BR102012009919B1 - Nanoemulsão de lychnophora pinaster e seu uso - Google Patents

Abstract

nanoemulsão de lychnophora pinaster e seu uso. a presente invenção trata-se de uma nanoemulsão que compreende como principal componente extrato vegetal ou óleo essencial de lychnophora pinaster e seu uso como composição odontológica. a nanoemulsão proposta pode ser utilizada em pacientes que fazem uso de aparelho ortodôntico fixo, pacientes que não fazem uso de nenhum aparelho ortodôntico e também por aqueles que utilizam aparelhos ortodônticos removíveis, por apresentar propriedades antimicrobianas contra micro-organismos presentes na cavidade bucal, especialmente contra sreptococcus mutans, um dos principais agentes etiológicos da cárie e marcada ação sobre o biofilme formado por essa espécie. além disso, a lychnophora pinester apresenta atividade analgésica, anti-inflamatória, antiedematogênica, antinociceptiva, antitumoral, cicatrizante, entre outras, tornando-a ainda mais efetiva como enxaguatório bucal.

Description

NANOEMULSÃO DE Lychnophora pinaster E SEU USO Campo da Invenção A presente invenção trata-se de uma nanoemulsão que compreende como principal componente extrato vegetal ou óleo essencial de Lychnophora pinaster e seu uso como composição odontológica. A nanoemulsão de Lychnophora pinaster pode ser utilizada em pacientes que fazem uso de aparelho ortodôntico fixo, pacientes que não fazem uso de nenhum aparelho ortodôntico e também por aqueles que utilizam aparelhos ortodônticos removíveis, por apresentar propriedades antimicrobianas contra microorganismos presentes na cavidade bucal, especialmente contra Streptococcus mutans, um dos principais agentes etiológicos da cárie e marcada ação sobre o biofilme formado por essa espécie. Além disso, a Lychnophora pinaster apresenta atividade analgésica, anti-inflamatória, antiedematogênica, antinociceptiva, antitumoral, cicatrizante, entre outras, o que a torna ainda mais efetiva como enxaguatório bucal.

Fundamentos da Invenção Fitoterapia A fitoterapia tem sido alvo de investigações científicas quanto ao uso, efeito e propriedades farmacológicas de plantas medicinais, tendo o seu uso direcionado ao tratamento de diversas doenças (Grégio et al., 2006). Desde a década de 50, tem sido observado mundialmente um crescente interesse global no aproveitamento da biodiversidade, particularmente no que se refere às plantas medicinais, que têm sido utilizadas em várias áreas da saúde como uma forma alternativa de tratamento e prevenção (Lewis e Elvin-Lewis, 1977).

De acordo com a FDA (2004), um produto natural, ou fitoterápico, deriva-se de uma ou várias plantas, algas, ou fungos macroscópicos. Um fármaco derivado de produtos naturais é preparado a partir de matérias-primas botânicas, por um ou vários dos seguintes processos: pulverização, decocção, extração aquosa, extração etanólica, ou outro processo similar. Pode estar disponível em uma variedade de formas físicas, tais como pó, pasta, líquido concentrado, suco, goma, xarope, ou óleo, sendo que geralmente não inclui uma substância altamente purificada ou quimicamente modificada derivada das fontes naturais.

Fitoterápicos ricos em fenóis, chamados de polifenóis, que só existem no reino vegetal, onde exercem a nobre e valorosa função de defesa das plantas, apresentam um poderoso efeito antioxidante e uma marcada ação antimicrobiana (Bakri e Douglas, 2005; Smullen et al., 2007; Ferrazzano et al., 2009; Sampaio et al., 2009; Koo et al., 2005; Duarte et al., 2006; Razak e Rahim, 2003; Nalina e Rahim 2007; Park et al., 1998; Koo et al., 2000; Castaldo e Capasso, 2002; Koo, et al., 2002; Duarte et al., 2003; Ooshima et al., 2000; Smullen et al., 2007; Ferrazzano et al., 2009).

Os compostos fenólicos das plantas se enquadram em diversas categorias, como fenóis simples, ácidos fenólicos (derivados de ácidos benzóico e cinâmico), cumarinas, flavonóides, estilbenos, taninos condensados e hidrolisáveis, lignanas e ligninas (Naczk et al., 2004).Muitas plantas utilizadas na medicina popular contem grande variedade de componentes fenólicos. Estes componentes, especialmente os flavonóides, atuam na limpeza de radicais livres e na inibição da peroxidação lipídica.

Os flavonóides são um grupo de ocorrência natural de compostos fenólicos da planta (frutas, legumes, flores, folhas). Uma variedade de propriedades farmacológicas tem sido atribuída aos flavonóides, como anti-inflamatória, antiviral, antiespasmódica, antitumoral e antialergênica, as quais são sempre associadas com sua atividade antioxidante (Kanashiro et al., 2004). Flavonóides como a naringenina, flavona e flavonol, incluindo canferol, morina e quercetina, constituem um amplo grupo de metabólitos secundários das plantas que apresentam atividade antibacteriana (Arima e Danno, 2002).

Dentre as espécies com potencial de uso farmacológico encontra-se a Lychnophora pinaster (Asteraceae), popularmente conhecida como arnica. Apesar da grande disponibilidade de informações a respeito da química e de outras características de espécies do gênero, pouco é sabido a respeito de Lychnophora pinaster, espécie conhecida popularmente por arnica-mineira, arnica-da-serra, entre outros.

Possui como sinonímia Vernonia pinaster (Mart.) Less, Vernonia trichocarpa Spreng., Lychnophora trichocarpa (Spreng) Spreng., Piptopcoma lychnophorioides Less., Lychnophora affins Gardn., Lychnophora brunoides var. affins (Gardner), Lychnophora rosmarinus Pohl. Ex. Schultz-Bip., Lychnophora rosmarinus var. rosmarinus Schultz-Bip., Lychnophora brunioides var. pinifolia Baker, Lychnophora pumiio Pohl e Lychnophora piptocoma Schultz-Bip (Semir, 1991).

Essa espécie é encontrada nos campos rupestres, campos sujos e campos limpos de altitudes elevadas (altos de serras) na região de Cerrado do Alto Rio Grande em Minas Gerais (Rodrigues, 1988). É encontrada também, em campos de canga, como os existentes na Serra do Rola Moça, na Serra Moeda e na Serra do Curral, e crescendo entre blocos de rochas ou alto de pequenos morros como nas Serra do Cipó, Serra do Caraça e Serra de Lavras, onde foi encontrada na Serrinha; em Itumirim, na Serra da Bocaina/Morro Janela; em Carrancas, na Cachoeira da Fumaça e na Serra de Carrancas (Semir, 1991). Carvalho (1992) descreve o crescimento de arbustos nos campos rupestres da Serra da Bocaina sobre depressões rochosas com acúmulo de matéria orgânica.

Na triagem fitoquímica do extrato etanólico bruto das folhas e das flores de Lychnophora pinaster, foi observada a presença de ácidos orgânicos, polissacarídeos, proteínas e aminoácidos, taninos, flavonóides, catequinas, lactonas sesquiterpênicas e outras lactonas, azulenos, esteróides e triterpenóides, depsfdeos e depsidonas, derivados da cumarina, saponina espumídica (somente nas folhas), alcalóides, purinas e antraquinonas (Pinheiro, 2002).

As folhas e flores da Lychnophora pinaster são intensamente utilizadas na medicina tradicional, na forma de extratos alcoólicos, infusões, banhos ou macerados em etanol e pomada, por possuir atividades analgésica, anti- ínflamatória, antiedematogênica, antinociceptiva e cicatrizante, no tratamento de contusões, reumatismo, feridas, coceira e picada de insetos (Bastos et al., 1987; Miguel et al., 199;, Almeida et al., 1998; Saúde et al., 1998; Duarte et al., 1999; Lopes, 2001; Souza, 2003; Azevedo, 2004; Silveira et al., 2005; Guzzo et al., 2008; Abreu et al., 2011).

