BG98862A

BG98862A - Многослойни мембрани за направлявана регенерацияна тъкани

Info

Publication number: BG98862A
Application number: BG98862A
Authority: BG
Inventors: Franco Dorigatti; Lanfranco Callegaro; Aurelio Romeo
Original assignee: M.U.R.S.T. Italian Ministry For Universities Andscientific And Technological Research
Priority date: 1991-12-18
Filing date: 1994-06-17
Publication date: 1995-05-31
Also published as: IT1254170B; HU9401838D0; JPH07502431A; EP0625056A1; ES2141145T3; NO942329D0; EP0625056B1; RO111200B1; ATE185699T1; HUT68706A; NZ246576A; AU3346793A; DE69230182T2; NO308724B1; CA2126087C; DK0625056T3; ITPD910228A1; AU669148B2; JP3277212B2; WO1993011805A1

Abstract

Описани са биоматериали, съставени от биоразграждащи се, биосъвместими и биоабсорбиращи се многослойни мембрани за приложение в хирургията. Многослойните мембрани са съставени от текстилни влакна, включени в свързващо вещество. Както свързващото вещество, така и влакната могат да бъдат от естери нахиалуроновата киселина, използвани поотделно или в комбинация, или естери на хиалуроновата киселинав комбинация с естери на алгиновата киселина или други полимери. </P>

Description

МНОГОСЛОЙНИ МЕМБРАНИ ЗА НАПРАВЛЯВАНА РЕГЕНЕРАЦИЯ НА ТЪКАНИ

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Представеното изобретение се отнася до многослойни мембрани за направлявана регенерация на тъкани. То се отнася до нов биоматериал, наречен многослойна мембрана, получен от производни на хиалуроновата киселина, до методите за производство и до приложението на тези многослойни мембрани в хирургията за направлявана регенерация на тъкани при обработката на повърхностни и вътрешни поражения.

Хиалуроновата киселина е естествен хетерополизахарид, съставен от редуващи се остатъци от D-глюкоронова киселина и М-ацетил-О-глюкозамин. Тя е линеен полимер с молекулно тегло между 50 000 и 13 000 000 в зависимост от източника, от който е получена и използуваните методи за получаване и

-2определяне. В природата се намира в перицелуларни гелове, в основната субстанция на съединителните тъкани при гръбначните организми, където тя е един от основните компоненти, в синовиалната течност на ставите в стъкловидното тяло на окото, в тъканта на пъпната връв и в гребена на петела.

ПРЕДШЕСТВУВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Известни са специфични фракции от хиалуроновата киселина с определени молекулни тегла, които не притежават възпалително действие и които, следователно, могат да бъдат използувани за стимулиране зарастването на рани, да заместят ендобулбарни течности или които могат да се използуват в терапията при патология на ставите чрез вътрешноставни инжекции, както е описано в Европейска патентна заявка No. 0 138 572, разрешена на заявителите на 25.07.1990.

Известни са също така естери на хиалуроновата киселина, в които всички или някои от карбоксилните групи на киселината са естерифицирани, както и приложението им във фармацевтичната и козметична промишленост и в областта на биоразграждащите се пластмаси, както е описано в патентни на САЩ 4,851,521; 4,965,353 и 5,147,861 и в Европейско патентно приложение 0 251 905 А2, публикувано на 07.01.1988 г.

Известно е, че хиалуроновата киселина играе съществена роля в процесите на възстановяване на тъканите, специално в първите стадии на гранулацията, чрез стабилизиране коагулационната мрежа и контролиране нейното разграждане, благоприятствувайки възстановяването на противовъзпалителните клетки, като полиморфонуклеарните левкоцити и моноцити на мезенхимните клетки, каквито са фибробластите и ендотелните клетки и ориентиране на последващата миграция на епителните клетки.

Известно е, че използуването на разтвори на хиалуроновата киселина може да ускори оздравяването при пациенти, засегнати от рани от залежаване, протриване и изгаряния.

Описана е ролята на хиалуроновата киселина в различните фази, които съставляват процесите на възстановяване на тъканите, чрез конструирането

-3на теоретичен модел от Weigel Р.Н. et al.: A model for the role of hyaluronic acid and fibrin In the early events during the inflammatory response and wound healing, J. Theor. Biol., 119:219,1986.

Изследванията, насочени към получаването на продукти за прилагане върху кожата, съставени от естери на хиалуроновата киселина, като такива или в смеси с други полимери, са довели до създаването на различните типове продукти. Между тях са тъканите, като например марли с различна дебелина (брой нишки на сантиметър), с различни размери и с нишки с различно дение (теглото за 9000 метра нишка).

Предложени са филми с най-разнообразни дебелини, както е описано в патентите на САЩ 4,851,521 и 4,965,353.

Едно от ограниченията в употребата на изработените продукти, съставени от естери на хиалуроновата киселина или от смеси на същите с други полимери, е тяхната ниска механична устойчивост, която може да предизвика сериозни проблеми при употребата им. В случая на биоматериали, като мембрани или други типове филмообразуващи продукти, които трябва да бъдат зашити на място, хирургичните игли или конци могат да доведат до появата на пукнатини, срезове или разкъсвания, които рискуват структурната херметичност на мембраната и в резултат на това - стабилността на мебраната на мястото й на прилагане, като по този начин раната остава отворена за замърсявания и нежелани последици.

Съвременната хирургия сега се стреми да използува, там където е възможно, биоматериали с висока биосъвместимост, като тези, получени от естерите на хиалуроновата киселина, характеризиращи се също така и с висока биоразграждаща се и биоабсорбираща способност.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Целите на представеното изобретение включват методи за получаване, охарактеризирано и приложението на многослойни, биосъвместими и биоабсорбиращи се мембрани, включващи естери на хиалуроновата киселина, поотделно или в смеси. В сравнение с други мембрани, получени от същите

-4естери на хиалуроновата киселина, тези многослойни мембрани притежават по-добри качества по отношение на механичната устойчивост на опън и физичното и механично разкъсване, дори когато са използувани хирургични шивове или други средства за свързване, нормално приложими в хирургичната практика за прилагане на биоматериали във или на повърхността на човешкото тяло. Освен този нови механични свойства, тези многослойни мембрани са също така високо биосъвместими и биоразграждащи се.

Многослойните мембрани от представеното изобретение могат да включват естери на хиалуроновата киселина, използувани поотделно или в комбинация, естери на алгиновата киселина, използувани също така отделно или в смеси, както и смесени мембрани, включващи комбинация от естери на хиалуроновата и алгиновата киселина или такива естери в комбинация с други полимери.

Друга област на приложение на представеното изобретение ще стане ясна от подробното описание и приложените чертежи, дадени по-долу. Обаче, трябва да се разбира, че подробното описание и посочените примери, представляващи предпочетени изпълнения на изобретението, са дадени само илюстративно, защото различни видоизменения и модификации в духа и обсега на изобретението ще бъдат забелязани от специалистите от това подробно описание.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТЕЖИТЕ

Горната и други цели, особености и предимства на представеното изобретение ще бъдат разбрани по-добре от следващите подробни описания, направени във връзка с придружаващите чертежи, като всичките са дадени само с цел илюстриране, а не ограничаване на представеното изобретение, на които:

фиг. 1 е схематична диаграма, илюстрираща етапите, включени в производството на многослойните мембрани от представеното изобретение.

фиг. 2 показва мрежата HYAFF 7, която е получена съгласно метода, описан в Пример 27.

-5Фиг. 3 показва мрежата HYAFF 7, показана на фиг.21 след нанасяне на полимерното свързващо вещество HYAFF11, както е описано в Пример 27.

Следващото подробно описание на изобретението е дадено, за да помогне на специалистите в тази област да изпълнят практически изобретението. Дори и така, даденото по-долу описание не трябва да се схваща като пределна граница на изобретението, тъй като могат да се извършат модификации и вариации в разгледаните изпълнения от всички, които са специалисти в областта, без да се излиза от духа и обсега на действие на представеното откритие.

Съдържанията на всеки един от цитираните литературни източници в представеното изобретение са включени в тяхната цялост.

Гореспоменатите цели са постигнати чрез създаването на многослойни мембрани, съгласно представеното изобретение, имащи основно тегло между около 8 г/см² и около 50 г/см², с дебелина в сухо състояние между около 0,08 мм и около 0,5 мм, минимална якост на опън при разкъсване в сухо състояние от около 100 кг/см² до около 1000 кг/см², удължение в сухо състояние между около 3% и 12%, минимална якост на опън при разкъсване в мокро състояние между около 30 кг/см² и около 450 кг/см² и удължение в мокро състояние между около 20% и около 60%, якост на скъсване в мокро състояние от около 40 кг/см² до около 200 кг/см² и в мокро - от около 20 кг/см² до около 160 кг/см².

