53 crescente número de genótipos (Novac et al., 1983; Rapela, 1985; Duncan et al., 1985; Phillips et al., 1988; Prioli & Silva, 1989; Lupotto, 2004; Petrillo et al., 2008). No entanto, a maioria destes genótipos forma apenas calos compactos do Tipo I.
[019] Apesar da maioria dos genótipos de milho, capazes de regenerar plantas, ser de adaptação a clima temperado, genótipos de adaptação tropical capazes de regeneração têm também sido identificados (Carvalho et al., 1994; Bohorova et al., 1995, Santos-Serejo & Aguiar-Perecin, 2000; Petrillo et al., 2008), o que indica a possibilidade de se manipular genótipos elite tropicais via transformação genética. Embriões zigóticos imaturos são os explantes preferidos para a geração de culturas embriogênicas e produção de plantas transgênicas de milho.
[020] Os diferentes métodos de transformação genética de plantas podem ser divididos em dois grupos principais: métodos indiretos e métodos diretos. A transformação genética por meio do método indireto utiliza uma bactéria, Agrobacterium tumefaciens, para introduzir o gene de interesse no genoma da planta.
[021] Durante vários anos, a transformação de monocotiledôneas via Agrobacterium tinha uma eficiência muito baixa. Entretanto, recentemente, esta metodologia de transferência gênica tem se tornado o método de escolha para este grupo de plantas. Este método utiliza um sistema natural de transferência de genes desenvolvido pela Agrobacterium. Agrobacterium é uma bactéria de solo capaz de causar tumores vegetais na região da infecção. Estes tumores resultam da presença do plasmídeo Ti ou plasmídeo indutor de tumor na célula bacteriana. O plasmídeo Ti é uma molécula circular grande (200 a 800 kb) de DNA fita dupla que pode se replicar independentemente do genoma de Agrobacterium tumefaciens (Gelvin, 2003). Localizado no plasmídeo Ti se encontram duas regiões importantes para a transferência de genes da bactéria
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8/53 para a planta, a região do T-DNA e a região vir. As regiões dos T-DNAs de plasmídeos selvagens contêm genes que comandam a produção de opinas e hormônios, tais como auxina e citocinina, pela célula vegetal. As opinas são aminoácidos utilizados apenas pela Agrobacterium como fonte de carbono e nitrogênio, enquanto que os hormônios são responsáveis pela indução de tumores vegetais. O T-DNA tem entre 10 e 30 kb e suas extremidades são delimitados por duas sequências de 25 pb altamente homólogas, denominados extremidades direita e esquerda. Agrobacterium selvagem transfere o seu TDNA através das membranas das células vegetais e o incorpora no DNA genômico da planta. O processamento do T-DNA e sua transferência para a célula vegetal é devido em grande parte à atividade de virulência das proteínas codificadas na região v/r(Gelvin, 2003).
[022] Para viabilizar a utilização da Agrobacterium em processos biotecnológicos de transferência de genes para plantas é necessário que os genes endógenos do T-DNA causadores de tumor sejam inativados e, que os genes exógenos, o gene de interesse (GDI) e o gene de marcador de seleção (GMS), sejam inseridos entre as extremidades direita e esquerda do T-DNA. O plasmídeo recombinante resultante é novamente colocado na Agrobacterium para ser transferido para células vegetais (Gelvin, 2003). Tecidos ou células transformados podem ser utilizados para regeneração de plantas transgênicas (Schafer et al., 1987; Hiei et al., 1994; Ishida et al., 1996).
[023] Por ser muito grande, o plasmídeo Ti é difícil de ser manipulado. Portanto, foram criados os vetores binários (Bevan, 1984), os quais são menores e capazes de multiplicar tanto em Agrobacterium como em E. coli e fáceis de manipular em laboratório. Estes vetores possuem um T-DNA artificial, no qual diferentes transgenes podem ser inseridos e uma origem de replicação compatível com o Ti na Agrobacterium. Os vetores binários são introduzidos em Agrobacterium desarmadas, ou seja, em Agrobacterium que carregam
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9/53 plasmídeos Ti que tiveram a região do T-DNA removida. O Ti de Agrobacterium desarmadas ainda possui a região de virulência (v/7j, sendo seus genes capazes de agir in trans para transferir o T-DNA recombinante do vetor binário (Gelvin, 2003).
[024] Agrobacterium tumefaciens constitui um excelente sistema de introdução de genes em células vegetais uma vez que: (i) o DNA pode ser introduzido em todos os tecidos da planta, o que elimina a necessidade da produção de protoplastos; e, (ii) a integração do T-DNA é um processo relativamente preciso. A região do DNA a ser transferida está definida pelas sequências flanqueadoras, extremidades direita e esquerda. Ocasionalmente se produz reordenações, mas na maioria das vezes a região é inserida intacta no genoma da planta. Normalmente os T-DNA integrados mostram mapas genéticos consistentes e segregação adequados. Ademais, os caracteres introduzidos por esta via têm se mostrado estáveis durante muitas gerações de cruzamentos. Esta estabilidade é crítica quando se pretende comercializar as plantas transgênicas geradas (Hiei et al., 1994; Ishida et al., 1996).
[025] Em particular, para o milho, a técnica de Agrobacterium foi relatada resultar em alta eficiência com alto número de eventos contendo apenas uma ou um baixo número de cópias do transgene no genoma quando comparado com a biobalística (Ishida et al., 1996; Zhao et al. 2001; Gordon-Kamm et al. 1990; Frame et al. 2002; Lupotto et al. 2004; Huang and Wei 2005; Ishida et al. 2007).
[026] Transgenes, isto é, os genes que são inseridos via técnicas de biologia molecular, são constituídos basicamente da região codificadora do gene de interesse ou do gene marcador de seleção e de sequências reguladoras da expressão gênica. O gene de interesse (GDI) e o gene marcador de seleção (GMS) são sequências de codificação ou ORF (Open Reading Frame) de uma determinada proteína que, quando expressa, define uma característica de
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10/53 interesse. O GMS serve para identificar e selecionar as células que tenham ο DNA heterólogo integrado no genoma. São fundamentais para o desenvolvimento de tecnologias de transformação de plantas, pois o processo de transferência de um transgene para uma célula receptora e sua integração no genoma é muito ineficiente na maioria dos experimentos, de forma que as chances de recuperação de linhas transgênicas sem seleção são geralmente muito baixas. Atualmente, os GMS mais utilizados para a produção de plantas transgênicas, tais como o milho, são aqueles que conferem tolerância a herbicidas. Dentre estes, os genes bar, isolados de Streptomyces hygroscopicus e o gene pat, isolado de Streptomyces viridochromogenes, ambos codificando a enzima fosfinotricina acetiltransferase (Pat) (De Block et al.,1989) são frequentemente utilizados (Gordon-Kamm et al. 1990; Zhao et al. 2001, Ishida et al 2007).
[027] Tanto a sequência de nucleotídeos que codifica para a proteína de interesse, quanto aquela que codifica para a proteína utilizada na seleção dos calos transgênicos é acompanhada por sequências reguladoras, tais como promotores e terminadores, os quais são responsáveis pelo controle da expressão gênica.
[028] Promotores são sequências de DNA, normalmente presentes nas extremidades 5’ de uma região codificadora, usadas pela RNA polimerase e fatores de transcrição para iniciar o processo de transcrição gênica (Buchanan et al., 2000). O promotor viral 35S isolado do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV35S) é um dos mais utilizados para direcionar alto nível de expressão constitutiva em plantas (Odell et al., 1985), entretanto seu funcionamento em monocotiledôneas não é tão eficiente quando em dicotiledôneas. O promotor mais utilizado para direcionar a expressão de uma proteína constitutiva em milho é atualmente o promotor isolado do gene da ubiquitina de milho Ubi1 (Christensen & Quail, 1996).
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11/53 [029] As regiões 3’ UTRs, também conhecidas como regiões terminadoras, são utilizadas para sinalizar o término da transcrição (Lessard et al. 2002), impedindo que ocorra a produção de moléculas quiméricas de RNA e, consequentemente, a formação de novas proteínas, se o complexo da polimerase continuar transcrevendo além do seu sinal de término. As sequências 3’ UTRs mais utilizadas em construções gênicas para transformação de milho incluem as regiões 3’ do gene da nopalina sintase de Agrobacterium (nos) (Depicker et al., 1982), do CaMV35S (Frame et al., 2002), e a do gene inibidor de proteinase pinllde batata (An et al., 1989).
[030] Embora para algumas das técnicas acima reportadas se tenha dado ênfase aos resultados obtidos em milho, as técnicas para obtenção de plantas transgênicas são de conhecimento geral de um técnico no assunto, e poderão variar a depender da planta de interesse a ser utilizada. Tal técnico no assunto poderá, sem experimentação indevida, com base em seu conhecimento geral e na literatura científica disponível, facilmente adaptar as metodologias preferenciais reportadas no presente documento de forma a obter plantas transgênicas diversas.
[031] Apesar do aumento do conhecimento científico acerca do papel das proteínas Cry na atividade inseticida contra pragas de culturas, as abordagens até o momento não se mostraram promissoras o suficiente quando se considera que, no caso de algumas culturas, ocorre acentuada resistência das pragas àquelas proteínas, de modo que novas estratégias se fazem constantemente necessárias.
[032] Em particular, no caso de culturas de milho, já se observou que as plantas transgênicas existentes no mercado brasileiro, como por exemplo, às que possuem o gene crylFem seu genoma (por exemplo, Herculex HX), não controlam mais, de forma adequada, algumas das espécies de pragas, tais como populações de lagartas das espécies Spodoptera frugiperda e Diatrea
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12/53 saccharalis.