Seu uso na forma de cosmético, como sabonete, também é indicado, por eliminar asperezas e rachaduras na pele, além de suavizar hematomas e contusões (Almeida et al., 1998). Outros estudos farmacológicos mostram que essa espécie possui, além da atividade analgésica e anti-inflamatória (Bastos et al., 1987; Miguel et al., 1996; Guzzo et al., 2008; Abreu et al., 2011), também atividade antitumoral (Kanashiro et al., 2004), tripanocida (Meyer et al., 1982; Duarte et al., 1999; Kanashiro et al., 2004; Alcântara et al., 2005, Silveira et al., 2005) e efeito antimicrobiano (Miguel et al., 1996; Abreu et al., 2011). A atividade antimicrobiana da Lychnophora pinaster foi avaliada contra Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus e Citrobacter freundi. Foram avaliados extratos etanólicos, frações metanólicas e hexânicas da Lychnophora pinaster e foi verificado que as frações apoiares das folhas e dos caules e a a-amirina, que foi isolada dessas frações, apresentaram efeito contra o Staphylococcus aureus em testes de disco difusão. Quanto ao teste de microdiluição, apenas a α-amirina e a mistura de α-amirina e lupeol demonstraram atividade, sendo a Concentração Inibitória Mínima (CIM) de 1.024 pg/mL (Abreu et al., 2011).

Ainda com relação ao Staphylococcus aureus, A CIM do ácido lichnofórico, foi de 30 pg/mL e a do ácido acetil lichnofórico < 10 pg/mL (Miguel et al., 1996). Carioloaia A doença cárie é um processo dinâmico, biofilme-açúcar dependente, que ocorre devido à fermentação dos carboidratos e produção ácida no biofilme e que resulta em um distúrbio do equilíbrio entre o mineral do dente e o fluido do biofilme adjacente. Com o decorrer do tempo, o resultado é a perda mineral (Thylstrup e Fejerskov, 1999). A desmineralização do esmalte é o primeiro passo para a instalação da cárie dental, doença de lenta progressão, sendo que o uso de fluoretos leva a alterações da cárie incipiente, que passa a se apresentar como lesão de mancha branca sem presença de cavidade (Verdonschot et al., 1999). Clinicamente, a cárie pode se apresentar de várias formas, desde opacidades no esmalte, difíceis de serem discernidas, até grandes cavidades que se estendem até a polpa dental.

No entanto, a superfície de esmalte com lesão de cárie tem possibilidade de remineralização quando em estágio inicial e isto enfatiza a necessidade do aperfeiçoamento de métodos preventivos que possam agir como coadjuvantes na prevenção e controle da cárie (Lussi et al., 1999).

Streptococcus mutans encontra-se amplamente distribuído não apenas em populações com moderada ou alta prevalência de cárie, mas também nas populações com baixa ou nenhuma experiência desta (Napimoga et al., 2004). É uma das bactérias mais representativas da microbiota oral e um importante patógeno relacionado com a cárie dental (Hamada e Slade, 1980; Loesche, 1986; Tanzeret al., 2001).

Ele é acidúrico, acidogênico e não só fermenta a sacarose como, a partir unicamente desta, sintetiza glucanos, solúveis e insolúveis (polissacarídeos), através das enzimas extracelulares glicosiltransferases (Hamada et al., 1981; Fujiwara, 1996; Colby e Russell, 1997; Banas e Vickerman, 2003), o que contribui para a formação do biofilme dentáriio, que tem sido amplamente estudado por sua relação direta com a doença cárie (Gibbons e van Houte, 1975; Paes Leme et al., 2006; Ccahuana-Vásquez et al., 2007; Vale et al., 2007) e inflamação gengival (gengivite).

Além disso, a presença de uma dieta rica em teores de sacarose promove um aumento da proporção de estreptococos do grupo mutans, uma vez que estes micro-organismos apresentam algumas vantagens ecológicas quando da presença deste açúcar no meio bucal, permitindo a sua aderência, colonização e posterior acúmulo na superfície lisa do esmalte dental (Dennis et al., 1975; Staat et al., 1975; Hamada e Slade, 1980; Loesche, 1986; Bradshaw et al., 1989; Bradshaw e Marsh, 1998).

Dentre os carboidratos da dieta, a sacarose é considerada como o mais cariogênico (Cury et al., 2000; Paes Leme et al., 2006), pois além de ser fermentada a ácidos, reduzindo o pH do biofilme dental, é substrato para a síntese de polissacarídeos extracelulares insolúveis (PECI) e solúveis (PECS) por meio de três glicosiltransferases: GTFB, GTFC e GTFD (Rõlla et al., 1985; Hamada e Slade, 1980; Cury et al., 2000; Bowen et al., 2002).

Além de promoverem a aderência microbiana à superfície dental (Loesche, 1986; Rõlla, 1989; Paes Leme et al., 2006), os PECI promovem modificações estruturais no biofilme dental, tornando-o mais poroso. Essa maior porosidade ao biofilme formado permite a penetração de substratos acidogêniços para as camadas mais internas do biofilme e, conseqüentemente facilitando a difusão de substratos ácidos para a superfície dental (Zero et al., 1986; Dibdin e Shellis, 1988; Zero et al., 1992). A fermentação de carboidratos, especialmente a sacarose, pelas bactérias do biofilme faz com que haja um aumento na concentração de lactato (Geddes, 1975; Bradshaw et al., 1989), reduzindo o pH do meio (Bowen et al., 1966; Bradshaw et al., 1989; Bradshaw e Marsh, 1998). Essas quedas de pH no biofilme dental são consideradas como um dos principais estresses aos quais os micro-organismos orais estão expostos (Lemos et al., 2005), podendo alterar a homeostasia microbiana do biofilme, o crescimento e a sobrevivência dos micro-organismos (Marsh, 1994; Bowden e Hamilton, 1998; Marsh, 2003; Lemos et al., 2005). A alteração da homeostasia microbiana do biofilme dental ocasionada pela queda de pH (Marsh, 1994; Lemos et al., 2005), pode promover seleção microbiana (Marsh, 2003; Paddick et al., 2003), selecionando micro-organismos com maior habilidade em responder às alterações nas condições ambientais (Bradshaw et al., 1989; Bradshaw e Marsh, 1998), o que leva a formação de um biofilme mais cariogênico pela seleção de bactérias como os Streptococcus mutans, que sobrevivem e predominam em um meio ácido (Bradshaw et al., 1989; Bradshaw e Marsh, 1998; Li et al., 2001; Marsh, 2003; Welin-Neislands e Svensáter, 2007). Em adição, o uso repetido de alguns agentes antimicrobianos no biofilme também pode selecionar microorganismos resistentes (Alviano et al., 2005).

Além disso, o comportamento de micro-organismos aderidos a superfícies pode ser diferente quando comparado ao comportamento destes como célula planctônica. Alguns trabalhos têm demonstrado que a expressão proteica e gênica de Streptococcus mutans em biofilmes é diferente em relação à expressão em culturas planctônicas (Marsh, 2004; Shemesh et al., 2007). Sabe-se que as bactérias que crescem no formato de biofilme expressam propriedades distintas das células planctônicas e estão preparadas para experimentar algum tipo de restrição de nutrientes. Vem sendo sugerido que esta limitação fisiológica pode esclarecer a resistência dos biofilmes aos agentes antimicrobianos (Mah e 0’Tolle, 2001; Dunne, 2002; Marsh, 2003; Alviano et al., 2005).

De acordo com Clarkson e McLoughlin (2000), apesar dos avanços acerca da prevenção e do controle da cárie dental, essa condição ainda é considerada um problema de saúde pública, que afeta muitos países do mundo. Apesar do amplo uso de compostos fluoretados, a cárie ainda se manifesta em determinados indivíduos ou grupos de indivíduos, seguindo uma polarização da cárie , sendo que apenas 15% dos jovens de 17 anos de idade apresentam-se livres de cárie. O controle mecânico representa o método mais valioso utilizado na prevenção e remoção do biofilme e consiste na escovação e no uso do fio dental. Porém nem sempre é realizado adequadamente e por outro lado, a escovação, mesmo associada ao uso de dentifrícios fluoretados convencionais (0,2 % de fluoreto de sódio) e fio dental, nem sempre é suficiente para a eliminação total do biofilme (Monfrin e Ribeiro, 2000). O fato de desorganizar o biofilme periodicamente já diminui seu potencial patogênico e aperfeiçoa o efeito do flúor (Cury, 1992). Se a higiene bucal fosse perfeita, o uso de flúor seria desnecessário (Rolla et al., 1991; Cury, 2001), porém, considerando que essa higiene é muito difícil de ser obtida em termos populacionais, o uso de flúor deve ser enfatizado, para que haja um efeito sinérgico (Rolla et al., 1991; Cury, 1992).

