BG108020A

BG108020A - Методи за лечение или профилактика на кожни заболявания с приложение на cd2-свързващи агенти

Info

Publication number: BG108020A
Application number: BG108020A
Authority: BG
Inventors: Akshay K. Vaishnaw; Kevin D. Cooper; Daniel Shrager; Thomas S. Mccormick
Original assignee: Biogen, Inc.; University Hospitals Of Cleveland
Priority date: 2001-02-01
Filing date: 2003-07-22
Publication date: 2004-03-31
Also published as: SK9722003A3; AR035079A1; EA200300849A1; ZA200305936B; EE200300366A; WO2002060480A1; EP1409015A4; EP1409015A1; IS6894A; PL368556A1; GEP20063828B; KR20040043112A; CZ20032081A3; NO20033443L; US20030185824A1; WO2002060480A9; CA2436411A1; YU61203A; HUP0303826A2; NO20033443D0

Description

МЕТОДИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКА НА КОЖНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ С ПРИЛОЖЕНИЕ НА С02-СВЪРЗВАЩИ АГЕНТИ 2595/03-РС

Сродни заявки

Тази заявка претендира за предимство пред U.S. придружаваща-нерешена заявка номер 60/265,964, представена на 1 февруари 2001, съдържанието, на която е включено тук чрез цитат.

Област на техниката

Изобретението се отнася за употребата на СО2-свързващ агент, например един инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействието (например един LFA-3/lgG слет полипептид), в комбинация с помощен агент, например UVB олъчване, за лечение на заболяване, например psoriasis или други епидермални или дермални нарушения, характеризиращи се с абнормна Т клетъчна активност или пролиферация.

Предшестващо състояние на техниката

Кожни нарушения, като псориазис, екзема, mycosis fungoides, actinic keratosis и lichen planus, е известно, че засягат един до два процента от населението на САЩ, с повече от 150,000260,000 нови случаи появяващи се годишно (“Research Needs in 11 Major Areas in Dermatology” I. Psoriasis. J.lnvest.Dermatol. 73:402-13, 1979). Известен брой от тези нарушения се характеризират с повишено Т клетъчно активиране и абнормно наличие на антиген в дермиса и епидермиса (Cooper, “Immunoregulation in the Skin”, в Cutaneous Lymphoma, Curr. Probl.Dermatol., eds. Van Vloten et al., 19, pp. 69-80 при pp. 73, 74, 76 (1990)). Например, при контактен алергичен дерматит, е наблюдавано активиране на вътрекожни Т клетки. Известно е, че кожа от пациенти проявяващи атопичен дерматит, съдържа повишен брой Langerhans’ клетки (Cooper, “Immunoregulatiom in the Skin”, in Cutaneous Lymphoma, Curr. Probl.Dermatol., eds. Van Vloten et al., 19, на стр.74 (1990)). В кожа засегната от псориазис, има повишен брой клетки с наличие на антиген, съставени от Langerhans’ клетки и не-Langerhans’ клетка Клас II МНС-носещи антиген представящи клетки (Cooper, “Immunoregulation in the Skin”, in Cutaneous Lymphoma, Curr. Probl.Dermatol., eds. Van Vloten et al., 19, на стр. 75 (1990)).

Кожна T клетъчна лимфома се характеризира с увеличение на малигнена клонална популация на Т клетки в дермиса и епидермиса. Увредени епидермални клетки съдържат повишен брой CDI⁺DR⁺ антиген представящи клетки (Cooper, “Immunoregulation in the Skin” in Cutaneous Lymphoma, Curr. Probl.Dermatol., eds. Van Vloten et al., 19, на стр. 76-77 (1990)).

Понастоящем известните терапии за гореспоменатите кожни заболявания са ограничени. Обикновено използвани са стероиди и циклоспорин А при лечение на псориазис, lichen planus, уртикария, атопичен дерматит, UV увреждане, pyoderma gangrenosum, vitiligo, очен цикатриксиален пемфигоид, alopecia areata, алергичен и дразнещ контактен дерматит и кожна Т клетъчна лимфома. В допълнение, за някои от тези кожни заболявания, различни терапии включват ретиноиди, PUVA, nitrogen mustard, интерферон, химиотерапия, метотрексат, светлинна терапия (например UV и PUVA), антибиотици и антихистамини. Виж общо, Fitzpatrick, Dermatology in General Medicine, 3^rd ed., McGraw Hill (1987. UV светлинна терапия, UVA и UVB терапия, излагат кожата на UV олъчване между 320-400 nm (UVA радиация) или 290-320 nm (UVB радиация). PUVA терапия е форма на фотохимиотерапия, която включва повтарящо се топично приложение на psoralen или съединение на базата на psoralen върху засегната област на кожата, последвано от излагане на тази област на UVA радиация. Друг метод използван за лечение на пролиферативни кожни заболявания, по-специално psoriasis и mycosis fungoides, е фотодинамична терапия (PDT).

Известни са странични ефекти на тези терапии. Най-често отчитани недостатъци за циклоспорин А включват токсичност, дължаща се на имуносупресия, както бъбречна и нервна токсичност. Стероидите имат добре известни странични ефекти, включително индукция на Cushing синдром. Странични ефекти на някои от другите гореспоменати терапии, включват кожен рак, костномозъчна и конституционална токсичност, калцификация на лигаменти, чернодробна фиброза и други нарушения. По отношение на светлинна терапия, продължително третиране на кожни заболявания, използвайки тези видове терапии, може да има за резултат значителни остри и хронични нежелани ефекти, включително еритема, сърбеж, кожен рак и хронично индуцирано със светлина увреждане на кожата (Stern et al., N.E.J. of Med. 300:809-812, 1979).

Съответно на това, налице е нужда от подобрени терапевтични модалности за профилактика и лечение на кожни заболявания, проявяващи повишено Т клетъчно активиране и абнормно наличие на антиген.

Техническа същност на изобретението

Изобретението се основава, отчасти, на откритието, че комбинацията на СО2-свързващ агент, например LFA-3/lgG слет полипептид и един помощен агент, например UVB олъчване, е силно ефективна при лечение на лезии от псориазис. Помощният агент е агент, притежаващ едно или повече от следните свойства: (i) той редуцира интерферон-γ (IFNy) продукцията и/или нивата; (ii) той редуцира броя на Т клетки в засегнатата тъкан, по-специапно CD69⁺ Т клетки; (iii) той намалява CD40 лиганд (CD40L, т.е. CD154) експресия; или (iv) той повишава Т клетъчна смърт, например апоптоза. Без да се желае да бъде свързано с теория, счита се, че третирането действа като редуцира броя и активността на Th 1-тип клетки в псориазисни лезии. Съответно, изобретението предоставя методи и препарати за лечение или профилактика на епидермапни или дермални нарушения, характеризиращи се с абнормна Т клетъчна активност или пролиферация.

Общо, изобретението характеризира метод за лечение или профилактика, у индивид с кожно заболяване, например епидермално или дермално нарушение, характеризиращо се с абнормна (например, повишена) Т клетъчна, например Th-1 тип клетъчна активност или пролиферация. Методът включва:

Въвеждане у индивид на СО2-свързващ агент, LFA-3свързващ агент, или инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействие, например, СО2-свързващ агент, в комбинация с помощен агент, например, агент притежаващ едно или повече от следните свойства:

(i) той редуцира продукцията и/или нивата на интерферон^ (IFN у);

(ii) той редуцира броя на Т клетки, например паметови ефекторни Т лимфоцити (например, CD8/CD45 RO+ клетки или CD4/CD45 RO+ клетки) в засегнатата тъкан, по-специално CD69+ Т клетки; (iii) той намалява експресията на CD40 лиганд (CD40L); или (iv) той повишава Т клетъчна смърт, например апоптоза, от това третиране или профилактика на споменато кожно нарушение.

В предпочитано изпълнение, кожното заболяване се характеризира с едно или повече от следните: (i) повишени нива на IFN у например, повишена Т клетъчна IFN у продукция; (ii) повишени нива на Т клетъчни популации, например CD3-, CD4-, CD45- и/или СО69-положителни Т клетки; (iii) повишена експресия на CD40 лиганд; или (iii) кератиноцитна хиперпролиферация.

В предпочитано изпълнение, кожното заболяване е хронично възпалително нарушение, например psoriasis.

В предпочитано изпълнение, кожното заболяване е автоимунно заболяване, например хронично автоимунно заболяване, например psoriasis.

В предпочитано изпълнение,

кожното нарушение подбрано от едно или повече от: psoriasis, атопичен дерматит, кожна Т клетъчна лимфома като mycosis fungoides, алергичен или дразнещ контактен дерматит, lichen planus, alopecia, например alopecia areata, pyoderma gangrenosa, vitiligo, очен цикатризиращ пемфигоид или уртикария. Предпочитано, кожното нарушение е psoriasis, атопичен дерматит, алергичен дерматит, или alopecia areata. Най-предпочитано, нарушението е psoriasis.

В предпочитано изпълнение, СО2-свързващият агент е инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействието, например един антиCD2 антитяло хомолог; разтворим СО2-свързващ фрагмент от LFA3; СО2-свързващ фрагмент от LFA-3 свързан, например слет с друга

4w·.·' чяст, например цял или част от плазмен протеин, като цял или част от имуноглобулин (например, IgG (например1дС1, lgG2, lgG3, lgG4), IgM, IgA (например, lgA1, lgA2), IgD и IgE, но предпочитано IgG) или негов фрагмент (например, една имуноглобулинова константна област), серум албумин (например, човешки серум албумин) или синтетичен хидрофилен полимер, като пегилиране (например, PEG); СО2-свързващ малка молекула или пептидомиметик; СО2-свързващ полипептиден фрагмент, идентифициран, например с фагов дисплей или като е използвана комбинаторна библиотека.

В предпочитано изпълнение, CD2 свързващият агент е СО2-свързващ фрагмент от LFA-3, слет с цял или част от имуноглобулинова прикрепена и тежковерижна константна област или част от нея (например, LFA-3/lgG слет полипептид, например LFA-3/lgG слет полипептид, притежаващ нуклеотидната или аминокиселинната последователност, представена в SEQ ID N0:7 и 8 от U.S. 6,162,432, която е включена тук чрез цитат). Друг предпочитан LFA-3/lgG слет белтък има аминокиселинната последователност, показана във Фигура 1 и е кодирана от нуклеотидната последователност, показана в същата Фигура.

В предпочитано изпълнение, CD2 свързващият агент е разтворим LFA-3 полипептид, например полипептид избран от аминокиселини 1-92, 1-80, 50-65, 20-80 на LFA-3 последователността, показана в SEQ ID N0:3 на U.S. 6,162,432, която е включена тук чрез цитат.

В предпочитано изпълнение, CD2 свързващият агент е анти-СО2 антитяло хомолог, например моноклонално анти-СО2 антитяло (например, един рекомбинант (например, химерно или хуманизирано анти-СО2 антитяло) или негов антиген свързващ фрагмент (например, Fab фрагмент, Fab’ фрагмент, F(ab’)2 фрагмент, F (v) фрагмент или интакгна имуноглобулинова тежка верига на един анти-СО2 антитяло хомолог).

В предпочитано изпълнение, CD2 свързващият агент включва една първа част, която свързва CD2 и една втора част, която подсилва една ефекторна клетка. Първата част може да бъде CD2 свързващ фрагмент на LFA-3, например фрагмент описан тук, или антитяло хомолог, който свързва CD2, например антитяло хомолог описан тук. Втората част може да бъде полипептид, способен да подсилва ефекторни клетки, като естествени клетки убийци (NK). Предпочитано, втората част включва: фрагмент на една имуноглобулинова константна област, например имуноглобулинов фрагмент описан тук: или Fc рецептор (например, FcyRI или FcyRII) свързващ антитяло хомолог.

В особено предпочитано изпълнение, CD2 свързващият фрагмент е химерен, например слет, полипептид, който включва СО2-свързващ фрагмент от LFA-3 и един полипептид, способен да подсилва ефекторни клетки. В предпочитано изпълнение, химерният или слетият полипептид включва един CD2 свързващ фрагмент от LFA-3, например един фрагмент описан тук, или антитяло хомолог, който свързва CD2, например антитяло хомолог описан тук и фрагмент от една имуноглобулинова константна област, например имуноглобулинов фрагмент, описан тук; или Fc рецептор свързващ антитяло хомолог.

В предпочитано изпълнение, инхибиторът на CD2/LFA-3 взаимодействието е LFA-3-свързващ агент, например aHTH-LFA-3 антитяло хомолог; разтворим LFA-3 свързващ фрагмент от CD2; LFA-3 свързващ фрагмент от CD2, слет с друга част, например плазмен белтък, като имуноглобулин (например, IgG (например, lgG1, lgG2, lgG3, lgG-4), IgM, IgA (например, lgA1, lgA2), IgD и IgE, предпочитано IgG), или негов фрагмент (например, имуноглобулинова константна област), серум албумин (например човешки серум албумин) или пегилиране; LFA-3-свързващ малка молекула или пептидомиметик; LFA-3-свързващ полипептиден фрагмент, идентифициран например с фагов дисплей или с използване на пептидна комбинаторна библиотека.

В предпочитано изпълнение, LFA-3-свързващият агент е aHTH-LFA-3 антитяло хомолог, например моноклонално aHTH-LFA-3 антитяло (например, рекомбинант (например химерно или хуманизирано aHTH-LFA-3 антитяло) или негов антиген свързващ фрагмент (например, Fab фрагмент, Fab’ фрагмент, F(ab’) фрагмент,

F(v) фрагмент или интактна имуноглобулинова тежка верига на антиLFA-3 антитяло хомолог).

В предпочитано изпълнение, помощният агент е агент, който директно или индиректно предизвиква едно или повече от: (i) намаление на интереферон-γ (IFN γ) продукция и/или нива; (ii) намаление броя на Т клетки, например паметови ефекторни Т лимфоцити (например, CD8/CD45 RO+ клетки или CD4/CD45 RO+ клетки), в засегнатата тъкан, по-специално CD69⁺ Т клетки; (iii) понижение експресията на CD40 лиганд (CD40L); или (iv) нарастване на Т клетъчна смърт, например апоптоза. Такива ефекти могат да са резултат от едно или повече от: намаление броя или активността на Т клетки, например паметови ефекторни Т лимфоцити (например, CD8/CD45 RO+ клетки или CD4/CD45 RO+ клетки); намаление броя или активността на IFN γ-продуциращи имунни клетки (например, Т клетки); отделяне или друго инактивиране на IFN γ; интерфериране със синтезата и/или секреция на IFN γ с имунна клетка; индуциране на клетъчно-(например, ефекторно клетьчно-)медиирано убиване на Т клетка (например IFN γ-продуцираща имунна клетка).

Примерни помощни агенти включват: светлинна терапия (например, UVA, UVB или PUVA); метотрексат; ретиноиди; циклоспорин; etretinate; цитокин инхибитор, например макролакгам (например, pimecrolimus); IFN γ-свързващ агент, например анти-IFN γ антитяло или негов антиген свързващ фрагмент; антагонист на IF1M γ или IFN γ-рецептор, например антитяло или негов антиген свързващ фрагмент, който инхибира IFN γ - рецепторно взаимодействие, малка молекула или пептидомиметичен инхибитор.

В предпочитано изпълнение, помощният агент е подбран от: ултравиолетово олъчване, например UVA или UVB олъчване, PUVA олъчване, метотрексат, ретиноиди, циклоспорин, etretinate, макролид, макролакгам (например, tacrolimus (FK506) или ascomycin macrolactam (например, pimecrolimus), или всякаква негова комбинация. Предпочитан агент е UVB олъчване.

В предпочитано изпълнение, методът освен това включва етап на мониториране на индивида, например за симптоми, или за промени в цитокинови нива, например IFN у или имунна клетъчна популация (например Т клетки, например паметови ефекторни Т лимфоцити (например, CD8/CD45 RO+ клетки или CD4/CD45 RO+ клетки); IFN γ- продуциращи Т клетки). Индивидът може да бъде мониториран преди началото на третиране, по време на третиране или след като бъдат въведени един или повече елементи от третирането. Мониториране може да бъде използвано за оценка необходимостта от последващо третиране със същите агенти или за допълнително третиране с допълнителни агенти. Общо, понижен ме на цитокиновите нива, например IFNy , или в подбраната имунна клетъчна популация (например, Т клетки, например паметови ефекторни Т лимфоцити (например, CD8/CD45 RO+ клетки или CD4/CD45 RO+ клетки); или IFNy-продуциращи Т клетки), е показателно за подобрение на нарушението у индивида.

