BR102016013224A2 - Acinetobacter baumannii antigens and respective uses - Google Patents

Acinetobacter baumannii antigens and respective uses Download PDF

Info

Publication number
BR102016013224A2
BR102016013224A2 BR102016013224-0A BR102016013224A BR102016013224A2 BR 102016013224 A2 BR102016013224 A2 BR 102016013224A2 BR 102016013224 A BR102016013224 A BR 102016013224A BR 102016013224 A2 BR102016013224 A2 BR 102016013224A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
acinetobacter baumannii
antibody
seq
Prior art date
Application number
BR102016013224-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Yang Chiou-Ying
Original Assignee
National Chung Hsing University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Chung Hsing University filed Critical National Chung Hsing University
Publication of BR102016013224A2 publication Critical patent/BR102016013224A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0208—Specific bacteria not otherwise provided for
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/05—Actinobacteria, e.g. Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Bifidobacterium, Gardnerella, Corynebacterium; Propionibacterium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1214—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1218—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Acinetobacter
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/22—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Neisseriaceae (F), e.g. Acinetobacter
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

a presente invenção refere-se a um antígeno de polipeptídeo isolado da acinetobacter baumannii, caracterizado por compreender, pelo menos, uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de(as): (a) id seq. nº 1-5; (b) uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 80% da identidade de sequência para a id seq. nº 1, 3, 4 ou 5, (c) uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 60% da identidade de sequência para a id seq. nº 2, e (d) um fragmento da sequência de aminoácidos de acordo com (a) a (c), em que o polipeptídeo, tendo a sequência de aminoácidos de acordo com (b) a (d), tem atividade imunoestimulatória. os antígenos de polipeptídeo universais da acinetobacter baumannii podem ser utilizados na preparação de vacina universal. os anticorpos correspondentes podem ser utilizados no diagnóstico e tratamento da acinetobacter baumannii.

