BG62976B1 - Методи и материали за придаване на устойчивост на растенията към болести - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до нуклеинови киселини, кодиращи полипептиди, които придават устойчивост спрямо Xanthomonas spp. Нуклеиновите киселини могат да се използват за продуциране на трансгенни растения, устойчиви на патогенния организъм.

Description

(54) МЕТОДИ И МАТЕРИАЛИ ЗА ПРИДАВАНЕ НА УСТОЙЧИВОСТ НА РАСТЕНИЯТА КЪМ БОЛЕСТИ (57) Изобретението се отнася до нуклеинови киселини, кодиращи полипептиди, които придават устойчивост спрямо Xanthomonas spp. Нуклеиновите киселини могат да се използват за продуциране на трансгенни растения, устойчиви на патогенния организъм.

претенции, 6 фигури (54) МЕТОДИ И МАТЕРИАЛИ ЗА ПРИДАВАНЕ НА УСТОЙЧИВОСТ НА РАСТЕНИЯ КЪМ БОЛЕСТИ

Настоящата заявка представлява частично продължение на US заявка за патент № 08/567 375, в процедура, подадена на 04.12.1995, която от своя страна е частично продължение на временна US заявка № 08/475 891, подадена на 07.06.1995, която от своя страна е частично продължение на US заявка в процедура N9 08/373 374, подадена на 17.01.1995. Посочените заявки са включени в настоящата за сведение.

Област на техниката

Настоящото изобретение се отнася найобщо до растителната молекулярна биология. Поточно се отнася до нуклеинови киселини и методи за придаване на устойчивост на растенията към болести.

Декларация за правото върху изобретения, осъществени при федерално спонсориране за изследвания и развитие

Настоящото изобретение е осъществено с правителствена подкрепа с Решение № GM47907, присъдено от National Instititees of Health и Решение № 9300834, присъдено от United States Department of Agriculture. Правителството има определени права над настоящото изобретение.

Предшестващо състояние на техниката

В много растителни видове са идентифицирани локуси, придаващи резистентност на растенията към болести. Генетичният анализ на значителен брой взаимоотношения растение - патогенен организъм показват, че растенията притежават локуси, които придават резистентност към специфични видове патогенни организми, съдържащи комплементарен авирулентен ген. Молекулярното охарактеризиране на тези гени трябва да предостави средства за придаване на резистентност към болести на широк кръг културни растения.

Тези гени за резистентност към болести, които са охарактеризирани на молекулярно ниво, попадат в четири класа. Един ген, Hml при зърнените растения, кодира редуктаза и действа срещу плесенния патогенен организъм Cochliobolus carbonum (Johal et al., Science 258:985-987 (1992)). При доматите, Pto генът придава ре зистентност към Pseudomonas syringae, който експресира avrPto авирулентния ген (Martin et al., Science 262:1432 (1993)). Очакваният Pto ген кодира серин треонин протеин киназа. Ген Cf-9 при доматите придава резистентност на видове от плесента Cladosporium fulvum, която съдържа авирулентния ген Avr9 (Jones et al., Science 266:789-793 (1994). Ген Cf-9 при доматите кодира предполагаем екстрацелуларен LRR протеин. Накрая, RPS2 гена на Arabidopsis thaliana придава резистентност към Р. syringae, който експресира AvrRpt2 авируленен ген (Bent et al., Science 265:1856-1860 (1994)). RPS2 кодира протеин с LRR мотив и Р-бримка мотив.

Болестта бактериална ръжда, причинена от Xanthomonas spp., инфектира почти всички културни растения и води до значителни загуби на посеви по целия свят. Бактериалната болест ръжда по ориза (Oryza sativa), причинена от Xanthomonas oryzae (Хоо), е значимо заболяване на тази култура. Идентифицирани са видове на Хоо, които индуцират реакции на резистентност или чувствителност при оризовите култури с отделни (Ха) гени на резистентност. Идентифициран е един източник на резистентност (Ха21) в дивия вид Oryza longistaminata (Khush et al., Proceedings of the International Workshop on Bacterial Blight of Rice. (International Rice Research Institute, 1989 и Ikeda et al., Jpn J. Breed 40 (Suppl. 1 ):280-281 (1990)). Xa21 е доминантен локус на резистентност, който придава резистентност на всички известни изолати на Хоо и е единственият, охарактеризиран Ха ген, който принася резистентност на Хоо вид 6. Генетичните и физични анализи на локус Ха21 са идентифицирали голям брой тясно свързани маркери върху хромозома 11 (Roanaid et al., Mol. Gen. Genet. 236:113-120 (1992)). Все още не е идентифициран молекулярният механизъм, по който Ха21 локуса придава резистентност на този патогенен организъм.

Значителни усилия са насочени към клонирането на растителни гени, придаващи резистентност на широк кръг бактериални, плесенни и вирусни заболявания. Само един ген за резистентност към вредители е клониран в едносемеделно растение. Изключително важно е идентифицирането на гените за резистентност към болести в растенията, тъй като културите на едносемеделни растения изхранват повечето хора и животни по света. Настоящото изобретение се отнася до тези и други потребности.

Техническа същност на изобретението

Настоящото изобретение се отнася до изолирани конструкции на нуклеинови киселини, включващи RRK полинуклеотидна последователност, която хибридизира с SEQ. ID. No 1 или с SEQ. ID. No 3, при строги условия. Примерно, RRK полинуклеотидните последователности са Ха21 последователности, които кодират един Ха21 полипептид, както е показано на SEQ. ID. No 4. RRK полинуклеотидната последователност кодира един протеин, притежаващ повтарящ се мотив богат на левцин и/или цитоплазматичен протеин киназен домен. Конструкциите на нуклеинови киселини, съгласно изобретението, могат освен това да включват операционно свързан промотор към RRK полинуклеотидна последователност. Промоторът може да е тъканноспецифичен промотор или конститутивен промотор.

Изобретението се отнася също до структури на нуклеинови киселини, съдържащи промоторни последователности от RRK гена, свързан към хетероложна полинуклеотидна последователност. Като пример, хетероложните полинуклеотидни последователности включват структурни гени, които придават на растенията резистентност към болести.

Изобретението се отнася и до трансгенни растения, включващи рекомбинантна експресионна касета, съдържаща промотор от RRK ген операционно свързан към полинуклеотидна последователност, както и трансгенетични растения, включващи рекомбинантна експресионна касета, съдържаща растителен промотор операционно свързан към RRK полинуклеотидна последователност. Въпреки че може да се използва всяко растение, съгласно изобретението, оризовите и доматени растения са най-подходящи за използване.

Изобретението се отнася и до методи за засилване резистентността на растенията към Xanthomonas. Методите включват въвеждането в растението на рекомбинантна експресионна касета, включваща растителен промотор операционно свързан към RRK полинуклеотидна последователност. Методите могат подходящо да се осъществят с оризови или доматени растения.

Дефиниции

Терминът “растение” включва цялото растение, органите на растението (например, листа, стебло, корени и т.н.), семената и растителните клетки, и неговото потомство. Класът, към който могат да принадлежат използваните в методите растения съгласно изобретението, обикновено е обширен, колкото класът на висшите растения податливи на техниките на трансформиране, като се включват както едносемеделни, така и двусемеделни растения.

“Хетероложна последователност” е такава, която произлиза от чужд вид, или ако е от същия вид, е съществено модифицирана спрямо първоначалната й форма. Например, промотор операционно свързан към хетероложен структурен ген е от вид различен от този, от който произхожда структурният ген, или ако е от същия вид, единият или и двата са съществено модифицирани спрямо тяхната първоначална форма.

“RRK ген” е член на нов клас гени за резистентността на болести, които кодират RRK полипептиди, включващи извънклетъчен LRR домен, трансмембранен домен, и цитоплазматичен протеин киназен домен (както е показано в примерите, RLK5, Pto и Fen (Martin et al., Plant Cell 6:1543-1552 (1994)). Както е използвано тук, един LRR домен е област на повтарящи се единици от около 24 остатъка, както е показано на фигура 1, и открита в Cf-9 и RLK5). Като се използват описаните тук последователности и стандартната хибридизация на нуклеинови киселини и/или техниките на амплифициране, специалистът в областта може да идентифицира членовете на тази група гени. Например, проба нуклеинова киселина от Ха21 гена открива полиморфизъм, който споделя с гена (Pi7) за устойчивост на вредители (Pyricularia oryzae) на 58 рекомбинантни инбредни линии ориз. Същата проба открива, също така, полиморфизъм в почти изогенни линии носители на ха5 и ХаЮ гени за резистентност.

