BR102013028097A2 - uso de naftoquinona na preparação de um medicamento para tratar doença causada por herpesvírus bovino - Google Patents

Abstract

uso de naftoquinona na preparaçáo de um medicamento para tratar doença causada por herpesvírus bovino. a presente invenção descreve uso de compostos derivados de naftoquinonas para preparação de medicamentos para tratar a doença de herpesvírus bovino, mais especificamente, para o tratamento de doença causada por vírus herpesvírus bovino tipo 5 (bohv-5). a presente invenção se situa no campo da indústria farmacêutica veterinária

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção USO DE NAFTOQUINONA NA PREPARAÇÃO DE UM MEDICAMENTO PARA

Tratar Doença Causada por Herpesvírus Bovino Campo da Invenção A presente invenção descreve uso de compostos derivados de naftoquinonas para preparação de medicamentos para tratar a doença de herpesvírus bovino. A presente invenção se situa no campo da indústria farmacêutica veterinária.

Antecedentes da Invenção O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) pertence à família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. O vírus Herpesvírus bovino-5 (BoHV-5) é o agente etiológico envolvido em quadro de meningoencefalite fatal em bovinos. O BoHV-5 acomete bovinos de 6 a 60 meses, com morbidade variável de 0,05% a 5% e letalidade próxima a 100%. São vírus que tem tropismo por sistema nervoso central e cujos sintomas clínicos característicos são consequentemente neurológicos. O curso da enfermidade varia de 1 a 15 dias o favorece a disseminação do virus no rebanho uma vez que a transmissão é feita por contato direto animal - animal. No Brasil o aumento de número de casos de encefalite provocados por BoHV-5 tem sido detectada em diversos estados brasileiros inclusive Rio de Janeiro.

Os vírus dessa família apresentam como propriedade biológica mais importante a capacidade de estabelecer infecção latente no hospedeiro após a infecção primária. A infecção latente permite aos vírus persistir no hospedeiro por tempo ilimitado e assim se perpetuar na natureza. A reativação da latência poderá ocorrer acompanhada ou não de sinais clínicos o que permite a transmissão e disseminação do vírus entre animais. A patogenia da infecção latente é objetivo de pesquisas, desde o postulado de Goodpasture E. W. 1929. Herpetic infection, with especial reference to involvement of the nervous system Medicine 8: 223-241, no qual ele sugeria que o herpesvírus era o agente etiológico da doença muco cutâneo, recorrente em humanos e que a recorrência da doença estava relacionada a um estado de “dormência” (hoje latência) viral nos gânglios sensoriais periféricos. Vários outros pesquisadores confirmaram a latência do vírus do herpes simplex humano (HSV) em gânglios sensoriais periféricos Rock D. L. & Fraser N. W. 1983. Detection of HSV-1 genome in central nervous system of latently infected mice. Nature 302:523-525. Rock D. L. 1994. Latent infection with bovine herpesvirus type-1. Sem. Virol. 5: 233-240.Vogei S. F.S., Caron L., Flores E. F., Weiblen R., Winkelmann E. R., Mayer S.V. & Bastos R. G. 2003.

Ao longo dos últimos anos, diversas publicações foram realizadas e diversas patentes foram concedidas para o uso quimioterápico das naftoquinonas do tipo 1,2 e 1,4-pirano ou furano naftoquinona, ou do tipo 1,4-naftoquinona-2-hidroxi contra diversas enfermidades, bem como de algumas patentes versando sobre a síntese de diversos derivados de estruturas similares.

No âmbito patentário, foram localizados alguns documentos relevantes que serão descritos a seguir. O documento US5314914 apresenta um método de prevenção ou alívio de infecções causadas por vírus da herpes em mamíferos por meio da administração de compostos derivados de naftoquinonas. Ainda, o documento US5314914 apresenta uma formulação cosmética de derivados de naftoquinonas e o uso desta formulação pra prevenir a eclosão de lesões herpéticas na pele. O documento US5314914 difere da presente invenção por abordar compostos derivados de naftoquinonas diferentes, ainda por apresentar o uso de naftoquinonas para o tratamento de uma família diferente do vírus da herpes apresentado pela presente invenção.

O documento US6080791 apresente um método de prevenção e tratamento de condições causadas por vírus, dentre as viroses citadas encontra-se a herpes simplex, por meio do uso de compostos do grupo hidroquinona e correspondente benzoquinona, dentre os quais encontram-se naftoquinonas. O documento US6080791 difere da presente invenção por: não apresentar método de tratamento de vírus da herpes da mesma família; não utilizar os mesmos compostos da presente invenção e por ser exclusivo ao uso em humanos. O documento US3555044 apresenta semi-carbazonas hexahidro-naftquinona, preparadas pela reação de substituição de naftoquinonas cetal cíclicas com thiosemicarbaziadas, para terapia de doença causada por herpesvírus simplex. O documento US3555044 difere da presente invenção por: não apresentar método de tratamento de vírus da herpes da mesma família; não utilizar os mesmos compostos da presente invenção e por ser exclusivo ao uso em humanos.

