BR102013033866A2 - composições antileishmania contendo o fulerol e uso - Google Patents

Abstract

composições antileishmania contendo o fulerol e uso. a presente invenção refere-se às composições farmacêuticas contendo fulerenos, preferencialmente o fulerol, que são nanoestruturas esféricas de carbono, como novas ferramentas para o tratamento das leishmanioses visceral e cutânea. as composições antileishmania contendo o fulerol podem compreender ainda um outro fármaco leishmanicida ou imunomodulador, estando na forma livre ou associada a um nanocarreador, tal como lipossomas, que confere propriedades farmacocinéticas mais favoráveis aos princípios ativos, o fulerol demonstrou de forma surpreendente uma atividade antileishmania, assim como uma capacidade de reduzir a hepatotoxicidade do antimoniato de meglumina quando administrado em associação em modelo animal de leishmaniose visceral. desta forma, o fulerol apresentou-se como o primeiro fármaco a demonstrar a dupla capacidade de exercer ação antileishmania sem efeitos colaterais e de reduzir a toxicidade de outro fármaco leishmanicida sem interferir na sua atividade farmacológica. por fim, a invenção compreende o uso de composições farmacêuticas contendo fulerenos para o tratamento das leishmanioses

Description

COMPOSIÇÕES ANTILEISHMANIA CONTENDO O FULEROL E USO A presente invenção refere-se às composições farmacêuticas contendo fulerenos, preferencialmente o fulerol, que são nanoestruturas esféricas de carbono, cono novas ferramenta$ para o tratamento das leishmanioses visceral e cutânea. As composições antileishmania contendo o fulerol podem compreender ainda um outro fárfnaco leishmanicida ou imunomodulador, ; li estando na forma livre ou associada a um nanocarreador, tal como lipossomas, que confere propriedades farmacqcinéticas mais favoráveis aos princípios ativos. O fulerol demonstrou de forma surpreendente uma atividade antileishmania, assim como uma capacidade de reduzir a hepatotoxicidade do ' !i antimoniato de meglumina quando; administrado em associação em modelo animal de leisjhmaniose visceral. Desta forma, o fulerol apresentou-se como o primeiro fárrnaco a demonstrar ia dupla capacidade de exercer ação antileishmania sem efeitos colaterais e de reduzir a toxicidade de outro fárrnaco leishmanicida sem interferir na sua atividade farmacológica. Por fim, a invenção compreende o uso de composições; farmacêuticas contendo fulerenos para o tratamento das leishmanioses. A leishrhaniose está entre as doenças tropicais mais negligenciadas no mundo, segundo a resolução da Sexagésima Assembléia Mundial da Saúde, em 2007. Epidemiologicamente, mais de 12 milhões de pessoas encontram-se infectadas no mundo, sendo 1,3 milhões de novos casos registrados a cada ano, com cerca de 20 a 30 mil mortes anuais, cuja doença afeta as populações mais pobres de 88 países (paísès em desenvolvimento) (World Health Organization - WHO. Report oíf the Fifth Consultative Meeting on Leishmania/HIV Coinfection. Addis Ababa, Ethiopia, 20 a 22 march 2007; WHO. Lèishmaniasis. Fév. 2013. Disponível em: http://www.who.int/mediacentre/factsneets/fs375/en/#. Acessado em: 16 de dezembro de 2013).

As leishmanioses são doenças parasitárias causadas por mais de 20 espécies de protozoários do gêriero Leishmania spp., da família dos Trypanosomatidae, parasitos hemoflagelados que mostram preferência pelos I 3 fagolisossomos do sistema fagocíticò mononuclear. São transmitidas para os humanos pela picada do vetor, as fêmeas dos gêneros Phlebotomo sp. e Lutzomyia sp. infectadas. A doença se apresenta com três manifestações clínicas diferentes: visceral, ou icomumente conhecida como calazar; a cutânea; e s muco-cutânea. (RIGCIARDI, L.V. Terapêutica antileishmania: revisando el pasado, ei presente y ei futuro. Gac. Méd. Caracas, v.117, n. 2, p.93-111,200;9). A leishmaniose cutânea é à forma mais comum de leishmaniose e apresenta-se por úlceras distribuídas nas partes expostas do corpo, deixando cicatrizes ao longo da vida e incapacidade grave. Cerca de 1/3 dos casos ocorrem nas Américas, na bacia do Mediterrâneo, Ásia Central e Oriente Médio. A leishmaniose mucocutânea leva às lesões mucosas mutilantes, que consistem na destruição parcial ou! total das membranas mucosas do nariz, boca e garganta, sendo a maior pafte dos casos relatados na Bolívia, Brasil e Peru (World Health Organization - WHO. Lèishmaniasis. Fev. 2013. Disponível em: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs375/en/#. Acessado em: 16 de dezembro de 2013).

Contudò, a forma mais grave de leishmaniose compreende a leishmaniose visceral. 90% dos novos casos de calazar ocorrem em seis países: Banglàdesh, Brasil, Etiópia, índia, Sudão do Sul e Sudão. A forma zoonótica, parja a qual os cães são p principal reservatório e fonte de infecção da doença nas áreas endêmicas, èstá presente na Bacia do Mediterrâneo, China, OrientJ Médio e América do Sul, e é causada pela Leishmania infantum infantum e Leishmania infantum chagasi, sendo esta última a espécie causadora ca leishmaniose visceral no Brasil (GRIENSVEN, J.; BALASEGARAM, M.; MEHEUS, F. et al. Combination therapy for visceral lèishmaniasis. Lancet infect Dis., v.10, p. 184-94, 2010). O ciclo de vida do parasito jé metaxênico, onde o agente passa por transformações no organismo do vetor flebotomíneo, inseto díptero. O protozoário flagelado L. infantum é; encontrado na forma móvel promastigota metacíclica nd vetor, e quando fagpcitado pelos macrófagos do hospedeiro vertebrado se transforma na forma imóvel amastígota. O ciclo tem início com a inoculação de formas promastigotas infectantes no : hospedeiro vertebrado durante o repasto sanguíneo. Ao atingirem a circulação sanguínea, as formas promastigotas utilizam de mecanishos específicos para sobreviver à lise celular, que sèrá ativada pelo sistema complemento. Devido a este mecanismo protetor, o parasito sobrevive ao ataque do hospedeiro e ainda consegue invadir macrófagos através da manipulação de receptores celulares (CAMPOS-PONCE M, PONCE C, PONCE E, MAINGON RDC. Leishmania chagasi/infantum: further investigations on Leishmania tropism in atypical cutaneous and visceral leishmaniasis foci in Centrai America. Experimental Parasitology, New York, v. 109, p. 209-219, 2005). No interior destes, o parasito encontra-se protegido contra a resposta | imune do hospedeiro, residindo no ambiente ácido do lisossomo secundário do macrófago onde sofre sucessivas multiplicações. Uma vez infectado, o hospedeiro torna-se reservatório do oarasito.