При някои предпочитани варианти за осъществяване на изобретението, гените членове на този клас гени за резистентност на болести могат да се идентифицират по способността им да бъдат амплифицирани чрез разбрадени PCR праймери, които съответстват на домените на LRR и на киназата. Праймери са използват, например за изолиране на хомоложни гени при доматите. Като пример за праймери за тази цел са tcaagcaacaatttgtcaggnca a/g at a/c/t cc (за последователност EQIP на LRR домена) и ataacagcacattgcttgatttnan g/a tcncg g/a tg (последователност HCDIK на киназния домен).

“Xa21 полинуклеотидна последователност” е субпоследователност или полинуклеотидна пос ледователност в цялата си дължина, на един Ха21 ген, като Ха21 гена на ориза, която, когато присъства в трансгенетично растение, му придава устойчивост към Xanthomonas spp. (например, X. oryzae). Като пример за полинуклеотиди, използвани в изобретението се включват кодиращите области на SEQ. ID. No 3. Един Ха21 полинуклеотид има типична дължина от около 3100 нуклеотида до около 6500 нуклеотида, обикновено от около 4000 до около 4500 нуклеотида.

“Ха21 полипептид” е генен продукт на една Ха21 полинуклеотидна последователност, който притежава активността на Ха21, т.е. способността да придава устойчивост към Xanthomonas spp. Ха21 полипептидите, както и другите RRK полипептиди, се характеризират с присъствието на един извънклетъчен домен, включващ област, богата на повторения на левцин (LRR) и/или цитоплазматичен протеин киназен домен. Като пример Ха21 полипептидът, съгласно изобретението, включва SEQ.ID. No 4.

Специалистът в областта ще разпознае при експресирането на трансгените, че инсертираната полинуклеотидна последователност не е нужно да е идентична и може да е “по същество идентична” на последователност от гена, от който тя произхожда. Както е обяснено по-долу, тези варианти се покриват специфично от този термин.

В случаите, когато инсерираната полинуклеотидна последователност се транскриибира и транслира за получаване на функционален RRK полипептид, специалистът в областта ще познае, че поради разпада на кода, голям брой полинуклеотидни последователности ще кодират същия полипептид. Тези варианти специфично се покриват от термина “RRK полинуклеотидна последователност”. Освен това, терминът включва специфично в пълна дължина тези съществено идентични последователности (определени, както са описани по-долу) с RRK генна последователност и които кодират протеини, които задържат действието на RRK протеина. Така, при описания тук случай на RRK гените на ориза, горепосоченият термин включва различни полинуклеотидни последователности, които са съществено идентични на тук описаните последователности, и които кодират протеини, способни да придадат устойчивост към Xanthomonas или към други болести по растенията и вредители при трансгенетичните растения, съдържащи тази последователност.

Два полинуклеотида или полипептидите са “идентични”, когато последователността от нуклеотидни или аминокиселинни остатъци, съответно, в двете последователности е същата, когато е съставена (подредена) от максимален брой съответствия, както е описано по-долу. Терминът “комплементарен на” се използва тук със значението, че комплементарната последователност е идентична на цялата или на част от сравнителната полинуклеотидна последователност.

Сравняването на последователности между два (или повече) полинуклеотида или полипептида се извършва типично, при сравняване на последователности на двете последователности през един сегмент или “сравнителен прозорец”, за да се идентифицират и сравнят локалните области на подобност на последователностите. Използваният сегмент със сравнителна цел може да се състои най-малко от около 20 съседни позиции, обикновено от около 50 до около 200, почесто от около 100 до около 150, в който последователността може да бъде сравнена със сравнителна последователност, съставена от същия брой съседни позиции, след като двете последователности са оптимално подредени.

Оптималното подреждане на последователностите за сравнение може да се проведе чрез алгоритъма за локална хомоложност на Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), чрез алгоритъма за хомоложно подреждане на Needleman and Wunsch J. Mol. Biol., 48:443 (1970), чрез метода на търсене за подобност на Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988), чрез компютърно осъществяване на тези алгиритми (GAP, Bestfif, and Tfasta in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), или чрез проучване.

“Процент на идентичност на последователности” се определя чрез сравняване на две оптимално подредени последователности през сравнителния прозорец, където участъкът от полинуклеотидната последователност в сравнителния прозорец може да съдържа добавки или делеции (т.н. дупки) при сравняване със сравнителната последователност (която не съдържа добавки или делеции) за оптимално подреждане на двете последователности. Процентът се изчислява чрез определяне на броя на позиции, в които идентичните бази на нуклеинови киселини или аминокиселинни остатъци се срещат и в двете последователности, което дава броя на допирни позиции, след което броят на допирни позиции се разделя на общия брой позиции в прозореца за сравнение, а полученият резултат се умножава по 100, за да се получи процента на идентичност на последователностите.

Терминът “по същество идентичен” на полинуклеотидните последователности означава, че полинуклеотидът включва последователност, която има най-малко 60% идентичност на последователност, за предпочитане 80%, още по за предпочитане 90%, а най-предпочетено 95%, сравнено със сравнителната последователност, при използване на програмите описани по-горе (за предпочитане Bestfit) и при използване на стандартни параметри. Специалистът в областта ще отчете, че стойностите могат да бъдат подходящо избрани за определяне съответната идентичност на протеините, кодирани от две нуклеотидни последователности, като се има предвид разпада на кода, аминокиселинната сходност, разположението на рамката на разчитане и други. Идентичност по същество на аминокиселинните последователности за целта, обикновено означава идентичност най-малко в 40%, за предпочитане наймалко 60%, още по-желателно най-малко 90% и най-предпочетено най-малко 95%. Полипептиди, които са “съществено подобни” участват в последователности, както бе отбелязано по-горе, с изключение на това, че позициите на остатъците не са идентични и може да се отличава по консервативни аминокиселинни промени. Консервативните аминокиселинни замествания се отнасят до взаимозаменяемостта на остатъци с подобни странични вериги. Например, група аминокиселини, имащи алифатни странични вериги са глицин, аланин, валин, левцин и изолевцин; група аминокиселини, имащи алифатнохидроксилни странични вериги са серин и треонин; група аминокиселини, имащи амидсъдържащи странични вериги са аспаргин и глутамин; група аминокиселини, имащи ароматни странични вериги са фенилаланин, тирозин и триптофан; група аминокиселини, имащи базични странични вериги са лизин, аргинин и хистидин; и група аминокиселини, имащи съдържащи сяра странични вериги са цистеин и метионин. За предпочитане, групите за консервативните аминокиселинни замяни са: валин-левцин-изолевцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспаргин-глутамин.

Друг белег, че нуклеотидните последователности са по същество идентични е, ако две молекули хибридизират между себе си при подходящи условия. Подходящи условия могат да бъдат силна или слаба строгост, и ще са различни при различни обстоятелства. Обикновено, строгите условия се подбират да са между около 5°С и около 20°С, под термичната точка на топене (Тт) за специфичната последователност, при дефинирани йонна сила и pH. Тт е температурата (при дефинирани йонна сила и pH), при която 50% от последователността мишена хибридизира с идеално пасваща проба. Типично, строги условия на промиване са тези, при които концентрацията на соли е около 0,02 моларна при pH 7 и температурата е най-малко около 60°С. Въпреки това, нуклеиновите киселини, които не хибридизират помежду си при строги условия, са съществено идентични, ако полипептидите, за които те кодират са съществено идентични. Това може да се случи, например, когато копие от нуклеиновата киселина е създадено при използване на максималния разпад на кодони, който се позволява от генетичния код. За хибридизации по Southern, строгите условия за промиване включват наймалко едно промиване в 0,1Х SSC при 65°С.

Нуклеиновите киселини, съгласно изобретението, могат да бъдат идентифицирани от сДНК или геномна банка, получена съгласно стандартни процедури и описаните тук нуклеинови киселини (например SEQ. ID. No 1 или 3) да се използват като проби. Слабите строги условия за хибридизиране включват типично най-малко едно промиване при използване на 2Х SSC при 65°С. Промиванията обикновено са следвани от последващо промиване при използване на IX SSC при 65°С.

Както се използва тук, хомолог на определен RRK ген (например Ха21 гена на ориза, описан тук) е втори ген (или от същия вид или от други видове), който кодира протеин, притежаващ аминокиселинна последователност, която има най-малко 25% идентичност или 45% подобност с (определена, както е описано по-горе) полипептидна последователност от продукта на първия ген. Смята се, че обикновено хомолозите имат общ евулюционен произход.

