BG112179A - Метод за получаване на фруктоза - Google Patents

Abstract

Изобретението представлява метод за получаване на фруктоза, при който инулин съдържащи субстрати се подлагат на ферментация от клетки на млечно кисели бактерии, притежаващи инулиназна активност. Ензимната хидролиза на инулина се извършва единствено от ензими, произведени от клетките по време на самата ферментация, т.е. методът не изисква добавяне на каквито и да е ензими, получени в други, предшестващи ферментацията процеси. Методът предлага и условия, при които метаболизирането на инулина от млечно киселите бактерии до млечна киселина да бъде частично или почти напълно спряно до междинния продукт фруктоза.

Description

МЕТОД ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ФРУКТОЗА

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Изобретението се отнася до метод за получаване на фруктоза, ценна суровина, намираща широко приложение в хранително-вкусовата промишленост като хранителна добавка, овкусител и подсладител (под формата на концентрирани фруктозни сиропи или кристална (чиста) фруктоза) в различни храни и напитки. Непрекъснато увеличаващия се интерес към фруктозата (респективно към начините и на получаване) се дължи на нейния GRAS (Generally Recognized As Safe) статут на безвреден подсладител (1). Фруктозата е предпочитан подсладител и поради пониската си калоричност, в сравнение с глюкозата и захарозата. Фруктозата намира приложение също във фармацията, като овкусител и пълнител в таблетки и сиропи, в химичната индустрия за получаване на 2,5-диметилфуран (2), като втечняващ агент в медицината (3,4), а отскоро и като стартов материал при производство на биогорива (5). Понастоящем, фруктозата е втората, най-използвана захар в света (след захарозата) с годишно производство от над 11 милиона тона само под формата и на високо концентрирани фруктозни сиропи.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

До момента, фруктозата се произвежда в индустриален мащаб главно по два начина: от захарна тръстика, чрез киселинна хидролиза на захароза, или от царевично брашно, чрез мултиензимна хидролиза на нишесте (6). През последните години като субстрат за получаване на фруктоза се използва и съдържащия се в корените на много растения, полифруктан - инулин. Разграждането му до фруктоза се осъществява също ензимно или чрез киселинна хидролиза.

Получаване на фруктоза от захароза

В този случай, чрез продължително загряване в присъствието на киселини, захарозата се хидролизира до инвертна захар (смес от глюкоза и фруктоза в равни количества). Впоследствие, получената смес се третира ензимно за изомеризиране на глюкозата във фруктоза (6,7). Използваните ензими се наричат инвертази и могат да се използват в свободно или имобилизирано състояние.

Получаване на фруктоза от нишесте

Класическият метод за получаване на високо концентрирани фруктозни сиропи е от нишесте съдържащи материали. Етапите включват: желатинизиране на нишестения разтвор при температура 105° С за 5-8 минути в присъствие на калциеви йони и термостабилен ензим α-амилаза; разграждане до декстрини чрез температурно третиране за 2 часа на 95° С; разграждане до глюкоза чрез добавяне на ензими (глюкоамилази или пулуланази) при 60° С в киселинни условия; превръщане на глюкозата във фруктоза чрез добавяне на глюкозо изомерази (инвертази) (6,8).

Получаване на фруктоза от инулин

Инулинът представлява полимер на фруктозата, завършващ с молекула глюкоза в единия край. Най-богати на инулин са корените на растения като цикория, гергина, земна ябълка. Получаването на фруктоза от инулин може да се осъществи чрез химична хидролиза, например чрез прекарване на воден разтвор на инулин през йонообменна смола (9), или чрез ензимна хидролиза (6,10).

Освен изброените класически случаи, в литературата са описани и множество други, голяма част от които са патентовани. Всички те, обаче, независимо от използвания субстрат, представляват различни варианти на химичната или ензимната хидролизи. Химичната се осъществява в присъствие на киселини при висока температура, докато ензимната - чрез добавяне на пречистени ензими към разтвор на субстрата. Основни недостатъци на киселинната хидролиза са енергоемките условия на процеса, както и получаването на продукта с ниско качество, нежелано оцветяване, в разтвор с много примеси, някои от които токсични (11). От друга страна, недостатък при ензимното получаване на фруктоза е бързото инактивиране на ензимите, дори при имобилизирано състояние. Това води до получаване на продукта в количества, недостатъчни за икономически рентабилното му производство. Още повече, при мултиензимното третиране, каквото обикновено се налага, оптималните условия за действие на ензимите са различни (9).

