BR102017004061A2 - composição e processo de preparação multiparticulada de natureza sólida contendo microescleródios de metarhizium anisopliae para controle de artrópodes-praga de importância na saúde humana, veterinária e na agropecuária e seus usos - Google Patents

Abstract

composição e processo de preparação multiparticulada de natureza sólida contendo microescleródios de metarhizium anisopliae para controle de artrópodes-praga de importância na saúde humana, veterinária e na agropecuária e seus usos. a presente invenção descreve formulações e processos de obtenção de sistemas sólidos multiparticulados contendo microescleródios de metarhizium anisopliae para o controle biológico de artrópodes-praga, especialmente de rhipicephalus microplus (carrapato-do-boi). essa forma de apresentação pode facilitar a aplicação dos agentes biológicos no campo, tornando-a mais reprodutível e efetiva, além de mais segura. os fungos formulados se apresentam com viabilidade estável sob refrigeração e os bioensaios comprovam sua efetividade. dessa forma, as formulações descritas aqui devem possibilitar um controle biológico mais eficaz e mais seguro que as formulações existentes atualmente.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO E PROCESSO DE PREPARAÇÃO MULTIPARTICULADA DE NATUREZA SÓLIDA CONTENDO MICROESCLERÓDIOS DE METARHIZIUM ANISOPLIAE PARA CONTROLE DE ARTRÓPODES-PRAGA DE IMPORTÂNCIA NA SAÚDE HUMANA, VETERINÁRIA E NA AGROPECUÁRIA E SEUS USOS (51) Int. Cl.: A01N 63/04; A01N 25/12; A01P 7/00 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS (72) Inventor(es): ÉVERTON KORT KAMP FERNANDES; RICARDO NEVES MARRETO; WOLF CHRISTIAN LUZ; ALAINE MARIA LOPES CATÃO; FLÁVIA REGINA SANTOS DA PAIXÃO; THAÍNA RODRIGUES SANTOS; GABRIEL MOURA MASCARIN (85) Data do Início da Fase Nacional:

24/02/2017 (57) Resumo: COMPOSIÇÃO E PROCESSO DE PREPARAÇÃO MULTIPARTICULADA DE NATUREZA SÓLIDA CONTENDO MICROESCLERÓDIOS DE Metarhizium anisopliae PARA CONTROLE DE ARTRÓPODES-PRAGA DE IMPORTÂNCIA NA SAÚDE HUMANA, VETERINÁRIA E NA AGROPECUÁRIA E SEUS USOS. A presente invenção descreve formulações e processos de obtenção de sistemas sólidos multiparticulados contendo microescleródios de Metarhizium anisopliae para o controle biológico de artrópodes-praga, especialmente de Rhipicephalus microplus (carrapato-do-boi). Essa forma de apresentação pode facilitar a aplicação dos agentes biológicos no campo, tornando-a mais reprodutível e efetiva, além de mais segura. Os fungos formulados se apresentam com viabilidade estável sob refrigeração e os bioensaios comprovam sua efetividade. Dessa forma, as formulações descritas aqui devem possibilitar um controle biológico mais eficaz e mais seguro que as formulações existentes atualmente.

Formifrcíw

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COMPOSIÇÃO E PROCESSO DE PREPARAÇÃO MULTIPARTICULADA DE NATUREZA SÓLIDA CONTENDO MICROESCLERÓDIOS DE Metarhizium anisopliae PARA CONTROLE DE ARTRÓPODES-PRAGA DE IMPORTÂNCIA NA SAÚDE HUMANA, VETERINÁRIA E NA AGROPECUÁRIA E SEUS USOS Campo da invenção [001] A presente invenção pertence ao campo da parasitologia, agropecuária, medicina veterinária e farmácia, envolvendo o desenvolvimento de preparações sólidas para uso no controle biológico de diferentes artrópodespraga, após sua aplicação no campo, no interior de residências e em locais de criação de animais. Em especial, a presente invenção refere-se a uma formulação granular/peletizada usada no controle de artrópodes, particularmente carrapatos da espécie Rhipicephalus microplus, os quais parasitam o rebanho bovino causando efeitos deletérios à saúde animal e perdas de grande impacto econômico.

[002] A presente invenção trata do desenvolvimento inovador de preparados sólidos de forma e tamanho controlados contendo estruturas fúngicas especiais, conhecidas como microescleródios. Os microescleródios são formas de resistência apresentadas por certos fungos entomopatogênicos, produzidos exclusivamente por meio de fermentação líquida submersa e capazes de produzir formas infecciosas (esporos assexuais) quando expostos a condições ambientais adequadas de umidade e temperatura.

[003] Dessa forma, a presente invenção trata do desenvolvimento inovador de produtos sólidos contendo essas formas de resistência fúngica, assim como trata de sua avaliação no controle de artrópodes-praga. Em suma, a presente invenção possibilitará a obtenção de produtos biológicos, também conhecidos por biopesticidas, para uso na agropecuária e no controle de vetores em geral, os quais serão capazes de realizar sua função de forma efetiva, ambientalmente segura, sem riscos à saúde humana e animal, e ainda evitando a ocorrência de fenômenos de resistência, apresentando, dessa forma, desempenho superior aos produtos que estão atualmente em comercialização.

