CN1146157A - 用作抗血栓形成剂的纤维蛋白特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用纤维蛋白特异性抗体在体内抑制血栓形成的方法。还提供了用于该方法的药用组合物以及试剂盒。

Description

用作抗血栓形成剂的纤维蛋白特异性抗体
    1.本发明领域
本发明涉及使用纤维蛋白特异性抗体在体内抑制血栓形成的方法。还提供了用于该方法的药用组合物。
    2.本发明的背景
    2.1.疾病或手术中的血栓形成
血液凝块或血栓在血管损伤处形成。病理学血栓形成或血栓疾病的临床表现极其多样化且包括深部静脉血栓形成(DVT)和动脉及静脉血栓形成。其它血管疾病(例如，动脉粥样硬化)的血栓栓塞和血栓并发症可导致主动脉的闭塞，引起器官局部缺血并出现危及生命的症状，如脑血管疾病(中风)，心肌梗塞等。
另外，侵入性手术过程，包括但不局限于气球血管形成术和器官移植(天然的和人工的)可能触发血栓形成。例如，气球血管形成术(一种用于清除闭塞的动脉的方法)实际上可能损伤动脉管壁，经过新的血栓沉积触发重新闭塞。一份报道指出经皮肤的转鲁米那冠状血管形成术持续受25-35％频率的血管重新闭塞的侵扰。Gimple，L.W.，et al.Circulation，86：1536-46(1992)。也见于Sarembock，I.J.，et al.，Circulation，80：1029-40(1989)；和Ip.J.H.，et al.，JACC，17：77B-88B(1991)。事实上，一份报道指出“在大多数情况下涉及内皮损伤和血小板破裂或解体的血管形成术的机制与导致急性局部缺血综合症的过程非常相似”。Tenaglia，A.N.，Ann.Rev.Med.，44：465-79，466(1993)。
由于用诸如肝素和香豆素的抗凝血剂进行的全身性治疗在防止血管形成术后重新闭塞上显示出很少或没有效力(Ip.J.H.，et al.，JACC，17：77B-88B(1991))，并且由于这类抗凝血剂治疗在病人中常有全身性出血的危险(Phvsicians’Desk Reference，47th Ed.，Medical Economics Data(1993))，所以抵制或干扰血栓形成的新位点特异性治疗方法在已存在血管疾病的情况下和在侵入性手术过程中均是有用的。
    2.2.止血系统
形成血栓的止血机制是涉及修复受伤血管损伤的复杂生理学反应机制。见Harker，L.A.，and Mann，K.G.，“Thrombosis andFibrinolysis”in：Thrombosis in Cardiovascular Disorders，Fuster，V.and Verstraetc，M.(eds)，W.B.Saunders Co.(1992)，pp.1-16。
血小板和凝血系统之间的协同作用在损伤的血管壁间完成了止血。见Furie，B.and Furie，B.C.，Cell，53：505-18(1988)。
凝血系统的作用是提供不溶性纤维蛋白基质以稳定和锚着已在损伤处的受伤血管内皮下结构上集结的血小板栓。凝血是涉及酶促反应链的放大过程，其中酶原(凝血因子)被依次激活以形成活性酶。从循环的纤维蛋白原形成纤维蛋白基质是这一级联顺序的酶促反应的结果，该反应导致凝血酶在所需位点爆发式生产，经凝血酶使纤维蛋白酶原转变为纤维蛋白，经XIIIa因子使纤维蛋白交联，从而形成血栓。
反应顺序可简单地以如下三步过程代表：
                      凝血酶步骤1-蛋白水解：纤维蛋白原---→纤维蛋白单体
  (DesAA，Des AABB)＋FPA和FPB步骤2-聚合作用：纤维蛋白单体←可溶性纤维蛋白多聚体
  (未交联的和交联的)步骤3-凝血：可溶性纤维蛋白多聚体→不溶性纤维蛋白凝块
