BG108805A - Имуностимулиращо средство - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до използване на 2-бензопирон (кумарин), 7-хидроксикумарин (70НС), 4,7-дихидроксикумарин, 7-аминокумарин, 7-амино-4-метилкумарин, 7-диметиламино-4-метилкумарин, както и/или техните соли със или без добавяне на поликлонални активатори, особено на липополизахариди или други бактериални съставки, като имуностимулиращо средство.

Description

Изобретението се отнася до имуностимулиращо средство, което може да намери приложение при имунотерапията, където се различават профилактично и терапевтично действие, което в едни случаи предизвика подтискане на имунната реактивност, а в други - повишаване на активността на имунната система, респективно модулиране на неадекватните имунни реакции.

© ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

В медицинската имунология се провеждат изследвания с цел да се провери експериментално предизвиканата резистентност чрез иницииране на имунен отговор или да се засилят защитните механизми по отношение на определени причинители. Това се постига с методите на предпазните имунизации, отдавна доказали ефективността си, при които на даден индивид се подават атенюирани или умъртвени бактерии или части от тях с цел имунната система да се сенсибилизира до такава

степен, че при действителен контакт с причинителите, те да бъдат неутрализирани, респ. елиминирани, преди да бъде предизвикано инфекциозното заболяване. Тази форма на повишаване на активността на имунната система се определя като активно, специфично имунопотенцииране и в този случай имунната система целенасочено се сенсибилизира по отношение на един специфичен антиген. Едновременно с това нараства и необходимостта от разкриването и прилагането на нови адюванти които имат свойствата да повишават клетъчния и хуморалния имунен отговор към ваксиналния антиген. Изборът на правилният имуноген има солидното предимство на голямата ефективност, но е ограничен само върху един потенциален причинител. В съвсем малък процент случаи е възможно да се предвиди с какви болестотворни организми ще се сблъска даден индивид. При това не трябва да се забравя, че до момента има на разположение малък брой ваксини срещу относително малко бактерии и вируси. По тази причина е желателно, освен специфичните имуностимулации да има на разположение и така наречените неспецифични имунотерапии. Те поставят имунната система по време на повишена опасност в състояние на “ бойна готовност”,

така че при “състезанието” за причиняването на заболяване от патогена или неговото елиминиране, имунната система да има стартово предимство. При това от особена важност е една потенциална субстанция да не активира сама имунната система. Това би довело от една страна до ненужен разход на ресурси, които могат да бъдат полезни впоследствие, а от друга страна до автоимунни реакции на базата на неконтролираното ύ активиране. Това означава, че подобен имуномодулатор би трябвало да усилва ефекторните механизми само в присъствието на инфекциозни причинители, но в никакъв случай при тяхното отсъствие.

Проблемите при прилагането на съществуващите в момента имуно-стимуланти възникват,от една страна, на базата на посочените причини на свръхстимулиране на имунната система. От друга страна, при множество препарати ефективната субстанция или възможният механизъм на въздействие не са характеризирани в достатъчна степен, така че ефективността им не може да бъде стандартизирана.

Известно е влиянието на 2-Бензопирон и неговите метаболити, върху предизвиканото от LPS освобождаване на цитокини (1). Нито една от изследваните дози на 2Бензопирон, както и неговите деривати 7-Хидроксикумарин (7-ОНС) и 4Хидроксикумарин (4-ОНС), не беше в състояние да предизвика освобождаване на цитокини от моноцитите, когато към културите беше прибавена среда без серум с цел да се избегне влиянието на възможни други стимулатори в серумните добавки. При добавяне на минимални количества от липополизахариди (10 pg/ml), които сами не са в състояние да предизвикат забележимо активиране на моноцитите, подаването на 2Бензопирон и в по-го леми дози на 7-ОНС или 7-Диметиламино-4-метилкумарин водеха до значително освобождаване на IL-1 в културата. С повишаване концентрацията на LPS този синергичен ефект също се наблюдава ясно. В резултат се наблюдава увеличен синтез на протеини, като това се получава при увеличена транскрипция на IL-1 гена. Това показва ясно, че използваните субстанции също и при високи концентрации не оказват сами влияние върху производството на цитокини от моноцитите, но са твърде ефективни при повишаването на субоптималната стимулация с помощта на бактериален продукт.