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Antecedentes da invenção [004] Metarhizium anisopliae, microescleródios e controle biológico Rhipicephalus microplus é um ectoparasita hematófago popularmente conhecido como carrapato-do-boi (ÂNGELO, BITTENCOURT, 2013; VERÍSSIMO, 2013). A produtividade na agropecuária pode ser altamente afetada pelos efeitos deletérios decorrentes do parasitismo do rebanho bovino por R. microplus. Estima-se que a ação desse parasita possa resultar em uma perda anual de cerca de três bilhões de dólares à economia brasileira, ocasionada por seus efeitos diretos e indiretos (GRISI et al., 2014). Os danos decorrentes da ação direta caracterizam-se pela espoliação sanguínea e suas consequências, que resultam em redução da produção de leite e carne, enquanto os danos indiretos envolvem a transmissão de diferentes agentes patogênicos (FURLONG, 2005; SANTOS, 2013; RECK et al., 2014).

[005] Rhipicephalus microplus depende de apenas um único hospedeiro para seu desenvolvimento, sendo preferencialmente bovinos, podendo também infestar equídeos, caprinos, ovinos, bubalinos e cervídeos (FERRETO, 2013). O ciclo biológico desse carrapato é dividido em uma fase de vida parasitária, que ocorre sobre o hospedeiro; e uma fase de vida livre (não parasitária), que acontece no solo (GARCIA, 2009; FERRETO, 2013).

[006] O controle das populações de carrapatos, como R. microplus, se baseia principalmente no uso de produtos químicos, denominados neste caso de acaricidas (LONC et al., 2014). Compostos arseniacais, organofosforados, formamidinas (amitraz), piretróides, lactonas macrocíclicas (ivermectina), fenilpirazóis (fipronila) e benzoilfeniluréias (fluazurona) foram e têm sido usados como acaricidas. Todos apresentam relatos de resistência para essa espécie de carrapato, sendo que o fipronil, cuja comercialização iniciou-se em 1996, só teve resistência confirmada em 2007. A fluazurona, por sua vez, que começou a ser comercializada em 1994, teve seu primeiro caso de resistência relatado em 2014 (RECK et al., 2014).

[007] A seleção de indivíduos resistentes, decorrentes do uso incorreto e indiscriminado de produtos químicos acaricidas, assim como o alto custo e a

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3/17 permanência de resíduos desses produtos em alimentos e no meio ambiente (ÂNGELO et al., 2010; FERNANDES, BITTENCOURT, ROBERTS, 2012; CAMARGO et al., 2014), têm motivado a mobilização de esforços visando ao desenvolvimento e aprimoramento de métodos alternativos de controle, incluindo o controle biológico (ÂNGELO et al. 2010). O controle biológico consiste na redução de uma população de artrópodes-praga pela utilização de predadores, parasitas ou patógenos de ocorrência natural (DALZOTO, UHRY,

2009) . Dentre as vantagens desse tipo de controle, encontram-se a alta especificidade, menor risco à saúde humana, menor impacto ambiental, mitigação da ocorrência de resistência nos artrópodes-praga e a possibilidade dos agentes biológicos se multiplicarem, aumentando sua permanência no ambiente (DALZOTO, UHRY, 2009; ÂNGELO et al., 2010).

[008] Os fungos são os agentes mais utilizados e eficazes em controle biológico de invertebrados, uma vez que podem atuar após ingestão ou penetração na cutícula dos artrópodes, sendo capazes de matar uma praga em qualquer estágio (SAMISH; GINSBERG; GLAZER, 2004). Em condições naturais, os esporos fúngicos entram em contato com a cutícula do carrapato, germinam e inserem suas estruturas invasivas no corpo do hospedeiro. As hifas, em seguida, começam a se multiplicar, resultando na morte do hospedeiro. A morte do hospedeiro geralmente ocorre após o esgotamento das reservas de nutrientes, mas alguns fungos são capazes ainda de produzir metabólitos tóxicos que aceleram esse processo (LONC et al., 2014).

[009] Metarhizium anisopliae (Ascomycota: Hypocreales: Clavicipitaceae) se encontra entre os fungos mais estudados e bem descritos para o controle biológico de artrópodes (FARIA, WRAIGHT, 2007; SCHRANK, VAINSTEIN,

2010) . Esse fungo apresenta ampla distribuição geográfica, sendo observado desde regiões tropicais a temperadas, podendo ser isolado do solo, da rizosfera de plantas, como saprobionte em cadáveres de artrópodes ou parasitando insetos e carrapatos (BISCHOFF, REHNER, HUMBER, 2009). Acredita-se que M. anisopliae possa infectar mais de 300 espécies de insetos, como gafanhotos (Locusta migratória, Chortoicetes terminifera), mosquitos

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4/17 (Aedes aegypti, Anopheles spp.) e as cigarrinhas da cana-de-açúcar e pastagens (Mahanarva posticata, Mahanarva fímbriolata) (SCHOLTE et al., 2004; SOUZA, 2007), além de carrapatos como Rhipicephalus microplus, Rhipicephalus sanguineus, Amblyomma variegatum, Amblyomma sculptum e Dermacentor nitens (ARRUDA et al., 2005; LOPES et al., 2007; FERNANDES et al.,2012).

[010] Os principais propágulos fúngicos que podem ser utilizados no controle de artrópodes são conídios, blastosporos, micélio e microescleródios, sendo os últimos, estruturas que permitem a sobrevivência do fungo no solo (SCHAMNE, 2010). Os microescleródios são estruturas de resistência fúngica compostas por agregados de hifas, frequentemente melanizados, e resistentes à dessecação (JACKSON, JARONSKI, 2009; MASCARIN et al., 2014; KOBORI et al., 2015). Estes propágulos fúngicos são os mais indicados para formulações que visam a aplicação em solo, porque ao contrário dos outros propágulos, como conídios e micélio, os microescleródios permanecem viáveis por longos períodos nesse ambiente (SONG et al., 2014; KOBORI et al, 2015), mostrando-se mais resistentes a intempéries de naturezas bióticas e abióticas, o que sugere a necessidade de aplicação de concentrações menores por hectare (MASCARIN et al., 2014).