Ето защо е целесъобразно разработване на метод, чрез който да се осигури повисока продуктивност на процеса, така че той да бъде икономически изгоден за промишлено получаване на фруктоза.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ

Изобретението представлява метод за получаване на фруктоза, при който: (i) Субстрати съдържащи фруктоолигозахариди (ФОС) или инулин съдържащи субстрати, като корени на цикория, грудки на земна ябълка или гергина, се подлагат на ферментация в периодичен процес с подхранване (fed batch), (ii) Ферментацията се извършва от клетки на млечно кисели бактерии, притежаващи инулиназна активност, обединени в родовете: Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Aerococcus, Camobacterium, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weisella, Leuconostoc, Streptococcus, Enterococcus, Bacillus и Rhizopus, метаболизиращи основния въглероден източник в средата до млечна киселина (МК), (iii) Методът касае всички МКБ, продуциращи ензима с екзоинулиназна активност β-ϋ-фруктан фруктохидролаза (ЕС 3.2.1.80) или ензима с инвертазна активност βфруктофуранозидаза (ЕС 3.2.1.26) или ензима с ендоинулиназна активност 2,1-β-ϋфруктан фруктанохидролаза (EC 3.2.1.7). (iv) Процесът на ензимна хидролиза на инулина се осъществява само от инулиназите, произведени по време на самата ферментация, без добавянето им отвън в културалната течност, (v) При подбрани ферментационни условия и състав на хранителната среда, основен продукт на ферментацията се явява фруктозата.

МКБ са добре известни със способностите си на продуценти на МК от различни субстрати. Използването на фруктоолигозахариди като инулина за получаването на МК също е известно [12]. То се осъществява от бактериални щамове, притежаващи инулиназна активност, като ферментацията протича през следните етапи: (i) Под действие на инулиназите, фруктозния полимер се хидролизира до захароза, фруктоза и глюкоза, чрез разкъсване на Р-2,1-гликозидните връзки между отделните фруктозни молекули; (ii) Последващо метаболизиране на монозахаридите по пътя на Ембден-Майерхоф-Парнас до МК (млечно-киселата ферментация). Така например, в периодичен ферментационен процес с клетки на Lactobacillus paracasei DSM 23505, от 136 г/л инулин съдържащ субстрат в биореактор с механично разбъркване и работен обем 1 литър, се получават 123.7 г/л МК [12]. При по-високи начални концентрации на субстрата, обаче, под комбинираното действие на субстратното и продуктно инхибиране, част от междинният метаболит фруктоза, не се метаболизира до МК, а се акумулира в културалната течност. Този ефект може силно да бъде повлиян от условията на култивирането и от състава на хранителната среда.

Провеждането на ферментацията като периодичен процес с подхранване (периодично добавяне на инулин съдържащият субстрат) довежда до възможността да бъдат хидролизирани огромни количества субстрат, метаболизирането на които води главно до натрупване на фруктоза. От друга страна, силно инхибиращия характер на МК върху клетъчният метаболизъм, не позволява продуцирането й от даден момент нататък.

Въпреки, че натрупването на МК не може да бъде избегнато напълно, при подбор на определени ферментационни условия - температура, киселинност на хранителната среда, скорост на разбъркване, както и състава на хранителната среда, крайното количество продуцирана МК може да бъде силно ограничено, за сметка на акумулираните количества фруктоза. За целта, параметрите на процеса трябва да бъдат подбрани така, че от една страна да бъде максимално засилена ензимната активност на произвеждащата се инулиназа, а от друга - максимално затруднена активността на ензимите, участващи в пътя на Ембден-Майерхоф-Парнас.

Експерименталните резултати показват, че най-висок добив на фруктоза се получава при периодичен процес с подхранване, при микроаерофилни условия, температура от 28 до 37° С, киселинност на средата от 4.5 до 6.5 и използване на органични азотни източници в хранителната среда.

Предимствата на разработеният метод за получаване на фруктоза са следните:

1. Получаване на концентриран разтвор на фруктоза само в една технологична стъпка - периодична ферментация с подхранване в присъствие на МКБ. За сравнение, всички известни методи за получаване на фруктоза са многоетапни.

2. В сравнение с различните методи на химична хидролиза за получаване на фруктоза, предимство на настоящият метод е получаването на продукта във високо качество, без наличие на дифруктозо анхидрид и нежелателно оцветяване. Поради това, настоящият метод не изисква допълнителните и силно оскъпяващи етапи на преработка и пречистване на продукта, нужни при химичното му получаване.

