BG62476B1

BG62476B1 - Методи и фармацевтични състави за инхибиране натромбообразуване

Info

Publication number: BG62476B1
Application number: BG100863A
Authority: BG
Inventors: Paul E. Gargan
Original assignee: American Biogenetic Sciences
Priority date: 1994-02-24
Filing date: 1996-09-23
Publication date: 1999-12-30
Also published as: JPH09509429A; EP0749320A4; AU1843495A; NO963497D0; MD960334A; CZ246496A3; EP0749320A1; LV11784B; WO1995022986A1; MD1521F2; HUT76536A; MX9603602A; NO963497L; CA2183953A1; BG100863A; UA41984C2; LT4192B; SG53279A1; AU708897B2; GEP20002257B

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до методи за прилагане на фибринспецифично антитяло за in vivo инхибиране на тромбообразуване. Също така да предвидени фармацевтични състави за използване на тези методи.

Предшестващо състояние на техниката

Тромбообразуване вследствие заболяване или хирургия

Кръвни агрегации, или тромби, се образуват в близост до увредени участъци на кръвоносните съдове. Клиничните прояви на патологичните тромбози или тромботичните болести са извънредно разнообразни и включват дълбоки венозни тромбози (ДВТ), и артериални или венозни тромбози.

Тромбоемболията и тромбозните усложнения при други съдови заболявания (например атеросклероза) могат да предизвикат запушване на главни артерии, водещо до исхемия на органа и да доведат до живото-застрашаващо състояние като мозъчно-съдов инцидент (удар), инфаркт на миокарда и др.

Освен това, инвазивните хирургични процедури, включително, но не само балонна ангиопластика, и трансплантация на органи (естествени или изкуствени), могат да доведат до тромбообразуване. Например, балонната ангиопластика, процедура използвана за отпушване на артерии, в действителност може да нарани стената на артерията, което да доведе отново до запушване от новообразуван тромб. Доклад установява, че перкутанната транслуминална коронарна ангиопластика оставя на същото място неблагоприятна последица, изразяваща се в ново запушване на съда, което се проявява с 25-25% честота. Gimple, L.W., et al., Circulation, 86: 1536-46 (1992). Виж също Saremboock, I.J., et al., Circulation, 80: 102949 (1989); и Ip, J.H., et al, JACC, 17: 77B-88B (1991). В друг доклад се твърди, че “техниката на ангиопластиката, предизвикваща в повечето случаи ендотелиални увреждания и счупвания или разкъсвания на стената /реф./, е много подобна на процеса, който води до остри исхемични синдроми” Tenaglia, A.N., Ann.Rev. Med., 44:465-79, 466 (1993).

Доколкото системното лечение с антикоагуланти като хепарин и кумарин, както е известно, има нисък или никакъв ефект за предотвратяване на запушвания след ангиопластика, (Ip, J.H., etal., JACC, 17.-77В-88В (1991)), и доколкото при прилагането на антикоагуланти често има риск от системна хеморагия (Physicians’Desk Reference, 47 th Ed., Medical Economics Data (1993)), ще са полезни нови локалноспецифични методи на въздействие за инхибиране или възпрепятстване образуването на тромби, както в случаите на вече съществуващо съдово заболяване, така и при инвазивни хирургични процедури.

Хемостазна система

Хемостазният механизъм, вследствие на който се образува тромб, е комплексен физиологичен отговор, насочен към отстраняване на уврежданията на наранен кръвоносен съд. Виж harker, L.A., and Mann, K.G., “Thrombosis and Fibrinolysis” in: Thrombosis in Cardiovascular Disorders, Fuster, V. and Verstraete, M. (eds), W.B.Saunders. Co. (1992), pp. 1-16.

Хемостазата се осъществява от съгласуваното взаимодействие между стената на увредения кръвоносен съд, тромбоцитите и коагулационната система. Вж. Furie, В. and Furie,

В.С., Cell, 53: 505-18 (1988).

Ролята на коагулационната система е да осигури неразтворима фибринова матрица да задържи и свърже тромбоцитна запушалка, която да бъде свързана към субендотелната структура на увредения съд на мястото на нараняването. Коагулацията е процес на нарастване, включващ поредица от ензимни реакции, в които проензими (съсирващи фактори) се активират последователно за получаване на активни ензими. Формирането на фибриновата матрица от циркулиращия фибриноген е резултат от тази каскадна последователност от ензимни реакции, водеща до експлозивна продукция на ензима тромбин на нужното място, превръщането на фибриноген във фибрин с помощта на тромбин и омрежването на фибрина с помощта на Фактор ХШа, чрез което се образува тромб.