[011] A publicação internacional WO 2009035925 A2 descreve a produção e uso de microescleródios obtidos a partir da inoculação de propágulos de diferentes espécies fúngicas, incluindo Metarhizium anisopliae, em meios líquidos e seu uso no combate a diferentes artrópodes-praga no solo e em vegetais. No entanto, é importante ressaltar que não está descrito o uso dessa estrutura para o controle do carrapato-do-boi, assim como não há referência ao desenvolvimento de preparações sólidas com propriedades projetadas e controladas para a facilitação da aplicação, aumento da eficácia e manutenção da viabilidade das formas de resistência, que trata a presente invenção. Em consulta ao sítio do INPI, realizada em 15 de agosto de 2016, não houve retorno quando a palavra-chave empregada foi microescleródio.

Formulações contendo agentes biológicos

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5/17 [012] O desenvolvimento de formulações contendo micopesticidas teve início no século XIX, apesar disto, no presente momento, apenas cerca de 1 a 2% dos pesticidas vendidos mundialmente são produtos contendo microorganismos (LACEY et al., 2015). Suspensões aquosas de conídios, contendo pequenas concentrações de tensoativos foram as primeiras formulações a despertar o interesse de pesquisadores, uma vez que a água é um veículo atóxico e de fácil aplicação (POLAR et al., 2005a). Entretanto, o uso de óleos nas formulações, seja de origem mineral ou vegetal, vem apresentando melhores resultados de infectividade quando comparado às formulações aquosas (ALVES et al., 2002). Tais óleos quando adicionados em meios aquosos, formam emulsões que permitem sua fácil aplicação utilizando equipamentos usualmente empregados pelo produtor (ALVES et al., 2000). Dentre as limitações do uso de micopesticidas líquidos (aquosos ou oleosos) estão a suscetibilidade dos fungos frente à radiação ultravioleta (UV) e reduzida meia-vida de armazenamento. As formulações sólidas apresentam inúmeras vantagens quando comparadas com as formulações líquidas, visto que podem garantir maior proteção aos propágulos fúngicos, maior meia-vida de armazenamento, homogeneidade na aplicação e facilidade no manuseio e armazenamento. Além disso, o modo e os equipamentos de aplicação são os mesmos usados para aplicar alguns pesticidas químicos. Vale ainda ressaltar que as formas sólidas promovem a criação de numerosos focos repletos de estruturas infectivas, garantindo que os artrópodes-praga tenham maior chance de entrar em contato com um ou poucos grânulos e, consequentemente, contaminem-se com uma dose letal de conídios (JARONSKI, JACKSON, 2008; JACKSON, JARONSKI, 2009).

[013] Preparações sólidas multiparticuladas podem ser classificadas como pellets, beads, pós e grânulos. Pellets podem ser definidos como pequenas unidades esféricas, com tamanho médio na faixa entre 500 e 2000 pm, formados a partir da aglomeração de pós finos em equipamentos adequados (SANTOS et al., 2004; DUKIÓ-OTT et al., 2009; RATUL, BAQUEE, 2013; SUSHMA, BATTU, RAO, 2014).

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6/17 [014] Na indústria farmacêutica, tais unidades despertam bastante interesse por apresentarem vantagens tecnológicas em relação a outros sistemas sólidos, tais como boas propriedades de fluxo, estreita distribuição de tamanho, forma esférica e superfície lisa (SANTOS et al., 2004; DUKIÓ-OTT et al., 2007; TRIVEDI et al., 2007). Os pellets podem ser obtidos por diversas técnicas, por exemplo, revestimento de substratos com líquidos ou pós, aglomeração em granuladores de alto cisalhamento ou do tipo leito fluidizado. A técnica mais conhecida e utilizada é a extrusão-esferonização (VERVAET, BAERT, REMON, 1995; DUKIÓ-OTT et al., 2009). A produção de pellets utilizando a técnica de extrusão-esferonização teve início no Japão em meados da década de 1960 e se caracteriza por ser um processo multiestágio (DUKIÓ-OTT et al., 2009; ZHANG et al., 2016), abrangendo basicamente 4 etapas: (1) malaxagem, (2) extrusão, (3) esferonização e (4) secagem (SANTOS et al., 2004; TRIVEDI et al., 2007). A primeira etapa consiste no preparo da massa úmida que será submetida ao processo de extrusão. A massa deve apresentar propriedades adequadas de lubrificação e plasticidade (DUKIÓ-OTT et al., 2009) e deve ser umedecida de forma adequada, tendo em vista que a molhagem insuficiente ou a sobremolhagem afeta adversamente as características dos produtos finais. A segunda etapa é a extrusão, realizada em equipamento específico que exerce pressão sobre a massa umidificada, forçando-a a passar por uma malha com abertura de tamanho definido, sendo então moldada na forma de cilindros de diâmetro uniforme, conhecidos por extrusados (SANTOS et al., 2004; TRIVEDI et al., 2007; RATUL, BAQUEE, 2013). Os extrusados são moldados em formas esféricas, na terceira etapa do processo de peletização, conhecida como esferonização (RATUL, BAQUEE, 2013). Tal processo ocorre no equipamento denominado esferonizador, que consiste em um cilindro no interior do qual há uma placa de fricção giratória, contendo ranhuras radiais ou perpendiculares (SANTOS et al., 2004; TRIVEDI et al., 2007). As unidades esféricas obtidas são, então, submetidas a última etapa do processo, a secagem, que pode ser realizada sob condições de temperatura ambiente ou sob temperaturas mais elevadas.