3. В сравнение с известните методи на ензимна хидролиза за получаване на фруктоза, при които субстратите се третират с получени в други процеси и впоследствие пречистени ензими, настоящият метод също има редица предимства: (i) Ензимната активност на произведената по време на ферментационният процес инулиназа достига много по-високи стойности и се запазва за много по-продължителен период от време, в сравнение с тази на пречистеният ензим, (п) Процесът се извършва при по-меки условия и при по-ниски температури. (Hi) Избягват се предварителните етапи на получаване, пречистване и съхранение на нужният за третиране ензим, (iv) Обикновено при ензимното получаване на фруктоза е необходимо мултиензимно третиране, което не е нужно при настоящият метод.

ПОЯСНЕНИЕ НА ПРИЛОЖЕНИТЕ ФИГУРИ

На Фигура 1 са представени кинетиките на разграждане на инулин и формиране на продуктите от неговото метаболизиране - захароза, фруктоза, глюкоза и млечна киселина, при ферментация на цикориево брашно (търговско име Frutafit® CLR, производител фирма Sensus) от клетки на Lactobacillus paracasei DSM 23505 в периодичен процес с подхранване. Изменението на количествата олигозахариди, състоящи се от 3 или повече монозахарида е показано като площ на общ хроматографският пик.

Процесът е проведен в биореактор с работен обем 1 литър при температура 37°С, pH на средата 4.90 и механично разбъркване със скорост 200 оборота в минута. Хранителната среда в началото на процеса съдържа: 25 г/л цикориево брашно, 10 г/л дрождев екстракт и 10 г/л бактопептон.

На Фигура 2 са представени кинетиките на разграждане на инулин и формиране на продуктите от неговото метаболизиране - захароза, фруктоза, глюкоза и млечна киселина, при ферментация на цикориево брашно (търговско име Frutafit® CLR, производител фирма Sensus) от клетки на Lactobacillus paracasei DSM 23505 в периодичен процес с подхранване. Изменението на количествата олигозахариди, състоящи се от 3 или повече монозахарида е показано като площ на общ хроматографският пик.

Процесът е проведен в биореактор с работен обем 1 литър при температура 28°С, pH на средата 4.90 и механично разбъркване със скорост 200 оборота в минута. Хранителната среда в началото на процеса съдържа: 25 г/л цикориево брашно, 10 г/л дрождев екстракт и 10 г/л бактопептон.

На Фигура 3 са представени кинетиките на разграждане на инулин и формиране на продуктите от неговото метаболизиране - захароза, фруктоза, глюкоза и млечна киселина, при ферментация на цикориево брашно (търговско име Frutafit® CLR, производител фирма Sensus) от клетки на Lactobacillus paracasei DSM 23505 в периодичен процес с подхранване. Изменението на количествата олигозахариди, състоящи се от 3 или повече монозахарида е показано като площ на общ хроматографският пик.

Процесът е проведен в биореактор с работен обем 1 литър при температура 37°С, pH на средата 6.00 и механично разбъркване със скорост 200 оборота в минута. Хранителната среда в началото на процеса съдържа: 25 г/л цикориево брашно, 10 г/л дрождев екстракт и 10 г/л бактопептон.

На Фигура 4 са представени кинетиките на разграждане на инулин и формиране на продуктите от неговото метаболизиране - захароза, фруктоза, глюкоза и млечна киселина, при ферментация на цикориево брашно (търговско име Frutafit® CLR, производител фирма Sensus) от клетки на Lactobacillus paracasei DSM 23505 в периодичен процес с подхранване. Изменението на количествата олигозахариди, състоящи се от 3 или повече монозахарида е показано като площ на общ хроматографският пик.

Процесът е проведен в биореактор с работен обем 1 литър при температура 33°С, pH на средата 5.50 и механично разбъркване със скорост 200 оборота в минута. Хранителната среда в началото на процеса съдържа: 25 г/л цикориево брашно, 10 г/л дрождев екстракт и 10 г/л бактопептон.

На Фигура 5 са представени кинетиките на разграждане на инулин и формиране на продуктите от неговото метаболизиране - захароза, фруктоза, глюкоза и млечна киселина, при ферментация на цикориево брашно (търговско име Frutafit® CLR, производител фирма Sensus) от клетки на Lactobacillus paracasei DSM 23505 в периодичен процес с подхранване. Изменението на количествата олигозахариди, състоящи се от 3 или повече монозахарида е показано като площ на общ хроматографският пик.