Многослойната мембрана от представеното изобретение е многослойна структура, включваща полимерно свързващо вещество в което е включена подсилваща (армираща) мрежа от същия или от различен материал, от който е изградена мрежата. Армиращата мрежа, която предпазва от разпространяването на пукнатини или разкъсване, причинени от хирургически игли или шевове, включва многовлакнеста, а възможно и усукана нишка (кабел), получена чрез екструзия на сухо или мокро, изтъкана в трикотажна тъкан с деление (екартеман) между около 10 и около 16.

-6Многовлакнестият кабел е съставен от между около 30 и около 120 влакна (филамента) с диаметър между около 18 и около 30 мкм и между около 150 и около 400 дение.

Полимерното свързващо вещество и вътрешната армираща мрежа могат да включват естерите на хиалуроновата киселина, както е описано в патенти на САЩ 4,851,521 и 4,965,353 и в публикацията на РСТ WO 92-13579, използувани поотделно или в смеси един с друг в различни процентни съотношения.

Освен това, полимерното свързващо вещество, в което е включена армиращата мрежа, може да включва смеси от един или повече естери на хиалуроновата киселина в допълнение към биологично и фармакологично активните съставки на желираните полизахариди като хитин, алгинати, цитозан, гелан и техните синтетични или полусинтетични производни.

Представените многослойни мембрани са уникални по това, че са изцяло биосъвместими и биоразграждащи се, защото те са съставени, отвътре и отвън, от материали, притежаващи такива характеристики. Многослойната структура, т.е. полимерното свързващо веществомрежа/полимер представлява единна маса, в която двете съставни части са неразделящи се, дори при намокряне. Това е в резултат на използуваната техника на нанасяне на покритие върху армиращата мрежа, при която разтворът с полимерното покритие съдържа разтворител, който е също така и разтворител, използуван за получаването на материала, съставящ армиращата мрежа. Разтворителят действува върху мрежата, създавайки химична връзка между полимерното свързващо вещество и армиращата мрежа. Крайният продукт е единно цяло, включващо двете комбинирани структури.

Представените многослойни мембрани са също така уникални поради факта, че е възможно да се променят механичните характеристики на материала - устойчивост и твърдост при навлажнявано. Това беше възможно да се постигне чрез въвеждане на биосъвместими и биоразграждащи се

-7мрежи, образуващи едно цяло с полимерното свързващо вещество. По такъв начин, могат да се постигнат различни механични свойства чрез използуването на различни материали, изграждащи нишките, с модулирано на свойствата им. Например, свойствата на нишките по отношение на HYAFF11 и ALAFF11, могат да се представят по следния начин:

	Якост на опън Удължение Модул на Юнг
(МРа)	(%)	(МРа)
HYAFF11	39	96	560
ALAFF11	183	15	5428
Така,	многослойните мембрани	от представеното изобретение

притежават предимството, че твърдостта на вътрешната мрежа може да се изменя (модулира), съобразно нуждите, като същевременно се гарантира цялостта на крайния продукт. Традиционните многослойни материали за биомедицинско приложение, включващи армиращи мрежи в полимерно свързващо вещество страдат от недостатъка, че двата компонента притежават различни механични характеристики и следователно са склонни да се отделят един от друг при дадени условия, например влага.

Многослойните мембрани от представеното изобретение притежават и това предимство, че при все че са изработени от материали с различни химични/физични характеристики, те не страдат от недостатъка да се разделят един от друг по време на приложението им.

Многослойните мембрани с гореспоменатите характеристики могат да се получат, като се излезе от армираща мрежа, получена по описания по-долу начин.

Във връзка с фиг.1, в съда (1) се приготвя полимерен разтвор с концентрация между около 80 мг/мл и около 180 мг/мл, след което се подава, посредством зъбната помпа (2), във филера, който е с между около 30 и около 120 отвора, за мокра екструзия, като всеки отвор е с диаметър между около 30 и около 120 микрона. Екструдираният по този начин многовлакнест кабел

-8преминава през коагулационната баня (3) и след това се придвижва посредством транспортни валци в три последователни бани за изплакване (4, 5, 6). Отношението между скоростта на третите валци (III) и това на първите валци (I) се нарича изтеглящо отношение и варира между около 1 и около 1,3, докато скоростта на валците варира между около 2 и около 30 об.мин*¹. След като е преминала през изплакващите бани, многовлакнестият кабел се изсушава с топъл въздух (7) при температура варираща между около 40°С и около 55°С и се навива върху рамката (8). Дението на нишката варира между около 150 и около 400. След това многовлакнестият кабел се усуква между около 90 и около 200 пъти на метър и се изтъкава на стан в гладка трикотажна тъкан с деление (екартеман) между около 10 и около 16 (9, 10). След като излезе от стана, тъканта се подава в каландера (11), който я изтънява. Полимерното свързващо вещество се подава през двете въздушните четки (14), които го пулверизират под формата на полимерен разтвор с концентрация между около 30 мг/мл и около 120 мг/мл. Разтворителят, който може да се използува за получаването на този полимерен разтвор, може да бъде апротонен разтворител и може да включва амид на карбонова киселина, по-специално диалкиламид на алифатна киселина с между 1 и 5 въглеродни атома и произлязъл от алкилни групи с между 1 и 6 въглеродни атома и от органичен сулфоксид т.е., диалкилсулфоксид с алкилни групи с максимум 6 въглеродни атома, каквито са специално диметилсулфоксид или диетилсулфоксид и от флуориран разтворител с ниска точка на кипене, като хексафлуороизопропанол. Също така полезен е и N-метил-пиролидон. Пулверизираната мрежа преминава през коагулационната баня (15), промивна камера (16) и през сушилна камера с горещи валци с температура варираща между около 40°С и 55°С (17).

Коагулиращите вани 3 и 15 са от неръждаема стомана и са под формата на обратен триъгълник, така че екстрахираният разтворител да може да се утаи в най-дълбоката част, докато материалът, който се обработва, може да се поддържа в контакт със свеж коагулиращ разтворител.

-9Процесът коагулация по същество е процес на екстракция, при който от разтвора на полимер и разтворител може да се постигне екстракция на солубилизиращия разтворител и втвърдяването на полимера може да се проведе чрез прибавянето на втори разтворител, например етанол, в който солубилизиращия разтворител, например диметилсулфоксид, е разтворим, както и самия полимер.

Следователно, представеното изобретение се отнася до нов клас продукти, които ще се използуват в областта на медицината и фармацията за лечение на вътрешни или повърхностни нарушения. Продуктът е известен като многослойна мембрана и е напълно или частично биосъвместим и биоразраждащ се. Той е съставен от естери на хиалуроновата киселина, поотделно или смесени с други естествени, синтетични или полусинтетични полимери. Такива материали показват висока механична устойчивост, специално спрямо разкъсване, което би се появило в хирургията, когато мембраните се фиксират към тъканите, заобикалящи оперираното място.

По-голямата механична якост на представените многослойни мембрани, в сравнение с мембраните, получени чрез проста екструзия, може да се определи чрез механични изпитания. За да се демонстрира това, проведено е сравнение между непрекъсната мембрана от етилов естер на хиалуроновата киселина и многослойна мембрана от мрежа от диетилов естер на хиалуроновата киселина и полимерно свързващо вещество от бензилов естер на хиалуроновата киселина. Резултатите от сравнителните изпитания са дадени по-долу в Таблица 1.

-10ТАБЛИЦА1

ТИП МЕМБРАНА

	НЕПРЕКЪСНАТ	МНОГОСЛОЕН
СУХ	МОКЪР	СУХ	МОКЪР
Дебелина (мкм)	18,8	60	195	400
Минимална якост на опън
при разкъсване (кг/см²)	1000	40	650	120
Удължение (%)	6	42	7	50
Якост на разкъсване
(кг/см²)	15	8	90	50

Якостта на разкъсване се определя като се прекара хирургически конец 8/0 през мембраната с хирургическа игла.

Тези данни показват, че при мокри условия (работни условия) механичните характеристики на многослойната мембрана от представеното изобретение са забележимо по-добри от тези на традиционните непрекъснати мембрани.

С Естерите на хиалуроновата киселина.

Естерите на хиалуроновата киселина, полезни за представеното изобретение са естери на хиалуроновата киселина с алифатни, арилалифатни, циклоалифатни или хетероциклени алкохоли, в които са естерифицирани всички (така наречени тотални естери) или само част (т.н. частични естери) от карбоксилните групи на хиалуроновата киселина и соли на частичните естери с метали или с органични основи, биосъвместими или приемливи от фармакологична гледна точка.

Полезните естери включват естери, които произлизат от алкохоли, самите те притежаващи забележимо фармакологично действие. Наситените

-11 алкохоли от алифатния ред или прости алкохоли от циклоалифатния ред са също така полезни за представеното изобретение.

В гореспоменатите естери, в които някои от карбоксилните групи остават свободни (т.е. частични естери), могат да бъдат превърнати в соли с метали или органични основи, каквито са алкалните или алкалоземни метали или с амоняк или азот-съдържащи органични основи.