  纤维蛋白原由三对不同多肽组成：Aα，Bβ和γ。见L.Stryer，Biochemistry，3rd Ed.，W.H.Freeman and Company New York(1988)，p.249。在纤维蛋白原转变成纤维蛋白的起始步骤中，如上面步骤1所示，纤维蛋白原被凝血酶裂解，从两个纤维蛋白原Aα-链的氨基末端释放出纤维蛋白肽A(FPA)。纤维蛋白原分子的剩余部分是命名为DesAA的“纤维蛋白单体”。也如步骤1中所示，凝血酶也同时(但更缓慢地)从两个纤维蛋白原Bβ-链氨基末端裂解纤维蛋白肽B(FPB)。该第二裂解过程后纤维蛋白原分子的剩余部分也是纤维蛋白单体，称为DesAABB。由于FPA和FPB的释放，在纤维蛋白单体α和β链上暴露出新的氨基末端。见W.Nieuwenhuizen，Blood Coagulationand Fibrinolysis，4：93-96(1993)。在步骤2中，纤维蛋白单体开始自发形成单体内非共价键(非交联的)以形成可溶性多聚体。XIIIa因子经酶促在纤维蛋白单体单位间加入共价键作用于该多聚体。交联多聚体可保持可溶，但在聚合和交联过程中的某点处，纤维蛋白多聚体变成不可溶，形成纤维蛋白凝块，如在步骤3中所示。
可溶性纤维蛋白多聚体是纤维蛋白凝块的最接近前体。因此，据信在即将发生或存在血栓形成的个体中可溶性纤维蛋白多聚体的血浆水平会升高。已显示在血液中对这些多聚体，尤其是DesAABB可溶性纤维蛋白多聚体的量的检测和测量可作为早期血液凝块形成的征兆。见Nieuwenhuizen，p.94；and Marder et al.，United States Patent No.5，206，140。
    2.3.针对止血系统成份的抗体
天然存在和实验室产生的抗体在鉴定止血系统的成份和解释其功能中均发挥着作用。
Marciniak，E.，and Greenwood，M.F.，Blood，53：81-92(1979)描述了在14岁唐氏先天愚症病人血清中凝血抑制剂的例子，它以IgG片段的形式存在并抑制从纤维蛋白原中酶促释放纤维蛋白肽A。Hoots，W.K.et al.，New Eng.J.Med.，304：857-61(1981)描述了患有慢性感染性肝炎及凝血缺陷的13岁病人的例子，其中追踪该缺陷为存在在病人血液中对纤维蛋白原和纤维蛋白都表现出高度亲和力的抗体，并且它抑制纤维蛋白单体的聚合，从而防止形成纤维蛋白胶体。
Sola.B.et al.，Thromb Res.，29：643-53(1983)描述了分泌对人纤维蛋白原和纤维蛋白都具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的建立。Elms.M.J.，et al.，Thromb.Haemostas，50：591-94(1983)描述了分泌识别D二聚体中抗原决定簇(交联纤维蛋白降解产生的特异性片段)的单克隆抗体之杂交瘤细胞系的制备。Hui，K.y.，et al.，Scierce，222：1129-32(1983)和Scheefers-Borchel，U.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：7091-95(1985)描述了分别代表人纤维蛋白α或β链氨基末端的合成六肽作为抗原用于生产即使在纤维蛋白原存在的条件下结合纤维蛋白的单克隆抗体。Kudryk，B.，et al.，Mol.Immunol.，21：89-94(1984)描述了分泌针对纤维蛋白原N-DSK部分的单克隆抗体之杂交瘤细胞系的制备。Sobel.J.H，et al.，Thromb and Haem，60：153-59(1988)描述了结合纤维蛋白原CNBr Aα链片段的两个不同单克隆抗体在研究相邻纤维蛋白分子间早期α链交联事件中的应用。Mirshahi.M.，et al.，Fibrinogen，4：49-54(1990)描述了分泌能抑制纤维蛋白聚合的抗纤维蛋白原单克隆抗体之杂交瘤细胞系的制备。Cierniewski，C.S.，and Budzynski.A.Z.