Последователността от реакции може да бъде опростено представено чрез триетапен процес, както следва:

Тромбин

Етап 1 - Протеолиза: Фибриноген >

Фибринови мономери (DesAA, DesAABB) + FPA и FPB

Етап 2 - Полимеризация: Фибринови мономери *

Разтворими фибринови полимери (неомрежени и омрежени)

Етап 3 - Съсирване: Разтворими фибринови полимери >

Неразтворим фибринов съсирек

Фибриногенът се състои от три двойки неидентични полипептидни вериги: Αα Ββ и γ. Вж. L.Stryer, Biochemistry, 3rd Ed., W.H. Freeman and Company New York (1988), p. 249. В началния етап, при който фибриногенът се превръща във фибрин, показан по-горе като етап 1, фибриногенът се разцепва от тромбина за получаване на фибринопептид A(FPA) откъм крайни аминогрупи на две фибриноген Αα-вериги. Останалите части от фибриногеновата молекула са “фибринов мономер”, означен като DesAA. Както е показано също така в етап 1, тромбинът спонтанно (но много бавно) разцепва също фибринопептида В (FPB) откъм крайните аминогрупи на две фибриноген Ββ-вериги. Останалите части от фибриногеновата молекула след това второ разцепване е също фибринов мономер, означен като DesAABB. Като резултат от получаването на FPA и FPB, нови крайни аминогрупи във веригите и на фибриновите мономери остават незащитени. Вж. W.Nieuwehuizen, Blood Coagulation and Fibrinolysis, 4: 93-96 (1993). В етап 2, фибриновите мономери спонтанно започват да образуват помежду си нековалентни връзки (неомрежени) до получаване на разтворим полимер. Фактор ХШа създава между молекулите на този полимер, посредством ензимно присъединяване, ковалентни напречни връзки между фибриновите мономерни единици. Омреженият полимер може да остане разтворим, но в същия момент в хода на процесите на полимеризация и омрежване, фибриновия полимер става неразтворим, образувайки фибринови конгломерати, както е показано в етап 3.

Разтворимите фибринови полимери са непосредствените предшественици на фибриновия възел - съсирек. Следователно, плазмените нива на разтворими фибринови полимери със сигурност се покачват при индивидите със застрашаваща или съществуваща тромбоза.

Откриването и измерването на количеството на тези полимери в кръвта, и по-специално на DesAABB разтворим фибринов полимер, както 15 е известно, може да служи за улавяне на зараждащо се тромбообразуване. Вж. Nieuwenhuizen, р. 94; and Marder et al., United States Patent No. 5 206 140.

2.3. Антитела, специфични към компо20 нентни на хемостазната система

Както естествено съществуващи, така и лабораторно получени антитела могат да играят роля за охарактеризираме на компонентите на хемостазната система и за изясняване на 25 техните функции.

Marciniak, Е., and Greenwood, M.F., Blood, 53; 81-92 (1979),описват случай на инхибитор на съсирването в серума на 14-годишен пациент със синдром на Даун, който е намерен в 30 IgG фракцията и който подтиснал ензимното получаване на фибринопептид А от фибриноген. Hoots, W. U., et al., New End.J.Med., 304: 85761 ‘1981), описват случая на 13-годишен пациент, страдащ от хроничен активен хепатит, 35 както и от нарушения на коагулацията, при което нарушенията са били открити по присъствието на антитела в кръвта на пациента, които показвали висок афинитет към фибриноген и фибрин, и които инхибирали полимеризацията 40 на фибриновите мономери, предотвратявайки по този начин образуването на фибринов гел.

Sola, В., et al., Thromb.Res., 29: 643-53 (1983), описват създаването на хибридомна клетъчна линия, секретираща моноклонални анти45 тела специфични към човешки фибриноген и фибрин. Elms, M.J., et al., Thromb.Haemostas, 50: 591 -94 (1983), описват получаване на хибридомна клетъчна линия, секретираща моноклонални антитела, които разпознават антиген50 на детерминанта в D димера, специфичен фрагмент, резултат от разкъсването на омрежен фибрин. Hui, K.Y. et al., Science, 222: 1129 (1983), and Scheefers-Borchel, U., etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7091-95 (1985), описват използването като антигени, на синтетични хексапептиди представящи амино-групите на а- и β-веригите, и респективно, на човешки фибрин, за продуциране на моноклонални антитела, които свързват фибрина даже в присъствие на фибриноген. Kydryk, В., et al., Mol. Immunol., 21: 89-94 (1984), описват получаването на хибридомна клетъчна линия, секретираща моноклонални антитела специфични към N-DSK-фрагмента от фибриногена. Sobel. J.H., et al., Thromb, and Haem., 60: 153-59 (1988), описват използването на две различни моноклонални антитела, които се свързват към CNBr Αα-фрагментите на фибриногена, за изследване в ранен стадий β-верижното омрежване произтичащо между съседни фибринови молекули. Mirshahi, М., et al., Fibrinogen, 4: 49-54 (1990), описват получаване на хибридомна клетъчна линия, секретираща моноклонални антитела специфични към фибриноген, които имат способността да инхибират фибриновата полимеризация. Cierniewski, C.S., and Budzynski, A.Z., Biochemistry, 31: 4248-53 (1992), описват получаване и използване на поликлонални и моноклонални антитела специфични към пречистен човешки фибриноген, които намаляват скоростта на полимеризация на фибриновите мономери и също така пречат на действието на тромбина върху фибриногена. Tymkewycz, Р.М., etal., Blood Coag. and Fibrinol., 4: 211-21 (1993), описват получаването на пет моноклонални антитела с висок афинитет към фибрина и, които не реагират с фибриноген. Gargan, Р.Е., et al., Fibrinolysis, 7: 275-83 (1993), описват създаването на хибридомна клетъчна линия, ΜΗ-1, която продуцира моноклонални антитела, които са специфични към омрежени и неомрежени фибринови полимерни структури, но нямат измерима имунореактивност спрямо фибриноген и спрямо разпадните продукти от фибрина или фибриногена. Освен това, МН-1 антитялото не реагира с DesAA или с DesAABB-фибринови мономери, и не е установена реактивност спрямо отделните α, β или γ-вериги на фибриногена.