Повечето от естерите на хиалуроновата киселина (HY), за разлика от самата HY, проявяват известна степен на разтворимост в органични разтворители. Тази разтворимост зависи от процента естерифицирани карбоксилни групи и от типа на алкилната група, свързана с карбоксилната. Следователно, едно HY съединение с естерифицирани всички карбоксилни групи, притежава добра разтворимост, при стайна температура, например в диметилсулфоксид (бензиловият естер на HY се разтваря в диметилсулфоксид в степен 200 мг/мл). Повечето от тоталните естери на HY притежават също така, за разлика от самата HY и специално нейните соли, слаба разтворимост във вода и са в основни линии неразтворими във вода. Характеристиките на разтворимост, заедно със забележимите вискоеластични свойства, правят HY естерите особено предпочетени за използуването им в многослойните мембрани.

Алкохолите от алифатния ред, които ще се използуват като естерифициращи агенти за карбоксилните групи на хиалуроновата киселина за многослойните мембрани, съгласно представеното изобретение, са например тези, с максимум 34 въглеродни атома, които могат да бъдат наситени или ненаситени и които евентуално могат да бъдат заместени с други свободни функционални или функционално- модифицирани групи, като аминна, хидроксилна, алдехидна, кето-група, меркаптан или карбоксилни групи или от групи, получени от тях, като хидрокарбил или дихидрокарбиламино групи (оттук нататък терминът хидрокарбил ще бъде използуван за означаване не само на едновалентни радикали на въглеводородите като тези от типа θη^2η+1- но също така и на двувалентни или тривалентни радикали, като

-12алкилени C_nH2n или алкилидени С_пН2п)> етерни или естерни групи, ацетални или кетални групи, тиоетерни или тиоестерни групи и естерифицирани карбоксилни или карбамидни групи и карбамид, заместен с една или повече хидрокарбилни групи, с нитрилна група или с халогени.

От гореспоменатите групи, съдържащи хидрокарбилни радикали, предпочетени са нисшите алифатни радикали, като алкили с максимум 6 въглеродни атома. Такива алкохоли могат също така да бъдат с прекъсната въглеродна верига от някакъв хетероатом, като кислород, азот и сяра. Предпочетени са алкохоли, заместени с една или две от споменатите функционални групи.

Алкохолите от гореспоменатите групи, които са предпочетени за употреба, са тези с максимум 12, а по-специално с 6 въглеродни атома и в които хидрокарбилните атоми в гореспоменатите амино, етерни, естерни, тиоетерни, тиоестерни, ацетални и кетални групи представляват алкилови групи с максимум 4 въглеродни атома, а също така в естерифицираните карбоксилни или заместени карбамидни групи, хидрокарбилните групи са алкили със същия брой въглеродни атома и в които амино или карбамидните групи могат да бъдат алкиленамино или алкиленкарбамидни групи с максимум 8 въглеродни атома. От тези алкохоли, специално предпочетени са наситените и ненаситени алкохоли, като метилов, етилов, пропилов и изопропилов алкохол, n-бутилов алкохол, изобутилов алкохол, третичен бутилов алкохол, амило-, пентил-, хексил-, октил-, нонил- и додецилов алкохол, преди всичко тези с линейна въглеродна верига, като нормален октил- и додецилалкохол. От заместените алкохоли от тази група, са полезни двувалентните алкохоли, като етиленгликол, пропиленгликол и бутиленгликол, тривалентните алкохоли като глицерин, алдехидалкохоли като тартронов алкохол, карбоксилирани алкохоли като млечните киселини, например, гликоловата киселина, маловата киселина, винените киселини, лимонена киселина, аминоалкохолите, като нормален аминоалкохол, аминопропанол, нормален аминобутанол и техните диметилирани и диетилирани производни в аминогрупата, холин,

-13пиролидинилетанол, пиперидинилетанол, пиперазинеилетанол и съответните производни на нормалния пропил или нормалния бутилалкохол, монотиоетиленгликол или неговите алкилови производни, като етиловите производни в мекраптановата функционална група.

От висшите наситени алифатни алкохоли предпочетени са цетилов и мерицилов алкохол, но за целта на представеното изобретение от особена важност са висшите ненаситени алкохоли с една или две двойни връзки, особено тези, съдържащи се в много от етеричните масла с афинитет към терпена, като цитронелол, гераниол, нерол, неролидол, линалол, фарнезол, фитол. От ненаситените нисши алкохоли от значение е да се имат предвид алилалкохол и пропаргилалкохол. От арил-алифатните алкохоли за предпочитане са тези само с един бензолов остатък и тези, в които алифатната верига е с максимум 4 въглеродни атома и в които бензолният остатък може да се замести с между 1 и 3 метилови групи или хидроксилни групи или с халогенни атоми, специално с хлор, бром и йод и в които алифатната верига може да се замести с една или повече функционални групи, избрани от групата, съдържаща свободни аминогрупи или моно- или диметилирани или от пиролидинови или пиперидинови групи. От тези алкохоли най-предпочетените са бензилалкохол и фенетилалкохол.

А Алкохолите от циклоалифатния или алифатния-циклоалифатен ред могат да бъдат получени от моно- или полициклени въглеводороди, могат да притежават препоръчително максимум 34 въглеродни атома, могат да бъдат незаместени и могат да съдържат един или повече заместители, като тези, споменати по-горе за алифатните алкохоли. От алкохолите, получени от циклични монопръстенни въглеводороди, предпочетени са тези с максимум 12 въглеродни атома, пръстени с препоръчителен брой въглеродни атома между 5 и 7, които могат да заместени, например с между една и три по-нисши алкилови групи, като метил, етил, пропил или изопропил. Като найпредпочетени специфични алкохоли от тази група са следните: циклохексанол, циклохександиол, 1,2,3-циклохексантриол и 1,3,5-циклохексантриол (флоро-14глуцитол), инозитол, а алкохолите, които са прозлезли от р-метан, такива като карвоментол, ментол и α-7-терпинеол, 1-терпинеол, 4-терпинеол и пиперитол или смес от тези алкохоли, известни като терпинеол, 1,4- и 1,8-терпин. От алкохолите, които са произлезли от въглеводороди с кондензирани ядра, такива като туян, пинан или камфан, предпочетени са следните: туянол, сабинол, пинол хидрат, D и L-борнеол и D и L-изоборнеол.

Алифатно-циклоалифатните полициклени алкохоли, които ще се използуват за естери в представеното изобретение, са стероли, холеви киселини и стероиди, като полови хормони и техните синтетични аналози, специално кортикостероиди и техните производни. Следователно, възможно е да се използуват: холестерол, дихидрохолестерол, епидихидрохолестерол, копростанол, епикопростанол, ситостерол, стигмастерол, ергостерол, холева киселина, деоксихолева киселина, литохолева киселина, естриол, естрадиол, еквиленин, еквилин и техните алкилирани производни, както и техните етинилови или пропинилови производни на 17 място, като 17а-етинилестрадиол или 7а-метил-17а-етинил-естрадиол, прегненолон, прегнандиол, тестостерон и неговите производни, като 17а-метилтестостерон, 1,2дехидротестостерон и 17а-метил-1,2-дехидротестостерон, алкинилираните производни на място 17 на тестостерона и на 1,2-дехидротестостерона, като 17а-етинилтестостерон, 17а-пропинилтестостерон, норгестрел, хидроксипрогестерон, кортикостерон, деоксикортикостерон, 19-нортестостерон, 19нор-17а-метилтестостерон и 19-нор-17а-етинилтестостерон, антихормони като ципротерон, кортизон, хидрокортизон, преднизон, преднизолон, флуорокортизон, дексаметазон, бетаметазон, параметазон, флуметазон, флуоцинолон, флуоцинолон, флупреднилиден, клобетазол, беклометазон, алдостерон, деоксикортикостерон, алфаксолон, алфадолон и боластерон. Като естерифициращи компоненти за естерите на представеното изобретение, са от полза следните съединения: генини (агликони) на кардиоактивните гликозиди, като дигитоксигенин, гитоксигенин, дигоксигенин, строфантинидин, тигогенин и сапонини.

-15Други алкохоли, които ще се използуват в представеното изобретение са витамини, като аксерофтол, витамини D2 и D3, аневрин, лактофлавин, аскорбинова киселина, рибофлавин, тиамин и пантотенова киселина.