Третирането може да включва комбинация с други агенти. Така, в предпочитано изпълнение, методът включва още: въвеждане у индивид на агент, който инхибира Т клетъчно рецепторен костимулаторен сигнал, например инхибитор на B7-CD28, ICAM-LFA-1 или CD40-CD40L взаимодействие, или всякаква тяхна комбинация. Агентът може да бъде всяка молекула (например антитяло или негов фрагмент, разтворим полипептид, малка молекула или пептидомиметик, който интерферира с лиганда (например, В7, ICAM, CD40), противолиганд (например, CD28, LFA-1, CD4OL) взаимодействие. Предпочитано, агентът е антитяло хомолог срещу LFA-1 или CD40L, например хуманизирано анти-LFA-! антитяло.

В предпочитано изпълнение, методът включва още: въвеждане у индивид, топично приложим агент, например един или повече от един стероид, витамин (например, витамин D), катран, антралин, макролид или макролактам, например, tacrolimus (FK5O6) или ascomycin macrolactam (например, pimecrolimus).

В предпочитано изпълнение, индивидът е бозайник, например примат, предпочитано висш примат, например човек. В едно изпълнение, индивидът е пациент с епидермално или дермално нарушение (например, пациент страдащ от лека, умерена или тежка форма на псориазис).

В предпочитано изпълнение, кожното нарушение засяга епидермална, дермална или хиподермална тъкан. Предпочитано, кожното нарушение засяга епидермална тъкан.

В предпочитано изпълнение, СО2-свързващият агент и помощният агент са въвеждани едновременно. В други изпълнения, СО2-свързващият агент и помощният агент са въвеждани последователно, например чрез въвеждане на СО2-свързващ агент пръв, последван от помощен агент, или обратно. СО2-свързващият агент и помощният агент могат дъ бадат въведени в комбинация с топична терапия (например, стероид, витамин (например, витамин D) или катрани, антралин или макролактам, например tacrolimus (FK506) или ascomycicn macrolactam (например, pimecrolimus).

В други изпълнения, СО2-свързавщият агент и помощният агент са въведени ротационно. Например, въвеждане на CD2свързващ агент може да бъде последвано от ротационна схема за топични терапии, например един курс стероидна терапия, последвана от витамин (например, витамин D3 третиране, след това последвано от антралин. Може да бъде използвана всяка комбинация и последователност за топичните агенти.

В предпочитано изпълнение, С02-свързващият агент и помощният агент са въвеждани в достатъчно тясна близост, например пространствено или временно, така че желаният ефект, например намалението на IFNy нивата, или намалението на симптом, е по-голямо от това, което би се наблюдавало с помощния агент, въведен без СО2-свързващия агент, или СО2-свързващият агент, въведен без помощен агент.

В предпочитано изпълнение, СО2-свързващият агент е въведен по време на период, където IFNy нивата са намалени от IFNy редуциращия агент. Например, СО2-свързващият агент може да бъде въведен у индивид, пациент с лека форма на псориазис, едновременно, преди или след топична терапия с един или повече от един стероид, витамин (например витамин D), катрани, антралини, макролиди или макролактами, например tacrolimus (FK506) или ascomycin macrolactam (например, pimecrolimus) или всяка тяхна комбинация. При нидивиди, например пациенти с умерена или тежка форми на псориазис, СО2-свързващият агент може да бъде въведен едновременно, преди или след светлинна терапия (например, третиране с UVB и/или PUVA). В други изпълнения, СО2-свързващият агент може да бъде въведен едновременно, преди или след светлинна терапия в комбинация с един или повече ретиноиди, метотрексат или циклоспорин. В едно изпълнение, умерен до тежък псориазисен пациент е третиран с СО2-свързващ агент по всяко време на схемата включваща: светлинна терапия и ретиноиди, последвана от метотрексат, последван от циклоспорин.

В някои изпълнения, СО2-свързващият агент е въвеждан системно (например интравенозно, интрамускулно, чрез устройство за инфузии или подкожно). В друго изпълнение, СО2-свързващият агент е въвеждан локално (например топично) на засегнатата област, например псориазисна лезия.

В предпочитано изпълнение, СО2-свързващият агент е LFAЗ/lgG слет полипептид и е въведен системно. В едно изпълнение, LFA-3/lgG слетият полипептид е въведен на пациент еднократно седмично по време на период на третиране от 12 седмици.

В предпочитано изпълнение, помощният агент е въвеждан локално, например с излагане на светлина, например UVA, UVB или PUVA олъчване. В други изпълнения, помощният агент (например метотрексат, орални ретиноиди, циклоспорин, макролакгам (например tacrolimus или pimecrolimus) е въведен системно.

В предпочитано изпълнение, помощният агент е UVB, например ултравиолетова светлина в обхвата 290-320 пт, попредпочитано във формата на тясна ивица UVB при 311 пт.

Всяка комбинация от начин на въвеждане на CD2свързващият агент и помощният агент е в обсега на изобретението.

СО2-свързващият агент и помощният агент могат да бъдат въвеждани по време на периоди на активно заболяване, или по време на период на ремисия или по-малко активно заболяване.

СО2-свързващият агент и помощният агент могат да бъдат въвеждани преди лечение, конкурентно с лечение, след лечение или по време на ремисия на заболяването.

В друг аспект, изобретението характеризира метод за лечение или профилактика на псориазис у даден индивид. Методът включва:

Въвеждане у даден индивид на слет полипептид, който включва СО2-свързващ фрагмент от LFA-3, слет с фрагмент от константната област на IgG, в комбинация с известно количество UVB, достатъчно да редуцира нивата на интерферон-γ в епидермиса на индивида, при което да лекува или предотвратява споменатия псориазис. Благоприятно, настоящият комбиниран метод на лечение може да има за резултат значително повишение степента на ремисия на заболяването ( включително изчистане) и/или значително удължен период на ремисия на заболяването или очистване, в сравнение с постигнатото с всеки друг агент самостоятелно.

В предпочитано изпълнение, фрагментът от LFA-3 е слет с цял или част от имуноглобулинова прикачена и тежковерижна константна област, например един LFA-3/lgG след полипептид, кодиран от нуклеинова киселина, притежаваща нуклеотидната последователност, представена в SEQ ID NO: 7, и притежаваща аминокиселинната последователност представена в SEQ ID N0:8 на U.S. 6,162,432, която тук е включена чрез цитат). Друг предпочитан LFA-3/lgG слет белтък има аминокиселинната последователност, представена на Фигура 1 и е кодиран от нуклеотидната последователност, представена в същата фигура.

В предпочитано изпълнение, CD2 свързващият LFA-3 полипептид включва аминокиселини 1-92, 1-80, 50-65, 20-80 на LFA-3 последователността, представена в SEQ ID N0: 3 на US 6,162,432, която тук е включена чрез цитат.

В предпочитано изпълнение, методът освен това включва етап на мониториране на индивида, например за симптоми или промени в нивата на цитокините, например IFNy или в подбрана имунна клетъчна популация (например, Т клетки, например паметови ефекгорни Т лимфоцити (например, CD8/CD45 RO+ клетки или CD4/CD45 RO+ клетки); или IFNy-продуциращи Т клетки). Индивидът може да бъде мониториран преди началото на лечение или след въвеждане на един или повече елементи на третирането. Мониториране може да бъде използвано за оценка на необходимостта от следващо третиране със същите агенти или за допълнително третиране с допълнителни агенти. Общо, намаление на цитокиновите нива, например IFNy или на подбраната имунна клетъчна популация (например Т клетки, паметови ефекгорни Т лимфоцити (например, CD8/CD45 RO+ клетки или CD4/CD45 RO+ клетки); или 1РМу-продуциращи Т клетки), е показателно за подобрение на нарушението у индивида.

Третирането може да включва комбинация с други агенти. Така, в предпочитано изпълнение, методът освен това включва: въвеждане у индивид на агент, който инхибира Т клетъчен рецепторен ко-стимулиращ сигнал, например инхибитор на B7/CD28, ICAM-LFA-3 или CD40/CD40L (т.е. CD154) или тяхна комбинация. Агентът може да бъде всяка молекула (например, антитяло или негов фрагмент, разтворим полипептид, малка молекула или пептидомиметик, който интерферира с лиганда (например, В7, ICAM, CD400), противолиганд (например, CD28, LFA-1, CD40L) взаимодействие. Предпочитано, агентът е антитяло хомолог срещу LFA-1, например хуманизирано анти-LFA-l антитяло.

В предпочитано изпълнение, методът освен това включва: въвеждане у индивид топично приложим агент, например един или повече, стероид, витамин (например, витамин D), катран или антралин.

В предпочитано изпълнение, индивидът е бозайник, например примат, предпочитано висш примат, например човек, например пациент, с епидермално или дермално нарушение (например, пациент страдащ от лека, умерена или тежка форма на псориазис).

В предпочитано изпълнение, слетият полипептид и UVB са прилагани едновременно. В други изпълнения, СО2-свързващият агент и помощният агент са прилагани последователно, чрез въвеждане първо на слетия белтък, последван от UVB третиране и обратно. Ако UVB е прилаган пръв, слетият белтък трябва да бъде въвеждан докато UVB лечението действа, например проявява се намаление нивото на IFN-γ. Ако слетият белтък е въведен пръв, UVB трябва да бъде прилаган докато се открива терапевтичен ефект на слетия белтък, например понижение нивото на IFN-γ.

Слетият полипептид и UVB могат да бъдат въвеждани в комбинация с топична терапия (например стероид, витамин (например, витамин D) или катрани, антралини или макролакгами, например tacrolimus (FK506) или ascomycin macrolactam (например, pimecrolimus). В други изпълнения, слетият полипептид и UVB са въвеждани ротационно. В друго изпълнение, въвеждане на CD2свързващ агент може да бъде последвано от ротационна схема на топични терапии, например курс стероидна терапия, последван от витамин (например, витамин D3 третиране, последвано от антралин.

Може да бъде използвана всякаква комбинация и последователност на топични и/или системни агенти.

В предпочитано изпълнение, слет полипептид и UVB са въвеждани в достатъчна близост, например, пространствено или временно, така че този ефект, например понижение на IFNy-нива или намалението на симптом е по-голямо от това, което би било L наблюдавано ако UVB е прилагана без слетия полипептид или ако слетият белтък е въведен без UVB.

В някои изпълнения, слетият полипептид е въведен системно (например, интравенозно, интрамускулно, чрез инфузия (например, с инфузионно устройство), или подкожно). В едно изпълнение, слетият полипептид е въведен у индивид еднократно за терапевтичен период на третиране от дванадесет седмици.

В предпочитано изпълнение, помощният агент е UVB, например ултравиолетова светлина в обхвата 290-320 nm, попредпочитано във формата на тясна ивица UVB при 311 nm.

В предпочитано изпълнение, UVB е прилагана локално, например чрез излагане на светлина, например UVB олъчване.

Слетият полипептид и/или UVB могат да бъдат прилагани през периоди на активно заболяване, или през период на ремисия или по-малко активно заболяване.

В друг аспект, изобретението характеризира метод за лечение или профилактика на индивид, нарушение, например възпалително нарушение. Възпалитеното нарушение може да бъде хронично възпалително нарушение, например хронично възпалително нарушение, характеризиращо се с абнормни (например повишени) Т клетки, например, ТМ-тип клетъчна активност или пролиферация. Методът включва:

Въвеждане у индивид на инхибитор на CD/LFA-3 взаимодействието, например инхибитор както е описано тук, в комбинация с помощен агент, например агент както е описано тук, при което да лекува или предотвратява споменатото хронично възпалително нарушение.

В предпочитано изпълнение, методът освен това включва етап на мониториране промените в цитокинови нива, например IFNy, или в имунна клетъчна популация (например, CD8/CD45 RO+ клетки или CD4/CD45 RO+ клетки); или IFNy- продуциращи Т клетки), където намалението на цитокинови нива, например IFNy или на имунна клетъчна популация, е показателно за подобрено нарушение у индивида.

В предпочитано изпълнение, хроничното възпалително нарушение е псориаззис.

В друг аспект, изобретението характеризира метод за лечение или профилактика у индивид, на автоимунно нарушение. Автоимунното нарушение може да бъде хронично автоимунно нарушение, характеризирано с абнормна (например, повишена) Т клетъчна, например, Th 1-тип клетъчна, активност или пролиферация. Методът включва:

Въвеждане у индивид на инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействието, например, инхибитор както е описано тук, в комбинация с помощен агент, например агент, както е описано тук, за лечение или предотвратяване на автоимунно нарушение.

В предпочитано изпълнение, методът освен това включва етап на мониториране промените в цитокинови нива, например, IFNy, или имунна клетъчна популация (например, CD8/CD45 RO+ клетки или CD4/CD45 RO+ клетки); или IFNy-продуциращи Т клетки), където понижение на цитокинови нива, например IFNy, или имунна клетъчна популация, е показателно за подобрено нарушение у индивида.

В предпочитано изпълнение, автоимунното нарушение е псориазис, захарен диабет, артрит (включително равматоиден артрит, ювенилен ревматоиден артрит, остеоартрит, псориатичен артрит) множествена склероза, енцефаломиелит, myasthenia gravis, системен lupus erythematosis, автоимунен тиреоидит, дерматит (включително атопичен дерматит и екзематозен дерматит)).

В предпочитано изпълнение, автоимунното нарушение засяга клетка, тъкан или орган на, или близо до телесната повърхност, например епидермална, дермална, окуларна, букална и/или назофарингеална мукоза. В други изпълнения, автоимунното нарушение засяга клетка, тъкан или орган, ккоито могат да бъдат достъпни като се използва устройство за предоставяне, например ендоскоп или игла.

В предпочитано изпълнение, автоимунното нарушение е подбрано от псориазис или дерматит (включително атопичен дерматит и екзематозен дерматит)).

В друг аспект, изобретението характеризира метод за лечение или профилактика у даден индивид, на псориазис. Методът се характеризира с това, че се въвежда у индивида инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействието, например СО2-свързващ агент, в комбинация с агент, подбран от групата на олъчване (например, UVB или PUVA олъчване), метотрексат, ретиноид (например, орален ретиноид) и циклоспорин, за лечение или профилактика на псориазис.

В предпочитано изпълнение, агентът е олъчване, например UVB олъчване.

В друг аспект, изобретението характеризира метод за модулиране (например, понижение) активността или пролиферацията на Т клетки (например паметови ефекторни Т лимфоцити (например, CD8/CD45 RO+ клетки или CD4/CD45 RO+ клетки); или IFNy-продуциращи клетки). Методът включва:

Поставяне в контакт на споменатата Т клетка с инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействието, например СО2-свързващ агент, в комбинация с помощен агент, например агент, както е описано тук, в количество достатъчно да модулира, например да понижава активността или пролиферацията на Т клетката.

Методът може да бъде използван на безклетъчни условия (например, реконституирана, въстановена система), на клетки в култура, например in vitro или ex vivo (например, култури включващи Т клетки). Например, клетките могат да бъдат култивирани in vitro в културелна среда и инхибитор и/или агент, както е описано тук, може да бъде поставен в средата за култивиране. В друго изпълнение, Т клетките са отстранявани от индивида преди етапа на контактуване.

Третираните клетки могат след това да бъдат върнати у индивида. По избор, методът може да бъде изпълнен на клетки, налични у индивида, например като част от in vivo (например, терапевтичен или профилактичен) терапевтичен протокол.

В друг аспект, изобретението характеризира състав (например фармацевтичен състав), който включва инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействието, например инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействието, както тук е описано, в комбинация с помощен агент, например агент както е описано тук, и фармацевтично приемлив носител.

В друг аспект, изобретението характеризира кит, който съдържа инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействието, например, инхибитор на CD2/LFA-3 както е описано тук, в комбинация с помощен агент, например агент, както е описан тук, или инструкции как да се употребява комбинацията от такива агенти.

В предпочитано изпълнение, инхибиторът на CD2/LFA-3 взаимодействието е LFA-3/lg слет полипептид. Предпочитано, LFAЗ/lg слетият полипептид е лиофилизиран.

Други особености и предимства на настоящето изобретение, ще станат по-явни от следващото подробно описание и претенции.

Кратко описание на фигурите

Фигура 1 представя аминокиселинните и нуклеотидни последователности на LFA-3/lgG слет белтък. Сигналният пептид съответства на аминокиселини 1-28 от Фигура 1; зрялата LFA-3 област съответства на аминокиселини 29-120 от Фигура 1; и lgG1 областта съответства на аминокиселини 121-351 от Фигура 1.

Подробно описание на изобретението

За да бъде настоящето изобретение по-разбираемо, найнапред някои термини са дефинирани. Допълнителни дефиниции са представени в подробното описание.