De acordo com Cury (2001), a eficácia do flúor é maior quanto menor a perda mineral. Dessa forma, a eficiência assenta-se na regularidade de escovação, uma vez que o flúor interfere na dinâmica do processo cariogênico. Assim, ao mesmo tempo em que o biofilme é desorganizado periodicamente, diminuindo seu potencial cariogênico, o flúor ajuda a saliva a repor minerais perdidos do dente. A escolha da estratégia de tratamento para controlar a progressão da doença cárie obviamente depende da atividade da doença do paciente. A presença contínua de baixas doses de flúor na saliva parece inibir efetivamente a desmineralização e melhorar o processo de remineralização, mesmo em casos de alto risco de cárie (Featherstone et al., 1986; ten Cate e Timmer, 1999; Sudjalim et al., 2006). No entanto, há um efeito terapêutico máximo do flúor, acima do qual não deve ser esperada proteção adicional (Tabchoury et al., 1998).

Em alguns indivíduos, a remoção do biofilme efetuada pelo próprio paciente, combinada com o uso de dentifrício fluoretado, é suficiente para manter a desmineralização em estágios subclínicos. Por outro lado, o risco de cárie fica aumentado com o uso do aparelho ortodôntico fixo, pois a remoção do biofilme, através da higiene bucal convencional, torna-se mais difícil. Portanto, trata-se de um efeito adverso, a desmineralização que ocorre ao redor dos braquetes, durante o tratamento ortodôntico (Lehman e Davidson, 1981; 0’Relly e Featherstone, 1987; Mitchell, 1992; Chadwick, 1994; Chang et al., 1997; Wilson e Donly, 2001; Benson et al., 2003; Staudt et al., 2004; Queiroz, 2007).

Por isso, em indivíduos com rápida progressão de lesões de cárie e em pacientes ortodônticos, são necessárias medidas mais específicas, como o uso de materiais de colagem liberadores de flúor (Cury, 2001). A evolução das propriedades físicas do ionômero de vidro contribuiu para diminuição da cárie dental nos pacientes tratados ortodonticamente, devido às características biológicas e químicas deste material (Mccarthy e Hondrum, 1994).

Por estas razões, a popularidade do uso de cimentos de ionômero de vidro modificado por resina para a colagem de braquetes está aumentando. Suas propriedades de adesão são aceitáveis e têm a vantagem a liberar flúor. Nesse sentido, o uso de cimento de ionômero de vidro para a colagem de braquetes resulta em sucesso na inibição da cárie (Chadwick e Gordon, 1995; Vorhies et al., 1998; Wilson e Donly, 2001; Gorton e Featherstone, 2003; Corry et al., 2003; Pascotto, 2004; Staudt et al., 2004; Benson et al., 2005).

Além disso, diante dos efeitos adversos do tratamento ortodôntico, têm-se buscado alternativas para incorporar ao meio bucal ortodôntico substâncias antimicrobianas que proporcionem controle químico do biofilme dental, tornando-se uma ferramenta adicional de proteção aos tecidos dentais (Anderson et al., 1997).

De acordo com Featherstone et al. (1986); Ogaard et al. (1986); 0’Relly e Featherstone (1987); Ogaard et al. (1994); Chang et al. (1997), há fortes evidências de que seria necessária uma combinação da escovação diária com dentifrício fluoretado e do bochecho diário para que houvesse proteção total do paciente ortodôntico pela inibição da desmineralização do esmalte ou pela remineralização da área de risco.

Neste contexto, novos agentes que possam atuar sobre microorganismos associados a biofilmes são extremamente necessários e poderão aumentar o número de terapias efetivas alternativas, uma vez que o controle do biofilme tem sido considerado como a principal estratégia de prevenção de cárie dental (Addy et al., 1992). Esta prevenção pode ser feita com base em várias abordagens: prevenir a formação do biofilme, desorganização do biofilme existente, prevenção de crescimento de futuros biofilmes, e diminuir a viabilidade dos microrganismos no biofilme (Sbordone e Bortolaia, 2003).

Desse modo, diversas substâncias têm sido utilizadas para o controle químico do biofilme bacteriano, como coadjuvante aos procedimentos mecânicos, entre elas estão os enxaguatórios contendo: fluoreto de sódio, clorexidina, cloreto de cetilpiridínio, triclosan, timol, entre outras (Monfrin e Ribeiro, 2000). Os enxaguatórios bucais podem ajudar a reduzir o biofilme deixado pelas falhas de escovação e pode auxiliar o controle mecânico desse biofilme, já que para a maioria dos indivíduos esse controle muitas vezes é inadequado (Mylesbust, 1995; Addy, 2003).

Enxaguatórios Bucais No controle químico do biofilme dental, através do uso de enxaguatórios bucais, um agente antimicrobiano deve inibir o estágio de adesão e colonização bacteriana, afetando o crescimento e atividade metabólica dos micro-organismos, sem, entretanto, interferir em qualquer outro processo biológico (Guimarães et al., 2006). Além disso, a associação dos efeitos cariostáticos do fluoreto a agentes antimicrobianos, tem sido sugerida para um efeito sinérgico (Katz, 1982; Leite et al., 2008). Há um intenso estudo sobre os agentes anticariogênicos (Park et al., 1998). Dentre essas substâncias, nenhum agente antimicrobiano tem recebido tanta atenção quanto à clorexidina. A clorexidina é uma bisguanida catiônica, disponível principalmente na forma de sais de digluconato. É a substância antimicrobiana mais comumente utilizada, devido a sua comprovada eficácia em alterar as funções de membrana, controlando o biofilme dental e inibindo o metabolismo de micro-organismos, uma vez que interfere na produção ácida do biofilme bacteriano (van Rijkom et al., 1996; Guimarães et al., 2008).

Esta substância representa o mais efetivo e bem documentado agente antimicrobiano (Lundstrõm et al., 1980; Brightman et al., 1991; Morrow et al., 1992; Emilson, 1994; Pratten et al., 1998), é o agente quimioterapêutico mais potente contra o Streptococcus mutans e a cárie dental e é o mais utilizado como controle positivo em avaliações do potencial antimicrobiano de outros agentes. Porém, possuí efeitos adversos como sabor desagradável, manchamento nos dentes, descamação da mucosa bucal (Scheie, 2003; Park et al., 2003; Chung et al., 2006; Lotufo et al., 2009), redução temporária na percepção de alguns sabores, vômitos e diarréia (Chung et al., 2006; Lotufo et al., 2009). O cloreto de cetilpiridínio é um composto monovalente, catiônico e pertence ao grupo dos compostos de amônio quaternário cujo efeito é semelhante ao da clorexidina, pois ambos alteram a estrutura da parede celular microbiana (Mendes et al., 1995). É mais efetivo contra Gram-positivos e fungos, provocando aumento da permeabilidade celular e rompimento da parede celular bacteriana, que favorece a lise e diminui o metabolismo celular e a habilidade da bactéria em se aderir à superfície dental (Pitten e Kramer, 2001). O triclosan é um fenol sintético, não iônico, de baixa toxicidade (Nabi et al., 1989; Mendes et al., 1995). Tem amplo espectro bacteriano, sendo eficaz contra Gram-positivos e Gram-negativos. Sua ação ocorre pela lise da membrana citoplasmática do micro-organismo (Lindhe et al., 1997). Pode ser encontrado associado ao copolímero gantrez 0,2 %, devido à baixa substantividade apresentada pelo antisséptico (Binney et al., 1996).

Os enxaguatórios comercialmente denominados Listerine® (Johnson & Johnson do Brasil) apresentam em sua composição, componentes de óleos essenciais, como timol, eucaliptol, mentol e salicilato de metila, além de álcool, com concentração variando entre 21,6 e 26,9%. Os compostos de óleos essenciais presentes na formulação agem lesando a parede celular bacteriana, inibindo os sistemas enzimáticos e diminuindo os lipopolissacarídeos e o conteúdo proteico da placa bacteriana. Este produto não tem carga, possui baixa substantividade e pode provocar sensação de queimação. Gosto amargo, manchas nos dentes e injúrias ao tecido bucal constituem seus efeitos adversos (Mendes et al., 1995).

Portanto, os enxaguatórios à base de produtos químicos, como a clorexidina, o cloreto de cetilpiridínio e o triclosan, são eficazes contra microorganismos periodontopatogênicos, mas podem alterar a microbiota bucal e apresentar efeitos adversos (Lotufo et al., 2009), como sabor desagradável, descamação da mucosa bucal (Scheie, 2003; Park et al., 2003, Chung et al., 2006; Lotufo et al., 2009), vômitos, diarréia e manchamento dos dentes (Chung et al., 2006; Lotufo et al., 2009).