От хетероциклените киселини, следните могат да бъдат разгледани като производни на гореспоменатите циклоалифатни или алифатно-циклоалифатни алкохоли, ако техните линейни или циклични вериги са прекъснати от един или повече, например между един и три хетероатома, подбрани примерно от от групата, съставена от -0-, -S-, -N- и -NH- и в тези съединения могат да бъдат налице една или повече ненаситени връзки, например двойни връзки, поспециално между една и три, като по този начин се включват и хетероциклени съединения с ароматни структури. Като примери могат да бъдат посочени следните съединения: фурфурилов алкохол, алкалоиди и производните им, като атропин, скополамин, цинхонин, 1а-цинхонидин, хинин, морфин, кодеин, налорфин, N-бутил-скополамониев бромид, аймалин, фенилетил-амини, като ефедрин, изопротеренол, епинефрин; фенотиазинови лекарства, като перфеназин, пипотиазин, карфеназин, хомофеназин, ацетофеназин, флуофеназин и N-хидроксиетилпрометазин хлорид; тиоксантенови лекарства като флупентиксол и клопентиксол; антиконвулсанти, като мепрофендиол антипсихотични като опипрамол; антиеметични, като оксипендил; аналгетични, като карбетидин, феноперидин и метадол; хипнотични, като етодроксизин, анорексични, като бензидрол и дифеметоксидин; слаби транквилизатори като хидроксизин; мускулни релаксанти, като цинамедрин, дифилин, мефенизин, метокарбамол, хлорфенезин, 2,2-диетил-1,3-пропандиол, гайфенезин, хидроциламид; коронарни съдоразширяващи средства, като дипидамол и оксифедрин; адренергични блокиращи средства, като пропанолол, тимолол, пиндолол, бупранолол, атенолол, метропролол, практолол; антинеопластични средства, като 6-азауридин, цитарабин, флуоксиридин; антибиотици, като хлорамфеникол, тиамфеникол, еритромицин, олеандомицин, линкомицин; антивирусни средства, като идоксуридин; периферни съдоръзширители като изоникотинилов алкохол; каробонови анхидразни инхибитори като

-16сулокарбилат; антиастматични и противовъзпалителни средства, като тиарамид; сулфамиди, като 2-р-сулфанилонов етанол.

В някои случаи от интерес могат да бъдат естери на хиалуроновата киселина, в които естерните групи са произлезли от две или повече терапевтично активни хидроксилни субстанции и естествено, могат да се получат всички възможни варианти. От специален интерес са субстанциите, в които са застъпени два типа различни естерни групи, произлизащи от лекарства с хидроксилен характер и в които останалите хидроксилни групи са свободни, превърнати в сол с метали или с основа, като е възможно също така и самите основи да са терапевтично активни, например, със същата или подобна активност както тази на естерифициращия компонент. По-точно, възможно е да се получат естери на хиалуроновата киселина, произлизащи от една страна от противовъзпалителен стероид, като един от тези, споменати по-горе, а от друга - от витамин, алкалоид или антибиотик, като един от споменатите по-горе.

Метод за получаване на естери на хиалуроновата киселина съгласно изобретението

Метод А;

Естерите на хилуроновата киселина могат да бъдат получени по известни методи за естерифициране на карбоновите киселини, например чрез обработка на свободна хиалуронова киселина с желаните алкохоли в присъствието на катализиращи вещества, като силни неорганични киселини или йонообменни агенти от киселинен тип или с естерифициращ агент, способен да въведе желания алкохолен остатък, в присъствието на неорганични или органични основи. Като естерифициращи агенти е възможно да се използуват тези, познати от литературата, като особено подходящи са естерите на различни неорганични или органични сулфонови киселини, като хидрациди, т.е. хидрокарбилни халогениди, като метил- или етилйодид или неутрални сулфати или хидрокарбилни киселини, алифати, карбонати,

-17силикати, фосфити или хидрокарбил сулфонати, като метилбензол или ртолуол-сулфонат или метил- или етил хлорсулфонат. Реакцията може да се извърши в подходящ разтворител, например алкохол, за предпочитане такъв, отговарящ на алкиловата група, която ще се въведе в карбоксилната група. Но реакцията може също така да се извърши и в неполярни разтворители, каквито са кетоните, етерите или диоксана или в апротонни разтворители, като диметилсулфоксид. Като основа е възможно да се използува например хидроокис на алкален, алкалоземен метал или магнезий, както и сребърен окис или основна сол на един от тези метали, като карбонат и, от органичните основи - третична азотна база, като например пиридин или колидин. Вместо основа е възможно също така да се използува йонообменна смола от основен тип.

Друг метод за естерифициране използува метални соли или соли с органични азотни бази, например, амониева основа или заместени амониеви соли. За предпочитане е да се използуват солите на алкални или алкалоземни метали, но могат да бъдат използувани и солите на други метали. Естерифициращите агенти в този случай са също така онези, споменати погоре и същото се отнася до разтворителите. За предпочитане е да се използуват апротонни разтворители, например диметилсулфоксид и диметилформамид.

В получените, съгласно тази процедура или съгласно някоя друга процедура, описана по-нататък, естери, свободните карбоксилни групи на частичните естери могат да бъдат превърнати в сол, ако е желателно, по известни per se методи.

Метод Б:

Хиалуроновите естери могат да бъдат получени също така по метод, който се състои в обработка на кватернерна амониева сол на хиалуроновата киселина с естерифициращ агент, за предпочитане в апротонен органичен разтворител.

-18Като органични разтворители е препоръчително да се използуват апротонни разтворители, като диалкилсулфоксиди, диалкилкарбоксамиди, като особено специални са диалкилсулфоксиди с нисш алкил, специално диметил-сулфоксид и нисш алкил диалкиламиди на нисши алифатни киселини, като диметил- или диетилформамид или диметил или диетилацетамид.

Обаче, трябва да се разгледат и други разтворители, които не са винаги апротонни, като алкохоли, етери, кетони, естери, специално алифатни или хетероциклени алкохоли и кетони с ниска точка на кипене, като хексафлуороизопропанол, трифлуороетанол и N-метилпиролидон.

Реакцията се извършва, за предпочитане в температурния интервал между около 0°С и 100°С, специално между около 25°С и 75°С, например при около 30°С.

Естерифицирането се провежда, за предпочитане, чрез прибавянето на порции на естерифициращ агент към гореспоменатата амониева сол в един от гореспоменатите разтворители, например диметилсулфоксид.

Като алкилиращи агенти е възможно да се използуват тези, споменати по-горе, специално хидрокарбилни халогени, например алкил халогени. Като изходящи кватернерни амониеви соли е за предпочитане да се използуват нисши амониеви тетраалкилати, като алкилните групи е препоръчително да бъдат между 1 и 6 въглероден атом. Най-често е използуван тетрабутиламониев хиалуронат. Тези кватернерни амониеви соли е възможно да се получат чрез взаимодействие на метална сол на хиалуроновата киселина, за предпочитане една от тези, споменати по-горе, специално натриева или калиева сол, във воден разтвор с превърната в сол сулфонова смола с кватернерна амониева основа.

Вариант на описаната по-горе процедура се състои в реакция на калиева сол на хиалуронова киселина, разтворена в подходящ разтворител, като диметилсулфоксид, с подходящ алкилиращ агент, в присъствието на каталитично действуващи количества от кватернерна амониева сол, като тетрабутиламониев йодид.

-19За получаването на естери на хиалуроновата киселина е възможно да се използуват хиалуронови киселини от всякакъв произход, като например, киселините екстрахирани от гореспоменатите изходни материали, например от гребен на петел. Получаването на тези киселини е описано в литературата: препоръчително е да се използуват пречистени хиалуронови киселини. Използуват се специално хиалуронови киселини включващи молекулни фракции от интегрални киселини, получени директно чрез екстракция на органичните материали с молекулни тегла, вариращи в широк интервал, например от около 90% - 80% (Мол. тегло = 11,7 -10,4 млн) до 0,2% (Мол. тегло = 30 000) от молекулното тегло на интегралната киселина, притежаваща молекулно тегло 13 милиона, за предпочитане между 5% и 0,2%. Такива фракции могат да бъдат получени по различни методи, описани в литературата, като хидролиза, окисление, ензимни или физични процедури, като механични или радиационни методи. По време на процедурите, описани в литературата често се получават първични екстракти (например, вижте статията на Balazs et al., публикувана в Cosmetics & Toiletries”). Разделянето и пречистването на получените молекулярни фракции се извършва по известни техники, например чрез филтруване през молекулно сито.

В допълнение, полезни са пречистени фракции, които могат да се L получат от хиалуронова киселина, като например тези, описани в Европейска патентна публикация No. 0138572.

Получаването на соли на хиалуроновата киселина с горепосочените метали за приготвяне на изходните соли за специалната процедура за естерифакция, се извършва по известни начини, например при реакция между хиалуронова киселина със стехиометрично изчислено количество алкални хидоокиси или с основните соли на тези метали като карбонати или бикарбонати.

В частичните естери е възможно да се превърнат в сол всички останали карбоксилни групи или само част от тях, като се дозират количествата основа, така че да се получи желаната стехиометрична степен на образуване на сол. С

-20правилната степен на превръщане в сол е възможно да се получат естери с широк диапазон от различни дисоциационни константи, които следователно ще бъдат в състояние да дадат желаното pH в разтвор или in situ по време на приложението им в терапията.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Дадените по-долу примери обясняват получаването на естери на хиалуроновата киселина, полезни за многослойните мембрани от представеното изобретение.

ПРИМЕР 1 - Получаване на (частичен) пропилов естер на хиалуронова киселина (HY) ** - 50% естерифицирани карбоксилни групи

- 50% превърнати в сол карбоксилни групи (Na)

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 00, отговарящи на 20 мола мономер са разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 1,8 г (10,6 мола) пропилйодид и полученият разтвор се поддържа при температура 30°С в продължение на 12 часа.