[033] Neste sentido, para satisfazer as necessidades da arte anterior, desenvolveu-se a presente invenção, que revela uma nova molécula de ácido nucleico cry 1 Da códon-otimizada, bem como a geração de plantas de milho transgênicas expressando tal gene de forma eficiente, obtendo, assim, efetivo controle de diversas espécies de pragas invertebradas, incluindo daquelas que se apresentavam resistentes a outras culturas de milho transgênicas à época da presente invenção (por exemplo, Herculex HX). Atualmente, no mercado brasileiro, não existe nenhuma planta transgênica de milho expressando a proteína CrylDa isolada de Bacillus thuringiensis para o controle de, por exemplo, Spodoptera frugiperda, bem como, considerando-se as plantas transgênicas de milho existentes no estado da técnica, não se pode esperar que àquelas plantas ou seus insertos gênicos inseticidas levariam, com expectativa razoável de sucesso, ao controle eficiente de diferentes espécies de pragas ou mesmo de populações diversas daquela espécie.
[034] As sequências cry 1 Da, tal como reveladas pela presente invenção, e possuindo conteúdo de G+C otimizado, levaram ao controle de pragas com eficiência muito elevada, tendo sido inclusive efetivas contra pragas resistentes das culturas de milho existentes à época da presente invenção, resolvendo um problema do estado da técnica. Conforme apontado anteriormente, ainda que eventual proteína seja igual ou semelhante às proteínas Cry1 Da já reportadas, as sequências nucleotídicas, conforme aqui reveladas, garantiram expressão aprimorada e possibilitaram alcançar os resultados excepcionais, conforme aqui exemplificados, e que não poderíam ser esperados, com expectativa razoável de sucesso, em vista dos ensinamentos do estado da técnica.
[035] Neste sentido, a presente invenção representa, de forma robusta, um avanço em relação ao estado da técnica.
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Breve Descrição das Sequências [036] SEQ ID NO: 1 se refere à sequência de ácido nucleico códon-otimizada do gene cry 1 Da da presente invenção.
[037] SEQ ID NO: 2 se refere à sequência de ácido nucleico do gene crylDa isolado da bactéria Bacillus thuringiensis, a partir da qual realizou-se a otimização.
[038] SEQ ID NO: 3 se refere à sequência de aminoácidos traduzida a partir de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 (proteína Cry1 Da).
[039] SEQ ID NO: 4 se refere à sequência de ácido nucleico da região promotora do gene da ubiquitina do milho (ubi), utilizada na construção da presente invenção.
[040] SEQ ID NO: 5 se refere à sequência de ácido nucleico da região terminadora 3’ UTR do gene da nopalina sintase de Agrobacterium (nos), utilizada na construção da presente invenção.
[041] SEQ ID NO: 6 se refere à sequência de ácido nucleico da região promotora do gene do gene CaMV 35S duplicado do virus do mosaico da couve-flor, utilizada na construção da presente invenção.
[042] SEQ ID NO: 7 se refere à sequência de ácido nucleico da região de enhancer traducional do virus Tobacco etch (tev), utilizada na construção da presente invenção.
[043] SEQ ID NO: 8 se refere à sequência de ácido nucleico da região codificadora de gene de seleção de fosfinotricina acetil transferase (bar) de Streptomyces hygroscopicus, utilizada na construção da presente invenção.
[044] SEQ ID NO: 9 se refere à sequência de ácido nucleico da região terminadora 3’ UTR do gene Tvsp que codifica para a proteína de reserva vegetativa de soja, utilizada na construção da presente invenção.
[045] SEQ ID NO: 10 se refere à sequência de ácido nucleico da construção de ácido nucleico da presente invenção (compreendendo o promotor do gene
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14/53 da ubiquitina de milho (ubi) (SEQ ID NO: 4), sequência codificadora códonotimizada da presente invenção (SEQ ID NO: 1) e sequência terminadora 3’ UTR do gene da nopalina sintase (nos)) (SEQ ID NO: 5) - UBI::cry1 Da::NOS. [046] SEQ ID NO: 11 se refere à sequência de ácido nucleico da construção de ácido nucleico da presente invenção, em sua integridade, compreendo as (região terminadora 3’ UTR do gene Tvsp (SEQ ID NO: 9); região codificadora de gene de seleção de fosfinotricina acetil transferase (ba/j (SEQ ID NO: 8), região de enhancer trad u ci on al (tev) (SEQ ID NO: 7); região promotora do gene do gene CaMV 35S duplicado (SEQ ID NO: 6), região promotora do gene da ubiquitina (ubi) (SEQ ID NO: 4); sequência de ácido nucleico códon-otimizada do gene crylDa da presente invenção (SEQ ID NO: 1); região terminadora 3’ UTR do gene da nopalina sintase (SEQ ID NO: 5)).
[047] SEQ ID NO: 12 se refere à sequência de ácido nucleico 5’-3’ do primer U4 utilizado nos experimentos de clonagem da construção gênica.
[048] SEQ ID NO: 13 se refere à sequência de ácido nucleico 5’-3’ do primer U1 utilizado nos experimentos de clonagem da construção gênica.
[049] SEQ ID NO: 14 refere à sequência de ácido nucleico 5’-3’ do primer BAR direto (forward) utilizado nos experimentos de clonagem da construção gênica. [050] SEQ ID NO: 15 refere à sequência de ácido nucleico 5’-3’ do primer BAR reverso (reverse) utilizado nos experimentos de clonagem da construção gênica.
[051] SEQ ID NO: 16 refere à sequência de ácido nucleico 5’-3’ do primer Ubi direto (forward) utilizado nos experimentos de clonagem da construção gênica. [052] SEQ ID NO: 17 refere à sequência de ácido nucleico 5’-3’ do primer CrylDa reverso (reverse) utilizado nos experimentos de clonagem da construção gênica.
[053] SEQ ID NO: 18 refere à sequência de ácido nucleico 5’-3’ do primer do gene cry1 Da direto (forward) utilizado nos experimentos de seleção do gene.
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15/53 [054] SEQ ID NO: 19 refere à sequência de ácido nucleico 5’-3’ do primer do gene cry1 Da reverso (reverse) utilizado nos experimentos de seleção do gene.
[055] SEQ ID NO: 20 à sequência de ácido nucleico 5’-3’ do primer do gene crylDa reverso (forward) utilizado nos experimentos de isolamento do gene completo da cepa Bt 1132C.
[056] SEQ ID NO: 21 refere à sequência de ácido nucleico 5’-3’ do primer do gene cry 1 Da reverso (reverse) utilizado nos experimentos de isolamento do gene completo da cepa Bt 1132C.
Breve Descrição das Figuras [057] A Figura 1 se refere ao alinhamento da sequência de ácido nucleico códon-otimizada do gene crylDa da presente invenção (SEQ ID NO: 1) em relação à sequência de ácido nucleico do gene crylDa isolado da bactéria Bacillus thuringiensis, a partir da qual realizou-se a otimização (SEQ ID NO: 2).
[058] A Figura 2 se refere ao desenho representativo do vetor de expressão em plantas pTF101.1. RB/R25: Borda direita do T-DNA; LB: borda esquerda do T-DNA; 2XP35S: Promotor CaMV35S duplicado do vírus do mosaico (Odell et al., 1985); TEV enhancer, enhancertraducional do vírus Tobacco etch (Gallie et al, 1995; Wilson, 1999); bar ORF: região codificadora do gene fosfinotricina acetil transferase de Streptomyces hygroscopicus que confere resistência ao herbicida fosfinotricina e seus derivados (Thompson et al, 1987; White et al, 1990; Becker et al, 1992); Tvsp: terminador 3’ do gene que codifica para a proteína de reserva vegetativa de soja (Mason et al., 1993); aadA: gene aminoglicoside 3’-adenilitransferase de Shigella flexneris 2a que confere resistência ao antibiótico espectinomicina e estreptomicina (Chinault et al., 1986); pVS1: a ampla gama de plasmídeo hospedeiro de Pseudomonas (Hajdukiewicz et al, 1994); múltiplos sítios de clonagem formado pelas enzimas de restrição Pvull, EcoRI, Saci, Kpnl, Smal, Xmal, BamHI, Xbal, Sail, Pstl, Hindlll, Pstl.
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16/53 [059] A Figura 3 se refere ao desenho representativo das construções gênicas Ubi::cry1 Da::NOS e 2x35S::bar::Tvsp inseridas nos sítios das enzimas Hind III e EcoRI do vetor binário pTF101.1, entre as bordas direita e esquerda do TDNA.
[060] A Figura 4 se refere a um resultado representativo do bioensaio em laboratório de alimentação de Spodoptera frugiperda em (A) milho nãotransgênico e (B) milho transgênico compreendendo a molécula de ácido nucléico códon-otimizada crylDa da presente invenção (SEQ ID NO: 1).
[061] A Figura 5 se refere a um resultado representativo do bioensaio em laboratório de alimentação de Diatrea saccharalis em (A) milho não-transgênico e (B) milho transgênico compreendendo a molécula de ácido nucléico códonotimizada crylDa da presente invenção (SEQ ID NO: 1). Em (C) observam-se lagartas crescidas em folhas de milho não transgênico (lagarta da esquerda) e milho transgênico da presente invenção (lagarta da direita).
