BG61042B1

BG61042B1 - Биометалургичен метод за биоокисляване на минерали

Info

Publication number: BG61042B1
Application number: BG95433A
Authority: BG
Inventors: Nora Panos
Original assignee: Leaching S.R.L.; Billiton Chile S.A.
Priority date: 1990-11-07
Filing date: 1991-11-07
Publication date: 1996-09-30
Also published as: AP283A; FI915244A0; MX9101933A; GR3019831T3; CA2054806C; FI915244A; DE69117016T2; DE69117016D1; RU2099432C1; PE14091A1; EP0489258A1; AU8699391A; JPH0841553A; DK0489258T3; ZA918770B; BR9104843A; AR245506A1; AU643566B2; AP9100333A0; YU176991A

Abstract

Методът намира приложение в хидрометалургията. С него се повишава скоростта на микробното окисляване на минералите. По метода минерални съединения отруди или концентрати, представляващи субстрати замикроорганизми, се подлагат на биоокисление, разтваряне и разделяне. През първия етап рудата или концентратът се обработват с киселина в минимално количество, осигуряващо пълното и равномерно подкисляване на субстрата, неутрализирането на материала исредата за развитие на микроорганизмите. През втория етап се добавя микробен инокулат, който окислява полезните минерали и обогатява микробната флорана минералната руда. През третия етап спонтанно или принудително се отделя излишъкът от вода чрез изпаряване или дехидратиране във въздушен поток до постигане на достатъчно ниска равновесна влажност,осигуряваща получаването на твърдофазен биоокислен продукт, съдържащ колонии от микроорганизми. В четвъртия етап продуктите на биоокислението се разделят.

Description

Изобретението се отнася до метод, при които минерали от минерални руди или рудни концентрати, които едновременно са субстрат за микроорганизми, се подлагат на биоокисление, с цел да се разтворят и разделят.

Методът намира приложение в металур10 сляване на сулфидните минерали се дължи на наличието на ферикатиони, които от своя страна са получени при бактериалното окисляване на руди, съдържащи ферожелязо и железосъдържащи сулфидни минерали.

В настоящия патент се анализира биологичното окисляване на пирит по най-вероятната реакция:

4FeS₂+15O₂ + 2H₂0 бактериално 2Fe₂(SO₄)₃ + 2H₂SO₄ ги ята.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Биотехнологията на металите е наука за извличане на метали от минерали, рудни концентрати, скални материали и разтвори с помощта на микроорганизми или на техни метаболити при нормално налягане и температурен интервал от 5 до 90°С. Конкретно технологично приложение на биотехнологията на металите е биометалургията, при която с помощта на ацидофилни микроорганизми се извършва окисляване на сулфидни руди, елементарна сяра, руди, съдържащи феро-желязо и редица др.метали, превръщайки ги в разтворими и лесно разделящи се съединения. Добре оптимизирана, тази технология допълва конвенционалните методи на екстрактивната хидрометалургия.

Доказано е, че чрез бактериална екстракция е възможно да бъдат окислени следните сулфиди: пирит и марказит (FeS₂), пиротит (FeS) халкопирит (CuFeS₂), борнит (Cu₅FeS₄), ковелит (CuS), халкоцит (Cu,S), тетрахидрид (Cu_gSb₂S₇), енарждит (3Cu₂S.As₂S₅), молибденит (MoS₂), сфалерит (ZnS), арсенопирит (FeAsS), риалгар (AsS), орпимент (As₂S₃), кобалтит (CoAsS), петландит ((Fe,Ni)₉S_g), виоларит (Ni₂FeS₄), бравоит ((NiFe)S,), мирерит (NiS), полидимит (Ni₃S₄), антимонит (Sb₂S₃), марматит (ZnS), галенит (PbS), геокронит Pb₅(Sb, As₂)S₈, а също така и Ga₂S₃, CuSe.

Известно е, че микробите окисляват неразтворимите сулфидни минерали както директно, така и индиректно, превръщайки ги в разтворими сулфати. При директно окисляване ензимната система на микроорганизмите атакува кристалната структура на сулфидните минерали и я разрушава. Индиректното окиГорната реакция илюстрира директното бактериално окисляване на пирита. Полученият 15 ферисулфат от своя страна окислява пирита, като образува феросулфат и елементарна сяра:

FeS + 7Fe,(SO ) + 8Н,0

2 4 3 2 химическо

15FeSO, + 8H,SO)

2 4

FeS₂ + Fe₂(SO₄)₃ химическо • 3FeSO, + 2S°

Рудата, съдържаща ферожелязо и сяра, претърпява бактериално окисляване:

бактериално

4FeSO₄ + О₂ + 2H₂SO₄-2Fe₂(SO₄)₃ + 2Н₂0

2S° + ЗО₂ + 2Н 0 бактериално. _{2Н S0}

2 2 4

Доказано е, че при халкоцита (Cu₂S) купройонът (Си^|+) и сулфидът (S²) се окисляват чрез микробната ензимна система съответно до Cu²⁺, S° и SO₄ ².

Подобен механизъм на бактериално окисляване е възможен за широк спектър сулфидни минерали.

Тиобацилните фероокислители и съответните им бактерии окисляват урановия йон 40 по следната реакция:

2U⁴⁺ + О₂ + 2Н₂0 бактериално. _2UQ^_{+ + 4Н+}

Важно значение при екстракцията на 45 уран има рудата, съдържаща ферижелязо. Fe³⁺окислява U⁴⁺ до U⁶⁺, който е разтворим в разтвори на сярна киселина.

UO₂+Fe₂(SO₄)₃ химическо

U0,S0₄ + 2FeSO

4 4 химическо

UO, + H,SO_A--UO,SO„ + FLO

2 4 2 4 2

II

Бактериите регенерират Fe³⁺ чрез окисляване на Fe²⁺ или FeS_r Чрез подобни на горните реакции могат да се окисляват много раз лични минерали. Най-важните микроорганизми в биохидрометалургията са представени в таблица 1.

Таблица 1

Важни микроорганизми в биометалурагията

Микроорганизми	Метод	Възможна сфера на приложение
Бактерии от класа на Тиобацилите и лептоспиралите: Тиобацили фероокислители Тиобацили тиоокислители Ацидофилни тиобацили (Syn.T.organoparus) Лептоспирили фероокислители в смесени щамове с Т.тиоокислители и ацидофилни Т.	Окисляване на сулфидни минерали, S° и Fe²⁺, при pH 1,4-3,5 и Т° = 5-35°С	Екстракция на метали от сулфиди, смесени руди или концентрати, от отпадъци на пирометалургията, разположени на открито, под земята или в специални реактори Десулфуризация на въглища. Пречистване на благородни метали.
Случайни (приспособяващи се) термофилни бактерии, подобни на тиобацилите Случайни (приспособяващи се) термофилни бактерии от класа на сулфобацилите	Също като погоре при рН=1,1-3,5 и Т°=30-55°С Също както погоре при рН=1,1-5,0 и Т=20-60°С	Също както по-горе Също както по-горе
Ацидофилни бактерии от класа на genus sulpholobus и Acidianus	Също като погоре при рН=1,0-5,0 и Т=45-96°С	Също както по-горе

Както се вижда от таблица 1, главните сфери на приложение на биометалургичните методи са: екстракцията на метали, десулфу- 45 ризация на въглища и пречистването на благородни метали.

Екстракцията на метали чрез микроорганизми се извършва по различен начин в зависимост от размерите и характеристиките на минералите. Микробната екстракция in situ е подземна и при нея, поради наличието на микроорганизми, металите,, съдържащи се в рудните късове с различна степен на едрина от най-големи до остатъци след смилане, се разтварят. Екстракционните разтвори се инжектират и проникват в скалната маса. След разтваряне на металите разтворите се събират и изпомпват в съоръжението за регенерация, където се пречистват от разтворените метали.

Микробната екстракция от типа dump е метод за извличане на метали от бедни руди,

II.

обикновено непродуктивни остатъци при открития рудодобив, т.е. това е онази част от рудата, която съдържа рудни късове с едрина помалка от горната граница и която трябва да се отстрани, за да се достигнат по-богатите мине- 5 рали. Рудната маса се насипва на купове непосредствено до рудодобива.Тя се оросява отгоре (при върха) с екстракционни разтвори, съдържащи микроорганизми. Тези разтвори се просмукват през скалната маса, разтваряйки 10 част от метала, като изтичат от дъното на купа и се събират в сборник, откъдето се изпомпват към съоръжението за регенерация на металите.

Микробната екстракция от типа heap е метод, при който натрошената руда се подрежда 15 на слоеве върху подходящо подготвени площи, като оформя пресечена пирамида. Контролният параметър е височината на насипа, която зависи от подреждането на минерала. Насипът се оросява отгоре с разтвор, съдържащ микро- 20 организми, който непрекъснато се просмуква през минералната маса.

Микробната екстракция от типа tank е метод, при който се извличат метали от руди или рудни концентрати в специални реактори 25 тип pachuca, където минералният пулп и екстракционният разтвор след като е инокулиран, се разбърква и аерира при изотермични условия.

В биотехнологичната практика разреждането на пулпа, изразено чрез съотношението течност:твърдо, съдържащи се в определена маса пулп, варира от 4 до 10.