Em humanos, a leishmaniose visceral apresenta-se como uma enfermidade generalizada, crônica, caracterizada por febre irregular e de longa duração, hepjatoespíenomegalia, línfadenopatia, anemia com leucopenia, hipergamaglobulinemia e hipoalbuminemia, emagrecimento, edema e estado de debilidade progressivo, levando à caquexia e, até mesmo, ao óbito. A í evolução das formas clínicas é diversa, podendo o indivíduo apresentar desde cura espontânea, formas oligóssintomáticas e assintomáticas, até manifestaçõeJ graves, podendo alcançar letalidade entre 10% e 98% em casos tratados inadequadamente e não tratados. Nos últimos anos, a letalidade da leishmaniose visceral vem aumentando gradativamenté, passando de 3,6% em 1994 para 6,7% em 2003, com um incremento de 85%, e para 8,4% em 2004 (ALVARENGA, D.G.; ESCALDA, P.M.F.; COSTA, A.S.V. et al. Leishmaniose visceral: estudo retrospectivo de fatores associados à letalidade. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., v. 43, n. 2, p. 194-07, mar-abr 2010), Compostos antimoniais foramj utilizados no tratamento da leishmaniose pela primeira Vez em 1912 pelo médico brasileiro Gaspar Vianna, inicialmente na forma trival9nte. Embora os antirponiais pentavalentes, como o antimoniato de meglumina (Glucantime®, SanofHAventis), tenham sido reconhecidos como clinicamente edcazes em 1947, atualmente ainda são os fármacos de primeira escolha para todas as leishmanioses na maioria dos países em desenvolvimento (BERMAN JD. Human leishmaniasis: clinicai, diagnostic, and chemotherapeitic developments in the last 10 years.Clin. Infect. Dis. 24, 684, 1997).A anfótericina B suas Várias formulações são utilizados como medicamentos de segunda escolha; (Ministério da Saúde. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral. jBrasília, 2003) No Brásil, a terapêutica das leishmanioses consiste no uso do antimoniato de meglumina (RICGIARDI, L.V. Terapêutica antileishmania: revisando el pasado, el presente yiel futuro. Gac. Méd. Caracas, v.117, n. 2, p.93-111, 20Cj9). Todavia, alguns fatores relacionados à farmacocinética deste fármaco desfavorecem o seu uso. A baixa absorção oral e elevada depuração plasmática determinam que seja administrado diariamente por via parenteral (endovenosa ou intramuscular), por um período de 20 a 40 dias. Além disso, os efeitos colaterais representam um problema importante no uso dos antimoniais pentavalentes. Estes aparecem principalmente ao final do tratamento e incluem náuseas, vômitos, diarréia, atralgias,; mialgias, anorexiai, elevação dos níveis de enzimas hepáticas, anomalias eletrocardiográficas, convulsões, pancreatite química e nefrotoxicidade. Reclamações de pacientes com sensação de dor no local e no mojmento da aplicação desses medicamentos são também comuns (FRÉZARD et al. Pentavalent Antimoniais: New Perspectives for Old Drugs. Molecules 14, 2317, 2009). O modelo geralmente aceito para o mecanismo de ação dos antimoniais pentavalentes (SbV) é que estes seriam um pró-fárniaco, sendo reduzido à forma ativa ei tóxica de antimônioi trivalente (Sblll), que destrói as formas amastigotas d!entro do fagolisossomos dos macrófagos. Neste contexto, Sblll promovería desbalanço no metabolismo dos tióis, resultando em estresse oxidativo e àpoptose (FRÉZARD et al. Pentavalent Antimoniais: New Perspectives f0r Old Drugs. MolecuIÇs 14, 2317, 2009).

Contudo, o Glucantime® é contra indicado em pacientes que fazem uso de beta-bloqueadores e drogas antiarrítmicas, comí insuficiência renal ou hepática, em liiulheres grávidas nos dois primeiros trimestres de gestação. Não há contra indiLações absolutas ap uso da anfótericina B; entretanto, complicações renais limitam o seiii uso (Ministério da Saúde. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral. Brasília, 2003).

Uma estratégia atualmente rpcomenda pela Organização Mundial da Saúde (OMS) refere-se ao tratamento com associação de fármacos leishmanicidais diferentes, tendo còmo principais benefícios, um tratamento mais eficaz e seguro e com menolr risco de desenvolvimento de resistência (Ministério da Saúde. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral. Brasília, 2003). Dentre os medicamentos que podem vir a substituir os antimoniais pentavalentes desfacam-se: anfotericina B lipossomal (AmBisome®)!, miltefosina (Impávido®) e paromomicina ou aminosidina. Entretanto, o uso desses medicamentos até hoje encontra-se limitado, seja pelo elevado custo e por problema de estabilidade (Ambisome®), pela baixa eficácia (paromomicina), por efeitos tóxicos indesejáveis (miltefosina, paromomicina) ou pelo aparecimentd de resistência (miltefosina) (FRÉZARD et al. Pentavalent Antimoniais: New Perspectives for Oíd Drugs. Molecules 14, 2317,2009).