Além disso, por razões sociais, razões de saúde e a possibilidade de aumentar o risco de desenvolvimento de câncer bucal, há uma demanda por enxaguatórios bucais livres de álcool (Smigel, 1991; Llewelyn, 1994; Carretero Peláez et al., 2004). Por outro lado, há outros efeitos relacionados à existência de álcool como ressecamento, mal-estar e ardência da mucosa bucal (Penugonda et al., 1994).

Além do álcool, outros agentes químicos que são utilizados para a diluição de substâncias que compõem os enxaguatórios bucais também apresentam problemas, entre eles o Dimetil Sulfóxido (DMSO), o Polissorbato (Tween 80) e o Propilenoglicol.

Como já é bem aceito, o DMSO é um agente tóxico para células (Karve et al., 2011; Kaltov et al., 2011), particularmente para células embrionárias humanas. Ele é um agente poderoso da diferenciação, que pode interagir com a estrutura da cromatina, é substancialmente mais tóxico que o Etilenoglicol, Propilenoglicol e Glicerol e de igual toxicidade que o Álcool Etílico (Etanol) e ao acetaldeido (Kaltov et al., 2011).

Com relação ao Tween 80, a presença dele nos meios de cultura para Streptococcus mutans foi associada com um aumento significante de três glicosiltransferases (Umesaki et al., 1977; Tomita et al. 1998), sendo que a quantidade de polissacarídeos insolúveis foi praticamente quintuplicada na presença de 0,1% de Tween e aumentou em proporção logarítmica na presença de Tween 80 a 1% (Umesaki et al., 1977). Concluíram que esse surfactante pode alterar o potencial cariogênico de Streptococcus mutans, mesmo em baixas concentrações (Tomita et al. 1998). >

Quanto ao Propilenoglicol, que é um álcool e um veículo popular para ser utilizado em cosméticos, sozinho, já possuí ação antibacteriana significativa (Thomas et ai., 1980), sendo que esse composto a 30% é capaz de matar diversos microrganismos, entre eles alguns estreptococos, cultivados em meio de cultura (Kinnunen e Kostela, 1991).

Uma vez que as plantas medicinais produzem uma variedade de substâncias com propriedades antimicrobianas, é esperado que programas de triagem possam descobrir compostos candidatos para o desenvolvimento de novos antibióticos (Ahmad e Beg, 2001). Quanto maior for a atividade antibacteriana de um extrato/composto maior será seu efeito inibitório na formação biofilme e no biofilme formado (Addy et al., 1992).

Os produtos naturais, ou fitoterápicos, vêm sendo exaustivamente estudados quanto aos seus efeitos antimicrobianos e resultados satisfatórios vêm sendo alcançados. Estudos têm demonstrado que alguns produtos naturais podem interferir na sobrevivência e nos fatores de virulência de Streptococcus mutans (Ahmad e Beg, 2001; Katsura et al., 2001; Bowen, 2002; Takarada et al., 2004; Alviano et al., 2005; Bakry e Douglas, 2005; Duarte et al., 2006; Smullen et al., 2007; Almeida, 2008; Sampaio et al., 2009).

Os fitoterápicos ricos em fenóis, chamados de polifenóis, apresentam um poderoso efeito antioxidante e uma marcada ação antimicrobiana contra o Streptococcus mutans (Park et al., 1998; Koo et al., 2000; Castaldo e Capasso, 2002; Koo, et al., 2002, Duarte et al., 2003; Naczk et al., 2004; Koo et al., 2005; Yatsuda et al., 2005; Duarte et al., 2006; Almeida et al., 2008; Murata et al., 2010). Por isso, é fundamental que a pesquisa com produtos naturais continue sendo realizadas (Rios e Recio, 2005).

Análises Microbiolóaicas Apesar de não existir um consenso sobre os níveis de inibição aceitáveis para compostos de plantas, quando comparados com antibióticos padrões, no entanto, Aligianis et al. (2001) propuseram uma classificação para materiais vegetais com base nos resultados de Concentração Inibitória Mínima, considerando como: forte inibição - CIM até 500 pg/mL; inibição moderada -CIM entre 600 e 1500 pg/mL e como fraca inibição - CIM acima de 1600 pg/mL.

Durante décadas o potencial dos antimicrobianos para o uso bucal i foi o alvo de testes clássicos de CIM e do CBM, que utilizam monocultura planctônica e com tempos de contato prolongado. No entanto, esses estudos não refletem a eficácia clínica desses enxaguatórios, uma vez que os microrganismos colonizam a cavidade bucal formando biofilmes e o modo de aplicação dos enxaguatórios é profilática e ou terapêutica. Dessa forma, a aplicação dos agentes antimicrobianos deve ser realizadas durante apenas 1 minuto, 2 vezes ao dia, simulando a aplicação clínica (Shapiro e Guggenheim, 1998, 1998 in Guggenheim et al., 2004).

Comparando com testes clínicos, as Concentrações Inibitórias Mínimas resultantes eram 100-1.000 vezes mais baixas que aquelas necessárias para atingir o biofilme (Shapiro e Guggenheim, 1998 in Guggenheim et al., 2004; Shapiro e Guggenheim, 2002). Esses testes permitiam somente comparações relativas e eram pouco preditivos com relação à previsão para a eficácia clínica de enxaguatórios anti-sépticos bucais. As razões óbvias para isso estão relacionadas ao uso dos enxaguatórios, que clinicamente são realizados brevemente durante os bochechos diários (3 min/dia) e a proliferação de microrganismos que sobreviveram no biofilme durante o restante do dia e da noite entre os bochechos (Shapiro e Guggenheim, 2002).

Além disso, alguns estudos que avaliam a Concentração Inibitória Mínima ou a Concentração Bactericida Mínima de substâncias antibacterianas contra Streptococcus mutans, frequentemente utilizam o meio de cultura BHI (Brain Heart Infusion) (Koo et al., 2000; Duarte et al., 2003; Razak e Rahim, 2003; Yatsuda et al., 2005; Silva et al., 2007; Sampaio et al., 2009) ou o TSB (Tryptic Soy Broth) (Koo et al., 2002; 2003).

Nesse sentido, a análise diferencial dos transcritos de Streptococcus mutans, desenvolvidos em diferentes meios de cultura, revelou mudanças significativas na expressão dos genes envolvidos, (Shemesh et al., 2007). Portanto, diferentes respostas podem ser alcançadas e os resultados não podem ser comparados, o que indica a necessidade de uma padronização de metodologia como a do CLSI, em que se utilizam meios de cultura padronizados, como é do caso do Müller Hinton (MH) com cátion ajustado, indicado pelo Documento M7-A6 (CLSI, 2003) para micro-organismos fastidiosos como o Streptococcus mutans.

Modelos in vitro utilizam simulações simples de situações in vivo para estudar a fisiologia e comportamento de biofilmes frente a diferentes condições (Sissons, 1997). Embora diversos estudos tenham contribuído para o entendimento de biofilmes dentais com relação à expressão gênica (Li e Burne, 2001; Shemesh et al., 2007), adaptação ácida (Li et al., 2001); e resistência antimicrobiana (Koo et al., 2003; 2006), estes estudos foram executados com protocolos de crescimento de biofilme mantendo uma exposição constante de carboidratos como fonte de nutrientes, o que não simula as verdadeiras alternâncias de episódios de “fartura e miséria” que acontecem na presença de açúcares. Além disso, estes modelos não utilizam substrato dental, o que impossibilita a avaliação de desmineralização dental provocada pelos biofilmes (Ccahuana-Vásquez e Cury, 2010). O modelo de biofilme formado in vitro, cujas respostas para o triclosan e a clorexidina imitou os resultados clínicos relatados para estes agentes antimicrobianos, utiliza o meio Fluid Universal Médium (FUM), que contém triptona, extrato de levedura e glicose, entre outros componentes, que pode ser modificado ou ajustado de acordo com as finalidades particulares de cada caso. Este modelo é especialmente útil para demonstrar mudanças na composição do biofilme, em resposta às variáveis ambientais, e para testar a eficácia de agentes sob circunstâncias de exposições repetidas em curto prazo (Guggenheim et al., 2001). Além disso, esse modelo de biofilme pode ser usado para se avaliar in vitro a desmineralização e a remineralização do esmalte bovino (Guggenheim et al., 2003). Já o modelo de formação de biofilme desenvolvido por Koo et al. (2003), que utilizou o meio Ultrafiltered Tryptone-Yeast Extract Broth (UTYEB), composto por caldo de carne e extrato de triptona-levedura e sacarose, ultrafiltrado, que foi utilizado em outros estudos (Koo et al. 2005; 2006; 2010;

Duarte et al., 2006) e modificado por Ccahuana-Vásquez e Cury, em 2010, foi desenvolvido para aprimorar a avaliação da desmineralização do esmalte e dentina dentais. No entanto, não existe na literatura uma padronização com relação ao meio de cultura utilizado, o que pode ser relevante quando da determinação da relação dose-efeito de antimicrobianos.