Както тук е използван, “CD2” означава CD2 полипептид, който взаимодейства с (например, свързва се с ) природно срещащ се LFA-3 полипептид и който има или е хомоложен (например, наймалко около 85% хомология) на аминокиселинна последователност, както е представено в SEQ ID N0: 5 от U.S. 6,162,432, която тук е включена чрез цитат; или който е кодиран от (а) природно срещаща се CD2 последователност на нуклеинова киселина от бозайник (например, SEQ ID N0:5 на U.S. 6,162,432, която тук е включена чрез цитат); (Ь) последователност на нуклеинова киселина най-малко 85% хомоложна на природно срещаща се CD2 последователност на нуклеинова киселина (например, SEQ ID N0:5 на U.S. 6,162,432, която тук е включена чрез цитат); или (d) последователност на нуклеинова киселина, която хибридизира с една от горните последователности на нуклеинови киселини, в условия еквивалентни на около 20°С до 27°С под Т_т и 1М натриев хлорид, например последователност на нуклеинова киселина, която хибридизира с една от горните последователности на нуклеинови киселини в строги условия, например силно строги условия.

Както тук е използван “LFA-3” означава LFA-3 полипептид, който се свързва с природно срещащ се CD2 полипептид и който има или е хомоложен (например, най-малко 85% хомология) на аминокиселинна последователност, както е показано в SEQ ID N0:1 или 3 на US 6,162,432; или който е кодиран от (а) природно срещаща се LFA-3 последователност на нуклеинова киселина (например, SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:3 на US 6,162,432, която е включена тук чрез цитат); (Ь) последователност дегенерат на нуклеинова киселина на природно срещаща се LFA-3 последователност на нуклеинова киселина; (с) последователност на нуклеинова киселина най-малко 85% хомоложна на природно срещаща се LFA-3 последователност на нуклеинова киселина от бозайник (например, SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:3 на US 6,162,432, която е включена тук чрез цитат); или (d) последователност на нуклеинова киселина, която хибридизира с една от горните последователности на нуклеинови киселини при условия еквивалентни на около 20°С до 27°С под Т_т и 1М натриев хлорид, например последователност на нуклеинова киселина, която хибридизира с една от горните последователности на нуклеинови киселини в строги условия, например силно строги условия.

“СО2-свързващ агент” е агент, който взаимодейства с (например свързва се със) CD2 и предпочитано модулира (предпочитано намалява) CD2/LFA-3 взаимодействието и/или модулира CD2 сигнализиране. Примери за СО2-свързващи агенти включват: разтворими LFA-3 свързващи фрагменти на природно срещащ се CD2 лиганд; разтворими фузии на LFA-3 или техен CD2 свързващ фрагмент, с друг белтък или полипептид, например имуноглобулин или негов фрагмент, LFA-3/CD2 слет полипептид; антитела, които свързват CD2, например рекомбинантни, моноклонални, химерни, CDR-присадени, хуманизирани или от гризачи антитела; и малка молекула или пептидомиметици.

“LFA-3-свързващ агент” е агент, който взаимодейства с (например свързва се със) LFA-3 и предпочитано модулира (предпочитано намалява) CD2/LFA-3 взаимодействието и/или модулира LFA-3 сигнализиране. Примери на LFA-3-свързващи фрагменти включват: разтворими CD2 свързващи фрагменти на природно срещащ се LFA-3 лиганд; разтворими фузии на CD2 или техен LFA-3 свързващ фрагмент с друг белтък или полипетид;

например имуноглобулин или негов фрагмент, LFA-3/CD2 слет полипептид; антитела, които свързват LFA-3, например, рекомбинантни, моноклонални, химерни, CDR-присадени, хуманизирани, човешки или от гризачи антитела; и малка молекула или пептидомиметици.

“LFA-3/lgG” слет полипептид е слет полипептид, който включва една LFA-3 последователност, която свързва CD2 и цяла или част от имуноглобулинова последователност, например, част от имуноглобулинова последователност, която взаимодейства с Fc рецептор. LFA-3 последователността може да бъде пълноразмерен LFA-3 или негов СО2-свързващ фрагмент. В предпочитано изпълнение, LFA-3 последователността е човешка LFA-3 и предпочитано последователност, която е идентична с една или двете апели на индивида. Други изпълнения могат да включват модифицирана LFA-3 последователност, например такава, която се различава от човешка LFA-3 последователност с най-малко един, но по-малко от 3, 4, 5 или 6 остатъци. (Пълната аминокиселинна последователност на човешки LFA-3 се намира в SEQ ID N0:1 или 3 на US 6,162,432, която тук е включена чрез цитат). Особено предпочитан LFA-3/lgG слет белтък е кодиран от нуклеинова киселина, с нуклеотидна последователност представена в SEQ ID N0:7, и притежаваща аминокиселинната последователност представена в SEQ ID N0:8 на US 6,162,432, която тук е включена чрез цитат. Друг предпочитан LFA-3/lgG слет белтък (също обозначаван тук като “голям продукт от снаждане”) има аминокиселинната последователност представена във Фигура 1 и е кодиран от нуклеотидната последователност, представена на същата фигура. Сигналият пептид съответства на аминокиселини 128 от Фигура 1; зрялата LFA-3 област съответства на аминокиселини

29-120 от Фигура 1; и IgG областта съответства на аминокиселини 121 до 351 от Фигура 1.

Както тук е използван “разтворим LFA-3 полипептид” или “разтворим CD2 полипептид” е един LFA-3 или CD2 полипептид, неспособен да се закрепва в биологична мембрана. Такива разтворими полипептиди включват например, CD2 и LFA-3 полипептиди, у които липсва достатъчна част от техния трансмембранен домен за закрепване на полипептида или са модифицирани, така че трансмембранният домен е нефункционален. Както тук е използвано разтворими LFA-3 полипептиди включват пълноразмерен или скъсен (например, с вътрешни делеции) Pl-свързан LFA-3.

Както тук е използван, “антитяло хомолог” е белтък, включващ един или повече полипептиди, подбрани от имуноглобулинови леки вериги, имуноглобулинови тежки вериги и техни антиген-свързващи фрагменти, които са способни да се свързват с един или повече антигени. Компонентите полипептиди на един антитяло хомолог, изграден от повече от един полипептид, могат по избор да бъдат дисулфидна връзка или ковалентно кръстосано свързване. Съответно, антитяло хомолози включват интактни имуноглобулини от типове IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (както техни подтипове), където леките вериги на имуноглобулина могат да бъдат от типове kappa и lambda. Антитяло хомолози също включват части от интактни имуноглобулини, които запазват антигенсвързваща специфичност, например Fab фрагменти, Fab’ фрагменти, F(ab’)2 фрагменти, F(v) фрагменти, тежковерижни мономери или димери, лековерижни мономери или димери, димери състоящи се от една тежка и една лека верига и подобни.

Както тук е използван, “хуманизиран рекомбинантен антитяло хомолог” е антитяло хомолог, получен с рекомбинантна

ДНК технология, при който някои или всички от аминокиселините на човешка имуноглобулинова лека или тежка верига, които се изискват за антигенно свързване, са заменени за съответните аминокиселини от не-човешка имуноглобулинова лека или тежка верига от бозайник.

Както тук е използвано, “химерен рекамбинантен антитяло хомолог” е антитяло хомолог, получен с рекомбинантна ДНК технология, при което цялата или част от прикрепената или константна области на имуноглобулинова лека верига, тежка верига или и двете, са заменени за съответните области от друга имуноглобулинова лека верига или тежка верига.

Последователности сходни или хомоложни (например наймалко около 85% идентичност на последователността) с последователностите представени тук, също са част от тази заявка. В някои изпълнения, идентичността на последователността може да бъде около 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или по-висока. По избор, значителна идентичност има когато сегменти на нуклеиновите киселини ще хибридизират при условия на селективна хибридизация (например, силно строги хибридизационни условия), с комплементарната на веригата. Нуклеиновите киселини могат да присъстват в цели клетки, в клетъчен лизат, или в частично пречистена или съществено чиста форма.

Изчисления на “хомология” или “идентичност на последователност” между две последователности (термините са използвани взаимозаменяемо тук), са проведени както следва. Последователностите са подравнени за целите на оптимално сравнение (например, интервали могат да бъдат въведени в един или двата от първата и втората последователност на аминокиселина или нуклеинова киселина, за оптимално подравняване и не-хомоложни последователности могат да бъдат игнорирани за целите на сравнението). В предпочитано изпълнение, дължината на референтна последователност, подравнена за целите на сравнение е най-малко 30%, предпочитано най-малко 40%, попредпочитано най-малко 50%, по-предпочитано най-малко 60% и още по-предпочитано най-малко 70%, 80%, 90%, 100% от дължината на референтната последователност. След това са сравнени аминокиселини ите остатъци или нуклеотиди в съответни аминокиселинни позиции или нукпеотидни позиции. Когато позиция в първата последователност е заета от същия аминокиселинен остатък или нуклеотид, както съответната позиция във втората последователност, тогава молекулите са идентични в тази позиция (както е използвано тук “идентичност на аминокиселина или нуклеинова киселина е еквивалентна на “хомология” на аминокиселина или нуклеинова киселина). Процентът идентичност между двете последователности е функция от броя на идентичните позиции, споделени от последователностите, като се взима предвид броя на интервалите и дължината на всеки интервал, който трябва да бъде въведен за оптимално подравняване на двете последователности.

Сравнението на последователности и определяне процента идентичност между две последователности, може да бъде извършено като се използва математически алгоритъм. В предпочитано изпълнение, процентът идентичност между две аминокиселинни последователности е определен като е използван Needleman and Wunsch ((1970) J.Mol.Biol. 48:444-453) алгоритъм, който е бил включен в GAP програма в GCG софтуерен пакет (достъпен на http://www.gcg.сот)като е използван или Blossom 62 matrix или РАМ250 matrix, и интервал на изменение на теглата 16, 14, 12, 10, 8, 6, или 4 и обсег на теглата 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В друго предпочитано изпълнение, процентът идентичност между две нуклеотидни последователности е определен, като е използвана GAP програмата и GCG софтуерен пакет (достъпен на http://www.gcg.com)KaTO е използван NWSgapdna.CMP matrix и интервал на теглата 40, 50, 60, 70 или 80 и обсег на теглата 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В особено предпочитан набор от параметри (и един, който трябва да бъде използван ако специалистът е несигурен за това какви параметри трябва да бъдат приложени за определяне ако една молекула, е в рамките на идентичност на последователност или ограничение на хомологията на изобретението) са Blossom 62 scoring matrix с ограничителен интервал 12, разширен ограничителен интервал 4 и ограничителен интервал на преместване на рамката 5.

Както тук е използвано, терминът “хомоложен” е синонимен със “сходство” и означава, че една последователност, която е от интерес, се различава от референтна последователност по наличието на една или повече аминокиселинни замени (въпреки умерените аминокиселинни инсерции или делеции), които могат да са налице. Понастоящем, предпочитани средства за изчисление степените на хомология или сходство с една референтна последователност, са с използване на BLAST и Pfam алгоритми, които са достъпни, съответно чрез Washington Universtity на http://blastwustl.edu и http://blast.wustledu във всеки случай, като се използва алгоритъм по разпознаване или препоръчани параметри за определяне значимост на сродство на изчислена последователност. Процентът идентичност между две аминокиселинни или нуклеотидни последователности може да бъде определен като се използва алгоритъма на Е.Meyers and W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17), който е включен в ALIGN програма (версия 2.0), използвайки една РАМ120 таблица на тегла на остатъци, дължина на ограничителен интервал интервал 12 и ограничителен интервал 4.

Както тук е използван, терминът “хибридизира при строги условия” описва условия за хибридизация и измиване. Строги условия са известни на специалиста в тази област и могат да бъдат намерени в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons,

N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Описани са водни и не-водни методи в този цитат и двата могат да бъдат използвани. Предпочитан пример за строги условия на хибридизация, са хибридизация в 6Х натриев хлорид/натриев цитрат (SSC) при около 45°С, последвана от едно или повече измивания в 0.2Х SSC, 0.1% SDS на 50°С. Друг пример за строги условия на хибридизация са хибридизация в 6Х SSC на около 45°С, последвана от едно или повече измивания в 0.2Х SSC,

O. 1% SDS на 55°С. Следващ пример за строги условия на хибридизация, са хибридизация в 6Х SSC на около 45°С, последвана от едно или повече измивания в 0.2Х SSC, 0.1% SDS на 60°С. Предпочитано, строги условия на хибридизация са хибридизация в 6Х SSC на около 45°С, последвана от едно или повече измивания в 0.2Х SSC, 0.1% SDS на 65°С. Особено предпочитани силно строги условия ( и условията, които трябва да бъдат използвани ако практикуващият специалист е несигурен за това какви условия трябва да бъдат приложени, за да се определи дали една молекула е в рамките на хибридизационно ограничение на изобретението) са 0.5М натриев фосфат, 7% SDS на 65°С, последвана от едно или повече измивания в 0.2Х SSC, 1% SDS на 65°С.

Разбираемо е, че полипептидите на изобретението могат да имат допълнителни консервативни или несъществени аминокиселинни замени, които нямат съществен ефект върху функциите на полипептидите. Дали дадена замяна ще бъде толерирана, т.е. няма нежелано да повлиява желани биологични свойства, като свързваща активност, може да бъде определено както е описано от Bowie, JU et al. (1990) Science 247:1306-1310.

“Консервативна аминокиселинна замяна” е тази, при която аминокиселинният остатък е заменен с аминокиселинен остатък, притежаващ сходна странична верига. Семейства аминокиселинни остатъци със сходни странични вериги са дефинирани в тази област. Тези семейства включват аминокиселини с базични странични вериги (например, лизин, аргинин, хистидин), киселинни странични вериги (например, аспаргинова киселина, глутаминова киселина), незаредени полярни странични вериги (например, глицин, аспаргин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярни странични вериги (например, аланин, валин, левцин, изолевцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разклонени странични вериги (например, треонин, валин, изолевцин) и ароматни странични вериги (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, хистидин).

“Не-съществен” аминокиселинен остатък е остатък, който може да бъде променен от дивия-тип последователност на хибридно антитяло, без унищожаване или по-предпочитано без същественно изменение на биологичната активност, докато “съществен” аминокиселинен остатък води до такава промяна.

Кожни заболявания

Методите на изобретението са полезни за профилактика или лечение на бозайници, например, примати, или хора, кожни нарушения, характеризиращи се с повишено Т клетъчно активиране и наличие на абнормен антиген в дермиса и епидермиса, чрез въвеждане на инхибитори на CD2/LFA-3 взаимодействието. Такива нарушения включват псориазис, UV увреждане, атопичен дерматит, кожна Т клетъчна лимфома като mycosis funcoides, алергичен или дразнещ контактен дерматит, lichen planus, alopecia, например alopecia areata, pyoderma gangrenosum, vitiligo, ocular cicatricial pemphigoid и уртикария. Разбираемо е, че методи за лечение и профилактика на кожни заболявания, като pyoderma gangrenosum и уртикария, са включени в обсега на настоящето изобретение. Последните кожни заболявания са също циклоспорин А чувствителни дерматози и следователно включват Т клетъчно активиране. Предпочитано, методите на изобретението са използвани за профилактика или лечение на псориазис, атопичен дерматит, алергичен дерматит, alopecia areata и по-предпочитано псориазис.

Методите на изобретението могат да бъдат прилагани на всеки индивид, например бозайник, предпочитано хора. Както тук е използван, терминът “индивид” е предвидено да включва човек и животни. Предпочитано хора, включва човек пациент с кожно заболяване, характеризиращо се с повишено Т клетъчно активиране и абнормно наличие на антиген в дермиса и епидермиса. Терминът “не-човешки същества на изобретението, включва всички гръбначни, например бозайници, като не-човешки примати (по-специално висши примати), овца, куче, гризач (например, мишка или плъх), морско свинче, коза, свиня, котка, заек, крава и не-бозайници, като пилета, земноводни, влечуги и др.

Инхибитори на CD2/LFA-3 взаимодействието

Всеки инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействието е приложим в методите на изобретението. Такива инхибитори включват анти-1ТА-3 антитяло хомолози, анти-СО2 антитяло хомолози, разтворими LFA-3 полипептиди, разтворими CD2 полипептиди, малки молекули, например (например, химичен агент с молекулно тегло по-малко 2500 Da, предпочитано по-малко от 1500 Da, химикал, например малка органична молекула, например продукт на комбинаторна библиотека), LFA-3 и CD2 миметични агенти и техни производни. Предпочитани инхибитори са разтворими LFA-3 полипептиди и анти-LFA-S антитяло хомолози.