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7/17 [015] As formulações para peletização são constituídas principalmente por celulose microcristalina. Esse tipo de celulose é caracterizado por ser um material filamentoso, com elevada área superficial, alta porosidade interna e propriedade de retenção de umidade. Esse material atua como uma esponja no processo de extrusão-esferonização. Assim, durante o preparo da massa úmida ocorre a retenção de água em sua estrutura interna; porém, durante a extrusão, a umidade retida é forçada a sair e atua como lubrificante (TRIVEDI et al., 2007; DUKIÓ-OTT et al., 2009). No entanto, em algumas aplicações específicas, o uso da celulose pode levar a limitações importantes no uso dos pellets e extrusados. No caso da presente invenção, substratos peletizados de natureza inorgânica foram desenvolvidos como uma alternativa aos pellets de celulose, o que pode ser interessante para a aplicação em questão, visto que a celulose pode atuar como fonte de carbono para o crescimento de outros micro-organismos oportunistas, capazes de competir e evitar ou reduzir a ação do fungo entomopatogênico sobre os artrópodes.

[016] A publicação internacional WO 2006121354 A1 descreve o uso de formulações sólidas como biopesticidas, sem fazer qualquer menção à microescleródios ou a formulações peletizadas em suas reivindicações. A publicação internacional WO 2009035925 A2 descreve o desenvolvimento de produto sólido contendo microescleródios de diferentes espécies fúngicas, inclusive M. anisopliae. No entanto, os inventores não descrevem a produção de pellets e o uso exclusivo de materiais inorgânicos como substrato carreador. De fato, a associação dessas abordagens (peletização e uso exclusivo de materiais inorgânicos) representa inovação significativa, visto que aumenta a uniformidade de aplicação e reduz a possibilidade de contaminação, aumentando assim a eficácia e o efeito residual do produto. Em suma, é possível afirmar que, de acordo com os documentos citados no estado da técnica, até o momento, não foram encontrados relatos de desenvolvimento de sistemas peletizados (preparados com material inorgânico ou mesmo com material orgânico) contendo microescleródios de Metarhizium anisopliae, destinados ao controle de artrópodes-praga no solo e em outros locais

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8/17 infestados. Dessa forma, concluímos que a presente invenção não é antecipada nem sequer sugerida pelos ensinamentos existentes.

Sumário da invenção [017] A presente invenção descreve o desenvolvimento de formulações multiparticuladas contendo microescleródios de Metarhizium anisopliae para controle de artrópodes-praga, em particular Rhipicephalus microplus. A presente invenção possibilitará realizar o controle biológico dos artrópodes, aumentando o efeito residual, reduzindo a dose, eliminando ou reduzindo fenômenos de resistência, aumentando o período de armazenamento, e melhorando o manuseio por parte do aplicador e a uniformidade da aplicação. Descrição das Figuras [018] A invenção poderá ser melhor compreendida com base nas Figuras de 1 a 5, cujas descrições seguem abaixo.

[019] A Figura 1 mostra os dados de esfericidade de pellets de diferentes formulações. Valores de esfericidade variam entre 0 e 1. Pontos referem-se às leituras da esfericidade, enquanto que as médias seguidas dos desviospadrões estão representadas pelo ponto e segmento em vermelho, respectivamente. F3 a F6 são formulações peletizadas preparadas com diferentes proporções de terra diatomácea, vermiculita, silicato de magnésio e dióxido de silício coloidal, todas contendo microescleródios.

[020] A Figura 2 mostra fotomicrografias dos pellets obtidos. Aumento de 0,63x. [021] A Figura 3 mostra a avaliação da produção de conídios por grama de pellets após processo de secagem em leito fluidizado a 40°C e a 50°C [022] A Figura 4 mostra o número médio de conídios (± erro padrão da média) de Metarhizium anisopliae / mg de pellets preparados com celulose (30 % celulose, 60 % de terra diatomácea) ou vermiculita (20 % de terra diatomácea + 78 % vermiculita + 2 % dióxido de silício), contendo ou não glicerina (10%), após exposição em 91 % UR, fotofase de 12 horas a 25 ± 1 °C por até 20 dias [023] A Figura 5 mostra as etapas do bioensaio empregado para avaliação da atividade dos pellets contendo microescleródios de Metarhizium anisopliae. A) Placas com latossolo vermelho estéril e adição de água destilada estéril; B)

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Comparação de placa com latossolo vermelho umidificado (à esquerda) e seco (à direita); C) Placa com latossolo úmido e 7 mg de péletes; D) Pellets com produção de conídios após15 dias de incubação a 27 ± 1 °C ; E) Placas preparadas para o bioensaio; F) Fêmea ingurgitada de R. microplus sobre pellets (seta amarela).

[024] A Figura 6 mostra a eficácia de pellets de Metarhizium spp. à base de microescleródios contra fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus, avaliando seu efeito sobre o período de oviposição das fêmeas e sobre o número de larvas eclodidas. Barras de médias e erro-padrão de cada tratamento (10 fêmeas por grupo).

[025] A Figura 7 mostra a curva de tolerância à radiação UV-B de conídios de Metarhizium anisopliae IP119 expostos a doses crescentes de radiação UV-B em condições laboratoriais.

[026] A Figura 8 mostra a produção de conídios a partir de pellets contendo microescleródios de M. anisopliae expostos à radiação UV-B [1239,23 mW/m² segundo Quaite et al. (1992).