Estudos utilizando antimicrobianos contra a formação de biofilme de Streptococcus mutans vêm sendo realizados por diversos pesquisadores como Alviano et al., 2005; Song et al., 2006; Wei et al., 2006; Beckloff et al., 2007; Song et al., 2007; Xiao et al., 2006; Almeida et al., 2008, que procuram mecanismos capazes de inibir seus fatores de virulência. Para isso, diferentes metodologias e meios de cultura são utilizados, como o Fluid Universal Médium (FUM) (Guggenheim et al., 2001; 2003; 2004; Shapiro et al., 2002), ou o Ultrafiltered Tryptone-Yeast Extract Broth (UTYEB), (Koo et al., 2003; 2005; 2006; Duarte et al., 2006; 2008; Almeida et al., 2008; Murata et al., 2010).

No entanto, as quantidades e tipos de nutrientes são relevantes na composição do biofilme formado (Bowden, 1966), sendo que o conteúdo de nutrientes do meio de cultura é capaz de regular o desenvolvimento do biofilme em organismos, além de possibilitar modificações na espessura do biofilme (Gilmore et al., 2003; Shemesh et al., 2007).

Além disso, a análise dos óleos essenciais e extratos vegetais quanto à atividade antibacteriana tem sido dificultada por peculiaridades que os mesmos apresentam, principalmente a insolubilidade em água e a complexidade química (Nascimento et al., 2007). As dificuldades tornam os resultados disponíveis na literatura difíceis de comparar uma vez que os métodos utilizados diferem largamente e fatores importantes, que influenciam os resultados, são frequentemente negligenciados (Nascimento et al., 2000).

Portanto, para a realização de testes que visam verificar a atividade antimicrobiana de óleos essenciais e extratos vegetais, é fundamental definir e adotar uma metodologia adequada e bem padronizada. É essencial que se utilizem métodos de investigação in vitro que produzam resultados confiáveis, que possam ser reproduzidos e validados. Somente assim será possível a comparação com outros dados e a confirmação dos efeitos das substâncias de interesse. Por isso, no presente estudo foram utilizadas as normas propostas pelo Instituto de Normas Clínicas e Laboratoriais (CLSI), Documentos M2-A8 (2003) e M7-A6 (2003). Com relação à insolubilidade em água, característica dos óleos essenciais e extratos vegetais, no presente trabalho foi elaborada uma nanoemulsão. O meio de cultura Müller Hinton (MH) com cátion ajustado, indicado pelo Documento M7-A6 (CLSI, 2003), foi comparado ao Ultrafiltered Tryptone-Yeast Extract Broth (UTYEB), descrito por Koo et al., (2003), em estudos Piloto. Os resultados obtidos revelaram que o meio MH apresenta maior sensibilidade para detectar o efeito dose-resposta no biofilme de Streptococcus mutans que o UTYEB e os meios não diferem quanto à desmineralização do esmalte. Portanto, o meio de cultura Mueller Hinton com cátion ajustado (MH), indicado pelo CLSI M7-A6 (2003), parece ser eficiente para o estudo de antimicrobianos em biofilme e para a avaliação da desmineralização (Artigos Submetidos).

Nanoemulsões A nanotecnologia é uma importante tecnologia que possibilita ampliar o campo da ciência e da tecnologia aplicadas, cujo tema unificador do controle da matéria está em escala molecular (Durán et al., 2011). A nanotecnologia nos proporciona possibilidades de diminuição do tamanho de partículas, aumentando assim a área de superfície de contato, podendo facilitar sua penetração em tecidos biológicos (Jeong et al., 2001).

Vem sendo visto um aumento no interesse na aplicação das micro e nanoemulsões como sistemas de liberação de fármacos, uma vez que esses agregados apresentam-se como sistemas reservatórios e permitem a liberação sustentada de fármacos, a qual proporciona efeito prolongado (Jeong et al., 2001). As nanoemulsões, também conhecidas na literatura como miniemulsões ou emulsões submicrométricas, consistem em emulsões muito finas apresentando glóbulos com diâmetro na faixa de 100 a 500 nm (Fernandez et al, 2004; Pey et al., 2006) ou 50 a 300 nm (Tadros et al., 2004).

As nanoemulsões podem ser preparadas por métodos que envolvem alta ou baixa energia de emulsificação (Kabanov et al., 2005; Pey et al., 2006; Date et al., 2010). Nos métodos que utilizam baixa energia, utilizam-se as propriedades físico-químicas do sistema, como temperatura ou pH, por exemplo, ou a inversão espontânea na curvatura do tensoativo para a obtenção de glóbulos de tamanho reduzido (Tadros et al., 2004).

Com relação aos métodos que utilizam alta energia, esta pode ser obtida por meio de cisalhamento de alta tensão, homogeneizadores de alta pressão, microfluidizadores, ou ultrassom (Fernandez et al., 2004; Tadros et al., 2004; Date et al., 2010). A alta energia mecânica imposta ao sistema gera forças capazes de deformar e quebrar as gotículas da fase interna em glóbulos menores (Fernandez et al., 2004), sendo que estas técnicas permitem melhor controle da granulometria e ampla escolha dos constituintes (Sonneville-Aubrun et al., 2004; Date et al., 2010). A determinação do diâmetro médio dos glóbulos e índice de polidispersividade após a obtenção das emulsões nos permite verificar se estas estão dentro do intervalo de diâmetro requerido para os fins desejados. Entretanto, além do diâmetro dos glóbulos, é importante determinar o índice de polidispersividade, que varia entre 0,1 e 1,0, sendo que valores abaixo de 0,3 indicam uma baixa polidipersividade na distribuição de diâmetro dos glóbulos nas amostras, enquanto valores acima de 0,7 indicam sistemas com alta polidispersividade (Jeong et al., 2001; Kulmyrzaev e Schubert, 2003). O potencial Zeta (ζ) pode ser definido como o potencial de superfície das partículas, o qual é influenciado por mudanças na interface com o meio externo, decorrente da dissociação de grupos funcionais presentes na superfície ou da adsorção de espécies tônicas do meio de dispersão (Shaffazick et al., 2003). O potencial Zeta geralmente é determinado por medidas de mobilidade eletroforética que correspondem à velocidade das partículas em suspensão, quando submetidas a um campo elétrico.

Um elevado valor de potencial Zeta em módulo (> 30 mV) é importante para a estabilidade físico-química das emulsões formadas com surfactantes iônicos, uma vez que forças repulsivas tendem a evitar possíveis agregações da fase interna (Benita e Levy, 1993). Alterações neste valor são informações significativas sobre as condições da interface e dos glóbulos na emulsão (Gu e Li, 1998). No entanto, quando são utilizados surfactantes não iônicos, a estabilidade também é dada pela molécula anfifílica formada, ou seja, a estabilidade é estérica e não depende somente da carga ou do potencial Zeta formado (Kabanov et al., 2005; Batrakova e Kabanov, 2008). A estabilidade inerente das nanoemulsões está diretamente relacionada ao processo de preparo. O tensoativo (surfactante) pode ser puro, mistura, ou combinação com outros componentes (co-tensoativos ou co-surfactantes), cuja principal função é a redução da tensão interfacial (D’Cruz, Uckun, 2001), ou solubilizantes, entre eles o propilenoglicol, o polietilenoglicol e o etanol (Date et al., 2010). Quando se emprega tensoativos não-iônicos e/ou polímeros, ocorre uma estabilização estérica, sendo que o movimento browniano dos diminutos glóbulos faz com que a atuação da força da gravidade diminua (Fernandez et al., 2004; Tadros et al., 2004). O Pluronic® F68 é utilizado como sistema de solubilização e estabilização de fármacos; formulações farmacêuticas; como sistema de liberação controlada de fármacos; e como agente seletivo e específico de sistema de liberação programada em locais previamente determinados (Adams et al., 2003). Trata-se de um bloco polimérico não-iônico, é aprovado pela FDA, formados por porções hidrofóbicas de óxido de polietileno (PEO) e porções hidrofílicas de óxido do propileno (PPO), arranjados em uma estrutura básica PEO-PPO-PEO. Este arranjo resulta em uma molécula anfifílica, sendo que variando o número de unidades de PEO e de PPO, pode-se variar o tamanho e o balanço hidrófilo-lipófilo da molécula (Kabanov et al., 2005; Batrakova e Kabanov, 2008).