Outro problema na terapêutiòa dessa doença no Brasil é sua grande ocorrência em zonas rurais, o que dificulta a assistência aos pacientes que têm que se deslocar até um centro de saude para receber o tratamento sob controle médico. Nessi contexto, os casos de interrupção de tratamento se tornam freqüentes, q que pode resultar no aparecimento de resistência ao medicamento.

No cão;, o principal reservatório doméstico de L infantum chagasi, é recomendada a utilização de uma Combinação de antimoniato de meglumina com alopurinol ou a combinação de miltefosina e alopurinol. O prolongamento do tratamento pode ser necessário e o prognóstico pode variar de favorável a desfavorável, isso dependerá do estado clínico e da resposta imunológica do animal (DANTAS-TORRES, F.; SOLANO-GALLEGO, L.; BANETH, G.; RIBEIRO, V. M. et al. Canine leishmaniosis in the Old and New Worlds: unveiled similárities and differencesj Trends in Parasitology, Oxford, v. 28, n. 12, p. 531-538, 2012). Todavia, independente do fármaco de escolha, a cura parasitológica está muito longe de |ser obtida, uma vez que mesmo que o tratamento permita redução da i transmissão do agente através dos flebotomíneos, isto ocorre por um I curto período. O que vai determinar a eficiência do tratamento está relacionado com o estado imune do cão, a farmacocinética e a sensibilidade ;de cada isolado de Leishmania, ou a resistência distes aos medicamentos (AIT-OUDHIA, K.; et al. In vitro susceptibility to antimonials and amphotericin B of Leishmania infantum strains isolated from dogs in a region laçking drug selection pressure. Veterinary Parasitology, Amsterdam, v. 187, p. 386-393, 2012).

As evidências sobre a ineficácia do tratamento farmacológico de cães infectados são cumulativas; elas; demonstram que o animal apesar de apresentar melhoras clínicas não aipresenta reversão do estado infectado, o que mantém o cão como fator de risco para a população e ainda aumenta a possibilidade de gerar cepas resistentes aos medicamentos de uso humano. Por não existir estratégias suficientes para evitar a transmissão da doença aos homens e animais, a conduta atual de maior segurança indicada é o sacrifício dos cães infectados (ORGANIZAÇÃO PAN AMERICAN A DE SAÚDE - OPAS. Encuentro sobre vigilância, prevención y control de leishmaniasis visceral (LV) en el Cono Sjr de Sudamérica. Foz do Iguazú, Brasil. 2009, Disponível em: http://new.pah o.org/hq/index.php?option=com_docman&task=doc_view&gid=16 961&ltemid=, Acesso em: 17 de dezembro de 2013).

Nesse contexto, a inexistência de tratamento efetivo da leishmaniose visceral canina representa uma importante limitação da terapêutica atual. O pequeno número de medicamentos disponíveis associado às limitações ) H- encontradas no seu uso aponta para a necessidade urgente de desenvolver novos fármacds ou formulações.

Uma estratégia bem sucedida para aumentar o índice terapêutico de fármacos contra a leishmaniose visceral refere-se à sua associação reversível a um nanosSistema carreador, permitindo prolongar sua meia-vida no organismo e direcioná-los para os sítios de infeção (FRÉZARD, F.; DEMICHELI, C. New delivery strategies for the old pentavalent antimonial drugs. Expert (Lpinion on Drug Delivery, v. 7, p. 1343-1358, 2010).

Entre os nanossistemas caireadores de medicamentos atualmente disponíveis, os lipossomas ocupam uma posição de destaque. Essas vesículas esféricas, constituídas por uma ou várias bicamadas concêntricas de lipídeos, podem armazenar em seu compartimento aquoso interno princípios ativos hidrossolúveis ou terem princípios ativos lipofílicos ou anfifílicos incorporados em suas membranas. Lipossomas convencionais são tipicamente formados de um fosfolipídeò, tal como a fosfatidiícolina, ou de um surfactante não iônico.

Podem também incluir na sua composição o colesterol, um fosfoiípideo com carga negativa, como por exemplo, fosfatidilglicerol, ácido fosfatidico, dicetilfosfato, ja/ou um fosfolipídeo com carga positiva, tal como esterarilamina. O medicamento administrado por via parenteral na forma encapsulada em lipossomals é liberado lentamente, evitando, por consequência, sua rápida eliminação pe o organismo. O resultado é um aumento da biodisponibilidade do medicamento, com potencialização da ação e redução da toxicidade.

Por serem rapidamente clareados da circulação sanguínea pelos macrófagos co sistema fagocítico mononuclear, principalménte o fígado, o baço e a mec ula óssea, os lipossomas convencionais carregam a droga para os principais sítios de infecção da leishmaniose visceral, o que disponibiliza uma maior quantidade do fármaco para interagir com o parasito. Nesse contexto, foi Jlesenvolvida uma formulação de anfotericina B em lipossomas convencionaiJ (AmBisome) que foi usada com sucesso no tratamento de pacientes não responsivos aos medicamentos antimoniais, o mesmo ocorrendo no tratamento de pacientes com a forma PKDL, sem relato de efeitos colaterais. A eficácia na faixa de 100% em pacientes imunocompetentes rendeu-lhe a aprovação pela U.S. Food and Drug Administration (FDA) como a primeira apresentação à base de lipossomas a ser reconhecida para tratamento do calazar (MEYERHOFF A. U.S. Food and Drug Administration approval of AmBisome (liposomal amphotericin B) for treatment of visceral leishmaniasis. Clinicai Infectious Disease, v. 28, p. 42-48, 1999).