，Biochemistry，31：4248-53(1992)描述了抑制纤维蛋白单体聚合速率及干扰凝血酶对纤维蛋白原作用的抗纯化人纤维蛋白原多克隆和单克隆抗体的制备和使用。Tymkewycz，P.M.，et al.，Blood Coag andFibrinol.，4：211-21(1993)描述了对纤维蛋白具有高度亲和力且不与纤维蛋白原发生反应的5种单克隆抗体的生产。Gargan，P.E.，et al.，Fibrinolvsis：7：275-83(1993)描述了生产对交联和非交联纤维蛋白多聚体结构都具有特异性但对纤维蛋白原和纤维蛋白或纤维蛋白原的任何降解产物都无可检测的免疫反应性的单克隆抗体之杂交瘤细胞系MH-1的建立。此外，MH-1抗体不与DesAA或DesAABB纤维蛋白单体反应，与纤维蛋白原的单个α，β，或γ链也检测不到任何反应性。
至于对止血系统成份特异性单克隆抗体的使用的进一步讨论可参见Kudryk，B.J.et al.，“Monodonal Antibodies as Probes for fibrin(ogen)Proteolysis”in：Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy，Chatal，J-F(ed)，CRC Press，Boca Raton，Fl.(1989)，pp.365-398。
已形成抗止血成份的修饰的抗体在临床上用作血栓原位成像的试剂。例如，见Liau，C-S and Su.C-T.，J.Form.Med.Med.Assoc.，88：209-12(1989)；Wasser，M.N.J.M.et al.，Blood，74：708-14(1989)；Walker，K.Z.et al.，Eur.J.Nucl.Med.，16：787-94(1990)；Alavi，A.，et al.，Radiology，175：79-85(1990)；Wasser，M.N.J.M.et al.，Thromb.Res，Supp.X：91-104(1990)；和Kanke.M.et al.，J.Nucl.Med.，32：1254-60(1991)。
已研制与血栓裂解酶连接的抗纤维蛋白抗体用于治疗用途，例如见Bode，c.，et al.，Science，229：765-67(1985)。在该报道中，位点特异性传递血栓裂解剂似乎显著增强了裂解凝块的试剂效力。
最后，一些美国专利公开了针对纤维蛋白原，纤维蛋白或其降解产物特异性单克隆抗体的制备和/或使用方法。见美国专利号4,722,903；4,758,524和4916070，所列出的这些文献并非穷举。
    2.4.防止血栓形成的方法
抗血栓治疗术典型地包括施用一种或多种抗凝剂，如肝素或香豆素。Physicians’Desk Reference，47th Ed.，Medical EconomicsData(1993)；The Merck Manual of Diagnostics and Therapy，15th Ed.，Merck Sharpe & Dohme Research Labs(1987)。这些抗凝剂通常用于尝试防止患有血管疾病的病人复发血栓形成和尝试防止血管形成术后急性血栓重新闭塞。
使用这类全身性抗凝血剂的主要缺点是有全身性出血的危险。用药医生被警告“在接受肝素的病人中实际上任何部位都可能发生出血”。PhVsicians’Desk Reference，47th Ed.，Medical Economics Date(1993)，p.2568。
另外，这类抗凝剂在血管形成术后防止重新闭塞效力显示出与安慰剂治疗无区别或无可重复性。(Ip.J.H.，et al.，JACC，17：77B-88B(1991))。因此，使用这类抗凝血剂的优势在防止重新闭塞中被出血的危险和其有疑问的效力抵销。
许多生物学和机械学方法已被用于减少血管形成术后重新闭塞率的尝试中，但尚无治疗方法显示出一致的阳性结果。因此，对将抗血栓剂“位点特异性地”或“直接”传递给血管受伤位点的兴趣不断增强。Gimple，L.W.，et al.，Circulation，86：1536-46(1992)。