Въпреки различията и специфичните им особености екстракционните методи, прилагани в практиката имат общи черти - рудите или концентратите се суспендират, заливат се, или се подлагат на омокряне с водни разтвори по такъв начин, че това да съответства на микроорганизмите.

Въглищата съдържат сяра в различни количества основно под формата на пирит (FeS₂). Изгарянето им предизвиква превръщането на сярата в серен двуоксид, който замърсява атмосферата, причинявайки киселинни дъждове. За да се поддържа подходящо ниво на серния двуоксид в атмосферата в районите, където се изгарят въглища в големи количества, би следвало да се използват нискосернисти въглища, в които общото съдържание на сяра да е под 1-1,5%.

Представлява интерес изолирането на фероксидани от киселите дренажи на въглищните мини, за да се десулфуризират въглища та чрез окисляване на сярата в пиритните минерали.

Микробната екстракция на серни съединения от въглища се практикува по същите направления и критерии, както и при микробната екстракция на метали, т.е. микроорганизмите трябва да действат във водна среда. При десулфуризацията на въглища е доказана ефективността за няколко вида микроорганизми. Процесът не се използва в промишлен мащаб, поради големите му продължителност и работни обеми като следствие от ниската активност на микробите.

Доказано е, че когато концентрати, съдържащи пирит, арсенопирит и фино диспергирано злато, се подложат на биоекстракция преди цианиране, то повечето от сулфидните минерали се разтварят и при последващото цианиране добивът на злато значително нараства.

Биометалургичната технология има следните предимства: ниски енергоемкост, потребност на химически реагенти и инвестиционни вложения. Освен това с нея не се замърсява околната среда и се използват нискокачествени твърди материали.

Приложението й изисква продължително обработване на твърдите материали от няколко месеца до години, за да се получи достатъчно извличане. Скоростта на екстракция е ниска вследствие бавното размножаване на бактериите.

Голямото времетраене на метода е технико-икономическа бариера при промишленото му внедряване.

Ниските скорости на екстракция изискват преработването на големи количества минерали, което пречи на прецизния контрол на системите, които варират, а това от своя страна води до непредсказуема продължителност на обработката.

Изследването на физиологичните характеристики, условията на растеж и развитие на микроорганизмите при използването им за окисляване на метали, за решаване на посочените по-горе технологични проблеми е важна изследователска област.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящото изобретение се отнася до биометалургичен метод, при който минерал50

Ιί ните съединения от минерални руди или концентрати, които едновременно са субстрати за микроорганизми, се подлагат на биоокисление, разтваряне и разделяне. Методът съгласно изобретението включва следните етапи. В първи етап минералната руда или концентратът се обработва с предварително определеното възможно минимално количество киселина, осигуряващо пълното и равномерно подкисляване на субстрата, неутрализиране на рудата или концентрата и среда за развитие на микроорганизмите, като същевременно възпрепятства уплътняването на материала. Рудата или концентратът може да се обработват с киселинни пари до равномерното подкисляване на субстрата, докато се въведе минимално възможното количество вода, осигуряващо покриването им в системата.

Във втория етап се добавя микробен инокулат, способен да окисли полезните минерали или да обогати собствената микробна флора на минералната руда едновременно при провеждането на първия етап или независимо от него.

В третия етап се извършва спонтанно или принудително отделяне на излишъка от вода, присъстваща в системата, чрез изпаряване или дехидратиране във въздушен поток до достигане на достатъчно ниска равновесна влажност, осигуряваща получаването на твърдофазен биоокислен продукт, който съдържа колонии от микроорганизми.

В четвъртия етап продуктите на биоокислението се разделят.

В предпочитани варианти съгласно изобретението са количеството киселина, с което се обработва минералната руда или концентрата, е възможно минималното, осигуряващо пълното и равномерно подкисляване на материала.

Обработването на минералната руда или концентрата включва добавяне на вещества под формата на соли или водни разтвори, съдържащи поне един от следните елементи: калий, фосфор, магнезий, калций и азот с цел осигуряване развитието на микроорганизмите и биоокисляване на субстрата. Добавянето на споменатите вещества зависи от щама и състава на минералната руда или концентрата.

Обемът на обработвания разтвор се намалява чрез прибавяне на повърхностно активни вещества, които също така стимулират развитието на микроорганизмите.

Биоокислителната активност в системата се повишава чрез намаляване на равновесната влажност чрез добавяне на дехидратиращи реагенти.

Използваните микроорганизми се развиват в температурния интервал от 5 до 100°С.

Наличната в системата равновесна влажност се увеличава или намалява алтернативно, за да се разтворят поне частично биоокислените частички и по този начин се освобождават съдържащите се в системата микроорганизми, които във влажна среда достигат до нови субстратни частици и ги окисляват след последващо намаляване на активността на водата. Този процес се повтаря до постигане на желаната степен на извличане.

Биоокислените продукти се разделят чрез промиване или пресяване.

При биоекстракцията на металите биоокислените съединения са полезните продукти, а твърдият остатък представлява утайка, докато при пречистващия процес биоокислените съединения образуват утайката, а твърдият остатък представлява пречистения продукт.

С метода съгласно изобретението значително се увеличава скоростта на микробно окисляване на минералите. Това води до намаляване времетраенето на процеса, което е свързано и с използването на по-малки по обем съоръжения за провеждането му, респективно намалени капитални вложения, енергиини и експлоатационни разходи.

Първият етап от взаимодействието на биоекстрахиращите микроорганизми с твърдия неорганичен субстрат се състои във фиксирането им към повърхността, където субстратът, вече окислен, се атакува биохимично.

Фиксирането е специфично за различните минерали, представляващи източник на енергия, но то не се постига винаги в изследваните системи. Условията, които улесняват стабилното и ефективно фиксиране и създават възможност на бактериите да трансформират субстрата и да се размножават бързо, не са изследвани.

От физиологичните характеристики и условията за развитие, описани впоследствие, става ясно, че тези микроорганизми имат определено хидрофобен характер, т.е. съдържанието на вода при най-често използваните системи затруднява стабилното фиксиране на клетките към субстрата.

Т

Явленията, възникващи при взаимодействието на клетките и повърхността на минералите, т.е. механизмът на разграждане на сулфидните минерални решетки, още не са изяснени. Въпреки това съществуват различни теории, предполагащи, че при това взаимодействие се включват и ензимни механизми. Ето защо се налага ензимите да не се разреждат с вода и да не се отмиват от реакционната повърхност. Популациите и биоокислението на минерали при условията, описани по-долу, са проведени с щамове, посочени в таблица 2.

Някои от тях са изолирани от минерали от находищата Bajo de La Alumbrera и Campana Mahuida в Аржентина.

Таблица 2

Щамове, подходящи за биоокисление на минерали

Находище	Тестувани или известни субстрати	Оптимален темп. интервал
Т.фероокислители АТСС 19.859	Fe²⁺, S°, S₂0₃ ²-, ^S4°₆ ² сулфидни минерали	28-37°С
ВА, изолиран от меден минерал от находището “Bajo de La Alumbrera”	Fe²⁺, CuS, Cu₂S, FeS₂, PbS, ZnS, Sb₂S₃, CoS	28-37°С
ВА₂ изолиран от меден минерал от находището “Bajo de la Alumbrera”	Fe²⁺, минерални сулфиди	28-37°С
BA₃ както по-горе	Fe²⁺, минерални сулфиди	40-50°С
SA изолиран от образци почва, богата на серни съединения	S°, S₂O₃\ CuS, ZnS	37-60°С
СМ, изолиран от меден минерал от находището	Fe²⁺, CuS, Cu₂S, FeS₂, CoS, PbS, ZnS, Sb₂S₂	28-37°С
СМ₂ както по-горе	както по-горе	28-45°С
CRT регистриран като температуро-устойчива съставка, получаваща се в сулфиди,стерилизирани във въздушен поток	CuS, ZnS, PbS, Sb₂S₃	70-100^пС

ОПИСАНИЕ НА ПРИЛОЖЕНИТЕ

ФИГУРИ

Фигура 1 представлява популации върху дехидратирана агаризирана желязосъдържа ща среда, отложена върху тънък ръб на Петри. Стрелката показва мястото на инокулация.