[062] A Figura 6 se refere ao resultado em gráfico da nota de injúria (±IC, P = 0,05) causada pela infestação de Spodoptera frugiperda em escala de Carvalho, 1970. Trat 1 = milho transgênico compreendendo a molécula de ácido nucléico códon-otimizada crylDa da presente invenção (SEQ ID NO: 1) + População de lagartas resistentes à Cry1 F; Trat 2 = Linhagem de milho L3 não transgênico + População de lagartas resistentes à Cry1F; Trat 3 = milho transgênico compreendendo a molécula de ácido nucléico códon-otimizada crylDa da presente invenção (SEQ ID NO: 1) + População de lagartas suscetíveis; Trat 4 = Linhagem de milho L3 não transgênico + População de lagartas suscetíveis.
[063] A Figura 7 se refere ao resultado em foto da nota de injúria acima reportada demonstrando (A) o milho transgênico compreendendo a molécula de ácido nucléico códon-otimizada crylDa da presente invenção (SEQ ID NO: 1) e (B) planta controle não transgênica infestada com lagartas S. frugiperda
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17/53 resistentes ao cry1 F.
Descrição Resumida da Invenção [064] A presente invenção se refere a novas moléculas de ácido nucleico códon-otimizadas crylDa a partir de uma sequência de gene isolado da bactéria Bacillus thuringiensis. Estas moléculas são utilizadas para a produção de construções de ácido nucléico, vetores e células hospedeiras, permitindo a produção de plantas transgênicas, tais como milho, resistentes a pragas invertebradas, tais como insetos da ordem Lepidoptera, particularmente Spodoptera frugiperda (Noctuidae, Lepidoptera) e Diatrea saccharalis (Crambidae, Lepidoptera). Também são objetos da presente invenção células vegetais e a plantas transgênicas compreendendo as moléculas ou as construções da invenção. Em especial, as plantas transgênicas, de acordo com a presente invenção, são capazes de controlar as lagartas das mencionadas espécies que se tornaram resistentes às plantas contendo o gene cry1F. Ainda, a presente invenção refere-se a um método para transformar uma célula, a um método de controle de pragas invertebradas de plantas de cultivo e aos usos das moléculas ou construções de ácido nucleico para a produção de plantas transgênicas e para o controle de pragas invertebradas.
[065] Assim, um primeiro objeto da presente invenção é uma molécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1.
[066] Em uma realização preferencial da presente invenção, a dita molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1.
[067] Em uma outra realização preferencial da presente invenção, a dita molécula de ácido nucleico é conforme definida na SEQ ID NO: 1.
[068] Um segundo objeto da presente invenção é uma construção de ácido
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18/53 nucleico, compreendendo a molécula de ácido nucleico cryWa códonotimizada, compreendendo a sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1. [069] Em uma realização preferencial da presente invenção, a dita construção compreende adicionalmente uma sequência promotora ligada operativamente à mencionada molécula de ácido nucleico, em que dita sequência promotora é preferencialmente a sequência promotora da ubiquitina de milho (ubi).
[070] Em uma outra realização preferencial da presente invenção, a dita construção compreende adicionalmente uma sequência terminadora 3’ UTR, em que dita sequência terminadora 3’ UTR é preferencialmente a sequência terminadora do gene da nopalina sintase (nos).
[071] Em uma outra realização preferencial da presente invenção, a dita construção compreende adicionalmente um gene de seleção, operativamente ligado a pelo menos uma sequência promotora e pelo menos uma sequência terminadora, em que a sequência promotora é preferencialmente a sequência promotora do gene CaMV 35S duplicado do vírus do mosaico da couve-flor e a sequência terminadora é preferencialmente a sequência terminadora do gene Tvsp que codifica para a proteína de reserva vegetativa de soja.
[072] Em uma outra realização preferencial da presente invenção, a dita construção compreende adicionalmente outras sequências reguladoras.
[073] Em uma outra realização preferencial da presente invenção, a construção compreende a sequência de ácido nucleico definida como SEQ ID NO: 10.
[074] Um terceiro objeto da presente invenção é um vetor, compreendendo a molécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a
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19/53 sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1 ou a construção de ácido nucleico da presente invenção, conforme definida no presente documento.
[075] Um quarto objeto da presente invenção é uma célula hospedeira, compreendendo a molécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico ou o vetor da presente invenção, conforme definidos no presente documento.
[076] Um quinto objeto da presente invenção é uma célula vegetal, compreendendo a molécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico da presente invenção ou o vetor, conforme definidos no presente documento.
[077] Um sexto objeto da presente invenção é uma planta transgênica, compreendendo a molécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico da presente invenção, conforme definida no presente documento.
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20/53 [078] Um sétimo objeto da presente invenção é um método de transformção de célula, compreendendo a introdução em dita célula a molécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico ou o vetor da presente invenção, conforme definidos no presente documento. Em uma realização preferencial da presente invenção, o dito método compreende a integração da molécula de ácido nucleico no genoma da célula.
[079] Um oitavo objeto da presente invenção é um método de produção de uma planta transgênica, compreendendo a transformação de célula vegetal com a molécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico ou o vetor da presente invenção, conforme definidos no presente documento. Em uma realização preferencial da presente invenção, o dito método compreende adicionalmente a seleção de uma célula vegetal transformada com a molécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico ou o vetor da presente invenção, conforme definidos no presente documento.
[080] Em uma outra realização preferencial da presente invenção, o dito método compreende adicionalmente a regeneração de uma planta transgênica
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21/53 a partir da mencionada célula vegetal.
[081] Em outra realização preferencial da presente invenção, a dita planta transgênica é resistente a pragas de cultura, em que a planta transgênica é preferencialmente uma monocotiledônea, preferencialmente uma planta de milho, arroz, cana-de-açúcar, sorgo, trigo ou braquiária.
[082] Em outra realização preferencial da presente invenção, a dita praga de cultura é preferencialmente um inseto, mais preferencialmente da ordem Lepidoptera, mais preferencialmente ainda é Spodoptera frugiperda e/ou Diatrea saccharalis.
[083] Um nono objeto da presente invenção é um método de controle de pragas invertebradas de plantas de cultivo, em que as plantas de cultivo compreendem a molécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico da presente invenção, conforme definida no presente documento, em que o método compreende o plantio de sementes obtidas a partir de uma planta compreendendo a molécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico da presente invenção, conforme definida no presente documento, em uma área de cultivo de plantas de cultura suscetíveis a pragas invertebradas.
[084] Um décimo objeto da presente invenção é um uso da molécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada, compreendendo uma sequência de ácido
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22/53 nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico da presente invenção, conforme definida no presente documento, em que o uso é para a produção de uma planta transgênica, em que a planta transgênica é preferencialmente uma monocotiledônea, preferencialmente uma planta de milho, arroz, cana-deaçúcar, sorgo, trigo ou braquiária.
[085] Em uma realização preferencial da presente invenção, o dito uso compreende que a planta transgênica é resistente a pragas invertebradas.
[086] Um décimo primeiro objeto da presente invenção é um uso da molécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico da presente invenção, conforme definida no presente documento, em que o uso é para o controle de pragas invertebradas, preferencialmente insetos.
[087] Qualquer um dentre os objetos ou suas realizações preferenciais acima descritos podem servir de base para compor os outros objetos e suas realizações preferenciais, ainda que tal(tais) relação(ões) não tenha(m) sido explicitamente descrita(s).
[088] Os inventores da presente invenção revelaram que, por meio da molécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada, conforme definida no presente documento, obteve-se plantas de milho transgênicas resistentes a pragas de cultura, incluindo pragas já resistentes às plantas transgênicas de milho do estado da técnica.
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Descrição Detalhada da Invenção
Definições [089] Salvo se definido de outro modo, todos os termos da técnica, anotações e outras terminologias científicas aqui utilizadas destinam-se a ter os significados normalmente compreendidos pelos técnicos no assunto do campo da presente invenção. Em alguns casos, os termos com significados comumente entendidos são definidos no presente documento com a finalidade de trazer clareza e/ou para pronta referência, e a inclusão de tais definições no presente documento não deve ser interpretada, necessariamente, como representando uma diferença substancial em relação ao que é geralmente entendido no estado da técnica.
[090] As técnicas e os procedimentos descritos ou referidos pelo presente documento são geralmente bem compreendidos e empregados usando a metodologia convencional pelos técnicos no assunto. Conforme apropriado, os processos que envolvem o uso de kits e reagentes disponíveis comercialmente são geralmente realizados de acordo com protocolos e/ou parâmetros definidos pelo fabricante, salvo quando indicado de outra forma.
[091] Vale ressaltar que a presente invenção, onde for apropriado, não se limita à metodologia, protocolos, linhagem de células, gêneros ou espécies de animais, construções e reagentes específicos descritos, os quais, de forma óbvia, podem variar. Além disso, a terminologia utilizada no presente documento é apenas para o propósito de descrever exemplos de realizações específicas, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção.
[092] Ao longo do presente documento, as formas singulares “um”, “uma” e “o”, “a”, ou formas singulares de qualquer termo ou expressão, incluem as referências ao plural, a menos que o contexto dite claramente de outra forma.
[093] Ao longo do presente documento, a palavra “compreende”, e quaisquer variações como “compreendem” ou “compreendendo”, devem ser interpretadas
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24/53 como “termos abertos”, podendo implicar na inclusão de elementos ou grupos de elementos adicionais, os quais não foram explicitamente descritos, não possuindo caráter limitativo.
[094] Ao longo do presente documento, a palavra “consiste”, e quaisquer variações como “consistem” ou “consistindo”, devem ser interpretadas “termos fechados”, não podendo implicar na inclusão de elementos ou grupos de elementos adicionais, os quais não foram explicitamente descritos, possuindo caráter limitativo.
[095] Ao longo do presente documento, os valores exatos ou faixas de valores exatos fornecidos com relação a um fator, quantidade, concentração ou preferência particular devem ser interpretados como também fornecendo valores ou faixas de valores aproximados correspondentes, tal como por meio da expressão “cerca de”.