Dessa forma, é possível perceber que há o desejo de novas e mais eficientes formas de combate do Herpesvírus bovino. Adicionalmente, é possível perceber a necessidade de formas de combate do Herpesvírus bovino do tipo 5, que é altamente letal quando acomete bovinos e figura como um problema significativo na agropecuária.

Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

Sumário da Invenção Em um aspecto, a presente invenção vem resolver o problema da doença causada pelo herpesvírus bovino, por meio do uso de compostos do grupo das naftoquinonas. É um objeto da presente invenção o uso de naftoquinona na preparação de um medicamento para tratar doença causada por Herpesvírus bovino.

Em uma realização preferencial da presente invenção, o Herpesvírus Bovino é do tipo 5 (BoHV-5).

Em uma realização preferencial da presente invenção, a naftoquinona utilizada é de uma das seguintes fórmulas: em que R1 a R6 são independentemente selecionados do grupo que consiste de substitutos conjugados ou independentes, grupos funcionais amínicos, guanidínicos, sulfâmico, hidroxílicos, ésteres, éteres, tioésteres, tioéteres, halogênios, alquílicos de cadeias de até 10 carbonos (C10).

Em uma realização preferencial da presente invenção, os grupos R1 a R6 definidos nas fórmulas I, II, III e IV são independentemente substituídos com pelo menos um grupo que consiste de cadeias Ci-C6 alquilas, de C2-C6 alquenilas, de Ci-C6-alcoxilas, de Ci-C6-alcoxicarbonílicas, de -(CH2)n-arílicas, de-(CH2)n-heteroaríHcas, de-(CH2)n-heterocíclicas; de-(CH2)n-fenílicas; de -(CH2)n-amínicas; de-(CH2)n-alcoxicarbonílicas, de alílicas ou arílicas; anéis arílicos ou triazólicos substituídos com hidroxilada, haiogenada, de-(CH2)n-halogênicas, S03H, S03Na, S03Li, S03K, de S03alquílicas, de S03arílicas, de S03heterocíclicas, de S03amínicas; de S03alquilamínicas; de S03alcoxílicas; N02; NH2; CN; derivado do enxofre, derivados de ésteres carboxílicos C02R; anéis carbocíclicos ou heterocíclicos fundidos ao anel aromáticos e tetrahidrofurânico; hidrazononas, hidroxiaminas.

Em uma realização preferencial da presente invenção, a naftoquinona utilizada é do tipo II representada pela fórmula: em que R1= R2= R3= R4=H e R5= aCH=C(CH3)2.

Em uma realização preferencial da presente invenção, a naftoquinona utilizada é do tipo I representada pela fórmula: Em uma realização preferencial, a naftoquinona do tipo I compreender concentração entre 25 a 50 μΜ.

Em uma realização preferencial da presente invenção, a naftoquinona utilizada é do tipo II representada pela fórmula: Em uma realização preferencial, a naftoquinona do tipo I compreender concentração entre 6,25 a 12,5 μΜ.

Em uma realização preferencial da presente invenção, a naftoquinona utilizada é do tipo III representada pela fórmula: Em uma realização preferencial, a naftoquinona do tipo I compreender concentração entre 6,25 a 12,5 μΜ.

Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se ao uso de compostos naftoquinônicos incluídos nas famílias de compostos das quinonas que possuem as fórmulas gerais dos tipos I, II, III, IV e seus sais, suas formas estereoisoméricas, misturas racêmicas, pró-drogas, metabólitos dos mesmos, composições farmacêuticas, de liberação controlada, composições farmacêuticas nanoestruturadas e kits para diagnóstico que compreendem as mesmas e uso em dosagens como compostos de referência ou como reagentes, como agentes antivirais, para tratamento de infecções cujo agente etioiógico é o herpes bovino, com a vantagem de terem atividade contra o vírus Herpesvírus bovino-5 (BoHV-5).

Naftoauinonas As naftoquinonas podem ser de origem natural ou sintética que com múltiplas propriedades biológicas. Na natureza suas fontes mais frequentes são plantas superiores, artrópodes, fungos, liquens, bactérias, algas e vírus, com funções biológicas múltiplas em ciclos metabólicos os mais diversos destes organismos. Um grande número de quinonas naturais possui aplicações biológicas práticas, algumas chegaram à produção industrial, como por exemplo, as vitaminas do tipo K, mitomicinas e antraciclinas, entre outras.