Цел на настоящото изобретение е създаването на ново ефективно средство за профилактика и/или лечение на инфекции, за повишаване ефективността при ваксинации (адювантно действие), както и за активиране на имунната система.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ

Същността на изобретението се състои в използването на 2-Бензопирон или неговите деривати самостоятелно или в комбинация с поликлонални стимуланти за лечение на инфекции, за повишаване ефективността на ваксинации, както и за активиране на имунната система. Тези методи не са били прилагани досега. Повод за използването на 2-Бензопирон и неговите деривати, бяха убедителните резултати, получени при експериментални модели с опитни животни.

Използването на 2-Бензопирон и неговите деривати е ефективно най-вече за профилактика при опасност от инфекции, респ. като подпомагащи агенти при имунизации, за потенциране действието на ваксините. Те представляват значителен терапевтичен напредък и нова стъпка към подобряване на имунологичната защита на организма. Това изисква използването на изследваните от нас препарати като адюванти. Като активни препарати без токсичност, те ще бъдат от особено значение при използването им, например при грипни ваксини, където процентът на протекция в някои случаи е много нисък. През последните 75 години много адюванти бяха охарактеризирани и предложени за употреба, но те не бяха възприети за рутинна ваксинация при хора заради тяхната токсичност и странични ефекти. В световната практика има само няколко адюванта, използвани при лицензираните ваксини за хора и понастоящем съществува определен интерес към намирането на нови ваксинационни адюванти, като изследванията са на стадий експериментални животни или клинични изпитания на хора (5).

Изобретението се отнася до средство за профилактика и лечение на инфекции, при който на пациентите се подава ефективна доза от някой от описаните бензопирони. Изобретението представлява средство за имунотерапия, особено за профилактика и лечение на инфекции, за подпомагане при ваксинации или за активиране на имунната система.

Предимство на2-Бензопирон и неговите деривати е, че след орално приложение се абсорбира бързо и напълно от храносмилателния тракт. Той бива открит непроменен, респ. под формата на метаболити почти 100% в системната циркулация. Биотрансформацията му се извършва първоначално чрез хидроксилиране до ΊХидроксикумарин в черния дроб, който след това бива глюкониран и изхвърлен чрез бъбреците до 90%.

Средството предвижда орално, парентерално, ректално или интрадермално приложение, като оралните дози на 2-Бензопирон и неговите деривати се подават в количества до 5 g дневно. Фармацевтичната форма е във вид на таблетка, филмтаблетка, драже или капсула, пълна с прах, гранулат или частици, или капсула от мек желатин или друга галенова форма, като инжекции, инфузии, супозитории и интрадермални дози.

ОПИСАНИЕ НА ПРИЛОЖЕНИТЕ ФИГУРИ

Фиг. 1. Ефект на кумарин (2-Бензопирон) и 7-хидроксикумарин върху преживяемостта на мишки, заразени със S. typhimurium. Кумарините се прилагат р.о. в доза 50 mg/kg за период от 10 дни преди инфекцията. След последното им приложение опитните мишки се заразяват с 2 различни инфекциозни дози S. typhimurium·. висока доза от 55 CFU/мишка (1а)и ниска доза - 38 CFU/на мишка (lb).

Фиг. 2. Влияние на 7-хидроксикумарин (в концентрации от 30, 10 и 3 pg/ml) върху индукцията на IL-12 от човешки моноцити in vitro при стимулиране със субоптимални концентрации на LPS.