Descrição Detalhada da Invenção [027] A presente invenção faz referência ao desenvolvimento de sistemas sólidos multiparticulados, em especial de pellets, para o controle biológico de artrópodes-praga, em particular do carrapato-do-boi. A tecnologia aqui relatada pode ser usada também no controle de outros artrópodes-praga que não desenvolvem parte do ciclo no solo, tais como Aedes aegypti e triatomíneos, aplicados em dispositivos que podem ser desenvolvidos para esta finalidade. Dentre os componentes utilizados para produção dos pellets na presente invenção, pode-se citar, mas não limitando-se a, celulose microcristalina (em seus diferentes graus), glicerina (ou outros umectantes), terra diatomácea, vermiculita, argilas diversas e outros materiais orgânicos e inorgânicos.

[029] Adicionalmente, os sistemas podem compreender tensoativos e dispersões aquosas de diferentes propágulos fúngicos, em particular de microescleródios. Pode-se destacar o emprego direto de filtrados obtidos a partir de suspensões fúngicas líquidas.

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10/17 [030] Em uma modalidade específica dessa invenção, foi utilizada a celulose associada à terra diatomácea, ou misturas de vermiculita, terra diatomácea e silicato para formação de um sistema sólido multiparticulado por extrusãoesferonização.

Exemplo 1. Realização Preferencial [031] O exemplo aqui mostrado tem o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção sem limitar, contudo, o escopo da mesma.

[032] Os pellets foram obtidos pelo método de extrusão-esferonização. O isolado fúngico estudado foi M. anisopliae IP 119, depositado na Coleção de Fungos Entomopatogênicos do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IP) da Universidade Federal de Goiás, sendo proveniente do solo da região norte do estado de Goiás (ROCHA et al., 2011). O cultivo para obtenção de conídios do isolado foi realizado em meio de cultura batata, dextrose e ágar, suplementado com extrato de levedura (1 g/L) (BDAL) em placas de Petri (100 x 15 mm) por 15 dias a 27 ± 1°C, em ausência de luz. Os conídios produzidos foram coletados da superfície do meio de cultura e sua concentração foi determinada com auxílio de câmara de Neubauer. A suspensão teve sua concentração final ajustada para 5 x 10⁷ conídios/mL. Para a produção de microescleródios, utilizou-se o meio de cultura líquido descrito por Jackson e Jaronski (2009), com relação carbono/nitrogênio 30:1. Após a adição do inóculo (10 mL da suspensão fúngica descrita acima), os frascos Erlenmeyer contendo o meio líquido foram inseridos em agitador orbital e mantidos sob agitação por 4 dias, sendo submetidos a agitação manual diariamente para evitar a formação de micélio na parede do frasco. Após esse período, a biomassa fúngica foi determinada por gravimetria. A concentração de microescleródios foi determinada através da coleta de 1 mL da cultura líquida total, seguida de diluição apropriada em solução de Tween 80 (0,05% v/v). Alíquota da suspensão (0,1 mL) foi adicionada em lâmina e avaliada em microscópio óptico. Os agregados de hifas maiores que 50 pm de diâmetro,

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11/17 compactos e com coloração escura foram contabilizados como microescleródios, de acordo com Jackson e Jaronski (2009).

[033] Para a obtenção dos pellets, pesou-se vermiculita previamente triturada, terra diatomácea e dióxido de silício coloidal em proporções variadas. Vermiculita foi adicionada na faixa de concentração de 78 a 100%, terra diatomácea foi adicionada na concentração entre 10 e 100%, e o silicato de alumínio e magnésio (Veegun) foi adicionado à formulação na faixa de concentração de 0 a 10%. Adicionalmente, utilizou-se quantidade de dióxido de silício coloidal de até 2% (m/m) da formulação seca. Os componentes foram misturados manualmente e posteriormente submetidos à tamboramento manual. Uma parte da mistura dos adjuvantes foi então adicionada ao meio líquido contendo microescleródios (5 g para cada 100 mL do caldo fermentado), e a homogeneização foi realizada com auxílio de bastão de vidro. A dispersão resultante foi então submetida à filtração sob vácuo. O líquido filtrado foi descartado. A massa retida no papel filtro foi adicionada gradativamente ao restante da mistura das matérias-primas, com auxílio de gral e pistilo. À massa úmida obtida, quando necessário, adicionou-se água purificada ou dispersão de silicato de alumínio e magnésio até a obtenção de material com plasticidade e lubrificação adequadas. Posteriormente, a massa foi extrusada em extrusor de rolos equipado com malha de 0,5 mm e operando a 30 rpm, e os extrusados foram submetidos à esferonização. Os pellets obtidos foram secos em leito fluidizado a 40 ou 50°C até que o conteúdo de umidade residual fosse inferior a 6%. Alternativamente, o preparo foi realizado substituindo o substrato inorgânico por celulose microcristalina. Nesses casos, foi adicionada quantidade adequada de terra diatomácea à formulação na concentração de 5 a 30% (m/m). Durante a esferonização, 5% (p/p) de dióxido de silício coloidal foi adicionado gradativamente à formulação. Algumas formulações foram preparadas com o acréscimo de 10% (m/m) de glicerina ou outros umectantes, como, por exemplo, manitol ou polietilenoglicol.