За по-подробно разглеждане на използването на моноклонални антитела, специфични към компонентите на хемостазната система, виж Uudryk, B.J., et al., “Monoclonal Antibodies as Probes for Fibrin (ogen) Proteolysis” в Monoclonal Antibodies in immunoscintigraphy, Chatal, J-F (ed), CRC Press, Boca Raton, Fl. (1989), pp. 365-398.

Модифицирани антитела, специфични към хемостазните компоненти, са създадени за клинична употреба като реагенти за визуализиране на тромби in situ. Виж, например, Liau, C-S, and Su, С-Т, J,Form. Med. Assoc., 88: 20912 (1989); Wasser, M.N.J.M., et al„ Blood, 74: 708-14 (1989); Walker, K.Z., etal., Eur.J.Nucl. Med., 16: 787-94 (1990); Alavi, A., etal., Radiology, 175: 79-85 (1990); Wasser, M.N.J.M., et al., Thromb.Res., Supp.N.: 91-104 (1990); and Kanke, M., et al., J.Nucl., Med., 32: 1254-60 (1991).

За терапевтични цели са създадени антитела, специфични към фибрин, конюгирани към тромболитични ензими. Виж например Bode,

С., et al., Science, 229: 776-67 (1985). Според тази статия, локално-специфичното прилагане на тромболитичния агент видимо значително е повишило ефективността на агента при лизирането на тромбите.

Издадени са няколко US патента, отнасящи се до получаване и/или методи за използване на моноклонални антитела, специфични към фибриноген, фибрин, или техните разпадни продукти. Виж, US 4 722 903; US 4 758 524 и US 4 916 070, чиито списък няма претенции за изчерпателност.

Методи за предотвратяване на тромбообразуване

Антитромботичната терапия обикновено включва прилагане на един или повече антикоагуланти, такива като хепарин или кумарин. Physicians’Desk Reference, 47th Ed., Medical Economics Data (1993); The Merck Manual of Diagnostics and Therapy, 15th Ed., Merck Sharpe & Dohme Research Labs (1987). Тези антикоагуланти се използват в опит да се предотврати тромбоза при пациенти, страдащи от съдово заболяване, и в опит да се предотврати акутно тромбозно запушване след ангиопластика.

Главният недостатък на използването на такива системи антикоагуланти е опасността от системна хеморагия. Назначаващите ги лекари трябва да са предупредени, че “(Х)еморагия може да настъпи на практика на всеки участък от пациента, приемащ хепарин” Physicians’Desk Reference, 47th Ed., Medical Economics Data (1993), з. 2568.

Освен това, известно е, че ефективността на такива антикоагуланти при предотвра тяването на ново запушване след ангиопластика, или не се различава от тази при плацебо лечение, или е невъзпроизводима. (Jp, J.H , et al., JACC, 17: 778-888 (1991)). Следователно, на ползата от използването на такива коагу- 5 ланти се противопоставят и рискът от хеморагия, и тяхната несигурна ефективност в предотвратяването на запушвания.

Използвани са ред биологични и механични стратегии в опита да се намали степента на нови запушвания при ангиопластика, но нито една терапия не е показала съществени положителни резултати. Поради това има повишаващ се интерес към “локално-специфично” или “директно” прилагащи се към местата на нараняване на съда антитромботични агенти. Gimpie, L.W., et al., Circulation, 86: 1536-46 (1992).

Локалноспецифичното приложение на антитромботични агенти, използващо антитела, предназначени да свържат компоненти на хемостазната система, може да се служи за локализиране на тези агенти на мястото на съдовото увреждане. Едното предимство на такава локализация е, че ще е необходима по-ниска 25 лечебна доза. Второто предимство на локализацията е, че ще се намали риска от системна хеморагия.

В някои случаи, антителата, специфични към определени компоненти на хемостазната система същевременно могат да действат инхибиращо върху фибриновата полимеризация. Francis, S.E., et al., Am.J.Hem., 18: 11-19 (1985), описват изследвания с моноклонални антитела, продуцирани срещу фибриноген, които имат “умерена” антикоагулантна активност. Mirshahi, М., et al., Fibrinogen, 4: 49-54 (1990), описват получаването на хибридомна клетъчна линия, секретираща моноклонални антитела, на които антиген е фермент D, продукт на плазмено разпадане на фибриноген. Тези моноклонални антитела реагират енергично с фибриноген и инхибират фибриновата полимеризация. Ciernewski, C.S., and Budzynski, A.Z., Biochemistry, 31: 4248-53 (1992), описват получаването на три различни хибридомни клетъчни линии, в които антигена е нативен човешки фибриноген, и които секретират моноклонални антитела, които инхибират скоростта на фибриновата полимеризация. 50

Тези три доклада са с малък или никакъв принос за разработването на локалноспе цифичните терапевтични или профилактични антитромботични агенти. Това е така, защото във всички тези случаи антителата реагират кръстосано или с фибриноген или с разпадните продукти на фибриногена, които всички присъстват повсеместно в хемостазната система. Такива антитела, приложени на пациент, биха се свързани с фибриногена или негови разпадни продукти, и не биха могли да инхибират 10 фибриновата полимеризация или тромбообразуването на мястото на съдовото увреждане.