Фигура 2, 3, 4 и 6 - популации, получени върху дехидратирана агар-агар феросреда;

Фигура 5 - популации, получени върху отложен в стъкло на Петри солев слой. Солите се получават при дехидратация на 3 cm³концентрирана течна феросреда (без добавяне на желиращо вещество);

Фигура 7 - схематично звездообразна популация, подобна на онази, указана със стрелка на фиг. 6, в която а) означава център,

в) - граничен ръб и с) - зона между центъра и граничния ръб;

Фигури 8, 9 и 10 - фотографии, получени чрез сканиращ микроскоп, съответстващи на центъра на популацията, обозначен с а) на фиг. 7;

Фигури 11, 12 и 13 - фотографии, съответстващи на зоната на популацията, обозначена с с) на схемата на фиг. 7, получени чрез сканиращ микроскоп;

Фигури 14, 15, 16, 17 и 18 - фотографии, получени чрез сканиращ микроскоп, съответстващи на граничния ръб на популацията, обозначен като в) на схемата на фиг. 7;

Фигура 19а - следите от преместването на бактериалната повърхност, по които бактериите се преместват на групи, наречени още “социални групи”, или “социално движение”. Картината е получена върху филм от феросулфат със степен на чистота на анализ, отложен върху стъкло на Петри;

Фигура 19в - популации, получени върху соли, които освен феросулфат, съдържат и други соли, необходими за развитието на бактериите;

Фигура 20 - сини популации от кристален тип, получени в подкиселен синтетичен меден сулфис чрез инокулиране на ВА₂ щам в инкубатор при 30°С;

Фигура 21 - бактериално развитие при светлосини кристали в стъкло на Петри с подкислен синтетичен CuS чрез инокулация в центъра на съда с концентрирана суспензия на ВА₃ щам. Култивацията се извършва при 37°С при полуотворено стъкло на Петри;

Фигура 22 - бактериално развитие при светлосини кристали с стъкло на Петри с подкислен синтетичен CuS чрез инокулация на СРТ щам в инкубатор при 85°С;

Фигура 23 - популации на щам СМ, съвместно с разтворими железни съединения, получени чрез използване на субстрат природен пирит, надробен до -0,15 min (-00 меша), в инкубатор при 30°С;

Фигура 24 - бактериално развитие при бял цинков сулфат, получен от подкислен свалеритов концентрат, използван за субстрат. Инокулацията се извършва с АТСС 19.859 в инкубатор при 30°С;

Фигура 25 - повърхност, подготвена по същия начин, както тази на фиг. 24. Дехидратирането се извършва, докато 90% от добавяната при подкисляването вода се извлече. Инокулацията се извършва с течен инокулат в място, посочено със стрелка на схемата;

Фигура 26 - бактериално развитие с цинков сулфат, при което инокулацията се извършва в място, посочено със стрелка. Освен това инокулацията се извършва с CRT щам от твърда популация в инкубатор при 96°С, като се държи стъклото на Петри полуотворено;

Фигура 27 - развитието на ВА₂ щам, като се използва Sb₂ S₃ като субстрат. Процесът се извършва в инкубатор при 30°С;

Фигура 28 - червено оцветени популации, получени чрез инокулиране на подкислен кобалтов сулфид (синтетичен) с различни щамове;

Фигура 29 - популация, оцветена в светлосиньо, получена чрез инокулация на BA_t и СМ₁ щамове в подкислен концентрат на халконит (Cu₂S) и енерджит (3Cu₂S.As₂S₅) като преобладаващи съставки на медта. Процесът се извършва в инкубатор при 30°С при напълно отворено стъкло на Петри;

Фигура 30 - фотографии от същите опити, показани на фиг. 29, заснети отблизо;

Фигура 31 (а) - минерални руди, роздробени до 0,64 cm (1/4 инча), съдържащи халкоцит (Cu₂S) като преобладаваща съставка на медта, подложени (отляво) и неподложени (отдясно) на биоокисление с СМ, щам. Процесът се извършва в инкубатор при 37°С в продължение на 16 часа при напълно отворено стъкло на Петри;

Фигура 31 (б) показва минерална руда, подложена на биоокисление;

Фигура 32 - фотографии, заснети отблизо на същата минерална руда от фиг. 31, която е била подложена на биоокисление чрез бактериална популация;

Фигура 33 - развитието на СМ₂ щам в меден минерал, съдържащ 2,1 % халкоцит, който е раздробен до -0,15 mm (-100 меша) и подкислен, като процесът се извършва в инкубатор при 37°С.

Фигура 34 - развитието на СМ₂ щам вър ху повърхността на стъкло на Петри, която предварително е дехидратирана. Стрелката показва мястото на инокулация. Субстратът е същият, както при фиг. 33;

Фигура 35 е схема на микроскопските наблюдения върху суспензия от бактериална популация в течна среда.

Най-често използваните бактерии в биометалурагията са Т-ферооксиглители. Въпреки че микроорганизми като тях изискват като енергетични субстрати редица неразтворими серни съединения, наред със съединенията, съдържащи феройон, разтворимостта на ферожелязото благоприятства използването им в хранителна (агар-агар) среда за получаване на популации в лабораторни условия.

Използването на Т-фероокислители в твърда хранителна (агар-агар) среда с оглед получаването на популации създава редица проблеми.

Досега са създадени няколко твърди феросреди. Всички те подпомагат растежа на популациите. Но получаваните популации са малки, бавно възпроизводими (от една до шест седмици) и водят често до ненадеждни резултати. Тези трудности се дължат на ниската скорост на размножаване на бактериите. Освен това се предполага, че агарът или хидролизираните продукти на агарозата, използвани за желиращо вещество, инхибират растежа.

Наблюденията върху популации във феросреда с агар-агар допринасят за установяване на условията за биоокисляване на серни съединения, които се обясняват по-долу.

Стъкла на Петри, приготвени с обичайната феросреда и 0,5% агароза, инокулирана с АТСС 19.859, ВА₁ и ВА₂ щамове, се култивират при 30°С и се наблюдават на всеки 6-ти и 8-ми час чрез стереомикроскопия. За период от около 40 дни приблизително няма забележими прояви на размножаване и растеж. В деня на появата на популации растежът става забележим чрез стереомикроскопия и след няколко часа популации от 0,5-1 mm в диаметър се виждат с просто око. Ако за получаването на популация е необходим 40-дневен период, предвид ниската скорост на бактериалното размножаване, то впоследствие растежът й е прогресивен.

Стъкла на Петри, разположени върху слабо наклонена плоскост, се приготвят с агаризирана феросреда, за да се проследи профилът на дебелината на агаризираната среда. Така слоят е най-дебел в единия край и най-тънък - в диаметрално противоположния. Стъклата се инокулират чрез добавяне на инокулат в участък с най-дебел слой, както е показано със стрелка на фиг. 1. На третия или на четвъртия ден се образуват популации в най-тънкия слой, диаметрално противоположен на мястото на инокулиране (фиг. 1). Няма доказателства за развитие преди деня на образуване на популациите. В случая, илюстриран на фиг. 1, популации се образуват даже върху тънкия филм от среда, нанесен върху страничната стена. Трябва да се има предвид обстоятелството, че колкото по-тънък е слоят от гел, толкова побързо той се дехидратира.

Голям брой тестове се провеждат при различни концентрации на агара или агарозата, като се анализира растежът с оглед на горните съображения. Може да се направи заключението, че нито агарът, нито агарозата влияят на закрепването (адхезията) на,бактериите върху мястото на инокулация, както е при другите бактерии.

Най-същественото условие за образуване на популации е закрепването (адхезията) на клетките към агаризираната среда. Необходимо е също така условията, които осигуряват тази адхезия, да се поддържат определено време.

Условията, които биха могли да се променят спонтанно с времето в една твърда агаризирана среда, съдържаща около 95% вода, се отнасят до загубата на вода чрез изпаряване, водеща до промяна на концентрацията на солите.

Изследванията се провеждат при вариране на концентрацията на солите в широки граници, без да се наблюдава забележима промяна във времето за възникване на популациите, а също така и без някакъв ефект върху адхезията на клетките съм инокулирания участък. По всичко личи, че адхезията на клетките към субстрата изисква много ниска съдържание на вода.

При изпитванията със стъкла на Петри, съдържаща равни обеми от съответните популации, даже последните да са разпръснати из цялото стъкло, степента на дехидратация се увеличава при изтичане на пробите в ламинарен поток и/или при съхраняването им при 30°С с цел да се изпари водата преди инокулацията.

При това се намалява значително времето за поява на нова популация. Така, като се използва по-горе изложеният подход, е възможно да се получат популации след 12 до 24 часа чрез добавяне на химични реагенти, съвместими с биологичните системи, регулирани от осмозата. Добавянето на етиленглрикол за намаляване на активността на водата, а също така и на повърхностно активни вещества, стимулира растежа в хранителната агар-агар среда.

Морфологията и размерът на популациите, както е показано на фиг. 2-6, зависят от приложения щам, от броя на инокулираните клетки в едно стъкло и най-вече от състава на средата, а също така и от начина на редуциране на водната активност.

Независимо от това, налице е един от всички получени популации фактор - геометричната форма, наподобяваща кристал. Този аспект се разглежда по-подробно по-долу, чрез наблюдения чрез сканиращ микроскоп.

Като се има предвид, че в агаризираната среда отстраняването на водата чрез изпаряване е бавен процес, приложен е друг подход за формиране на популации по бърз начин върху стъклата на Петри. Върху всяко стъкло се разслояват 3 cm³ солев разтвор 10Х с концентрация на феройони, както в предходните тестове, но без да се агаризира, след което се извършва инокулацията. По този начин се постига пониско съдържание на вода и се увеличава скоростта на изпаряване в сравнение с агаризираната среда. Веднага щом се разслои тънък филм от соли върху повърхността на стъклата и се изгуби типичният блясък от излишъка на влага, популациите се развиват за няколко часа, прилепвайки към стъклената повърхност, както е показано на фиг. 5.

Още веднъж трябва да се подчертае високите степен на адхезия и скорост на размножаване на бактериите в силно дехидратирана среда.

Горните тестове показват възможността на бактериите да се придвижват по стъклото на Петри дори при силно дехидратирана агаризирана среда. При работа с течен инокулат е невъзможно директно фиксиране на бактериите към инокулирания участък, даже и когато средата е силно дехидратирана.