As substâncias substituídas, ou não, nos anéis aromáticos e tetra-hidrofurânico, respectivamente, com grupos funcionais R1, R2, R3, R4, R5 e R6 conjugados, ou independentes, alquilícos variados, dos tipos lineares, cíclicos, arílicos simples ou arílicos substituídos, ou não, tendo os anéis aromáticos ou hetero-aromáticos que compõem os grupos R1 a R6, respectivamente, substituídos conjugados ou independentes, com grupos funcionais amínicos, guanidínicos, sulfâmico, hidroxílicos, ésteres, éteres, tioésteres, tioéteres, halogênios, alquílicos de cadeias de carbonos encadeados variando até C10, substituídas ou com selecionados grupos independentemente, consistindo de cadeias Ci-C6 alquilas variadas; seguindo-se, de modo alternativo, de C2-C6 alquenilas, de C^Ce-alcoxilas, de Ci-C6-alcoxicarbonílicas, dè -(CH2)rrarílicas, de-(CH2)n-heteroarílicas, de-(CH2)nheterocíclicas; de-(CH2)n-fenílicas; de -(CH2)n-amínicas; de-(CH2)n-alcoxicarbonílicas, de alílicas ou arílicas; anéis arílicos e triazólicos substituídos com hidroxilada, halogenada, de-(CH2)n-halogênicas, SO3H, S03Na, S03ü, S03K, de S03alquílicas, de S03arílicas, de S03heterocíclicas, de S03amínicas; de SOsalquilamínicas; de SOsalcoxílicas; N02; NH2; CN; derivado do enxofre, derivados de ésteres carboxílicos C02R; anéis carbocíclicos ou heterocíclicos fundidos ao anel aromáticos e tetrahidrofurânico; R1 a R2 metilas e R3,R4,R5,R6 conjugado ou independente com hidrazononas, hidroxiaminas e derivados.

As naftoquinonas da presente invenção podem ser do tipo I, II, III ou IV, representado pelas seguintes fórmulas estruturais, respectivamente: Ainda, utiliza-se também o composto Lapachol, representado pela seguinte formula estrutural: 1r = 2r = 3R=4R= H sR s CH=C(CH3)2 Lapachol As substâncias naturais ou sintéticas dos tipos I e III, respectivamente, são dotadas de um sistema naftoquinônico do tipo 1,4-piranonaftoquinoidal e no caso da substância IV um sistema naftoquinônico do tipo 1,4-furanonaftoquinoidal ou, similarmente, α-lapachonas no caso das substâncias I e III e α-nor-lapachonas para substância IV, e devido a esta particularidade exibem inúmeras ações farmacológicas. Por exemplo, composto químico incluído no tipo II onde 1R=2R=3R=:4R=H e 5R=CH=CH2(CH3)2, e doravante denominada por Lapachol, exibi inúmeras ações farmacológicas.

Herpesvírus Bovino A família Herpesviridae é amplamente estudada na Medicina Veterinária devido às perdas econômicas observadas em rebanho de bovinos infectados inclusive os brasileiros. O herpesvírus tipo 1 de bovino (BoHV-1) está associado a doenças de bovino como: rinotraqueíte, conjuntivite, doença genital, abortamento, doenças multisistêmicas em animais neonatos e doenças neurológias. Na América do Sul incluindo o Brasil, o BoHV-5 é frequentemente isolado de animais jovens e adultos com manifestações neurológicas. O BoHV-5 apresenta potencial neuropatogênico é isolado de encéfalo de bovino com encefalite ou meningoencefalite, entretanto algumas vezes é isolado de espécime clínico de bovinos com doença respiratória e genital.

Na presente patente descrevem-se os resultados da atividade antiviral de naftoquinonas obtidas por síntese química (tipos I, II, III e IV), em inibir o Herpes Vírus Bovino -5 (BoHV-5) em diferente fases da replicação do vírus.

Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma.

Procedimento geral de síntese das naftoquinonas do tipo I e III

Em um balão esmerilhado bitubulado munido de condensador de refluxo e bolhômetro contendo 1 mmol de 2-hidroxi-1,4-naftoquinona, 10 mL de água e 10 mL de etanol, adicionou-se 8 mmols de paraformaldeído. O sistema foi levado ao refluxo em banho de óleo e manteve-se a agitação por 30min. onde em seguida foi adicionado o dienófilo (3 mmols). Manteve-se a reação sob-refluxo e agitação por um tempo reacional que variou de 24 - 48 horas, dependendo da olefina. Em seguida, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo dissolvido em acetato de etila, lavado com uma solução saturada de bicarbonato de sódio e água. Após evaporação do solvente sob pressão reduzida em evaporador rotatório, obteve-se uma mistura de produtos que foi separado por cromatografia em coluna de silicagel utilizando a mistura hexano/acetato de etila como eluente. Em geral, obteve-se os produtos do tipo I e III na forma sólida em rendimentos que variaram de 40-95%.