利用抗止血系统合适成份的抗体位点特异性地传递抗血栓剂将有助于将这类试剂定位于血管损伤位点。这种定位的一个优势是需要用药的剂量更低。定位的第二个优势是减少全身性出血的危险。
在一些例子中，抗止血系统特定成份的抗体本身显示出抑制纤维蛋白聚合。Francis，S.E.，et al.，Am.J.Hem，18：111-19(1985)描述了对具有“温和”抗凝血剂活性的抗纤维蛋白原单克隆抗体的研究。Mirshahi，m.，et al.，Fibrinogen，4：49-54(1990)，描述了分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系的获得，其中抗原是片段D，一种纤维蛋白原的血纤维蛋白溶酶降解产物。这些单克隆抗体与纤维蛋白原发生强烈反应并抑制纤维蛋白聚合。Ciernewski，C.S.，and Budzynski，A.Z.，Biochemistry，31：4248-53(1992)描述了三种不同杂交瘤细胞系的获得，其中抗原是天然人纤维蛋白原，且它分泌的单克隆抗体抑制纤维蛋白聚合速率。
然而，这三份报道在研制点特异性治疗性或预防性抗血栓剂中都具有很少或没有用处。这是因为在这些例子中抗体与纤维蛋白原或纤维蛋白原降解产物发生交叉反应，所有这些抗原在止血系统中是普遍存在的。任何这类施用给病人的抗体将与纤维蛋白原或纤维蛋白原降解产物结合起来，不能在血管损伤位点抑制纤维蛋白聚合或血栓形成。
本发明经过利用纤维蛋白特异性(即与纤维蛋白原或与来自纤维蛋白原或纤维蛋白的血纤维蛋白溶酶降解产物无明显的交叉反应性)单克隆抗体使人们获得抑制血栓形成的完全不同的方法。本发明提供了所说的纤维蛋白特异性单克隆抗体的使用方法，它在血管损伤位点惊人地抑制血栓形成。
    3.本发明概述
本发明提供了经过施用纤维蛋白特异性单克隆抗体在需要所说抑制的人类血管损伤位点抑制血栓形成的方法。本发明进一步提供了纤维蛋白特异性单克隆抗体的片段或衍生物，该片段和衍生物含有抗体结合区。本发明进一步提供了含有纤维蛋白特异性单克隆抗体或其片段或衍生物，以及药用上有效的载体的药物组合物，其足够的剂量在抑制人血栓形成中有效。本发明进一步提供了包含本发明药物组合物的一种或多种成份的药用试剂盒。
    4.附图的简要描述
图1.包括在纤维蛋白原/凝血酶凝血反应混合物中的MH-1单克隆抗体抑制凝血速率和绝对量。“纤维蛋白原”和“45J”是对照反应。
图2.包括在纤维蛋白原/凝血酶凝血反应混合物中的MH-1单克隆抗体量的增加导致凝血抑制水平的增加。“纤维蛋白原”是对照反应。
    5.本发明的详细描述
    5.1.本发明的效用
令人惊奇地发现纤维蛋白特异性单克隆抗体可抑制纤维蛋白聚合和血栓形成。因此纤维蛋白特异性单克隆抗体可用于预防或治疗经过抑制纤维蛋白聚合或血栓形成可预防或治疗的任何人类疾病。例如，纤维蛋白特异性单克隆抗体在治疗患有涉及病理性血栓形成危险的任何血管疾病的病人中有用。这类血管疾病的非限制性例子包括深部静脉血栓形成(DVT)，动脉和静脉血栓形成，中风，血栓栓塞，肺栓塞和动脉粥样硬化血栓并发症。
纤维蛋白特异性单克隆抗体在例如：侵入性手术过程的准备，进行或恢复的人类治疗中也是有用的。为本发明目的，术语“侵入性手术过程”指可导致动脉或静脉血管损伤、可引起血栓并发症的任何手术过程。这类过程的非限制性例子包括气球血管形成术，器官移植(天然的或人工的)。
除了纤维蛋白特异性单克隆抗体外，用已知技术可产生含纤维蛋白特异性抗体的独特型(结合区)的抗体片段。例如，这些片段包括但不限于：(1)能用胃蛋白酶消化抗体分子生产的F(ab’)2片段；(2)能经过减少F(ab’)2片段的二硫键产生的Fab’片段；(3)能经过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段。这类抗体片段包括在本发明的范围内。至于抗体片段的制备和使用的其它例子，参见Parham，P.，et al.，J.Immunol.Meth.，53：133(1982)；和Khaw，B-A，et al.，J.Nucl Med.，34：2264-68(1993)。