Кратко описание на фигурите

Фигура 1 представлява сравнение между протеини, богати на повтори на левцин.

Фигура 2A-2F - частична рестрикционна карта на ВАС и клонове на козмиди, съдържащи области, които хибридизират с Ха21-специфични проби.

Фигура 3 - рестрикционна карта на рВ822, най-активното копие.

Фигура 4 - резултатите от изследването за измерване на устойчивостта към Xanthomonas в трансгенетичните растения, съдържащи Ха21 ген от рВ822 клона.

Фигура 5 - позицията на TRK1 на картата.

Фигура 6 - позицията на TRL1 на картата.

Описание на предпочитаните варианти за осъществяване на изобретението

Изобретението се отнася до растителни RRK гени, като Ха21 гените на ориза. Последователностите на нуклеинови киселини от RRK гените, в частност Ха21 гените, могат да се използват за придаване на резистентност на растенията към Xanthomonas и други патогенни организми. Изобретението намира приложение за придаване на резистентност на всички висши растения, чувствителни към патогенни инфекции. Така изобретението се използва в широки граници на видовете растения, включително видове от родовете Juglanus, Fragaria, Lorus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumus, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum и Sorghum.

Разделът, включващ примерите по-долу, в които се описва изолирането и охарактеризирането на Ха21 гените на ориза, е примерен за общ подход за изолиране на Ха21 гените и на други RRK гени. Изолираните гени могат да се използват след това за конструиране на рекомбинантни вектори за прехвърляне експресията на RRK гените в трансгенетични растения.

Обикновено, номенклатурата и лабораторните методи при рекомбинантните ДНК технологии, описани по-долу, са добре известни и широко използвани в състоянието на техниката. Използват се стандартни техники за клониране, изолиране на ДНК и РНК, амплифициране и пречистване. Ензимните реакции, включващи ДНК лигаза, ДНК полимелаза, рестрикционни ендонуклеази и други подобни, обикновено се провеждат според препоръките на производителя. Тези техники, както и много други, обикновено се осъ ществяват съгласно Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (1989).

Изолирането на Xa21 и свързаните RRK гени може да се осъществи при използване на голям брой техники. Например, алигонуклеотидни проби, базиращи се на описаните тук последователности, могат да се използват за идентифициране на желания ген в сДНК или геномна ДНК библиотека. За конструирането на геномни библиотеки се създават големи сегменти от геномна ДНК чрез случайно фрагментиране, например чрез използване на рестрикционни ендонуклеази, и се лигира към ДНК-ов вектор, за да образува конкатамери, които могат да се въведат в подходящ вектор. За приготвянето на сДНК библиотека се изолира иРНК от желаните органи, като листа, а сДНК библиотека, която да съдържа RRK генен транскрипт се получава от иРНК. Алтернативно, сДНК може да се получи от иРНК, отделена от други тъкани, в които се експресират RRK гените или други хомолози.

сДНК или геномната библиотека може след това да бъде скринирана чрез използване на проба, базирана на последователността на клониран RRK ген, като тези на Ха21 гените на ориза, посочени в описанието. Пробите могат да се използват за хибридизиране с геномни ДНК или сДНК последователности, за изолиране на хомоложни гени от едно и също или различни видове растения.

Алтернативно, нуклеиновите киселини, представляващи интерес могат да се амплифицират от проби от нуклеинови киселини, при използване на техниките за амплифициране. Например, техниката на полимеразната верижна реакция (PCR) за амплифициране на последователности от RRK и свързаните гени, директно от геномна ДНК, от сДНК, от геномни библиотеки или сДНК библиотеки. PCR и други методи за in vitro амплификация, могат също да са полезни, например за клониране на последователности на нуклеинови киселини, които кодират за протеини, които ще бъдат експресирани, за да се използват нуклеиновите киселини, като проби за откриване присъствието на желаната иРНК в пробата, за секвениране на нуклеинови киселини или за други цели.

Подходящи праймери и проби за идентифициране на RRK последователности от растителни тъкани се получават при сравнение на посочените тук последователности. За общ преглед на

PCR, виж PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. (Innis, M., Gelfand, D., Sninsky, J. and Whitw, T., eds.), Academic Pres, San Diego (1990), включени тук за справка.

Полинуклеотидите могат да се синтезират, също така, по добре изместени техники, както се описва в техническата литература. Виж например, Carruthers et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418 (1982), и Adams et al., J. Am. Chem. Soc. 105:661 (1983). След това могат да се получат двойноверижни ДНК фрагменти или чрез синтезиране на комплементарната верига и хибридизиране на веригите помежду си, при подходящи условия, или чрез добавяне на комплементарната верига, при използване на ДНК полимераза с една подходяща праймерна последователност.

Изолираните последователности, получени, както е описано, могат след това да се използват за осигуряване на експресия на RRK гена и следователно за резистентност към Xanthomonas в желаното растение. Специалистът в областта ще се съгласи, че нуклеиновите киселини, кодиращи функционален RRK протеин (например SEQ. ID. No 2 и 4) нямат нужда да са с последователност, идентична на тази на описания тук примерен ген. Освен това, полипептидите, кодирани от RRK гените, както и другите протеини, притежават различни домени, които осъществяват различни функции. Следователно, не е необходимо RRK гениите последователности да са в пълна дължина, а толкова дълги, колкото желаният функционален домен на протеина се експресира. Както се обяснява в детайли по-долу, протеините, съгласно изобретението включват екстрацелуларен домен, богат на повтори на левцин, както и един интрацелуларен киназен домен. Модифицираните белтъчни вериги могат също така лесно да бъдат конструирани, при използване на различни рекомбинантни ДНК техники, добре известни на специалистите в областта. Веригите, например, могат да се различават от естествено срещащата се в природата последователност на първичното структурно ниво по аминокиселинни замествания, делеции, прибавяния и други подобни. Модификациите могат да включват също така и заменени домени на протеина, съгласно изобретението, със сродни домени от други гени за резистентност на вредители. Например, извънклетъчния домен (включително богатия на повтори на левцин участък) на протеините, съгласно изобретението, може да бъде заместен от този същия ген Cf-9 на домата, като по този начин се осигури устойчивост към плесенните патогенни организми на ориза. Тези модификации могат да се използват в голям брой комбинации за получаване на крайната модифицирана белтъчна верига.

За да се използват изолираните RRK последователности при посочената техника, се приготвят рекомбинантни ДНК-ови вектори, подходящи за трансформиране растителни клетки. Техниките за трансформиране на голямо разнообразие висши растения са добре известни и описани в техническата и научната литература. Виж например, Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988).

За конструиране на рекомбинантна експресионна касета, която да може да се въведе в желаното растение, се използва ДНК последователност, кодираща желания RRK полипептид, например сДНК или геномна ДНК или геномна последователност, кодираща цялата дължина на протеина. Типично една експресионна касета включва RRK полинуклеотид, операционно свързан към регулаторните последователности за иницииране на транскрипцията и транслацията, които последователности насочват транскрипцията на последователността от RRK гена в предвидената тъкан на трансформираното растение.

Може да се използва, например фрагмент от растителен промотор, който насочва експресията на RRK във всички тъкани на регенерираното растение. Такива промотори се посочват в описанието, като “конститутивни” промотори и са активни при повечето условия на околната среда и етапи на развитие или клетъчна диференциация. Примери за конститутивни промотори включват областта за иницииране на транскрипцията на вируса на мозайката по карфиола (CaMV) 35S, Г- или 21’-промотор, получен от Т-ДНК на Agrobacterium tumefaciens, както и други области за инициация на транскрипцията от различни растителни гени, известни на специалистите в областта.

Алтернативно, растителният промотор може да насочва експресията на RRK гена в специфична тъкан или иначе може да е под по-прецизния контрол на заобикалящата среда и на развитието. Такива промотори се означават в текста като “индуцируеми” промотори. Примери за условия на околната среда, които могат да въздействат над транскрипцията чрез индуцируеми промотори включват атаки на патогенни организми, анаеробни условия или наличието на светлина.

Примери за промотори под контрол на раз7 витието включват промотори, които инициират транскрипцията само на определени тъкани, като например листата, корените, плодовете, семената или цветовете. Действието на промотора може да зависи, също така, от неговото разположение в генома. По този начин един индуцируем промотор може да се превърне в напълно или частично конститутивен при определено разположение.

Ендогенните промотори от RRK гените, съгласно изобретението, могат да се използват за насочване експресията на гените. Промоторите могат, също така, да се използват за насочване експресията на хетероложни структурни гени. Така, промоторите могат да се използват в рекомбинантни експресионни касети за провеждане на експресията на гени, придаващи резистентност към голям брой патогенни организми, включително плесени, бактерии и други подобни.