Статистическа обработка - Student’s t-test, *-р<0.05, **-р<0.01,***-р<0.001

Фиг. 3. Фагоцитоза на флуоресцентно-белязана Salmonella typhimurium (FITCSalmonella) от перитонеално ексудатни клетки (РЕС), изолирани от третирани със 7хидроксикумарин мишки (50 mg/kg, 10 последователни дни, перорално). Клетките са изолирани на 1, 5, 15 и 20 ден след последното приложение на препарата. Фагоцитната активност е определена чрез проточна флуоцитометрия.

Статистическа обработка - Student’s t-test, *- р<0.001

Фиг. 4. Фагоцитоза на E.coli от моноцити (Мо) и полиморфонуклеарни левкоцити (PMN), изолирани от третирани със 7-хидроксикумарин мишки (50 mg/kg, 10 последователни дни, перорално). Клетките са изолирани на 1, 5 и 15 ден след последното приложение на препарата. За определяне на % фагоцитоза е използван стандартен кит Phagotest (Sigma).

Статистическа обработка - Student’s t-test, *- рО.001

Фиг. 5. Влияние на кумарин (2-Бензопирон) и 7-хидроксикумарин върху фагоцитната активност in vitro на миши перитонеални макрофаги. Клетките са инкубирани с различни концентрации на кумарин и 7-хидроксикумарин (3, 12, 50 и 200 pg/ml) за 4 часа (светло сини колони) или 24 часа ( сини колони), като тяхната фагоцитна активност е сравнена с тази на контролните макрофаги (инкубирани само в пълна среда RPMI). След това време на инкубация към клетките е добавен убит Staphylococcus aureus и клетките се култивират 30 мин., сред което процентът на фагоцитиращите клетки е определен микроскопски.

Статистическа обработка - Student’s t-test, * р<0.05, ** р<0.01, *** р<0.001

Фиг. 6. Вътреклетъчно убиване на Salmonella typhimurium от миши перитонеални макрофаги след in vitro инкубация със 7-хидроксикумарин (7ОНС). Перитонеалните макрофаги (5.5 х 10⁵ клетки/ml) са инкубирани в присъствие на 5, 20 и 80 pg/ml 7ОНС и са инфектирани с предварително опсонизирани бактерии (съотношението макрофаги: бактерии е 1:50)

Статистическа обработка - Student t-test, ***- р<0.001

Фиг. 7. Вътреклетъчно убиване на Salmonella typhimurium от перитонеални макрофаги, изолирани от мишки, които са третирани перорално със 7-хидроксикумарин (7ОНС) 50 mg/kg за 2, 6 и 10 дни. Перитонеалните макрофаги (1 х 10⁶ клетки/ml) са инфектирани с предварително опсонизирани бактерии (съотношението макрофаги: бактерии е 1:50) Статистическа обработка - Student t-test, ***- р<0.001

Фиг. 8. Спонтанна (А) и РМА-индуцирана (В) продукция на Ог’ от перитонеални макрофаги, изолирани от мишки, третирани със 7ОНС (50 mg/kg, перорално, 10 последователни дни), като 24 часа след последното приложение на препарата 2 групи мишки (Salm и Salm-OHC) са заразени интраперитонеално със Salmonella typhimurium (45 CFU/мишка).

Статистическа обработка- Student’s t-test; *-р<0.05, **-р<0.01, ***-р<0.001

Фиг. 9. Спонтанна (А) и РМА-индуцирана (В) продукция на Н2О2 от перитонеални макрофаги, изолирани от мишки, третирани със 7ОНС (50 mg/kg, перорално, 10 последователни дни), като 24 часа след последното приложение на препарата 2 групи мишки (Salm и Salm-OHC) са заразени интраперитонеално със Salmonella typhimurium (45 CFU/мишка).

Статистическа обработка - Student’s t-test; *-р<0.05, **-р<0.01, ***-р<0.001

Фиг. 10. Продукция на N0 от перитонеални макрофаги, изолирани от мишки, третирани със 7ОНС (50 mg/kg, перорално, 10 последователни дни). 24 часа след последното приложение на препарата 2 групи мишки (Salm и Salm-OHC) са заразени интраперитонеално със Salmonella typhimurium (45 CFU/мишка).