Os blocos copolímeros de Pluronic® são alistados nos EUA e na Farmacopéia Britânica sob o nome de Poloxamero, são amplamente utilizados em uma variedade de aplicações farmacêuticas, como na formulação de géis, de emulsões, e de nanopartículas (Anderson et al., 2001; Kabanov e Alakhov, i 2002). Além disso, vêm demonstrando significativa contribuição para o aumento da biodisponibilidade/atividade de fármacos antibacterianos e antifúngicos, aumentando a ação destes compostos frente a vários microorganismos (Adams et al., 2003; Croy e Kwon, 2004; Ma et al., 2008).

Breve Descrição A presente invenção trata-se de uma nanoemulsão que compreende como principal componente extrato vegetal ou óleo essencial de Lychnophora pinaster e seu uso como composição odontológica. A nanoemulsão compreende extrato vegetal de Lychnophora pinaster, água e diluente ou surfactante e/ou adjuvante. O extrato é etanólico com teor de fenóis totais de 0,072±0,001 mg EAG por grama de extrato vegetal e atividade antioxidante IC50 DPPH de 0,76±0,13 mg/mL. O diluente ou surfactante pode ser Dimetilsulfoxido (DMSO), Etanol, Polissorbato, Polietilenoglicol (PEG), Propiplenoglicol e Pluronic® ou a combinação entre eles. O adjuvante pode ser ácido clorídrico, ácido acético, ácido lático, hidróxido de sódio, tampão fosfato, bicarbonato, entre outros, sendo que a concentração de diluente ou surfactante e/ou adjuvante pode estar entre 5 e 20%. Os glóbulos da nanoemulsão possuem 226,8±1,27 nm de tamanho, índice de polidispersividade de 0,547±0,02 e potencial Zeta de -46,55±5,59 mV.

Apresenta efeito antimicrobiano contra micro-organismos presentes na cavidade bucal, especialmente contra Streptococcus mutans com CIM entre 25 e 50 pg/mL e CBM de 50 e 100 pg/mL. Possui aplicação odontológica, mais especificamente atua sobre o biofilme dental e previne a cárie dental em pacientes com ou sem aparelho ortodôntico. Além disso, a Lychnophora pinaster apresenta atividade analgésica, anti-inflamatória, antiedematogênica, antinociceptiva, antitumoral, cicatrizante, entre outras, o que a torna ainda mais efetiva para uso como enxaguatório bucal. O extrato vegetal poder ser substituído por óleo essencial de Lychnophora pinaster. Nesse caso, nanoemulsão apresenta atividade antimicrobiana contra micro-organismos presentes na cavidade bucal, especialmente contra Streptococcus mutans com CIM entre 100 e 200 pg/mL e CBM entre 200 e 400 pg/mL.

Descrição Detalhada A presente invenção trata-se de uma nanoemulsão que compreende como principal componente extrato vegetal de Lychnophora pinaster e seu uso como composição odontológica. A nanoemulsão de Lychnophora pinaster compreende os seguintes componentes: - extrato vegetal de Lychnophora pinaster, - água e - diluente ou surfactante. A principal aplicação da nanoemulsão é a atuação sobre o biofilme dental e a prevenção da cárie em pacientes com ou sem aparelho ortodôntico. O estudo científico de Lychnophora pinaster obteve autorização para atividades com finalidade científica pelo Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade - SISBIO, sob protocolo n° 22772-1.

Após a coleta do material vegetal de Lycnhophora pinaster Mart, no f município de Lavras - MG, as folhas de cada indivíduo foram manualmente separadas dos caules e das inflorescências, acondicionadas em sacos de papel devidamente identificados e colocadas para secagem em estufa de circulação forçada de ar, em temperatura controlada a 40°C, realizando-se pesagens diárias subsequentes, até que se obtivesse massa constante. Após a secagem, foi realizada a moagem do material vegetal em moinho tipo Willey. O extrato etanólico foi obtido a partir de porções de 10 g das folhas secas e moídas que foram transferidas para frascos de vidro com fechamento hermético onde foram adicionados 100 mL de álcool etílico absoluto à temperatura ambiente. A mistura foi mantida sob agitação, protegida de luz, em orbital shaker a 37° C a 1200 rpm durante 2 horas. Após este período, a solução foi filtrada com auxílio de papel filtro e o solvente eliminado em evaporador rotativo a 60° C para obtenção do extrato vegetal seco. Os frascos com o extrato vegetal foram colocados em dessecador e o peso foi monitorado até que permanecesse constante. O teor de fenóis totais foi avaliado pelo método de Folin Ciocauteau, de acordo com Waterman e Mole, 1994 e Rudnicki et al., 2007 e a avaliação da atividade antioxidante foi baseada na metodologia descrita por Duarte-Almeida et al. (2006). O teor de fenóis totais foi expresso como mg de EAG (equivalentes de ácido gálico) por grama de extrato vegetal, mediante a construção de curva de calibração do padrão comercial ácido gálico (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA). A concentração inibitória mínima ICso, (quantidade de antioxidante necessária para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50%), foi determinada a partir da curva exponencial de primeira ordem, obtida plotando-se na abscissa as concentrações da amostra (mg/ml_) e na ordenada o percentual de inibição do DPPH. A eficiência do potencial antioxidante do extrato vegetal foi comparada aos padrões quercetina e rutina. O rendimento do extrato etanólico de Lychnophora pinaster obtido foi de 10,96±0,84% em relação à massa seca das folhas. O teor de fenóis totais foi de 0,072±0,001 mg de EAG (equivalentes de ácido gálico) por grama de extrato vegetal. Quanto ao Potencial Antioxidante, foi verificado que é necessária uma concentração de 0,76±0,13 mg/ml de amostra para uma inibição de 50% do DPPH, ou seja, IC50 DPPH = 0,76+0,13 mg/mL.

Para a formulação da nanoemulsão, objeto da presente invenção, 0 extrato etanólico de Lychnophora pinaster, diluído com o surfactante Pluronic® F68 (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) a 10%, foi aquecido em banho maria a 55 ± 5°C durante 10 minutos, sendo que após 5 e 10 minutos foi realizada agitação mecânica em Sistema Vortex. A seguir, em temperatura ambiente controlada (25°C), foi submetido à sonicação utilizando um aparelho Branson Sonifier 450 (Branson Ultrasomics Co., Danbury, CT, USA) por 3 minutos a 20 W, com agitações mecânicas em Sistema Vortex a cada minuto. Ao final, a nanoemulsão obtida foi filtrada à vácuo com auxílio de papel filtro. A nanoemulsão de Lychnophora pinaster foi analisada quanto ao pH, diâmetro médio dos glóbulos, índice de polidispersividade e potencial Zeta. A determinação do pH foi realizada diretamente na nanoemulsão, em pHmêtro previamente calibrado. A nanoemulsão apresentou um pH de s 5,5, sendo que o mesmo foi ajustado com NaOH para um valor de = 7,0, para que não interferisse com o processo de desmineralização/remineralização dental, tendo em vista os valores críticos do esmalte. A determinação do diâmetro médio e índice de polidispersividade foram mensurados através do Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) e o potencial Zeta das formulações foi obtido através de eletroforese, utilizando o ZetaSizer Nano-ZS (Malvern Instruments Ltd.,Worcestershire, U.K.).

Os resultados estão expressos pelas médias das duplicatas da amostra, seguidas pelo desvio padrão. O tamanho dos glóbulos formados na nanoemulsão é de 226,8±1,27 nm com um índice de polidispersividade de 0,547±0,02 e um potencial Zeta de -46,55±5,59 mV. O extrato vegetal poder ser substituído por óleo essencial de Lychnophora pinaster. Nesse caso, o óleo essencial foi obtido por hidrodestilação em sistema tipo Clevenger e para se avaliar a presença e quantidade de fenóis foi realizada análise da composição química em cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massas (GC-MS) e a avaliação da atividade antioxidante foi baseada na metodologia descrita por Duarte-Almeida et al. (2006), utilizando-se o eugenol como padrão.