[096] Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “preferencialmente”, “particularmente”, “por exemplo”, “como”, “tal como”, “mais particularmente” e similares, e suas variações, devem ser interpretadas como características inteiramente opcionais, realizações preferenciais ou exemplificações possíveis não exaustivas, sem conferir caráter limitativo de escopo.
[097] Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “ácidos nucleicos”, “nucleotídeos” e similares devem ser interpretadas como ácidos nucleicos ou nucleotídeos que ocorrem naturalmente, sintéticos ou artificiais. Compreendem desoxirribonucleotídeos (DNA) ou ribonucleotídeos (RNA) ou qualquer análogo de nucleotídeo e polímeros ou híbridos dos mesmos na configuração sense ou antisense, de fita simples ou fita dupla. Salvo quando disposto de outra forma, uma sequência de ácido nucleico específica também abrange implicitamente variantes conservadoramente modificadas desta (por exemplo, substituições de códons degenerados) e sequências
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25/53 complementares, bem como as sequências explicitamente indicadas. O termo “ácido nucleico” é utilizado de maneira alternada no presente documento com os termos “gene”, “cDNA”, “mRNA”, “oligonucleotídeo”, “molécula de ácido nucleico” ou “primer.
[098] As expressões “molécula de ácido nucleico”, “sequência de ácido nucleico” e similares referem-se a um polímero de bases de DNA ou RNA de fita simples ou fita dupla, lido da extremidade 5’ para a extremidade 3’. Inclui DNA cromossômico, plasmídeo de autorreplicação, polímeros infecciosos de DNA ou RNA que desempenham um papel principalmente estrutural, entre outros. Também se referem a uma lista consecutiva de abreviaturas, letras, caracteres ou palavras, que representam nucleotídeos ou genes, conforme usualmente empregados no campo técnico da presente invenção.
[099] Ao longo do presente documento, a expressão “códon-otimizada”, quando se referir às moléculas ou às sequências da presente invenção, deve ser interpretada como a molécula ou sequência de nucleotídeos que passou por um processo de adequação da sua constituição de nucleotídeos (conteúdo C+G e A+T) à constituição do organismo hospedeiro ou receptor, para que pudesse expressar de modo mais eficiente uma proteína heteróloga. Processos de otimização de códon são conhecidos por um técnico no assunto.
[0100] Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “similaridade de sequência”, “identidade” e similares, com relação a uma outra sequência, deve ser interpretada como a porcentagem de nucleotídeos na sequência que é idêntica aos nucleotídeos de outra sequência, após o alinhamento das sequências e a introdução de gaps, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência. De acordo com a presente invenção, a expressão “pelo menos 70% de similaridade” é definida como similaridade ou identidade de 70 a 100%. Preferencialmente, a porcentagem de similaridade é de pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo
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26/53 menos 90%, pelo menos 95% ou 100%.
[0101] Ao longo do presente documento, a expressão “construção de ácido nucléico” deve ser interpretada como uma construção de DNA, de filamento único ou duplo, linear ou circular, que é capaz de resultar na expressão da proteína de interesse. Tipicamente, compreende uma sequência promotora e uma sequência codificadora. Ainda, tipicamente, as construções podem compreender também uma região 3’ UTR. Tais construções podem compreender ainda outras sequências reguladoras ou sinalizadoras conhecidas por um técnico no assunto. Preferencialmente, a construção da presente invenção compreende a sequência de ácido nucléico definida como SEQ ID NO: 10.
[0102] Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “promotor”, “sequência promotora” e similares devem ser interpretadas como uma sequência de DNA que, uma vez operativamente ligada a uma sequência de nucleotídeos de interesse, é capaz de controlar a transcrição da sequência de nucleotídeos de interesse em RNA. Um promotor está localizado a 5’ (ou à montante) em relação ao local de início da transcrição de uma sequência de nucleotídeos de interesse cuja transcrição em mRNA ele controla e fornece um sítio para a ligação específica da RNA polimerase e outros fatores de transcrição para o início a transcrição. Pode incluir outras sequências reguladoras, conhecidas por um técnico no assunto. De acordo com a presente invenção, o promotor pode ser heterólogo ou homólogo à respectiva célula ou hospedeiro. Uma sequência de ácido nucléico é “heteróloga” a um organismo ou a uma segunda sequência de ácido nucléico se ela se origina a partir de uma espécie diferente ou, se a partir da mesma espécie, é modificada de sua forma original.
[0103] Podem ser diversos os promotores adequados para a realização da presente invenção. Promotores não exaustivos adequados são, por exemplo,
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27/53 os promotores 19S e 35S do virus do mosaico da couve-flor CaMV e do virus do mosaico da escrofulária FMV, duplicados ou não, os promotores de Arabidopsis e de ubiquitina de milho (ubi), os promotores da nopalina sintase (nos) e da octopina sintase (ocs), o promotor induzível pela luz da subunidade pequena de ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase (ssRUBISCO), entre outros. Preferencialmente, a sequência promotora é a sequência promotora da ubiquitina de milho (ubi), definida como SEQ ID NO: 4, e a sequência promotora do gene CaMV 35S duplicado do vírus do mosaico da couve-flor, definida como SEQ ID NO: 6.
[0104] Ao longo do presente documento, a expressão “sequência terminadora 3’ UTR” deve ser interpretada como a sequência terminadora 3’ da região não traduzida, que se estende a partir do códon de terminação. Podem ser diversas as sequências terminadoras 3’ UTR adequadas para a realização da presente invenção. Sequências terminadoras 3’ UTR não exaustivas adequadas são, por exemplo, a sequência terminadora nopalina sintase (nos) de Agrobacterium, a sequência Tvsp do gene que codifica para a proteína de reserva vegetativa de soja, a região 3’ do CaMV 35S e a do gene inibidor de proteinase pinll de batata. Preferencialmente, a sequência terminadora 3’ UTR é a sequência terminadora nopalina sintase (nos) de Agrobacterium, definida como SEQ ID NO: 5, e a sequência Tvsp do gene que codifica para a proteína de reserva vegetativa de soja, definida como SEQ ID NO: 9.
[0105] Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “gene de seleção”, “marcador selecionável”, “gene marcador de seleção (GMS)” e similares devem ser interpretadas como genes que produzem um produto, o qual serve para selecionar ou diferenciar a célula ou tecido que o expressa, das demais células ou tecidos, os quais não o expressam. Podem ser diversos os genes de seleção adequados para a realização da presente invenção. Genes se seleção não exaustivos adequados são, por exemplo, GUS (sequência de
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28/53 codificação para β-glucuronidase), GFP (sequência de codificação para a proteína fluorescente verde), LUX (gene de codificação para luciferase), genes marcadores de resistência a antibióticos (como, por exemplo, transposons Tns (bla), Tn5 (nptll), TN7 (dhfr), penicilinas, canamicina, neomicina, metotrexato, tetraciclina, etc.) ou genes de tolerância a herbicidas (como o da enzima 5enol-piruvil shiquimato fosfato sintase (EPSPS) modificado, gene de fosfinotricina acetil transferase (bar) de Streptomyces hygroscopicus, definido como SEQ ID NO: 8, gene pat, isolado de Streptomyces viridochromogenes, entre outros). O gene de seleção, de acordo com a presente invenção, é operativamente ligado a pelo menos uma sequência promotora e pelo menos uma sequência terminadora. Preferencialmente, a sequência promotora é a do gene CaMV 35S duplicado do vírus do mosaico da couve-flor e a sequência terminadora é a sequência Tvsp do gene que codifica para a proteína de reserva vegetativa de soja. No entanto, outras sequências promotoras e terminadoras adequadas podem também ser utilizadas, como, por exemplo, às sequências relacionadas no presente documento.
[0106] Ao longo do presente documento, a expressão “outras sequências reguladoras” refere-se a, por exemplo, enhancers e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação), que podem estar localizados à montante (região 5’ UTR) ou à jusante (região 3’ UTR), ou mesmo dentro ou entre outras sequência nucleotídicas descritas na invenção. Preferencialmente, a sequência reguladora é sequência de ácido nucleico da região de enhancer traducional do vírus Tobacco etch (tev), definida como SEQ ID NO: 7. Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), e Gruber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, eds. Glick e Thompson, Capítulo 7, 89-108, CRC Press; Boca Raton, Florida, incluídos no presente como
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29/53 referência. Sequências reguladoras incluem as que direcionam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras e as que direcionam a expressão direta da sequência de nucleotídeos somente em certas células hospedeiras ou sob certas condições. [0107] Ao longo do presente documento, o termo “transformação” e similares deve ser interpretado como um processo para a introdução de DNA heterólogo em uma célula, tecido vegetal ou planta. Pode ocorrer sob condições naturais ou artificiais, como pelo uso de vários métodos bem conhecidos na técnica, seja em uma célula hospedeira procarionte ou eucarionte. O método é geralmente selecionado com base na célula hospedeira que será transformada e pode incluir, mas não se limitar a, infecção viral, eletroporação, lipofecção, bombardeamento de partículas (biobalística) e mediada por Agrobacterium.
[0108] Uma das realizações da presente invenção refere-se a um método de transformação celular. Qualquer método de transformação celular está incluído no escopo da presente invenção, não sendo de particular relevância para a obtenção das realizações da invenção, desde que inclua a introdução em dita célula, por meios conhecidos por um técnico no assunto, dajnolécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico da presente invenção, conforme definida no presente documento^Preferencialmente, a molécula de ácido nucléico integra-se no genoma da célula.