Description

"ANTÍGENOS DE ACÍNETOBACTER BAUMANNII E USOS RESPECTIVOS".
REFERÊNCIA-CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO
[0001] O presente pedido reivindica a prioridade do pedido de patente taiwanês n° 104118940, depositado em 11 de junho de 2015, que é incorporado aqui por referência.
HISTÓRICO DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção refere-se ao antígeno utilizado para obter resposta imunológica, mais particularmente, refere-se ao antígeno de polipeptídeo contra a Acínetobacter baumannii. A presente invenção refere-se, ainda, à composição da vacina, compreendendo o antígeno de polipeptídeo contra a Acínetobacter baumannii e o anticorpo especificamente ligado ao antígeno de polipeptídeo da Acínetobacter baumannii. Além disso, a presente invenção refere-se ao ácido nucleico isolado, codificando o antígeno de polipeptídeo da Acínetobacter baumannii, ao vetor de expressão contendo o ácido nucleico isolado e à célula hospedeira contendo o vetor de expressão.
TÉCNICAS PRÉVIAS
[0003] As Acínetobacter spp. são amplamente distribuídas na natureza. Elas são bactérias gram-negativas e são divididas aproximadamente em 20 espécies. Entre elas, a Acínetobacter baumannii é a mais geral e bem-estudada. Elas conseguem sobreviver em uma variedade de superfícies, sejam úmidas ou secas, e se tornaram um dos patógenos nosocomiais mais comuns no hospital. A Acínetobacter baumannii é um patógeno humano oportunista. Normalmente, é não patogênico a um indivíduo saudável, embora cause doenças clínicas graves quando o indivíduo está com o sistema imunológico comprometido.
[0004] Em geral, a Acinetobacter baumannii é encontrada em vários objetos ou dispositivos em um hospital, tais como luvas, seringas, agulhas, carrinhos, respiradores, camas, armários, pias, pisos e saídas de ar condicionado, até em um estetoscópio ou laudos médicos. Particularmente, a Acinetobacter baumannii aparece com frequência em ambientes mornos e úmidos tais como água potável, alimentos, e canais de drenagem, bem como no corpo humano, tais como na pele, axilas, conjuntiva, cavidade oral, trato respiratório superior, nasofaringe, trato gastrointestinal, uretra, etc. Os pacientes ou suas famílias em contato com estas bactérias geralmente ficam doentes quando o seu sistema imunológico está fraco. Em particular, durante os tratamentos invasivos, tais como incubação ou cirurgia, os pacientes teriam um risco maior de serem infectados por estes patógenos oportunistas. Portanto, a probabilidade de infecção nosocomial aumentou e, portanto, se tornou um problema sério de saúde no que se refere aos pacientes e ao cuidado com a saúde.
[0005] Geralmente, os antibióticos são comumente utilizados para o tratamento de infecção bacteriana. No entanto, devido ao uso em excesso de antibióticos, algumas bactérias tornaram-se gradualmente resistentes aos mesmos e são difíceis de eliminar. A forma de superar este problema é tratar com antibióticos diferentes ou aplicar antibióticos novos, porém caros. Se não houver uma forma eficaz de inibir a evolução da resistência das bactérias às drogas, nenhum antibiótico disponível para curar a infecção bacteriana chegará à característica próxima. Em relação à Acinetobacter baumannii, que causa infecções nosocomiais, muitas estirpes multirresistentes à droga foram isoladas. Uma vez que elas conseguem sobreviver por algum tempo na superfície de um objeto, há a necessidade de fornecer um tratamento ou método de prevenção adequado para que o problema da infecção nosocomial possa ser reduzido.
[0006] Vacinar os indivíduos para gerar a proteção contra a infecção bacteriana pode ser uma forma eficaz de solucionar o problema descrito acima. A maioria das vacinas é produzida por patógenos inativados ou atenuados e, então, todos os patógenos tratadas são injetados em um indivíduo. 0 indivíduo imunizado responde produzindo ambas as respostas, humoral (isto é, anticorpo) e celular (isto é, célula T reguladora, auxiliar ou citotóxica), assim, o patógeno que invade uma hospedeira mais tarde pode ser neutralizado e removido. No entanto, o uso de vacinas de patógeno inativado ou atenuado para a prevenção de doenças pode ser perigoso, especialmente quando a patologia e a respectiva natureza de atenuação não são claras. Portanto, a composição da vacina compreendendo os antígenos de epitopos do patógeno, que pode estimular uma resposta imunológica, em vez de introduzir todo o patógeno, é atualmente um dos métodos principais para preparação de vacinas mais seguras.
[0007] No entanto, a identificação de antígenos específicos para preparar a vacina é difícil. Em estudos anteriores, Pantophlet et al. identificaram estirpes de Acinetobacter pelo antígeno 0 do lipopolissacarídeo e anticorpos correspondentes {Pantophlet R. et al., Clinicai and Diagnostic Laboratory Immunology, 9, 60- 65, 2002), porém não divulgaram outros antígenos e quaisquer aplicações da vacina respectiva. Embora a patente Americana 6.562.958 tenha divulgado cerca de 4000 sequências de aminoácidos e nucleotídeo relativas à Acinetobacter baumannii, elas estão, em sua maioria, com função não identificada e não se sabe se o gene pode ser expresso ou não. Portanto, para prevenir e diagnosticar a infecção por Acinetobacter baumannii, há uma necessidade urgente de encontrar os antígenos alvo para obter a resposta imunológica de forma eficiente e os anticorpos específicos utilizados no diagnóstico e tratamento da infecção por Acinetobacter baumannii.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0008] Tendo em vista as razões acima, um objetivo da presente invenção é fornecer um antígeno de polipeptídeo universal das estirpes de Acinetobacter para preparar a composição da vacina para obter imunidade protetora contra a infecção por Acinetobacter baumannii ou infecção por outros patógenos tendo antígenos semelhantes. Outro objetivo da presente invenção é fornecer um anticorpo especificamente direcionado contra os antígenos de polipeptídeo descritos anteriormente para o diagnóstico ou tratamento de um indivíduo infectado com Acinetobacter baumannii.
[0009] No intuito de atingir os objetivos acima, um antígeno de polipeptídeo isolado de Acinetobacter baumannii é fornecido. 0 antígeno de polipeptídeo isolado compreende, pelo menos, uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de (as) : (a) ID SEQ. N° 1-5; (b) uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 80% da identidade de sequência para a ID SEQ. N° 1, 3, 4 ou 5; (c) uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 60% da identidade de sequência para a ID SEQ. N° 2; e (d) um fragmento da sequência de aminoácidos de acordo com (a) a (c); caracterizado pelo polipeptídeo, tendo a sequência de aminoácidos de acordo com (b) a (d), ter atividade imunoestimulatória. A sequência de aminoácidos das ID SEQ. N° 1-5 refere-se à listagem de sequência.
[0010] Em uma aplicação da presente invenção, um anticorpo direcionado contra Acinetobacter baumannii é fornecido. O anticorpo se liga especificamente aos antígenos de polipeptídeo supracitados, caracterizado pelo anticorpo poder ser um anticorpo policlonal ou anticorpo monoclonal. Além de normalmente a estrutura intacta do anticorpo ter duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, o anticorpo também pode ser o fragmento do anticorpo respectivo, mas reconhecendo o mesmo antígeno. Exemplo do fragmento do anticorpo inclui, mas não se limita a anticorpo Fab, F (ab')2, Fv ou ScFv.
[0011] Em uma aplicação da presente invenção, uma composição farmacêutica, compreendendo o anticorpo supracitado, e um transportador farmaceuticamente aceitável é fornecido.
[0012] Em outra aplicação da presente invenção, um método para direcionar uma Acinetobacter baumannii é fornecido. 0 método compreende as etapas de fornecimento do anticorpo, caracterizado pelo anticorpo poder se ligar especificamente ao antigeno de polipeptídeo, por em contato o anticorpo com uma amostra e detectar e analisar um complexo imunológico formado pelo anticorpo e o antigeno de polipeptídeo na Acinetobacter baumannii com reagentes ou instrumentos para determinar a presença da Acinetobacter baumannii na amostra. 0 método determinado pode ser Western blot, ELISA ou habilidades comuns com base na reação imunológica na técnica.