Encontra-se também no estado da técnica, pedido de patente intitulado “COMPOSIÇÃb FARMACÊUTICA COMPREENDENDO LIPOSSOMAS CONVENCIONAIS E LIPOSSOMAS DE CIRCULAÇÃO PROLONGADA COMO SISTEMA ENTREGADOR DE FÁRMACOS LEISHMANICIDAS” (BR102012005265) que reivindica composições farmacêuticas para o tratamento dà leishmaniose visciral caracterizada por compreender a associação de lipossomas convencionais e de lipossomas de circulação prolongada como sistema entregador de fármacos leishmanicidas. Essa composição permite que o fármaco atinja com eficiência todos os sítios de infecção pelo parasito, sendo que os lipossomas de ciculação prolongada promovem o direcionamento mais efetivo de fármacos leishmanicidas para a medula óssea e o baço, enquarito lipossomas convencionais atuam no direcionamento do fármaco para o fígado.

Os fulerenos foram descobertos em 1985 (ADAMS, P.D., GROSSE-KUNSTLEVE, R.W., HUNG, L.-W., et al. C60: buckminsterfullerene. Nature, v. 318, p.162-163, 1985) e representam uma família extensa de nanoestruturas esféricas de carbono, tendo como exemplo clássico a molécula de Οβο denominada fulereno. Devido ás suas propriedades químicas e físicas, estas moléculas torriaram-se alvos atraentes para o uso na medicina (REBECCA, M.; HSING-LIN, W.; JUN,G., et al. Impact of physicochemical properties of engineered fullerenes on key. Toxic. and App. Pharmac., v.234, p.58-67, 2009). | !

Essas nanoestruturas destacam-se pela alta estabilidade química e sua capacidade de complexar radicais livres e promover a expressão gênica de enzimas antioxidantes, inibindo os danos oxidativos (JENSEN, A.W.; WILSON, S.R., SCHUSTER, D.l. Biological Applications of Fullerenes . Bioorg. Med. Chem. v. 4, 767-79, 1996). Os fulerenos possuem alta reatividade com espécies reativas de oxigênio (|ROS), tais como superóxido, radicais hidroxilados e óxido nítrico, os quais atacam macromoléculas biológicas como proteínas, lipídeos e DNA (BOSI, S.; ROS T.D.; SPALLUTO, G. et al. Fullerene derivatives: an attractive tool for biological applications, v. 38, p. 913-23, 2003). } 1 Entretanto, a aplicação tecnológica; do fulereno na área biomédica tem sido limitada pelo caráter hidrofóbico da molécula. Neste contexto, foi desenvolvida uma classe dè fulerenos polihidroxilados, também chàmados de fulerenol ou fulerol, formadbs por modificação química. A solubilidade de cada molécula de fulerenol é dependente do número de grupos hidroxila introduzidos (KOKUBO, K. Water-Soluble Single-Nano Carbón Particles: Fullerénol and Its Derivatives. The Deliivery of Njanoparticles. <Disponível em: http://www.intechopen.com/download/get/type/pdfs/id/3é889>. Acessado em: 18 de dezembro de 2013). Dentre estas moléculas, foi feita a adição de 22-24 hidroxilas na sua superfície, geranldo um composto S hidrofílico denominado fulerol, o que aumenta sua solubilidade em solução aquosa e reduz a sua citotoxicidade (LI, J., TAKEUCHI, |A., OZAWA, M., LI, X., et al. Fullerol formation catalyzed by quaternary ammonium hydroxides. J. Chem. Soc., Chem. Commun, p.1784-1785, 1993). Desde então, estas moléculas vem sendo estudádas pelo seu potencial terapêutico em diferentes patologias, incluindo doelnças infectocontagiantes, que envolvem o estresse oxidativo, oncóticas.

Um derivado polihidroxilado de fulereno solúvel em água, o fulerenel, demonstrou àtividade antiviral em células mononucleares periféricas de humanos (PBMC) com infecção agjjda e células H9 cronicamente infectadas com vírus HV-1, apresentando EC50 de 7,3±5,9 μΜ e 10,8±8,2 μΜ, respectivamente. Já em células PBMC infectadas de forma aguda com HIV-2ROD, cepa resistente aos fármacos anti-retrovirais, o fulerenel apresentou uma EC50= 0,003±0,004 μΜ, mostrando-se portanto altamente eficaz como fármaco antiviral no tratamento desta síndrome (Schinazi, R. F.; Sijbesma, R.; Srdanov, G.; HilI, C. L.; Wudl, F. Synthesis and Virucidal Activity of a Water-Soluble, Con igurationally Stable, Derivatized C60 Fullerenel. Antimicrob. Agents Chemother, v. 37, p. 1707-10. 1993).

Foi comprovado que o fulerol pode agir como fármaco neuroprotetor em doenças degenerativas relacionadas ao estresse oxidativo (DORDEVIC, A. e BOGDANOVIC, G. Fullerenol - a new nanopharmaceutic? Arch. Oncol., v.16, 't p.42-5, 2008).; O mecanismo de neuroproteção mediada pelo fulerenol ocorre pela inibição dos receptores para glutamato, e também pela redução da liberação de gjlutamato via aumento nas concentrações intracelulares de cálcio, um mecanismo crítico de excitotoxicidade em neurônios (SILVA, G.A. Nanotechnology approaches for the regeneration and neuroprotection of the central nervou!s system. Surgical Neüroiogy , v. 63, p. 301—306, 2005). Já se sébe que o fulerol não apresenta toxicidade aguda ou sub-aguda em roedores e protege os tecidos dé danos celulares causados por ROS após exposição a substâncias tóxicas pró-oxidantes incluindo alguns fármacos, por absorver estes radicais livres que causariam injúrias teciduais e celulares (BOSI, S.; Dj\ ROS, T.; SPALLUTO, G., et al. Fullerene derivatives: an attractive toolj for biological applications. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 38, p. 913-23, 2003).