[034] Os pellets secos foram então avaliados quanto ao seu conteúdo de umidade por gravimetria. O aspecto visual dos pellets foi analisado utilizandoPetição 870170036812, de 31/05/2017, pág. 13/26

12/17 se estereomicroscópio acoplado à câmera fotográfica. A distribuição de tamanho foi determinada em analisador de partículas. A viabilidade dos conídios produzidos a partir dos microescleródios incorporados nos pellets também foi avaliada. Para tanto, 30 miligramas de pellets foram adicionados em placas de Petri (100 x 15 mm) contendo meio ágar-água 2% (p/v) e incubados em estufa para crescimento microbiológico a 27 ± 1°C por 10 dias, com fotoperíodo de 12 horas. Após esse período, os pellets e conídios foram raspados, com auxílio de espátula, e transferidos para solução de Tween 80 a 0,05% (v/v). A concentração de conídios na suspensão foi determinada com auxílio de câmara de Neubauer. Além disso, foi determinado o efeito da presença de umectantes no tempo necessário para o início da produção de micélio e na formação de conídios entre as diferentes formulações. A viabilidade dos conídios foi determinada de acordo com o método descrito por Braga et al. (2001). Para tanto, foram adicionados 20 μΙ_ de suspensão de conídios em placas de Petri (60 x 15 mm) contendo meio BDAL, acrescido de antibiótico. As placas foram incubadas por 48 horas a 27 ± 1°C e UR > 98%, em ausência de luz. Posteriormente, duas gotas de lactofenol de Amann acrescido de azul de algodão foram adicionadas sobre a zona de crescimento fúngico, para avaliação da germinação. Um total de 300 conídios foi avaliado. Os pellets contendo microescleródios foram armazenados em tubos Falcon de 50 mL, tampados e posteriormente mantidos sob refrigeração a 4°C a fim de simular uma condição de armazenamento. Em intervalos de tempo pré-determinados, alíquotas de 100 mg foram coletadas e submetidas ao ensaio de viabilidade, conforme já descrito. O ensaio foi conduzido em triplicata, com lotes de pellets produzidos em dias diferentes e submetidos ao armazenamento imediatamente após o preparo. Os ensaios in vivo foram realizados conforme descrito a seguir: Os testes foram conduzidos espalhando-se manualmente 0,007 g de pellets sobre a superfície de 5 g de latossolo vermelho estéril seco, previamente tamisado com malha de 1 mm, e umedecido com 1 mL de água destilada em placa de Petri (65 x 15 mm). Dez placas foram preparadas para cada formulação peletizada. Outras 10 placas contendo apenas latossolo vermelho

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13/17 umedecido foram usadas no grupo controle. As placas foram incubadas por 15 dias a 27 ± 1 °C e umidade próxima de saturação para permitir a conidiogênese a partir dos pellets. Após esse período, em cada placa de Petri foi colocada uma fêmea ingurgitada de R. microplus, previamente pesada (Figura 5). As fêmeas foram acompanhadas diariamente e avaliadas quanto à oviposição e o início da conidiogênese sobre os indivíduos mortos. Ao término da postura, a massa de ovos de cada fêmea foi pesada e colocada em tubo de ensaio vedado com algodão hidrófilo, e mantidos a 27 ± 1°C e UR > 80% para permitir a eclosão das larvas. Os seguintes parâmetros foram investigados: peso inicial da fêmea ingurgitada; período de postura, e eclosão larval, avaliado através da quantificação total das larvas eclodidas em cada tubo. Por fim, os conídios de M. anisopliae e pellets inorgânicos selecionados foram avaliados quanto a tolerância à radiação UV. Os conídios foram cultivados conforme anteriormente descrito. Ao centro de placas de Petri (60 x 15 mm) contendo meio BDAL acrescido de Benomyl e cloranfenicol, adicionou-se 20 μΙ_ da suspensão padronizada de conídeos e esperou-se cerca de 30 minutos até que a gota secasse. As placas foram então expostas a 541,54 mW/m² de radiação ultravioleta em câmara contendo 4 lâmpadas ultravioletas (UVB-313 EL, Q-Lab Corporation, Cleveland, EUA), com produção majoritária de radiação UV-B, e comprimento de onda máximo em 311 nm. A fonte utilizada produz mínima quantidade de radiação UV-A. As placas apresentavam-se cobertas com filme de diacetato de celulose com espessura de 0,13 mm, o qual bloqueia a passagem de comprimentos de onda menores que 290 nm. O espectro de irradiação foi medido com auxílio de espectroradiômetro (Ocean Optics, USB2000+RAD, Dunedin, EUA). No ensaio, placas foram coletadas nos intervalos de 20, 40, 60, 80,100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240 min, representando doses totais, respectivamente, de 0,65; 1,30; 1,95; 2,60; 3,25; 3,90; 4,55; 5,20; 5,85; 6,50; 7,15; e 7,80 kJ/m². As placas do grupo controle não foram expostas à radiação. Ao fim do período de exposição, as placas foram incubadas por 48 horas, a 27 ± 1°C em ausência total de luz. Avaliou-se então a viabilidade dos conídios nas placas expostas e no grupo controle,

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14/17 conforme método já descrito, e determinou-se a porcentagem de germinação relativa (GR) dos conídios. No caso dos pellets contendo microescleródios foram adicionados 0,03 g de pellets contendo ME de M. anisopliae em placas de Petri (100x15 mm) contendo meio ágar-agua 2% (p/v). Após a adição, as placas foram expostas a 1239,23 mW/m² de radiação ultravioleta em câmara contendo 4 lâmpadas ultravioletas (UVB-313 EL, Q-Lab Corporation, Cleveland, EUA), com produção majoritária de radiação UV-B, e comprimento de onda máximo em 311 nm. Uma vez mais, as placas apresentavam-se cobertas com filme de diacetato de celulose com espessura de 0,13 mm. O espectro de irradiação foi medido com auxílio de espectroradiômetro (Ocean Optics, USB2000+RAD, Dunedin, EUA). Os intervalos de coleta determinados foram de 120, 240, 360, 480, 600 e 720 min, representando doses totais, respectivamente, de 8,92, 17,84, 35,69, 44,61, 53,53 kJ/m². As placas do grupo controle não foram expostas à radiação. Ao fim da exposição as placas foram incubadas em estufa para crescimento microbiológico a 27 ± 1°C por 10 dias e a produção e viabilidade dos conídios foram determinadas, conforme anteriormente descrito.