[0013] Em uma aplicação adicional da presente invenção, um kit de diagnóstico para detecção da Acinetobacter baumannii, compreendendo o anticorpo supracitado, é também fornecido.
[0014] Ainda em outra aplicação, a presente invenção fornece um método para prevenir infecções bacterianas através da vacinação de um indivíduo com um antigeno de polipeptídeo descrito acima. Em uma aplicação adicional, a presente invenção também fornece uma composição de vacina, compreendendo, pelo menos, um antigeno de polipeptídeo da Acinetobacter baumannii. A composição de vacina pode, ainda, compreender um transportador farmaceuticamente aceitável ou um adjuvante. A definição de "transportador farmaceuticamente aceitável" se destina a abranger qualquer transportador que não interfira na efetividade da atividade biológica do ingrediente ativo e não seja tóxico ao hospedeiro sendo administrado. O transportador farmaceuticamente aceitável pode incluir, mas não se limita a diluentes, estabilizantes, conservantes, antioxidantes, agentes dispersantes, agentes solubilizantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, adjuvantes e agentes imunoestimulatórios e quaisquer combinações respectivas· 0 termo "adjuvante", conforme aqui utilizado, refere-se a uma substância distinta do antigeno alvo que é capaz de aumentar a resposta antigênica. 0 adjuvante pode ser, mas não se limita a adjuvante Gerbu, Corynebacterium ou micobactéria, toxina colérica, toxoide tetânico ou uma variedade de emulsões óleo-água (p.ex., IDEC-AF). Além disso, o adjuvante pode também incluir sais minerais ou géis minerais (p.ex., hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e fosfato de cálcio}, substâncias ativas de superfície (p.ex., lisolecitina) e moléculas imunoestimulatórias {p.ex., saponina), oligonucleotídeos, interleucina-2 e assim por diante.
[0015] Para obter o antigeno de polipeptídeo descrito acima, em uma aplicação da presente invenção, um ácido nucleico isolado para codificar um antigeno de polipeptídeo da Acínetobacter baumannii é fornecido. O ácido nucleico isolado, codificando um antigeno de polipeptídeo da Acínetobacter baumannii, compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de(as): (a) ID SEQ. N° 1-5; (b) uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 80% da identidade de sequência para a ID SEQ. N° 1, 3, 4 ou 5; (c) uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 60% da identidade de sequência para a ID SEQ. N° 2; e (d) um fragmento da sequência de aminoácidos de acordo com (a) a (c); caracterizado pelo polipeptídeo, tendo a sequência de aminoácidos de acordo com (b) a (d) , ter atividade imunoestimulatória.
[0016] Em um aspecto, o ácido nucleico isolado pode ter uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 6-10.
[0017] Em uma aplicação adicional da presente invenção, um vetor de expressão é fornecido. O ácido nucleico codificando o antígeno de polipeptídeo pode ser clonado no vetor de expressão, ligado a um fator regulador de transcrição, para expressão do antígeno de polipeptídeo necessário. O fator regulador de transcrição pode regular diretamente, por exemplo, atos no operão (p.ex., operon lac) para iniciar a transcrição ou regular indiretamente em enzimas (p.ex., polimerases) necessárias para transcrição ou tradução. Por fim, o antígeno de polipeptídeo supracitado foi expresso.
[0018] Em uma aplicação adicional da presente invenção, a célula hospedeira transformada com o vetor de expressão ou um ácido nucleico de forma a expressar o antígeno de polipeptídeo é fornecido.
[0019] Em uma aplicação adicional, a presente invenção fornece um kit de diagnóstico para detectar a Acinetobacter baumannii. Um kit de diagnóstico compreende um par de iniciadores, caracterizado pelo par de iniciadores amplificar um ácido nucleico modelo em uma amostra contendo Acinetobacter baumannii para produzir um ácido nucleico ou um fragmento respectivo com um método PCR {reação em cadeia da polimerase). Os iniciadores podem amplificar o comprimento total do ácido nucleico da Acinetobacter baumannii ou parte dele. Consequentemente, a Acinetobacter baumannii não pode ser apenas detectada por anticorpos direcionados contra, mas também pelo DNA respectivo de forma que o objetivo de monitorar a Acinetobacter baumannii seja alcançado.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0020] A presente invenção será aparente àqueles especialistas na técnica ao ler a descrição detalhada a seguir, de uma aplicação preferida respectiva, com referência aos desenhos anexados, em que: [0021] A FIG. 1 mostra os resultados da eletroforese 2D analisada com Western blot e mancha prata para detecção dos antígenos com atividade indutora de imunidade em membrana externa da Acinetobacter baumannii, de acordo com o Exemplo 1 da presente invenção. (A) e (B) mostram os resultados reagidos por soros humanos diferentes. Em cada figura, os painéis, esquerdo e direito, são os resultados da análise de Western blot e mancha prata, respectivamente. As setas representam os pontos imunoativos.
[0022] A FIG. 2 mostra os resultados da análise de Western blot com os soros humanos e a mancha azul de Coomassie das proteínas recombinantes expressas por plasmídeo (a) pET-NcsP e (b) pET-TonB-R, de acordo com o Exemplo 1 da presente invenção. 'M' representa os marcadores de proteína, representa nenhuma adição de IPTG, '+' representa adição de IPTG para induzir a expressão de proteína, 'CB' representa azul de coomassie, yHS-AB' representa os soros humanos, e '*' representa a proteína recombinante alvo expressa.
[0023] A FIG. 3 mostra as taxas de sobrevivência dos ratos imunizados com antígeno (a) NcsP, (b) TonB-R, (c) Pasel, e (d) Pase2 após o teste desafio, de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção. 'PBS' representa o grupo de controle.
[0024] A FIG. 4 mostra os resultados do ensaio MTT em relação aos antígenos de polipeptídeo de acordo com o Exemplo 4 da presente invenção.
[0025] A FIG. 5 mostra os resultados do teste bactericida do antissoro anti-GPl de acordo com o Exemplo 6 da presente invenção. 'NS' representa o soro normal.
[0026] A FIG. 6 mostra os resultados da análise de Western blot da proteína recombinante GPl com soros humanos, de acordo com o Exemplo 6 da presente invenção. Vias: 1-proteína A da membrana externa de Acinetobacter baumannii; 2-TonB-R; e 3- GPl. 'NHS' representa os soros humanos normais (painel esquerdo) (controle). 'HS-AB' representa os soros de um paciente infectado com Acinetobacter baumannii (painel direito).
DESCRIÇÃO DETALHA DAS APLICAÇÕES PREFERIDAS
[0027] A presente invenção fornece um antígeno de polipeptídeo isolado da Acinetobacter baumannii. O antígeno de polipeptídeo isolado compreende, pelo menos, uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de(as): (a) ID SEQ. N° 1-5; (b) uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 80% da identidade de sequência para a ID SEQ. N° 1, 3, 4 ou 5; (c) uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 60% da identidade de sequência para a ID SEQ. N° 2; e (d) um fragmento da sequência de aminoácidos de acordo com (a) a (c) ; caracterizado pelo polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com (b) a (d) ter atividade imunoestimulatória.
[0028] Os números de identidade da sequência (ID SEQ. N°) para o aminoácido e sequências de nucleotídeo correspondentes dos antigenos de polipeptídeo estão listados na Tabela 1. As informações detalhadas da sequência de nucleotídeo e aminoácido de cada número de identidade da sequência estão listadas na Listagem de Sequência. _________________TABELA 1_______________________________________ Sequências de Sequências de Polipeptídeos ____aminoácidos_______________nucleotídeos__ ________NcsP____________ID SEQ. N° 1__________ID SEQ. N° 6 _______TonB-R___________ID SEQ. N° 2__________ID SEQ. N° 7 ________Pasel___________ID SEQ. N° 3__________ID SEQ. N° 8 ________Pase2___________ID SEQ. N° 4__________ID SEQ. N° 9 ________GP1_____________ID SEQ. N° 5__________ID SEQ. N° 10 [0029] As ID SEQ. N° 1-5 são as sequências de aminoácidos dos polipeptídeos que servem como antigenos de polipeptídeo, de acordo com os Exemplos da presente invenção, enquanto as ID SEQ. N° 6-10 são as sequências de nucleotídeos correspondendo às ID SEQ. N° 1-5. Em uma aplicação, o antígeno de polipeptídeo pode ter uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de (a)-(d), ou uma combinação respectiva, e tem atividade imunoestimulatória. Além de qualquer sequência de aminoácidos estabelecida nas ID SEQ. N° 1-5, o antígeno de polipeptídeo também pode ter uma sequência de aminoácidos que é 20% ou menos de substituição, deleção ou adição com base no comprimento total de uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer um das ID SEQ. N° 1, 3, 4 e 5, ou uma sequência de aminoácidos que é de 40% ou menos de substituição, deleção ou adição com base no comprimento total de uma sequência de aminoácidos estabelecida na ID SEQ. N° 2. Além disso, o antígeno de polipeptídeo pode também ser um fragmento do polipeptídeo de comprimento total ou derivados respectivos.