Настоящото изобретение дава възможност за съвършено различен подход към инхибирането на тромбообразуването чрез използ15 ване на моноклонални антитела, които са фибриноген или плазмин-разпадните продукти на фибриноген или фибрин). Настоящото изобретение предлага метод за използване на казаните фибринспецифични антитела, който води 20 до инхибиране на тромбообразуването в мястото на увреждане на кръвоносния съд.

Техническа същност на изобретение

Настоящото изобретение предлага метод за инхибиране на тромбообразуването в мястото на увреждането на кръвоносния съд на човека при необходимост от такова инхибиране, чрез прилагане на фибринспецифично монок30 лонално антитяло. Изобретението също така предлага фрагменти или производни на фибринспецифично моноклоиално антитяло, които фрагменти и производни съдържат свързващия сектор от антитялото. Изобретението се отнася 35 и до фармацевтичен състав, съдържащ фибринспецифично моноклоиално антитяло, или фрагмент, или производно от него, и фармацевтично-приложим носител, в достатъчно ефективно количество за инхибиране на тром40 бообразуването при човек. Изобретението се отнася до фармацевтични китове, съдържащи един или повече от компонентите на фармацевтичните състави, съгласно изобретението.

Описание на фигурите

Фигура 1 представлява включване на МН-1 моноклоиално антитяло във фибриноген/тромбин реакционна смес инхибира и степента и абсолютното количество на съсирека. “Фибриноген” и 45J” са контролни реакции.

Фигура 2 - включване на повишено ко5 личество МН-1 моноклонално антитяло във фибриноген/тромбин реакционна смес води до повишаване на степента на инхибиране на съсирването. “Фибриноген” и контролна реакция.

Подробно описание на изобретението

Приложение на изобретението

Фибринспецифичното моноклонално антитяло може да инхибира полимеризацията на фибрина и образуването на тромби. Вследствие на това фибринспецифичното антитяло може да бъде използвано за предпазване и лечение на симптоми при човека, които могат да бъдат предпазени или лекувани чрез инхибиране на полимеризацията на фибрина или образуването на тромби. Например, фибринспецифичните моноклонални антитела са приложими за лечение на хора, страдащи от съдово заболяване, което се съпътства от патологична тромбоза. Неизчерпващи примери на такива съдови заболявания са дълбоките венозни тромбози (ДВТ), артериални и венозни тромбози, инсулт, тромбоемболия, белодробна емболия, и тромбозни усложнения при атеросклероза.

Фибринспецифичните моноклонални антитела са приложими също така, например, при лечение на хора, които се подготвят за, или се възстановяват след инвазивни хирургични операции. Предвид целта на изобретението, терминът “инвазивни хирургични операции” включва хирургични операции, които могат да предизвикат увреждане на артериален или венозен кръвоносен съд, което може да доведе до тромботично усложнение, неизчерпващи примери на такива операции включват балонна ангиопластика, трансплантация на органи (естествени или изкуствени).

Освен фибринспецифичните моноклонални антитела, фрагменти от фибринспецифичното антитялото, които съдържат идиотипа (свързващия домен), могат да бъдат получени по познат начин. Например, такива фрагменти включват, без да се ограничават до тях: (1) Р(аЬ’)₂-фрагменти, които могат да бъдат продуцирани при хидролиза с пепсин на молекулата на антитялото: (2) Fab’-фрагмент, който може да бъде получен чрез редукция на дисулфидния мост на Р(аЬ’)₂-фрагмента; и (3) Fabфрагмент, който може да бъде получен чрез третиране на молекулата на антитялото с па пани и редуциращ реагент. Такива фрагменти от антитяло се включват в обхвата на настоящото изобретение. Друг пример за получаване и използване на фрагменти от антитяло е Parham, Р., et al., J.Immunol.Meth., 53: 133 (1982); и Khaw, B-A, et al., J.Nucl.Med., 34: 2264-68 (1993).

Освен фибринспецифични антитела и техни фрагменти, и други производни на антителата, които съдържат идиотипа (свързващия домен) от фибринспецифичното антитяло, могат да бъдат получени по познат начин. Например, могат да бъдат синтезирани рекомбинантни и синтетични олигопептиди и техни аналози, които проявяват същия инхибиращ ефект върху образуването на тромби, както фибринспецифичните антитела и техни фрагменти. Такива производни също се включват в замисъла на изобретението. За примери на използване на синтетични олигопептиди с последователност базираща се на първичен свързващ участък на моноклонално антитяло, виж Knight, L., et al., J.Nucl.Med., 35: 282-88 (1994).

Функционално еквивалентни фибринспецифични моноклонални антитела, фрагменти или производни от тях също влизат в обхвата на изобретението. Под термина “функционално еквивалентни” се разбира фибринспецифични моноклонални антитела, или фрагменти или производни от тях, които имат способността да инхибират в достатъчна степен образуването на тромби у човека при необходимост от такова третиране чрез свързване към същия епитоп, към който се свързват МН-1антителата.