Procedimento geral de síntese das naftoquinonas do tipo II

Em um reator de alta pressão de 600 mL (Marca: Berghof, Modelo: BR-300) foram adicionados lausona (1 equivalente), 150-250 mL de uma mistura etanol/água 1:1 (v/v), o correspondente aldeído (1 equivalente) e acido fórmico (3-5 equivalentes). A mistura reacional foi aquecida entre 25-150 °C, sendo a temperatura mantida por um período de 2-3 horas sob pressão entre 3-3000 psi. Após o total consumo do material de partida, observado par cromatografia em camada fina, a mistura reacional foi retirada do reator e resfriada a temperatura ambiente, para que em seguida fosse realizada a evaporação do solvente em evaporador rotatório. Ao resíduo obtido foi adicionada água, para que então se procedessem as extrações com acetato de etila. As fases orgânicas foram reunidas, secas com sulfato de sódio anidro e o solvente removido a pressão reduzida. O produto bruto foi purificado par cromatografia em coluna por gradiente empregando gel de sílica, usando como eluente uma mistura hexano/acetato de etila. Os produtos foram obtidos em rendimentos que variaram de 45-90%.

Procedimento gerai de síntese das naftoquinonas do tipo IV

Em um balão esmerilhado bitubulado munido de condensador de refluxo e bolhômetro contendo 1 mmol de 2-hidroxi-1,4-naftoquinona, 1 mmol de dieno em THF seco (10mL), adicionou-se uma solução de CAN (2,3 mmol) em 10 mL de THF seco. O sistema foi mantido sob agitação por 3 horas a temperatura ambiente. Em seguida, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo dissolvido em acetato de etila, lavado com água. A fase orgânica foi seca som sulfato de sódio e após evaporação do solvente sob pressão reduzida em evaporador rotatório, obteve-se uma mistura de produtos que foi separado por cromatografia em coluna de silicagel utilizando a mistura hexano/acetato de etila como eluente. Em geral, obtiveram-se os produtos do tipo IV na forma sólida em rendimentos que variaram de 30-90%.

Procedimentos para avaliação da atividade antiviral Cultivo Celular e Caracterização da Amostra de BoHV-5 As células de rim bovino Madin Darbin Bovine Kidney (MDBK) foram gentilmente cedidas pelo Setor de Virologia/ Departamento de Medicina Preventiva da Universidade Federal de Santa Maria, do Rio Grande do Sul (UFSM- RS). As células foram cultivadas em meio mínimo essencial (MEM) contendo sais de Earle (MEM-E) suplementado com 10% de soro equino, com 0,075% de bicarbonato de sódio tampão e antibióticos (penicilina 200UI/ml, estreptomicina 200pg/mL e 0,50pg/mL de anfotericina B). Para manutenção do cultivo celular e replicação dos vírus, o meio de crescimento foi substituído pelo meio de manutenção, contendo 2% de soro equino.

Utilizamos amostra de vírus BoHV-5 RJ42/01 isolado de amostra de encéfalo de bovino com quadro de desordem neurológica. As cepas padrão do BoHV-1 (Cooper) e BoHV-5 (A-663) e anticorpos monoclonais: (AcMs) anti-BoHV-1 (11H6) e anti-BoHV-5 (2G5) utilizados na técnica de imunofluorescência indireta (IFI) foram gentilmente cedidos pelo Dr. Paulo Michel Roehe (Centro de Pesquisas Desidério Finamor/FEPAGRO e Departamento de Microbiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul). O anticorpo secundário utilizado foi o anti-lgG de camundongo conjugado com FITC (Sigma).

Para isolamento do vírus BoHV-5 42/01, aproximadamente 1g de cada secção de encéfalo foi macerada com areia estéril, diluída para 10mL com meio de cultivo, clarificada por 10 minutos a 2000 x g e o sobrenadante foi dividido em alíquotas e armazenado a - 70°C para posterior inoculação em cultivo celular e extração de DNA. Cem microlitros (pl_) das suspensões a 10% preparadas com as amostras clínicas foram inoculados em cultivo celular com 70% de confluência e incubados por uma hora a 37°C em estufa de C02 para adsorção viral. Após esse período, os inóculos foram removidos, as monocamadas de células lavadas com meio sem soro com posterior adição de meio de manutenção contendo 2% de soro fetal bovino. Os tubos foram incubados a 37°C por um período de sete dias, com monitoramento diário para observação de efeito citopático (ECP). Como controle negativo foi utilizado cultivo celular inoculado com MEM-E e como controle positivo um cultivo celular inoculado com uma das amostras padrão.

Após identificação como BoHV-5 RJ42/01 a amostra foi amplificada para produção de massa viral e o título da amostra foi determinado pela técnica de Reed Müchen Reed, L.J., Müench, H. (1938). A simple method of estimating fifty per cent end points. Am. J. Hyg. 27, 493-497 e ensaio de placas seguindo protocolo previamente descrito por Dulbecco, R., & Vogt, M. (1953). Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 18, 273-279.