[0030] O termo "isolado", conforme utilizado aqui, refere-se a um padrão ou composição de um objeto que é diferente daquele no ambiente natural e é isolado ou purificado do ambiente natural ou produzido por métodos artificiais.
[0031] O termo "antígeno", conforme utilizado aqui, se refere a um material sendo capaz de introduzir uma resposta imunológica em um indivíduo, a saber, um material tendo atividade imunoestimulatória. O termo "atividade imunoestimulatória", conforme utilizado aqui, se refere à indução de uma resposta imunológica inicial tal como resposta humoral (isto é, anticorpo) e/ou celular (isto é, célula T reguladora, auxiliar ou citotóxica) ao administrar um antígeno a um indivíduo. Como tal, o antígeno é reconhecido e ligado, e é finalmente eliminado. Geralmente, a resposta imunológica pode ser obtida apenas por antígenos, ou ser aumentada pela assistência do adjuvante. Portanto, um "antígeno de polipeptídeo da Acinetobacter baumanníí", conforme utilizado aqui, se refere a um antígeno que é um polipeptídeo ou um análogo respectivo e é capaz de induzir a resposta imunológica supracitada.
[0032] 0 termo "substituição, deleção ou adição de uma sequência de aminoácidos", conforme utilizado aqui, se refere à substituição de um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácidos original, deleção de um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácidos original, adição de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos original ou modificação pela combinação respectiva. Os análogos modificados têm identidade pré-determinada com sequência de aminoácidos original. Em geral, com base no comprimento total de uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das ID SEQ. N° 1, 3, 4 e 5, 20% ou menos da substituição, deleção ou adição é realizada, preferencialmente 10% ou menos, mais preferencialmente 5% ou menos, e o mais preferido 1-5 aminoácidos; a saber, o grau de identidade da sequência é de 80% ou mais. Além disso, com base no comprimento total de uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer um da ID SEQ. N° 2, 40% ou menos da substituição, deleção ou adição é realizada, preferencialmente 20% ou menos, mais preferencialmente 5% ou menos, e o mais preferido 1-5 aminoácidos; a saber, o grau de identidade da sequência é de 60% ou mais.
[0033] O termo "fragmento de um polipeptídeo", conforme utilizado aqui, se refere a uma parte da sequência de aminoácidos original ou combinação das partes respectivas.
Ele não compreende a deleção de 20% ou 40% ou menos mencionada acima.
[0034] A identidade das sequências de amíno pode ser determinada por um software conhecido na técnica; por exemplo, o método BLAST descrito por Altschul et al. (Nucleic Acíds Res. 25:3389-3402, 1997). O software BLAST pode ser obtido no Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (NCBI / National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast/blast.cgi)).
[0035] Para os objetivos da presente invenção, o algoritmo tBLAST com as seguintes configurações pré-definidas é utilizado: Limiar esperado: 10; tamanho da palavra: 3; correspondências máxima em uma faixa de pesquisa: 0; Matriz: BLOSUM6 2; Existência: 11, Extensão: 1; Ajustes composicionais: ajuste de matriz de classificação composicional condicional; Filtro: Regiões de baixa complexidade selecionadas; Mascaramento: não selecionado.
[0 036] 0 termo " Acinetobacter baumanníi'', conforme utilizado aqui, refere-se à espécie Acinetobacter baumanníi, conforme classificada em Acinetobacter Molecular Biology {Ed.: Ulrike Gerischer, Caister Academic Press, 2008). A espécie Acinetobacter baumanníi compreende ATCC 17978 e 6200, SDF..., etc. recitados na Tabela 2. As referências e informações em relação a estas estirpes podem ser recebidas na homepage de Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode =Undef&id=470&Ivl=3&keep%20=l&srchmode=l&unlock).
[0037] A tabela 2 abaixo mostra a conservação da identidade de sequência de aminoácidos de proteínas codificadas por várias estirpes da Acinetobacter baumannii. Os cinco polipeptídeos de acordo com a presente invenção, a saber, NcsP, TonB-R, Pasel, Pase2 e GPl são, respectivamente, comparados a outros 29 polipeptídeos homólogos codificados por estirpes diferentes da Acinetobacter baumannii. Tendo em vista a Tabela 2, as identidades entre os NcsP, TonB-R, Pasel, Pase2 e GPl respectivos e vários polipeptídeos homólogos são, em sua maioria, tão altas quanto 98-99%, enquanto apenas parte de TonB-R, cujas identidade entre polipeptídeos homólogos são de 60% ou mais. O grau elevado da identidade de sequência de aminoácidos das proteínas homólogas em várias estirpes da Acinetobacter baumannii mostra que os polipeptídeos de acordo com a presente invenção têm especificidade ampla e, portanto, têm valores terapêuticos altos. Em conformidade com o ensaio bactericida do soro e o ensaio de proteção ativa em um rato, os resultados respectivos indicam que os cinco polipeptídeos de acordo com a presente invenção podem ser determinados como bons antígenos de polipeptídeo universais para preparar vacinas para prevenir a infecção por Acinetobacter baumannii. TABELA 2________________________________________ [0038] O polipeptídeo servido como um antígeno da Acinetobacter baumanníi pode ser preparado pelos métodos comuns de engenharia genética da técnica. O DNA codificando o polipeptideo é ampliado por PCR e, então, clonado em um vetor de expressão (Vide Sambrook et ai., Molecular Clonlng: A-Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Segunda (1998) e Terceira (2000) Edição; Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, Genetlcs and Molecular Biology, Methods ín Enzymology, Guthrie & Fink, Academic Press, San Diego, Calif., 1991, e Hitzeman et al., J. Biol. Chem. , 255:12073-12080, 1990). Além disso, o polipeptídeo pode também ser sintetizado com os outros métodos conhecidos na técnica.
[0039] De acordo com a presente invenção, o antígeno de polipeptideo é identificado pela abordagem imunoproteômica e vacinologia reversa. A seguir será apresentada uma descrição detalhada em relação à triagem, identificação do antígeno de polipeptideo da Acinetobacter baumannii e imunidade respectiva. EXEMPLO 1 TRIAGEM E IDENTIFICAÇÃO DOS ANTÍGENOS NCSP E
TONB-R
[0040] Os antígenos NcsP e TonB-R foram identificados pela abordagem imunoproteômica neste exemplo. Primeiro, o sangue dos pacientes foi coletado e o soro foi obtido por centrífuga. Então, a análise de Western blot foi realizada ao usar o antissoro para reagir com as proteínas totais dos isolados clínicos da Acinetobacter baumannii taiwanesa e o soro com anticorpos especificamente direcionados contra a Acinetobacter baumannii foi identificado (referido aqui como HS-AB). Além disso, a proteína da membrana externa da Acinetobacter baumannii foi extraída e isolada e a eletroforese 2D respectiva foi realizada. Uma das cópias dos géis de eletroforese obtidas foi, então, realizada por mancha prata e a outra foi imunodetectada por HS-AB. Os resultados são mostrados na FIG. 1. Ao comparar os géis de Western blot e mancha prata, a proteína na mancha prata correspondente ao ponto imunoativo em Western blot foi recuperado e sujeito à análise de espectrometria de massa (MS | mass spectrometric). 0 resultado da MS mostra que as proteínas alvo com as classificações mais altas são da suposta superfamília do domínio LysM da estirpe AB SDF (YP_001707847) e receptor da membrana externa da estirpe AB ACICU (YP_001845144), respectivamente. Com base na característica da sequência, YP_001707847 é prevista para ser uma proteína secretória não clássica, e YP_001845144 é prevista para ser uma suposta proteína férrica do receptor de sideróforo.