Получаване и охарактеризиране на МН-1 моноклонално антитяло

Много от по-ранните подходи приемаха получаване на фибринспецифични антитела, концентрирани в имунизирани животни с разтворими фибринови фрагменти и синтетични пептиди, които имитират неоантигенни участъци от фибрина.

Виж Hui, K>Y., et al., Science 222: 112932 (1983); Scheefers-Borchel, U., etal., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 82: 7091-95 (1985); Elms, M.J., et al., Thromb.Hdemostas, 50: 591-94 (1983); и Kudryk, B., et al., Mol.Immunol., 2: 89-94 (1984). Счита се, че свързващия участък от такива антитела се запазва по време на разграждането на фибрина, поради което такива анти тела могат също да се свържат с продуктите на разграждането на фибрина.

US 5 120 834 (по-нататък означаван като US 834), който е включен тук чрез реферат, най-общо се отнася до метод за получаване на моноклонални от стерилни животни чрез имунизиране на тези стерилни животни с антиген по избор. Предимство на използването на стерилна система, с която да се продуцират моноклонални антитела е това, че такава система ще покаже силно повишен имунен отговор към антигена, повишавайки вероятността от натрупване на В-лимфоцити, които продуцират антитела, свързващи се към специфичния епитоп на антигена. Такава система беше избрана като специално приложима за генериране на високоспецифични антитела към фибрин, които реагират слабо или не реагират кръстосано с фибриноген. Добиването на такова селективно антитяло е било проблематично, доколкото структурното и конформационно сходство между фибрин и фибриноген, както е установено, е над 98% (Plow, E.F., et al., Semin, Thromb.Haemostas, 8: 36 (1982). Като резултат, само малък процент от епитопите на фибриновата молекула са фактически неоантигени (т.е. като в оригиналния фибрин).

US’834 се отнася до хибридомна клетъчна линия, ATCC No НВ 9739, секретираща моноклонално антитяло МН-1. МН-1 моноклонално антитяло е специфично към омрежени и неомрежени фибринови полимери, но не реагира кръстосано с фибриноген или продукти от плазмин-разпадане на фибриноген или фибрин.

МН-1 се пречиства, съгласно метода, описан в US’834. МН-1 се свързва специфично с фибрин и не реагира кръстосано с фибриноген при конкурентни изследвания. МН-1 не реагира кръстосано и с получени с помощта на плазмин разпадни продукти на фибриногена, нито с получени с помощта на плазмин разпадни продукти на омрежен фибрин. В резултат, може да се заключи, че: (1) МН-1 разпознава епитоп на цялостна фибринова молекула, който липсва или не проявява по повърхността на предшествуващата молекула фибриноген; и (2) епитопът вероятно е разграден при хидролиза на омрежен фибрин с плазмин.

МН-1 беше охарактеризиран чрез Scatchard-анализ (Frankel, et al., Mol.Immunol. 16: 101-6 (1979) използвайки ' ^2JI-белязано Μ H-

-антитяло за определяне на афинитета на МН1 към фибрин. Получените стойности за дисоциационната константа K_D са 6,7 х 10¹⁰, този афинитет е около 5 000 пъти този на тъканен плазминогенен активатор за фибрин.

Western blotting-анализът показа, че МН1 не реагира кръстосано с Αα, Ββ, или γ веригите на фибриногена. Същият метод показа, че МН-1 не реагира кръстосано с третирана с тромбин Αα или Ββ вериги от фибриноген. Освен това, ELICA-анализът показа, че МН-1 реагира с омрежен фибрин и неомрежен фибрин, с афинитет към омрежения фибрин по-голяма от двата.

Методи за приложение

Съгласно изобретението, фибринспецифичните моноклонални антитела, или фрагменти или производни от тях, се прилагат при хора при необходимост от това за инхибиране на образуването на тромби. Антителата, или фрагменти или производни от тях, се прилагат за предпочитане при хора под форма, която е несвързана към маркиран, тромболитичен или друг агент, или друга молекула или част от нея. Методите, съгласно изобретението могат да бъдат осъществени с използване на антитела или производни, които са свързани към маркиран, тромболитичен или друг агент, или молекула, или част от нея, и се разбира, че влизат в границите на настоящото изобретение.

Терминът “носител” включва разтворител, инертен пълнител или вехикул, с който се прилага фибринспецифичните моноклонални антитела, или фрагменти или производни от тях.

Терминът “фармацевтично приемлив носител” означава, че носителят е одобрен от оторизирана агенция на федералното или щатското правителство или фигурира в Фармакопеята на САЩ или друга общоизвестна фармакопея за прилагане на животни, и по-специално, на хора.

Терминът “антитромботичен състав” е използван в изобретението относно състав, включващ фибринспецифично моноклонално антитяло, или фрагмент, или производно от него, и фармацевтично приемлив носител, който състав в достатъчно количество може да инхибира образуването на тромби при хора при необходимост от такова инхибиране.