Статистическа обработка - Student’s t-test; *-р<0.05, **-р<0.01.

Фиг. 11. Продукция на TNF-α в серума на мишки, които са третирани със Ίхидроксикумарин (7ОНС) (50 mg/kg, перорално). Серумите са събрани на 2, 6 и 10 ден по време на третирането и на 1, 5 и 10 ден след последното приложение на 7ОНС. Статистическа обработка - Student’s t-test; ** р<0.01, *** р<0.001

Фиг.12. Продукция на TNF-a в култури от перитонеални макрофаги, изолирани от мишки, които са третирани със 7ОНС (50 mg/kg, перорално). Клетките са изолирани на 2, 6 и 10 ден по време на третирането и на 1, 5 и 10 ден след края на приложението на 7ОНС.

Статистическа обработка - Student’s t-test, ***р<0.001, *р<0.05

Фиг.13. Продукция на TNF-a в култури от перитонеални макрофаги, изолирани от мишки, които са третирани със 7-хидроксикумарин (7ОНС) (50 mg/kg, перорално). Клетките са изолирани на 2, 6 и 10 ден по време на третирането и на 1, 5 и 10 ден след последното приложение на 7ОН. Макрофагите допълнително са стимулирани in vitro за 24 часа с убита Salmonella typhimurium.

Статистическа обработка - Student’s t-test * ρ<0.05, *** р<0.001 сравнено с контролната група - нестимулирани макрофаги +++- р< 0.001, сравнено със Salmonella typhiturium-cvuMyjinpavin макрофаги

Фиг. 14. Влияние на кумарин (2-Бензопирон) - (А) и 7-хидроксикумарин (Б), и комбинацията им с LPS върху преживяемостта на ICR мишки със Саркома 180. Приложението но кумарините е перорално в доза 50 mg/kg за 10 последователни дни преди туморната имплантация. Подаването на LPS е интравенозно в доза 0.1 pg/kg 24 часа преди имплантацията.

Фиг. 15. Влияние на кумарин (2-Бензопирон) - (А) и 7-хидроксикумарин (Б), и комбинацията им с LPS върху растежа на Саркома 180 при ICR мишки. Туморната имплантация се извършва подкожно с 2.10⁶ клетки/мишка. Третирането с кумарини е перорално в доза 50 mg/kg за 10 последователни дни преди туморната имплантация.

Приложението на LPS е интравенозно в доза 0.1 pg/kg 24 часа преди имплантацията на Саркома 180.

Фиг. 16. Влияние на кумарин (2-Бензопирон) и 7-хидросксикумарин върху растежа на Саркома 180 при мишки ICR. Туморната имплантация се извършва подкожно с 2.10⁶ клетки /мишка. Третирането с кумарини е перорално в доза 50 mg/kg живо тегло и започва 24 часа след трансплантацията на тумора.

Статистическа обработка - Student’s t-test, *р<0.05

Фиг. 17. Ефект на 7-хидроксикумарин върху преживяемостта на мишки, заразени с грипен вирус A/Aichi/2/68 (H3N3), адаптиран към миши бял дроб. Препаратът се прилага перорално 10 последователни дни в доза 50 mg/kg преди грипната инфекция. Мишките са заразени с 2 различни инфекциозни дози: 5 LD50 (А) и 10 LD₅o (В) 24 часа след последното приложение на 7ОНС.

Статистическа обработка - Fisher’s Exact test: ***-р<0.001, **-р<0.01, *-р<0.05

Фиг. 18. Ефект на 7-хидроксикумарин върху преживяемостта на мишки, заразени с грипен вирус A/Aichi/2/68 (H3N3), адаптиран към миши бял дроб. Мишките са заразени с 5 LD50 Третирането със 7 ОНС е перорално (10 последователни дни в доза 50 mg/) и започва 24 часа след грипната инфекция.