Използването в методите на изобретението на специфични разтворими CD2 полипептиди, разтворими LFA-3 полипептиди, антиLFA-3 антитяло хомолози, анти-СО2 антитяло хомолози или CD2 и LFA-3 миметични агенти, може лесно да бъде определено чрез тестиране на тяхната способност да инхибират LFA-3/CD2 взаимодействието. Способността може да бъде тестирана, например като се използва прост тест за клетъчно свързване, което позволява визуална (при увеличение) оценка на способността на предполагаем инхибитор да инхибира взаимодействието между LFA-3 и CD2 на клетки носещи тези молекули. Предпочитани са Jurkat клетки като CD2⁺ субстрата и овчи червени кръвни клетки или човешки JY клетки са предпочитани като LFA-3⁺ субстрат. Свързващите характеристики на разтворими полипептиди, антитяло хомолози и миметични агенти, използвани в това изобретение, могат да бъдат тестирани по няколко известни начина, като радиоактивно белязане на антитяло хомолога, полипептида или агент (например ³⁵S или ¹²⁵1) и след това поставяне в контакт белязания полипептид, миметичния агент или антитяло хомолога с CD2⁺ на LFA-3⁺ клетки, както е подходящо. Свързващи характеристики могат също да бъдат тестирани като се използва ензимно белязано вторично антитяло. Конкурентни тестове розетка, като описаните от Seed et а\.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, рр. 3365-69 (1987)) могат също да бъдат използвани.

AHmu-LFA-3 u aHmu-CD2 антитяло хомолози

Много типове aHTH-LFA-З или анти-СО2 антитяло хомолози, са използвани в методите на това изобретение. Такива включват моноклонални антитела, рекомбинантни антитела, , химерни рекомбинантни антитела, хуманизирани рекомбинантни антитела, както и антиген-свързващи участъци на горните.

Измежду aHTH-LFA-З антитяло хомолозите, се предпочита да се използват моноклонални aHTH-LFA-З антитела. Попредпочитано е да се използва моноклонално анти-1ТА-3 антитяло, продуцирано от хибридома, подбрана от групата на хибридомите с Ключови номера АТСС НВ 10693 (IE6), АТСС НВ 10694 (HC-IB11), АТСС НВ 10695 (7А6) и АТСС НВ 10696 (8В8) или моноклоналното антитяло известно като TS2/9 (Sanchez-Madrid et al., “Three Distinct Antigenes Associated with Human T-Lymphocyte-Mediated Cytolysis: LFA-1, LFA-2 и LFA-3”, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 79, pp.7489-93 (1982)). По-предпочитано, моноклоналното aHTH-LFA-З антитяло е получено с хибридома, подбрана от групата на хибридоми с Ключови номера АТСС НВ 10695 (7А6) и АТСС НВ 10693 (IE6).

Измежду анти-СО2 антитяло хомолозите, се предпочита да се използват моноклонални анти-СО2 антитела, като анти-СО2 моноклоналните антитела, известни като Т1^ епитоп антитела, включително TS2/18 (Sanchez-Madrid et al., “Three Distinct Antigenes Associated with Human T-Lymphocyte-Mediated Cytolysis: LFA-1, LFA-2 и LFA-3”, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 79, pp.7489-93 (1982)).

Технологията за получаване на моноклонални антитела е добре известна. Накратко, обезсмъртена клетъчна линия (обикновено миеломни клетки) е слета чрез фузия с лимфоцити (обикновено спленоцити) от бозайник, имунизиран с препарат съдържащ даден антиген, и надстоящите течности от културите на получените хибридомни клетки са скринирани за антитела срещу антигена. Виж общо, Kohler et al., Nature, “Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity”, 256, pp.49597 (1975). Полезни имуногени за целта на това изобретение включват CD2- или LFA-3-носещи клетки, както и безклетъчни препарати, съдържащи LFA-3, CD2 или техни противо рецепторсвързващи фрагменти (например, CD2 фрагменти, които се свързват с LFA-3 или LFA-3 фрагменти, които се свързват с CD2).

Имунизация може да бъде изпълнена със стандартни процедури. Единицата доза и схемата на имунизация зависи от видовете имунизирани бозайници, техния имунен статус, телесно тегло на бозайника и т.н. Обикновено, имунизираните бозайници са обезкьрвени и серумът от всяка кръвна проба е тестиран за специални антитела, като се използват подходящи тестове за скриниране. Например, полезни aHTH-LFA-З или анти-СО2 антитела могат да бъдат идентифицирани чрез тестиране способността на имунния серум да блокира образуване розетки от овчи червени кръвни клетки ат Jurkat клетки, което е резултат от наличието на LFA-3 и CD2 по съответните повърхности на тези клетки. Използваните лимфоцити при получаването на хибридомни клетки, обикновено са изолирани от имунизирани бозайници, чиито серуми са тестирани като положителни за наличието на желаните антитела, като се използват такива скрининг тестове.

Обикновено, обезсмъртената клетъчна линия (например, ммиеломна клетъчна линия), произлиза от същите видове бозайници както лимфоцитите. Предпочитани обезсмъртени клетъчни линии са миши миеломни клетъчни линии, които са чувствителни към средата за клетъчни култури, съдържаща хипоксантин, аминоптерин и тимидин (“НАТ” среда).

Обикновено, НАТ-чувствителни миши миеломни клетки са слети чрез фузия с миши спленоцити, като е използван полиетилен гликол (“PEG”) 3350. Хибридомни клетки получени от фузията след това са отбрани, като е използвана НАТ среда, която убива неслетите и непродуктивно слетите миеломни клетки (не-слети спленоцити умират след няколко дни, тъй като те не са трансформирани). Хибридоми продуциращи желано антитяло са откривани чрез скриниране надстоящите течности на хибридомни култури, например, за способност да се свързват с техния съответен противо рецептор, или за тхната способност да блокират Jurkat клетъчна адхезия спрямо овчи червени кръвни клетки. Субклониране на хибридомни култури, чрез ограничително разреждане, обикновено е извършвано за осигуряване на моноклоналност.

За получаване анти-LFA-S или анти-СО2 моноклонални антитела, хибридомни клетки, които са тестирани като положителни в такива скрининг тестове, са култивирани в хранителна среда в условия и за време, достатъчно да позволява хибридомните клетки да секретират моноклоналните антитела в средата за култивиране. Тези техники на култивиране и среди за култивиране, подходящи за хибридомни клетки, са добре известни. Кондиционираната надстояща течност от среда за хибридоми, може да бъде събрана и желаните антитела по избор след това да бъдат пречистени с добре известни методи.

По избор, желаното антитяло може да бъде получено чрез инжектиране на хибридомните клетки в перитонеалната кухина на pristane-индуцирана мишка. Хибридомните клетки пролиферират в перитонеалната кухина, секретирайки антитяло, което акумулира като асцитна течност. Антитялото може да бъде събрано, чрез изсмукване на асцитната течност от перитонеалната кухина със спринцовка.

Ahth-CD2 и aHTH-LFA-3 антитяло хомолози, използваеми в настоящето изобретение, могат да бъдат също рекомбинантни антитела, получени от клетки гостоприемници, трансформирани с ДНК, кодираща имуноглобулинови леки и тежки вериги на желано антитяло. Рекомбинантни антитела могат да бъда получени с добре известни техники на генното инженерство. Виж, например U.S.Patent No. 4,816,397, който е включен тук чрез цитат.

Например, рекомбинантни антитела могат да бъдат получени чрез клониране кДНК или геномна ДНК, кодираща имуноглобулиновите леки и тежки вериги на желаното антитяло от хибридомна клетка, която произвежда антитяло хомолог, полезен за това изобретение. кДНК или геномна ДНК кодираща тези полипептиди, след това е вмъкната чрез инсерция в експресионни вектори, така че двата гена са оперативно свързани с техните собствени транскрипционни или транслационни контролиращи експресията последователности. Експресионният вектор и експресионните контролни последователности са подбрани да бъдат съвместими с експресията на използваната клетка гостоприемник. Обикновено, двата гена са вмъкнати в същия експресионен вектор.

Могат да бъдат използвани прокариотни или еукариотни клетки гостоприемници. Експресия в еукариотни клетки гостоприемници е предпочитана, тъй като такива клетки е повероятно в сравнение с прокариотни клетки, да асемблират и секретират точно нагънато и имунологично активно антитяло. Обаче, всяко получено антитяло, което е неактивно поради неточно нагъване, може да бъде ренатурирано съгласно добре известни методи (Kim amd Baldwin, “Specific Intermediaates in the Folding Reactions of Small Proteins and the Mechanism of Protein Folding”, Ann.Rev.Biochem., 51, pp.459-89 (1982)). Възможно е клетките гостоприемници да произвеждат части от интактни антитела, като лековерижни димери или тежковерижни димери, които са също антитяло хомолози, съгласно настоящето изобретение.

Разбираемо е, че варианти на горната процедура са използваеми в горното изобретение. Например, може да е желателно да се трасформира клетка гостоприемник с ДНК, кодираща лека верига или тежка верига (но не и двете) на един антитяло хомолог. Рекомбинантна ДНК технология може също да бъде използвана за отстраняване на част или цялата ДНК, Q кодираща една от двете - лека или тежка вериги, която не е необходима за CD2 или LFA-3 противо рецепторно свързване. Молекулите експресирани от такива скъсени ДНК молекули, са използваеми в методите на това изобретение. В допълнение, бифункционални антитела могат да бъдат получени, при които една тежка и една лека верига са анти-СО2 или анти-1ТА-3 антитяло хомолози и другата лека и тежка верига са специфични за даден антиген, различен от CD2 или LFA-3, или друг епитоп на CD2 или LFA-3.

Химерни рекомбинантни aHTn-LFA-З или анти-СО2 антитяло хомолози могат да бъдат получени чрез трансформиране на клетка ν гостоприемник с подходящ експресионен вектор, съдържащ ДНК кодираща желаните имуноглобулинови лека и тежка вериги, в който цялата или част от ДНК кодираща прикачената и константна области на тежката и/или леката верига, са заменени с ДНК от съответната област на имуноглобулинова лека или тежка верига от различни видове. Когато оригиналното рекомбинантно антитяло е не-човешко и инхибиторът трябва да бъде въведен на човек, предпочитана е замяна на съответни човешки последователности. Примерно химерно рекомбинантно антитяло има миши променливи области и човешка прикрепена и константна области. Виж общо, U.S.Patent No.

4,816,397; Morrison et al., “Chimeric Human Antibody Molecules: Mouse Antigen-Binding Domains With Human Constant Region Domains”, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 81,pp.6851-55 (1984); Robinson et al., International Patent Publication PCT/US86/02269; Akira et al., European Patent Application 184, 187; Taniguchi, M., European Patent Application 171,496; Neuberger et al., International Application WO 86/01533; Better et al. (1988 Science 240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:34393443; Liu et al., 1987, J.lmmunol. 139, 3521-3526] Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc.Res. 47:999-1005; Wood et al., (1985) Nature 314:446-449; и Shaw et al., 1988, J.Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559).

Хуманизирани рекомбинантни aHTH-LFA-3 или анти-СО2 антитела могат да бъдат създадени чрез заместване последователности на Fv променлива област, които не са пряко участващи в антигенното свързване, с еквивалентни последователности от човешки Fv променливи области. Общи методи за създаване на хуманизирани антитела са предоставени от Morrison, S.L., 1985, Science 229:1202-1207, от Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214 и от Queen et al. US 5,585,089, US 5,693,761 и US 5,693,762, съдържанията на всички, от които са включени тук чрез цитат. Тези методи включват изолиране, манипулиране и експресиране на последователности от нуклеинови киселини, които кодират целите или част от имуноглобулинови Fv променливи области от най-малко една от тежка или лека верига. Източници на такава нуклеинова киселина са добре известни на специалиста в тази област, например, може да бъде получена от хибридома, произвеждаща aHTH-LFA-3 или анти-СО2 антитяло. Нуклеинови киселини кодиращи хуманизираано антитяло или негов фрагмент, могат след това да бъдат клонирани в подходящ експресионен вектор.

Хуманизирани или CDR-присадени антитяло молекули или имуноглобулини могат да бъдат получени чрез CDR-присаждане или CDR замяна, където една, две или всички CDR’s на имуноглобулинова верига могат да бъдат заменени. Виж например, U.S.Patent 5,225,539; Jones et al., 1986 Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988 Science 239:1534; Beidler et al 1988 J.Immunol. 141:4053-4060; Winter US 5,225,539, съдържанието на всички от които е специално включено тук чрез цитат. Winter описва CDRприсаждащ метод, който може да бъде използван за изготвяне на хуманизирани антитела на настоящето изобретение (UK Patent Application GB 2188638А, представена на 26 март 1987; Winter US 5,225,539), ссъдържанието на които е специално включено чрез цитат. Всички от CDR’s на дадено човешко антитяло могат да бъдат заменени с не-човешки CDR’s. Необходимо е само да се замени броя на CDR’s необходими за свързване на хуманизираното антитяло с предварително определения антиген, например LFA-3 или CD2.

Също в обсега на изобретението са хуманизирани антитела, включително имуноглобулини, в които специфични аминокиселини са заменени, делетирани или добавени. Поспециално, предпочитани хуманизирани антитела имат аминокиселинни замении в областта на рамката, така че да подобрят свързването с антигена. Например, подбран, малък брой остатъци на акцепторната рамка на хуманизирана имуноглобулинова верига, могат да бъдат заменени със съответни донорни аминокиселини. Предпочитани локализации на замените включват аминокиселинни остатъци, съседни на CDR, които са способни да взаимодействат с CDR (виж например, US 5,585,089). Критерии за подбор на аминокиселини от донора са описани в US 5,585,089, например колони 12-16 на US 5,585,089, съдържанията на които са включени тук чрез цитат. Други техники за хуманизирани имуноглобулинови вериги, включително антитела, са описани в Padlan et al EP 519596 А1, публикувана на 23 декември 1992.

Човешки моноклонапни антитела (mAbs), насочени срещу човешки LFA-3 или CD2 могат да бъдат създадени, като се използват трансгенни мишки, притежаващи пълната човешка имунна система, отколкото мишата система. Спленоцити от тези трансгенни мишки, имунизирани с антиген, който е от интерес, са използвани за получаване на хибридоми, които секретират човешки mAbs със специфични афинитети за епитопи от човешки белтък (виж, например Wood et al. International Application WO 91/00906, Kucherlapati et al. PCT publication WO 91/10741; Lonberg et al. International Application WO 92/03918; Kay et al. International Application 92/03917; Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368:856-859; Green, L.L. et al., 1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S.L. et al. 1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855; Bruggeman et al., 1993 Year Immunol. 7:33-40; Tuaillon et al. 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman etal. 1991 Eur. J. Immunol. 21:1323-1326).

Моноклонални антитела могат също да бъдат създадени с други методи, известни на специалиста в областта на рекомбинантната ДНК технология. Алтернативен метод, означен като “комбинаторен антитяло дисплей метод, е създаден за идентифициране и изолиране на антитяло фрагменти, притежаващи специална антигенна специфичност и може да бъде използван за получаване на моноклонални антитела (за описания на комбинаторен антитяло дисплей виж например, Sastry et al. 1989 PNAS 86:5728; Huse et al. 1989 Science 246:1275; и Orlandi et al. 1989 PNAS 86:3833). След имунизация на животно с имуноген както е описано по-горе, антитяло репертоарът на получения В-клетъчен пул е клониран. Общо известни са методите за получаване на ДНК последователност от променливите области на разнообразна популация от имуноглобулинови молекули, като се използва смес от олигомерни праймери и PCR. Например, смесени олигонуклеотидни праймери, съответстващи на 5’ лидерните (сигнален пептид) последователности и/или последователности на рамка 1 (FR 1), както и праймер за праймер на една консервирана З’константна област, може да бъде използван за PCR амплификация на леко и тежковерижните променливи области от известен брой миши антитела (Larrick et al., 1991, Biotechniques 11:152-156). Сходна стратегия може също да бъде използвана за амплифициране на човешки тежко и лековерижни променливи области от човешки антитела (Larrick et al., 1991, Methods: Companion to Methods in Enzymology 2:106-110).

В илюстративно изпълнение, РНК е изолирана от В лимфоцити, например, периферни кръвни клетки, костен мозък или препарати от слезка, като са използвани стандартни протоколи (например, U.S.Patent No. 4,683,202; Orlandi et al. PNAS (1989) 86, 3833-3837; Sastry et al., PNAS (1989) 86: 57-28-5732; и Huse et al. (1989) Science 246:1257-1281). Първа-верига кДНК е синтезирана като са използвани праймери, специфични за константната област на тежката верига(и) и всяка от к и λ леки вериги, както и праймери за сигналната последователност. Използвайки PCR праймери за променлива област, променливите области на двете - тежка и лекка вериги са амплифицирани, всеки поотделно или в комбинация и са лигирани в подходящи вектори, за последваща манипулация при създаване на дисплей пакетите. Олигонуклеотидни полимери използваеми в протокили за амплификация, могат да бъдат уникални или дегенерат, или включват инозин в дегенерирани позиции. Последователности разпознавани от рестрикционни ендонуклеази могат също да бъдат включени в праймерите, за да позволяват клониране на амплифицирания фрагмент във вектор в предварително определена рамка за четене за експресия.