Para caracterização da amostra RJ42/01 pela reação em cadeia pela polimerase, procedeu-se a extração do DNA a partir de 250μΙ das suspensões a 10% e dos sobrenadantes dos cultivos celulares utilizando-se o método do TRIZOL- LSTM (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. O DNA extraído foi ressuspendido em TE (10mM Tris, 1mM EDTA), quantificado e empregado nas reações de PCR. O produto de amplificação por PCR foi utilizado para caracterização como BoHV-5 por Nested/PCR.

Os primers utilizados neste experimento são complementares às sequências do gene da glicoproteína C (gC) do BoHV-1 e BoHV-5. Os protocolos e condições utilizados nas técnicas de PCR e Nested-PCR foram previamente descritos por Ashbaugh S.E., Thompson K.E., Belknap E.B., Schultheiss P.C., Chowdhury S.l. & Collins J.K. 1997. Specific detection of BHV-5 and BHV-1 is shedding and latency using a nested polymerase chain reaction. J. Vet. Diagn. Invest. 9: 387-394. Os amplicons resultantes da PCR e Nested-PCR, (655pb/274pb e 589pb/166pb para o BoHV-1 e BoHV-5, respectivamente foram analisados em eletroforese de gel de agarose a 2% seguido de coloração com brometo de etídio (0,5pg/mL) descrito previamente (Sambrook J., Fritsch E.F. & Maniatts T.( 1989). Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, p.957) e visualizados sob luz ultravioleta. Para foto documentação foi empregado o sistema GDAS-1200PC Manufacturer: UVP 2066w11th. Sobrenadantes de cultivos celulares foram utilizados como controle negativo para isolamento viral e água ultrapura autoclavada (Milli-Q®) (Invitrogen) foram utilizados como controles negativos em todos os procedimentos.

Avaliação da Citotoxicidade Celular pelo Método Colorimétrico do Sal de Tetrazolium (ΜΤΠ Para determinação da citotoxicidade dos compostos utilizamos o método do sal tetrazólico (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromide; Sigma-Aldrich) (MTT) Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival. J. Irmmunol. Methods, 65, 55-63, que mede a atividade metabólica de células viáveis pela redução do sal de tetrazólico a formazana através da succinato desidrogenase mitocondrial, uma enzima que é ativa em células com a cadeia respiratória e metabolismo intactos. O efeito dos compostos Lapachol, Dímero e Quins 28 sobre a viabilidade celular foi avaliado pelo método MTT em células MDBK partindo-se de 3x103 células/200ul cultivadas por 24h a 37°C e 5% C02 até confluência em placas de 96 poços. As células foram posteriormente tratadas com diferentes concentrações dos compostos estudados (1000, 500, 250, 50, 25, 12.5 e 6.25μΜ) e após incubação das células/ compostos por 72h a temperatura de 37°C e 5% C02 a citotoxicidade foi determinada pela capacidade da metabolização do MTT pela succinato desidrogenases da mitocôndria resultando na produção do precipitado azul de formazan que foi, posteriormente, dissolvido pelo Dimetilsulfóxido (DMSO/ MERCK) e quantificado espectrofotometricamente a 520nm. Todos os ensaios foram feitos em triplicata e a média da concentração dos compostos capaz de matar 50% das células (CC50) foi calculado por regressão linear. Os resultados do CC5o para Acyclovir, Dímero, lapachol e Quins 28 foram respectivamente 989± 2; 58±3.5; 49.7±9.2 e 396± 7.3.

Determinação da Atividade Antiviral dos compostos pelo MTT (ECgn) Células MDBK (3x103 células/200pL7poço) foram cultivadas por 24h a 37°C e 5% C02 ou até confluência em placas de 96 poços e, posteriormente, infectadas com 200 P.F.U de suspensão de BoHV-5 RJ42/01 por 1h para adsorção (considerado T = Oh pós-infecção). Após este período 0.2mL de E-MEM contendo ou não diferentes concentrações dos compostos foram adicionados e as placas reincubadas e, após 72h pós-infecção (p.i.). o sobrenadante do cultivo celular foi removido, as células lavadas três vezes com MEM sem soro e a viabilidade celular ensaiada pelo método de redução do MTT (idem item anterior). As atividades antivirais dos compostos foram determinadas conforme previamente descritos por Pauwels, R., Balzarini, J., Baba, M., Snoeck, R., Schols, D., Herdewijn, P., Desmyter, J., De Clercq, E. (1988) Rapid and automated tetrazolium-based colorimetric assay for the detection of anti-HIV. Journal of virological methods 20(4):309-21. As concentrações em μΜ dos compostos (Acyclovir, Dímero, Lapachol e Quins 28) calculada conforme (Weislon, O. S. Kiser, R., Fine, D.L., Bader, J. Shoemaker, R.H. Boyd M.R.(1989). New soluble-formazan assay for HIV-1 Cytopathic Effects: aplication to High-flux Screening of synthetic and natural products for AIDS-Antiviral activity. The Journal of the National Câncer Institute. Vol.81 p.577-586), necessárias para inibir 50% da replicação do BoHV-5 RJ42/01 (EC50) foram respectivamente: 125±1,8; 1.8+ 3; 2.9±5.8; 4,5 ± 9.