Прибавя се разтвор, съдържащ 62 мл вода и 9 г натриев хлорид и получената смес се излива бавно в 3 500 мл ацетон при постоянно разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива трикратно с 500 мл ацетон/вода 5:1 и трикратно с ацетон и накрая се суши под вакуум в продължение на осем часа при 30°С.

След това продуктът се разтваря в 550 мл вода, съдържаща 1% натриев хлорид и разтворът се излива бавно в 3 000 мл ацетон при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и се промива двукратно с 500 мл ацетон/вода (5:1) и трикратно с с 500 мл ацетон и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получават се 7,9 г частичен пропилов естер от заглавието. Извършено е количественото определяне на естерните групи, като се използува метода на R.H. Cundiff and P.O. Markunas [Anal. Chem. 33,1028-1030. (1961)].

-21 ПРИМЕР 2 - Получаване на (частичен) изопропилов естер на хиалуронова киселина (HY) - 50% естерифииирани карбоксилни групи - 50% превърнати в сол карбоксилни групи (Na)

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 160 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 1,8 г (10,6 мола) изопропилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Прибавя се разтвор, съдържащ 62 мл вода и 9 г натриев хлорид и получената смес се излива бавно в 3 500 мл ацетон при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива трикратно с 500 мл ацетон/вода (5:1), трикратно с ацетон и накрая се суши под вакуум в продължение на 8 часа при 30°С.

След това продуктът се разтваря в 550 мл вода, съдържаща 1% натриев хлорид и разтворът се излива бавно в 3 000 мл ацетон при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива двукратно с 500 мл ацетон/вода (5:1) и трикратно с 500 мл ацетон, накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С.

Получават се 7,8 г частичен изопропилов естер - съединението от заглавието. Извършено е количествено определяне на естерните групи, като е използуван метода на R.H. Cundiff and Р.С. Markunas [Anal.Chem. 33,1028-1030 (1961)].

ПРИМЕР 3 - Получаване на (частичен) етилов естер на хиалуроновата киселина - 75% естерифииирани карбоксилни групи - 25% превърнати в сол карбоксилни. групиДМа)

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуроновата киселина с молекулно тегло 250 000, отговарящо на 20 мола от мономера се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 2,5 г (15,9 мола) етилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Прибавя се разтвор, съдържащ 62 мл вода и 9 г натриев хлорид и получената смес се излива бавно в 3 500 мл ацетон при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива трикратно с

-22500 мл ацетон/вода (5:1), трикратно с ацетон и накрая се суши под вакуум в продължение на 8 часа при 30°С.

Получават се 7,9 г частичен изопропилов естер - съединението от заглавието. Извършено е количествено определяне на естерните групи, като е използуван метода на R.H. Cundiff and Р.С. Markunas [Anal.Chem. 33,1028-1030 (1961)].

ПРИМЕР 4 - Получаване на (частичен) метилов естер на хиалуроновата киселина - 75% естерифицирани карбоксилни групи - 25% превърнати в кол карбоксилни групи

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 80 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 2,26 г (15,9 мола) метилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Прибавя се разтвор съдържащ 62 мл вода и 9 г натриев хлорид и получената смес се излива бавно в 3 500 мл ацетон при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива трикратно с 500 мл ацетон/вода (5:1), трикратно с ацетон и накрая се суши под вакуум в продължение на 8 часа при 30°С.

Получават се 7,8 г частичен изопропилов естер - продукта от заглавието. Ивършено е количествено определяне на естерните групи, като е

-23използуван метода на R.H. Cundiff and Р.С. Markunas [Anal.Chem. 33,1028-1030 (1961)].

ПРИМЕР 5 - Получаване на метилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 120 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 3 г (21,2 мола) метилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 мл етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 мл етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С.

Получават се 8 г етилов естер - продукта от заглавието. Извършено е количествено определяне на естерните групи, като е използуван метода на

R.H. Cundiff and Р.С. Markunas [Anal.Chem. 33,1028-1030 (1961)].

ПРИМЕР 6 - Получаване на етилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 85 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 3,3 г (21,2 мола) етилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

R.H. Cundiff and Р.С. Markunas [Anal.Chem. 33,1028-1030 (1961)].

ПРИМЕР 7 - Получаване на пропилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл

-24диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 3,6 г (21,2 мола) пропилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получават се 8,3 г пропилов естер - съединението от заглавието. Извършено е количествено определяне на естерните групи, като е използуван метода на R.H. Cundiff and Р.С. Markunas [Anal.Chem. 33,1028-1030 (1961)].

ПРИМЕР 8 - Получаване на (частичен) бутилов естер на хиалуронова киселина - 50% естерифииирани карбоксилни групи - 50% превърнати в сол карбоксилни групи (Na)

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 620 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 1,95 г (10,6 мола) n-бутилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Прибавя се разтвор, съдържащ 62 мл вода и 9 г натриев хлорид и получената смес се излива бавно в 3 500 мл ацетон при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива трикратно с • 500 мл ацетон/вода (5:1), трикратно с ацетон и накрая се суши под вакуум в продължение на 8 часа при 30°С.

Получават се 8 г частичен бутиловлов естер - съединението от заглавието. Ивършено е количествено определяне на естерните групи, като е използуван метода на R.H. Cundiff and Р.С. Markunas [Anal.Chem. 33,1028-1030 (1961)].

-25ПРИМЕР 9 - Получаване на (частичен) етокси-карбонилметилов естер на хиалуроновата киселина - 75% естерифицирани карбоксилни групи - 25% превърнати в сол карбоксилни групи

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 180 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 2 г (15 мола) тетрабутиламониев йодид и 1,84 г (15 мола) етил-хлорацетат и полученият разтвор се поддържа в продължение на 24 часа при 30°С.

Получават се 10 г етоксикарбонил метилов естер - съединението от заглавието.

Извършено е количествено определяне на естерните групи, като е използуван метода на R.H. Cundiff and Р.С. Markunas [Anal.Chem. 33,1028-1030 (1961)].

ПРИМЕР 10 - Получаване на n-пентилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 620 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 3,8 г (25 мола) n-пентилбромид и 0,2 г тетрабутил-амониев йодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получават се 8,7 г n-пентилов естер - съединението от заглавието.

Извършено е количествено определяне на естерните групи, като е използуван метода, описан на страници 169-172 от Siggia S. & Hanna J.G. Quantitative organic analysis via functional groups 4th Edition, John Wiley and Sons.

ПРИМЕР 11 - Получаване на изопентилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 3,8 г (25 мола) изопентилбромид и 0,2 г тетрабутил-амониев йодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получават се 8,6 г изопентилов естер - съединението от заглавието.

ПРИМЕР 12 - Получаване на бензилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,5 г (25 мола) бензилбромид и 0,2 г

-27тетрабутил-амониев йодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получават се 9 г бензилов естер - съединението от заглавието.

ПРИМЕР 13 - Получаване на бета-фенилетилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 125 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,6 г (25 мола) 2-бромоетилбензол и 185 мг тетрабутиламониев йодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получават се 9,1 г бета-фенилетилов естер - съединението от заглавието.

-28ПРИМЕР14 - Получаване на бензилов естер на хиалуроновата киселина г калиева сол на хиалуроновата киселина с молекулно тегло 162 000 се суспендират в 200 мл диметилсулфоксид, прибавят се 120 мг тетрабутиламониев йодид и 2,4 г бензилбромид.

Суспенсията се разбърква в продължение на 48 часа при 30°С. Получената смес се излива бавно в 1 000 мл етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и се промива четирикратно с 150 мл етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С.

Получават се 3,1 г бензилов естер - съединението от заглавието. Извършено е количествено определяне на естерните групи, като е използуван метода, описан на страници 169-172 от Siggia S. & Hanna J.G. Quantitative organic analysis via functional groups 4th Edition, John Wiley and Sons.

ПЕИМЕЕ__15 -__Получаване__на__(частичен пропилов)__eciep__на хиалуроновата киселина - 85% естерифинирани карбоксилни групи - 15% превърнати в сол карбоксилни групи.

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 165 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 2,9 г (17 мола) пропилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

След това продуктът се разтваря в 550 мл вода, съдържаща 1% натриев хлорид и разтворът се излива бавно в 3 000 мл ацетон при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива двукратно с

-29500 мл ацетон/вода (5:1) и трикратно с 500 мл ацетон, накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С.

Получават се 8 г частичен пропилов естер - съединението от заглавието.

ПРИМЕР 16 - Получаване на n-октилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящо на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,1 г (21,2 мола) 1-бромоктан и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 мл етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и се промива четирикратно с 500 мл етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получават се 9,3 г октилов естер съединението от заглавието.

Извършено е количествено определяне на естерните групи, като е използуван метода, описан на страници 169-172 от Siggia S. & Hanna J.G. Quantitative organic analysis via functional groups 4th Edition, John Wiley and _w Sons.