Движението на микробите в овлажнени сулфиди и минерали, което е регистрирано и описано по-долу.

Движение на микроби през повърхността на агаризирана среда, дори ако тя е силно дехидратирана, и потребността от силно дехидратирана агаризирана среда за фиксиране на клетките и за образуване на популация, са характерните особености на т.н. плъзгащи бактерии (gliding bacteria). Те образуват групата на хетерогенните бактерии с фитогенен произход от различни видове.

Няколко от общите характерни особености: клетъчната стена е обикновено грамотрицателна, в повечето случаи липополизахаридното съединение се изолира и охарактеризира. Някои плъзгащи бактерии са свързани с отделяне на пихтиест материал, който е причина клетките в течна среда да се групират или да прилепват към стените на съда, в който се развиват популациите. Тези особености са същите, които са характерни и за биоекстракционните бактерии.

Обкръжаващата среда и обмяната на веществата (метаболизмът), вследствие на които се появяват плъзгащи бактерии, благоприятства подвижността им върху повърхностите. В основни линии те преобразуват субстратите, които не дифундират, така че микроорганизмите трябва да се движат, за да ги достигнат. Върху синтетична среда се демонстрира, че плъзгането най-много зависи от влажността и концентрацията на хранителни вещества.

Може да се установи, че при микроорганизмите с биоектракционни способности, които се развиват в минерална среда, неразтворимите субстрати са с понижена концентрация и накрая изчезват напълно. Само развитието на повърхности или тяхното преместване им позволява да съществуват.

Тези особености са от голямо значение при използване на процеса за технологични цели. Може да се установи, че за да се достигне висок добив в биоокисляването на съединения, намиращи се в минерални руди, в момента на достигане на необходимите условия за дехидратация, които позволяват стабилно фиксиране на бактериите, така че всяка частица да претърпи промяна, е необходимо тя да е в контакт поне с една клетка. Ако това не стане с последващи овлажняване и дехидратация, на клетките трябва да се даде възможност да се придвижат и достигнат нова частица.

Както бе отбелязано, ниската скорост

II, при биоекстракционните методи в условията, при които се експериментира, се дължи на ниската скорост на бактериалното размножаване.

Развитието на бактериални популации за няколко часа ясно подсказва, че когато бакте- 5 риите се прилепват към твърд субстрат с ниско водно съдържание, те бързо се възпроизвеждат.

Времената за образуване на АТСС 19. 859, ВА] и ВА₂ щамове са определени с оглед да се сравняват при две системи. Едната е оби- 10 чайната течна феросреда, разклащана при 30°С. Развитието се проследява чрез взимане ежедневно на проби, като броят на клетките се определя чрез разреждане и последващо преброяване в стъкло на Петри. 15

В експоненциалната фаза, съответстваща на най-високата скорост на възпроизвеждане, са определени минималните времена за образуване на популациите, което е посочено в табл. 3 като времена на образуване, съответ- 20 стващи на свободно нарастване в течна среда.

Другата система съответства на разви тие в среда със същия състав, както по-горе, но солидизирана с 0,35% агароза и силно дехидратирана. Средните времена на образуване са определени, приемайки, че всяка популация води началото си от една клетка, а също така времето за развитие съответства на период, започващ 1,5 часа преди регистрирането на първите признаци на нарастване чрез стереомикроскопия и свързващ в момента, когато са налице ясно образувани популации, които могат да се изолират (чрез клечка за зъби). Всяка популация се суспендира в премерено количество (обем) разтвор, тексира се с оглед да се освободят клетките. Броят на клетките във всяка популация се определя чрез повторно преброяване в стъкло на Петри, като се осреднява въз основа на три различни популации.

Таблица 3 показва средните времена на образуване за случая, когато щамовете нарастват закрепени (фиксирани) към силно дехидратирана твърда среда.

Таблица 3

Времена на образуване (t)

Щамове	Минимални tg. Свободно нарастване в течна среда	Средни tg. Нарастване във “фиксирано” състояние в твърда дехидратирана среда
АТСС 19.859	10 h и 20 min	24 min и 50 s
ВА,	8 h и 27 min	20 min
ва₂	11 h и 32 min	28 min и 15 s

Тези резултати показват, че оптималното микробно развитие съответства на ниско влагосъдържание или на сухи среди.

Както е посочено по-горе, популациите от изследваните щамове имат ръбеста кристаловидна структура, при все че плътни бакте45 риални популации съществуват в суспендирано състояние в течна среда и се наблюдават чрез микроскоп. Както се очаква, окислените продукти от тяхната обмяна на вещества са твърди, когато влагосъдържанието е ниско.

С оглед да се изследва връзката бактериитвърд продукт от такива популации се провеж дат наблюдения чрез сканиращ микро-скоп. Описани са звездообразни бактериални популации с приблизителен размер 1 cm в диаметър, каквито са показани със стрелка на фиг. 6. Тези популации се получават от агаризирана феросреда при намалено водно съдържание, както е посочено по-горе.

Представената на фиг. 7 популация е от стандартен тип с характерните й зони а) център в) гранична зона и с) междинна зона между границите и центъра.

Центровете на популациите, обозначени с а) при директно наблюдение показват

II проявата на гранули или се израждат. В съответствие с това на фотографиите на фиг. 8, 9 и 10 се виждат малки частички от разрушена кубична форма (фиг. 8) или с перфорирани стени (фиг. 9 и 10). Това предполага, че бак- 5 териите остават временно включени в твърдия продукт, който те са формирали, след което го перфорират и напускат.

Наблюденията чрез сканиращ микроскоп на междинната зона с) на фиг. 7), показват, че при нея само твърдото съединение изглежда като кристали, наредени успоредно на плоскостта на популациите, което е илюстрирано на фиг. 11. Обаче ако популацията се промие с разреден кисел разтвор, преди да се фиксира за анализ чрез сканиращ микроскоп, се наблюдават и безпорядъчно разпръснати бактерии от вътрешността, което се вижда на фиг.

12. Ако кристалообразната твърда фаза от тази зона се разруши механично чрез стерилизирана клечица, преди наблюденията на саниращия микроскоп, бактериите изглеждат разпръснати и подредени по дадени направления, както е показано на фиг. 13.

При наблюдения на граничната зона, отбелязана с в) на фиг. 7, се виждат кристалоподобни тела, ако преди сканирането не се извърши някаква предварителна обработка, но тези кристалоподобни тела се различават от тези в зона с), тъй като възникват от популацията и групи от тях оформят грозд (фиг. 14 и 15). Въпреки това всички тела от граничната зона имат подобна форма, като разликите между тях се забелязват в техния горен край, изложен повече на атмосферата и отдалечен от основата. Някои от тези тела са със затворена горна повърхност, но други са отворени (фиг. 16 и 17). В горната си част някои от телата са “нарязани” (фиг. 18).

Наблюденията, проведени за граничната зона на популациите, както и фактът, че анализираните популации са получени след 24 до 48 h сочат, че около основните колонии популации се формират вторични популации без всякаква връзка със субстрата, който феномен се нарича транслокация на бактериите по повърхността, известен още в микробиологията като darting. Този феномен се дължи на силите на оттласкване между клетките в клетъчния агрегат, водещи до изхвърляне на клетки от него.

Въпреки, че биоекстракционните бакте рии са много ефикасни при летливия азот под формата на амоняк, недостатък на азот в екстракционните разтвори ограничава ефективността на биоекстракционните процеси. От друга страна добавянето на амоняк към екстракционните разтвори води до допълнителни материални разходи.

Възможността да се задържи азотът е важна за всеки организъм, обитаващ жизнена среда, лишена от азот.

Демонстрирано е, че Т. фероокислителите са в състояние да фиксират атмосферен азот при условия на ограничено снабдяване с кислород и се характеризират като азотсъдържаща система, от която се разклоняват т.н. nif genes.

Обаче при изследванията in situ не се демонстрира екс фиксиращата активност на азота при екстракционните процеси. Въпреки това физиологичните условия, при които азотът се фиксира варират, като съдържащият азот ензим се съхранява и обикновено е чувствителен към кислорода. Nif-протеините са нестабилни спрямо кислорода, като фиксирането на азота се извършва само в защитени от кислород системи.

Физиологията на самостоятелен аеробен микроорганизъм, притежаващ азотсъдържаща система, е определена в науката като очевидно биологично противоречие, неразрешено досега. Независимо от това, за очакване е, че ако се развиват бактерии с азотсъдържаща система, трябва да съществуват условия, при които тази система да функционира ефикасно.

Растежът на микроорганизмите с биоокислителен капацитет, отбелязани в табл. 2, които използват синтетични сулфиди като субстрат, при условия, споменати по-долу (характеризиращи се с ниско съдържание на вода) и които водят до съответни окислени форми на твърдата фаза (кристалоподобни продукти, съдържащи бактерии), е напълно независещ от добавянето на азот.

Необходимостта от източник на азот и на други елементи за растежа на микробите, макар и в малки количества като фосфор, калий, магнезий, е анализирана по отношение на състава на средата, като се използва феросулфат с аналитична чистота като енергетичен субстрат.