除了纤维蛋白特异性单克隆抗体和抗体片段外，可用已知方法生产含纤维蛋白特异性抗体独特型(结合区)的其它抗体衍生物。例如，可合成重组的和合成的寡核苷酸及其类似物，作为纤维蛋白特异性单克隆抗体或其片段，诱发相同的对血栓形成的抑制效应。这些衍生物包括在本发明的范围内。具有根据单克隆抗体一级结合区的序列的合成寡肽之应用的其它例子见Knight，L.，et al.，J.Nucl.Med.，35：282-88(1994)。
最后，任何功能上等价的纤维蛋白特异性单克隆抗体，其片段或衍生物都在本发明的范围内。术语“功能上等价”是指任何纤维蛋白特异性单克隆抗体，或其片段或衍生物，在足够量时，它能经过与MH-1抗体所结合的相同抗原决定基结合在需要该治疗的人中抑制血栓形成。
    5.2.MH-1单克隆抗体的生产和鉴定
许多早期研究方法采用从可溶性纤维蛋白片段和合成肽免疫动物，产生浓缩的纤维蛋白特异性抗体，所述片段和合成肽模拟暴露的纤维蛋白上的新抗原位点。见Hui，K.Y.，et al.，Science 222：1129-32(1983)；Scheefers-Borchel.U.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：7091-95(1985)；Elms，M.J.，et al.，Thromb Haemostas，50：591-94(1983)；和Kudryk，B.et al.，Mol.Immunol.，21：89-94(1984)。然而，据信这类抗体的结合位点在纤维蛋白降解过程中保留下来，因此，抗体也可结合纤维蛋白降解产物。
Gargan et al.于1992年6月9日公开的美国专利号5,120,834(下文称“834专利”)(本文引用以供参考)涉及经过用选定抗原免疫所说的无菌动物从无菌动物生产单克隆抗体的一般方法。据信使用无菌系统生产单克隆抗体的优势在于这种系统对抗原表现出极大增强的免疫反应，增加了使产生能结合抗原的特异性抗原决定基之抗体的B淋巴细胞定位的可能性。已确定这类系统对产生抗纤维蛋白的高度特异性抗体特别有用，且所说抗体对纤维蛋白原具有很小或无交叉反应性。产生这样一种区别对待的抗体尚存在困难，因为估计纤维蛋白和纤维蛋白原之间的结构和构象相似性大于98％(Plow，E.F.，et al.，Semin.Thromb.Haemostas，8：36(1982))。因此，事实上在纤维蛋白分子上只有小部分抗原决定基是新抗原(即，对纤维蛋白是单一的)。
’834专利涉及分泌单克隆抗体MH-1的杂交瘤细胞系ATCC No.HB 9739。MH-1单克隆抗体对交联的和未交联的纤维蛋白多聚体具有特异性，但与纤维蛋白原或纤维蛋白原或纤维蛋白的血纤维蛋白溶酶降解产物不发生交叉反应。
根据在’834专利中公开的方法纯化MH-1。MH-1特异性地结合纤维蛋白，但在竞争试验中与纤维蛋白原不发生交叉反应。MH-1与任何血纤维蛋白溶酶产生的纤维蛋白原降解产物不发生交叉反应，也不与任何血纤维蛋白溶酶产生的交联纤维蛋白降解产物发生交叉反应。结果，可推断：(1)MH-1识别完整纤维蛋白分子的抗原决定基，该抗原决定基在前体分子(纤维蛋白原)的表面不存在或未暴露；(2)该抗原决定基明显被血纤维蛋白溶酶消化交联的纤维蛋白所破坏。
以Scatchard分析(Frankel，et al.，Mol.Immunol.，16：101-6(1979))进一步鉴定了MH-1，使用125I标记的MH-1抗体测定了MH-1对纤维蛋白的亲和力。获得的解离常数KD值为6.7×10-10M，该亲和力是组织血纤维蛋白溶酶原活化剂对纤维蛋白亲和力的大约5,000倍。
Western免疫印迹分析表明MH-1与纤维蛋白原的Aα，Bβ或γ链不发生交叉反应。同一方法还表明MH-1不与凝血酶处理的纤维蛋白原的Aα，Bβ链发生交叉反应。另外，ELISA分析表明MH-1与交联纤维蛋白和非交联纤维蛋白都发生反应，对交联纤维蛋白的亲和力在两者中更大。