Статистическа обработка - Fisher’s Exact test: **-р<0.01, *-р<0.05

Фиг. 19. Влияние на 7ОНС върху първичния и вторичния IgG антитяло отговор към OVA при 3 групи мишки:

• А - мишки, третирани 10 дни със 7ОНС (50 mg/kg) и имунизирани с OVA, (100 pg/MHimca) 24 часа по-късно.

• В - мишки, имунизирани с OVA (100 ц£/мишка) и след това третирани 10 дни със 7ОНС (50 mg/kg).

• С- мишки, които са инжектирани интраперитонеално (i.p.) с OVA (100 pg/MuniKa), комбинирай със 7ОНС (50 mg/kg).

Серумите са събрани на 7 и 14 ден и IgG титрите са измерени чрез ELISA..

И при трите групи вторичната имунизация с OVA (100 pg/мишка) се провежда на 15тия ден след първото подаване на OVA. Серумите се събират на 21 и 28 ден и се измерват IgG титрите

Фиг. 20. Влияние на 7ОНС върху първичния и вторичния IgM антитяло отговор към OVA при 3 групи мишки:

• А - мишки, третирани 10 дни със 7ОНС (50 mg/kg) и имунизирани е OVA (100 pg/MHHiKa) 24 часа по-късно.

• В - мишки, имунизирани с OVA (100 μg/мишκa) и след това третирани 10 дни със 7ОНС (50 mg/kg).

• С- мишки, които са инжектирани интраперитонеално (i.p.) с OVA (100 pg/MHinKa), комбиниран със 7ОНС (50 mg/kg).

Серумите са събрани на 7 и 14 ден и IgM титрите са измерени чрез ELISA.

И при трите групи вторичната имунизация с OVA (100 pg/мишка) се провежда на 15тия ден след първото подаване на OVA. Серумите се събират на 21 и 28 ден и се измерват IgM титрите.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ

Пример 1:

След 10-дневно предварително третиране с 2-Бензопирон (подаване на субстанцията per os ) мишките се заразяваха със смъртоносна доза от Salmonella typhimurium и се оценяваше тяхната преживяемост в сравнение с нетретирани животни. Степента на преживяемост се оказа значително по-висока. Докато при инокулация с висока доза бактерии на 6-тия ден всички животни вече бяха мъртви, третираните с 2-Бензопирон показваха 40% преживяемост след този срок (>20 дни, р<0,05). Значителна разлика имаше и при инокулация с по-малка доза бактерии (40% при контролните срещу 80% при третираните мишки на 20-тия ден след инфектирането). Подобен, и дори още посилно изразен ефект беше доказан и за деривата 7-ОНС (Фигура 1). Експериментите ех vivo показаха, че при подготвените животни размножаването на бактериите е значително по-слабо изразено. Протективният ефект зависи от дозата и продължителността на третирането, което показва, че е необходимо да се постигне определено ниво но ефективната субстанция. Но не така изразен ефект беше наблюдаван и при терапевтично приложение (2-Бензопирон се прилага след инфектирането).

Подобен протективен ефект беше наблюдаван и при използването на другите деривати на 2-Бензопирон: 7-Хидроксикумарин (7ОНС), 4,7-Дихидроксикумарин, 7Аминокумарин, 7-Амино-4-метилкумарин, 7-Диметиламино-4-метилкумарин, както и/или техните соли.