[0041] Para confirmar que estes dois antígenos são reconhecidos por HS-AB, os procedimentos de expressão e clonagem de gene foram realizados. Primeiro, os iniciadores para PCR foram projetados de acordo com a sequência de DNA codificando YP_001707847 e YP_001845144. Os isolados clínicos da Acinetobacter baumanníi taiwanesa supracitados foram fornecidos como modelos, e então, o PCR de colônia foi realizado por iniciadores descritos anteriormente. Os produtos do DNA amplificado codificando estes dois antígenos foram clonados respectivamente em pGEM-T Easy para sequenciação. Conforme a listagem de sequência mostra, a identidade entre a sequência de DNA amplificado precedente {ID SEQ. N° 6) e YP_001707847 é de 98%, enquanto entre a última sequência de DNA amplificado {ID SEQ. N° 7) e YP_0 01845144 é tão alta quanto 99%. Por outro lado, em comparação com a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de DNA anterior, a identidade entre a sequência de aminoácidos precedente (ID SEQ. N° 1) e YP_001707847 é de 99%, enquanto entre a última sequência de aminoácidos {ID SEQ. N ° 2) e YP_001845144 é tão alta quanto 99%. Os resultados mostram que as proteínas expressáveis tríadas devem ser YP_001707847 e YP_001845144. Portanto, os polipeptídeos tendo sequências estabelecidas nas ID SEQ. N° 1 e 2 são aqui referidos como "NcsP" e "TonB-R".
[0042] Após isso, os produtos de DNA amplificado por PCR supracitados foram, ainda, clonados no vetor de expressão pET-21 (designado como pET-NcsP e pET-TonB-R, respectivamente), e então, que foram transformados em E. coli L303 (DE3) . IPTG foi utilizado para regular a expressão da proteína, e a proteína recombinante expressa foi analisada pela análise de Western blot. A proteína recombinante expressa foi determinada pela detecção de HS-AB do soro humano, e o resulto é mostrado na FIG. 2. Conforme é mostrado, as proteínas recombinantes expressas pelo gene de NcsP e TonB-R são ambas reconhecidas pelo HS-AB do soro humano de forma que NcsP e TonB-R serem os antígenos alvo de HS-AB é confirmado. Além disso, o resultado é também a primeira evidência para confirmar que YP_001707847/NcsP e YP_001845144/TonB-R são realmente expressáveis em Acinetobacter baumannii e têm antigenicidade de forma a serem reconhecidas pelo antissoro de pacientes.
[0043] No intuito de confirmar se os genes de NcsP e TonB-R existiram em várias estirpes de Acinetobacter baumannii, a análise de Western blot de centenas de isolados clínicos coletados em Taiwan foi realizada. Os resultados mostram que NcsP e TonB-R são ambos detectados em todas estas estirpes. Entre elas, 10 clones das estirpes de Acinetobacter baumannii foram selecionados aleatoriamente e sequenciadas para que todas estas estirpes fossem confirmadas como tendo estes dois genes. As sequências de aminoácido de NcsP e onB-R foram, ainda, comparadas aos polipeptideos homólogos codificados por outras 29 estirpes de Acinetobacter baumanníi em GenBank, e a identidade elevada entre as estirpes diferentes foi encontrada. Referindo-se à Tabela 2, as identidades da sequência de aminoácidos de NcsP (ID SEQ. N° 1) entre várias estirpes de Acinetobacter baumanníi são tão altas quanto 99%, e as identidades da sequência de aminoácidos de TonB-R (ID SEQ. N° 2) entre várias estirpes são, em sua maioria, tão altas quanto 99%, enquanto apenas parte daquelas cujas identidades são 60% ou mais. Portanto, NcsP e TonB-R existiram universalmente em várias estirpes de Acinetobacter baumanníi e com homologia alta entre as estirpes. EXEMPLO 2 TRIAGEM E IDENTIFICAÇÃO DOS ANTÍGENOS PASE1 E PASE2 [0044] Os antigenos Pasel e Pase2 foram identificados por vacinologia reversa neste exemplo.
Primeiro, o genoma ATCC 17978 foi procurado pela palavra-chave "protease" em uma base de dados de DNA. Lá foram encontrados A1S_2546 e A1S_0699, que foram anotados respectivamente como "serina protease tipo-tripsina secretada" (aqui referida como Pasel) e uma "suposta metaloprotease endopeptidase de glicoproteína" (aqui referida como Pase2). Por comparação, AlS_2546/Pasel e A1S_0699/ Pase2, ambas apareceram em várias estirpes de Acinetobacter baumannii, e as identidades das quais entre várias estirpes são de cerca de 96% ou mais. No entanto, por não saber suas funções, os nomes delas são diferentes.
[0045] No intuito de confirmar se estes dois DNA são expressos, os iniciadores para RT-PCR (transcrição reversa-PCR) foram primeiramente designados de acordo com o genoma ATCC 17978 e, subsequentemente, a RT-PCR foi realizada. Os produtos resultantes com comprimento previsto foram clonados no pGEM-T Easy e sequenciados. Devido aos produtos serem obteníveis por RT-PCR, Pasel e Pase2 foram confirmados como sendo realmente transcritos.
[0046] As sequências de aminoácido de Pasel e Pase2 foram, ainda, comparadas aos polipeptídeos homólogos codificados por outras 29 estirpes de Acinetobacter baumannii em GenBank, e a identidade elevada da sequência de aminoácidos entre as estirpes diferentes também foi encontrada. Referindo-se à Tabela 2, as identidades da sequência de aminoácidos de Pasel (ID SEQ. N° 3) entre várias estirpes de Acinetobacter baumannii são tão altas quanto 99%, e as identidades da sequência de aminoácidos de Pase2 (ID SEQ. N° 4) entre várias estirpes são tão altas quanto 92-100%. Portanto, Pasel e Pase2 são existentes universalmente em várias estirpes de Acinetobacter baumannii e com homologia alta entre as estirpes.
[0047] Após isso, os produtos de DNA amplificado por PCR supracitados foram, ainda, clonados no vetor de expressão pET-21 (designado como pET-Pasel e pET-Pase2, respectivamente) e, então, expressos no exemplo a seguir. EXEMPLO 3 TESTE DE SOBREVIVÊNCIA DE RATOS IMUNIZADOS COM ANTÍGENOS NCSP, TONB-R, PASEl E PASE2 [0048] Para avaliar se as proteínas de NcsP, TonB-R, Pasel e Pase2 são adequadas para serem incluídas como composição da vacina de Acinetobacter baumanníí, os clones de E. coli L337 transformados com pET-NcsP, pET-TonB-R, pET-Pasel e pET-Pase2, foram incubados, e então, o IPTG foi adicionado para induzir, de forma indireta, a expressão das proteínas recombinantes quando o OD6oo da cultura alcançou 0,8-1.
[0049] Após isso, as proteínas recombinantes resultantes (NcsP, TonB-R, Pasel e Pase2) foram isoladas e purificadas por cromatografia em coluna de afinidade ao Ni"+. A pureza das proteínas recombinantes foi verificada subsequentemente por SDS-PAGE, e então, foram aplicadas para imunização de ratos. Além disso, a especificidade do antissoro contra estas proteínas recombinantes foi verificada pela análise de Western blot e ELISA (ensaio imunoadsorvente ligado à enzima). Então, o ATCC 17978 de Acinetobacter baumannii foi utilizado para realizar o teste de desafio pulmonar e as taxas de sobrevivência de ratos imunizados com antígenos NcsP, TonB-R, Pasel e Pase2 foram determinadas. Os ratos foram imunizados por via intraperitoneal com NcsP, TonB-R, Pasel e Pase2 recombinante na presença do adjuvante completo de Freund (FA) para a primeira injeção e FA incompleto para imunização de reforço. Os ratos foram desafiados com ATCC 17978 após a 3a imunização, e os resultados sao mostrados na FIG.3. Como mostrado na FIG. 3, as taxas de sobrevivência de 5-dias dos ratos imunizados são de 10-30% (PBS), 90% (NcsP), 80% (TonB-R), 80% (Pasel), e 90% (Pase2), respectivamente. As taxas de sobrevivência de 5 dias dos ratos imunizados com os antigenos de polipeptídeo de acordo com a presente invenção são significativamente maiores que aquelas do grupo de controle (PBS). Portanto, os antigenos de polipeptídeo de acordo com a presente invenção podem obter imunidade protetora excelente nos ratos recebidos e serem qualificados como composições de vacina candidatas. Nota-se que embora a identidade da sequência de aminoácidos do TonB-R recombinante comparada à sequência correspondente de ATCC 17978 seja apenas de 61%, o efeito da imunidade protetora ainda é significativo. EXEMPLO 4 TESTE DE SEGURANÇA DOS ANTIGENOS NCSP, TONB- R, PASEl E PASE2 [0050] Para confirmar se os antigenos de polipeptídeo de acordo com a presente invenção são citotóxicos ou não, as células epiteliais A549 de adenocarcinoma no pulmão humano foram fornecidas e tratadas com as proteínas recombinantes purificadas (NcsP, TonB-R, Pasel e Pase2), e então, analisadas pelo ensaio MTT. O ensaio MTT pode se referir como descrito no Livro de Sambrook et al. ('Sambrook et al., Molecular Clonlng) . Os resultados são mostrados na FIG. 4. Os resultados indicam que todos estes quatro antigenos não são citotóxicos às células A549. Eles são antigenos de polipeptídeo bons e de segurança, e estão adequavelmente incluídos como composição da vacina para prevenção da infecção por Acinetobacter baumannii.