[0109] Ao longo do presente documento, o termo “transgene” deve ser interpretado como qualquer sequência de ácido nucleico que é introduzida em uma célula por meio de manipulações experimentais, podendo ou não ser integrado ao genoma. Um transgene pode ser uma “sequência de DNA
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30/53 endógeno”, ou “sequência de DNA exógeno” (ou seja, “heterólogo”). A expressão “sequência de DNA endógeno” refere-se a uma sequência de nucleotídeos que é naturalmente encontrada na célula na qual é introduzida. A expressão “sequência de DNA exógeno” refere-se a uma sequência de nucleotídeos que não é naturalmente encontrada na célula na qual é introduzida. O termo “transgênico”, quando se refere a um organismo transformado, significa um organismo transformado com uma molécula de DNA recombinante que compreende preferencialmente um promotor adequado operacionalmente ligado a uma sequência de DNA de interesse.
[0110] Ao longo do presente documento, o termo “vetor” deve ser interpretado como uma construção contendo uma sequência de DNA que é operativamente ligada a uma ou mais sequências controle adequadas capazes de levar à expressão da dita sequência de DNA em um hospedeiro adequado. Tais sequências controle incluem um promotor para efetuar a transcrição, uma sequência operadora opcional para o controle de tal transcrição, uma sequência de codificação dos sítios de ligação adequados do mRNA ao ribossomo, e às sequências que controlam o término da transcrição e tradução, por exemplo.
[0111] Podem ser diversos os vetores adequados para a realização da presente invenção. Vetores são, por exemplo, fagos, vírus como SV40, CMV, baculovírus, adenovirus, transposons, elementos IS, plasmídeos, fagomídeos, cosmídeos, DNA linear ou circular. Esses vetores podem ser replicados de forma autônoma no organismo hospedeiro ou ser replicados pelo cromossomo. O vetor pode, também, ser um plasmídeo. De acordo com o presente documento, os termos “plasmídeo” e “vetor” são algumas vezes utilizados de forma alternada. Preferencialmente, o vetor, de acordo com a presente invenção, compreende a molécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de
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31/53 similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico, conforme definida no presente documento.
[0112] Ao longo do presente documento, as expressões “célula hospedeira”, “organismo hospedeiro” e similares devem ser interpretadas como sendo o organismo hospedeiro específico ou a célula alvo específica, mas também como sendo os descendentes ou potenciais descendentes desses organismos ou células. Uma vez que, devido à mutação ou aos efeitos ambientais, determinadas modificações podem surgir em gerações sucessivas, esses descendentes não precisam ser necessariamente idênticos à célula parental. No entanto, ainda estão incluídos no escopo de proteção da presente invenção. De acordo com a presente invenção, as células hospedeiras podem ser procarióticas ou eucarióticas. Preferencialmente, a células hospedeira, de acordo com a presente invenção, é uma célula hospedeira de planta. Preferencialmente, compreende a molécula de ácido nucleico crylDa códonotimizada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico ou o vetor da presente invenção, conforme definidos no presente documento.
[0113] Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “célula vegetal transgênica”, “planta transgênica” e similares devem ser interpretadas como células ou plantas que possuem e preferencialmente expressam, por meio de manipulações experimentais, um transgene, bem como também se referem à progênie de uma planta transgênica e gerações subsequentes de plantas, conforme acima.
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32/53 [0114] Ao longo do presente documento, o termo “planta” e similares deve ser interpretado como sendo a parte ou o todo do organismo vegetal. Por “parte”, neste contexto, entende-se células vegetais e tecidos, órgãos e partes de plantas em todas as suas manifestações, como sementes, folhas, anteras, fibras, tubérculos, raízes, pelos de raízes, caules, embrião, calos, cotilédones, pecíolos, material coletado, tecido vegetal, tecido reprodutivo e culturas de células. As plantas transgênicas, de acordo com a presente invenção, podem ser geradas e autofecundadas ou cruzados com outros indivíduos a fim de obter plantas transgênicas adicionais. Plantas transgênicas também podem ser obtidas por propagação vegetativa de células vegetais transgênicas.
[0115] Qualquer planta transformada obtida de acordo com a invenção pode ser usada em um esquema de melhoramento convencional ou na propagação vegetal in vitro para produzir mais plantas transformadas com as mesmas características e/ou podem ser usadas para introduzir a mesma característica em outras variedades da mesma espécie ou de espécies relacionadas. Essas plantas também são parte da invenção. Sementes obtidas a partir das plantas transformadas geneticamente também contêm a mesma característica e são parte da invenção. A presente invenção é aplicável a qualquer planta e cultura que possa ser transformada com qualquer um dos métodos de transformação conhecidos pelos técnicos no assunto. As plantas, de acordo com a presente invenção, podem ser plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Plantas monocotiledôneas preferenciais incluem, mas não estão limitadas a plantas de milho, arroz, cana-de-açúcar, sorgo, trigo ou braquiária, mais preferencialmente milho. Ainda, preferencialmente, as plantas de acordo com a presente invenção são plantas transgênicas resistentes a pragas de cultura.
[0116] Uma das realizações da presente invenção refere-se a um método de produção de uma planta transgênica. Qualquer método de produção de uma planta transgênica está incluído no escopo da presente invenção, não sendo de
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33/53 particular relevância para a obtenção das realizações da invenção. Preferencialmente, o método compreende a transformação uma célula vegetal com a molécula de ácido nucleico crylDa códon-otimizada compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico da presente invenção, conforme definida no presente documento. Preferencialmente, o método compreende adicionalmente selecionar uma célula vegetal transformada com a molécula de ácido nucleico crylDa códonotimizada compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico ou o vetor da presente invenção, conforme definidos no presente documento. Preferencialmente, o método compreende adicionalmente regenerar uma planta transgênica a partir da mencionada célula vegetal.
[0117] Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “praga”, “pragas de cultura” e similares devem ser interpretadas como praga invertebradas, que incluem, mas não estão limitadas a insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros, carrapatos e semelhantes. Em particular, os insetos incluem os selecionados a partir das ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, entre outras. Preferencialmente, Coleoptera, Lepidoptera e Diptera.
[0118] Particularmente, a ordem Lepidoptera inclui, mas sem se limitar, às famílias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae,
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Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae, Crambidae e Tineidae, mais particularmente Spodoptera sp., particularmente Spodoptera frugiperda (Noctuidae) e Diatrea sp., particularmente Diatrea saccharalis (Crambidae).
[0119]Uma das realizações da presente invenção refere-se a um método de controle de pragas invertebradas de plantas de cultivo. Qualquer método de controle de pragas invertebradas de plantas de cultivo está incluído no escopo da presente invenção, não sendo de particular relevância para a obtenção das realizações da invenção, desde que as plantas de cultivo, de acordo com a presente invenção, compreendam a molécula de ácido nucleico crylDa códonotimizada compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico da presente invenção, conforme definida no presente documento, em que o método compreende, preferencialmente, o plantio de sementes obtidas a partir de uma planta compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, preferencialmente com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente sendo a SEQ ID NO: 1, ou a construção de ácido nucleico da presente invenção, conforme definida no presente documento, em uma área de cultivo de plantas de cultura suscetíveis a pragas invertebradas.
[0120] Ao longo do presente documento, todos os títulos e subtítulos são utilizados apenas por conveniência e não deverão ser interpretados como limitações da presente invenção.
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Exemplos
Exemplo 1 - Seleção do gene cryIDa [0121] Foi realizada uma busca no banco de germoplasma de B. thuringiensis pertencente ao Laboratório de Controle Biológico com objetivo de detectar cepas capazes de controlar o desenvolvimento de Spodoptera frugiperda. Por meio de experimentos de PCR utilizando primers específicos do gene crylDa (SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19) (Cerón et al., 1994) foram identificadas cepas contendo o fragmento de 290 pb. Esses fragmentos foram sequenciados e comparados com banco de dados do NCBI. Primers representando regiões das bordas 5’ e 3’ do gene crylDa baseados em sequências presentes no NCBI (SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21) foram utilizados para isolar o gene completo da cepa Bt 1132C utilizando taq polimerase de alta fidelidade. O fragmento amplificado representando o gene completo crylDa foi clonado no vetor pGEM (Promega) por meio de uma reação para adição de adenina e utilizado para sequenciamento de ambas fitas utilizando primers internos. O sequenciamento foi realizado de três clonagens obtidas de amplificações independentes.
[0122] A definição da sequência para a síntese do gene Bt presente na construção gênica codifica para uma proteína de 625 amino ácidos correspondente ao sítio ativo da proteína crylDa e foi baseada em três aspectos: (i) Presença dos domínios C-terminal (Endotoxina C), Central (Endotoxina M) e N-terminal (Endotoxina N); (ii) Tamanho do núcleo ativo da proteína - resíduos de aa 1 a 625 (Abdul Αζίζ,Η., Wei Hong,L. and Yusoff,K. Comparative study of cry1D gene expressed in E. coli and Baculovirus expression system / http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/protein/AFK29089.1); (iii) Detecção in siiico de sítios de hidrólise da protoxina cry1 Da com as enzimas tripsina ou quimotripsina.
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Exemplo 2 - Mudança do códon do gene cryIDa nativo [0123] Em uma segunda etapa, modificou-se o códon do núcleo ativo da proteína - resíduos de aa 1 a 625 / sequência nucleotídica de 1875 bp originalmente isolado de B. thuringiensis (SEQ ID NO: 2) para que ele ficasse compatível com o códon do milho. A modificação do códon do gene cry 1 Da foi feita com o auxílio do software Optimizer (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/Form.php) (Puigbo, 2007) e a sequência enviada digitalmente para síntese comercial. A sequência inicialmente isolada da estirpe BT 1132C possuía um conteúdo de CG de 37,91% e foi otimizada para 63,8% (SEQ ID NO: 1) de conteúdo CG (Figura 1).