С цел в анализираната система да се внесат възможно минималното количество състав ки и като се има предвид, че желиращите вещества могат да внесат замърсявания, се използва методът за получаване на популации в соли, отложени върху повърхност (в стъкло на Петри).

Стъкла на Петри с размери 9 cm в диаметър се приготвят, като се разпределят всяка от избраните среди в отделно стъкло:

а) 3 ml 10%-ен разтвор на FeSO₄.7H₂0 с рН=1,8

б) 1,5 ml 20%-ен разтвор на FeS0₄.7H₂0 с рН=1,8 и 1,5 ml разтвор с рН=1,8, съдържащ: 0,1 g К.С1; 0,25 g К₂НРО₄; 0,25 g MgSO₄7H₂0; 0,01 g Ca(NO₃)₂; 800 ml вода;

Различните щамове дават сходни резултати. В стъклата, съдържащи само аналитично чист феросулфат, не се образуват популации. В някои случаи остават слузести следи от някакъв вид транслокация на бактериалната повърхност, наречена social gliding, както е показано на фиг. 19(b).

Това дава възможност да се предположи, че при силно дехидратиране, системата, съдържаща азот, ефикасно фиксира атмосферния азот. Може да се предположи също така, че твърдият продукт, в който бактериите остават включени, поне временно предпазва системата, съдържат азот, от достъпа на кислород.

Охарактеризирането на тези бактерии като свободно живеещи микроорганизми би трябвало да се изследва по-задълбочено.

Принципите, описани по-горе, отнасящи се до влиянието на водата върху биоекстрахиращите бактерии, се прилагат и към биоокисляването на синтетични сулфиди, природни образци, концентрати и руди.

Претеглено и стерилизирано количество от всеки субстрат се поставя в стъкла на Петри и се разпределя равномерно по цялата повърхност. След това субстратът се овлажнява с разтвор на H₂SO₄, като обемът и концентрацията се определят за всеки конкретен случай съгласно следните критерии:

- За най-подходящ се определя минималният обем за единица маса субстрат, осигуряващ цялостното и равномерно подкисляване на субстрата.

Този обем ще зависи от физичните и химични характеристики на всеки отделен субстрат, като при порьозните минерали трябва да се осигури подкисляването през порите.

Независимо от това, обемът трябва да е по възможност по-малък, за да не се губи време при дехидратацията на субстрата.

- За най-подходяща концентрация се определя тази на минималния обем разтвор, осигуряваща неутрализацията на минерала, като се предотврати уплътняването, осигури се ефикасно развитие на бактериите и се предвидят загубите на киселина от изпаряване.

Установените критерии за оптимална стойност на рН при растежа на бактериите в течна среда в този случай не са валидни по няколко причини. Обемът за подкисляване е многократно по-малък в сравнение с обемите разтвор, осигурявани при течните системи. Ако концентрациите на киселина са същите или еквивалентни, то в системата ще има много малко киселина. Условията за обмяна на веществата, както и съставът на клетъчната повърхност на бактериите в такава разнообразна жизнена среда са по-различни. Когато системата достигне висока степен на дехидратация, необходима за бързото развитие на бактериите, общата представа за рН-стойност не е приложима.

Съществуващите замърсявания в природните видове, а също и в изследваните синтетични сулфиди, са достатъчни да осигурят необходимите малки количества елементи, съществени за бактериалния растеж като фосфор, калий, магнезий и др. Но това трябва да се анализира за всеки субстрат поотделно.

Повърхностите се инокулират с някои от щамовете, посочени в табл. 2, и се инкубират по такъв начин, че да се улесни изпаряването на вода, внесена по време на подкисляването. При всички случаи когато е необходимо субстратът да е сух, микробното развитие, както и съответният биоокислен твърд продукт се получават за няколко часа.

По-долу се описват тестове с различни субстрати, които не ограничават метода съгласно изобретението.

а) Тънък слой от сух и стерилен синтетичен меден сулфид се разпръсква върху стъкло на Петри с размери 9 cm в диаметър, подкислява се на капки с 1,5 cm ³ стерилен 0,1 н разтвор на сярна киселина. Инокулира се в центъра на повърхността с 10 ц1 от ВА₂ щам, приготвен чрез разтваряне на кристален меден сулфат в 0,06 н сярна киселина. Инокулатът се приготвя по време на инокулиране

Ill на следващото стъкло на Петри, за да се държат бактериите възможно най-малко време в течната среда. Държи се в инкубатор при ЗО°С. Когато субстратът е сух се появяват първи признаци на развитие и няколко часа по-къс- 5 но се наблюдават сини кристали от меден сулфат. Те са широки 0,5 cm и държи от 1,5 до 2,5 cm (фиг.20). Тези кристали са бактериални популации.

б) Повърхност (стъкло на Петри), под- 10 готвена както в т. а), се инокулира в центъра с μΐ гъст инокулат от ВА₃ щам и се култивира при 37°С, като стъклото Петри се държи полуотворено с цел по-лесното изпаряване на водата. След 12 h се наблюдава развитие (фиг. 15 21). Това показва, че при наличието на влага бактериалният капацитет се променя.

в) Стъкло на Петри, подготвено, както преди това, се подкислява чрез добавяне на cm ³ 0,06 н разтвор на сярна киселина. Ино- 20 кулира се с 10 μΐ инокулат от CRT щам, приготвен, както е посочено преди това, и се държи в инкубатор при 85°С. След 6 h се регистрират първите признаци на развитие. 2 h покъсно се наблюдава такова развитие, каквото е показано на фиг. 22.

г) За субстрат се използва природен пирит (FeS₂) с висока степен на чистота, надробен до -0,15 mm (-100 меша), подкислен и дехидратиран. Той показва силна тенденция на сгъстяване, което пречи на бактериалното развитие. Определено е, че при тегловно съотношение на пирита към подкисляващия обем 1:1, най-подходящата концентрация на киселина е 0,45 н. Фин, хомогенен слой от подкислен сулфат се получава, като се поставят 0,5 g стерилен пирит върху пластмасова повърхност с диаметър 5,5 cm, добавят се 0,5 ml стерилен разтвор на 0,45 н сярна киселина и компонентите се смесват чрез кръгово движение. Инокулира се центърът с инокулат от СМ_{ щам, пригоден за растеж в пирит. Държи се в инкубатор при 30°С, като повърхността е покрита. За да се изсуши субстратът при тези условия, са необходими 24 h. 10 h по-късно се наблюдават първите признаци на развитие (фиг. 23).

д) За субстрат се използва природен галенит (PbS) с висока степен на чистота, натрошен до -0,37 mm (-40 меша). 1 g от стерилния галенит се поставя върху пластмасова кръгла повърхност с диаметър 5,5 cm. Подкислява се с 1 ml стерилен разтвор на 0,24 н сярна киселина и се инокулира с СМ₂ щам от предходна култура в меден сулфид. Държи се в инкубатор при 37°С. Началото на растеж се регистрира след 18 до 22 h. 6 h по-късно се наблюдават гладки бели тела с кристаловидна структура. Размерът им е същият, както на галенитовите зърна, но те контрастират на сивия тон на галенита. Установено е чрез микроскопски наблюдения, че тези тела са плътна бактериална популация.

е) 2 g от същия субстрат, както в т. д) се поставят в стъкло на Петри. Добавят се 2 ml н сярна киселина. Инокулира се с CRT щам. Държи се в инкубатор при 90°С. След 6 h се наблюдават първите признаци на развитие, а h по-късно се получават бели твърди тела с подобна характеристика на онези, описани в Т. д).

ж) За субстрат се използва концентрат от сфалерит (ZnS), съдържащ 56% цинк. 2 g се поставят върху пластмасова повърхност с диаметър 9 cm. Добавят се 1,5 ml стерилна 0,24 н сярна киселина. Чрез кръгови движения подкисленият субстрат се разпределя върху повърхността. Инокулира се в центъра с АТСС 19.859 щам, адаптиран да се развива в цинков сулфид и суспендиран 0,06 н сярна киселина в момента на инокулация. Държи се в инкубатор при 30°С при затворена повърхност. След около 48 h се наблюдават първите признаци на развитие, а 12 h по-късно - развитието, показано на фиг. 24, при типично бяло оцветяване от цинков сулфат.

з) Повърхност, подготвена по същия начин, както в т. ж), но без инокулация, се държи в инкубатор при 30°С, докато се изпарят 90% от водата, внесена при подкисляването, определяно по намаляване на теглото. След това се инокулира с течен инокулат в мястото, посочено със стрелка на фиг. 25, 12 h по-късно в близост до инокулираното място се наблюдава типично бяла популация. В мястото на инокулиране не се наблюдава популация, тъй като там влажността е голяма, което се дължи на инокулата. Това показва, че бактерията се придвижва от най-влажната към помалко влажната повърхност, където се закрепва, трансформирайки субстрата.

и) Стъклена повърхност с 2 g от същия концентрат на сфалерит, както в т. ж) из), се подкислява с 2 ml стерилна 0,18 н сярна киселина. Инокулира се с CRT щам от пред

Il ходна култура в цинков сулфид, вместо да се суспендира инокулатът в разтвор. Инокулацията се извършва чрез директно пренасяне на твърдия цинков сулфат с дебела игла до маркирания ръб на съда, показан със стрелка 5 на фиг. 26.