Uma patente concedida intitulada “FULLERENE PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR PREVENTING OR TREATING DISORDERS” (US 6.777.445 B2), refere-se a um método para a prevenção e tratamento de infecções bacterianas causadas por bactérias gram-positivas e gram-negativas e doenças \jirais, tais como dengue e encefalite vira! compreendendo a administração de composições farmacêuticas contendo um fulereno, sendo este administrado in vivo numa quantidade de cerca de 0,001 a cerca de 100 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Entretanto, nesta invenção, foi testado um único fulireno solúvel em água derivado de ácido carboxílico de fórmula estrutural C6q(C3) simétrico, se diferenciando primordialmente da presente invenção por esta ser um fulereno com adição de 22-24 hidroxilas na superfície, além desta não reivindicar a administração parenteral de formulações com nanossistemas carreadores. Ademais, distingui-se por se tratar do uso oo fulerol para tratamento das leishmanioses visceral e cutânea. 1 · 3 Outra patente concedida, a US 7.947.262 B2, intitulada “USE OF FULLERENE$ FOR THE TREATMENT OF MAST CELL AND BASOPHIL-MEDIATED DjlSEASE” que compreônde o uso de derivados fulerenos solúveis em água, preferencialmente C40rC8o para o tratamento de distúrbios envolvendo células do sistema imurjie como mastócitos e basófilos periféricos sanguíneos relacionados com processos alérgicos e inflamatórios, como artrite. Essa invenção refere-se ainda a moléculas quiméricas de fulerenos solúveis em água funcionalizadas com compostos capazes dè se ligar a receptores presentes em mastócitos ou basófilos, mediando a liberação de cítocinas e imunoglobulinas, como por exemplo peptídeos derivados de fatores de crescimento de células-tronco. A patente apesar de reivindicar composições farmacêuticas de fulerenos C40-C8o encapsulados em lipossomas, não avalia pré-clinica e c inicamente, e tampouCo especifica as formulações lipossomais. Além de apresjentar uma aplicabilidade distinta da tecnòlogia aqui descrita. A patente intitulada “FINELY PARTICULATE COMPOSITE CONTAINING CARBON COMPOÜND ENCAPSULATED THEREIN” (US 2007/0077432 A1), que reivindica Composições contendo nanocompostos a base de polímferos fechados de carbono C30-C2000, preferencialmente entre 60-120 átomos dje carbono, como fulerenos ou nanotubos podendo conter um metal associado, sendo estes empregados na medicina para a terapêutica ou usados para diagnósticos, distingui-se da presente tecnologia por esta compreender composições antileishmania contendo fulerenos, preferencialménte o fulerol, estando estes em associação a fármaco leishmanicida ou imunomodulador, livre ou encapsulado em nanossistema carreador colòídal.

Assim, diante do que foi ericontrado no estado da técnica, frente à problemática do alto índice mundial de casos de infecção por Leishmania spp., dos graves efeitos colaterais ocasionados pelo medicamento atual antimoniato de meglumina e do número escasso de outros medicamentos disponíveis para o tratamento cas leishmanioses, conclui-se que as composições antileishmania contendo o ftlerol e demais composições contendo um fulereno solúvel em água mostram-se ferramentas promissoras para serem produzidas e utilizadas na terapêutica contra as leishmanioses. A presente invenção relata de forma surpreendentej a atividade antileishmania do fulerol, assim èomo sua dupla capacidade de exercer ação antileishmania sem efeitos colaterais e de reduzir os efeitos colaterais do antimoniato de meglumina sem interferir nas propriedades ármacológicas deste, quando administrado em associação via parenteral. O xatamento de camunclongos infectados experimentalmente com Leishmania infantum chagasi com fulerol livre ou encapsulado: reduziu a carga parasitária herética de modo equivalente ao observado pelo antimoniato de meglumina. O fulerol apresentou uma maior atividade antileishmania na forma encapsulada em lipossomas que na forma livre. Todavia, quando comparada a posologia deste (5 doses de 0,05 mg/kg a cada 4 dias) com a do medicamento de primeira elcolha (20 doses de Glucantime 120 mg Sb/kg/dia), o fulerol mostrou-se muito mais eficaz considerando a baixa dose administrada e o longo intervalo de tempo entre as doses. Ademais, quando avaliado o tratamento ccjm fulerol encapsulado em lipossomas em associação ao Glucantime, nao foram observadas as alterações histopatológicas no fígado dos animais ocasionadas com o uso do fármaco de primeira escolha e que caracterizam a hepatotoxicidade. O que demonstra a ação he pato protetora do co-tratamento com o fulerol encapsulado em lipossomas. Portanto, essa invenção reivindica composições farmacêuticas contendo os fulerenos como novos medicamentos antileishmania e o uso destes em associação com fármaco(s) leis!hmanicida(s) ou imunpmodulador(es) para potenciar a eficácia e reduzir a toxicidade dos mesmos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: A figura 1 mostra de forma comparativa a carga parasitária no fígado de jcamundongos BALB/c infectados experimentalmente com Leishmania infantum (modelo murino de leishmaniose visceral). A quantidade de parasitos foi determinada por PCR em tempo real quantitativa, após 20 dias de tratamento administrados por via intraperitoneal com doses diárias de ; V

Glucantime (120 mg Sb/kg), fulerol livre (0,05 mg/kg), fulerol encapsulado em lipossomas (0 05 mg/kg) e salina (controle negativo).

Figura 2: A figura 2 compreende a avaliação da eficácia do tratamento com fulerol ná forma livre ou encapsulada em lipossomas. Para esta avaliação foram administradas em camundongos BALB/c infectados experimentalmente com Leishmania infantum por via intraperitoneal uma dose de fulerol tanto na forma livre como na encapsulada (0,05 mg/kg/dose) com intervalo de 4 dias, durante 20 dias (totalizando 5 doses). A carga parasitária no fígado foi determinada por PCR em tempo reál quantitativa após 20 dias de tratamento. O Glucantime 120 mg Sb/kg administrado diariamente por 20 dias foi utilizado como controlei.