[0124] O fragmento sintetizado foi clonado no plasmídeo pUC19 com sítios de enzimas de restrição compatíveis para a clonagem no vetor binário pTF101. A sequência sintetizada foi confirmada por sequenciamento, de acordo com técnicas padrão.
Exemplo 3 - Construção gênica [0125]A clonagem do gene cryIDa 63,8%CG foi realizada no vetor binário pTF101 (Paz et al., 2004) contendo o promotor do gene da ubiquitina de milho (ubi) e o terminador do gene da nopalina sintase (nos). O plasmídeo pTF101 e o plasmídeo pUCcrylDa foram clivados com as enzimas EcoRI e Hindlll. Em seguida, uma reação de ligação foi realizada entre o vetor binário pTF101 e o gene UBI::cry1 Da::NOS. A divagem e a ligação realizadas com enzimas de restrição e T4 ligase, respectivamente foram feitas conforme instrução do fabricante (Invitrogen / USA). O resultado desta clonagem foi transformado, via eletroporação (BioRad/MicroPulser), em E. coli HB101 utilizando o marcador de seleção espectinomicina e algumas colônias desta bactéria foram analisadas para verificar a presença do gene UBI::cry1 Da::NOS. A clonagem e direção foram confirmados por PCR e sequenciamento utilizando os primers descritos na Tabela 1, que amplificam o fragmento referente ao promotor da Ubiquitina e
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37/53 divagem com as enzimas Hindi 11 e BamHI. Para o sequenciamento foi utilizado o kit comercial BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems). DNA plasmidial de duas colônias de bactéria contendo a construção gênica foi sequenciado e comparado com a sequência de interesse e constatou-se que elas eram idênticas.
[0126] Uma vez confirmada a clonagem do gene UBI::cry1 Da::NOS no plasmídeo pTF101, esta construção gênica foi transferida para a Agrobacterium tumefaciens EHA101, utilizando a metodologia de eletroporação (BioRad/MicroPulser). O mesmo procedimento acima foi realizado para comprovação da presença do vetor binário contendo o gene crylDa em A. tumefaciens. O DNA plasmidial foi isolado de colônias de A. tumefaciens, amplificado com primers para detecção do gene bar da Tabela 1 (gene de seleção presente no vetor binário). O DNA plasmidial também foi clivado com enzimas de restrição e o tamanho das bandas vistas em gel de agarose foi correspondente ao esperado, confirmando, assim, a presença correta do gene de interesse na A. tumefaciens. Todas as reações de amplificação de fragmentos por PCR utilizaram as seguintes condições: 94 °C por 2 min; 35 ciclos de 94 °C por 30 seg; 55 °C por 30 seg; 72 °C por 30 seg; um ciclo de 72 °C por 5 min. Os resultados foram visualizados em gel de agarose 1% corados com GelRed (Biotium). As fotos foram documentadas em sistema de captura de imagem digital.
[0127] Agrobacterium tumefaciens EHA 101 contendo as construções gênicas de interesse (UBI::cry1 Da::NOST e 35S::bar::35T) foi utilizada na transformação genética de milho.
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Tabela 1 - Sequências dos primers utilizados e o tamanho dos seus
RESPECTIVOS AMPLICONS
| Primer | Sequência 5’ - 3’ | Amplicon | SEQ ID NO: |
| U4 | ACCGGCTAGAGCCATCCCAG | -600 pb | SEQ ID NO: 12 |
| U1 | ACCAACCAGCGAACCAG | SEQ ID NO: 13 | |
| BAR-F1 | AGAAACCCACGTCATGCC | 413 pb | SEQ ID NO: 14 |
| BAR-R1 | TG CACCATCGTCAACCAC | SEQ ID NO: 15 | |
| Ubi-F | TTGATGTGGG I I I IACTGATGC | 589 pb | SEQ ID NO: 16 |
| Cry1 Da-R | C ACCTTGTAC AG GTTG G AC A | SEQ IS NO: 17 |
Exemplo 4 - Transformação genética de embriões imaturos de milho Hill via
Agrobacterium tumefaciens [0128] O genótipo utilizado neste protocolo de transformação é o milho Hill (Armstrong et al., 1991), conforme protocolo por Frame et al. (2002), com pequenas modificações. Brevemente, para a transformação deste genótipo, foram coletados embriões imaturos entre 1,8 - 2,0 mm de comprimento (10-12 dias após a polinização). Espigas utilizadas para a coleta dos embriões foram mergulhadas em uma solução de 1:1 de água sanitária comercial (2,5% hipoclorito de sódio) e H2O destilada com 1-2 gotas de Tween 20, por 20 minutos. Em seguida, foram enxaguadas com água destilada estéril por 5 minutos, duas vezes.
[0129] Os embriões imaturos foram coletados com o auxílio de uma espátula a partir de um corte superficial dos grãos. Para a transferência da construção gênica para o milho utilizou-se Agrobacterium tumefaciens EHA101. A partir de uma cultura estoque da A. tumefaciens contendo a construção gênica de interesse, mantida em glicerol a -80 °C, uma estria foi feita em meio YEP (5 g.L’ 1 de extrato de levedura; 10 g.L'1 de peptona; 5 g.L1 de NaCI; 15 g.L1 de bacto ágar) contendo os antibióticos necessários (espectinomicina 100 mg.L'1 e 50 mg.L'1 kanamicina) e a placa foi incubada por 2 a 3 dias a 28 °C placa mãe). Para a transformação genética, uma estria da Agrobacterium utilizando uma colônia isolada da placa mãe foi feita em meio YEP contendo os antibióticos necessários. A placa foi incubada por 2 a 5 dias a 19 °C. Em seguida, a
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Agrobacterium foi ressuspendida em meio de infecção (4,0 g.L'1 de N6 sais;
68,4 g.L'1 de sacarose; 36,0 g.L1 de glicose; 0,7 g.L'1 de prolina; 1,5 mg.L'1 de 2,4-D; 1,0 mL.L'1 N6 vitaminas (1000X = 1,0 g.L'1 de tiamina HCI; 0,5 g.L'1 de piridoxina HCI; 0,5 g.L'1 ácido nicotínico); pH 5,2) suplementado com 100 μΜ de acetoseringona até atingir uma OD550 = 0,3-0,4 e, incubada em agitador a -150 rpm, 23 °C por 2 horas.
[0130] Para a infecção dos embriões imaturos de milho, 50 a 100 embriões foram coletados em 1 mL de meio de infecção acrescido de acetoseringona. Após a coleta, os embriões foram enxaguados duas vezes, 1 mL da cultura bacteriana foi adicionado e a suspensão incubada por cinco minutos a 23 °C. Após a infecção, os embriões foram transferidos para a superfície de meio de co-cultivo (4,0 g.L1 de N6 sais; 1,5 mg.L'1 de 2,4-D; 30,0 g.L1 de sacarose; 0,7 g.L'1 de prolina; 1,0 mL.L'1 N6 vitaminas (1000X); 0,85 mg.L'1 de AgNOa; 100 μΜ de acetoseringona; 300 mg.L'1 de L-cisteína; 3,0 g.L1 de phytagel; pH 5,8) com o escutelo voltado para cima. As placas foram incubadas no escuro a 20 °C por 3 a 5 dias. Após o co-cultivo os embriões foram transferidos para o meio de repouso (4,0 g.L1 de N6 sais; 1,5 mg.L'1 de 2,4-D; 30,0 g.L1 de sacarose; 0,5 g.L1 de MES; 0,7 g.L'1 de prolina; 1,0 mL.L'1 N6 vitaminas (1000X); 0,85 mg.L'1 de AgNOa; 100 mg.L'1 de Tioxin; 3,0 g.L-1 de phytagel; pH 5,8) a 28 °C (escuro) por 7 a 15 dias. Em seguida, os embriões foram transferidos para o meio de seleção (4,0 g.L1 de N6 sais; 1,5 mg.L'1 de 2,4-D; 30,0 g.L1 de sacarose; 0,5 g.L1 de MES; 0,7 g.L'1 de prolina; 1,0 mL.L'1 N6 vitaminas (1000X); 0,85 mg.L'1 de AgNOa; 100 mg.L'1 de Tioxin; 1,5 e 3,0 mg/L de bialaphos; 3,0 g.L'1 de phytagel; pH 5,8) (25 embriões/placa). Subcultivos destes embriões em meio seletivo são realizados a cada 15 dias até a seleção de calos crescendo vigorosamente.
[0131] Calos selecionados foram transferidos para meio de regeneração (4,62 g.L'1 de MS sais; 60,0 g.L1 de sacarose; 100 mg.L'1 de mio-inositol; 1,0 mL. L'1
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40/53 de MS vitaminas (1000X); 1,5 mg/L de bialaphos; 4,0 g.L'1 de phytagel; pH 5,8) e incubados a 26 ± 2 °C (escuro) por 15 a 21 dias. Calos prontos para a germinação, possuindo aspecto seco e coloração branca opaca, foram transferidos para o meio de germinação (4,62 g.L'1 de MS sais; 30,0 g.L'1 de sacarose; 100 mg.L'1 de mio-inositol; 1,0 mL.L'1 de MS vitaminas (1000X = 0,5 g.L'1 de tiamina HCI; 0,5 g.L'1 de piridoxina HCI; 0,05 g.L'1 ácido nicotínico); 3,0 g.L'1 de phytagel; pH 5,8) (12 calos por placa), 25 °C, 80-100 pE/m2/sec de intensidade luminosa, 16 horas de fotoperíodo). Plântulas com folhas e raízes foram transferidas para a casa-de-vegetação dentro de 14 a 20 dias.