Терминът “ефективна доза” е използван в изобретението в смисъл на такова количество моноклонално антитяло, или фрагмент или производно от него, което е напълно достатъчно да инхибира тромбообразуването при човек при необходимост от такова третиране. Дозирането не трябва да бъде толкова широко, че да предизвика обратни странични ефекти, като неочаквано кръстосана реакция или анафилактична реакция и други подобни. Общо, дозата ще варира в зависимост от възрастта, кондицията, пола и продължителността на заболяването на пациента, противопоказания, ако има, имунна толерантност, и други вариращи показатели, и установени от назначаващия лекар. Също така дозата ще варира в зависимост от индивидуалната съвкупност от обстоятелства /състояние/, в повечето случай на съдово заболяване и при повечето хирургически последици дозата ще се определя по телесното тегло на човека при необходимост от терапия, в границите от около 1 pg/mg телесно тегло до около 50 pg/kg телесно тегло, и за предпочитане от около 5 pg/kg телесно тегло до около 10 pg/kg телесно тегло.

Методи за приложение

Фибринспецифичните моноклонални антитела, или фрагменти или производни от тях, могат да бъдат прилагани върху хора по който и да е възприет метод, включително парентерално чрез еднократна болестна инжекция, чрез непрекъсната инфузия, или чрез комбиниране на тези два метода. Прилагането може да стане също чрез директна инфузия с катетър, така както при интракоронарно внасяне, където е показано.

Приготвянето за парентерално приложение се състои, например, във възстановяване на лиофилизирани фибринспецифични моноклонални антитела, или фрагменти или производни от тях, в стерилен, пречистен от ендотоксини физиологичен разтвор, или може да се състои във възстановяване или диспергиране на фибринспецифични моноклонални антитела, или фрагменти или производни от тях, в стерилен воден или неводен разтвор, суспензия и емулсия. Примери за неводни разтворители са пропилен гликол, полиетилен гликол, растително масло като маслинено масло, и органични естери като етилолеат, които могат да бъдат впръсквани.

Водните носители включват вода, алкохолно/ водни разтвори, емулсии или суспензии, включително физиологичен разтвор и буферирани среди. Парентералните носители включват разтвор на натриев хлорид. Рингер-декстроза, декстроза и натриев хлорид, Рингер-лактат, или нелетливи масла. Интравенозните носители включват течност и хранителен пълнител, като тези, базирани на Рингер-декстроза, и други подобни. Консерванти и други добавки също могат да бъдат включени, такива като например, антимикробни, антиоксидантни, хелатизиращи средства и инертни газове и други подобни. За препоръчване е фармацевтични състави, съгласно изобретението да бъдат в стерилизирана форма, така че да отговарят на изискванията за стерилност, поставени от Комисията по храни и лекарства на САЩ.

Изобретението се отнася и до фармацевтични китове, съдържащи един или повече от ингредиентите на фармацевтичните състави, съгласно изобретението, съхранявани в същите или отделни контейнери. Незадължително към този контейнер (и) може да има бележка във форма, препоръчана от правителствена агенция, регулираща производството, използването и продажбата на фармацевтични или биологични продукти, която бележка отразява разрешението на тази комисия за производство, използване и продажба за приложение на хора. Незадължително към китове, които съдържат само лиофилизирани антитела или фрагменти или производни от тях, може да има инструкции какви носители са подходящи за прилагане на хора при необходимост от терапия.

Обемът, продължителността, моментът и методът на лечение варират в зависимост от възрастта, теглото, кондицията и пола на човека при необходимост от лечение, както и в зависимост от типа и продължителността на заболяването, което се нуждае от това лечение, и ще бъдат уточнени от лекуващия лекар в съответствие с всяка съвкупност от обстоятелства. Лечението може да бъде приложено или непосредствено преди, по време, или след хирургична процедура, или преди и по време на процедурата, или по време и след процедурата, или преди, по време и след процедурата, в зависимост от специфичната съвкупност от обстоятелства в случая.

Например, при хирургична процедура като балонната ангиопластика, често са случаите на пациенти, които имат вече голям брой широко разпръснати кръвни съсиреци. В този случай, положителен ефект има прилагането на антитромботичното средство непосредствено след като ангиопластиката е осъществена, за предпочитане е използването на катетър за ангиопластиката, докато той е на мястото, така че директно да се прелее в увредения участък от кръвоносния съд антитромботичен състав, с което ще се фокусира третирането върху този участък. Това предотвратява загубата на антитромботично средство, която би имало, например от свързването на антитела към тромби в непоразени места.

В ситуации на инвазивни хирургични процедури при пациенти с неизвестна история на патологична тромбоза, най-общо се препоръчва прилагането на антитромботично средство или непосредствено преди, или по време на процедурата, докато има по-малък риск, че антитромботичното средство ще бъде загубено при свързването на непоразени места.

В повечето ситуации, вследствие инвазивни хирургични процедури, времето през което има повишена опасност от образуване на тромби, има тенденция да бъде непосредствено след завършване на процедурата, като резултат, само ограничен брой третирания, или даже едно третиране с достатъчно продължителност, може да постигне ефективно инхибиране на тромбообразуването, с което съществено да се намали риска от хирургично предизвикано съсирване със съпътствуващите го рискове за пациента.

В случаи на хронично тромбозно заболяване, моментът, продължителността и броя на антитромботичните третирания зависят главно от диагнозата на състоянието на пациента преди и след третирането и отговарят на предварително антитромботично третиране, което може да бъде детерминирано, мониторирано и оценено от лекуващия лекар.