Caracterização dos pellets [035] Os pellets desenvolvidos apresentaram valores de esfericidade na faixa entre 0,60 e 0,75 (± 0,07), valores considerados satisfatórios. O tamanho médio dos pellets esteve na faixa entre 590 e 640 micrometros, com reduzida dispersão dos valores, o que demonstra a elevada uniformidade de tamanho dos pellets. É importante ressaltar que a faixa de tamanho médio é apropriada para a aplicação pretendida. A Figura 1 mostra a dispersão dos dados de esfericidade e a Figura 2 mostra as micrografias ópticas dos pellets obtidos. [036] A produção de conídios a partir dos pellets secos em leito fluidizado a 40 °C ou a 50 °C foi avaliada e os dados estão apresentados na Figura 3. A produção de conídios foi semelhante para ambas as temperaturas. Não houve perda considerável de viabilidade dos conídios, a qual permaneceu superior a 93% em todos os tempos e para ambas as temperaturas. O efeito da presença de umectante sobre o desenvolvimento de micélio e produção de conídios foi

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15/17 então estudado. Nos pellets à base de vermiculita formulados com 10 % de glicerina, houve desenvolvimento de micélio e produção de conídios, quando os mesmos foram expostos a 91 % UR. No grupo controle, sem glicerina, os pellets expostos a 93 % e 91 % formaram micélio, mas apenas os pellets expostos a 93 % produziram conídios. O desenvolvimento de micélio sobre os pellets com 10 % de glicerina expostos a 91 % UR teve início no 5° dia, e a produção de conídios no 8° dia de exposição, tempo inferior ao do controle. Houve efeito do tipo de carreador na produção de conídios sobre os pellets expostos a 91 % UR. Pellets de vermiculita com 10 % de glicerina tiveram maior e mais rápida produção de conídios em relação aos pellets com celulose, sendo no 20° dia a maior produção (1,1 x 105 ± 5,2 x 103 conídios / mg) (Figura 4).

[037] Nos ensaios de viabilidade após armazenamento, foi possível observar que na temperatura de 4°C o fungo de interesse se apresenta estável, estando melhor adaptado do que possíveis contaminantes. Durante os 21 dias analisados não houve diferença significativa entre os resultados de produção e a viabilidade conidial quando comparados ao tempo zero, mostrando que quando armazenada sob tais condições de tempo e temperatura a formulação se mantém estável.

[038] Os pellets obtidos foram avaliados quanto a sua infectividade. No bioensaio conduzido com exposição de fêmeas ingurgitadas de R. microplus a conídios produzidos a partir dos pellets contendo microescleródios, o tempo médio para observação da conidiogênese sobre as fêmeas tratadas variou de quatro dias a nove dias, dependendo do isolado testado. O período de oviposição das fêmeas, assim como o número de larvas de R. microplus eclodidas, foram reduzidos consideravelmente pela exposição das fêmeas aos tratamentos com Metarhizium spp. (Figura 6).

[039] A virulência de conídios produzidos a partir de microescleródios para o carrapato R. microplus foi demonstrada com pellets de Metarhizium spp. aplicados sobre a superfície de solo estéril úmido. O contato das fêmeas ingurgitadas de R. microplus com os pellets e com os conídios produzidos a

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16/17 partir destes em placas de Petri proporcionou condição favorável à infecção pelo fungo. Os resultados obtidos a partir do bioensaio possibilitaram selecionar dois isolados de M. anisopliae s.s. (CG 47 e IP 119) por apresentarem relevante produção de conídios a partir dos pellets e menor tempo para início de conidiogênese sobre fêmeas ingurgitadas de R. microplus. O menor tempo (dias) para detecção de conidiogênese dos fungos sobre as fêmeas de R. microplus esteve diretamente associado ao menor número de larvas eclodidas. Isso refere-se também ao fato de que as fêmeas tiveram menos tempo para realizar oviposição, pois o número de larvas gerado por fêmea é, de forma geral, relacionado à sua capacidade de conversão do seu peso em ovos.

[040] Por fim, os conídios de M. anisopliae e os microescleródios incorporados em pellets selecionados foram avaliados quanto a sua tolerância à radiação UV-B. Foi possível observar que com aumento no tempo e, consequentemente, na dose aplicada houve redução da viabilidade dos conídios, até que ao fim de 240 min de exposição não foi mais possível observar germinação conidial. O isolado IP 119, se apresentou sensível à radiação UV-B, com decréscimo importante na germinação, mesmo após poucas horas de exposição, indicando uma provável redução da eficácia de tais propágulos após aplicação (Figura 7). A dose letal mediana (DL50), ou seja, a dose de radiação necessária para inviabilizar 50% dos conídios submetidos ao ensaio foi calculada como sendo 5,545 ± 0,059 kJ/m² (intervalo de confiança 95%: 5,42 - 5,67). Em seguida, os pellets foram avaliados e pode-se notar que mesmo após 12 horas de exposição à radiação UV-B, equivalente a uma dose de 53,5 kJ/m², a germinação de conídios obtidos a partir da formulação peletizada permaneceu alta (-98%), fato contrário ao que se observa quando apenas conídios do mesmo fungo foram expostos a uma dose bastante inferior (7,8 kJ/m²). A Figura 8 apresenta esses dados e sua análise permite observar a redução na produção de conídios obtidos a partir dos pellets contendo ME expostos à radiação UV-B quando comparado ao controle não-irradiado. Essa redução foi independente da dose de energia luminosa considerando a faixa estudada. Os

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17/17 resultados obtidos sugerem que a radiação UV-B afetou principalmente aqueles ME presentes na superfície dos pellets. Dessa forma, sugere-se que a radiação não foi capaz de penetrar a estrutura dos pellets. Com isso, os pellets podem se apresentar como forma adicional de proteção aos propágulos fúngicos, podendo ser considerados veículos eficazes para fungos entomopatogênicos usados no controle biológico de pragas no solo, como o R. microplus.