Utilizando o óleo essencial a nanoemulsão apresenta atividade antimicrobiana contra micro-organismos presentes na cavidade bucal, especialmente contra Streptococcus mutans com CIM entre 100 e 200 pg/mL e CBM entre 200 e 400 pg/mL.

Experimento 1: Efeito antibacteriano do óleo essencial e do extrato etanólico de Lychnophora pinaster sobre células planctônicas de Streptococcus mutans UA159 ATCC700610 Foi avaliado o efeito antibacteriano do óleo essencial e do extrato etanólico de Lychnophora pinaster solubilizado com diluentes ou surfactantes, descritos nos Documentos do CLSI ou em artigos da literatura nacional e internacional, entre eles: Dimetilsulfoxido (DMSO), Etanol, Polissorbato 80 (Tween 80), Polietilenoglicol (PEG), Propiplenoglicol e Pluronic® F68 e adjuvantes: ácido clorídrico, ácido acético, ácido lático, hidróxido de sódio, tampão fosfato e bicarbònato, sobre células planctônicas de Streptococcus mutans UA159 ATCC700610.

Inicialmente, foram realizados testes utilizando os diversos diluentes ou surfactantes e/ou adjuvantes, sozinhos ou em combinação, variando suas concentrações (5 a 20%), a potência (10 a 30 W) e os tempos utilizados no ultrassom (1 a 10 minutos), sendo ele um Banho Ultrassônico - Banho USC-1400 (Unique, Indaiatuba, SP, Brasil) ou Ultrassom tipo Sonicador - Branson Sonifier 450 (Branson Ultrasomics Co., Danbury, CT, USA). A seguir, foram realizados Testes de Disco Difusão (DD) (CLSI M2-A8, 2003), Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) (CLSI M7-A6, 2003).

Os testes por disco de difusão para Streptococcus mutans UA159 ATCC700610 foram realizados de acordo com as normas do Documento CLSI M2-A8 (2003), em duplicata. As amostras em análise foram: o óleo essencial e o extrato etanólico (100.000 pg/mL ou 10%); o digluconato de clorexidina (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) (1.200 pg/mL ou 0,12%) (controle positivo); e o surfactante ou diluente ou o adjuvante (200.000 pg/mL ou 20%).

Estes testes serviram como triagem para avaliação da presença de atividade antibacteriana das substâncias avaliadas para Streptococcus mutans UA159 ATCC700610, sendo que aquelas que apresentaram halo inibitório significativo seguiram para as análises de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM). A determinação da CIM das amostras em análise: o extrato etanólico (6.400 - 12,5 pg/mL), o digluconato de clorexidina (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) (16,0 - 0,03 pg/mL) (controle positivo) e o surfactante ou diluente ou adjuvante (200.000 - 390,5 pg/mL), frente ao Streptococcus mutans UA159 ATCC700610 foi realizada pela técnica de microdiluição em caldo, de acordo com o Documento CLSI M7-A6 (2003). Os testes foram realizados em duplicata e, devido à dificuldade de leitura da CIM, em uma das duplicatas foi adicionado corante Resazurina (ou Alamar Blue) 0,01% antes da incubação.

Após o período de incubação indicado pelo CLSI M7-A6 (2003), foi realizada a interpretação dos resultados, comparando-se o crescimento de cada poço com os do controle negativo e positivo, observando a mudança de coloração da Resazurina (Pettit et ai, 2009; Kucharzyk et ai, 2010).

Para determinação da CBM do Streptococcus mutans UA159 ATCC700610, de todos os poços das placas de microdiluição onde não houve crescimento microbiano visível, retirou-se uma alíquota e esta foi semeada em placas de ágar Müller Hinton. Após incubação por 18-24 horas em estufa de ÇO2 a 35°C, tomando-se como base o crescimento do controle positivo, foi realizada a leitura do teste determinando a CBM (a menor concentração da substância que não permitiu o crescimento do micro-organismo) (CLSI M7-A6, 2003). Os testes foram realizados em duplicata.

Os melhores resultados obtidos nos testes de Disco Difusão (DD), Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) para 0 óleo essencial e o extrato etanólico de Lycnhophora pinaster foram quando os mesmos foram solubilizados com Pluronic® F68. O óleo essencial e 0 extrato etanólico de Lycnhophora pinaster, que foram avaliados a 100.000 pg/mL, apresentaram halo inibitório de 20 mm, similar ao da clorexidina a 0,12% (ou 1.200 pg/mL) (controle positivo), sendo que essas concentrações foram as de escolha porque seriam as concentrações máximas a serem aplicadas no biofilme de Streptococcus mutans UA159 ATCC700610. Quanto a CIM/CBM, os resultados para o óleo essencial se apresentaram entre 100 e 200 pg/mL e 200 e 400 pg/mL respectivamente e para o extrato etanólico entre 25 e 50 pg/mL e 50 e 100 pg/mL, respectivamente.

De acordo com a classificação para materiais vegetais, esses resultados indicam uma forte inibição. A CIM/CBM encontrada para a clorexidina esteve entre 1 e 2 pg/mL, respectivamente e para o Pluronic® F68, que não apresentou halo inibitório, a CIM/CBM foi > 200.000 pg/mL. Experimento 2: Efeito dose-resposta do extrato etanólico de Lvcnhonhora pinaster sobre o biofilme de Streptococcus mutans Foi testado o efeito dose-resposta do extrato etanólico de Lycnhophora pinaster solubilizado com: Dimetilsulfoxido (DMSO), Etanol, Polissorbato 80 (Tween 80), Polietilenoglicol (PEG), Propiplenoglicol e Pluronic® F68, no biofilme de Streptococcus mutans UA159 ATCC700610 formado sobre lâminas de vidro para microscópio (Corning® Incorporated, New York, USA), de acordo com o método proposto por Koo et al. (2003), utilizando o meio Müller Hinton com cátion ajustado (MH), indicado pelo CLSI M7-A6 (2003), suplementado com sacarose a 1%.

As amostras do extrato etanólico de Lychnophora pinaster diluídas com os diluentes ou surfactante a 10% foram aquecidas em banho maria a 55 ± 5°C durante 10 minutos, sendo que após 5 e 10 minutos foi realizada agitação mecânica em Sistema Vortex. A seguir, em temperatura ambiente controlada (25°C), as amostras foram submetidas à sonicação utilizando um aparelho Branson Sonifier 450 (Branson Ultrasomics Co., Danbury, CT, USA) por 3 minutos a 20 W, com agitações mecânicas em Sistema Vortex a cada minuto e ao final, foram filtradas à vácuo com auxílio de papel filtro. O diâmetro médio dos glóbulos e o índice de polidispersividade foram determinados através do Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) e o potencial Zeta das formulações foi obtido através de eletroforese, utilizando o ZetaSizer Nano-ZS (Malvern Instruments Ltd.,Worcestershire, U.K.), sendo que foi observada a formação de nanoemulsões, com diferentes características físico-químicas, para cada um dos diluentes ou surfactantes.

Para cada surfactante ou diluente, foram avaliados 6 grupos (n=4), sendo um controle negativo de 120 horas (NaCI 0,9%), um controle do diluente e 4 (extrato etanólico de Lycnhophora pinaster na CIM, CIM x 10, CIM x 100 e CIM x 1000) .Foram utilizados lâminas de vidro de 10 x 5 x 1 mm, mantidas verticalmente em placas de cultura celular de 24 poços a 37°C em estufa de C02. Após 48 horas os grupos experimentais foram tratados por 1 minuto 2x/dia com os respectivos tratamentos. Os meios foram trocados diariamente, sendo o pH determinado (indicador da acidogenicidade do biofilme).

Completadas 120 horas, os biofilmes foram coletados e foi determinado o peso seco e os micro-organismos viáveis (UFC) (Koo et al., 2002). O efeito dose-resposta pode ser melhor observado quando utilizados os diluentes DMSO, Tween 80, Etanol e Pluronic® F68, todos a 10%.

Observou-se que, nos grupos controle utilizando os diluentes DMSO, Etanol e Propilenoglicol, houve diminuição na relação UFC/peso seco de biofilme em relação ao grupo controle negativo 120 horas e utilizando o Tween 80 o efeito antibacteriano foi prejudicado.