    5.3.用药方法
根据本发明，将纤维蛋白特异性单克隆抗体或其片段或衍生物施用给需要治疗以抑制血栓形成的人类。施用给人的抗体或其片段或衍生物优选是未与任何放射标记物，血栓裂解剂或其它试剂或任意其它分子或其部分接合的形式。然而，本发明的方法也可使用与放射性标记物、血栓溶解剂或其它试剂或任意分子或其部分连接的抗体或衍生物来完成，该方法也应包括在本发明的范围内。
术语“载体”指与纤维蛋白特异性单克隆抗体或其片段或衍生物一起施用的稀释剂、赋形剂或载体。
术语“药用载体”指被联邦管理机构或被政府批准的或在美国药典或其它普遍认可的药典中列出的用于动物，更具体地说是用于人类的载体。
用于本发明的术语“抗血栓组合物”指包含纤维蛋白特异性单克隆抗体或其片段或衍生物以及药用上可接受的载体的组合物，在足够量时它能在需要所说抑制的人中抑制血栓形成。
用于本发明的术语“有效剂量”意思是指单克隆抗体或其片段或衍生物的量足以在需要这类治疗的人中抑制血栓形成。该剂量不应太大以致引起有害的副作用，如不需要的交叉反应或过敏性反应或类似反应。一般来说，该剂量随病人的年龄、状态、性别和疾病程度，抵抗适应症(如果有的话)，免疫耐受性和其它这类可变因素而变化，所述剂量由各医生来判断。尽管剂量随个体环境因素而改变，但在大多数血管疾病例子中和在大多数手术条件下，该剂量由需要治疗的人的体重来测定，变化范围为从大约1μg/kg体重至大约50μg/kg体重，优选范围为大约5μg/kg体重到大约10μg/kg体重。
    5.4.用药方法
可经任何合适的方式给人体施用纤维蛋白特异性单克隆抗体或其片段或衍生物，包括经单个大丸药注射，连续输注或经这两种方法结合进行肠胃外用药。也可经用插管直接输注用药，如在指示的冠状内用药。
肠胃外用药的制品包括，例如，在无菌，无内毒素的生理盐水中重新配制的冻干的纤维蛋白特异性单克隆抗体或其片段或衍生物或更普遍的是可包括在无菌水或非水溶液、悬液和乳剂中的重新配制或分散的纤维蛋白特异性单克隆抗体或其片段或衍生物。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇，植物油如橄榄油和可注射的有机酯，如油酸乙酯。含水载体包括水，乙醇/水溶液，乳剂或悬液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液，任氏葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸化的任氏液或固定油。静脉内载体包括流体和营养填充剂，如以任氏葡萄糖为基础的载体和类似物。也可存在保存剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体等等。本发明的药用组合物可优选是无菌形式以便满足美国食品和药品管理局提出的无菌标准。
本发明还提供了包含贮存在同一或分装容器中的本发明的药用组合物的一种或多种成份的药用试剂盒。可任何与这类容器相联合的通告形式是由管理药用或生物学产品的生产、使用或销售的政府机构规定的，该通告反应了人用药的生产，使用或销售管理机构的批准情况。任选与仅含有冻干抗体，或其片段或衍生物的试剂盒相联合的可以是对适于施用给需要治疗的人的载体进行的说明。
治疗的程度，疗程，时间和方法随需要治疗的人的年龄、体重、症状和性别而变化，并随所需治疗的疾病的类型和程度而变化，由用药医生根据各具体情况来判断。治疗可在任何手术过程之前、期间或之后用药，或在该过程之前和期间都用药，或在该过程期间和之后都用药，或在该过程之前，期间和之后都用药，这取决于病例的具体情况。
例如，在诸如气球血管形成术的手术过程的情况下，通常病人已存在大量广泛分布的血凝块。在这种情况下，在进行气球血管形成术之后立即施用抗血栓组合物一般是有利的，优选在血管形成插管仍在原位时使用该插管，以便抗血栓组合物直接流向血管损伤部分，从而使治疗集中在该位置。这可防止由诸如抗体与非相关位点的血栓结合引起的抗血栓组合物的丢失。