й) За субстрат се използва природен антимонит (Sb₂ S₃) с висока степен на чистота, надробен до -0,15 mm (-100 меша). От изследваните субстрати този е най-труден за подкис- 10 ляване, поради хидрофобността си. За да се получи хомогенен подкислен пулп, разпределен върху повърхността, се изисква по-голям обем разтвор на киселина, отколкото в предходните случаи. Освен това пулпът се хомоге- 15 низира, като се разбърква със стерилна шпатула. Тази система показва също така тенденция на сгъстяване, което пречи на бактериалното развитие. Това обяснява и необходимостта от по-високи концентрации на киселина в 20 сравнение с предходните случаи. Проведени са голям брой изследвания за определяне на найподходящия обем и концентрация на киселина. Най-добри резултати за кой да е от щамовете, посочени в табл. 2, се получават при хомоге- 25 низиране на 0,5 g антимонов сулфид с 1,5 ml 0,6 н сярна киселина върху полистиролова повърхност с размери 5,5 cm в диаметър. Държи се в инкубатор при 30°С, повърхността е открита за улесняване изпаряването на водата. 30 След 3 до 4 дни започва развитието на микробите, като едновременно с това се получава бял твърд продукт на биоокислението (фиг. 27). Обемът за подкисляване се намалява чрез добавяне на повърхностно активни вещества, нап- 35 ример на саркозил 1%, който подпомага последващото микробно развитие. По този начин е възможно да се наблюдава развитие след 24 до 30 h.

к) Върху повърхности 9 cm в диаметър 40 се нанася тънък слой от сух стерилен синтетичен кобалтов сулфид (CoS). Подкислява се чрез добавяне на капки на 0,5 ml 0,3 н стерилна сярна киселина, така че да се омокри целият субстрат. Инокулира се с различни щамове от 45 предходни култури в кобалтов сулфид и се държи в инкубатор при 30°С. 24 h по-късно се получава популация (фиг. 28). Там се забелязва типичното розово оцветяване на кобалтовия сулфат. Твърдите биоокислени продук- 50 ти се отделят чрез пресяване.

л) За субстрат се използват меден кон центрат. Минералният състав, преизчислен на база 100% медно сулфидни минерали, показва, че преобладаващ е халкоцитът (64,29%) и енерджитът (21,96%). Поставят се 1 g върху всяко Петри, с 9 cm в диаметър. За подкисляване се използва 1 ml 0,3 н сярна киселина. Повърхностите се инокулират с ВА₁ и СМ₁щамове от предходни култури при същата концентрация. Инкубира се при 30°С, като стъклата на Петри се отварят. След 24 h се получава бактериално развитие, както е посочено на фиг. 29. Фиг. 30 показва същото бактериално развитие, заснето отблизо.

м) Тествана е минерална руда от Аржентина от находището “Сатрапа Mahuida”, съдържаща предимно халкоцит (Cu₂S) и натрошена до 0,64 mm (1/4 инча). От рудата се поставят 30 g върху Петри с диаметър 9 cm. Извършва се подкисляване чрез добавяне на 20 ml разтвор на 0,45 н сярна киселина. Извършва се инокулация с СМ! щам от предходна култура в синтетичен меден сулфид. Инкубира се при 37°С, като стъклото не се държи отворено, за да се извърши бърза дехидратация. След 12 h, когато минералът е сух, започва бактериалното развитие. След още 4 h се получава бактериално развитие едновременно с окисляването на сулфида. Фиг. 31 (а) показва минерала неподложен (отляво) и подложен (отдясно) на биоокисление. Фиг. 31 (в) показва биоокисления минерал. Фиг. 32 са фотографии отблизо на популация върху биоокисления минерал.

н) Меден минерал, натрошен до -0,15 mm (-100 меша) и съдържа 2,1% халкоцит (Cu₂S), се използва за субстрат. 5 g стерилен минерал се поставя върху полистиролови блюда с диаметър 8,5 cm и се подкислява с 5 ml стерилен разтвор на 0,4 н сярна киселина, като чрез кръгови движения пулпът се разпределя равномерно върху повърхността. Добавят се 100 μΐ инокулат от СМ₂ щам от култура в меден сулфид на капки и инокулираният субстрат се държи в инкубатор при 37°С. След 48 h и когато субстратът е сух, започва бактериалното развитие, което прилича на издутини върху по-сухите ръбове на Петри. След още 12 h се получава картината, показана на фиг. 33, която се характеризира с неравномерности в минералния слой, заедно със сини малки кристали.

о) Петри със същия състав, както е по14 сочено в н) се използва, с тази разлика, че инкубацията, както и подготовката се извършват при леко наклонено положение на блюдото така, че пулпът върху него е в по-тънък слой в единия край в сравнение с диаметрално 5 противоположния. Инокулацията се извършва върху по-дебелия край, както е показано със стрелка на фиг. 34. Инокулацията се извършва с 20 μΐ със същия инокулат, както е посочено в н). Инкубира се при 37°С. Както 10 трябва да се очаква, тънкият край се дехидратира най-напред. След 26 h се регистрират първите прояви на бактериално развитие и придвижване върху тънкия ръб, а 6 h след това бактериалното развитие, посочено на фиг. 34. 15

След няколко дни, когато блюдото е напълно дехидратирано от водата, добавена при подкисляването, не се наблюдава никакво бактериално развитие върху останалата му повърхност. Този факт показва, че когато е налице 20 излишък от влага, бактериите се придвижват през субстрата, през онази част, която показва отрицателна влажност, фиксирайки се стабилно върху дехидратирани повърхности.

Познаването на физиологията на мик- 25 роорганизмите позволява да се решават специфични проблеми, свързани с оптимизацията на биоокислителните процеси и с интензификацията им.

Окислителната активност на субстрата варира както при различните бактерии, така и при едни и същи бактерии, но при различни щамове и се определя от тяхната предистория, от механизма на закрепване субстрат-клетка и от разрушаването на кристалната решетка на сулфида.

Въз основа на описаните тестове може да се заключи следното:

1) Бактериите се развиват в минерална среда с ниско влагосъдържание, или поне не се отнасят към течните системи. Съдържанието на вода в минерала и влажността на средата са достатъчни за тяхното развитие.

2) Биологичното окисление върху твърд неразтворим субстрат предполага взаимодействие субстрат-клетка чрез механизма на адхезия. Стабилната адхезия позволява да се развие по-висока скорост на възпроизвеждане на бактериите. Излишъкът от влага затруднява адхезията.

3) Ако в разрушаването на кристалната решетка на сулфидния минерал се включи ен зимна система, то такива ензими не трябва да се разреждат или отмиват от реакционната повърхност.

4) При ниска влага се активизира обмяната на веществата на микроорганизмите, при което значително се намалява времето за образуване, съответстващо на висока скорост на възпроизвеждане на бактериите и на висока скорост на окисляване на субстрата.

5) При тези условия микроорганизмите се размножават, оставяйки поне временно затворен в твърдата фаза кристалоподобен продукт на биоокислението.

6) Изследваните микробни щамове, когато растат в силно дехидратирана среда не изискват добавяне на източник на азот предполагайки ефикасно фиксиране на атмосферния азот.

7) По-голямата част от микроорганизмите се делят при намаляване на налягането на водата, но относително малка част от тях са се адаптирали физиологично, че да растат добре в среда с ниско водно съдържание (a_w). За описание на тези микроорганизми се използват редица понятия: халофилни, осмофилни, ксерофилни (от гр.обичащи сухота), които са най-подходящите.

Обстоятелството, че тези бактерии не са изследвани досега при подобни на описаните условия, се дължи на трудностите при изолирането им, като се започне от киселинното дрениране на мините, където се счита, че има условия за живот само на водолюбивите системи, без при това да се отчита, че тези бактерии се развиват, превръщайки минерали, които обикновено не се намират в природата, суспендирани във водна среда, а са сухи, съдържайки няколко процента вода, която е в равновесие с влажността на околната среда.

Според нашия опит образците от минерали, които са привидно дехидратирани, имат богата микробна флора, и по-специално върху повърхността, изложена на въздуха, и това са преходни клетки.

Като се вземе предвид антагонизма между тези процеси и биохидрометалургията предвид на водата, то микробното биоокисление при описаните условия може да се нарече с термина “биодехидрометалургия”.

Изводите, които могат да се направят въз основа на прилагането на принципите на настоящото изобретение, са следните.

При всички развити досега биометалургични методи като екстракция от типа tank, т.е. в закрит съд, от типа in situ, или от типа dump микробната флора се развива във водна среда. При тези условия скоростите на размножаване на микробите и на биоокислението на субстрата са ограничени. Това води до голяма продължителност на процесите, от порядъка на няколко месеца, което от своя страна е технически и икономически неразумно. Ако се приложат описаните по-горе принципи, е възможно да се постигне съпоставими степени на екстракция за няколко дни. Като се има предвид, че микроорганизмите се развиват, трансформирайки своя субстрат за часове, то определящият параметър за този метод е скоростта на дехидратация за всяка система, както и използваният подход за подкисляване и инокулация, внасяйки в системата най-малко възможното количество вода.

Значително по-малкото време за провеждане на процесите при този метод водят до помалки по обем съоръжения за провеждането му, като се икономисват капитални вложения.