Процесът е проведен в биореактор с работен обем 1 литър при температура 33°C, pH на средата 5.50 и механично разбъркване със скорост 200 оборота в минута. Хранителната среда в началото на процеса съдържа: 25 г/л цикориево брашно и 10 г/л дрождев екстракт.

ПРИМЕРНО ИЗПЪЛНЕНИЕ НА МЕТОДА

ПРИМЕР 1:

Биореактор с механично разбъркване и работен обем 1 литър, се инокулира с 24 часова култура на Lactobacillus paracasei DSM 23505 в съоношение 1/10, в хранителна среда, съдържаща: 25 г/л цикориево брашно (търговско име Frutafit® CLR, производител фирма Sensus), 10 г/л дрождев екстракт и 10 г/л бактопептон. Процесът се провежда при температура 37°С, pH на средата 4.90 и механично разбъркване със скорост 200 оборота в минута в продължение на 160 часа. По време на процеса се извършва подхранване с чисто цикориево брашно, в количества по 50 или по 100 грама, които се добавят нестерилно към ферментационната среда. По време на целия процес се добавят общо 300 грама (100+100+50+50). След 160 часа, ферментационната среда съдържа: фруктоза - 131.9 г/л; млечна киселина - 55.1 г/л; захароза - 23.5 г/л; глюкоза - 5.7 г/л (Фигура 1).

ПРИМЕР 2:

Биореактор с механично разбъркване и работен обем 1 литър, се инокулира с 24 часова култура на Lactobacillus paracasei DSM 23505 в съоношение 1/10, в хранителна среда, съдържаща: 25 г/л цикориево брашно (търговско име Frutafit® CLR, производител фирма Sensus), 10 г/л дрождев екстракт и 10 г/л бактопептон. Процесът се провежда при температура 28°С, pH на средата 4.90 и механично разбъркване със скорост 200 оборота в минута в продължение на 160 часа. По време на процеса се извършва подхранване с чисто цикориево брашно, в количества по 50 или по 100 грама, които се добавят нестерилно към ферментационната среда. По време на целия процес се добавят общо 300 грама (100+100+50+50). След 160 часа, ферментационната среда съдържа: фруктоза - 131.4 г/л; млечна киселина - 53.3 г/л; захароза - 31.9 г/л; глюкоза - 0.7 г/л (Фигура 2).

ПРИМЕР 3:

Биореактор с механично разбъркване и работен обем 1 литър, се инокулира с 24 часова култура на Lactobacillus paracasei DSM 23505 в съоношение 1/10, в хранителна среда, съдържаща: 25 г/л цикориево брашно (търговско име Frutafit® CLR, производител фирма Sensus), 10 г/л дрождев екстракт и 10 г/л бактопептон. Процесът се провежда при температура 37°С, pH на средата 6.00 и механично разбъркване със скорост 200 оборота в минута в продължение на 160 часа. По време на процеса се извършва подхранване с чисто цикориево брашно, в количества по 50 или по 100 грама, които се добавят нестерилно към ферментационната среда. По време на целия процес се добавят общо 600 грама (100+100+100+50+50+50+100+50). След 160 часа, ферментационната среда съдържа: фруктоза - 243.2 г/л; млечна киселина - 74.8 г/л; захароза - 24.8 г/л; глюкоза - 15.9 г/л (Фигура 3).

ПРИМЕР 4:

Биореактор с механично разбъркване и работен обем 1 литър, се инокулира с 24 часова култура на Lactobacillus paracasei DSM 23505 в съоношение 1/10, в хранителна среда, съдържаща: 25 г/л цикориево брашно (търговско име Frutafit® CLR, производител фирма Sensus), 10 г/л дрождев екстракт и 10 г/л бактопептон. Процесът се провежда при температура 33°C, pH на средата 5.50 и механично разбъркване със скорост 100 оборота в минута в продължение на 160 часа. По време на процеса се извършва подхранване с чисто цикориево брашно, в количества по 50 или по 100 грама, които се добавят нестерилно към ферментационната среда. По време на целия процес се добавят общо 650 грама (100+100+100+100+50+100+100).

След 160 часа, ферментационната среда съдържа: фруктоза - 358.9 г/л; млечна киселина - 55.2 г/л; захароза - 17.9 г/л; глюкоза - 34.8 г/л (Фигура 4).