Figura 3: A figura 3 mostra a eficácia do tratamento associando o fulerol com Glucantime em modelo murino de leishmaniose visceral, sendo o fulerol administrado ria forma livre ou encapsulada em lipossomas. Avaliou-se a carga parasitária no fígado de camundohgos BALB/c infectados com Leishmania infantum chagasi, determinada por PCR em tempo real quantitativa, após 20 dias de tratamento por via intraperitoneal com fulerol encapsulado em lipossomas (θ[θ5 mg/kg/dose com intervalo de 4 dias), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia), Glilicantime (120 mg Sb/kg/dia) + Fulerol (0,05 mg/kg/dose/4 dias), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia) + Fulerol em lipossomas (0,05 mg/kg/dose/4 dias) ou salina.

Figura jl: A figura 4 apresenta os resultados de análise histopatológica e de apoptose por microscopia óptica; utilizando o método de coloração HE do fígado de camundongos BALB/c infectados experimentalmente com Leishmania infantum, após 20 dias de tratamento por via intraperitoneal com Glucantime (120 mg Sb/kg/dia), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia) associado ao Fulerol (0,05 npg/kg/dose/4 dias), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia) associado ao Fulerol em lipossomas (0,05 mg/klg/dose/4 dias) ou salina. Os parâmetros histopatológiclos avaliados foram k degeneração hidrópica: (A) e o índice apoptótico (B) DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-sp às composições farmacêuticas contendo fulerenos, cojmo novas ferramentas para o tratamento das leishmanioses visceral e cctânea. Essas compojsições compreende preferencialmente os fulerenos solúveis em água de 60 a 120 carbonos com adição de grupamentos hidroxila, tal como o fulerol C6oOH22-24. As composições antileishmania contendo o fu erol podem compreender o fármaco em associação com outro(s) fármaco(s) leishmanicida(s) ou imunomodulador(es), estando na forma livre, ou associada a um nanocarreador, como lipossomass, que confere aos princípios ativos propriedades farmacocinéticas mais favoráveis. Por fim, a invenção compreende o uso de composições! farmacêuticas contendo fulerenos para o tratamento das leishmanioses. 1. ώ fulerol foi sintetizado de acordo com o processo já descrito na patente depositada BR 0404543-2 A2, intitulada “PROCESSO E SISTEMA DE PRODUÇÃO CONTÍNUA EM LARGA ESCALA DE NANOESTRUTURAS DE CARBONO CONSTITUÍDO DE DISPOSITIVOS PARA; EFETUAR O PROCESSO”. O fulerol foi também encapsulado em lipossomas formados de fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidilglicerol na relação molar 5:4:1 usando o método de desidratação-reidratação (FRÉZARD, F. e SCHETTINI, D.A. Lipossomas: Dropriedades físico-químicas e farmacológicas1, aplicações na Quimioterapia à base de antimônio. jouim. Nova, V. 28, n. 3, p.511-518, 2005). No entanto esses podem ser formaclos de colesterol e um lipídeo com carga negativa ou positiva, na presença ou ausência e de polímeros e/ou ligantes acoplados em suas superfícies. 2. A encapsulação foi seguida da calibração dò tamanho das vesículas por extrusão através de membrana de policarbonato de poro de diâmetro de 2Í00 nm (NAYAR, R., HOPE, M.J., CULLIS, P.R. Generation of i : large unilamellar vesicles from long-chain saturated phosphatidylcholines by extrusion technique. Biochim. Biophys. Acta, v. 986, p. 200-206, 1989). na presença ou ausência e de polímeros e/ou ligantes acoplados em suas superfícies. A atividade antileishmania e a ação quimioprotetora do fulerol foram avaliadas em camundongos BALB/c infectados com Leishmania infantum, como modelo murino de leishmaniose visceral tratado ou não com Glucantime® (antimoniato de meglumina). No primeiro teste, foram utilizados quatro grupos (n = 9-10) que receberam doses diárias por via intraperitoneal durante 20 dias dos seguintes tratamentos: 1) Glucantime na dose de 120 mg Sb/kg de peso corporal; 2) Fulerol na dose de 0,05 mg/kg de peso corporal; 3) Fulerol encapiulado em lipossomas na dose de 0,05 mg/kg; 4) salina (controle negativo). Dejpois dos tratamentos, os animais foram sacrificados para a determinação da carga parasitária no fígado pela técnica de PCR em tempo real quantitativa.

Tambéijn foi avaliada a eficácia do Fulerol livre e encapsulado em lipossomas após a administração de apenas cinco doses (0,05 mg/kg/dose), com intervalo de 4 dias (diferentemente das 20 doses administradas no primeiro testej) em comparação à eficácia do Glucantime (120 mg kg/dia) administrado diariamente durante 20 dias. O resultado obtido estabeleceu que I o uso do fulerol encapsulado em lipossomas apresentou uma atividade antileishmania similar a demonstrada pelo Glucantime, porém com posologia mais aceitável!.

Dessa forma, de acordo com a presente invenção, o fulerol pode ser associado a nLnossístemas carreadores e/ou sistemas de liberação controlada de fármaco, visando um aumeinto da sua estabilidade, uma maior biodisponibilidade, uma ação mais prolongada e/ou um direcionamento para o tecido alvo. Esses sistemas caírreadores ou de liberação controlada classicamente usados no estado da técnica incluem, de forma não limitante, ciclodextrinas, polímeros, polímeros mucoadesivos, vesículas lipídicas, lipossomas, polimersomas, nanopartículas lipídicas sólidas, micro- e nanopartículas poliméricas, micro- e nanocapsulas, micro- e nanoemulsões, dendrímeros, micelas, micelas poliméricas, nanopartículas inorgânicas, nanopartículas* de carbono, adesivos transdérmicos, matrices poliméricas implantáveis e dispositivos que possam ser implantados.

Sabenjdo que o fulerol apresenta propriedades antioxidantes, o teste seguinte foi para avaliar se haveria algum benefício oriundo pia associação do fulerol com o Glucantime, em termos de ganho de eficácia e de redução de toxicidade. Fjoi utilizado o modelo murino de leishmaniose visceral para avaliar, por PCR em jtempo real quantitativa, a carga parasitária no fígado dos animais após os tratamentos. Observou-jse uma redução significativa da carga parasitária hjepática nos grupos tratados com Glucantime e Glucantime associado ao Fulerol encapsulado em lipossomas, quando comparado ao grupo controlL. Todavia, a associação entre o fulerol e o Glucantime pareceu ser mais eficaz no tratamento da leishmaniose, quando comparada ao efeito do Fulerol ou do Glucantime isolado.