[0132] Quando as raízes estiveram bem desenvolvidas e as estruturas foliares mediram cerca de 5 cm de comprimento, as plântulas foram transplantadas para vasos em casa de vegetação contendo uma mistura de solo e matéria orgânica (2/3 de solo e 1/3 de matéria orgânica (TDP 30/15) produzida comercialmente.
Exemplo 5 - Geração de eventos de milho transgênico contendo o gene cryIDa [0133] Foram gerados eventos de milho contendo a molécula de ácido nucléico códon-otimizada cryIDa da presente invenção (SEQ ID NO: 1), conforme Tabela 2 abaixo. O evento ME240913 (Evento 01) foi gerado a partir da transformação do híbrido temperado Hill foi introgredido na linhagem tropical L3, utilizando seleção assistida por marcadores moleculares.
Tabela 2
| Eventos Produzidos | Número de sementes produzidas na 1 ° geração |
| ME240913 - Evento 01 | 101 |
| ME240913 - Evento 04 | 03 |
| ME260913 - Evento 02 | 33 |
Exemplo 6 - Bioensaios [0134] Visando avaliar a suscetibilidade do milho transgênico expressando a proteína CryIDa (codificada a partir da molécula de ácido nucléico códon
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41/53 otimizada da presente invenção), realizaram-se bioensaios em laboratório.
[0135] Os ensaios foram realizados da seguinte maneira: lagartas neonatas da espécie Spodoptera frugiperda foram inoculadas em folhas de plantas de milho transgênico crylDa mantidas em casa de vegetação e na isolinha não transgênica (5 lagartas por recipiente), em estágio V7 e V8. Após a infestação, os recipientes foram fechados e as avaliações das notas de danos ocorreram após 05 dias. Em cada caso, o delineamento experimental foi composto por grupo tratamento (evento ME240913 (Evento 1) de milho transgênico contendo a construção cry1 Da) e grupo controle (milho não transgênico).
[0136] Os parâmetros avaliados foram: nota de injúria utilizando a escala proposta por Carvalho, 1970 (0: planta com folhas não-danificadas; 1: planta apresentando folhas raspadas; 2: planta apresentando folhas furadas; 3: planta apresentando folhas rasgadas; 4: planta apresentando lesão no cartucho; e 5: planta apresentando cartucho destruído); sobrevivência de lagartas (contou-se o número de lagartas sobreviventes em cada vaso); e biomassa de lagartas (utilizando balança de precisão de quatro casas decimais).
Exemplo 7 - Bioensaios para controle de Spodoptera frugiperda e Diatrea SACCfíAfíAL/S UTILIZANDO OS EVENTOS TRANSGÊNICOS DE MILHO GERADOS [0137] Ensaios com Spodoptera frugiperda: inicialmente, o evento ME240913 (Evento 1) foi testado para o controle de S. frugiperda. Sementes do evento foram germinadas em casa de vegetação e quando as plantas atingiram o estádio entre 10 e 12 folhas (final do estádio vegetativo), as duas folhas mais novas de cada planta foram utilizadas em bioensaios com Spodoptera frugiperda. Foram realizadas três repetições, com cinco lagartas por repetição. Utilizou-se folhas dos milhos Hill e L3 como controle negativo (lagartas crescem normalmente) e folhas do milho Viptera como controle positivo (lagartas não conseguem crescer). Neste primeiro teste foi verificado que o evento ME240913 (Evento 1) possuía boa capacidade de controlar o
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42/53 desenvolvimento da lagarta, atingindo 100% de mortalidade (Tabela 3).
Tabela 3 - Avaliação de eventos transgênicos de milho com relação ao
CONTROLE DE SPODOPTERA FRUGIPERDA (BIOENSAIO 1)
| Evento / Repetição | Lagartas vivas (Após 05 dias) | Lagartas mortas | Peso total das Lagartas vivas (mg) |
| ME240913 - Evento 1 {crylDa)/1 | 0 | 5 | 0 |
| ME240913 - Evento 1 {crylDa) / 2 | 0 | 5 | 0 |
| ME240913 - Evento 1 {crylDa) / 3 | 0 | 5 | 0 |
| Milho Viptera Controle + /1 | 0 | 5 | 0 |
| Milho Viptera Controle + / 2 | 0 | 5 | 0 |
| Milho Viptera Controle + / 3 | 0 | 5 | 0 |
| Milho Hill Controle - /1 | 5 | 0 | 70,3 |
| Milho Hill Controle - / 2 | 4 | 1 | 77,3 |
| Milho Hill Controle - / 3 | 5 | 0 | 68,7 |
| Milho L3 Controle - /1 | 4 | 1 | 39,5 |
| Milho L3 Controle - / 2 | 5 | 0 | 84,4 |
| Milho L3 Controle - / 3 | 5 | 0 | 61,6 |
[0138] O bioensaio com este evento foi repetido, utilizou-se, desta vez, quatro repetições com 20 lagartas por repetição, e os resultados confirmaram que este evento possuía a capacidade de controlar o desenvolvimento da S. frugiperda (Figura 4 representativa dos bioensaios de alimentação com Spodoptera frugiperda em milho não-transgênico e milho transgênico da presente invenção). Em época diferente, foi realizado outro bioensaio para teste de mais dois dos eventos crylDa gerados: ME260913 - Evento 2 (crylDa) e ME240913 - Evento 4 (crylDa) (Tabela 4). Estes dois eventos gerados também foram capazes de controlar eficientemente o desenvolvimento de S. frugiperda.
Tabela 4 - Avaliação de eventos transgênicos de milho com relação ao
CONTROLE DE SPODOPTERA FRUGIPERDA (BIOENSAIO 2)
| Evento | Lagartas vivas | Lagartas mortas | Peso total das Lagartas vivas (mg) |
| ME240913 - Evento 1 {crylDa) /1 | 0 | 20 | 0 |
| ME240913 - Evento 1 {crylDa)/2 | 0 | 20 | 0 |
| ME240913 - Evento 1 {crylDa)/3 | 0 | 20 | 0 |
| ME240913 - Evento 1 {crylDa)/4 | 0 | 20 | 0 |
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43/53
| Evento | Lagartas vivas | Lagartas mortas | Peso total das Lagartas vivas (mg) |
| ME240913 - Evento 4 (crylDa) /1 | 0 | 20 | 0 |
| ME240913 - Evento 4 (crylDa) / 2 | 0 | 20 | 0 |
| ME240913 - Evento 4 (crylDa) / 3 | 0 | 20 | 0 |
| ME260913 - Evento 2 (crylDa) /1 | 1 | 19 | 0,7 |
| ME260913 - Evento 2 (crylDa) / 2 | 0 | 20 | 0 |
| ME260913 - Evento 2 (crylDa) / 3 | 0 | 20 | 0 |
| Hill /1 | 18 | 02 | 176,7 |
| Hill/2 | 18 | 02 | 131,7 |
| Hill/3 | 15 | 05 | 137,0 |
| Hill/4 | 17 | 03 | 212,7 |
| L3/1 | 19 | 01 | 131,9 |
| L3/2 | 19 | 01 | 132,5 |
| L3/3 | 19 | 01 | 133,3 |
| L3/4 | 18 | 02 | 115,6 |
[0139] Ensaios com Diatrea saccharalis·. os mesmos eventos testados para a S.
frugiperda foram testados também para a Diatraea saccharalis. Cinco lagartas de um dia foram colocadas em folhas dos eventos transgênicos de milho e controles. Foi observado que o evento ME240913 (Evento 1) também foi capaz de controlar o desenvolvimento da D. saccharalis. Neste período, as lagartas não morreram, mas não foram capazes de crescer (Tabela 5).
Tabela 5 - Avaliação de eventos transgênicos de milho com relação ao
CONTROLE DE PlATRAEA SACCHARALIS (BIOENSAIO 1)
| Evento | Lagartas vivas (Após 05 dias) | Lagartas mortas | Peso total das Lagartas vivas (mg) |
| ME240913 - Evento 1 (crylDa) /1 | 05 | 0 | >0,1 |
| ME240913 - Evento 1 (crylDa) / 2 | 05 | 0 | >0,1 |
| ME240913 - Evento 1 (crylDa) / 3 | 04 | 1 | 0,2 |
| Milho Viptera Controle + /1 | 05 | 0 | >0,1 |
| Milho Viptera Controle + / 2 | 04 | 1 | >0,1 |
| Milho Viptera Controle + / 3 | 03 | 2 | 0,2 |
| Milho Hill Controle - /1 | 05 | 0 | 6,7 |
| Milho Hill Controle - / 2 | 05 | 0 | 7,6 |
| Milho Hill Controle - / 3 | 04 | 1 | 5,7 |
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| Evento | Lagartas vivas (Após 05 dias) | Lagartas mortas | Peso total das Lagartas vivas (mg) |
| Milho L3 Controle - /1 | 05 | 0 | 6,3 |
| Milho L3 Controle - / 2 | 05 | 0 | 20,5 |
| Milho L3 Controle - / 3 | 04 | 1 | 4,6 |
[0140] Foi realizado um novo bioensaio com esse evento para confirmar a toxicidade. Desta vez, foram utilizadas quatro repetições e 20 lagartas em cada repetição. O mesmo resultado obtido anteriormente foi conseguido neste segundo ensaio (Figura 5 representativa dos bioensaios de alimentação com Diatrea saccharalis em milho não-transgênico e milho transgênico da presente invenção). Em época diferente, foi realizado outro bioensaio para teste de mais um dos eventos crylDa gerados ME260913 - Evento 2 (crylDa) (Tabela 6). Este evento também foi capaz de controlar eficientemente o desenvolvimento de D. saccharalis.