ПРИМЕР 17 - Получаване на изопропилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 2,6 г (21,2 мола) изопропилбромид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 мл етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 мл етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение

-ЗОна 24 часа при 30°С. Получават се 8,3 г изопропилов естер - съединението от заглавието.

ПРИМЕР 18 - Получаване на 2.6-дихлорбензилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 5,08 г (21,2 мола) 2,6дихлохбензилбромид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 мл етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 мл етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получават се 9,8 г 2,6-дихлорбензилов естер съединението от заглавието.

ПРИМЕР__19__:__Получаване__на 4-трет-бутилбензилов__eciep__на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,81 г (21,2 мола) 4-трет-бутилбензилов бромид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 мл етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива

-31 четирикратно с 500 мл етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получават се 9,8 г 4-трет-бутилбензилов естер съединението от заглавието.

ПРИМЕР 20 - Получаване на хептадеиилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 6,8 г (21,2 мола) хептадецилбромид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 мл етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 мл етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получават се 11 г хептадецилов естер - съединението от заглавието.

ПРИМЕР 21 - Получаване на октаденилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 7,1 г (21,2 мола) октадецилбромид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

-32четирикратно с 500 мл етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получават се 11 г октадецилов естер - съединението от заглавието.

ПРИМЕР 22 - Получаване на 3-фенилпропилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно ν

тегло 170 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,22 г (21,2 мола 3фенилпропилбромид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 мл етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 мл етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получават се 9 г 3-фенилпропилов естер - съединението от заглавието.

ПРИМЕР 23 - Получаване на 3.4.5-триметокси-бенизилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,6 г (21,2 мола) 3,4,5триметоксибензилхлорид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 мл етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 мл етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получават се 10 г 3,4,5-триметоксибензилов естер съединението от заглавието.

ПРИМЕР 24 - Получаване на иинамилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,2 г (21,2 мола) цинамилбромид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 мл етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 мл етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получават се 9,3 г цинамилов естер - съединението от заглавието.

Извършено е количествено определяне на естерните групи, като е използуван метода, описан на страници 169-172 от Siggia S. & Hanna J.G. “Quantitative organic analysis via functional groups 4th Edition, John Wiley and Sons.

ПРИМЕР 25 - Получаване на денилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,7 г (21,2 мола) 1-бромодекан и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 мл етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 мл етилацетат и накраая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получават се 9,5 г децилов естер съединението от заглавието.

ПРИМЕР 26 - Получаване на нонилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 мола мономер се разтварят в 620 мл диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,4 г (21,2 мола) 1-бромононан и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 мл етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 мл етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получават се 9 г нонилов естер - съединението от заглавието.

_w Извършено е количествено определяне на естерните групи, като е използуван метода, описан на страници 169-172 от Siggia S. & Hanna J.G. Quantitative organic analysis via functional groups 4th Edition, John Wiley and Sons.

Естери на алгиновата киселина

Естерите на алгиновата киселина, които могат да бъдат използувани в представеното изобретение могат да бъдат получени по метода, описан в ЕРА 0 251 905 А2, като се излезе от кватернерни амониеви соли на алгиновата киселина с естерифициращ агент, за предпочитане в апротонен органичен разтворител, като диалкилсулфоксиди, диалкилкарбоксамиди, като особено подходящи са нисшите алкилни диалкилсулфоксиди, най-вече

-35диметилсулфоксид и нисши алкилни диалкиламиди с нисши алифатни киселини, като диметил- или диетилформамид или диметил- или диетилацетамид. Възможно е, обаче, да се използуват и други разтворители, които са не винаги апротонни, като алкохоли, етери, кетони, естери, специално алифатни или хетероциклени алкохоли и кетони с ниска точка на кипене, като хексафлуоризопропанол и труфлуоретанол. Препоръчително е реакцията да се проведе при температури между около 0°С и 100°С, поспециално - между около 25°С и 75°С, например около 30°С.

За предпочитане е естерифицирането да се проведе чрез постепенно прибавяне на естерифициращ агент към гореспоменатата амониева сол, разтворена в един от споменатите разтворители, например в диметилсулфоксид. Като алкилиращи агенти могат да бъдат използувани вече споменатите по-горе, особено хидрокарбил халидите, например алкил халиди.

Предпочетеният естерифициращ процес следователно включва взаимодействие, в органичен разтворител, на кватернерна амониева сол на алгиновата киселина със стехиометрично количество от съединение с обща формула

А-Х в която А е подбрано от групата състояща се от алифатни, арилалифатни, циклоалифатни, алифатно-циклоалифатни и хетероциклени радикали, a X означава халогенен атом, и при който споменатото стехиометрично количество на А-Х се определя от желаната степен на естерификация.

Като изходни кватернерни амониеви соли е препоръчително да се използуват нисши алкилни тетраалкилати, чиито алкилни групи притежават, за предпочитане от 1 до 6 въглеродни атома. Най-често се използува тетрабутиламониев алгинат. Тези кватернерни амониеви соли могат да бъдат получени при взаимодействието на метална сол на алгиновата киселина, за предпочитане една от тези, споменати по-горе, особено натриевата или калиева сол, във воден разтвор с превърната в сол сулфонова смола с кватернерна амониева основа.

-36Вариант на по-горе описаната процедура се състои във взаимодействие на калиева или натриева сол на алгиновата киселина, разтворена или суспендирана в подходящ разтворител, като диметилсулфоксид, с подходящ алкилиращ агент в присъствието на каталитично действуващо количество кватернерна амониева сол, например тетрабутиламониев йодид. Тази процедура прави възможно получаването на тотални естери на алгиновата киселина.

За получаването на нови естери е възможно използуването на алгинови киселини от всякакъв произход. Получаването на тези киселини е описано в литературата. За предпочитане е да се използуват пречистени алгинови киселини.

В частичните естери е възможно превръщането в сол на всички оставащи карбоксилни групи или само на част от тях, като количеството основа се дозира така, че да се получи желаната стехиометрична степен на превръщане в сол. При правилно дозиране степента на превръщане в сол, възможно е да се получат естери с широк диапазон от различни дисоциационни константи, като по този начин се създаде желаното pH на разтворите in situ по време на терапевтичното приложение.

Особено полезни за представените многослойни мембрани са ALAFF11, бензилов естер на алгиновата киселина и ALAFF 7, етилов естер на алгиновата киселина.

С чисто илюстративна цел, по-долу са дадени някои примери за това как могат да бъдат получени многослойните мембрани и как могат да бъдат използувани в практиката.

ПРИМЕР 27

Произведена е многослойна мембрана съставена от бензилов естер на хиалуроновата киселина HYAFF11, т.е. хиалуронова киселина естерифицирана 100% с бензилов алкохол, с армираща мрежа изградена от етилов естер на хиалуроновата киселина HYAFF 7, т.е. хиалуронова киселина, естерифицирана 100% с етанол с базисно тегло 14 мг/см2, дебелина - 0,25 мм, минимална якост

Was·’

-37на опън при разкъсване и удължение в сухо състояние, съответно 400 кг/см² и

7%, минимална якост на опън и удължение в мокро състояние, съответно 50 кг/см² и 55%, якост на опън в сухо състояние - 90 кг/см² и якост на опън м мокро състояние 50 кг/см², съгласно описаната по-долу процедура.

Мрежата HYAFF 7 е получена като се излезе от разтвор на HYAFF 7 в диметилсулфоксид с концентрация 125 мг/мл, приготвен в съд 1, показан на фиг. 1. Разтворът се поема от зъбната подхранваща помпа (2) и се подава във филера за мокра екструзия, който е снабден със 100 отвора, всеки от тях с размер 65 мкм в диаметър.

Екструдираният многовлакнест кабел се прекарва през коагулационната баня (3), съдържаща абсолютен етанол и след това през транспортните валци - в три последователни изплакващи бани (4, 5 и 6), съдържащи също така абсолютен алкохол. Отношението между скоростта на третите валци (III) към това на първите (I) се нарича изтеглящо отношение и стойността му е 1,05, докато скоросттите на отделните валци са 23 об.мин^-1(валци I), 24 об.мин*¹ (валци II и III), 25 об.мин’¹ (валци IV). След като многовлакнестият кабел е преминал през изплакващите бани, той се изсушава с топъл въздух (7) с температура 45°С и се намотава на рамката (8). Кабелът е 237 дение. Многовлакнестият кабел след това се пресуква 135 пъти на метър и се изтъкава на стан в гладка трикотажна тъкан с деление 14 (9,10). От стана тъканта се подава в каландъра (11), който я изтънява. На фиг. 2 е показана мрежата, получена в резултат на този процес.

Полимерното свързващо вещество се нанася чрез двете въздушни четки (дюзи) (14), които пулверизират разтвор на HYAFF 11 в диметилсулфоксид с концентрация 40 мг/мл. Така пулверизираната мрежа се прекарва през коагулационната баня (15), съдържаща абсолютен етанол, през изплакващата камера (16), съдържаща чиста, дестилирана вода и през специалната сушилна камера (17) с топъл въздух 50°С. На фиг. 3 е показан крайният продукт.