За идентифицирането на промоторите се анализират 5’ участъците на описаните клонове за последователности, характерни за промоторни последователности. Например, елементите на промоторни последователности включват ТАТАблок консенсусна последователност (ТАТААТ), която обикновено се състои от 20 до 30 бази двойки в посока възходящо от мястото на начало на транскрипцията. При растенията, по-нататък в посока възходящо от ТАТА-блока, в позиции - 80 до 100, има типичен промоторен елемент със серия аденини, заобикалящи тринуклеотида G (или Т) NG. J. Messing et al., in Genetic Engineering in Plants, pp. 221-227 (Kosage, Meredith and Hollander, eds. 1983).

Ако се желае същинска полипептидна експресия трябва да се включи област на полиаденилация в 3’-края на RRK кодиращата област. Областта на полиаденилация може да се получи от съществуващия в природата ген, от голям брой други растителни гени, или от Т-ДНК.

Векторът, съдържащ последователностите от един RRK ген, типично включва маркерен ген, който придава фенотип за селекция на растителни клетки. Маркерът, например, може да кодира резистентност на биоциди, в частност резистентност на антибиотици, като например резистентност на канамицин, G418, блеомицин, хигромицин, или резистентност на хербициди, като например резистентност на хлоросулфорон или Basta.

Подобни ДНК конструкции могат да се въведат в генома на желаното растение-госто приемник, при използване на голямо разнообразие от конвенционални техники. ДНК конструкцията може, например, директно да се въведе в геномната ДНК на растителната клетка, чрез използване на техники като електропорация, PEG порация, бомбардиране с частици и микроинжектиране на протопластите на растителни клетки или ембриогенен калус, или ДНК конструкциите могат директно да се въведат в растителната тъкан чрез използване на балистични методи, като например бомбардиране с ДНК-ови частици. Алтернативно, ДНК конструкциите могат да се комбинират с подходящи Т-ДНК крайни участъци и да се въведат в конвенционален вектор на гостоприемник Agrobacterium tumefaciens. Функциите на вирулентност на гостоприемника Agrobacterium tumefaciens ще насочват въвеждането на конструкцията и на прилежащите маркери в ДНК на растителната клетка, когато клетката е инфектирана с бактерията.

От състоянието на техниката са известни техники на трансформиране и са добре описани в научната и патентната литература. Въвеждането на ДНК-ови конструкции при използване на утаяване с полиетиленгликол се описва в Paszkowski et al., Embo J. 3: 2717-2722 (1984). Техники на електропорация се описват в Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824 (1985). Техниките на балистично трансформиране са описани в Klein et al., Nature 327:70-73 (1987). Чрез използване на голям брой различни подходи могат да се трансформират видове от зърнени растения, като ръж (de la Pena etal., Nature 325:274-276 (1987)), жито (Rhodes etal., Science 240:204-207 (1988)) и ориз (Shimamoto et al., Nature 338:274-276 (1989) чрез електропорация; Li et al., Plant Cell Rep. 12:250-255 (1993) чрез балистични техники).

Техники на трансформиране с помощта на Agrobacterium tumefaciens са добре описани в научната литература. Виж, например, Horsch et al., Science 233:496-498 (1984), and Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983). Въпреки че Agrobacterium е използван първоначално при двусемеделните растения, някои едносемеделни растения могат да бъдат трансформирани чрез Agrobacterium. Например, трансформирането на ориза чрез Agrobacterium е описано от Hiei et al., Plant J. 6:271-182 (1994).

Трансформираните растителни клетки, които са получени, по която и да е от описаните техники на трансформиране, могат да се култивират за регенериране на цяло растение, което има трансформираният генотип и по този начин и желаният контролиран от RRK фенотип. Така, техниките на регенериране се основават на манипулации на някои фитохормони в растежна среда за тъканна култура, като типично се основава на биоцидни и/или хербицидни маркери, които могат заедно да се въведат в RRK нуклеотидни последователности. Регенерирането на растение от култура на протопласти се описва от Evans et al., Protoplast Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; and Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 2173, CRC Press, Boca Raton, 1985. Регенерирането може да се осъществи също така, от калус на растение, експлант, органи или техни части. Такива техники на регенериране са описани найобщо от Klee et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486 (1987).

Методите, съгласно настоящото изобретение, са изключително подходящи за инкорпориране на RRK полинуклеотиди в трансформирани растения, по начин и при обстоятелства, които не се срещат естествено в природата. По-точно, RRK полипептидите могат да се експресират в определено време или в количества, които не са характерни за естествено съществуващите в природата растения.

Специалистът в областта ще отчете, че когато експресионната касета е стабилно инкорпорирана в трансгенетичните растения и е потвърдено, че е способна да действа, тогава може да се въведе в други растения чрез полово кръстосване. Може да се използва коя да е от стандартните техники на кръстосване, според това какви видове трябва да се кръстосат.

Ефектът на модифицирането на експресията на RRK гена може да се измери чрез определяне на нарастването или намаляването на нивото на иРНК, като се използва например, Northem-блот. Освен това, фенотипичните ефекти на генната експресия могат да се установят чрез измерване на дължината на лезия в растенията. По-долу се описват подходящи изследвания за определяне на устойчивостта.

Примери за конкретно изпълнение

Следващите примери са представени като илюстративен материал, а не за ограничаване.

Пример 1. Растителни гени могат, също така, да се изолират чрез използване на методи, основаващи се на картиране. Тази стратегия се състои в идентифициране на ДНК маркери, които са тясно свързани с гена или гените, представляващи интерес. Едно изискване за успеха на клонирането, основаващо се на картиране и на физичния анализ на големи хромозомни участъци, е достъпността на библиотеки, съдържащи големи инсерти от геноман ДНК. Наскоро Shizuya, Н., et al.. Proc. Natl. Acad. Sci.89, 8794-8797 (1992), описват бактериална изкуствена хромозомна (ВАС) система за клониране на големи ДНК фрагменти от човешкия геном. Тази система използва един вектор, основаващ се на F-фактор и е способна да задържа фрагмент от човешка геномна ДНК над 300 kb. ДНК може да се клонира с висока ефикасност, лесно да се манипулира и стабилно да се поддържа в E.coli. Следното представлява описание на използването на тази техника за изолиране на гените съгласно изобретението.

Изолиране на ВАС и на козмидни клонове, пренасящи ВАС клонове, свързани с Ха21 последователности

А. Материали и методи

Приготвяне на ДНК с висок молекулно тегло от ориз

Като растителен материал се използва International Rice Research Institute (IRRI) оризова линия IR-BB21, носителка на Ха21. Растенията се отглеждат в оранжерия в продължение на 3-5 седмици. Взима се листната тъкан, която се промива с дестилирана вода преди да се смели. ДНК с високо молекулно тегло се екстрахира от тъканта на ориза по същество, както е описано от Hatano, S., et al., Plant Sciences, 83,55-64, (1992) and Zhang, H.B., etal., Plant J.7:175-184 (1994), със следните модификации: приблизително 20 g тъкан от листата се смилат на прах, чрез използване на студено хаванче и пестик в течен азот. Прахът се суспендира чрез разбъркване в 200 в ml студен буфер за ядрена екстракция (NE) (1 ММ спермидин, 1 тМ спермин, 10 тМ Na2 EDTA, 10 тт основа Trizma, 80 тМ КС1, 0,5% TritonX 100 и 0,4 М захароза, pH 9,4). Сместа се филтрира през два слоя марля в GSA колба и се центрофугира при 120 g за 20 min при 4°С. Супернатантата се излива, а утайката (пелета) от ядра (бледозелени) се ресуспендира в 150 ml студен NE буфер. Ресуспендираната утайка се филтрира след това през 80-микроново сито в 50т1-ова епруветка за отстраняване на отломките от зелената тъкан, след което се центрофугира при 1000 g в продължение на 10 min. Утайката се ресуспендира и центрофугира, както по-горе, но без да се пропуска през 80-микронното сито. Пелетата от ядра (около 5 х 10⁸ ядра/ml) се ресуспендира в 2,5 ml SCE буфер 1М сорбитол, 0,1 М Na-цитрат, 60 mM EDTA, pH 7,0) и се инкорпорира в 2,5 ml топяща се при ниски температури (LMP) 1 % агароза (Ultrapure). 80 μΐ manu се инкубират в 25 ml разтвор на ESP (0,5 М EDTA, pH 9,3, 1 % натриев лаурел саркозин, 5 mg/ml протеиназа К, Boehringer Mannheim) при 50°С в продължение на два дни, с една смяна на буфера. Всяка тапа съдържа около 5 g ДНК.