Portanto, a presente invenção refere-se também a composições farmacêuticas que comprendem fulèrenos associados a um ou mais fármacos leishmanicidajs e estes serem: antimoniais pentavalentes, preferencial mente o antimoniato dp meglumina; anfotericina B; alopurinol; cetoconazol; itraconazol; fluconazol; posaconazol; tucaresol; paramomicina; pentamidina; miltefosina, sitamaquina, iminoquimod; azitromicjina; buparvaquona; tamoxífeno; terbinafina; furazolidona; fluoroquinolona; dompjeridona; derivado de alquil-lisofosfolipídeo ou de alquil-fosfolipídeo; aza-esterol; licocalcona A; maesabalid III; tricotecenos; n-acetil-cisteina; quinolina 3-substituída, ou a uma ou mais substâncias imunomoduladoras, pireferencialmente peptídeos ou proteínas imunogênicas derivadas de Leishmania, interferon gama, citocinas, lipídeo A, oligonucleotídeos, imunoprotetores L antiinflamatórios esteroidais. Os fígados dos animais com leishmaniose visceral e submetidos à quimioterapia antimonial também foram utilizados para a análise de alterações histopatológicas e de apoptose utilizando o método de coloração HE por miscroscopia óptica. AlteraçõeJ histopatológicas características de degeneração hidrópica foram observadas nos fígados dos animais que receberam Gllicantime isolado, eviqenciando a hepatotoxicidâde do fármaco j .1 I que pode ser atribuída à indução de estresse oxidativo. Contudo, essas alterações nãjo foram observadas no grupo que recebeu a associação Glucantime+fulerol encapsulado em lipossomas, o que demonstra a ação hepatoprotetora do co-tratamento com o fulerol em sistema de nanocarreadores.

Sendo assim, o fulerol demonstrou de forma surpreendente uma atividade antileishmania, assim como uma capacidade de reduzir a hepatotoxicidade ocasionada pelo Glucantime quando administrado em associação em modelo animal para leishmaniose visceral. Logo, o fulerol apresentou-se como sendo o primeiro fármaco a demonstrar a dupla capacidade de exercer ação antileishmania sem efeitos colaterais e de reduzir a toxicidade de outro fármaco leishmanicida sem interferir nas sua atividade farmacológica.

Dessa forma, o conjunto de resultados obtidos nos testes permitiu antecipar que composições farmacêuticas contendo o fármaco antimonial e fulerol, principalmente aquelas baseàdas em lipossomas, apresentam atividade antileishmania mais elevada e toxicidade reduzida, quando comparado ao medicamento comercial Glucantime.

Essa composições contendo fulerenos solúveis em água puros ou associados a fármacos leishmanicidas ou imunomoduladores podem ser ainda administradas por via parenteral, preferencialmente endovenosa, intramuscular, subcutânea, intralesional e intraperitoneal; via oral, preferencialmente na forma de cápsulas, drágeas, comprimidos, xaropes ou elixir; tópica, preferencialmente na forma de pomada, loção, pasta ou gel.

Na presente tecnologia as composições compreendem particularmentê o fulerol associado com o antimoniato de meglumina encapsulados !em lipossomas . A invenção poderá ser melhor compreendida a partir dos exemplos, não limitantes, que seguem.

Exemplo 1: Atividade antileishmania do Fulerol Para avLliar se o Fulerol apresentaria atividade antileishmania, analisou-se a carga parasitária no fígado de camundongos BALB/c infectados experimentalmente com Leishmania infantum (modelo murino de leishmaniose visceral). Os Jnimais foram divididos em quatro grupos (n = 9-10). Durante 20 ; i? dias, foram administradas por via intraperitoneal doses diárias de Glucantime (120 mg Sb/kg), Fulerol livre (0,05 mg/kg), Fulerol encápsulado em lipossomas (0,05 mg/kg) e Salina (controle negativo). Após o período de tratamento, os animais forarfi sacrificados para determinar a carga parasitária no fígado ! utilizando a técnica de PCR em tempo real quantitativa. A Figura 1 mostra uma redução significativa da carga parasitária hepática dos animais tratados com Glucantirne, Fulerol e Fulerol encapsulado em lipossomas (*P < 0,05 com relação ao grupo controle; teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn s). Portanto, estabelecemos pela primeira vez a atividade anti-leishmania do fulerol em mjdelo experimental de leishmaniose, que mostrou-se equivalente àquela do fármaco comercial Glucantirne.

Exemplio 2: Atividade antileishmania do Fulerol na forma encapsulada em lipossomas Para esta avaliação, camundongos BALB/c infectados experimentalmente com Leishmania infantum (n = 6/grupo) receberam por via intraperitonea cinco doses de fulerol (0,05 mg/kg/dose) tanto na forma livre como na forma encapsulada, com intervalo de 4 dias durante os 20 dias de tratamento. O Glucantirne 120 mg /kg administrado diariamente por 20 dias foi utilizado como controle positivo. A carga parasitária no fígado foi determinada por PCR em tempo real quantitativa após o período de tratamento. A Figura 2 demonstrou que o uso do fulerol encapsulado em lipossomas apresentou uma atividade antileishmania similar a apresentada pelo Glucantirne, porém utilizando posjologia mais aceitável. Em contrapartida, mostrou que o fulerol encapsulado em lipossomas apresentou maior atividade antileishmania do que o fulerol livre, quando administrado na posologia de uma dose a cada 4 dias (*P < 0,05 com relação ao grupo salina; teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn's).