V-генна библиотека, клонирана от получен от имунизация антитяло репертоар, може да бъде експресирана от популация на дисплей пакети, предпочитано производни от филаментозен фаг, за образуване на антитяло дисплей библиотека. Идеално, дисплей пакетът включва една система, която позволява взимането на проби от много големи разнообразни антитяло библиотеки, бързо сортиране след всеки кръг на афинитетно разделяне и лесно изолиране на антитяло гена от пречистени дисплей пакети. В допълнение към търговски достъпни китове за създаване на фагов дисплей библиотеки (например, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalog no. 27-9400-01; и Stratagne SurfZAP™ phage display kit, catalog no. 240612), примери на методи и реагенти, особено податливи за употреба при създаване на разнообразна антитяло дисплей библиотека, могат да бъдат намерени в, например Ladner et al. U.S. Patent No. 5,223,409; Kang et al. International Publication No. WO 92/18619; Dower et al. International publication No. WO 91/17271; Winter et al. International Publication WO 92/20791; Markland et al. International Publication No. WO 92/15679; Breitling et al. International Publication WO 93/01288; McCafferty et al. International Publication No. WO 92/01047; Garrard et al. International Publication No. WO 92/09690; Ladner et al. International Publication No. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al (1992) J.Mol.BioL 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al (1991) BioTechnology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; и Baras et al. (1991) PNAS 88:7978-7982.

В известни изпълнения, домените на V областта с тежки и леки вериги, могат да бъдат експресирани на същия полипептид, свързан с подвижен линкер, за образуване на едноверижен Fv фрагмент, и scFV генът впоследствие да бъде клониран в желан експресионен вектор или фагов геном. Както общо е описано в McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554, пълни V_H и V_L домени на антитяло, свързани с подвижен (Gly₄-Ser)₃ линкер, могат да бъдат използвани за произвеждане на едноверижно антитяло, което може да направи дисплей пакета отделим, въз основа на антигенен афинитет. Изолирани scFV антитела, имунореактивни с антиген, могат впоследствие да бъдат комбинирани във фармацевтичен препарат за употреба в даден метод.

Веднъж проявена по повърхността на един дисплей пакет (например, филаментозен фаг), антитяло библиотеката е скринирана с антигена, или негов пептиден фрагмент, за идентифициране и изолиране на пакети, които експресират антитяло със специфичност за антигена. Нуклеинова киселина кодираща подбраното антитяло, може да бъде извлечена от дисплей пакета (например от фаговвия геном) и субклонирана в други експресионни вектори със стандартни рекомбинантни ДНК техники.

Специфични антитела с висок афинитет за един повърхностен белтък, могат да бъдат изготвени съгласно методите, известни на специалистите в тази област, например методи включващи скрининг библиотеки (Ladner, R.C., et al. U.S.Patent 5,233,409; Ladner, R.C., et al. U.S. Ppatent 5,403,484). Освен това, методите на тези библиотеки могат да бъдат използвани в подбори за получаване свързващи детерминанти, които са миметици за структурните детерминанти на антитела.

По-специално, Fv свързващата повърхност на дадена антитяло молекула взаимодейства с нейния прицелен лиганд, съгласно принципите на белтък-белтък взаимодействия, тъй като данни за последователност за V_H и V_L (последната, от които може да бъде к или λ тип верига), е основата за белтъчни техники на генно инженерство, известни на специалиста в тази област. Детайли на белтъчната повърхност, които включват свързващите детерминанти, могат да бъдат получени от информация за антитяло последователност, чрез моделираща процедура, използвайки предварително определени три-димензионални структури от други антитела, получени от NMR проучвания или кристалоглафски данни. Виж например, Bajorath, J. and S. Sheriff, 1996, Proteins: Struct., Fund, and Genet. 24(2), 152-157; Webster, D.M. and A.R.Rees, 1995, Molecular modeling of antibody-combining sites,” in S.Paul, Ed., Methods in Molecular Biol. 51, Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, pp 17-49; и Johnson, G., Wu, T.T. and E.A.Kabat, 1995, “Seqhunt: A program to screen aligned nucleotide and amino acid sequences, “ in Methods in Molecular Biol. 51, op.cit., pp 1-15.

Може да бъде също получена антиген свързваща област, чрез скриниране на различни типове комбинаторни библиотеки с желана свързваща активност и да се идентифицират активните видове с описаните методи.

В едно изпълнение, разнообразна пептидна библиотека е експресирана чрез популация от дисплей пакети, за получаване на пептидна дисплей библиотека. Идеално, дисплей пакетът включва система, която позволява взимане на проби от много големи разнообразни пептидни дисплей библиотеки, бързо сортиране след всеки цикъл на афинитетно разделяне и лесно изолиране на пептидкодиращия ген от пречистени дисплей пакети. Пептидни дисплей библиотеки могат да бъдат в например, прокариотни организми и вируси, които бързо могат да бъдат амплифицирани и относително лесно да се манипулират и което позволява създаването на голям брой клонове. Предпочитани дисплей пакети включват например, вегетативни бактериални клетки, бактериални спори и найпредпочитано, бактериални вируси (по-специално ДНК вируси). Обаче, настоящето изобретение също предвижда употребата на еукариотни клетки, включително дрожди и техните спори, като потенциални дисплей пакети. Фагов дисплей библиотеки са описани по-горе.

Други техники включват афинитетна хроматография с подходящ “рецептор”, за изолиране на свързващи агенти, последвано от идентифициране на изолираните свързващи агенти или лиганди с конвенционални техники (например, мас спектрометрия и NMR). Предпочитано, разтворимият рецептор е свързан с един белег (например флуорофори, колориметрични ензими, радиоизотопи или луминисцентни съединения), които могат да бъдат открити за указване лигандно свързване. По избор, имобилизирани съединения могат селективно да бъдат освобождавани и да бъдат оставени да дифундират през мембрана за взаимодействие с рецептор.

Могат също да бъдат синтезирани комбинаторни библиотеки от съединения, с “tags” да кодират идентичността на всеки член на библиотеката (виж например, W.C.Still et al. International Application WO 94/08051). Общо, този метод характеризира употребата на инертни, но пряко откриваеми tags, които са прикачени към твърда подложка или към съединението. Когато е открито активно съединение, идентичността на съединението е определяна чрез идентифициране на уникален придружаващ tag. Този tagging метод позволява синтезата на големи библиотеки от съединения, които могат да бъдат идентифицирани при много ниски нива измежду тотален набор от всички съединения в библиотеката.

Ahth-CD2 и aHTH-LFA-3 антитяло хомолози, които не са интактни антитела, са използваеми също в това изобретение. Такива хомолози могат да бъдат производни от всеки от антитяло хомолозите, описани по-горе. Например, използваеми са антигенсвързващи фрагменти, както пълноразмерни мономерни, димерни или тримерни полипептиди, производни от горе-описаните антитела. Използваеми антитяло хомолози от този тип включват (i) Fab фрагмент, моновалентен фрагмент състоящ се от VL, VH и СН1 домени; (ii) F(ab’)2 фрагмент, един двувалентен съдържащ Fab фрагменти, свързани с дисулфиден мост при прикрепена област; (iii) Fv фрагмент състоящ се от VH и СН1 домени; (iv) Fv фрагмент състоящ се от VL и VH домените на единично рамо на антитяло; (ν) dAb фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), който се състои от един VH домен; и (vi) изолирана определяща комплементарността област (CDR). Освен това, въпреки че двата домена на Fv фрагмента, VL и VH са кодирани от отделни гени, те могат да бъдат свързани, като се прилагат рекомбинантни методи, с един синтетичен линкер, който позволява те да са изградени от единична белтъчна верига, в която VL и VH областите правят чифт, за образуване на моновалентни молекули (известни като едноверижни Fv (scFv); виж например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426] и Huston et al. (1988) Proc.NatLAcad.Sci. USA 85:58795883). Такива едноверижни антитела се предвижда също да бъдат обхванати от термина “антиген-свързващ фрагмент” на антитяло. Тези антитяло фрагменти са получени като са използвани конвенционални техники, известни на специалистите в тази област и фрагментите са отбрани за използване по същия начиин както интактни антитела. Ahth-LFA-З тежки вериги са предпочитани aHTHLFA-3 антитяло фрагменти.

Антитяло фрагменти могат също да бъдат получени с химични методи, например, разцепване на интакгно антитяло с протеаза, като пепсин или папаин и по избор третиране на продукта от разцепване с редуциращ агент. По избор, използваеми фрагменти могат да бъдат получени като се използват клетки гостоприемници, трансформирани със скъсени тежко и/или лековерижни гени. Тежко и лековерижни мономери могат да бъдат получени чрез третиране на интакгно антитяло с редуциращ агент, като дитиотреитол, последвано от пречистване за отделяне на веригите. Тежко и лековерижни мономери могат също да бъдат получени с клетки гостоприемници, трансформирани с ДНК, кодираща желаната тежка верига или лека верига, но не и двете. Виж например, Ward et al., “Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli”, Nature, 341, pp. 544-46 (1989); Sastry et al., “Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library”, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86, pp. 5728-32 (1989).

Разтворими CD2 u LFA-3 полипептиди

Разтворими LFA-3 полипептиди или разтворими CD2 полипептиди, които инхибират взаимодействието на LFA-2 и CD2 са използваеми в методите на настоящето изобретение. Предпочитани са разтворими LFA-3 полипептиди.

Разтворими LFA-3 полипептиди могат да бъдат производни на трансмембранната форма на LFA-3, по-специално екстрацелуларния домен (например, АА_ГАА₁₈₇ на SEQ ID N0:2 на US 6,162,432, която тук е включена чрез цитат). Таккива полипептиди са описани в U.S.Patent No. 4,956,281 и придружаваща висяща U.S.

Patent Application Serial No. 07/667,971 (която споделя общ правоприемник с настоящата заявка), които тук са включени чрез цитат. Предпочитани разтворими LFA-3 полипептиди включват полипептиди състоящи се от АА1-АА92 на SEQ ID N0:2, AA-i-AAgo на SEQ ID N0:2, АА50-АА56 на SEQ ID N0:2 и ААго-ААбо на SEQ ID N0:2, където SEQ ID N0:2 е представен в US 6,162,432, която тук е включена чрез цитат. Вектор съдържащ ДНК последователност, кодираща SEQ ID N0:2 (т.е. SEQ ID N0:1), е депозиран в American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, c ключов № 75107, където SEQ ID N0:1 и 2 са представени в US 6,162,432, които са включени тук чрез цитат.

Най-предпочитаните слети белтъци от този тип съдържат амино крайните 92 аминокиселини на зрял LFA-3, С-крайните 10 аминокиселини на човешки lgG1 прикрепена област, съдържаща двата цистеинови остатъци, считани че участват в междуверижно дисулфидно свързване, и СН2 и СНЗ области на човешки lgG1 тежковерижен константен домен (например, SEQ ID N0:8). Този слет белтък е обозначен тук като “LFA3TIP”. Един плазмид, pSAB152, кодиращ примерен LFA3TIP, е депозиран в American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, c ключов номер ATCC 68720. ДНК последователността на pSAB512 инсерта е SEQ ID N0:7. SEQ ID N0:7 и 8 са представени в US 6,162,432, които са включени тук чрез цитат.

Аминокиселинната и нуклеотидната последователности на по-дълъг снаден вариант на LFA-3TIP, в сравнение с такъв представен в US 6,162,432 е показан във Фигура 1. Сигналният пептид на по-дългия LFA-3TIP вариант, съответства на аминокиселини 1-28 от Фигура 1; зрялата LFA-3 област съответства на аминокиселини 29-120 от Фигура 1; и lgG1 областта съответства на аминокиселини 12-351 от Фигура 1. По-дългият снаден вариант на LFA-3TIP се различава от по-късия вариант, притежавайки шест аминокиселини, добавени към С-терминалния край.

Един начин за получаване LFA3TIP за използване в методите на изобретението, е описан в придружаваща-нерешена, обикновено определена U.S.Patent Application Serial No. 07/770,967. Общо, кондиционирана среда за култивиране на COS7 или СНО клетки, трасфектирани с pSAB152, е концентрирана като е използвана AMICON S1Y30 спирална патронна система (AMICON, Danvers, Massachusetts) и подложена на Protein A-Sepharose 4В (Sigma St.Louis, Missouri) хроматография. Свързаните белтъци са елюирани и подложени на Superose-12 (Pharmacia/LKB, Piscataway, New Jersey) гел филтрация хроматография.

Superose-12 фракции, съдържащи LFA3TIP с най-малкото количество онечистващи белтъци, както е определено на SDS-PAGE телове и с Western blot анализ, (виж например, Towbin et al., PrOC.Natl.Acad.Sci.USA, 74, pp.4350-54 (1979); Antibodies: A

Laboratory Manual, pp.474-510 (Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), са обединени и концентрирани в YM30 Centricon (AMICON). LFA3TIP е откриван с Western blots, като е използван заешки aHTH-LFA-3 поликлонален антисерум, последван от откриваемо белязан антизаешки IgG. Пречистеният LFA3TIP на COS7 или СНО клетки е димер на два мономерни LFA-3-lg слети белтъци, свързани с дисулфидни връзки.

Друг предпочитан слет белтък се състои от първия и втория LFA-3 домен, слет с прикрепените Сн2 и С_н3 области на човешки lgG1, обозначен тук като LLFA3-lg.

Разтворими LFA-3 полипептиди могат също да бъдат производни на Pl-свързаната форма на LFA-3, като тези описани в РСТ Patent Application Serial No. WO 90/02181. Вектор съдържащ ДНК последователност, кодираща Pl-свързан LFA-3 (т.е., SEQ ID

N0:3) е депозиран в American Type Culture Collection, Rockville, Maryland c ключов No 68788. Трябва да се има предвид, че Plсвързаната форма на LFA-3 и трансмембранната форма на LFA-3 имат идентични аминокиселинни последователности в целия екстрацелуларен домен. Съответно, предпочитаните Р1-свързани LFA-3 полипептиди са същите както за трансмембранната форма на LFA-3.

Разтворими CD2 полипептиди могат да бъдат производни на пълноразмерен CD2, по-специално екстрацелуларния домен (например, АА_ГАА₁₈5 на SEQ ID N0:6). Такива полипептиди могат да включват целия или част от екстрацелуларния домен на CD2. Примерни разтворими CD2 полипептиди са описани в PCT W0 90/08187, който е включен тук чрез цитат.

Произвеждането на разтворими полипептиди, използваеми в това изобретениец може да бъде постигнато с различни методи, известни в тази област. Например, полипетидите могат да произхождат от интактни трансмембранни LFA-3 или CD2 молекули, или интактна Pl-свързана LFA-3 молекула, чрез протеолиза, като се използват специфични ендопептидази в комбинация с екзопептидази, Edman разграждане, или и двете. Интактната LFA-3 молекула или интактната CD2 молекула могат да бъдат пречистени от техния природен източник, като се използват конвенционални методи. По избор, интактният LFA-3 или CD2 могат да бъдат получени с известни рекомбинантни ДНК техники, като се използват кДНКи (виж например, U.S.Patent No. 4,956,281 за Wallner et al., ; Aruffo and Seed, Proc.Natl.Acad.Sci., 84, pp.2941-45 (1987); Sayre et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 84, pp.2941-45 (1987)).

Предпочитано, разтворимите полипептиди използваеми в настоящето изобретение са получени директно, така се елиминира нуждата от цяла LFA-3 молекула или цяла CD2 молекула като изходен материал. Това може да бъде постигнато с конвенционални химични синтетични техники или с добре известни рекомбинантни ДНК техники, където само тези ДНК последователности, които кодират желаните пептиди са експресирани в трансформирани гостоприемници. Например, ген който кодира желания разтворим LFA-3 полипептид или разтворим CD2 полипептид, може да бъде синтезиран по химичен път, като се използва олигонукпеотиден синтезатор. Такива олигонуклеотиди са планирани въз основа на аминокиселинната последователност на желания разтворим LFA-3 полипептид или разтворим CD2 полипептид. Специфични ДНК последователности, кодиращи желания пептид могат също да произлизат от пълноверижна ДНК последователност, чрез изолиране на специфични рестрикционни нуклеазни фрагменти или чрез PCR синтеза на специфична област.

Могат да бъдат приложени стандартни методи за синтезиране на ген, кодиращ разтворим LFA-3 полипептид или разтворим CD2 полипептид, който е използваем в настоящето изобретение. Например, пълната аминокиселинна последователност може да бъде използвана за конструиране на обратнотранслиран ген. ДНК олигомер, съдържащ нуклеотидна последователност, кодираща разтворим LFA-3 полипептид или разтворим CD2 полипептид, приложим в това изобретение, могат да бъдат синтезирани в един етап. По избор, няколко по-малки олигонуклеотиди, кодиращи части на желания полипептид, могат да бъдат синтезирани и след това лигирани. Предпочитано, разтворим LFA-3 полипептид или разтворим CD2 полипептид, приложими в това изобретение, могат да бъдат синтезирани като няколко отделни олигонуклеотиди, които впоследствие са свързани заедно. Отделните олигонуклеотиди обикновено съдържат 5’ или 3’ стърчащи краища за комплементарно свързване.