[0051] Além disso, embora Pasel e Pase2 fossem anotados como "proteases tipo tripsina", nenhuma atividade da protease foi detectada com até 0,5 mg/ml das proteínas recombinantes purificadas usando o kit de ensaio de protease QuantiCleave™. Combinando este atributo com o resultado do ensaio MTT, Pasel e Pase2 foram, ainda, confirmados como sendo não-citotóxicos.
[0052] Com base nos resultados acima, pode-se determinar que NcsP, TonB-R, Pasel e Pasel são todos "expressáveis" em várias estirpes de Acinetobacter baumannii, o que não é conhecido e não foi divulgado ou pensado. Uma vez que as identidades da sequência de aminoácidos entre as estirpes de Acinetobacter baumannii eram altas, a imunidade protetora deve ser toda obtida contra infecções das estirpes diferentes de Acinetobacter baumannii. Além disso, com segurança elevada e nenhuma citotoxicidade, NcsP, TonB-R, Pasel e Pase2 são todos suficientes para serem antígenos candidatos das vacinas de amplo espectro contra Acinetobacter baumannii. EXEMPLO 5 TRIAGEM E IDENTIFICAÇÃO DO ANTÍGENO GPl [0053] O antígeno GPl foi identificado por vacinologia reversa neste exemplo. Primeiro, a sequência de aminoácidos de AIS_0556 (aqui referida como GPl) foi analisada por DOLOP (Base de dados das lipoproteínas bacterianas). O resultado mostra que há uma sequência líder do sinal de lipidação, assim, GPl foi previsto como sendo uma lipoproteina. Além disso, Iwashkiw et ai. descobriram que GPl em ATCC 17978 é modificado por glicosilação (Iwashkiw JA, Seper2 A, Weber BS, Scott NE, Vinogradov E, Stratilo C, Reiz Bet al., 2012. Identification of a general O-linked protein glycosylatíon system in Acinetobacter baumannii and its role in virulence and biofilm formatíon. PLoS Pathogens, 2012). Neste exemplo, o fragmento de DNA codificando a sequência de amino de GPl do resíduo de aminoácido nas posições 39 a 313 foi amplificado por PCR e, então, clonado no vetor de expressão pET21. Pela transformação subsequente para E.coliL311r o gene GPl foi induzido de forma indireta para expressar a proteína recombinante ao adicionar IPTG. A proteína recombinante expressa foi isolada e purificada por cromatografia em coluna de afinidade ao Ni“+. A proteína recombinante purificada foi, então, usada para imunizar os ratos. Após a imunização, a análise de Western blot foi realizada ao usar o antissoro coletado de ratos imunizados para reagir com as proteínas totais dos isolados clínicos da Acinetobacter baumannii taiwanesa. Os resultados mostram que o GPl pode ser detectado em todas as estirpes de Acinetobacter baumannii testadas. Além disso, a sequências de aminoácido de GPl foi comparada aos polipeptídeos homólogos codificados por outras 29 estirpes de Acinetobacter baumannii em GenBank. Consequentemente, a identidade da sequência de aminoácidos é tão alta quanto 95-99% entre as estirpes diferentes (vide Tabela 2) . Ou seja, o GPl também é confirmado como sendo um antígeno conservado da Acinetobacter baumanníí. EXEMPLO 6 TESTE BACTERICIDA DO ANTISSORO COLETADO DE RATOS IMUNIZADOS COM O ANTÍGENO GPl [0054] Para avaliar se a proteína de GPl pode ser englobada na composição da vacina de Acinetobacter baumannii, não somente realizando o teste de sobrevivência in vivo ao desafiar os ratos com ATCC 17978, como declarado anteriormente, o teste bactericida in vitro de ATCC 17978 por anticorpos induzido pelo antígeno de polipeptídeo também é um método comum para determinar a efetividade de uma vacina· [0055] Portanto, neste exemplo, o GPl recombinante purificado por cromatografia em coluna de afinidade à Ni2+ foi utilizado para imunizar os ratos, e então, o antissoro (anti-GPl) recuperado foi utilizado para realizar o teste bactericida. Aproximadamente 100 CFU de Acinetobacter baumannii foram incubadas em 50% de meio de anti-GPl/PBS a 37°C por 4 horas. O número de Acinetobacter baumanníí viável foi determinado, e os resultados são mostrados na FIG. 5. Conforme visto na figura, o número viável de Acinetobacter baumanníí no grupo tratado com anti-GPl é significativamente inferior aquele do grupo de controle (o soro utilizado no controle é de ratos pré-imunizados) . O efeito de anti-GPl (aproximadamente 18%) é até melhor que aquele do anti-NcsP (aproximadamente 35%) e, portanto, é determinado que GPl tem efeito bactericida excelente. Consequentemente, GPl é provado como sendo capaz de induzir uma resposta imunológica protetora, e pode ser um antígeno eficaz englobado em uma vacina. Além disso, pela análise de Western blot, na qual o soro do paciente infectado com Acinetobacter baumannii foi direcionado ao GPl recombinante, e um sinal de reconhecimento especifico foi detectado e mostrado na FIG. 6. Os resultados demonstram que o GPl, de fato, é capaz de obter resposta imunológica humana, e pode servir como uma composição de vacina. EXEMPLO 7 PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS
[0056] A preparação de anticorpos monoclonais pode ser realizada pelo método conhecido na técnica. Os antígenos de polipeptideo/recombinantes supracitados ou fragmentos respectivos foram purificados por cromatografia em coluna de afinidade ao Ni^+. Os ratos BALB/c foram então imunizados com a proteina/antigenos de polipeptídeo na presença do adjuvante de Freund (FA | Freund's adjuvant) completo para a primeira injeção e FA incompleto para imunização de reforço. O intervalo é três vezes por mês, e a dose é de 10-15 çg em cada vez. Após 4 dias do último reforço, o baço dos ratos foi removido, e as respectivas células do baço foram fundidas com Sp2/0-Agl4 do mieloma. A triagem subsequente das células vivas do hibridoma foi realizada com ELISA e análise de Western blot para obter clones de células com especificidades.
[0057] O anticorpo monoclonal criado contra cada antigeno de polipeptideo/proteína recombinante da presente invenção, derivado ou fragmento respectivo pode ser incluído em um kit de diagnóstico para detectar a presença de Acinetobacter baumannií em uma amostra. 0 método de detecção pode ser realizado por especialidades comuns na técnica. 0 anticorpo monoclonal pode ser misturado com uma amostra para analisar a ligação entre o anticorpo e o antígeno para determinar a presença de Acinetobacter baumannií na amostra por absorção ou fluorescência usando reagentes e instrumentos.
[0058] Os anticorpos monoclonais supracitados englobados no kit de diagnóstico podem ser um anticorpo monoclonal direcionado contra um antígeno de polipeptídeo, dois ou mais anticorpos monoclonais direcionados contra um antígeno de polipeptídeo, ou múltiplos anticorpos monoclonais direcionados contra dois ou mais antígenos de polipeptídeo. Através da detecção múltipla, a precisão da detecção pode ser aumentada.
[0059] Além disso, não apenas o anticorpo monoclonal contra o antígeno de polipeptídeo, o anticorpo policlonal ou fragmento respectivo contra o antígeno de polipeptídeo pode ser utilizado para tratar o paciente infectado com Acinetobacter baumannii. Para preparar uma composição farmacêutica, a quantidade eficaz dos anticorpos anteriores descritos pode ser fornecida e/ou formulada com um transportador farmaceuticamente aceitável.
[0060] O anticorpo contido na composição farmacêutica é preferencialmente um anticorpo monoclonal. Conforme descrito acima, o anticorpo utilizado pode ser um anticorpo monoclonal direcionado contra um antígeno de polipeptídeo ou dois ou mais anticorpos monoclonais direcionados contra dois ou mais antígenos de polipeptídeo.
[0061] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência às aplicações preferidas respectivas, é aparente para aqueles especialistas na técnica que uma variedade de modificações e mudanças pode ser feita sem afastar-se do escopo da presente invenção que se destina a ser definida pelas reivindicações anexas. REIVINDICAÇÕES :