[041] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outros variantes, abrangidos no escopo das reivindicações anexas. Embora a versão preferida da invenção tenha sido ilustrada e descrita, deve ser compreendido que a invenção não é limitada. Diversas modificações, mudanças, variações, substituições e equivalentes poderão ocorrer, sem que haja desvio do escopo da presente invenção.

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Claims (10)

1. Reivindicações

   1. Composição e processo de preparação multiparticulada de natureza sólida contendo microescleródios de Metarhizium Anisopliae para controle de artrópodes-praga de importância na saúde humana; veterinária e na agropecuária e seus usos caracterizado por possuir de 78% a 100%, de vermiculita, de 20 a 100% de terra diatomácea, de 0 a 20% de silicato de alumínio e magnésio, adicionado como pó ou como dispersão aquosa, de 0 a 5% de dióxido de silício coloidal, quantidade adequada de propágulos fúngicos, em particular, de microescleródios;
2. 2. Composição e processo de preparação multiparticulada de natureza sólida contendo microescleródios de Metarhizium Anisopliae para controle de artrópodes-praga de importância na saúde humana veterinária e na agropecuária e seus usos caracterizado por possuir de 70 a 100% de celulose microcristalina, em diferentes graus, de 5 a 30% de terra diatomácea, e quantidade apropriada de propágulos fúngicos, em especial, microescleródios;
3. 3. Composição e processo de preparação multiparticulada de natureza sólida contendo microescleródios de Metarhizium Anisopliae para controle de artrópodes-praga de importância na saúde humana veterinária e na agropecuária e seus usos caracterizado por possuir de 40 a 90% de celulose microcristalina, em diferentes graus, de 5 a 30% de terra diatomácea, de 0 a 30% de glicerina ou outro umectante de natureza orgânica ou inorgânica e quantidade apropriada de propágulos fúngicos, em especial, microescleródios;
4. 4. Composição e processo de preparação multiparticulada de natureza sólida contendo microescleródios de Metarhizium Anisopliae para controle de artrópodes-praga de importância na saúde humana veterinária e na agropecuária e seus usos caracterizado por possuir, de acordo com as reivindicações de 1 a 3, os componentes inorgânicos selecionados do grupo que consiste diversas argilas in

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   2/3 natura ou purificadas, ou ainda quimicamente modificadas, entre outros materiais inorgânicos;
5. 5. Composição e processo de preparação multiparticulada de natureza sólida contendo microescleródios de Metarhizium Anisopliae para controle de artrópodes-praga de importância na saúde humana veterinária e na agropecuária e seus usos caracterizado por compreender misturas de materiais inorgânicos diversos como celulose microcristalina ou outro polímero orgânico que atue como aglutinante, lubrificante, desintegrante ou conferindo funcionalidade diversa à formulação e ou seu material ativo (propágulo fúngico), entre outros;
6. 6. Composição e processo de preparação multiparticulada de natureza sólida contendo microescleródios de Metarhizium Anisopliae para controle de artrópodes-praga de importância na saúde humana veterinária e na agropecuária e seus usos caracterizado por ser aplicada diretamente no solo ou em locais de confinamento ou em armadilhas localizadas em espaços internos ou externos e assim promover controle biológico de diferentes artrópodes-praga;
7. 7. Composição e processo de preparação multiparticulada de natureza sólida contendo microescleródios de Metarhizium Anisopliae para controle de artrópodes-praga de importância na saúde humana veterinária e na agropecuária e seus usos caracterizado por ser preparada na forma de grânulos de tamanho e forma irregular obtidos por processo de aglomeração por via úmida ou via seca, revestimento ou qualquer outro processo similar;
8. 8. Composição e processo de preparação multiparticulada de natureza sólida contendo microescleródios de Metarhizium Anisopliae para controle de artrópodes-praga de importância na saúde humana veterinária e na agropecuária e seus usos caracterizado por ser preparada na forma peletizada por extrusão-esferonização ou por

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   3/3 qualquer outro método de aglomeração que resulte em sistemas esféricos ou quase esféricos, revestidos ou não.
9. 9. Composição e processo de preparação multiparticulada de natureza sólida contendo microescleródios de Metarhizium Anisopliae para controle de artrópodes-praga de importância na saúde humana veterinária e na agropecuária e seus usos caracterizado por ser preparada com o isolado em questão ou quaisquer outros isolados de fungos do gênero Metarhizium ou de outras espécies de fungos entomopatogênicos capazes de serem usadas no controle biológico de artrópodes;
10. 10. Composição e processo de preparação multiparticulada de natureza sólida contendo microescleródios de Metarhizium Anisopliae para controle de artrópodes-praga de importância na saúde humana veterinária e na agropecuária e seus usos caracterizado por ser capaz de aumentar significativamente a tolerância dos propágulos fúngicos frente à radiação UV-B.

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    Τ'

    ο.οοF3 F4 F5

    Fo/muíações