Частично смилане на ДНК с висока молекулна маса и фракциониране по размер чрез PFGE

Тапи от агароза се диализират двукратно срещу ТЕ (10 mm Tris-HCl и 1 mM EDTA, pH 8,0) плюс 1 mm PMSF (фенилметил сулфонил флуорид) при 50°С в продължение на 1 h, след което двукратно се уравновесява с Hindlll буфер (50 mM NaCl, 10 тМ Tris-HCl, 10 тМ MgC12 и 1 тМ дитиотреитол, pH 7,9) при стайна температура в продължение на 1 h. Тапите се разтопяват при 65°С в продължение на 15 min и се поддържат на 37°С за 5 min преди частичното смилане. Към разтвора на ДНК се прибавят от пет до седем единици от Hindlll (NEB, USA) на тапа и се инкубират при 37°С в продължение на 30 min. Реакцията се спира чрез прибавяне на 1 /10 обема 0,5 М EDTA, pH 8,0. Частично смляната ДНК веднага се прехвърля върху 0,8% LMP агарозен гел с пипетата, отрязан така, че вътрешният диаметър да е 2 mm, и се разделя чрез PFGE (CHEF DR II system, Biorad, USA). За конструирането на библиотеката се използват два различни PFGE метода. Първо гелът се подлага на електрофореза при 150 V, при използване 8 s първоначално и 8 s крайно време на прекъсване за 16 h при 14°С. Неразтворената ДНК (около 200 kb) се концентрира в тънка ивица. След това гелът се подлага на електрофореза при 150 V, времето за прекъсване се променя от 60s на 90s в продължение на 16 h, при 14°С. И при двата метода гелът, съдържащ частично смляната ДНК се срязва и се потапя в ТЕ, докато се оцветят ивиците на маркера с етидиев бромид. Агарозният срез, съдържащ фрагмент по-големи от 20 kb (първият PFGE метод) или агарозният срез, съдържащ 250-300 kb (вторият метод) се изразяват от гела. Агарозният срез се поставя за уравновесяване в ТЕ за 2 h при 4°С, поставя се в 1,5 ml-ова епруветка, разтопява се при 65°С за 10 min, смила се с Gelase (Epicentre, USA) (една единица ензим на 100 mg агароза) и се инкубира при 45°С за 1 h. Разтворът на ДНК директно се използва при реакцията на лигиране.

Изолиране и приготвяне на вектор, и реакция на лигиране

Вектор, pBeloBAC II е доставен от Dr. Н. Shizuwa и M.Simon (California Institute of Technology, USA). Този вектор съдържа lacz ген, който е инсериран във вектор pBAC108L. Shizua et al., (1992). Единична колония се инокулира в 5 ml LB среда, съдържаща 12,5 μΐ/ml хлорамфенникол и се култивира при 37°С в продължение на 4-5 h преди да се добавят 6 1 LB среда. Инокулумът се развива около 16 h при 37°С до OD^o™ 1,3-1,5 х (оптическа плътност). 1,3-1,5 х (оптическа плътност). Плазмидът се изолира при използване на комплект Qiagen’s plasmid maxi isolation (Qiageh, USA). Векторната ДНК понататък се пречиства чрез равновесно центрофугиране в цезиев хлорид/етидиев бромид при 45 000 rpm pd 60 h. Скоростта на ротора се намалява до 35 000 rpm за 1 h, за да се позволи на градиента да се установи, като се използва “ангьр” ротор 70,1 (Beckman, USA). Плазмидът се смила с Hindlll до изчерпване и се изследва чрез гелна електрофореза. Краищата на вектора се дефосфорилират с НК фосфатаза (Epicentr, US) при 30°С за 1 h, при използване на 1 единица ензим на 1 pg векторна ДНК. НК фосфагазата се инактивира чрез нагряване до 65°С за 30 min. Лигирането се осъществява в обем от 100 μΐ, в който около 40 ng от избраната по размер оризова ДНК (около 85 μΐ) се лигират с 10 ng смлян с Hindlll вектор (1 μΐ) моларно отношение от около 10 към 1 при вектор в излишък) с 400 единици Т4 ДНК лигаза (NEB, USA) при 16°С цялата нощ Преди трансформирането, лигиращата смес се диализира срещу ТЕ в ULTRAFREE-MC филтърна епруветка (Millipore, USA) при 4°С цялата нощ.

ВАС трансформация

Трансформацията на компетентни E.coli DH10B клетки (GIBCOBRL, USA) се провежда чрез електропорация, при използване на CellPorator (GIBCO-BRL,USA) при следните параметри: напрежение: 400; скорост на зареждане: бързо; напрежение върху бъстърното съпротивление: 4 000; капацитет: 330 μΡ; импеданс: нисък. Тринайсет μΐ компетентни клетки се смесват с 0,5-01,0 μΐ разтвор за лигиране за всяка електро порация. След електротерапията клетките се преместват в 1 ml SOC разтвор (2% Bacto триптон, 0,5% Bacto дрождев екстракт, 10 ММ NaCI, 2,5 mM КС1, 10 тМ MgCl₂, 10 тМ MgSO₄, 20 тМ глюкоза, pH 7,0) и се инкубират при 37°С при леко разбъркване (90-95 грт) за 45 min. Клетките се посяват върху LB петрита, съдържащи хлорамфеникол (12,5 pg/ml) X-gal (400 g/ml) и IPTG (изопропилтио-р-О-галактозид) (0,072 g/ml). Петритата се инкубират в продължение на 24 h при 37°С. Бели колонии, съдържащи инсърти на оризовата ДНК с прехвърлят на нови LB петрита за второ отсяване по цвят. ВАС клоновете се прехвърлят в микротитърни панички с 384 ямки (Genetix, UK), съдържащи 60 μΐ ледена LB буфер (36 mM К₂ НРО₄, 1,2 тМ КН₂ РО₄, 1,7 тМ цитрат, 0,4 ММ MgSO₄,6,8 mM (NM₄)₂SO₄,4,4% об/об глицерол, 12,5 g/ml хлорамфеникол, LB) и се инкубират при 37°С в продължение на 245 h. Тъй като над 95% от колоните са все още бели при второто отсяване, използва се само едно отсяване при последващите експерименти, а белите колонии директно се прехвърлят в 384-ямкови титърни блюда. Библиотеката се реплицира в повторение и се съхранява в два различни фризера при -80°С.

Подготовка на филтрите

ВАС клоновете във всяка 384-ямкови микротитърна паничка се реплицират в Hybond N⁺ филтър (Amersham, USA). Филтърът се поставя в пластмасова кутия, съдържаща LB/arap с 12,5 pg/ml хлорамфеникол и кутията се оставя при 37°С за една нощ, докато колониите станат с диаметър около 2-3 nm. Филтрите се обработват, както бе описано. Nizetic, D., et al., Nucl. Acids. Res. 19, 182 (1990); J.D., etal., Cell, 73, 109-120 (1993). Условията за хибридизация и за промиване са същите, както са описани от Hoheisel, et al., (1993). Пробите се бележат чрез произволно праймерно разширение. Feinberg, А.Р. and Vogelstein, L, Anal. Biochem. 132,6-13 (1983); Addendun 137,266-267 (1984).

В. Резултати

Описаната по-горе ВАС библиотека се състои от 11 000 клона. Библиотеката се конструира като се използват два различни подхода. Едната половина на библиотеката, която съдържа 7269 ВАС клона, е изготвена чрез подбор на един размер, при използване на метода на зоната на компресия, както е описано от Ramsay, М. and Wicking, С., Protocol in Human Molecular Genetics, 197-221 (1991). Втората половина от библио теката, съдържа 3731 клона бе получена при използване на селекция по два размера на частично смляна ДНК. Селекцията по два размера все пак не успя да увеличи средния размер на ДНК инсертите. Очевидно, все още присъстват малки ДНК молекули в разтвора на ДНК подбрана по размер (само 250-350 kb изолирана ДНК). Последващите експерименти сочат, че подбора на ДНК по два размера между 350-500 kb за лигиране, дава по-голяма средна стойност на размера на инсертите във ВАС клоновете. От библиотеката се избират над 54 произволни ВАС клона, като 50 клона съдържат оризовата ДНК (93,0%). Някои от клоновете (7%) не съдържат инсерги. Размерът на ДНК инсертите е от 30-250 kb.