Определяне на ефекта от лечението

Ефекта от антитромботичното лечение на МН-1 моноклонални антитела, или с фрагменти или производни от тях, може да се определи по стандартни методи. Примери за такива методи включват, без да се ограничават до тях: (1) ангиографски мониторинг чрез изобразяване на артериалния или венозен цветен поток, като появата на препятствие на потока показва необходимостта от по-нататъшно третиране; (2) с помощта на сцинтиграфия, използваща тромбоспецифичните антитела, конюгирани към маркирани, при която размерите и местоположението на тромба могат да бъдат регистрирани за сигнализиране, че е необходимо по-нататъшно третиране; (3) чрез регистриране на проявата и тежестта на клинични симптоми, при което повишаването на броя или остротата на симптомите може да покаже необходимостта от по-нататъшно третиране; и (4) чрез измерване на нивата на фибриногена в кръвта на лицето, докато е налице обратно съотношение между фибриногеновото и фибриново нива, при което спадът на нивото на фибриногена показва възможно съответно повишаване нивото на фибрина и полимеризацията му, показвайки необходимостта от по-нататъшно третиране.

Описано общо изобретението може да се постигне по-задълбочено разбиране на конкретните изпълнения на изобретението, които са само за целите на илюстрирането, и не изчерпват възможните реализации.

Пример, in vitro инхибиране на съсирване

Проведени са серия от in vitro опити за определяне на влиянието на МН-1 върху съсирването. Пречистен човешки фибриноген (Kabi, Chromogenix Co, Ohio) се разтваря в 150 mM буфериран с фосфат физиологичен разтвор, с физиологично pH, с концентрация 1 mg/ml и приблизително 100 μΐ се поставят във всяка ямка на микротитрационна плака (Costar). Към всяка ямка се добавят приблизително 50 μΐ говежди тромбин до крайна концентрация от 0,5 ΝΙΗ единици/ml за приготвяне на реакционна смес. Към реакционната смес, в началния (нулевия) момент се прибавя приблизително 50 μΐ от всяко от следните: (1) МН-1 моноклонално антитяло, до достигане крайна концентрация на антителата 100 pg/ ml; (2) 45 J моноклонално антитяло (45 J моноклоналното антитяло, което реагира кръстосано с фибрин и фибриноген, се секретира от хибридомна клетъчна линия ATCC No НВ 9740, която е получена по конвенционален начин с използване на Balb/c мишки, като мишките се имунизират с фибрин) до достигане на крайна концентрация на антитела 200 pg/ml; или (3) физиологичен разтвор. Реакцията се оставя да протече за 60 min при 37°С. Съсирването се измерва спектрофотометрично при 340 nm на всеки 2 min. Повишаването на абсорбцията показва, че съсирването прогресира. Краят на процеса на съсирване може да се наблюдава като лато в кривата на функцията екстинкция/време.

Фиг. 1 представлява с МН-1 инхибиращо степента на съсирване, както се вижда от по-малката начална стръмнина на кривата екстинкция/време на реакционната смес, третирана с МН-1, и в сравнение или с 45 J контролна реакционна смес, или с физиологична контролна реакционна смес (Фибриноген). Освен това, МН-1 намалява абсолютното количество на съсирека, който се получава, установено от по-ниското ниво на платото на кривата, в сравнение с контролните реакции, контролната реакционна смес, съдържаща 45 J антитяло (с два пъти по-висока концентрация от МН-1) не проявява инхибиране на съсирването в сравнение с реакцията на физиологичния разтвор. Тези данни са основание да се твърди, че МН-1 моноклоналното антитяло може да инхибира тромбообразуването.

Във всеки експеримент е изследван ефекта на няколко различни концентрации на МН1 върху времето на съсирване, в сравнение с фибриногенова контролна реакция.

Фиг. 2 - профилите на съсирване (екстинкция/време), показващи повишаване инхибирането на съсирването с повишаване концентрацията на МН-1 в реакционната смес. (:1000= 1 pg/ml; 1:100 = 10 pg/ml; 1:50 = 20 pg/ ml; 1:20 = 50 pg/ml; 1:10 = 100 pg/ml; Фибриноген = контрола).

Депозиране на хибридома

Хибридомни клетъчни линии МН-1 и 45 J са депозирани в Американската колекция (АТСС) на 9 юни 1988 г. и имат съответно номера НВ 9739 и НВ 9740. АТСС се намира на адрес: 12301 Parklawn Drive, Rockwille, MD 20852. МН-1 антитялото е IgGj антитяло с лека капа верига и е установено, че МН-1 антитялото реагира, свързва човешки фибрин и заешки фибрин.

Настоящото изобретение не се ограничава в обхвата на депозираната хибридомна клетъчна линия АТСС No НВ 9739 или на моноклонално антитяло МН-1, което е пример на фибринспецифично антитяло, което инхибира тромбообразуването. Функционално еквивалентни фибринспецифични моноклонални антитела, или фрагменти или производни от тях, влизат в обхвата на изобретението. Терминът “функционално еквивалентни” означава, че моноклонални антитела, или фрагменти или производни от тях, имат способността на инхибират образуването на тромби чрез свързване към същия епитоп, към който се свързва МН-1 антитялото.