ПРИМЕР 5:

Биореактор с механично разбъркване и работен обем 1 литър, се инокулира с 24 часова култура на Lactobacillus paracasei DSM 23505 в съоношение 1/10, в хранителна среда, съдържаща: 25 г/л цикориево брашно (търговско име Frutafit® CLR, производител фирма Sensus) и 10 г/л дрождев екстракт. Процесът се провежда при температура 33°C, pH на средата 5.50 и механично разбъркване със скорост 100 оборота в минута в продължение на 160 часа. По време на процеса се извършва подхранване с чисто цикориево брашно, в количества по 50 или по 100 грама, които се добавят нестерилно към ферментационната среда. По време на целия процес се добавят общо 550 грама (100+100+50+100+100+50+50). След 160 часа, ферментационната среда съдържа: фруктоза - 289.7 г/л; млечна киселина - 62.9 г/л; захароза -31.8 г/л; глюкоза - 20.7 г/л (Фигура 5).

ПРИЛОЖЕНИЕ НА МЕТОДА

Методът е изключително удобен за промишлено получаване както на високо концентриран фруктозен сироп, така и на кристална фруктоза. Досега известните методи за получаване са на базата на многостъпални и скъпоструващи процеси, или на многоетапно мултиензимно третиране, или на процеси със скъпоструващи стъпки на пречистване. Настоящият метод за получаване на фруктоза е технологично прост, лесен за изпълнение и най-важното - поради ниската себестойност на полученият продукт - икономически изгоден за изпълнение в индустриални мащаби. На практика, крайният състав на ферментационната среда от Пример 4 се доближава до комерсиалният високо фруктозен сироп - 36 % фруктоза срещу 42 % в готовият комерсиален продукт, като допълнително предимство е ниската концентрация на глюкоза (3.5 % срещу 53-55 %). Поради това, методът е приложим и за получаване на диетична, хранителна добавка.

ЛИТЕРАТУРА

1. Position of the American Dietetic Association: Use of nutritive and nonnutritive sweeteners (2004) J. Am. Diet. Assoc. 104:255-275.

2. Dumesic J. A., Roman-Leshkov Y., Chheda J. N. (2007) Catalytic process for producing furan derivatives from carbohydrates in a biphasic reactor. WO patent 2007146636.

3. Schmidt E., Dooley N., Ford S. J., Elliott M., Halbert G. W. (2011) Physicochemical investigation of the influence of saccharide-based parenteral formulation excipients on Ε-β-boronphenylalanine solubilisation for boron neutron capture therapy. J. Pharm. Sci. 101:223-232.

4. Mallard C., Coudane J., Rault I., Vert M. (2000) In vivo delivery of a sparingly water soluble compounds from PLA50 microparticles. J. Microencapsul. 17:13-28.

5. Tong X., Ma Y., Li Y. (2010) Biomass and chemicals: Conversion of sugars to furan derivatives by catalytic processes. Appl. CataL A-Gen. 385:1-13.

6. Lima D. M., Fernandes P., Nascimento D. S., Ribeiro R. C. L. F., de Assis S. A. (2011) Fructose Syrup: A Biotechnology Asset. Food Technol. Biotechnol. 49:424434.

7. US patent 2005084939 (2005).

8. Buchholz K., Seibel J. (2008) Industrial carbohydrate biotransformations. Carbohydr. Res. 343:1966-1979.

9. US patent 4613377 (1986).

10. Ricca E., Calabro V., Curcio S., Iorio G. (2009) Fructose production by chicory inulin enzymatic hydrolysis: A kinetic study and reaction mechanism. Process Biochem. 44:466-470.

11. Vitolo Μ. (2004) Invertase. In: Enzymes as Biotechnological agents, S. Said and R.C.L.R. Pietro (Eds), pp. 207-221.

12. Petrova P., Velikova P., Popova L., Petrov K. (2015) Direct conversion of chicory flour into L(+)-lactic acid by the highly effective inulinase producer Lactobacillus paracasei DSM 23505. Bioresour. Technol. 186:329-333.

Claims (4)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   Е Метод за получаване на фруктоза чрез ензимна хидролиза на инулин съдържащи субстрати, характеризиращ се с това, че във ферментатор, в присъствие на култура на млечно кисела бактерия и хранителна среда съдържаща органичен азотен източник, процесът на ензимна хидролиза на инулина се осъществява само от инулиназите, произведени по време на самата ферментация.
2. 2. Методът от претенция 1, характеризиращ се с това, че ферментацията се провежда като периодичен процес с подхранване (fed-batch).
3. 3. Методът от претенция 1, характеризиращ се с това, че ферментацията се провежда при температури от около 25°С до около 40°С;
4. 4. Методът от претенция 1, характеризиращ се с това, че ферментацията се провежда при pH на хранителната среда от около 4.5 до около 7.0