-38ПРИМЕР 28

Армирана мембрана, съставена от полимерно свързващо вещество от частичен бензилов естер (75%) на хиалуронова киселина - HYAFF 11р75 с армираща мрежа, съставена от тотален бензилов естер на хиалуроновата киселина - HYAFF11 с базисно тегло 10 мг/см², дебелина 0,15 мм и минимална якост на опън при разкъсване и удължение в сухо състояние, съответно 300 кг/см² и 4%; минимална якост на опън при разкъсване и удължение в мокро състояние, съответно 40 кг/см² и 45%; якост на опън в сухо състояние 120 кг/см² и в мокро състояние 60 кг/см², е произведена съгласно следната процедура.

HYAFF 11р75 се получава по следната процедура. 10 г тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина, с молекулно тегло 620,76, равно на

16,1 наномола, се разтварят в смес от N-метил пиролидон/вода, 90/10, 2,5% тегловни, за получаването на 400 мл разтвор. Разтворът се охлажда до 10°С, след това през разтвора барботира пречистен азот в продължение на 30 мин. Този разтвор след това се естерифицира с 1,49 мл (равни на 12,54 милимола) бензилбромид. Разтворът се разтръсква леко в продължение на 60 часа при 15-20°С.

Извършва се последователно пречистване чрез утаяване в етилацетат, последвано от прибавянето на наситен разтвор на натриев хлорид и няколкократни промивания със смес от етилацетат/абсолютен етанол, 80/20. Твърдата фаза се отделя чрез филтруване и се обработва с безводен ацетон. По този начин се получават 6,8 г от продукта, представляващи добив около 95%.

Мрежата HYAFF 11 е получена като се излезе от разтвор на HYAFF 11 в диметилсулфоксид с концентрация 145 мг/мл, приготвен в съд 1, показан на фиг. 1. Разтворът се поема от зъбната подхранваща помпа (2) и се подава във филера за мокра екструзия, който е снабден със 70 отвора, всеки от тях с диаметър 50 мкм.

-39Екструдираният многовлакнест кабел се прекарва през коагулационната баня (3), съдържаща 90% абсолютен етанол и 10% чиста, дестилирана вода и след това през транспортните валци - в три последователни изплакващи бани (4, 5 и 6), съдържащи също така 90% абсолютен алкохол и 10% чиста дестилирана вода. Отношението между скоростта на третите валци (III) към това на първите (I) се нарича изтеглящо отношение и стойността му е 1,03, докато скоросттите на отделните валци са 20 об.мин^-1 (валци I), 21 об.мин'¹ (валци II и III), 22 об.мин'1 (валци IV). След като многовлакнестият кабел е преминал през изплакващите бани, той се изсушава с топъл въздух (7) с температура 47°С и се намотава на рамката (8). Полученият кабелът е 150 дение. Многовлакнестият кабел след това се пресуква 90 пъти на метър и се изтъкава на стан в гладка трикотажна тъкан с деление 12 (9,10). От стана тъканта се подава в каландъра (11), който я изтънява.

Полимерното свързващо вещество се нанася чрез двете въздушни четки (дюзи) (14), които пулверизират разтвор на HYAFF11 р75 в диметилсулфоксид с концентрация 30 мг/мл. Така пулверизираната мрежа се прекарва през коагулационната баня (15), съдържаща абсолютен етанол, през изплакващата камера (16), съдържаща чиста, дестилирана вода и през специалната сушилна камера (17) с топъл въздух 45°С.

ПРИМЕР 29

Многослойна мембрана, съставена от свързващо вещество от частичен бензилов естер (75%) на хиалуронова киселина - HYAFF 11р75 с армираща мрежа, съставена от смес на влакна от тотален бензилов естер на хиалуроновата киселина - HYAFF 11 и от бензилов естер на алгиновата киселина - ALAFF 11, в еднакво процентно съотношение и базисно тегло 16 мг/см², дебелина 0,25 мм и минимална якост на опън при разкъсване и удължение в сухо състояние, съответно 350 кг/см² и 5%; минимална якост на опън при разкъсване и удължение в мокро състояние, съответно 100 кг/см² и 35%; якост на якост на скъсване в сухо състояние 110 кг/см² и в мокро състояние 70 кг/см², е произведена съгласно следната процедура.

-40Бензиловият естер на алгиновата киселина - ALAFF 11 се получава по метод, описан в Патент на САЩ 5,147,861 и ЕРА 0 251 905 А2. 10 г (23,9 мола) тетрабутиламониева сол на алгиновата киселина се разтварят в 400 мл диметилсулфоксид при 25°С. Прибавят се 4,45 г (26 мола) бензилбромид и 0,1 г тетрабутиламониев йодид.

Разтворът се разбърква добре в продължение на 12 часа при 30°С и след това се излива бавно на равномерни капки и при разбъркване в 3,5 л етилацетат (или толуол). Утайката се филтрува и след това се промива четирикратно с етилацетат и се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. По този начин се получават 5 г от съединението.

Мрежата, образувана от многовлакнестите кабели на HYAFF11 и ALAFF 11 в еднакво процентно съотношение се получава като се излезе от два отделни многовлакнести кабела, единият от HYAFF11 със 60 дение, а другият от ALAFF 11 с 75 дение.

Многовлакнестият кабел от HYAFF 11 е получен по метода, описан в Пример 2, докато многовлакнестият кабел от ALAFF 11 е получен по следния начин. Разтвор на ALAFF 11 в диметилсулфоксид с концентрация 100 мг/мл, се приготвя в съд 1, показан на фиг. 1. Разтворът се поема от зъбната подхранваща помпа (2) и се подава във филера за мокра екструзия, който е _w снабден с 35 отвора, всеки от тях с диаметър 50 мкм.

Екструдираният многовлакнест кабел се прекарва през коагулационната баня (3), съдържаща 45% абсолютен етанол, 45% етилацетат и 10% чиста, дестилирана вода. След това се придвижва чрез транспортните валци - в три последователни изплакващи бани (4, 5 и 6), съдържащи ацетон. Отношението между скоростта на третите валци (III) към това на първите (I) се нарича изтеглящо отношение и стойността му е 1,1, докато скоросттите на отделните валци са 20 об.мин·¹ (валци I), 21 об.мин-¹ (валци II и III), 22 об.мин'¹(валци IV). След като многовлакнестият кабел е преминал през изплакващите бани, той се изсушава с топъл въздух (7) с температура 55°С и се намотава на рамката (8). Кабелът HYAFF 11 със 60 дение и кабелът ALAFF 11 с 75 дение се

-41 комбинират в пресукващата машина, даваща многовлакнест кабел от HYAFF 11 и ALAFF 11. Многовлакнестият общ кабел след това се пресуква 90 пъти на метър и се изтъкава на стан в гладка трикотажна тъкан с деление 12 (9,10). От стана тъканта се подава в каландъра (11), който я изтънява.

ПРИМЕР 30

Механичните и биологични предимства на многослойните мембрани съгласно представеното изобретение са били показани чрез серия клинични и периодонтални хирургически експерименти, проведени с използуването на материалите, описани в Пример 1, съгласно стандартните ръководни предписания за регенареция на тъканите. Тези предписания изискват, материалът, който ще се постави съгласно подходящите хирургични техники чрез зашиване към мястото на прилагане, да стимулира образуването на нови тъкани, да замести увредените или разрушени при различните периодонтални патологии.

Такива поражения, най-общо представляват загуба на оригиналната структура на периодонталната тъкан и интрофлексия в така образуваните кавитети, в мукогингивалната тъкан. Това води до неправилно оздравяване с отслабващ ефект върху функциите, структурата и стабилността на включените зъбни елементи. Изследвани са два типа дефекти. Първият включва перирадикулярни увреждания от различни видове (на една или повече стени, частично или пълно разкрити бифуркации, кръгли или полукръгли дефекти). Вторите включват костни ръбове, които са твърде фини, за да издържат нормално зъбно заместване или поставянето на имплант. Сравнителни стойности включват цялостта на армираната мембрана по време и място на i

-42нейното прилагане (максималната цялост е обозначена с +++), възпалението на тъканите над мембраната (максималното възпаление е означено с +++), намаляване на дефекта 30 дни след хирургическата намеса (максималното намаление означено с +++) и резорбция на поместения материал (максимална резорбция означена с +++). Таблица 2 показва примери на данни, свързани с хирургичните операции върху хора в клинични експерименти, с използуването на многослойните мембрани, като тези, описани в Пример 27.