Веднъж свързани, предпочитани гени ще бъдат характеризирани чрез последователности, които са разпознати от рестрикционни ендонуклеази (включително уникални рестрикционни места за директно свързване в клониращ или експресионен вектор), предпочитани кодони взимайки предвид експресионната система на гостоприемника, който ще се използва и последователността, която когато е транскрибирана, произвежда стабилно, ефективно транслирана мРНК. Точно свързване може да бъде потвърдено с нуклеотидно секвениране, рестрикционно картиране и експресия на биологично активен полипептид в подходящ гостоприемник.

Специалистът в този област ще прецени, че поради дегенерация на генетичния код, ДНК молекули съдържащи много други нуклеотидни последователности, също ще са способни да кодират разтворимия LFA-3 и CD2 полипептиди, кодирани от специфични ДНК последователности, описани по-горе. Тези дегенерирани последователности също кодират полипептиди, които са приложими в това изобретение.

ДНК последователностите могат да бъдат експресирани в едноклетъчни гостоприемници. Както е добре известно в тази област, за да се получат високи нива на експресия на трансфектиран ген в даден гостоприемник, генът трябва да бъде оперативно свързан с контролиращи транскрипционна или транслационна експресия последователности, които са функционални в избрания експресионен гостоприемник. Предпочитано, контролиращи експресията последователности и генът, който е от интерес, ще съдържат един експресионен вектор, който освен това съдържа бактериален селекционен маркер и начало на репликация. Ако експресионният гостоприемник е еукариотна клетка, експресионният вектор трябва освен това да съдържа допълнителен експресионен маркер, използваем в експресионния гостоприемнник.

ДНК последователностите, кодиращи желаните разтворими полипептиди, могат или не могат да кодират сигнална последователност. Ако експресионния гостоприемник е прокариот, общо се предпочита ДНК последователността да не кодира сигнална последователност. Ако експресионният гостоприемник е еукариотен, общо се предпочита да бъде кодирана сигнална последователност.

Амино краен метионин може да присъства или да не присъства в експресирания продукт. Ако крайният метионин не е отцепен от експресионния гостоприемник, той може, ако е желателно, да бъде химически отстранен със стандартни техники.

Може да бъде използвано голямо разнообразие от експресионен гостоприемник/вектор комбинации. Използваеми експресионни вектори за еукариотни гостоприемници включват, например вектори съдържащи контролиращи експресията последователности от SV40, говежди папилома вирус, аденовирус и цитомегаловирус. Използваеми експресионни вектори за бактериални гостоприемници включват познати бактериални плазмиди, като плазмиди от E.coli. включително col Е1, pCI, pBR322, рМВ9 и техни производни, широк диапазон гостоприемници плазмиди, като RP4, фагови ДНКи, например многобройните производни на фаг lambda, например NM989 и други ДНК фаги, като М13 и нишковидни едноверижни ДНК фаги. Приложими експресионни вектори за дрождеви клетки включват 2μ плазмид и негови производни. Приложими вектори за клетки от насекоми включват pVL 941.

В допълнение, всяка от голямо разнообразие контролиращи експресията последователности, може да бъде използвана при тези вектори. Такива използваеми контролиращи експресията последователности включват контролиращите експресията последователности, свързани със структурни гени на горните експресионни вектори. Примери за използваеми контролиращи експресията последователности включват например, ранните и късни промотори на SV40 или аденовирус, /ас системата, trp системата, ТАС или TRC системата, главните операторна и промоторна области на фага lambda, контролните области на fd coat белтък, промотора за 3-фосфоглицерат киназа или други гликолитични ензими, промоторите на кисела фосфатаза, например Pho5, промоторите на дрождената α-mating система и други последователности, известни да контролират експресията на гени на прокариотни или еукариотни клетки или техни вируси и различни техни комбинации.

Използваеми са голямо разнообразие от едноклетъчни гостоприемници. Тези гостоприемници могат да включват добре известни еукариотни и прокариотни гостоприемници, като щамове E.coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, гъби, дрожди, клетки от насекоми като Spodoptera fungiperda (SF9), животински клетки като СНО клетки и миши клетки, клетки от африкански зелени маймуни като COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 и BMT 10, и човешки клетки, както и растителни клетки в тъканни култури. За животинска клетъчна експресия, ние предпочитаме СНО клетки и COS 7 клетки.

Трябва да бъде разбираемо, че не всички вектори и контролиращи експресията последователности, ще функционират еднакво добре, да експресират ДНК последователностите, описани тук. Нито всички гостоприемници ще функционират еднакво със същата експресионна система. Обаче, специалистът в тази област може да направи подбор измежду тези вектори, контролиращи експресията последователности и гостоприемници без прекомерно експериментиране. Например, при подбор на вектор, трябва да бъде разглеждан гостоприемника, тъй като векторът ще реплицира в него. Векторният копиен брой, способността да контролира този брой на копията и експресията на всякакви други белтъци, кодирани от вектора, като антибиотични маркери, трябва също да бъдат взети предвид.

При подбор на контролираща експресията последователност, трябва да се вземат предвид също различни фактори. Такива включват, например относителна сила на последователността, нейната контролируемост и нейната съвместимост с ДНК последователностите, обсъдени тук, поспециално по отношение на възможни вторични структури. Едноклетъчни гостоприемници трябва да бъдат подбрани като се разглежда тяхната съвместимост с избрания вектор, токсичността на продукта, кодиран от ДНК последователностите, техните секреционни характеристики, тяхната способност да нагъват точно разтворимите полипептиди, тяхната ферментация или културелни изисквания и леснината на пречистване на продуктите, кодирани от ДНК последователностите.

В рамките на тези параметри, специалистът в тази област може да подбере различни вектор/контролираща експресията последователност/гостоприемник комбинации, които ще експресират желаните ДНК последователности при ферментация или в голям мащаб животинска култура, например с СНО клетки или COS 7 клетки.

Разтворимите LFA-3 и CD2 полипептиди могат да бъдат изолирани от ферментацията или клетъчната култура и пречистени, като се използва всеки от разнообразните конвенционални методи. Специалистът в тази област може да подбере най-подходящата изолираща и пречистваща техники.

Докато рекомбинантните ДНК техники са предпочитан метод за получаване на използваеми разтворими CD2 полипептиди или разтворими LFA-3 полипептиди, притежаващи една последователности с повече от 20 аминокиселини, по-късите CD2 или LFA-3 полипептиди, притежаващи по-малко от около 20 аминокиселини, предпочитано се произвеждат с конвенционални химични синтетични техники. Синтетично получени полипептиди, използваеми в това изобретение, могат изгодно да бъдат произвеждани в изключително високи добиви и могат лесно да бъдат пречиствани.

Предпочитано, такива разтворими CD2 полипептиди или разтворими LFA-3 полипептиди, са синтезирани с разтворима фаза или твърдофазна полипептйдна синтеза и по избор, хидролизирани с карбоксипептидаза (за отстраняване С-крайни аминокиселини) или са деградирани с мануална Edman деградация (за отстраняване Nкрайни аминокиселини). Точно нагъване на полипептидите може да бъде постигнато в окислителни условия, които благоприятстват образуването на дисулфидни мостове, както е описано от Kent, “Chemical Synthesis of Polypeptides and Proteins, Ann.Rev.Biochem., 57, pp.957-89 (1988). Полипептиди получени по този начин, могат след това да бъдат пречистени с разделителни техники, широко известни в тази област, предпочитано използвайки обратна фаза HPLC. Използването на разтворима фаза синтеза благоприятно позволява директна добавка на някои дериватизирани аминокиселини за нарастване на полипептидната верига, като Осулфатен естер на тирозин. Това прави очевидна необходимостта от последващ дериватизационен етап за модифициране на който и да е остатък на полипептидите, използваем в това изобретение.

LFA-3 и CD2 миметични или нискомолекулни агенти

Също използваеми в методите на това изобретение са LFA-3 и CD2 миметични агенти. Тези агенти, които могат да бъдат пептиди, семи-пептидни съединения или не-пептидни съединения (например, малки органични молекули), са инхибитори на CD2/LFA-3 взаимодействието. Предпочитани CD2 и LFA-3 миметични агенти ще инхибират CD2/LFA-3 взаимодействието поне като aHTH-LFA-3 моноклонално антитяло 7А6 или анти-СО2 моноклонапно антитяло TS2/18 (описани по-горе).

В предпочитани изпълнения, тестираният агент е член на комбинаторна библиотека, например пептидна или органична комбинаторна библиотека, или библиотека на природни продукти. В предпочитано изпълнение, множеството от тестирани съединения, например членове на библиотека, включва най-малко 10, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 1О⁷ или 10⁸ съединения. В предпочитано изпълнение, множеството от тестираните съединения, например членове на библиотека, споделят структурна или функционална характеристика.

В едно изпълнение, изобретението предоставя библиотеки на LFA-3 и/или CD2 инхибитори. Синтезата на комбинаторни библиотеки е добре известна на специалистите в тази област и е обобщена (виж, например Е. М.Gordon et al. J.Med.Chem. (1994) 37:1385-1401; DeWitt, S.H.; Czamik, A.W. Acc.Chem.Res. (1996) 29:114; Armstrong, R.W.; Combs, A.P.; Tempest, P.A.; Brown, S.D.; Keating,T. A. Acc.Chem.Res. (1996) 29:123; Ellman, J. A. Acc.Chem.Res.(1996) 29:132; Gordon, E.M.; Gallop, M.A.; Patel, D.V. Acc.Chem.Res. (1996) 29:144; Lowe, G. Chem.Soc.Rev. (1995) 309, Blondelle et al. Trends Anal.Chem. (1995) 14:83; Chen et al., J.Am.Chem.Soc. (1994) 116:2661; U.S.Patents 5,359,115, 5,362,899 и 5,288,514; PCT Publication Nos. WO 92/10092, WO 93/09668, WO 91/07087, WO 93/20242, WO 94/08051).

Библиотеки от съединения на изобретението могат да бъдат изготвени съгласно различните методи, някои от които са известни в тази област. Например, “split-pool” стратегия може да бъде изпълнена по следния начин: зърна от функционализирана полимерна подложка, са поставени в множество реакционни съдчета; известно е разнообразие от полимерни подложки подходящи за твърдофазна пептидна синтеза и някои са търговски достъпни (например, виж M.Bodansky “Principles of Peptide Synthesis”, 2^nd edition, Springer-Verlag, Berlin (1993)). Към всяка порция от зърна е добавен разтвор с различна активирана аминокиселина и реакцията е оставена да протече за получаване на множество имобилизирани аминокиселини, една във всяко реакционно съдче. Порциите от дериватизирани зърна след това са измити, “обединени” (т.е. рекомбинирани) и пулът от зърна отново е разделен, като всяка порция е поставена в отделно реакционно съдче. Друга активирана аминокиселинаа след това е добавена към всяка порция зърна. Цикълът на синтез е повтарян докато се получи желаната дължина на пептида. Аминокиселинните остатъци, добавени при всеки синтетичен цикъл могат да бъдат случайно подбрани; по избор, аминокиселини могат да бъдат подбрани за осигуряване на ’’“biased” (“отклонена”) библиотека, например библиотека, в която известни части на инхибитора са подбрани неслучайно, например за осигуряване на инхибитор с известно структурно сходство или хомология с известен пептид, способен да взаимодейства с антитяло, например анти-идиотипно антитяло антиген свързващо място. Ще се оцени, че голямо разнообразие от пептидни, пептидомиметични и не-пептидни съединения могат директно да бъдат създадени по този начин.

“Split-pool” стратегията има за резултат библиотека от пептиди, например инхибитори, които могат да бъдат използвани за изготвяне на библиотека от тест съединения на изобретението. В друга илюстративна синтеза е създадена една “диверзомерна библиотека” (diversomer library) с метода на Hobbs DeWitt et a\.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909 (1993)). Други синтетични методи, включително “tea bag” (чаено-пликче) техниката на Houghten (виж например, Houghten et al., Nature 354:84-86 (1991)) може също да бъде използвана за синтезиране на библиотеки от съединения, съгласно предмета на изобретението.

Библиотеки от съединения могат да бъдат скринирани за определяне дали някои членове на библиотеката имат желаната активност и ако това е така, да се идентифицират активните видове. Описани са методи за скриниране на комбинаторни библиотеки (виж например, Gordon et al., J.Med.Chem, по-горе). Библиотеки от разтворими съединения могат да бъдат скринирани с афинитетна хроматография с подходящ рецептор, за изолиране на лиганди за рецептора, последвана от идентифициране на изолираните лиганди с конвенционални техники (например, мас спектрометрия, NMR и подобни). Имобилизирани съединения могат да бъдат скринирани чрез поставяне на съединенията в контакт с разтворим рецептор; предпочитано, разтворимият рецептор е конюгиран с белег (например, флуорофори, колориметрични ензими, радиоизотопи, луминисцентни съединения и подобни), който може да бъде открит за указване на лигандно свързване. По избор, имобилизирани съединения могат селективно да бъдат освободени и оставени да дифундират през мембрана, за да взаимодействат с рецептор. Примерни тестове, използваеми за скриниг на библиотеки на изобретението са описани по-долу.

В едно изпълнение, съединения на изобретението могат да бъдат скринирани за способност да взаимодействат с CD2 или LFA3 полипептид, чрез тестиране активността на всяко съединение да

Чий?»'·¹ се свързва директно с полипептида или да инхибира CD2/LFA-3 взаимодействие, например чрез инкубиране на тестираното съединение с CD2 или LFA-3 полипептид и лизат, например Т или АРС клетъчен лизат, например в една ямка на многоямкова платка, като стандартна 96-ямкова микротитрационна платка. В това изпълнение, активността на всяко отделно съединение може да бъде определена. Ямка или ямки, които нямат тестирано съединение, могат да бъдат използвани като контроли. След инкубация, активността на всяко тестирано съединение може да бъде определена като се тестира всяка ямка. Така, активностите на множеството тестирани съединения могат да бъдат определени паралелно.

В друго изпълнение, голям брой тестирани съединения могат да бъдат едновременно тестирани за свързваща активност. Например, тестирани съединения могат да бъдат синтезирани на твърди зърна от смола в “едно зърно-едно съединение* синтеза; съединенията могат да бъдат имобилизирани на подложка от смола чрез фотолабилен линкер. Множество от зърна (например от порядъка на 100,000 зърна или повече), може след това да бъде комбинирано с дрождеви клетки и да бъде разпръснато в множество от “нано-капчици“, в което всяка капчица включва единично зърно (и, следователно едно тест съединение). Излагането на нано-капчиците на UV светлина води до отгцепване на съединенията от зърната. Може да се прецени, че този тест формат позволява скриниг на големи библиотеки от тестирани съединения в бърз формат.

Комбинаторни библиотеки от съединения могат да бъдат синтезирани с “tags”, за кодиране идентичността на всеки член на библиотеката (виж например, W.C.Still et al., U.S.Patent No. 5,565,324 и PCT Publication Nos WO 94/08051 и WO 95/28640). Общо, този метод характеризира употребата на инертни, но директно откриваеми tags, които са прикачени към твърда подложка или към съединения. Когато е открито активно съединение (например, с една от техниките описани по-горе), идентичността на съеденинето е определена чрез идентифициране на уникалния придружаващ tag. Този tagging метод позволява синтезата на големи библиотеки от съединения, които могат да бъдат идентифицирани при много ниски нива. Такава tagging схема може да бъде полезна, например при “нано-капчици” скрининг тест, описан по-горе, за идентифициране съединения освободени от зърната.

В предпочитани изпълнения, библиотеките от съединения на изобретението съдържат най-малко 30 съединения, попредпочитано най-малко 100 съединения и най-предпочитано наймалко 500 съединения. В предпочитани изпълнения, библиотеките от съединения на изобретението съдържат по-малко от 10⁹съединения, по-предпочитано по-малко от 10® съединения и още попредпочитано по-малко от 10⁷ съединения.

Дериватизирани инхибитори

Също полезни при тези методи на изобретението са дериватизирани инхибитори на CD2/LFA-3 взаимодействието, при което например, всеки от антитяло хомолозите, разтворими CD2 и LFA-3 полипептиди, или CD2 и LFA-3 миметични агенти,описани тук, са функционално свързани (чрез химично свързване, генетична фузия или по друг начин) с един или повече членове, подбрани независимо от групата състояща се от aHTH-LFA-З и анти-СО2 антитяло хомолози, разтворими LFA-3 и CD2 полипептиди, CD2 и LFA-3 миметични агенти, цитотоксични агенти и фармацевтични агенти.