Използваните ДНК с високо молекулно тегло за конструиране на ВАС библиотеката се изолират от пречистени ядра на ориз. Повечето хлоропласти и митохондрии се отстраняват чрез нискооборотно центрофугиране (по-ниско от 1000 g). Ниската честота на клонове на хлоропласти и митохоццрии, открити в създадената ВАС библиотека (по-малко 0,3%) намалява възможността от колигиране между органело/ядрена ДНК.

ВАС библиотеката се използва за конструиране на набор от съседни клонове, разпростиращи се около Ха21 локуса. Два ДНК маркера свързани с Ха21, RG103 (1 kb, виж Ronald, et al., Mol. Gen. Genet. 236&113-120 (1992) и pTA818 (1,2 kb, еквивалентен на RAPD818 в Roanaid, et al.,) се използват за скриниране на ВАС библиотеката. RG103 е открит в 8 копия в линията, съдържаща Ха21 и хибридизира с 8 геномни Hindlll ДНК фрагмента в същата линия. Всички тези фрагменти са генетично и физически свързани с Ха21 лоукса за устойчивост към болести. рТА818 хибридизира с 2 фрагмента ДНК, като най-малко един от тези фрагменти е свързан с Ха21 локуса. Ronald, et al., (1992).

7296 ВАС клона се изследват за хибридизация с пробите рТА818 (2 копия) и RG103 (8 копия). Идентифицирани са седми и пети от ВАС клоновете, които хибридизират съответно с RG103 и рТА818. Изолира се ВАС ДНК от тези клонове и се смила с Hindlll. Фрагментите ДНК се разделят чрез PFGE. Анализът по Southern показва, че хибридизиращите с RG103 седем ВАС клона са натоварени с четири различни копия на RG103 геномни Hindlll фрагменти. Пробите се хибридизират с 4,3 kb ДНК, фрагмент и 9,5 kb фрагмент, 9,6 kb фрагмент и 6,2 kb фрагмент. Размерът на ДНК фрагментите се определя от ламбада ДНК смляна с Hindlll.

Изолирани са четири ВАС клона, които носят едно копие на рТА818 Hindlll фрагмента и е идентифициран един ВАС клон, който съдържа другото копие. Един от ВАС съдържащите рТА818 също хибридизира с маркера РТА248 (еквивалентен на RAPD248 in Roanaid, et al., (1992), като потвърждава по този начин, че тези два клонирани RAPD маркера са на 60 kb един от друг. Ronald, et al., (1992).

Идентифицирането на 12 ВАС клона, хибридизиращи с две клониарни ДНК последователности (съответстващи на 10 ДНК фрагмента в генома на ориза) е незначително по-ниско от това на очакваните 20 клона, основаващо се на скрининг 2 х геномни еквиваленти (7296 клонове, 450 000 kb геном, 125 kb среден размер на инсертите). Специфично, рТА818 последователностите и четири (от осем) от RG103 хибридизиращите последователности, са силно представени в този участък на библиотеката. В противовес, останалите четири RG103 хибридизиращи последователности са с ниско представяне. Размерът на ДНК инсертите на тези клонове включва от 40 до 140 kb.

Козмидни клонове

А. Материали и методи

Приготвяне на ДНК с високо молекулно тегло (ВМТ) от листа на ориз

Линията ориз 1188, носеща Ха21 лоукса, се използва като растителен материал за изолиране на ВМТ ДНК. Взимат се 120 g 4-6 седмична тъкан от листа и се смилат на фин прах, в течен азот, при използване на студено хаванче и пестик. След това прахът се суспендира чрез разбъркване в 800 ml студен Н буфер [4 mM спермидин, 1 тМ спермин, 10 mM EDTD, 10 тМ Tris-HIl, 80 тМ КС1, 0,5 М захароза, 1 тМ PMSF (фенилметил сулфонил флуорид, прибавен непосредствено преди употреба), 0,5% (об/об) Triton-X 100, 1/100 (об/об), β-меркаптоетанол (прибавен непосредствено преди употреба), pH 9,5]. Сместа се филтрира през 80 = микроново сито в GSA колби и утайката се ресуспендира в 400 ml Н буфер и отново се филтрира. Двата отфилтрирани обема се смесват и се центрофугират при 3500 rpm за 10 min при 4°С. Утайката (пелетата) се ресуспендира в 300 ml промивен буфер (същия, както Н буфера, с изключение на PMSF и -меркаптоетанола) и се центрофугира на 3500 rpm за 10 min при 4°С. Утайката се промива допълнително още два пъти, докато цветът й стане бледозелен. Пелетата се ресуспендира в 40 ml про мивен разтвор и ядрата се лизират чрез добавяна на равен обем буфер за лизис (2% лаурел саркозин, 100 mM Tris-HCl, 0,5 М EDTA, pH 9,5), съдържащ 2 mg/ml протеиназа К 9Borhringer Mannheim |. Протеините се отделят чрез инкубиране при 50°С в продължение на 5 h, с последваща екстракция на разтвора (чрез мека инверсия) с равен обем фенол-хлороформ-изоамилов алкохол (24:24:1) за 10 min при стайна температура. ВМТ ДНК се утаява чрез внимателно нанасяне на 1/10 об.З М натриев ацетат (pH 5,5), 2 об. етанол, с няколкократно инвертиране. Найнакрая ДНК се отделя от етанола чрез използване на пипета с широк отвор, промива се със 70% етанол, изсушава се и се разтваря в 1 ml ТЕ (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) при 4°С за цялата нощ, без разклащане. Нормално от 120 g листа могат да се изолират 250 pg ВМТ ДНК.

Получаване на инсерционна ДНК (A) Частично смилане на ВМТ ДНК Пилотен експеримент. 30 ug (70 ul) ВМТ

ДНК се смесват с 10 ul 10 х Sau буфер (NEB) и предварително се нагряват до 37оС за 5 min. След това към ДНК разтвора се прибавят 20 ul (2 единици) Sau3AI, внимателно се разбърква с пипета с широк отвор и се инкубира при 37°С. Отделят се 15 ul аликвотни части в 0, 5, 10, 20, 30 и 70-та min, като моментално се примесват с 5 ul 0,5 М EDTA (pH 8,0) върху лед, за спиране на реакцията. Пробите се анализират чрез електрофореза върху 0,3% агароза/ТВЕ гел при 2V/cm дължина на гела в продължение на 36 h в хладилна камера.

Широкомащабното частично смилане на ДНК се осъществява чрез повторение на пилотния експеримент, при използване на оптимизирано време на интервалите за инкубация от 20 min при 37°С.

(B) Селекция по размер частично смляната ДНК се фракционира върху захароза с плътностен 1радиент от 5% до 40% чрез центрофугиране на SW27 ротор при 26 000 rpm при 20оС в продължение на 13 h. Отделят се 0,8 ml-ови фракции (общо 20) чрез внимателно поставяна на капилярна епруветка на дъното на центрофужната епруветка и изпомпване на градиента при много ниска скорост. 20 ul от всяка проба се изследват върху 0,3% агарозен гел при 2V/cm дължина на гела в продължение на 36 h. Фракциите ДНК с приблизително 35-50 ub се събират заедно. След разреждане на захарозата е равен обем Н₂О, ДНК се утаява с два обема етанол. Частичното изпълнение на реакцията се осъществява при използване на стандартни протоколи.

Лигиране, пакетиране и трансфектиране

Козмидния вектор рНС80 бе любезно предоставен от Dr. Scot Hulbert. Векторът и инсерираната ДНК се лигират в отношение 1 към 2, при крайна концентрация 0,8 ug/ml. Реакцията на лигиране се осъществява с 600 единици Т4 ДНК лигаза (NEB, USA) при 16°С през цялата нощ. Лигираната ДНК in vitro се пакетира с Gigapackll екстракт за пакетиране (Staratagene, USA) и се трансфектира в компетентни клетки E.coli NM554, съгласно препоръките на Stratagene.