Оперирането с по-малки съоръжения повишава контролируемостта на процесите.

Конвенционалните методи са свързани със значителни енергийни разходи. В реакторите при метода от типа tank е необходимо постоянно да се разбърква или аерира. При другите конвенционални методи пък киселият екстрахиращ разтвор се филтрува през минерала, което също така е свързано със значително енергийни и капитални разходи. Тези разходи са още по-големи, когато процесите са продължителни. По-бързите процеси изискват по-ниски експлоатационни разходи.

Най-подходящите обем и концентрация на киселина се определят за всяка система поотделно в съответствие с по-горе споменатите критерии, при което се гарантират неутрализирането на минералната руда или концентрата, избягва се уплътняването и се осигурява адекватна среда за развитие на бактериите.

След като субстратът е бил вече подкислен и инокулиран, трябва да се осигури дехидратацията на излишната вода чрез естествено изпаряване, индуцирано чрез сушител или въздушен поток през минералната руда или концентрата.

Субстратите, които трябва да бъдат окислени чрез действието на микроорганизми, са част от минерални руди, най-често раздробени на малки частички. Превръщането на всяка частичка е свързано с прилепването поне на една клетка. Частички, които към този момент са дехидратирани, изпълняват горните условия и се превръщат след няколко часа в разтворим твърд продукт, който в същото време служи за основа на микробната популация. Ако в следващия етап минералната руда се овлажни, за да разтвори поне частично току що формирания твърд продукт, бактерията ще го напусне и ще припълзи, или ще достигне по друг начин нови частички от субстрата.

Описаните етапи се повтарят многократно, докато се получи необходимата степен на екстракция, като продължителността зависи от характеристиките на всяка конкретна система, дали субстратът е минерална руда или руден концентрат.

Накрая биоокислените твърди продукти се разделят чрез отмиване или чрез пресяване, когато на биоокисление е бил подложен руден концентрат. Ако разделянето се извършва чрез разтваряне, рН на промивните разтвори зависи от разтворимостта на окислените продукти.

Като се има предвид, че разтварянето на металите се извършва и индиректно, което се дължи на наличието на феройони, получени в резултат на биоокислението. Последните от своя страна могат да реагират химически със сулфидите, окислявайки ги и превръщайки ги в разтворими съединения. Необходимостта да се държи промивният разтвор в контакт с минерала за определено време, очаквайки евентуално увеличаване степента на екстракция, за сметка на това индиректно окисление, трябва да се анализира за всеки частен случай поотделно.

При биоекстракцията на метала, интересуващият ни продукт се съдържа в промивния разтвор, докато твърдите вещества образуват остатъка. При биопречиствателните методи, например при десулфуризацията на въглища или при пречистването на благородни метали, промивните разтвори съдържат остатъка, а твърдата фаза - интересуващия ни продукт.

Изобретението се илюстрира със следните примери, които не го ограничават.

Примери I и II илюстрират количествено различията в ефективността на биоокисле нието на метални съединения в течна среда и в среда с ниско влагосъдържание.

Пример III илюстрира прилагането на изобретението към конкретна минерална руда.

Пример I.

За субстрата се използва природен пирит (FeS₂), с висока степен на чистота 43,5% Fe, 49,67% сяра и 6,83% замърсявания, надробен до -0,15 mm (-100 меша) и стерилизиран в три последователни дни чрез поток от пара.

Използва се инокулат, съответстващ на CMj щам, предварително адаптиран за развитие в пирит. Във всички случаи се провежда едновременно и контрол за стерилност.

Биологичното окисляване е изследвано в конвенционална течна система с или без добавка на амоняк при ниско съдържание на вода, в съответствие с настоящото изобретение.

Биологичната активност се определя чрез измерване на разтворимото желязо чрез абсорбционна спектрофотометрия. Броят на клетките се определя чрез преброяване в Петри в агаризирана феросреда.

В течна среда тестът се провежда в 300 ml Ерленмайерови колби, съдържащи 5 g пирит, 95 ml разтвор на сярна киселина с или без добавяне на 0,3 g амониев сулфат и при довеждане на pH до 1,7. Средата се инокулира с 5 ml СМ, щам, съдържащ 2х10⁸ клетки/ml. При контрола за серилност се добавят 100 вместо 95 ml разтвор. Ерленмайеровите колби се държат в инкубатор при 30°С, като се разклащат едновременно.

Кинетиката на разтварянето на желязото се проследява чрез периодично определяне на концентрацията на разтвореното желязо в аликвотна част, взета от екстракционния разтвор.

Скоростта на екстракция на желязото се определя по линейния участък на кинетичната крива - биологично разтворено желязовреме, като тази стойност се отнесе за всяка инокулирана клетка в системата.

Скоростта на разтваряне на желязото се изразява в mg разтворено желязо за час за инокулирана клетка. При опита с амоняк тази стойност е 1,68x10’ mg/h клетка. При опита без амоняк не се наблюдава разлика с контролата за стерилност.

При изследването с дехидратирана твърда среда най-подходящите обем и концентра ция на киселина се определят предварително. Най-подходящият обем е този, съответстват на съотношение 1:1 - пирит в g към обем на киселината в ml. Най-подходящата концентрация на киселина е 0,45 н.

При кинетичните изследвания по разтваряне на желязо се използват 5,5 cm (в диаметър) полистиролови блюда на Петри, всяко съдържащо 0,5 g пирит и 0,5 μΐ 0,45 н сярна киселина. Чрез въртеливи движения цялата повърхност се покрива с филм. Всяко блюдо на Петри се инокулира с по 360 клетки от CMj щам, съдържащ 20 μΐ 0,06 н сярна киселина. Броят на клетките се определя чрез преброяване на популациите в агаризираната среда и съвпада с грешка + 7% с преброените популации в Петри с пирит. Популациите 1 тези блюда при най-голямото си развитие са с вида, показан на фиг. 23, 20 μΐ 0,06 н стерилна сярна киселина се добавят към съответните контролни проби за стерилност. Всички проби се държат в инкубатор при 30°С.

Периодично едно стерилно и едно инокулирано Петри се подлагат на контрол за определяне съдържанието на разтворено желязо чрез абсорбционна спектрофотометрия. Разтвореното желязо чрез биологично окисляване се представя графично като функция на времето. Биологичното окисляване започва след 22 h, когато пробите са вече сухи. Започвайки от 26-тия час и в продължение на 8 h се наблюдава най-голямата скорост на биологично окисляване (8,79x10 ⁴ mg/h клетка).

Сравнявайки получената стойност с онази в течна среда с амоняк, се вижда, че разликата е 5 порядъка.

Пример II

За субстрат се използва синтетичен купросулфид. Той се инокулира с BAj щам.

Както и при пример I, биологичното окисляване в конвенционална течна среда се провежда с или без добавяне на амоняк, а в твърда дехидратирана среда - в съответствие с вече описаните критерии. Във всички случаи едновременно се провеждат и съответните проби за контрол на стерилност. Разтворената мед се определя чрез абсорбционна спектрофотометрия. Биологичното окисляване се определя като разлика в концентрациите на разтворената мед между инокулирана система и съответстващата й контрола за стерилност.

Екстракцията в течна среда се провеж17

II.

да в Ерленмайерови колби, съдържащи 5 g купросулфид и 95 ml разтвор на сярна киселина с или без добавка на 0,3 g амониев сулфат. pH на разтвора е 2. Течната среда се инокулира с 5 ml ВА, щам, съдържащ 2х10⁸ клетки/ml. При контролите за стерилност се използват 100 вместо 95 ml разтвор от киселина. Ерленмайеровите колби се държат в инкубатор при 30°С, като се разклащат едновременно.

Кинетиката на разтваряне на медта се снема при периодично определяне концентрацията на разтворената мед в аликвотна част, взета от екстракционния разтвор. Определя се скоростта на биологично разтваряне на медта, съответстваща на линейния участък на кинетичната крива - биологически разтворена мед - време. Тя се представя като милиграми разтворена мед за час за инокулирана клетка. При опита с амоняк тази стойност е 5,1x10 ’ mg/h клетка. При опита без амоняк няма различия с пробата за стерилен контрол.

При изследванията с дехидратирана твърда среда се подготвят Петри с 9 cm в диаметър, като към тях се прибавят 2 g купросулфид и 2 ml вода. Образуваният пулп се разпределя равномерно по цялата повърхност чрез кръгови движения. Пробите в Петри се сушат в ламинарен поток до достигане на постоянно тегло. Към всяка от тях се добавят 0,5 ml 0,3 н стерилна сярна киселина. Прибавянето на киселината се извършва капка по капка, за да се получи равномерно подкисляване. Всяко Петри се инокулира с около 40 клетки от ВА₁ щам, съдържащ 20 μΐ 0,06 н сярна киселина. Броят на клетките, съдържащи се в инокулата (2000 ml) се определя чрез преброяване на популациите във фероагаризирана среда и съвпада в рамките на грешката ± 8% - с броя на популациите, получени в Петри с купросулфид при крайния момент на развитие.

При контролните проби за стерилност се добавят 20 ц1 стерилна 0,06 н сярна киселина. Всички проби се държат в инкубатор при 30°С.