Determinação da Atividade Antiviral por Redução do Número de Placas (ECm) O ensaio seguiu o protocolo descrito previamente por Cheng, Η. Y., Lin, C. C. & Lin, T. C., 2002a. Antiherpes simplex virus type 2 activity of casuarinin from the bark of Terminalia arjuna Linn. Antiviral Res 55, 447-455, com algumas modificações. Suspensão de células MDBK (104celulas) foram semeadas em placas de 24 poços e crescidas a 37°C por 24h em estufa com 5% C02, seguindo de infecção com 200 P.F.U of BoHV-5 RJ42/01. Após período de adsorção de 1h (T = Oh p. i) foram adicionados meio de cultivo (MEM) contendo 1%de agarose e diferentes concentrações dos compostos. Após 72h p.i as monocamadas foram fixadas e coradas com cristal violeta 1% em formalina 10%. As placas virais foram então contadas e as concentrações dos compostos necessárias para reduzir 50% do número de placas em relação ao controle infectado não tratado (EC50) foram calculadas pela formula: (%)=Número de placas do controle - Número de placas do teste x 100 Número de placas do controle O resultado do EC5o (μΜ) para Acyclovir, Dímero, Lapachol e Quíns 28 foram respectivamente: 166 ± 2; 2.3 ±8,0; 4.1 ±10.2; 2,8 ±7,0. índice de Seletividade Com base nos valores de CC50 e EC5o, foi calculado o valor do índice de seletividade (S.I.), que representa o grau de segurança para a utilização de um composto “in vitro”. Este parâmetro farmacológico foi calculado através da razão entre o CC50 e o EC50 de cada substância. Os resultados de S.l pelo MTT e pelo ensaio de placas foram respectivamente Acyclovir (7,9 e 6,0), Dímero (30,5 e 25,0), Lapachol (17 e 5,0) e Quins 28 (88 e 141).

Determinação da Atividade Virucida A atividade virucida dos compostos Dímero Lapachol e Quins 28 e ACV foi avaliada conforme protocolo previamente descrito por Cheng, Η. Y., Yang, C. M., Lin, T. C., Shieh, D. E., Lin, C. C., 2006. ent-Epiafzelechin-(4 8) epiafzelechin extracted from Cassia javanica inhibits herpes simplex virus type 2 replication. J. of Med. Microbiol. 55, 201-206, com algumas modificações. Suspensão de BoHV-5 RJ42/01 contendo 2x107 P.F.U tratada ou não com diferentes concentrações dos compostos (25, 50 e 100μΜ) e mantidos por 6h a temperatura ambiente de 24°C. Posteriormente, as amostras tratadas e não tratadas foram diluídas e a infectividade residual foi determinada por ensaio de placas e calculada conforme formula abaixo: (%) = Número de placas do controle - Número de placas do teste x 100 Número de placas do controle Os resultados mostraram que a concentração de 50 μΜ e 25μΜ o lapachol foi extremamente citotóxico. Para tratamento com concentração 25μΜ dímero e lapachol mostraram atividade virucida de aproximadamente 10%, Quins 28 5% e Acyclovir aproximadamente 2%.

Análise da infecção Curso Temporal Ensaio para determinar inibição da adsorção seguiu a metodologia previamente descrita por Cheng, Η Y., Lin, T. C., Yang, C. M., Wang, K. C., Lin, L. T. & Lin, C. C., 2004a. Putranjivain A from Euphorbia jolkini inhibits both virus entry and late síage of replication of herpes simplex virus type 2 in vitro. J Antimicrob Chemother 53, 577-583, com algumas modificações. Suspensão de células MDBK (2x104ceiulas) foi crescida em placa de 24 poços a 37°C com 5% C02 e após 24h as monocamadas foram infectadas com 1x104 P.F.U BoHV-5 RJ42/01. Imediatamente após 1h de incubação, para adsorção do vírus, e período considerado corno tempo zero pós-infecção (TOh p.i.), o inoculo foi removido de todas as placas e as placas foram divididas em grupos seguindo o seguinte esquema: Grupo 1: As células foram tratadas após TOh p.i com 0,2mL de solução contendo Dímero 25 μΜ; Lapachol 12,5 μΜ; Quins 28 μΜ e Acyclovir 50 μΜ e reincubadas por período de 1, 2 e 3 horas. Após esses períodos as monocamadas de células foram lavadas e reincubadas com meio de manutenção por 72. Grupo 2: As células foram reincubadas com meio de cultivo por T, 2 e 3h e após cada período foi descartado para adição da mesma concentração acima de compostos (0,2mL solução contendo Dímero 25 μΜ; Lapachol 12,5 μΜ; Quins 28 μΜ e lapachol 50 μΜ). Após 3 h de tratamento, as monocamadas foram lavadas e meio de cultivo adicionado seguindo de reincubação por mais 72h. Grupo 3: As células infectadas foram reincubadas com meio de cultivo por 6h, que foi posteriormente descartado para tratamento com 0,2mL de solução contendo os compostos (Dímero 25 μΜ; Lapachol 12,5 μΜ; Quins 28 μΜ e lapachol 50 μΜ) e reincubadas por 72h. Grupo 4: No TOh p.i este grupo de células infectadas foram tratadas com as mesmas concentrações acima dos compostos e mantidos por 72h.