在涉及对无病理性血栓形成病史的病人进行侵入性手术过程的情况下，一般优选在该过程之前或期间施用抗血栓组合物，因为这样降低了抗血栓组合物因在非相关位点结合而丢失的危险。
而且，在大多数涉及侵入性手术过程的情况下，形成凝血危险增加的时间是就在完成该过程之后。因此，仅仅有限次数的治疗，或甚至是足够时间的一次治疗可足以有效地抑制血栓形成，从而基本上减少了手术诱导的凝血对病人产生的危险。
在慢性血栓疾病的情况下，抗血栓治疗的时间、期限和次数极大地取决于治疗前或后对病人状态的诊断和对初次抗血栓治疗的反应，这应由主治医生来确定，监测或估计。
    5.5.测定治疗效果
用MH-1单克隆抗体或用其片段或衍生物进行抗血栓治疗的效力可用标准方法测定。这类方法的例子包括但不限于：(1)以动脉或静脉染色流成相进行血管造影监测，在出现染色流堵塞的位置表明需要进一步治疗；(2)使用闪烁法，利用与放射性标记相连的血栓特异性抗体，其中可监测血栓大小和位置作为需要进一步治疗的信号；(3)监测临床症状的出现和程度，其中数目的增加或症状的严重性表明需要进一步治疗；(4)测量人体血液中纤维蛋白原的水平，因为纤维蛋白原和纤维蛋白水平反相关，其中纤维蛋白原水平的下降表明纤维蛋白水平和纤维蛋白的聚合可能相应地增加，指示需要进一步的治疗。
由于已一般性描述了本发明，以本文所包括的仅作为举例目的而不用作限定的具体实施例作参考将更易于理解本发明。
    5.6.实施例凝血的体外抑制
为测定MH-1对凝血的影响进行了一系列的体外实验。
纯化的人纤维蛋白原(Kabi，Chromogenix Co.Ohio)在生理pH下以1mg/ml的浓度溶于150mM磷酸盐缓冲盐水中，在微滴定板(costar)各孔中放入大约100μl。向各孔中加入大约50μl牛凝血酶使终浓度为0.5NIH单位/ml以形成反应混合物。在0时间向反应混合物中加入大约50μl的下列成份之一：(1)MH-1单克隆抗体，终抗体浓度为100μg/ml；(2)45J单克隆抗体(与纤维蛋白和纤维蛋白原交叉反应的45J单克隆抗体由杂交瘤细胞系ATCC No.HB 9740分泌，该细胞系以常规方法利用常规Balb/c小鼠制备，其中用纤维蛋白免疫小鼠)，终抗体浓度为200μg/ml，或(3)生理盐水。反应在37℃下进行60分钟。每隔2分钟在340nm下以分光光度术测定凝血。吸光率的增加表明形成凝血。凝血过程的终止可在吸光率/时间曲线中以平台观察到。
图1表示用MH-1处理抑制凝血率，作为证据，用MH-1处理的反应混合物的吸光率/时间曲线的起始斜率与45J对照反应混合物或盐水对照反应混合物(纤维蛋白原)相比更低。另外，MH-1降低了发生凝血的绝对量，测量为曲线的平台水平比对照反应更低。含45J抗体(以MH-1两倍的浓度)的对照反应混合物与盐水对照反应相比不表现出任何凝血抑制。这一数据支持了MH-1单克隆抗体能抑制血栓形成的主张。
在第二个实验中试验了与纤维蛋白原对照反应比较，几种不同浓度的MH-1对凝血时间的影响。图2显示了凝血反应图(吸光率/时间)、表明凝血反应的抑制随反应混合物中MH-1浓度的增加而增加。(1∶1000＝1μg/ml；1∶100＝10μg/ml；1∶50＝20μg/ml；1∶20＝50μg/ml；1∶10＝100μg/ml；纤维蛋白原＝对照)。
    5.7.杂交瘤的保藏
杂交瘤细胞系MH-1和45J于1988年6月9日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)并分别给定了保藏号HB 9739和HB 9740。ATCC位于12301 Parklawn Drive，Rockville，MD，20852。MH-1抗体是具有κ轻链的IgG1抗体，已观察到MH-1抗体与人纤维蛋白和兔纤维蛋白交叉反应。