Пример 2:

На базата на тези резултати, получени при опити с животни, беше изследвано и влиянието на 2-Бензопирон и неговите деривати върху освобождаването на основния за защитата от инфекцията цитокин IL-12 in vitro и беше установено значително увеличаване при стимулиране със субоптимални концентрации на LPS. Най-силно изявена индукция на IL-12 се наблюдава при използването на 7-ОНС (Фиг 2) По тази причина 2-бензопироните са в състояние още в присъствието на минимални количества от причинители да предизвикват активиране на имунната система до степен, че дори и при минимален брой патогени тя да реагира ефикасно и по този начин да пречи на размножаването им до ниво, предизвикващо заболяване. Механизмът на действие се състои в активиране на моноцитно-фагоцитната система и по този начин се обуславя повишената диференциация на провъзпалителните Т клетки на базата на усиленото производство на IL-12, предизвикано от 2-Бензопирон.

Пример 3:

Експериментите, които бяха проведени със S. typhimurium и E.coli показаха, че след третиране със 7-ОНС на мишки на 5-ия ден се повишава фагоцитозата на макрофаги и моноцити (Фиг. 3 и Фиг. 4). 2-Бензопирон и 7-ОНС приложени in vitro на макрофаги в различни концентрации засилват значимо фагоцитозата на St. aureus (Фиг. 5). Подобни резултати са наблюдавани и при използването на другите деривати на 2-Бензопирон: 7Хидроксикумарин (7ОНС), 4,7-Дихидроксикумарин, 7-Аминокумарин, 7-Амино-4метилкумарин, 7-Диметиламино-4-метилкумарин, както и/или техните соли.

Пример 4:

Едновременно с повишаване на фагоцитната активност се установява, че 2-Бензопирон и неговите деривати водят до засилено вътреклетъчно убиване на S. typhimurium в перитонеални макрофаги след in vitro и in vivo приложение, като най-добър резултат е наблюдаван при използването на 7-ОНС. (Фиг. 6 и Фиг.7).

Пример 5:

В интрацелуларното убиване на микроорганизмите са ангажирани реактивните кислородни и азотни радикали( reactive oxigen species -ROS и реактивни азотни метаболити - RNI) на макрофагите. Тяхното повлияване при инфекция със S. typhimurium е показано на Фиг. 8, Фиг. 9 и Фиг. 10, където ясно се набюдава повишаване нивото на О₂', Н₂О₂ и N0 на 5-ия ден след инфекцията (както спонтанно освободени, така и в присъствие на РМА -форболмиристат ацетат). Когато обаче мишките бяха третирани със 7-ОНС, не се установи повишение на ROS, а понижение, което започваше още на 1-ия ден. При прилагане на 7-ОНС преди салмонелната инфекция също има понижение в нивото на ROS с едно изключение, когато нивото на О₂ е повишено на 5-ия ден (само при стимулиране с РМА). Данните показват, че умереното понижение на количествата супероксиден радикал, водороден прекис и азотен окис, продуцирани от макрофагите, не води до нарушение на вътреклетъчното убиване на патогените. Може да се заключи, че това модулиране на секрецията на активни кислородни и азотни метаболити ограничава вредното им имуносупресивно и увреждащо здравите клетки и тъкани действие, без да повлиява способността на активираните макрофаги да убиват бактериите.

При използването на другите деривати на 2-Бензопирон (7-Хидроксикумарин (7ОНС), 4,7-Дихидроксикумарин, 7-Аминокумарин, 7-Амино-4-метилкумарин, 7Диметиламино-4-метилкумарин, както и/или техните соли ) са отчетини аналогични резултати.

Пример 6:

Други фактори, които участват в активирането на макрофагите са лимфокините - IFNγ, GM-CSM, TNF-α и др., освобождавани по време на Т-клетъчно медиирания отговор. От една страна е известно, че TNF играе съществена роля в защитата на организма при © инфекция със S.typhimurium.iT). Ние наблюдавахме повишение на нивото на TNF, както в серума така и в клетъчни култури на макрофаги, в интервала от последния ден от третирането със 7-ОНС до 5-ия ден. Подобно, но-много по-силно беше действието на 7-ОНС върху TNF при салмонелна инфекция на мишки ( Фиг. 11, Фиг. 12 и Фиг. 13), където разбира се не се изключва и влиянието на LPS на микроорганизма. При използването на 2-Бензопирон и другите негови производни се наблюдават същите резултати.От друга страна, повишеното ниво на TNF-a и други цитокини е от значение за цитостатичното и цитоцидно действие върху туморните клетки. Този факт, а и получените от други автори данни по отношение на антитуморното действие на 2Бензопирон и 7-ОНС (3, 4) ни дадоха основание да проучим какъв е ефектът им при експериментален туморен модел на Sarcoma 180 на мишки.