Скрининг на библиотеката

61440 колонии козмиди (повече от пет геномни еквивалента) в 160 микротитърни блюда с по 384 ямки се прехвърлят върху Hybond N + филтри (Amersham, US) с два вида плътност. При първия метод козмидните клонове се репликират при ниска плътност (1536 колонии /11,5 х 15 cm филтър) чрез използване на ръчен репликатор (Genetix, U.K.) и се култивират една нощ върху LB\arap със 100 ug/ml ампицилин. Четиридесет филтъра са подготвени така, че да покриват цялата козмидна библиотека. При втория метод, козмидните клонове се репликират на площ с висока плътност, при използване на Beckman Biomek™ роботна установка за работа, и се култивират, като се използва същият метод, както по-горе. Използва се площ 3x3, като 3456 колонии се прехвърлят върху филтри с размери 8,5 х 12 cm. С цел съвсем точно да се локализират положителните колонии върху отрицателния фон, в първа позиция на всяка мрежа 3 х 3 се посява сравнителна козмидна колония (съдържаща RG103 маркер). В оставащите осем позиции се посяват колонии от осем микротитърни панички от козмидната библиотека. В този случай, 20 филтъра с размер 8,5 х 12 cm всеки, могат да покрият цялата библиотека. При хибридизиране с една единствена проба, RG103 пробата се смесва с единствената проба в отношение 1:4, за получаване на сравнителната матрица.

Бактериите върху филтрите се лизират и фиксират чрез използване на техниката на банята с водна пара със следните модификации: колониите се поставят с лицето нагоре върху две парчета 3 ММ Whatman напоени в разтвор за лизис (0,5 М NaOH, 1,5 М NaCl) за 4 min при стайна температура, пластмасовите кутии съдържащи филтрите се инкубират в баня на водна пара при 85°С за 6 min, след което филтрите се прехвърлят на 3 ММ Whatman напоени с неутрализиращ буфер (1 М Tris-HCI (pH 7,4), 1,5 М NaCl) за 4 min. Белтъчините и клетъчните отломки се отстраняват чрез натапяне в 50 ml в разтвор на протеиназа К (50 mM Tris-HCI (,Н8,5), тМ EDTA (pH 8,0), 100 тМ NaCl, 1 % (тегло/обем) Na-лаурил-саркозин, 250 ug/ml протеиназа К) и се инкубира за 20 min при 37°С. Филтрите се промиват внимателно в 2 х SSC разтвор в продължение на 5 min при стайна температура, изсушават се и се облъчват с UV при 10 cm за 2,5 min.

Хибридизацията се осъществява съгласно стандартните методи, както следва: Филтрите се поставят в разтвор за предварителна хибридизация (7% SDS, 0,5 М Na₂PO₄ (pH 7,2) 1 тМ EDTA, 100 ug/ml ssflHK) при 65°С от два часа до една нощ. Пробите се бележат чрез използване на метода на произволно праймерно разширение и хибридизацията се осъществява при 65°С за една нощ при разбъркване. Филтрите за кратко време се промиват в (40 mM Na₂PO₄ (pH 7,2), 0,1 % SDS) при стайна температура и се инкубират в същия разтвор при 65°С за 20 min при леко разбъркване.

В. Резултати

За скриниране на козмидната библиотека се използват три маркера свързани с Ха21 (RG103, RAPD 284 и RAPD 818). Геномен анализ по Southern показва, че броят копия на тези три маркера в резистемнтни линии са 8, 1 и 2, съответно (непубликувани резултати). Изентифицирани са и са потвърдени чрез анализ по Souhem шест положителни козмидни клона, хибридизиращи с RG103 маркера. Въпреки това не са идентифицирани положителни клонове, които да съдържат RAPD248 и RAPD818.

Пример 2. Охарактеризиране на Ха21 гените

Пет козмидни клона и един ФАС клон, изолиран в пример 1, се охарактеризират понататък чрез картиране с рестрикционни ензими. Фигури от 2А до 2Е представляват частични рестрикционни карти на козмидните клонове. Фигура 2F представлява частична рестрикционна карта на ВАС клона.

Идентифицирана е отворена четяща рамка (SEQ.ID.No 1) в един от клоновете. Тя включва промоторната област, предсказания (очаквания) интрон и частична 3’ последователност SEQ. ID No 2 показва предсказаната аминокиселинна последователност. Присъединен е предсказаният интрон.

Предсказаната аминокиселинна последователност показва две характеристики на белтъка, което показва, че е кодиран от гени членове на новия клас гени за резистентност на растенията на болести, тук посочени като RRK гени. Първо, извънклетъчният домен на протеините, кодирани от тези гени, включва блок от около 23 тандема на богати на левцин повтори (LRR или БЛП) със средна дължина от 24 аминокиселини. БЛП мотива се включва в протеин-протеини взаимодействията и свързва лиганда в голям брой протеин. Извънклетъчният домен включва, също така, област между RRK и сигналния пептид, която съдържа мотив, SWNTS, който се запазва сред известен брой протеини, включително Cf-9, PGIP и RLK5. Освен това, протеинът съдържа област с висока идентичност на последователността с наподобяващата рецептор протеинкиназа (RLPKs), като RLK5 и ТМК1 (Walker et al., Plant J. 3:451 (1993); Chang et al., Plant Cell 4:1263 (1992); Valon et al., Plant Molec. Biol. 23:415 (1993)), тъй както и при продукта на гена за резистентност на домата, Pto (Martin et al., Science 262:1432 (1993). Сигналният домен, екстрацелуларният домен (включително и RRK областта), трансмембранният домен и домена на ицитоплазматичната киназа, се идентифицират в SEQ.ID. No 2.

Фигура 3 представлява рестрикционна карта на втория клон рВ822, който се използва за конструиране па плазмида, използван при описаните по-долу в пример 3 експерименти за трансформация. Ха21 гена в този клон също е секвениран (SEQ.ID.No 3). Предсказаната аминокиселинна последователност (SEQ.ID No 4) разкрива същите мотиви, като идентифицираните в SEQ.ID.No 2.

Протеинкиназинят домен е носител на 11 субдомена, съдържащи 15 запазени остатъка, диагностични за протеинкиназите, като в краищата има 31 аа близкомембранни домени (аа 677707) и С-краен домен. Предполагаемият интрон се локализира между двата силно консервирани остатъка Р и Е (аа 892 и аа 893) в предполагаемия каталитичен домен. Консенсусните последователности присъстващи в субдомениге VI (DIKSSN) и +III (GTIGYAAPE) силно подсказват, че Ха21 има серин/треонин киназна (като се противопостави на трирозин) активност.

Предшестващата работа показва, че фосфорилираният RLK5 протеин взаимодейства с киназния домен за взаимодействие (KID) от тип 2С серин-треонин протеин фосфатаза (Stone et al., Scince 266:793-795 (1994). KID свързва фосфорилания LRR, съдържащ протеини, RLK5 и ТМК1, но не успява да свърже свързаните с S рецептор кинази ZmpKl и RLK4. Тези резултати подсказват, че KUD на Arabodopsis е функционално аналогичен на SH2 домена на животинските протеини. Подреждането на последователностите на наподобяващите рецептори кинази на Arabidopsis RLK5, ТМК1 и на Ха21, разкрива комплект запазени аминокиселини (N/Q)X(L/V)S(G/S)(L/ A)(F/V)(P/E), заобикалящи серинов остатък, който е карбокси-краен за последния остатък (аргинин) силно консервативен при всички протеинкинази (позиции 999 в продукта на Ха21 гена). Карбокси-крайната позиция в този консенсус на тези протеини е подобна на карбоксикрайния фосфотирозин при онкогенния продукт ррбО c-Src на вируса на саркомата на Rous, който е съществен за свързването към протеините, съдържащи SH2 домен. Тези консервативни аминокиселини липсват в свързаните с S рецепторкинази ZmpKl, RLK4 и SRK6, и при интрацелуларните кинази, които не свързват KID. По този начин, тази област действа като високоафинитетен и специфичен сайт за свързване на протеините, съдържащи KID. Модификация на аминокиселинната последователност на тази област на Ха21 може да се използва по този начин, за промяна на афинитета към KID протеина и по този начин да се контролира вътреклетъчната сигнализация в отговор на свързването на лиганд от LRR домена.

Пример 3. Трансформиране на растение при използване на Ха21 ген

Описаният ген Ха21 се използва за трансформиране на оризови растения, за да се докаже, че гените могат да придават устойчивост към Xanthomonas на чувствителните растения. Генът се въвежда в чувствителен оризов щам, като се използва вариант на методите на Li et al., Plant Cell Rep. 12:250-255 (1993). Накратко, котрансформацията се осъществява чрез използване на хигромициновата конструкция pMON410 (от Monsanto) и вектора bluescript, съдържащ интересуващите ни последователности. Освен това, Крп фрагментът на рВ822 се клонира във вектор рТ818, който произхожда от Invitrogen вектор per 1000, и съдържа 1 kb-fl фрагмент RAPD818 (Ronald et al., по-горе). Полученият плазмид се бележи като рС822. Растенията се селекционират върху хигромицин (30 mg/L) след което се отсяват по резистентност към Хоо раса 6.