Един тип дериватизиран инхибитор е получен чрез кръстосано свързване на два или повече инхибитори (от същия тип или различни). Подходящи кръстосани линкери включват тези, които са хетеробифункционални, притежаващи две отделни реактивни групи, отделени със съответен разделител (например, т-малеимидобензоил-1М-хидроксисукцинимид естер) или хомобифункционални (например, дисукцинимидил суберат). Такива линкери са на разположение от Pierce Chemical Company, Roockford, Illinois.

Друга възможност за кръстосано свързване има предимство на PI свързващата сигнална последователност в Pl-свързан LFA-3 или негов фрагмент. Специално, ДНК кодираща Р1-свързваща сигнална последователност (например, ΑΑι₆2-ΑΑ₂ι₂ на SEQ ID N0:4) е лигирана след ДНК кодираща желан полипептид, предпочитано един разтворим LFA-3 полипептид. Ако този конструкг е експресиран в подходяща еукариотна клеткиа, клетката ще разпознава PIиВЪрооаЩа ι а мпята iivuric^uDaicJinwi и Щс voDpcoa imjdcu icn ι HO PI c полипептида. Хидрофобното свойство на PI след това може да бъде използвано за образуване на мицелни агрегати на полипептидите.

Също използваеми са инхибитори, свързани с един или повече цитотоксични или фармацевтични агенти. Използваеми фармацевтични агенти включват биологично активни пептиди, полипептиди и белтъци, като антитяло хомолози, специфични за човешки полипептид, различен от CD2 или LFA-3, или части от тях. Използваеми фармацевтични агенти и цитотоксични агенти включват също циклоспорин А, преднизон, FK506, метотрексат, стероиди, ретиноиди, интерферон и nitrogen mustard.

Предпочитани инхибитори, дериватизирани с фармацевтичен агент, включват рекомбинантно-произведени полипептиди, при които разтворим LFA-3 полипептид, разтворим CD2 полипептид или пептидил CD2 или пептидил LFA-3 миметичен агент е снет чрез фузия с цяла или част от имуноглобулинова тежковерижна прикрепена област и цяла или част от една тежковерижна константна област. Предпочитани полипептиди за изготвяне на такива слети белтъци са разтворими LFA-3 полипептиди. Най-предпочитани са слети белтъци съдържащи AA_rАА92 на LFA-3 (например, SEQ ID N0:2), слети с част от човешка lgG1 прикрепена област (включително С-крайните десет аминокиселини на прикрепената област, съдържащи два цистеинови остатъци, при което да участват в междуверижно дисулфидно свързване) и Сн2 и С_н3 областите на един lgG1 тежковерижен константен домен. Такива слети белтъци се очаква да проявят удължен серумен полу-живот и да позволят инхибиторна димеризация.

Комбинирана терапия

Свързващите агенти, например CD2 или LFA-3 свързващи агенти, могат да бъдат използвани в комбинация с други терапии, като светлинна терапия (например, UVA, UVB или PUVA); химиотерапия (например, метотрексат, ретиноид, циклоспорин, етретинат); или топична терапия (например, стероид, витамин (например витамин D), катран, антралин, макролид или макролактам (например, tacrolimus или pimecrolimus). Такава комбинирана терапия може благоприятно да използва по-малки дозировки от терапевтични или профилактични агенти.

Въведен “ в комбинация”, както тук е използвано, означава, че две (или повече) различни третирания са предоставени на индивида по време на протичане страданието на индивида с нарушение, например две или повече третирания са предоставени след като индивида е бил диагностициран с нарушение и преди нарушението да е излекувано или елиминирано. В някои изпълнения, осигуряването на едно лечение е вече проявено, когато предоставянето на второ започва, така има известно припокриване. Това понякога се означава тук като “едновременно или конкурентно предоставяне”. В други изпълнения, предоставянето на едно лечение завършва преди да започне прилагане на друго лечение. В някои изпълнения на един от случаите, лечението е по-ефекгивно поради комбинирано въвеждане. Например, второто третиране е по-ефекгивно, например, наблюдаван е еквивалентен ефект с по-малко от второто третиране, или второто третиране намалява симптоми в по-голяма степен, отколкото би било наблюдавано ако второто третиране е прилагано в отсъствие на първото третиране, или аналогичната ситуация е наблюдавана с първото третиране. В някои изпълнения, предоставянето е такова, че намалението на симптом, или друг параметър свързан с нарушението, например намаление нивото или продукцията на IFN γ, индуциране на Т клетъчна апоптоза, или понижение на CD40L експресия, е по-голямо от това, което би било наблюдавано с едно лечение, предоставено в отсъствие на другото. Ефектът от двете третирания може да бъде отчасти сумарен, изцяло сумарен или по-голям от сумарен. Предоставянето може да бъде такова, че ефект от първото третиране, което е предоставено, е вече откриваем, когато се предоставя второто, например UVB е първо приложено, намаление на IFN γ е вече откриваемо когато е предоставена LFA-3/lg фузия.

В предпочитано изпълнение, прилагането на първото третиране и прилагането на второто третиране е в рамките на 1, 2, 5,10 или 30 дни едно от друго.

Свързващите агенти, както е описано тук, могат да бъдат използвани като допълнение към конвенционални терапии на кожни заболявания, като псориазис. Например, свързващи агенти могат да бъдат въвеждани преди, конкурентно със, или след последователна терапия на псориазис (обобщено от Koo, J. (1999) J.Am.Acad.Dermatol. 41(3 Pt 2): S25-8). Терминът “последователна терапия се отнася за лечебна стратегия, включваща употребата на специфични терапевтични агенти в обмислена последователност, за оптимизиране на терапевтичния резултат. Същественото за тази стратегия при псориазис е, че това е хронично заболяване, изискващо продължителна подържаща терапия, както и бързо облекчение на симптомите и че някои терапии, които са на разположение за псориазис, са по-подходящи за бързо очистване, докато други са по-подходящи за продължително подържане. С Последователна терапия включва три главни етапи: (1) очистването, или “quick-fix” фаза; (2) преходната фаза; и (3) фаза на подъържане.

Един пример на последователна системна терапия включва употребата на бързо действащ помощен агент, например циклоспорин при максимална дерамтологична доза (5 mg/kg дневно) или метотрексат. След около 1 месец, преходната фаза е инициирана с постепенно въвеждане на СО2-свързващ агент и/или друг помощен агент, например acitretin, като подържащ агент. След като е определена максималната поносима доза СО2-свързващ агент и/или друг помощен агент, например acitretin, бързо действащият помощен агент, например циклоспорин, постепенно е засилван и СО2-свързващият агент и/или друг помощен агент, например acitretin, е продължен за дълготрайна подръжка. Комбинация с фототерапия (UVB или PUVA) може да бъде добавена за подобрен контрол, ако е необходимо.

В други примерни изпълнения, СО2-свързващият агент може да бъде въведен за удължен период от време (например, период на терапевтично третиране от дванадесет седмици). През периоди на ремисия или по-малко активно заболяване, CD2свързващият агент може да бъде въведен самостоятелно или в комбинация с топичен агент (например, стероид, витамин (например витамин D), катран, антралин, макролид, или макролактам (например, tacrolimus (FK506) или pimecrolimuus)) и/или фототерапия (например, UVA, UVB или PUVA, но предпочитано, UVB). През периоди на активно заболяване, бързо действащ, но токсичен помощен агент, като метотрексат и/или циклоспорин, може да бъде въведен за кратък период на третиране.

Производни на ascomycin macrolactam като pimecrolimus (ASM 981 крем 1%) са селективни инхибитори на възпалителни цитокини, които текущо се прилагат при третиране възпалителни кожни нарушения, като атопичен дерматит, алергичен контактен дерматит, дразнещ контактен дерматит и псориазис (Stuetz, A. et al. ((2001) Semin.Cutan.Med.Surp. 20(4):233-41; Bomhovd, Е. et al. (2001) J.Am.Dermatol. 45(5):736-43).

В предпочитано изпълнение, СО2-свързващият агент (например LFA-3/lgG фузия) или фармацевтичен състав, съдържащ същия агент, е въведен системно (например, интравенозно, интрамускулно, подкожно, интра-артикуларно, интратекално, периостално, интратуморно, интралезионно, перилезионно чрез инфузия (например като се използва инфузионно устройство), орално, топично или чрез инхалации). Предпочитано, CD2свързващият агент е въвеждан интрамускулно или венозно. В друго изпълнение, СО2-свързващият агент е въвеждан локално (например, топично) на засегнатата област, например псориазисна лезия.

Светлинна терапия

В едно изпълнение, свързващият агент както е представен тук, например СО2-свързващият агент описан тук, е въведен в комбинация с фототерапия (обозначавана тук като “светлинна терапия”). Фототерапията използва оптична абсорбция на ултравиолетово (UV) олъчване на кожата за убиване на бързо растящите клетки и да спира пролиферацията. Понастоящем, UVA и UVB терапията, при които се излага кожата на UV олъчване между 320-400 nm (UVA олъчване) или 290-320 nm (UVB олъчване), са ефективни и широко използвани за лечение на кожни заболявания. В предпочитано изпълнение, се използва UVB олъчване в диапазона от 290-320 nm, по-предпочитано във формата на тясна ивица UVB при 311 nm. В други изпълнения, може също да бъде използвана PUVA терапия, една форма на фотохимиотерапия, която включва повтарящо се тонично приложение на psoralen или на базата на psoralen съединение, върху засегната кожна област, последвано от излагане на тази област на UVA олъчване. В други изпълнения, може да бъде използвана фотодинамична терапия (PDT) за третиране на кожни нарушения, по-специално псориазис и mycosis fungoides. При този метод, фотосензитизиращ агент, който е лекарство селективно задържано от карциномни клетки, е въвеждан у даден индивид. След абсорбция на светлина (обикновено между 320-700 nm, в зависимост от лекарство) фотосензитизиращият агент претърпява фотохимична реакция, което води до получаване на цитотоксичен кислород, който евентуално води до разрушаване на туморните съдове в кожата (Anderson, et al. (1992) Arch.Dermatol. 128:1631-1636).

В много случаи има повтаряща се доставка на един или двата СО2-свързващ агент, например LFA-3/lg фузия и светлинна терапия, например UVB. СО2-свързващият агент може да бъде предоставен на равни или неравни интервали от време. Например, СО2-свързващият агент може да бъде предоставян всеки 3-12 дни, например един път седмично. Доставката може да бъде повтаряна 3, 6, 12, 15, 24 или повече пъти. Един или повече курсове на второ третиране, например предоставянето на светлинна терапия, например UVB, може да предшества, последва или да се наслагва едновременно с курса на предоставяне на слет белтък.

Фармацевтични препарати

Настоящето изобретение предоставя метод за профилактика или лечение на горе-споменатите кожни заболявания у индивид, чрез въвеждане у бозайник един или повече CD2свързващи агенти, например инхибитори на CD2/LFA-3 взаимодействието, или негова дериватизирана форма(и), в комбинация с помощен агент.

Предпочитано, въвеждано е ефективно количество от CD2свързващия агент или негова дериватизирана форма. “Ефективно количество” означава количество способно да намали разпространението или тежестта на кожни заболявания, описани тук.

Ще бъде очевидно за специалиста в тази област, че ефективното количество на инхибитор ще зависи между другото, от схемата на приложение, единичната въведена доза, дали инхибиторът е въведен в комбинация с други терапевтични агенти, имунния статус и здравословното състояние на пациента, терапевтичната и профилактичната активност на дадения инхибитор, който е въведен и серумния полу-живот.

Предпочитано, С02-свързващите агенти са въведени в доза между около 0.001 и около 50 mg инхибитор на kg телесно тегло, попредпочитано, между 0.01 и около 10 mg инхибитор на kg телесно тегло, най-предпочитано между около 0.1 и около 4 mg на kg телесно тегло.

Единични дози трябва да бъдат въвеждани докато се забележи някакъв ефект. Ефектът може да бъде измерен с различни методи, включително in vitro тестове за Т клетъчна активност и очистване на засегнатата кожна област. Предпочитано, единичната доза е въвеждана около един до три пъти седмично или един до три пъти дневно. По-предпочитано, тя е въвеждана около един до три пъти дневно за около 3 до 7 дни, или около един до три пъти дневно за между около 3 и 7 дни на месечна база. Признава се, обаче, че по-ниски или по-високи дозировки и други схеми на приложение могат да бъдат използвани.

СО2-свързващият агент(и) или негова дериватизирана форма(и) също предпочитано са въвеждани в състав, включващ . фармацевтично приемлив носител. Като “фармацевтично приемлив Ч&Г м v носител се счита носител, които не предизвиква алергична реакция или друг неблагоприятен ефект у пациенти, на които се прилага.

Подходящи фармацевтично приемливи носители включват, например един или повече от вода, физиологичен разтвор, фосфатно буфериран физиологичен разтвор, декстроза, глицерол, етанол и подобни, както и техни комбинации. Фармацевтично приемливи носители могат освен това да съдържат малки количества помощни вещества, като овлажняващи или емулгиращи агенти, консерванти или буфери, които повишават времето на годност или ефективността на инхибитора.

Както е описано по-горе, фармацевтичният състав или CD2свързващият агент могат да бъдат приложени в комбинация с други помощни терапевтични или профилактични агенти. Такива включват, например, циклоспорин А, стероиди, ретиноиди, nitrogen mustard, интерферон, метотрексат, антибиотици и антихистамини.

Тези помощни агенти могат да бъдат прилагани в единична дозирана форма с инхибитор (т.е. като част от същия фармацевтичен състав), множествена дозирана форма, отделно от инхибитора, но конкурентно, или множествена дозирана форма, където двата компонента са въвеждани отделно, но последователно. По избор, СО2-свързващият агент и другият активен агент, могат да бъдат във формата на единична конюгирана молекула. Конюгиране на два компонента може да бъде постигнато със стандартни техники за кръстосано свързване, които са известни в тази област. Единична молекула може също да приеме формата на рекомбинентен слет белтък. В допълнение, инхибиторите, или фармацевтични препарати, приложими в настоящето изобретение, могат да бъдат използвани в комбинация с други терапии, като PUVA, химиотерапия и UV светлина. Такива комбинирани терапии могат благоприятно да използват по-ниски дозировки от терапевтичните или профилактични агенти.

С02-свързващият агент, или фармацевтичен състав, може да бъде в разнообразни фо0ми. Такива включват, например твърди, полу-твърди и течни дозирани форми, като таблетки, пилюли, прахове, течни разтвори, дисперсии или суспензии, липозоми, супозитории, инжектируеми, инфузионни и топични препарати. Предпочитаната форма зависи от предвидения начин на въвеждане и терапевтичното приложение. Предпочитаните форми са инжектируеми и инфузионни разтвори.

Изобретението включва комбинации, подходящи за употреба като топично приложими слънчеви екрани или UVпротектори. Предпочитани изпълнения включват LFA3TIP препарати. Активната съставка може да бъде комбинирана като липозома. Продуктът може да бъде приложен преди, по време на, или след UV излагане, или преди, по време на или след развитие на зачервяване.

Китове

В друг аспект, изобретението предоставя китове, които включват СО2-свързващия агент както е описано по-горе, в комбинация с помощен агент, например агент, както е описано тук, или инструкции как да се използва такъв агент.

В предпочитано изпълнение, инхибиторът на CD2/LFA-3 взаимодействието е LFA-3/lg слет полипептид. Предпочитано, LFAЗ/tg слетият полипептид е лиофилизиран.

Изобретението е илюстрирано освен това със следните примери, които не трябва да бъдат разглеждани като ограничаващи. Съдържанията на всички цитати, нерешени патентни заявки и публикувани патенти, цитирани в заявката, тук са включени специално чрез цитат.

ПРИМЕРИ

ПРИМЕР 1: In vitro инхибиране на IFNy и понижение на CD25 нива след LFA3TIP ко-култивиране

In vitro изследване на LFA3TIP като са използвани периферни кръвни мононуклеарни клетки (PBMC’s) от непсориазисни и псориазисни доброволци, демонстрира значимо инхибиране на IFNy както и намаление на CD25 нива след LFA3TIP ко-култивиране. Понижението на IFNy нивата също се отразява в in vivo изследване на Т клетки от LFA3TIP третирани пациенти. Представяйки значимия ефект на LFA3TIP върху PMBC’s in vitro, ние искаме да определим дали или не, in vivo LFA3TIP въвеждане има ефект върху PBMC’s от третирани доброволци. За да се определи това, периферна кръв е взета и е добавена към протоколното време, да съвпада с всяка кератомна проба, за да ни позволи да изследваме IFNy и CD25 нива в PBMC’s от LFA3TIP третирана популация. РВМС препарати са правени над фикол и са Стимулирани в съответствие с РВМС протоколи, известни в тази област. PBMC’s получени от in vivo LFA3TIP третирани пациенти, са използвани в последващи експерименти с проточна цитофотометрия. Експериментите с периферна кръв прибавят допълнителни 15 експериментални пункта, към проекта за всеки пациент, на всеки етап от време. Това ще съответства на оцветяване за CD3, CD69, CD25, CD2, IFN gamma, CD40L и Аро2.7. Допълнително, CD40L експресия също е изследвана върху PBMC’s от in vivo третирани пациенти.