Tabela 6 - Avaliação de eventos transgênicos de milho com relação ao
CONTROLE DE PlATRAEA SACCHARALIS (BIOENSAIO 2)
| Evento | Lagartas vivas (Após 05 dias) | Lagartas mortas | Peso total das Lagartas vivas (mg) |
| ME240913 - Evento 1 (crylDa) /1 | 0 | 20 | 0 |
| ME240913 - Evento 1 (crylDa)/2 | 0 | 20 | 0 |
| ME240913 - Evento 1 (crylDa)/3 | 0 | 20 | 0 |
| ME240913 - Evento 1 (crylDa)/4 | 0 | 20 | 0 |
| ME260913 - Evento 2 (crylDa) /1 | 0 | 20 | 0 |
| ME260913 - Evento 2 (crylDa) / 2 | 0 | 20 | 0 |
| ME260913 - Evento 2 (crylDa) / 3 | 0 | 20 | 0 |
| Milho Viptera Controle + /1 | 04 | 16 | >0,1 |
| Milho Viptera Controle + / 2 | 02 | 18 | >0,1 |
| Milho Viptera Controle + / 3 | 04 | 16 | >0,1 |
| Milho Viptera Controle + / 4 | 0 | 20 | >0,1 |
| Milho Hill Controle - /1 | 15 | 05 | 12,0 |
| Milho Hill Controle - / 2 | 20 | 0 | 21,2 |
| Milho Hill Controle - / 3 | 18 | 02 | 20,6 |
| Milho Hill Controle - / 4 | 19 | 01 | 22,4 |
| Milho L3 Controle - /1 | 20 | 0 | 22,8 |
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| Evento | Lagartas vivas (Após 05 dias) | Lagartas mortas | Peso total das Lagartas vivas (mg) |
| Milho L3 Controle - / 2 | 20 | 0 | 19,6 |
| Milho L3 Controle - / 3 | 20 | 0 | 22,8 |
| Milho L3 Controle - / 4 | 20 | 0 | 24,0 |
Exemplo 8 - Análises de expressão do gene cryWa nos eventos
TRANSGÊNICOS DE MILHO [0141] Analisou-se a expressão do gene crylDa por meio do ensaio de reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), de acordo com técnica padrão conhecida por um técnico no assunto. Os resultados desta análise mostraram que os eventos, capazes de inibir o crescimento das lagartas, expressam o gene cry1 Da de forma eficiente.
Exemplo 9 - Bioensaios utilizando lagartas resistentes ao milho TRANSGÊNICO CONTENDO O GENE CRY1F [0142] Ensaios foram realizados para verificar o potencial da molécula de ácido nucleico códon-otimizada crylDa da presente invenção no controle de S. frugiperda resistente à proteína cry1 F.
[0143] O experimento foi realizado em casa de vegetação, com o plantio do milho transgênico, compreendo a molécula de ácido nucleico códon-otimizada cryWa da presente invenção (ME240913 (Evento 1)) e do milho não transgênico (controle negativo). Lagartas neonatas pertencentes a duas populações distintas de Spodoptera frugiperda foram inoculadas nas plantas de milho (15 lagartas por planta), em estágio V7 e V8. Após a infestação, os vasos foram isolados com gaiola voil e as avaliações das notas de injúria ocorreram após 07, 14 e 21 dias. O delineamento experimental foi composto por 04 tratamentos, com 05 vasos cada, contendo de 02 a 03 plantas de milho por vaso:
[0144] Tratamento 1: Evento transgênico da invenção ME240913 (Evento 01) infestado com a população de Spodoptera frugiperda resistente à proteína
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46/53
Cry 1F de acordo com Leite et al. 2016.
[01451 Tratamento 2: Linhagem isogênica L3 não transgênica infestada com a população de Spodoptera frugiperda resistente à proteína Cry1F de acordo com Leite et al 2016.
[01461 Tratamento 3: Evento transgênico da invenção ME240913 (Evento 01) infestado com a população de lagartas suscetíveis oriunda de criação de manutenção do laboratório de entomologia da Embrapa Milho e Sorgo.
[0147] Tratamento 4: Linhagem isogênica não transgênica infestada com a população de lagartas suscetíveis oriunda de criação de manutenção do laboratório de entomologia da Embrapa Milho e Sorgo.
[0148] Os resultados indicaram que a planta transgênica compreendendo a molécula de ácido nucleico códon-otimizada crylDa da invenção foi capaz de controlar a infestação com a população de Spodoptera frugiperda resistente à proteína Cry1F, tão bem quanto em relação à população suscetível, inibindo seu desenvolvimento (Figura 6) e protegendo a planta do ataque por tal praga (Figura 7), conforme observado pela nota de injúria (±IC, P=0,05). O percentual de sobrevivência de Spodoptera frugiperda, avaliada 21 dias após a liberação de lagartas em diferentes tratamentos, foi de 0% para os tratamentos 1 e 3, e cerca de 65% e 35% para os tratamentos 2 e 4, respectivamente. A biomassa de Spodoptera frugiperda, avaliada 21 dias após a liberação de lagartas em diferentes tratamentos, foi de 0% para os tratamentos 1 e 3, e cerca de 260 mg e 300 mg para os tratamentos 2 e 4, respectivamente. Em ambos os casos, as médias não sobrepostas pelo IC, diferem entre si (P=0,05).
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Claims (35)
- Reivindicações1. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO CRY1DA CÓDON-OTIMIZADA, caracterizada por compreender uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 70% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1.
- 2. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 90% de similaridade com a sequência definida como SEQ ID NO: 1.
- 3. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por ser a sequência definida como SEQ ID NO: 1.
- 4. CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO, caracterizada por compreender a molécula de ácido nucléico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
- 5. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por compreender adicionalmente uma sequência promotora ligada operativamente à mencionada molécula de ácido nucléico.
- 6. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pela sequência promotora ser a sequência promotora do gene da ubiquitina de milho (ubi).
- 7. CONSTRUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizada por compreender adicionalmente uma sequência terminadora 3’ UTR.
- 8. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pela sequência terminadora 3’ UTR ser a sequência terminadora do gene da nopalina sintase (nos).
- 9. CONSTRUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizada compreender adicionalmente um gene de seleção, operativamente ligado a pelo menos uma sequência promotora e pelo menos uma sequência terminadora.Petição 870180037611, de 07/05/2018, pág. 63/762/5
- 10. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pela sequência promotora ser a sequência promotora do gene CaMV 35S duplicado do vírus do mosaico da couve-flor e a sequência terminadora ser a sequência terminadora do gene Tvsp que codifica para a proteína de reserva vegetativa de soja.
- 11. CONSTRUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a10, caracterizada por compreender adicionalmente outras sequências reguladoras.
- 12. CONSTRUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a11, caracterizada por compreender a sequência de ácido nucleico definida como SEQ ID NO: 10.
- 13. VETOR, caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou a construção de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a12,
- 14. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender a molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou a construção de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 12, ou o vetor, conforme definido na reivindicação 13.
- 15. CÉLULA VEGETAL, caracterizada por compreender a molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou a construção de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 12.
- 16. PLANTA TRANSGÊNICA, caracterizada por compreender a molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou a construção de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 12.
- 17. MÉTODO DE TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULA, caracterizado porPetição 870180037611, de 07/05/2018, pág. 64/763/5 compreender a introdução em dita célula a molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou a construção de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a12.
- 18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela molécula de ácido nucleico integrar no genoma da célula.
- 19. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PLANTA TRANSGÊNICA, caracterizado por compreender a transformação de célula vegetal com a molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou com a construção de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 12.
- 20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por compreender adicionalmente a seleção de célula vegetal transformada com a molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou com a construção de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 12.
- 21. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20, caracterizado por compreender adicionalmente a regeneração de planta transgênica a partir da mencionada célula vegetal.
- 22. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pela planta transgênica ser resistente a pragas de cultura.
- 23. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pela planta transgênica ser uma monocotiledônea.
- 24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pela monocotiledônea ser uma planta de milho, arroz, cana-de-açúcar, sorgo, trigo ou braquiária.
- 25. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pela praga de cultura ser um inseto.Petição 870180037611, de 07/05/2018, pág. 65/764/5
- 26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo inseto ser da ordem Lepidoptera.
- 27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo inseto ser Spodoptera frugiperda.
- 28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo inseto ser Diatrea saccharalis.
- 29. MÉTODO DE CONTROLE DE PRAGAS INVERTEBRADAS DE PLANTAS DE CULTIVO, em que as plantas de cultivo compreendem a molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou a construção de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 12, caracterizado por compreender o plantio de sementes obtidas a partir de uma planta compreendendo a molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou a construção de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 12, em uma área de cultivo de plantas de cultura suscetíveis a pragas invertebradas.
- 30. USO DA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou da construção de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 12, caracterizado por ser para a produção de uma planta transgênica.
- 31. USO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pela planta transgênica ser uma monocotiledônea.
- 32. USO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pela planta monocotiledônea ser uma planta de milho, arroz, cana-de-açúcar, sorgo, trigo ou braquiária.
- 33. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 32, caracterizado pela planta transgênica ser resistente a pragas invertebradas.
- 34. USO DA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, conforme definida emPetição 870180037611, de 07/05/2018, pág. 66/765/5 qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou da construção de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 12, caracterizado por ser para o controle de pragas invertebradas.
- 35. USO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelas pragas invertebradas serem insetos.
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