Claims (10)

1. Um antígeno de polipeptídeo isolado da Acinetobacter baumannií, caracterizado por compreender, pelo menos, uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de(as): (a) ID SEQ. N° 1-5; (b) uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 80% da identidade de sequência para a ID SEQ. N° 1, 3, 4 ou 5; (c) uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 60% da identidade de sequência para a ID SEQ. N° 2; e (d) um fragmento da sequência de aminoácidos de acordo com (a) a (c); em que o polipeptídeo, tendo a sequência de aminoácidos de acordo com (b) a (d), tem atividade imunoestimulatória.
2. Um anticorpo direcionado contra a Acinetobacter baumannií, caracterizado pelo anticorpo se ligar especificamente ao antígeno de polipeptídeo da reivindicação 1.
3. O anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo monoclonal ou um fragmento respectivo.
4. Uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender o anticorpo da reivindicação 2 ou 3 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
5. Um método para detectar a Acinetobacter baumannii, caracterizado por compreender: fornecer um anticorpo da reivindicação 2; por em contato o anticorpo com uma amostra; detectar e analisar um complexo imunológico formado pelo anticorpo e o antigeno de polipeptídeo na Acinetobacter baumannii para determinar a presença da Acinetobacter baumannii na amostra.
6. Um kit de diagnóstico para detectar a Acinetobacter baumannii, caracterizado por compreender o anticorpo da reivindicação 2.
7. Uso do antigeno de polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser na preparação de uma vacina contra a Acinetobacter baumannii.
8. Uma composição de vacina, caracterizado por compreender, pelo menos, um antigeno de polipeptídeo da reivindicação 1.
9. Um ácido nucleico isolado, codificando um antigeno de polipeptídeo da Acinetobacter baumannii, caracterizado por compreender uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de(as): (a) ID SEQ. N° 1-5; (b) uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 80% da identidade de sequência para a ID SEQ. N° 1, 3, 4 ou 5; (c) uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 60% da identidade de sequência para a ID SEQ. N° 2; e (d) um fragmento da sequência de aminoácidos de acordo com (a) a (c); em que o polipeptídeo, tendo a sequência de aminoácidos de acordo com (b) a (d) , tem atividade imunoestimulatória.
10. Um kit de diagnóstico para detectar a Acinetobacter baumannii, caracterizado por compreender um par de iniciadores, em que o par de iniciadores amplifica um ácido nucleico modelo em uma amostra contendo Acinetobacter baumannii para produzir um ácido nucleico ou um fragmento respectivo da reivindicação 9 com um método PCR (reação em cadeia da polímerase).
BR102016013224-0A 2015-06-11 2016-06-08 Acinetobacter baumannii antigens and respective uses BR102016013224A2 (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW104118940 2015-06-11
TW104118940A TWI649331B (zh) 2015-06-11 2015-06-11 鮑氏不動桿菌（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）多胜肽抗原及其抗體以及編碼該抗原之核酸