Разтворената мед се анализира периодично от стерилна проба и инокулирана проба. Биологичното окисляване започва след 18 h, когато пробите в Петриевите блюда са вече сухи и продължава с почти постоянна скорост в следващите 8 h. В края на този период се достига максимално развитие с оглед размера на популациите, включени в кристаловидния меден сулфат.

Скоростта на биологично окисляване през този период, изразена като разтворена мед и за час за инокулирана клетка, е 0,319 mg/h кл. Тази стойност е сравнима със съответната в течна среда.

Когато бактериалната популация, включена в кристаловидния твърд продукт се суспендира в разтвор, даже и ако е разбърквана и се изследва след това под микроскоп, е възможно да се наблюдават форми, подобни на онези, показани на фиг. 35: малки подвижни клетки, междинни (по размер) и много дълги неподвижни клетки и групи от клетки, които приличат на тънка нишка (филамент). Не е сигурно, дали популацията произлиза от една клетка или от група клетки и това да е било отразено при преброяването на клетките, присъствуващи в инокулата върху блюдото. Независимо от това, имайки предвид, че използванията инокулат при течната и при твърда среда е с един и същ произход и е обработен по един и същ начин, стойностите на биологичната активност, отнесени към клетките инокулат са сравними при сходни цели, при все, че това не са абсолютни стойности.

Пример III

Изследва се биоокисляването на медна руда с оглед да се определи степента на екстрахиране на медта и необходимото за това време, прилагайки принципите на настоящото изобретение.

Характеристика на рудата

а) химични показатели

Общо мед 1,25%

Разтворима мед 0,15%

Общо желязо 2,66%

Общо сяра 1.78%

Неразтворими вещества 78,50%

б) Минералогични характеристики

Изброени са по-долу основните съставки на рудата, получени чрез минералогичен анализ. Процентът на всяка от тях е изразена спрямо 100% руда.

I

Съставка	Тегло	Сяра	Мед	Желязо
Халкоцит	1,26	0,25	1,01	-
Халкопирит	0,13	0,05	0,04	0,04
Ковалит	0,06	0,02	0,04	-
Борнит	0,01	< 0,01	« 0,01	« 0,01
Пирит	2,71	1,45	-	1,26

Вижда се, че преобладаващата медна съставка е халкоцитът. Халкопиригьт, ковалитът и борнитът са наредени според важността си.

в) Гранулометричен състав

Стритият до 0,64 cm (1/4 инч) минерал се подлага на гранулометричен анализ, използвайки комплект сита Tyler с размери 4,75 mm (#4), 2,36 mm (#8), 1,0 mm (#16), 0,37 mm (#40), 15 0,2 mm (#65), 0,15 mm (#100). Гранулометричното разпределение е както следва.

Г ранулометрично разпределение по	Тегловен остатък по фракции	Сумарно тегло
-4,75 mm (-4 #) + 4,75 mm (+ 4 #)	2,6	2,6
-2,36 mm (-8 #) + 2,36 mm (+ 8 #)	36,7	39,3
-1,0 mm (-16 #) + 1,00 mm (+16 #)	34,4	73,7
-0,3 mm (-40 #) + 0,37 mm (+40 #)	9,1	82,2
-0,2 mm (-60 #) + 0,21 mm (+65 #)	5,3	88,1
-15 mm (-100 #) + 0,15 mm (+100 #)	2,2	90,3
	9,7	100,0

г) Определяне на естествената влага

Естествената влага се определя тегловно при 100°С до достигане на постоянно тегло. Тя възлиза на 1,5%.

д) тест за киселинна потребност

Потребността от сярна киселина за рудата се определя по стандартен тест. Тя е 9,9 g/kg минерал.

Провеждат се два паралелни теста върху скари от неръждаема стомана 35x45 cm. Върху всяка се поставя по 1 kg от минерала и се обработва, както е посочено по-долу.

Тестовете се провеждат в затворено помещение, с изолирана врата и сушилен агент. Водата се кондензира върху сушителя и се дренира вън от помещението чрез маркуч. По този начин се улеснява дехидратирането. Температурата в помещението се поддържа между и 32°С.

Равномерно разпределеният върху всяка от скарите минерал се подкислява с 800 ml разтвор, съдържащ киселина в количество, определено в т. д), което възлиза на 9,9 g сярна киселина.

Всяка скара се инокулира с 10 ml инокулат от СМ₂ щам. Инокулатът се приготвя чрез суспендиране на бял цинков сулфат в 0,06 н сярна киселина, което съответства на попула45 цията в този щам в цинков сулфид. Инокулатът се приготвя в момента на инокулация, като се разпределя равномерно капка по капка върху цялата скара. Скарите се държат в инкубатора при описаните по-горе условия.

5θ След 26 h минералът показва признаци на изсушаване и се извършва бързо бактериално развитие, съпроводено с отделянето на

II И!

I IL.

малки светлосини кристали. В основни линии това се наблюдава върху повърхностите и участъците от минерала, които са изложени повече на въздух. Както е вече показано, микроорганизмите се придвижват към повърхности, ко- 5 ито по-бързо се дехидратират.

В края на този етап и в края на всеки от следващите се взимат проби от по 30 g минерал от всяка скара, за да се анализира съдържанието на разтворена мед чрез абсорбционна 10 спектрометрия. С оглед да се вземе представителна проба, с лъжица се взема материал, така че да се представени всички слоеве по дебелина върху скарата.

Провеждат се три етапа на овлажняване 15 и дехидратация. Добавеният разтвор за подкисляването на всеки етап се разпределя равномерно чрез разпръсквател.

Накрая минералът се промива в продължение на 6 h, за да се увеличи индиректно 20 отделяне на мед. Разтворената мед се определя във филтрата и се изчислява окончателното екстрахирано количество.

На табл. 4 са показани работните условия и за необходимото за всеки етап време, а също така и за екстрахираното количество мед за всеки етап за двете скари.

На табл. 4 е представен киселия разтвор и количеството добавена на всеки етап киселина, отнесена за 1 kg минерал. На практика се добавя пропорционален обем киселина, съответстващ на действителното количество останал минерал, като се отчете количеството на пробите, взети за анализ.

От табл. 4 е видно, че при посочените работни условия, след 3 дни се достига екстракция на мед 66-68%. Знае се, че при конвенционалните системи, функциониращи в същия мащаб, необходимото време за такава степен на екстракция е от 70 до 90 дни.

Claims

1. Биометалургичен метод, при който минерални съединения от минерални руди или концентрати, представляващи субстрати за микроорганизми, се подлагат на биоокисление, 50 разтваряне и разделяне, характеризиращ се с това, че включва следните етапи: първи етап, при който минералната руда или концентратът се обработва с предварително определено възможно минималното количество киселина, осигуряващо пълното и равномерно подкисляване на субстрата, неутрализиране на минералната руда или концентрата и среда за развитие на микроорганизмите, като същевременно препятства уплътняването на мате20

I риала, или минералната руда или концентратът се обработва с киселинни пари до равномерно подкисляване на субстрата, докато се въведе минимално възможното количество вода, осигуряващо покриването на минералната руда или концентрата в системата; втори етап, при който се добавя микробен инокулат, способен да окисли полезните минерали или да обогати собствената микробна флора на минералната руда едновременно при провеждането на първия етап или независимо от него; трети етап, при който се извършва спонтанно или принудително отделяне на излишъка от вода, която може да присъства в системата, чрез изпаряване или дехидратиране във въздушен поток до постигане на достатъчно ниска равновесна влажност, осигуряваща получаването на твърдофазен биоокислен продукт, който съдържа колонии от микроорганизми, и последен, четвърти етап, при който продуктите на биоокислението се разделят.

2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченото количество киселина в разтвора е възможно минималното, осигуряващо пълното и равномерно подкисляване на минералните руди или концентрати.

3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че обработването на минералната руда или концентрата включва добавяне на вещества под формата на соли или водни разтвори, съдържащи поне един от следните елементи: калий, фосфор, магнезий, калций и азот, за осигуряване развитието на микроорганизмите и биоокисляване на субстрата, като добавянето на споменатите вещества е в зависимост от щама и състава на минералната руда или концентрата.

4. Метод съгласно претенция 1, харак- теризиращ се с това, че обемът на обработвания разтвор се намалява чрез прибавяне на повърхностно активни вещества, които също така стимулират развитието на микроорга5 низмите.

5. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че биоокислителната активност се повишава чрез намаляване на равновесната влажност чрез добавянето на дехид-

10 ратиращи реагенти.

6. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че използваните микроорганизми се развиват в температурния интервал от 5 до 100°С.

15

7. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че наличната равновесна влажност се увеличава или намалява алтернативно, за да се разтворят поне частично биоокислените частички и по този начин се освобождават съдържащите се в системата микроорганизми, които във влажна среда достигат до нови субстратни частици и ги окисляват след последващо намаляване на активността на водата и този процес се повтаря до дости25 гане на желаното извличане.

8. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че биоокислените продукти се разделят чрез промиване или пресяване.

30 9. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че при биоекстракцията на металите биоокислените съединения са полезните продукти, а твърдия остатък представлява утайка, докато при пречистващия про35 цес биоокислените съединения образуват утайката, а твърдият остатък представлява пречистения продукт.

Приложение: 35 фигури

Издание на Патентното ведомство на Република България 1113 София, бул. Д-р Γ. М. Димитров” 52-Б