本发明并不打算将范围限定到保藏的杂交瘤细胞系ATCC No.HB9739或MH-1单克隆抗体，而试图作为抑制血栓形成的纤维蛋白特异性单克隆抗体的一个说明。任何功能上等价的纤维蛋白特异性单克隆抗体或其片段或衍生物都在本发明的范围内。术语“功能上等价的”是指单克隆抗体，或其片段或衍生物能经过与MH-1抗体所结合的相同抗原决定基结合来抑制血栓形成。
本发明可以以其它不偏离其精神或基本性质的其它特定形式来体现，因此，应参考所附权利要求而不是上面的说明书来表示本发明的范围。
上面引证的所有文献和专利引入本文以供参考。

Claims (34)

1.一种抑制人血栓形成的方法，包括给需要所说抑制的人施用有效剂量的纤维蛋白特异性单克隆抗体。
2.权利要求1的方法，其中的纤维蛋白特异性单克隆抗体是MH-1。
3.一种抑制人血栓形成的方法，包括给需要所说抑制的人施用有效剂量的纤维蛋白特异性单克隆抗体的片段或衍生物，其中该片段或衍生物含有所说抗体的结合区。
4.权利要求3的方法，其中纤维蛋白特异性单克隆抗体是MH-1。
5.一种治疗人类以减少人手术后血栓并发症危险的方法，包括给需要所说治疗的人施用有效剂量的纤维蛋白特异性单克隆抗体。
6.权利要求5的方法，其中纤维蛋白特异性单克隆抗体是MH-1。
7.权利要求5的方法，其中所说的手术后血栓并发症由血管形成术引起。
8.权利要求5的方法，其中所说的手术后血栓并发症由器官移植引起。
9.一种治疗人类以减少人手术后血栓并发症危险的方法，包括给需要所说治疗的人施用有效剂量的纤维蛋白特异性单克隆抗体片段或衍生物，该片段或衍生物含有所说抗体的结合区。
10.权利要求9的方法，其中纤维蛋白特异性单克隆抗体是MH-1。
11.权利要求9的方法，其中所说的手术后血栓并发症由血管形成术引起。
12.权利要求9的方法，其中所说的手术后血栓并发症由器官移植引起。
13.一种治疗人血栓性血管疾病的方法，包括给需要所说治疗的人施用有效剂量的纤维蛋白特异性单克隆抗体。
14.权利要求13的方法，其中纤维蛋白特异性单克隆抗体是MH-1。
15.权利要求13的方法，其中血栓性血管疾病是中风。
16.权利要求13的方法，其中血栓性血管疾病是肺栓塞。
17.权利要求13的方法，其中血栓性血管疾病是深部静脉血栓形成。
18.权利要求13的方法，其中血栓性血管疾病是动脉或静脉血栓形成。
19.权利要求13的方法，其中血栓性血管疾病是动脉粥样硬化。
20.一种治疗人血栓性血管疾病的方法，包括给需要所说治疗的人施用有效剂量的纤维蛋白特异性单克隆抗体的片段或衍生物，该片段或衍生物含所说抗体的结合区。
21.权利要求20的方法，其中纤维蛋白特异性分子单克隆抗体是MH-1。
22.权利要求20的方法，其中血栓性血管疾病是中风。
23.权利要求20的方法，其中血栓性血管疾病是肺栓塞。
24.权利要求20的方法，其中血栓性血管疾病是深部静脉血栓形成。
25.权利要求20的方法，其中血栓性血管疾病是动脉或静脉血栓形成。
26.权利要求20的方法，其中血栓性血管疾病是动脉粥样硬化。
27.一种药用组合物，包含一种未连接的纤维蛋白特异性单克隆抗体和一种药用载体，其中所说的组合物是以无菌形式存在。
28.权利要求27的组合物，其中的纤维特异性单克隆抗体是MH-1。
29.一种药用组合物，包含未经结合的纤维蛋白特异性单克隆抗体片段或衍生物，以及一种药用载体，该片段或衍生物含所说抗体的结合区，其中所说的组合物是以无菌形式存在。
30.权利要求29的组合物，其中纤维蛋白特异性单克隆抗体是MH-1。
31.一种用于治疗需要抑制血栓形成的人类的试剂盒，其中所说的试剂盒包含未经结合的纤维蛋白特异性单克隆抗体或含所说抗体结合区的其片段或衍生物，它是以无菌形式存在的。
32.权利要求31的试剂盒，其中纤维蛋白特异性单克隆抗体是MH-1。
33.权利要求31的试剂盒，进一步包含药用载体，它是以无菌形式存在的。
34.权利要求33的试剂盒，其中纤维蛋白特异性单克隆抗体是MH-1。
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