Grupo 5: Os controles cie células infectadas não tratadas foram feitos paralelamente e correspondeu a cada período estudado quando as células foram lavadas e, o meio trocado seguindo de reincubação por 72h. Após 72h p.i, as células foram rompidas três vezes por congelamento e descongelamento a 37°C e os fragmentos das células foram removidos por centrifugação a 2000 x g por 10min. Os sobrenadantes aliquotado e estocado a -70°C. As percentagens de redução do número de placas foram calculadas como o decréscimo no título do vírus observado nas células infectadas tratadas pelos compostos, comparada com o título de vírus nas células infectadas não tratadas nos diferentes períodos estudados.

Os resultados obtidos em percentagem.

Acyclovir 50μΜ: T0-1-72(2±2,0); T0-2-72(1±2,0); T0-3-72(10±4,9); T0-1-3-72(10±3,2); T0-2-3-72(7±8,1); T0-3-3-72(24±2,6); T0-6-72(13±4,5); T0-72(1 ±2,1). Dímero 25μΜ: T0-1 -72(91 ±1,5); T0-2-72(99±2,4); T0-3-72(91 ±5,7); T0-1-3-72(99±4,0); T0-2-3-72(99±3,1); T0-3-3-72(100±1,5); T0-6-72(100±2,7); T0-72(100±3,1).

Lapachol 12,5 μΜ: T0-1-72(32±5,3); T0-2-72(99±2,9); T0-3- 72(100±1,1); T0-1-3-72(99±2,4); T0-2-3-72(99±2,1); T0-3-3-72(100±4,9); T0-6-72(99±2,7); T0-72(100±1,5).

Quins 28 50μΜ T0-1-72(84±2,1); T0-2-72(79±2,6); T0-3-72(94±1,5); T0-1 -3-72(82±6,4); T0-2-3-72(98±3,2); T0-3-3-72(95±1,0); T0-6-72(35±4,7); T0-72(100±3,0).

Ensaio de Inibição da Adsorção Ensaio para determinar inibição da adsorção seguiu metodologia previamente descrita por (De Logu et al. 2000 e Cheng et al. 2004) com algumas modificações. Suspensão de células MDBK contendo 104celulas/ml_ foi adicionada as placas de 24 poços e crescidas a 37°C por 24h com 5% C02. Após este período as placas foram resfriadas a 4°C por 1 h e infectadas com 200 P.F.U de BoHV-5 RJ42/01, na presença e ausência de diferentes concentrações de cada compostos (6,25; 12,5; 25; e 50μΜ). As placas foram reincubadas por mais 3h a 4°C e após esse período, os sobrenadantes foram removidos e descartados e, as células lavadas três vezes com meio MEM sem soro e adicionado o meio de cobertura (meio de cultivo contendo agarose 1%) e reincubadas. Após 72h p.i. as monocamadas foram fixadas e coradas com solução de cristal violeta preparada em formalina 10%.

Inibição (%) = N° de placas do controle - N° de placas do teste x 100 Número de placas do controle As percentagens de inibição após tratamento com: 6,25; 12,5; 25; e 50μΜ foram respectivamente. Dímero: 72%; 79%; 83%; 90%.

Lapachol: 78%; 87%; 93%; 95%.

Quins 28: 66%; 68%; 70%; 81%.

Acyclovir: 0.60%; 0.76%; 1%; 2%.

Ensaio de Inibição da Penetração Ensaio para determinar inibição da penetração seguiu metodologia previamente descrita por Cheng, Η. Y., Yang, C. M., Lin, T. C., Shieh, D. E., Lin, C. C., 2006. ent-Epiafzelechin-(4a->8) epiafzelechin extracted from Cassia javanica inhibits herpes simplex virus type 2 replication. J. of Med. Microbiol. 55, 201-206, com algumas modificações. A suspensão de células MDBK (104 células) foi semeada em placa de 24 poços e crescida a 37°C por 24h com 5% C02. Após este período as placas foram resfriadas a 4°C por 1h, (T0). As células foram infectadas com 200 P.F.U BoHV-5 RJ42/01 e reincubadas a 4°C por mais 3h, com diferentes concentrações dos compostos em estudo dímero e Lapachol (25 e 50 μΜ) Acyclovir e Quins 28 (50 μΜ). As placas foram subsequentemente incubadas por 60minutos e a cada 15 minutos de intervalos as monocamadas foram tratadas com PBS pH=3 por 1 minuto e imediatamente neutralizadas com PBS pH-11. As placas foram cobertas com meio de cobertura e após 72h as monocamadas foram fixadas e coradas. As placas foram contadas e a percentagem de inibição da penetração calculada idem formula do item anterior. As percentagens de inibição após tratamento nos intervalos (15; 30; 45 e 60 min.) foram respectivamente. Dímero 50 μΜ: 76%; 75%; 72% e 75%. Dímero 25 μΜ: 63%; 63%; 69% e 71% Lapachol 50μΜ: 87%; 91%; 96% e97%.