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR102016013224A2 true BR102016013224A2 (pt) 2017-09-26

Family

ID=56148122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR102016013224-0A BR102016013224A2 (pt) 2015-06-11 2016-06-08 Acinetobacter baumannii antigens and respective uses

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10124049B2 (pt)
EP (1) EP3103471A3 (pt)
JP (2) JP6334607B2 (pt)
CN (1) CN106243198A (pt)
BR (1) BR102016013224A2 (pt)
TW (1) TWI649331B (pt)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101996643B1 (ko) * 2017-08-01 2019-07-04 한국기초과학지원연구원 아시네토박터 바우마니 감염 진단용 마커 및 이의 용도
CN108503698B (zh) * 2018-05-24 2021-03-05 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 鲍曼不动杆菌Ata蛋白的免疫原性
CN110713523B (zh) * 2019-10-31 2023-02-03 湖北工业大学 一种定性检测人血清中鲍曼不动杆菌特异性抗体的检测条
CN110724201B (zh) * 2019-10-31 2023-01-24 湖北工业大学 基于多重表位融合抗原的鲍曼不动杆菌感染快速检测法
CN110713524B (zh) * 2019-10-31 2023-02-03 湖北工业大学 一种高灵敏度的鲍曼不动杆菌抗原Elisa测定试剂盒
CN116134150A (zh) * 2020-09-16 2023-05-16 南京迈西可生物科技有限公司 病原体特异性核酸片段及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6562958B1 (en) * 1998-06-09 2003-05-13 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Acinetobacter baumannii for diagnostics and therapeutics
AU2001249345A1 (en) * 2000-03-21 2001-10-03 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Identification of essential genes in prokaryotes
WO2002077183A2 (en) * 2001-03-21 2002-10-03 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Identification of essential genes in microorganisms
ES2366735B1 (es) * 2009-10-08 2012-09-13 Fundación Pública Andaluza Para La Gestión De La Investigación En Salud De Sevilla Vacuna frente a acinetobacter baumannii.
EP2556085A2 (en) * 2010-04-05 2013-02-13 Bar-Ilan University Protease-activatable pore-forming polypeptides
CN102344911A (zh) * 2010-08-02 2012-02-08 财团法人佛教慈济综合医院 鲍氏不动杆菌的噬菌体
EP2599496A1 (en) * 2011-11-30 2013-06-05 Kenta Biotech AG Novel targets of Acinetobacter baumannii

Also Published As

Publication number Publication date
CN106243198A (zh) 2016-12-21
JP6488419B2 (ja) 2019-03-20
JP2018134103A (ja) 2018-08-30
EP3103471A2 (en) 2016-12-14
JP6334607B2 (ja) 2018-05-30
TW201643180A (zh) 2016-12-16
US10124049B2 (en) 2018-11-13
JP2017008034A (ja) 2017-01-12
TWI649331B (zh) 2019-02-01
US20160361406A1 (en) 2016-12-15
EP3103471A3 (en) 2017-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR102016013224A2 (pt) Acinetobacter baumannii antigens and respective uses
US8173773B2 (en) Mycobacterium tuberculosis fusion protein and uses thereof
Liu et al. Immunological characterizations of the nucleocapsid protein based SARS vaccine candidates
Fu Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications
Wu et al. Th17-stimulating protein vaccines confer protection against Pseudomonas aeruginosa pneumonia
Durant et al. Identification of candidates for a subunit vaccine against extraintestinal pathogenic Escherichia coli
CN109456393B (zh) 肺炎链球菌蛋白在抗肺炎链球菌感染中的应用
WO2016201825A1 (zh) 结核分枝杆菌抗原及其应用
ES2568071T3 (es) Dianas novedosas de Acinetobacter baumannii
JP2007530022A (ja) 病原性株に特有のポリペプチドの組成物およびワクチンとしておよび免疫療法におけるそれらの使用
KR101846478B1 (ko) 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 감염 예방용 백신 조성물
Wolfenden et al. Development and evaluation of candidate recombinant Salmonella-vectored Salmonella vaccines
US7811589B2 (en) Method for stimulating immune response against Moraxella catarrhalis
Anam et al. Shigella flexneri vaccine development: Oral administration of peptides derived from the 49.8 kDa pili protein subunit activates the intestinal immune response in mice
EP1342784A1 (en) ExPEC-specific proteins, genes encoding them and uses thereof
TWI396547B (zh) 溶血性曼哈米亞桿菌疫苗
Nicholson et al. Immunogenicity of inactivated influenza vaccine in residential homes for elderly people
MX2008012664A (es) Composicion farmaceutica que comprende la proteina nmb0938.
Zhang et al. First report of human infection by Rhodoplanes sp., Alphaproteobacteria in China
Wu et al. Screening of linear B-cell epitopes and its proinflammatory activities of Haemophilus parasuis outer membrane protein P2
US20030049265A1 (en) Heliobacter pylori antigen
KR101680052B1 (ko) 탄저병의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물
US20180243392A1 (en) Cs21 and lnga protein vaccines
JP2008525008A (ja) 髄膜炎菌に対するワクチン
Afkhamipour et al. Potential Gastric Cancer Immunotherapy: Stimulating the Immune System with pIRES2-DsRed-Express-DNA Vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
B03A Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A 6A ANUIDADE.

B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]

Free format text: EM VIRTUDE DO ARQUIVAMENTO PUBLICADO NA RPI 2673 DE 29-03-2022 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDO O ARQUIVAMENTO DO PEDIDO DE PATENTE, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013.