Пример 7:

Доказано беше антитуморното действие на 2-Бензопирон и неговите деривати, изразяващо се не само в повишаване на преживяемостта на мишките, но и в подтискане растежа на туморната формация, като ефекта беше потенцииран от ЬР8.(Фиг.14, Фиг. 15.и Фиг. 16). Най-убедителни резултати се отчитат при използване на 2-Бензопирон и 7-ОНС. Вероятно за тези ефекти има значение и отбелязаното погоре инхибиране на ROS.

Пример 8:

Друг пример, който потвърждава значимостта на имуностимулиращото действие на 2Бензопирон и неговите деривати при инфекции е установеният от нас протективен ефект при инфекция на мишки с грипния вирус A/Aichi/2/68(H3N2). Експериментите, проведени с деривата 7-ОНС в дози 50 mg/kg са най-представителни.Приложението е per os 10 последователни дни преди или след заразяване с 5 LD50 от грипния вирус. Когато 7-ОНС се прилагаше предварително, ефектът беше по-изразителен - 90% от мишките преживяваха, докато при третиране след заразяване преживяемостта достигна 60% (при контролите 20%). При увеличаване на дозата на грипния вирус на 10 LD50, също се наблюдаваше протективен ефект на 7-ОНС - 40% преживяемост (контролните мишки умираха 100% на 20-ия ден) (Фиг. 17 и Фиг. 18). За обяснението на тези факти и механизмите, включени в протективния ефект е необходимо да се определи ролята на IFN и NK-клетките, изследвания които се извършват понастоящем.

Пример 9:

За да обосновем необходимостта от използването на 2-Бензопирон и неговите деривати при потенцииране на ваксинациите беше необходимо да покажем повишение на имуногенността на ваксината, изразяващо се в клонална експанзия на антигенспецифични Т-'и/или В-клетки с наличие на повишено ниво на антитела.

Антителният отговор определяхме като използвахме за антиген разтворим яйчен албумин (OVA), който инжектирахме i.p. или s.c на мишки. 7-ОНС прилагахме преди, след и едновременно с инжектирането на антигена. Нивото на IgM на 7-ия ден след последното третиране е статистически повишено и в трите групи, а на IgG само в групата, където 7-ОНС е приложен преди антигена. На 14-ия ден при едновременното подаване с антигена, нивото на IgM и IgG е повишено в различна степен. След реимунизация на 15-ия ден със OVA , на 21-ия ден от първата имунизация се наблюдаваше отчетливо повишение на нивото на IgM и за трите групи, като найвисоко беше при едновременното прилагане на 7-ОНС и на антигена. Повишението на IgG беше по-слабо изразено и то само в случаите на предварително прилагане на 7ОНС (Фиг. 19 и Фиг. 20). Подобни резултати бяха получени и при прилагането на 2Бензопирон и другите негови деривати - 7-Хидроксикумарин (7ОНС), 4,7Дихидроксикумарин, 7-Аминокумарин, 7-Амино-4-метилкумарин, 7-Диметиламино-4метилкумарин, както и/или техните соли.

Claims (2)

1. Използуване на 2-Бензопирон, неговите ^с производни и фармацевтично приемливи соли с или без добавки на липополизахариди или имуностимулиращо средство, лечение на инфекции.

бактериални съставки като по-специално за профилактика и/или

2. Използуване на 2-Бензопирон и неговите производни, съгласно претенция 1, като адюванти при ваксинации.

la