Lapachol 25μΜ: 93%; 92%; 82% e 83%.

Quins 28 50μΜ: 63%; 66%; 61%; 60%.

Acyclovir: 50μΜ: 0,33%; 1,65%; 1,45% e 1,93%.

Resultados dos Ensaios de Atividades Inibidoras dos Compostos na Replicacão do Herpesvírus Bovino -5 (BoHV-5) Alguns exemplos de substâncias testadas das classes I e II estão mostrados na Tabela 1 e na Tabela 2, respectivamente, onde se podem observar os efeitos inibitórios (%) das naftoquinonas I e II frente ao Herpesvírus Bovino-5 (BoHV-5).

Tabela 1: Efeito inibitório (%) das Piranonaftoquinonas do tipo I e III na Replicação do Herpesvírus Bovino-5 (BoHV-5). CC50 = Concentração Citotóxica (Concentração do composto necessária para matar 50% das células). EC50 Concentração Efetiva do composto necessária para inibir em 50% o número de placas virais ou reduzir em 50% a produção de vírus.

Sl= índice de Seletividade é relação entre CC5o/EC5o. NR= Não realizado (droga citotóxica).

Tabela 2: Efeito Inibitório (%) das 2-hidroxi-1,4-naftoquinonas do tipo II na Replicação do Herpesvírus Bovino- 5 (BoHV-5).

Tabela 3: Efeito Inibitório (%) das Furanonaftoquinonas do tipo IV Frente ao Herpesvírus Bovino (BoHV-5) Pela análise in vito a concentração ótima para os compostos foram: • Lapachol: 6,25 -12,5 μΜ e Si- 5 • Dímero = 6,25 - 12,5 μΜ (SI 25) • Quins 28 = 25- 50 μΜ (SI 141) A droga Quins 28 foi o composto mais promissor em função de sua toxicidade e do seu valor do índice de seletividade =141.

Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outros variantes, abrangidos no escopo das reivindicações anexas.

Reivindicações USO DE NAFTOQUINONA NA PREPARAÇÃO DE UM MEDICAMENTO PARA Tratar Doença Causada por Herpesvírus Bovino

Claims (12)

1. Uso de naftoquinona caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar doença causada por Herpesvírus bovino.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo Herpesvírus Bovino ser do tipo 5 (BoHV-5).

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela naftoquinona ser de uma das seguintes fórmulas: em que R1 a R6 são independentemente selecionados do grupo que consiste de substitutos conjugados ou independentes, grupos funcionais amínicos, guanidínicos, sulfâmico, hidroxílicos, ésteres, éteres, tioésteres, tioéteres, halogênios, alquííicos de cadeias de até 10 carbonos (Cio)-

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por R1 a R6 serem independentemente substituídos com pelo menos um grupo que consiste de cadeias C^Ce alquilas, de C2-Ce alquenilas, de CrC6-alcoxilas, de Ci-C6-alcoxicarbonílicas, de -(CH2)n-arílicas, de-íCH^n-heteroarílicas, de-(CH2)n-heterocíclicas; de-(CH2)n-fenílicas; de -(CH2)n-amínicas; de-(CH2)n-alcoxicarbonílicas, de alílicas ou arílicas; anéis arílicos ou triazólicos substituídos com hidroxilada, haiogenada, de-(CH2)nTialogênicas, S03H, S03Na, S03Li, S03K, de S03alquílicas, de S03arílicas, de S03heterocíciicas, de S03amínicas; de S03alquilamínicas; de S03alcoxílicas; N02; NH2; CN; derivado do enxofre, derivados de ésteres carboxílicos C02R; anéis carbocíciicos ou heterocíclicos fundidos ao anel aromáticos e tetrahidrofurânico; hidrazononas, hidroxiaminas.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela naftoquinona do tipo II ser representada pela fórmula: em que R1= R2= R3= R4=H e Rs= 0CH=C(CH3)2.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela naftoquinona tipo I ser representada pela fórmula:

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela naftoquinona do tipo I compreender concentração entre 25 a 50 μΜ.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela naftoquinona do tipo II ser representada pela fórmula:

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela naftquinona do tipo II compreender concentração entre 6,25 a 12,5 μΜ.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela naftoquinona do tipo III ser representada pela fórmula:

11.

Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela naftoquinona do tipo III compreender concentração entre 6,25 a 12,5 μΜ.