ТАБЛИЦА 2

Случай Тип операция Цялост Възпаление Намаляване Резорбция Бр. на дефекти (30 дни)

1	1	+++	+ --	+ + -	++ -
2	1	+++	++ -	+ + -	+ + -
3	1	+++	+ --	+ + +	+ + +
4	1	+++	+ --	+ + -	+ + -
5	1	+++	+ --	++ +	+ + +
6	1	++ +	+ --	+ + -	+ + -
7	1	+++	++ -	++ -	++ -
8	1	++ +	+ --	+ + +	+++
9	1	++ +	+ --	+ + -	++ -
10	1	+ + +	+ --	+ + -	++ -
11	1	+ + +	++ -	+ + -	++ -
12	1	+ + +	+ --	+ + -	++ -
13	2	+ + +	+ + -	+ + +	++ -
14	2	+ + +	+ + -	+ + -	+ --
15	2	+ + +	+++	+ --	+ --
16	2	+ + +	++ -	+ + -	+ --
17	2	+ + +	+ + -	+ + -	++ -

= Перирадикуларни увреждания = Нарастване на костен ръб

Резултатите, показани в Таблица 2 показват, че съставните мембрани съгласно представеното изобретение успешно съчетават биосъвместимостта, биопоглъщането и биоразгращдането с висока степен на механична устойчивост. Тази комбинация от свойства не е представена в други продукти,

-43използувани за същите приложения в периодонталната хирургия, показвайки превъзходството на представените многослойни мембрани пред традиционните продукти.

От така описаното изобретение, става ясно, че същото може да се различава много направления. Тези промени не трябва да бъдат разглеждани като отстъпление от духа и обсега на действие на изобретението и всички такива видоизменения ще бъдат явни за специалистите в областта и трябва да бъдат включени в обсега на действие на дадените по-долу претенции.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Многослойна мембрана, включваща армираща мрежа включена в полимерно свързващо вещество, при което споменатата мрежа е съставена най-малко от един материал, избран от групата, състояща се от хиалуронова киселина или нейно производно или алгинова киселина или нейно производно, а споменатото свързващо вещество е съставено най-малко от един материал, избран от групата, състояща се от хиалуронова киселина или нейно производно, алгинова киселина или нейно производно и желиран полизахарид.
2. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, в която споменатото производно на хиалуроновата киселина е естер на хиалуроновата киселина.
3. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, в която споменатото производно на алгиновата киселина е естер на алгиновата киселина.
4. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, в която споменатият желиран полизахарид е най-малко един член избран от групата, състояща се от хитин, алгинат, цитозан, гелан, синтетично производно на някое от горепосочените съединения, или полусинтетично производно на някое от горепосочените съединения.
5. Многослойна мембрана, съгласно претенция 2, в която споменатият естер на хиалуроновата киселина е застъпен сам или в комбинация с други естери на хиалуроновата киселина.
6. Многослойна мембрана, съгласно претенция 3, в която споменатият естер на алгиновата киселина е застъпен сам или в комбинация с други естери на алгиновата киселина.
7. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, при което споменатата многослойна мембрана включва естер на една отделна хиалуронова киселина или смес от естери на различни хиалуронови киселини.
8. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, при което споменатата многослойна мембрана включва естер на една отделна алгинова киселина или смес от естери на различни алгинови киселини.
9. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, при което споменатата многослойна мембрана включва смес от естер на хиалуроновата киселина и естер на алгиновата киселина.
10. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, при което споменатата многослойна мембрана включва смес от естери на хиалуроновата киселина и естери на алгиновата киселина.
11. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, при което споменатата многослойна мембрана включва смес от естери на хиалуроновата киселина, естери на алгиновата киселина и най-малко един желиран полизахарид, избран от групата, съставена от хитин, алгинат, цитозан, гелан, тяхно синтетично производно и тяхно полусинтетично производно.
12. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, в която споменатата мрежа и споменатото свързващо вещество включват естер на хиалуроновата киселина или нейно производно.
13. Многослойна мембрана, съгласно претенция 12, в която споменатото производно е естер на хиалуроновата киселина.
14. Многослойна мембрана, съгласно претенция 13, в която споменатата мрежа включва етилов естер на хиалуроновата киселина, а споменатото свързващо вещество включва бензилов естер на хиалуроновата киселина.
15. Многослойна мембрана, съгласно претенция 13, в която споменатата мрежа включва бензилов естер на хиалуроновата киселина, а споменатото свързващо вещество включва частичен бензилов естер на хиалуроновата киселина.
16. Многослойна мембрана, съгласно претенция 15, в която споменатият частичен бензилов естер на хиалуроновата киселина е 75% бензилов естер на хиалуроновата киселина.
17. Многослойна мембрана, съгласно претенция 13, в която споменатата мрежа включва етилов естер на хиалуроновата киселина, а споменатото свързващо вещество включва частичен бензилов естер на хиалуроновата киселина.
18. Многослойна мембрана, съгласно претенция 17, в която споменатият частичен бензилов естер на хиалуроновата киселина е 75% бензилов естер на хиалуроновата киселина.
19. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, в която споменатата мрежа включва смес от влакна на бензилов естер на хиалуроновата киселина и бензилов естер на алгиновата киселина, а споменатото свързващо вещество включва частичен бензилов естер на хиалуроновата киселина.
20. Многослойна мембрана, съгласно претенция 19, в която споменатите влакна са в равни количества и в която споменатият частичен бензилов естер на хиалуроновата киселина е 75% бензилов естер на хиалуроновата киселина.
21. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, притежаваща базово тегло между около 8 г/см² и около 50 г/см²; деление (екартеман) от около 0,08 мм до около 0,5 мм; минимална якост на опън при разкъсване в сухо състояние между около 100 кг/см² и около 500 кг/см²; удължение в сухо състояние между около 3% и около 12%; минимална якост на опън при скъсване в мокро състояние между около 30 кг/см² и около 450 кг/см²; удължение в мокро състояние между около 20% и около 60% и якост на скъсване в сухо състояние между около 40 кг/см² и около 200 кг/см² и якост на скъване в мокро състояние между около 20 кг/см² и около 160 кг/см².
22. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, притежаваща базово тегло около 14 г/см²; деление (екартеман) от около 0,25 мм; минимална якост на опън при разкъсване в сухо състояние от около 400 кг/см²; удължение в сухо състояние около 7%; минимална якост на опън при скъсване в мокро състояние около 50 кг/см² и удължение в мокро състояние около 55% и якост на скъсване в сухо състояние около 90 кг/см² и якост на скъване в мокро състояние около 50 кг/см².

Ши*
23. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, притежаваща базово тегло около 10 г/см²; деление (екартеман) от около 0,15 мм; минимална якост на опън при разкъсване в сухо състояние от около 300 кг/см²; удължение в сухо състояние около 4%; минимална якост на опън при скъсване в мокро състояние около 40 кг/см² и удължение в мокро състояние около 45% и якост на скъсване в сухо състояние около 120 кг/см² и якост на скъване в мокро състояние около 60 кг/см².
24. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, в която споменатата армираща мрежа включва многовлакнеста мрежа, съставена от множество кабели от около 30 до 100 снопчета от влакна, като всяко едно от тях е с размери между около 18 мкм и около 35 мкм в диаметър, при което кабелът е с между около 150 и около 400 дение, в него влакната са усукани между около 90 и около 200 пъти на метър и който е преработен в трикотажна тъкан с деление между около 10 и 16.
25. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, в която споменатата армираща мрежа включва многовлакнеста мрежа, съставена от множесто кабели от най-малко 100 снопчета от влакна, при което кабелът е около 237 дение и в който влакната са усукани около 135 пъти на метър и който е преработен в трикотажна тъкан с деление около 14.
26. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, в която споменатата армираща мрежа включва многовлакнеста мрежа, съставена от множесто кабели от около 100 снопчета от влакна, при което кабелът е около 150 дение и в който влакната са усукани около 90 пъти на метър и който е преработен в трикотажна тъкан с деление около 12.
27. Многослойна мембрана, съгласно претенции 2 или 3, в която алкохолът на споменатият естер е фармакологично неактивен алкохол.
28. Многослойна мембрана, съгласно претенция 27, в която споменатият алкохол е алифатен, арилалифатен, циклоалифатен или хетероциклен алкохол.
29. Многослойна мембрана, съгласно претенци 2 или 3, в която алкохолът от споменатия естер е фармакологично активен алкохол.
30. Метод за направлявана регенерация на тъкани, характеризиращ се с това, че включва здраво закрепване на повърхностни или вътрешни увреждания с многослойна мембрана, включваща армираща мрежа, включена в полимерно свързващо вещество, при което споменатата мрежа включва наймалко един материал, избран от групата, съставена от хиалуронова киселина или нейно производно и алгинова киселина или нейно производно и споменатото свързващо вещество включва най-малко един материал, избран от групата, съставена от хиалуронова киселина или нейно производно, алгинова киселина или нейно производно и желиран полизахарид.
31. Метод за получаване на многослойна мембрана, характеризиращ се с това, че включва образуването на армираща мрежа, при което спомената мрежа включва най-малко един материал, избран от групата съставена от хиалуронова киселина или нейно производно и алгинова киселина или нейно производно и нанасяне върху споменатата мрежа на свързващо вещество, включващо най-малко един материал, избран от групата, съставена от хиалуронова киселина или нейно производно, алгинова киселина или нейно производно и желиран полизахарид.
32. Използуването на многослойна мембрана съгласно всяка една от претенциите от 1 до 29 в хирургията за направлявана регенерация на тъкани.