Utilizando o Propilenoglicol ou o PEG, não pôde ser observado efeito dose-resposta com relação às diferentes concentrações de extrato etanólico de Lycnhophora pinaster. Com relação ao Pluronic® F68, observou-se efeito dose-resposta, sem, no entanto, o surfactante, quando utilizado como controle, apresentar atividade sobre o biofilme.

Experimento 3: Efeito dose-resposta da nanoemulsão do extrato etanólico de Lvchnophora pinaster sobre células planctônicas e biofilme de Streotococcus mutans e sobre a desmineralizacão do esmalte dental.

Foi avaliado o efeito dose-resposta da nanoemulsão do extrato etanólico de Lychnophora pinaster sobre células planctônicas e biofilme de Streptococcus mutans UA159 ATCC700610 e sobre a desmineralização do esmalte dental ao redor de braquetes ortodônticos. Além disso, foi avaliada a associação do íon flúor (F"), contido em um dos materiais de colagem de braquetes com a nanoemulsão, assim como a interferência da mesma sobre a força de adesão dos materiais.

Com as células planctônicas foram realizados testes de disco difusão (DD), Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM). A formação do biofilme sobre blocos de esmalte dental bovino, tendo braquetes colados, foi induzida de acordo com o método de Koo et al., 2003, modificado por Ccahuana-Vásquez e Cury, 2010 e utilizando-se meio Müller Hinton cátion ajustado (CLSI M7-A6), com 0.1 mM de glicose, trocado a cada 12 h, com exposição 8x/dia a sacarose 10%.

Os blocos de 9 x 9 x 5 mm foram divididos em experimentos de acordo com o material de colagem, Transbond XT ((3M Unitek, Monrovia, CA, USA) ou Fuji Ortho LC (GC América Inc, Alsip, IL, USA). Após a colagem dos braquetes Synergy® (Rocky Mountain Orthodontics Inc., Denver, Colorado, USA), o próximo passo foi isolar com verniz ácido resistente as superfícies de dentina e uma janela de esmalte, que serviu como controle.

Para cada material foram avaliados 6 grupos (n=4); 2 controles negativos (48 e 120 horas), 3 experimentais (nanoemulsão na CIM; CIM x 100; CIM x 1000) e 1 controle positivo (clorexidina - CHX 0,12%), sendo que os experimentos foram realizados em duplicata. Os blocos foram mantidos verticalmente em placas de cultura celular de 24 poços a 37°C em estufa de C02. Após 48 horas, os biofilmes foram tratados 2x/dia com NaCI 0,9% (controle negativo 120 horas), nanoemulsão (experimentais), ou CHX 0,12% (controle positivo).

Os meios foram trocados a cada 12 horas, o pH mensurado a cada troca e os biofilmes coletados após 120 horas. Com os biofilmes foram determinados peso seco, micro-organismos viáveis (UFC) (Koo et al., 2002) e concentração de F' pela técnica de microdifusão facilitada por hexametildisilazano (HMDS) (Taves, 1968; Lima e Cury, 2001). O fluoreto presente na amostra foi analisado com eletrodo específico (Orion Research Inc., Mod. 96-09; Boston, MA) acoplado a um analisador de íons (Orion Research Inc., Mod. EA 940; Boston, MA).

Os blocos foram submetidos ao teste de cisalhamento, em uma máquina Instron USA modelo 4411 (Instron Corporation, Canton, USA), com velocidade de 0,5 mm/min até a remoção dos braquetes (Fox et al., 1994; ISO TR 11405, 1994). Os valores de resistência ao cisalhamento foram registrados em kgf e foram transformados em kgf/cm2, através da fórmula: R = F/A, onde: R = resistência ao cisalhamento; F = carga necessária para o rompimento da união braquete-dente; e, A = área da base do braquete (9 mm2). Os valores de resistência ao cisalhamento em kgf/cm2 foram ainda transformados em MPa. A desmineralização do esmalte dental foi determinada em secção transversal (ΔΖ), nas posições 0, 100 e 500 pm de distância do braquete. Para cada um desses 3 pontos foram avaliados 7 pontos no sentido longitudinal, nas profundidades de 20, 40, 60, 80, 100, 120 e 140 pm, iniciando pela superfície externa do esmalte. As impressões foram realizadas por meio de um Microdurometro (Future Tech FM ARS 900, Futre Tech Corp. Tokyo, Japan) e para o cálculo da perda mineral, os valores de dureza Knoop obtidos em cada profundidade foram transformados em porcentagem de volume mineral (%vol) pela fórmula proposta por Fearthestone et al. (1983).

Os resultados demonstraram que o halo inibitório da nanoemulsão foi similar ao da CHX 0,12% (20 mm) e a CIM/CBM se apresentaram entre 25 e 50, pg/mL e entre 50 e 100 pg/mL respectivamente, o que indica uma forte inibição ao Streptococcus mutans UA159 ATCC700610. No biofilme formado, utilizando ambos os materiais de colagem, a nanoemulsão 1000 x CIM foi similar a CHX 0,12% na diminuição da UFC/peso seco.

Quanto à desmineralização do esmalte dental, utilizando Transbond XT, a nanoemulsão 100 ou 1000 x CIM foi similar a CHX 0,12% e utilizando Fuji Ortho LC, a nanoemulsão a partir da CIM foi similar a CHX 0,12%. Para todos os grupos, a distância 0 pm apresentou maior desmineralização que as distâncias 100 e 500 pm. A média de resistência ao cisalhamento do experimento com Transbond XT foi superior a do experimento com Fuji Ortho LC, porém não houve diferença entre os grupos em nenhum dos experimentos.

Os resultados demonstram que a nanoemulsão do extrato etanólico de Lychnophora pinaster foi efetiva contra células planctônicas e biofilme de Streptocoçcus mutans UA159 ATCC700610 e sobre a desmineralização do esmalte dental ao redor de braquetes ortodônticos, sem interferir na força de adesão dos braquetes, sendo que associada ao F' do Fuji Ortho LC, o efeito de inibição da desmineralização foi potencializado.

Portanto, a nanoemulsão' do extrato etanólico de Lychnophora pinaster apresenta propriedades antimicrobianas contra micro-organismos presentes na cavidade bucal, especialmente contra Streptococcus mutans, um dos principais agentes etiológicos da cárie e marcada ação sobre o biofilme formado por essa espécie. Além disso, a Lychnophora pinaster apresenta atividade analgésica, anti-inflamatória, antiedematogênica, antinociceptiva, antitumoral, cicatrizante, entre outras, tornando-a ainda mais efetiva como enxaguatório bucal. O extrato etanólico poder ser substituído por óleo essencial de Lychnophora pinaster e o uso odontológico da nanoemulsão de Lychnophora pinaster não fica limitada a pacientes que fazem uso de aparelho ortodôntico fixo. Ela pode ser utilizada por pacientes que não fazem uso de nenhum aparelho ortodôntico e também por aqueles que utilizam aparelhos ortodônticos removíveis.

REIVINDICAÇÕES

Claims (5)

1. Nanoemulsão caracterizada por compreender os seguintes componentes: - extrato etanólico de Lychnophora pinaster compreender teor de fenóis totais de 0,072 ±0,001 mg de EAG (equivalentes de ácido gálico) por grama de extrato e atividade antioxidante ICso DPPH de 0,76±0,13 mg/mL; - água e - 5 a 20% de concentração de diluente ou surfactante poder ser selecionado do grupo Dimetilsulfoxido (DMSO), Etanol, Polissorbato, Polietilenoglicol (PEG), Propiplenoglicol e Poloxamero, ou a combinação entre eles; e/ou adjuvante poder ser selecionado do grupo ácido clorídrico, ácido acético, ácido lático, hidróxido de sódio, tampão fosfato e bicarbonato.

2. Nanoemulsão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo extrato etanólico poder ser substituído por óleo essencial de Lychnophora pinaster

3. Nanoemulsão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender glóbulos formados com 226,8±1,27 nm de tamanho, índice de polidispersividade de 0,547±0,02 e potencial Zeta de -46,55±5,59 mV.

4. Nanoemulsão, de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de apresentar efeito antimicrobiano contra Streptococcus mutans presentes na cavidade bucal.

5. Uso da nanoemulsão descrita nas reivindicações de 1 a 4, caracterizado por ter aplicação odontológica e atuar sobre o biofilme dental e prevenir a cárie em pacientes com ou sem aparelho ortodôntico.