Exemplo 3: Eficácia da associação do Fulerol com o Glucantirne em modelo muriiio de leishmaniose visceral Avalioujse a carga parasitária no fígado de camundongos BALB/c infectados com Leishmania infantum (n = 5-6/grupo) determinada por PCR em tempo real quantitativa, após 20 dias de tratamento por via intraperitoneal com fulerol encapsulado em lipossomas (0,05 mg/kg/dose com intervalo de 4 dias), Glucantirne (120 mg Sb/kg/dia), Gluícantime (120 mg Sb/kg/dia) associado ao Fulerol (0,05 mg/kg/dose/4 dias), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia) associado ao Fulerol em lipossomas (0,05 mg/kg/dose/4 dias) ou salina. A Figura 3 mostra uma redução significativa da carga parasitária hepática apenas nos grupos tratados com Glucantime e Glucantime associado ao Fulerol encapsulado em lipossomas, quando comparado ao| grupo controle (*P < 0,05 com relação ao grupo salina; teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn's). Todavia, a associação entre o Fulerol e o Glucantime pareceu ser mais eficaz no tratamento da leishmaniose, quando comparada ao Fulerol ou Glucantime isolado. Portanto, esse exemplo estabelece o benefício da associação do Glucantime com o fulerol encapsulado em lipossomas, em termos de ganho de eficácia no tratamento da leishmaniose visceral.

Exemplo 4: Efeito quimioprotetor do Fulerol em modelo de leishmaniose visceral submetido jà quimioterapia antimonial Foi feita a análise histopatológica e de apoptose por microscopia óptica utilizando o método de coloração HE do fígado de camundongos BALB/c infectados eXperimentalmente com Leishmania infantum, após 20 dias de tratamento por via intraperitoneal com Glucantime (120 mg Sb/kg/dia), Glucantime (|20 mg Sb/kg/dia) associado ao Fulerol (0,05 mg/kg/dose/4 dias), Glucantime (|120 mg Sb/kg/dia) associado ao Fulerol em lipossomas (0,05 mg/kg/dose/4| dias) ou salina. Os parâmetros histopatológicos avaliados foram a degeneração hidrópica (A) e o índice apoptótico (B). A Figura 4, mostra alterações histopatológicas caraéterísticas de degeneração hidrópica e aumento do índice apoptótico no fígado dos animais que receberam ; I

Glucantime evidenciando a hepatótoxicidade do fármaco. Essas alterações foram observadas também no grupo que recebeu a associação Glucantime + fulerol, mas não no grupo que recebeu a associação do Glucantime + fulerol encapsulado em lipossomas, demonstrando a ação hepatoprotetora do co-tratamento com fulerol encapsulado em lipossomas. Ou seja, além de exercer ação antileijShmania, o fulerol em lipossomas mostrou uma ação quimioprotetora, evidenciada pela redução da hepatótoxicidade do Glucantime na presença do fulerol em lipossomas.

Claims (10)

1. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA caracterizadas por compreender fülerenos solúveis em água.

2. COMPÒSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelos fülerenos solúveis em água possuírem de 60 a 120 carbonos com adição de grupamentos hidroxila.

3. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizadas pelo fulereno ser preferencialmente o fulerol (C6oOH22-24)-

4. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracterizadas pelos fülerenos solúveis em água estarem associados a um ou mais fármacos leishmanicidas ou imunomoduladores.

5. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelos fármacos leishmanicidas serem selecionados do grupo compreendendo antimoniais pentavalentes, preferencialmente o antimoniato de meglumina; anfotericina B; alopurinol; cetoconazol; itraconazol; fluconazòl; posaconazol; tucaresol; paramomicina; pentamidina- miltefosina, sitámaquina, iminòquimod; azitromicina; buparvaquonà; tamoxifeno; teribinafina; furazolidona; fluoroquinolona; domperidonaj derivado de alquil-lispfosfolipídeo ou de alquil-fosfolipídeo; aza-esterol; licocalcona A; maesabalid líl; tricotecenos; n-acetil-cisteina; quinolina 3-substituída e os imunomoduladores serem selecionados do grupo compreendedo peptídeos ou proteínas ímunogênicas derivadas de Leishmania, interferon gaLna, citocinas, lipídeo A, oligonucleotídeos, imunoprotetores e antiinflamatór}ios esteroidais.

6. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com a reivindicação de 1 a 5, caracterizadas pelos fülerenos solúveis em água estarem associados ou não á nanossistemas carreadores e/ou sistemas de liberação controlada de fármacos selecionados do grupo compreendendo ciclodextrinasl polímeros, polímeros mucoadesivos, vesículas lipídicas, lipossomas, polimersomas, nanopartículas lipídicas sólidas, micro- e nanopartículas poliméricas, micro- e nanocapsulas, micro- e nanoemulsões, dendrímeros, micelas, micelas poliméricas, nanopartículas inorgânicas, adesivos tranísdérmicos, matrices poliméricas implantáveis e dispositivos que possam ser implantados.

7. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com as reiviijidicações^de 1 a 6, caracterizadas pelos fulerenos solúveis em água estarem ou não encapsulados em lipossomas, podendo os lipossomas ser compostoO por fosfolipídeos, colesterol e um lipídeo com carga negativa ou positiva, na presença ou ausência e de polímeros e/oü ligantes acoplados em suas superfícies.

8. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com a reivjindicação de 7, caracterizadas pelos lipossomas serem constituídos preferencial mente de fdsfatidilcolina, colesterol e fosfatidilglicerol.

9. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com as reivindicações de 1 a 6, caracterizadas por Serem administradas por via parenteral, preferencialmente endovenosa, intramuscular, subcutânea, intralesional e intraperitoneal; via oral, preferencialmente na forma de cápsulas, drágeas, comprimidos, xaropes ou êlixir; tópica, preferencialmente na forma de pomada, loção, pasta ou gel.

10.USO DAS COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA descritas nas reivindicações de 1 a 9, caracterizado por ser na preparação de medicame;ntos para o tratamento das leishmanioses visceral, mucocutânea e cutânea, preferencialmente a lêishmaniose visceral e as composições compreenderem preferencialmente o fuíerol associado com o antimoniato de meglumina encapsulados em lipossomas .