Настоящото изобретение може да бъде конкретно осъществено в други специфични форми без да се излезе от неговия обхват или съществените признаци, и съответно препратката по-скоро трябва да бъде направена към зависимите претенции, отколкото към горното описание, така както е маркиран замисъла на изобретението.

Всички публикации и патенти, цитирани по-горе са включени тук чрез отпратки.

Claims

Патентни претенции

1. Метод за инхибиране на тромбообразуване при човек, характеризиращ се с това, че включва прилагане върху човека, при необходимост от казаното инхибиране, на ефективна доза от неконюгирано фибринспецифично моноклонално антитяло.
2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че фибринспецифичното моноклонално антитяло е МН-1.
3. Метод за инхибиране на тромбообразуване при човек, характеризиращ се с това, че включва прилагане върху човека, при необходимост от казаното инхибиране, на ефективна доза фрагмент или производно от фибринспецифично оноклонално антитяло, който фрагмент или производно съдържа свързващия домен на антитялото.
4. Метод съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че неконюгираното фибринспецифично моноклонално антитяло е МН-1.
5. Метод за намаляване риска от постхирургични тромбозни усложнения, характеризиращ се с това, че включва прилагане при необходимост на ефективна доза от неконюгирано фибринспецифично моноклонално антитяло върху човека.
6. Метод съгласно претенция 5, характеризиращо се с това, че неконюгираното фибринспецифичното моноклонално антитяло е МН-1.
7. Метод съгласно претенция 5, харак10 теризиращ се с това, че включва прилагане на неконюгирано фибринспецифично моноклонално антитяло при постхирургични тромбозни усложнения от ангиопластика.
8. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че включва прилагане на неконюгирано фибринспецифично моноклонално антитяло при постхирургични тромбозни усложнения при трансплантация на органи.
9. Метод за намаляване риска от постхирургични тромбозни усложнения, характеризиращ се с това, че включва прилагане върху човек при необходимост от такова въздействие на ефективна доза от фрагмент или производно от фибринспецифично моноклонално антитяло, който фрагмент или производно съдържа свързващия домен на антитялото.
10. Метод съгласно претенция 9, в който фибринспецифичното моноклонално антитяло е МН-1.
11. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективна доза от неконюгирано фибринспецифично моноклонално антитяло върху човека при постхирургични тромбозни усложнения от ангиопластика.
12. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективна доза от неконюгирано фибринспецифично моноклонално антитяло върху човека при постхирургични тромбозни усложнения при трансплантация на органи.
13. Метод за лечение на тромбозно съдово заболяване на човек, характеризиращ се с това, че включва прилагане върху човека на ефективна доза от неконюгирано фибринспецифично моноклонално антитяло.
14. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че фибринспецифичното моноклонално антитяло е МН-1.
15. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че тромбозното съдово заболяване е мозъчен инсулт.
16. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че тромбозното съдово заболяване е белодробна емболия.
17. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че тромбозното съдово заболяване е дълбока венозна тромбоза.
18. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че тромбозното съдово заболяване е артериална или венозна тромбоза.
19. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че тромбозното съдово заболяване е атеросклероза.
20. Метод за лечение на тромбозно съдово заболяване на човек, характеризиращ се с това, че включва прилагане върху човека при необходимост от казаното лечение, на ефективна доза от фрагмент или производно от фибринспецифично моноклонално антитяло, който фрагмент или производно съдържа свързващия домен на казаното антитяло.
21. Метод съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че фибринспецифичното моноклонално антитяло е МН-1.
22. Метод съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че тромбозното съдово заболяване е мозъчен инсулт.
23. Метод съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че тромбозното съдово заболяване е белодробна емболия.
24. Метод съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че тромбозното съдово заболяване е дълбока венозна тромбоза.
25. Метод съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че тромбозното съдово заболяване е артериална или венозна тромбоза.
26. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че тромбозното съдово заболяване е атеросклероза.
27. Фармацевтичен състав за инхибиране на тромбообразуването при човек, характеризиращ се с това, че включва неконюгирано фибринспецифично моноклонално антитяло и фармацевтично-приемлив носител и е в стерилна форма.
28. Състав съгласно претенция 27, характеризиращ се с това, че фибринспецифичното моноклонално антитяло е МН-1.
29. Фармацевтичен състав за инхибиране на тромбообразуването при човек, характеризиращ се с това, че съдържа фрагмент или производно от фибринспецифично моноклонално антитяло, който фрагмент или производно съдържа свързващия домен на казаното антитяло, и фармацевтично приемлив носител, и е в стерилна форма.
30. Състав съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че фибринспецифичното моноклонално антитяло е МН-1.
31. Кит за въздействие върху човек при необходимост от инхибиране на тромбообразуване, характеризиращ се с това, че съдържа неконюгирано фибринспецифично моноклонално антитяло, или фрагмент или производно от него, съдържащ свързващия домен на казаното анти- 5 тяло, който е в стерилна форма.
32. Кит съгласно претенция 31, характеризиращ се с това, че фибринспецифичното мо ноклонално антитяло е МН-1.
33. Кит съгласно претенция 31, характеризиращ се с това, че съдържа и фармацевтично приемлив носител, и е в стерилна форма.
34. Кит съгласно претенция 33, характеризиращ се с това, че фибринспецифичното моноклонално антитяло е МН-1.