Стандартните методи се използват за тестуване на устойчивост към Xanthomonas при трансформантите. Изследванията се извършват съгласно методите на Kaufman et al., Plant Disease Rep. 57:537-541 (1973). Накратко, Xoo paca 6 се култивира върху PSA петрита в продължение на 3 дни. Бактериите се остръгват, ресуспендират се във вода и OD (оптическа плътност) се довежда до 10’ колония образуващи единици на ml. В суспензията се потапят ножици и се отрязват листата на трансформантите (4 месеца след бомбардирането) на 5 cm от върха. Растенията се преглеждат за наличие на лезии 11 дни след инкубирането.

Фигура 4 показва данни от експериментите за дължината на лезиите, чрез използване на експресионен вектор включващ гена от рС822 клона. Отделни растения получени от независими трансформанти 106, -9, -22, -11, -17, -1, -12, -4, 16 и -29 са носители на рС822 структурата и показват нарастнала устойчивост при сравняване с чувствителни нетрансформирани контроли (IR24), както и оризови растения трансформирани с вектора (1-15).

Пример 4. Изолиране на RRK гени от домат Както бе отбелязано по-горе, Ха21 последователност може да се използва за изолиране на RRK гени от други растителни видове, чрез използване на разграден праймер или подход на хибридизация на слаба строгост. Този пример описва изолирането и охарактеризирането на два RRK гена на домата, чрез използване на подхода на разградения праймер.

Разградените праймери се изготвят така, че продуктите на PCR (полимеразна верижна реакция) трябва да се амплифицират между LRR и киназните домени и, следователно обхваща трансмембранния домен. Предходните праймери се взимат от мотиви, запазени в LRR областта на Ха21 и няколко други растителни протеина (напримера Cf-9, RLK5 hPGIP). Обратните праймери се взимат от мотиви запазени в Ха21 киназния домен и други растителни серин-треонин киназни домени (например RLU5, Pto и Fen (Martin et al., Plant Cell 6:1543-1552 (1994).

Използваните разградени праймери за амплифициране на PCR продуктите са както следват:

1. LRR област

TCA AGC AAC AAT TTG TCA GGN CA(A/G) АТ(АОТ) СС (SEQ. ID. No 5)

2. Киназна област:

ТАА CAG САС АТТ GCT TGA TTT NAN (G/A)TC NCG (G/AJTG (SEQ. ID. No 6)

TAA CAG САС ATT GCT TGA TTT NAN (G/A)TC G/A)CA (G/A)TG (SEQ. ID. No 7)

TAA CAG CAC ATT GCT TGA TTT NAN (G/A)TC (T/C)CT (G/AJTG (SEQ. ID. No Cl

PCR

Условията за PCR са, както следва (20 μΐ реакция):

Първи цикъл:

94°С за 30 s (денатуриране)

55°С за 30 s (хибридизация между НК)

72°С за 1 min (удължаване)

При следващите 19 цикъла, температурата за осъществяване на хибридизацията намалява с 1°С за всеки цикъл. След приключването на 20-те цикъла реакцията се инкубира за 10 min при 72”С.

След първоначалната амплификация при използване на тези разградени праймери, се осъществява втори етап на амплификация със следните специфични праймери:

TAAGCAACAATTTG (SEQ. ID. No 9) u

TAACAGCACA1TGCTTGAB (SEQ. ID. No 10)

Условията за провеждане на амплификацията са, както следва:

94°С за 15 s

55°С за 15 s

72°С за 15 s

В края на 35-ия цикъл реакцията се инкубира при 72°С за 10 min.

Продуктите на PCR се клонират и се използват като проби за сДНК библиотека на домата. Библиотеката се конструира от домата сДНК, която започва с олиго DT праймери, лигирани към EcoRI адаптери и клонирани в ламбада GT11 вектор.

Тези праймери се използват за изолиране на два PCR продукта на домата и сДНК, принадлежащи на PRK семейството гени за резистентност на болести. Първият клон TRK1 (Tomato Recerptor Kinase De PCR продукт c 250 базови двойки и се използва за изолиране на частични сДНК. ДНК последователността е показана SEQ.ID. No 11.Изведената аминокиселинна последователност на TRK1 (Tonato Receptor Kinase 1) e PCR продукт c 250 базови двойки и се използва за изолиране на частични сДНК. ДНК последователността е показана на SEQ.ID. No 11. Изведената аминокиселинна последователност на TRK1 е показана на SEQ. ID.No 12.

Клонът присъства в генома на домата под формата на едно или две копия и едно копие съвпада с късото рамо на хромозома 1 в близост до гена за устойчивост на Xanthomonas campestris pv. vericatoria (Rxl) (Zu et al., 141:675-682 (1995)) (виж фигура 5).

Вторият клон TRL1 (Tomato Receptor Like 1) e PCR продукт c 496 базови двойки. ДНК последователността е показана на SEQ. ID. No 13. Изведената аминокиселинна последоавтелност и SEQ.ID.No 14. TRL1 съвпада с малкото сМ от men (виж фигура 6) мутация върху хромозома 3,

SEQ. ID. No. 1

RRK-F която причинява точкова некроза по растенията, типична за защитен фенотип.

Тези резултати показват, че Ха21 генът може да се използва за изолиране на RRK гени 5 от други растителни видове. Например, изолираните TRK1 и TRL1 гени са важни съставни части на пътя на сигналната транедукция при растенията, водещ до защитен отговор. Тези гени са полезни за оформяне на устойчивост към болести при 10 домата и при други растителни видове.

Горните примери са представени да илюстрират изобретението, но без да ограничават обхвата му. На всеки специалист в областта веднага стават ясни и други варианти, които се включват 15 от приложените патентни претенции. Всички цитирани публикации, патенти и патентни заявки са включени за справка.

Claims (20)

1. Патентни претенции

   1. Структура на изолирана нуклеинова киселина, съдържаща RRK полинуклеотидна последователност, който палинуклеотид хибридизира 5 при строги условия със SEQ.ID. Nol3.
2. 2. Структура на нуклеинова киселина съгласно претенция 1, при която полинуклеотиданта последователност е ген в пълната си дължина.
3. 3. Структура на нуклеинова киселина съгласно претенция 1, при която RRK полинуклеотидната последователност е Ха21 ген, който кодира един Ха21 полипептид, посочен на SEQ. ID.No 2, SEQ.ID.No4 или SEQ.ID.No 12.
4. 4. Структура на нуклеинова киселина съгласно претенция 1, която съдържа, освен това промотор операционно свързан към RRK полинуклеотидната последователност.
5. 5. Структура на нуклеинова киселина съгласно претенция 4, при която промоторът е тъканноспецифичен промотор.
6. 6. Структура на нуклеинова киселина съгласно претенция 4, при която промоторът е конститутивен промотор.
7. 7. Структура на нуклеинова киселина, включваща промоторна последователност от RRK ген, свързан към хетероложна полинуклеотидна последователност.
8. 8. Структура съгласно претенция 7, при която хетероложната полинуклеотидна последователност е структурен ген, който придава на растенията устойчивост към патогенни организми.
9. 9. Структура съгласно претенция 7, при която промоторът е от SEQ.ID No 1.
10. 10. Трансгенно растение, включващо рекомбинантна експресионна касета, съдържаща растителен промотор операционно свързан към Ха21 полинуклеотидна последователност съгласно претенция 1.
11. 11. Трансгенно растение, съгласно претенция 10, в което растителният промотор е хетероложен промотор.
12. 12. Трансгенно растение, съгласно претенция 10, което е ориз.
13. 13. Трансгенно растение, съгласно претенция 10, което е домат.
14. 14. Метод за засилване устойчивостта на растенията към Xantkomonas, характеризиращ се с това, че в растението се въвежда рекомбинантна експресионна касета, включваща растителен промотор операционно свързан към RRK полинуклеотидна последователност съгласно претенция 1.
15. 15. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че растителната тъкан е от ориз.
16. 16. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че растителната тъкан е от домат.
17. 17. Метода съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че промоторът е тьканноспецифичен промотор.
18. 18. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че промоторът е конститутивен промотор.
19. 19. Метод за изолиране на RRK последователност в растение, характеризиращ се с това, че:

    - се доставя ДНК, получена от растението;

    - ДНК се поставя в контакт с праймер, чиято последователност е от SEQ.ID.No 1 или SEQ.ID.No3;

    - се определя дали е настъпила амплификация.
20. 20. Метод, съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че ДНК е сДНК.