ПРИМЕР 2: Човешки LFA-3/igG1 слет белтък инхибира продукцията на IFNy в нормални и псориазисни Т клетки от периферна кръв и повишава действието на UVB.

Псориазис е медииран, отчасти от активиирана Т клетъчна продукция на интерферон гама (ΙΡΝγ). Alefacept (човешки LFA-3/lgG1 слет белтък, LFA3TIP, понастоящем създаден от Biogen, Inc. с фабрично име Amevive™), проявява инхибиторни ефекти върху Т клетки in vivo и in vitro. Фаза 3 клинични изпитвания на alefacept са текущи при псориазис. UVB олъчване остава едно от найефективните лечения на псориазис и ние сме съобщили по-рано, че еднократно in vivo UVB излагане може селективно да понижи Т клетъчната продукция на IFNy.

За изследване ефектите на alefacept върху Т клетъчна продукция на ΙΡΝγ, РВМС от нормални индивиди (п=7) или псориазисни пациенти (п-7) са активирани и ΙΡΝγ продукция е измервана с проточна цитофотометрия. За 8 pg/ml alefaceptтретирани не-псориазисни РВМС, броят на iFNy* Т клетки намалява при 5/7 случаи (20-90% намаление), повишава при 1/7 или остава непроменен при 1/7 случаи. При псориазно болен РМВС, 8 pg/ml alefacept третиране, е предизвикало понижение на ΙΡΝγ продукцията при 6/7 тестирани пациенти, със средно 56+12% намаление, (р<0.005). РМВС популации могат да бъдат разпределени в две групи въз основа на продукцията на IFNy, висока (>10%) или ниска (<10%) IFNy^+CD3+ Когато се разглеждат поотделно, и двата- непсориазисни и псориазисни високо произвеждащи, ефективно са инхибирани с 8 pg/ml alefacept, със средно намаление от 56% и 65% съответно. За разлика от това, ниско продуциращите показват слабо инхибиране. Анти-Fcy RI и Rill mAb претретиране унищожава намалението на IFNy с alefacept. Когато РМВС популации са претретирани с UVB олъчване (0-20 ml/cm2), alefacept повишава UVB-индуцирана апоптоза и последващо намалява IFNy с 32.2% (р=0.009, п=3).

Тези резултати показват, че alefacept инхибира Т клетъчна IFNy продукция, че взаимодействие с FcyR носещи клетки е необходимо и че неговата комбинация с UVB може да се окаже ефективна при намаление броя и активността на ТМ-тип клетки в псориазисните лезии.

Пример 3: Третиране с човешки LFA-3/lgG1 слет белтък за псориазис намалява броя на инфилтриращи 1ЕМу⁺-продуциращи Т клетки в кожни лезии

Псориаззис е хронично възпалително кожно заболяване медиирано, отчасти, чрез продукция на IFNy от активирани Т клетки на лезии (Th1 skewed) (Th1 изкривени). Alefacept (човешки LFA3/lgG1 слет белтък, LFA3TIP, понастоящем създаден с фабрично наименование AMEVIVE™) е нов рекомбинаантен белтък, който води до обратимо намаление на СОЗ+СО45РО+кръвни Т клетки.

За изследване ефектите на кожни Т клетки, е проведено открито-белязано alefacept Фаза III проучване на псориазис върху 6 пациенти, на които е даван alefacept един път седмично 7.5 mg IV, за 12 последователни седмици. Процентите на CD3⁺ Т клетки и IFNyпродуциращи CD3⁺ популации общо в епидермални и дермални клетки са анализирани с проточна цитофотометрия и са изчислени CD3⁺ или IFNy⁺CD3⁺ клетъчните плътности както и клетъчен брой/mm².

При 5/6 от пациентите демонстриращи клинично подобрение на 13-та седмица, плътността на епидермалните Т клетки продуциращи IFNy(IFNy⁺CD3⁺) е намалена до 0.26+0.3% от изходното ниво. Средната плътност IFNy⁺CD3⁺ клетки за всичките 6 пациенти на изходното ниво е била 182+91/mm² спрямо 77+45/mm²на 12 седмици alefacept третиране (р=0.05). За всички 6 пациенти, PASI подобрението корелира с % промяна в IFNy⁺CD3⁺ епидермални клетки при г=0.80, р=0.06. Интересно, в началната фаза на третиране, няколко пациенти демонстрират преходни повишения на IFNy*CD3* Т клетките на лезиите на 3-тата седмица, свързани с преходно повишение дебелината на епидермиса; след това и двете - IFNy⁺CD3⁺ Т клетките и дебелината на епидермиса намаляват в следващите седмици.

Нашите резултати насочват, че alefacept може значимо да намалява броя на инфилтриращи ТМ-тип IFNy⁺CD3⁺ Т клетки, свързано с клинично подобрение. Тъй като се счита, че IFNy е ключов фактор в патогенезата на псориазис, намалението на ТМ клетките в кожата може да представлява критичен етап в клиничното подобрение на псориазис.

Депозити

Миши хибридомни клетки и анти-LFA-S антитела, използваеми в настоящето изобретение са заверени с култури, депозирани чрез Budapest Treaty в American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A, на 5 март 1991 и идентифицирани като: Обозначение АТСС ключов No.

IE6

НВ 10693

HC-IB11

7А6

8В8

НВ 10694

НВ 10695

НВ 10696

Бактериофаг носещ плазмид, кодиращ трансмембранен LFA-3 е депозиран чрез Budapest Treaty в In vitro International, Inc., Linthicum, Maryland, U.S.A. на 28 май 1987 c ключов No. IVI-10133. Този депозит е пренесен в American Type Culture Collection на 20 юни 1991 и идетифициран като:

Обозначение АТСС ключов No.

λΗΤ16[Xgt 10/LFA-3] 75107

E.coli трансформирани с плазмид кодиращ Pl-свързан LFA-3, са депозирани чрез Budapest Treaty в In vitro International, Inc. на 22 юли 1988 c ключов No. IVI-10180. Този депозит е пренесен в American Type Culture Collection на 20 юни 1991 и идентифициран

АТСС ключов No.

68788 като:

Обозначение

Р24

Последователности

Следващото е обобщение на последователностите, описани в US 6.162,432 и цитирани в заявката:

SEQ ID N0:1 ДНК последователност на трансмембранен LFA-3

SEQ ID N0:2 Аминокиселинна последователност на трансмембранен LFA-3

SEQ ID N0:3 ДНК последователност на Pl-свързан LFA-3

SEQ ID N0:4 Аминокиселинна последователност на Pl-свързан

LFA-3

SEQ ID N0:5

ДНК последователност на CD2

SEQ ID N0:6

Аминокиселинна последователност на CD2

SEQ ID N0:7

ДНК последователност на LFA3TIP

SEQ ID N0:8

Аминокиселинна последователност на LFA3TIP

Еквиваленти

Специалистът в тази област ще прецени, или ще установи, като използва рутинни експерименти, много еквиваленти на специфичните изпълнения на изобретението, описано тук. Такива еквиваленти са предвидени да обхващат следващите претенции.

Други изпълнения са в рамките на следващите претенции.

LFA-3 сигнална последователност

ATG GIT GCT G3G AGC GAC GOG GGS 033 GCC CTC G33 GIC CTO AGC GIG CTC TOC pMet Vol Al a Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Vol val Cys

CTG СТС CAC TGC ΊΤΤ GOT TIC ATC AGC TOT

19> Leu Leu ΗI s Cys Phe Gl y Phe 11 e Ser Cys

LFA-3

TIT TOC CAA CAA ATA TAT GGT GIT CTG TAT GGG AAT GIA ACT TIC CAT GIA CCA

29>Phe Ser Gin Gin He Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro

139 AGC AAT GTG CCT ΊΤΑ AAA GAG CTC CTA TGG AAA AAA CAA AAG GAT AAA GIT GCA

47>Ser Asn Vol Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gin Lys Asp Lys Vol Ala

193 GAA CTC GAA AAT TCT GAA TIC AGA GCT TIC TCA TCT TIT AAA AAT AGG GIT TAT

65>GI u Leu Gl u Asn Ser Gl u Phe Ar g Al o

247 TTA GAC ACT CTG TCA GGT AGC CTC ACT

83> Leu Asp T nr Val Ser Gly Ser Leu Thr

301 GAT GAG TAT GAA ATG GAA TOG CCA AAT loi^Asp Gl u Tyr Gl u Met Gl u Ser Pro Asn 355 TAT GTC

H9>Tyr Val

IgGl (hinge, CH2, CH3)

361 GAC AAA ACT СДС ACA TGC CCA COG TCC 1211 Asp Lys Thr His Thr C^s Pro Pro Cys 41S TCA GIC TIC CTC TIC COC CCA AAA CCC i39>Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 469 CCT GAG GIC ACA TGC GIG GIG CTG GAC i57>Pro Glu Vol Thr Cys Vol Vol Val Asp 523 TIC AAC TOG TAC GIG GAC GGC CTG GSG 175> Phe As η T r p Ty r Val As p Gl y Vol Gl u 577 GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CCT 193>Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 631 CAG GAC TGG CIG AAT GGC AAG GAG TAC 2ii»Gln Asp T rp Leu AsnGly Lys GluTyr 685 CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC 229*Pro Alo Pro lie &u Lys Thr lie Ser 739 CAG CTG TAC ACC CIG CCC CCA TCC CQG 2471 Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 793 CTC ACC TGC CIG GTC AAA GGC TTC TAT 26sHeu Thr Cys Leu Val lys Gly Phe Tyr 847 AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC 283>Ser Asn Gly Gin ProGlu Asn AsnTyr 901 GAC GGC TCC TIC TIC CTC TAC AGC AAG 301>Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 955 CAG GGG AAC CTC TTC TCA TGC TCC CTG 319>GIn Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser vol

Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg Val Tyr

ATC TAC AAC TTA ACA TCA TCA GAT GAA

11e Tyr Asn Leu T hr Ser Ser Asp Glu

ΑΊΤ ACT GAT ACC ATG AAG TIC ΤΊΤ СТГ lie Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu

OCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG

Pr o Al o Pr o Gl u Leu Leu Gly Gly Pro

AAG GAC ACC CTC ATG ATC TOC OGG AOC

Lys Asp T hr Leu Met 11e Ser Arg Thr

GTC AGC CAC GAA GAC CCT GAG CTC AAG Val Ser His Gl u Asp Pro Gl u Val Lys CTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG COG OGG Vol His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

GTC GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC

Vol Vol Ser Val Leu Thr Val Leu His

AAG TGC AAG CTC TCC AAC AAA GCC CTC

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

AAA GCC AAA GOG CAG COC CGA GAA OCA

Lys Alo Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro

GAT GAG CTG AOC AAG AAC CAG GTC AGC

Asp Gl u Leu T hr Lys Asn Gl n Val Ser

CCC AGC GAC ATC GCC GIG GAG TOG GAG Pro Ser Asp I I e Ala vol Glu Trp Glu AAG ACC AOG CCT COC GIG TTC GAC TCC Lys T hr T hr Pr o Pr o Vol Leu Asp Ser CTC ACC GIG GAC AAG AGC AGG TOG CAG Leu Thr Vol Asp Lys Ser Arg Trp Gin ATC CAT GAG OCT CTG CAC AAC CAC TAC Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

1009 ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GAT TCC AAC 33?»Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Asp Ser Asn

CTA TGG AAC TCA Leu TrpAsn ···

ФИГУРА 1

1/9

СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ <110> Biogen, Inc.

<12θ| МЕТОДИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКА НА КОЖНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ i С ПРИЛОЖЕНИЕ НА СО2-СВЪРЗВАЩИ АГЕНТИ

<130> 10274-041W01 <150> 60/265,964, <151> 2001-02-01 <160> 10 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 753 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)...(750) <221> sigjpeptide <222> (1)...(84) <221> matjpeptide <222> (85)...(750) <400> 1

Чи.»

atg gtt get ggg

age gac geg ggg egg gee etg ggg gtc etc age gtg

48

Met Val Ala

Gly -25

Ser

Asp

Ala Gly

Arg -20

Ala

Leu

Gly

Val Leu -15

Ser Val

gtc

tgc

etg

cac

tgc

ttt

ggt

ttc

ate

age

tgt

ttt

tec

caa

96

Val

Cys

Leu -10

Leu

His

Cys

Phe

Gly -5

Phe

lie

Ser

Cys

Phe 1

Ser

Gin

ata

tat

ggt

gtt

gtg

tat

ggg

aat

gta

act

ttc

cat

gta

cca

age

aat

144

lie 5

Tyr

Gly

Val

Tyr 10

Gly

Asn

Val

Thr

Phe 15

His

Val

Pro

Ser

Asn 20

gtg

cct

tta

aaa

gag

gtc

eta

tgg

aaa

caa

aag

gat

aaa

gtt

gca

192

Val

Pro

Leu

Lys

Glu 25

Val

Leu

Trp

Lys

Lys 30

Gin

Lys

Asp

Lys

Val 35

Ala

gaa

etg

gaa

aat

tet

gaa

ttc

aga

get

ttc

tea

tet

ttt

aaa

aat

agg

240

Glu

Leu

Glu

Asn 40

Ser

Glu

Phe

Arg

Ala 45

Phe

Ser

Phe

Lys 50

Asn

Arg

gtt

tat

tta

gac

act

gtg

tea

ggt

age

etc

act

ate

tac

aac

tet a

aca

288

Val

Tyr

Leu 55

Asp

Thr

Val

Ser

Gly 60

Ser

Leu

Thr

lie

Tyr 65

Asn

L>eu

Thr

tea

gat

gaa

gat

gag

tat

gaa

atg

gaa

teg

cca

aat

att

act

gat

336

Ser

Asp

Glu

Asp

Glu

Tyr

Glu

Met

Glu

Ser

Pro

Asn

lie

Thr

Asp

75 80

2/9

85

90

95

100

Leu

Thr

Cys

Ala

Leu

Thr

Asn

Gly

Ser

He

Glu

Val

Gin

Cys

Me x

He

105

110

11 5

Pro

Glu

His

Tyr

Asn

Ser

His

Arg

Gly

Leu

He

Met

Tyr

Ser

T1T3>

Asp

120

125

130

Cys

Pro

Met

Glu

Gin

Cys

Lys

Arg

Asn

Ser

Thr

Ser

lie

Tyr

Ph_e

Lys

135

140

145

Met

Glu

Asn

Asp

Leu

Pro

Gin

Lys

He

Gin

Cys

Thr

Leu

Ser

Asn

Pro

150

155

160

Leu

Phe

Asn

Thr

Ser

He

Leu

Thr

Cys

He

Pr~o

Ser

165

170

175

180

Ser

Gly

His

Ser

Arg

His

Arg

Tyr

Ala

Leu

He

Pro

He

Pro

Leu

Ala

185

190

195

Val

He

Thr

Cys

lie

Val

Leu

Tyr

Met

Asn

Gly

Met

Tyr

Al_a

Phe

200

205

210

w^;

<210> 5
<211> <212> <213>	1056 DNA Homo	sapiens
<220>
<221>	CDS
<222>	(1) ..	.(1053)
<221>	sig_peptide
<222>	(1) ..	. (72)

<221>

<222>

mat_peptide (73)...(1053) >

<400>

atg Met

age ttt

cca Pro

tgt Cys -20

aaa ttt

gta gcc age ttc ett etg att tt re aat

48

Ser

Phe

Lys

Phe

Val Ala

Ser -15

Phe

Leu

He

P-he Asn - 10

gtt

tet

tcc

aaa

ggt

gca

gtc

tcc

aaa

gag

att

acg

aat

gcc

ttg

gaa

96

Val

Ser

Lys

Gly

Ala

Val

Ser

Lys

Glu

He

Thr

Asn

Ala

L«eu

Glu

-5

1

5

acc

tgg

ggt

gcc

ttg

ggt

cag

gac

ate

aac

ttg

gac

att

cct

agt

ttt

144

Thr

Trp

Gly

Ala

Leu

Gly

Gin

Asp

He

Asn

Leu

Asp

He

Pro

Ser

Phe

10

15

20

caa

atg

agt

gat

att

gac

gat

ata

aaa

tgg

gaa

aaa

act

tzea

gac

192

Gin

Met

Ser

Asp

lie

Asp

lie

Lys

Trp

Glu

Lys

Thr

Ser

Asp

25

30

35

40

aag

aaa

aag

att

gca

caa

ttc

aga

aaa

gag

aaa

gag

act

ttc

aag

gaa

240

Lys

lie

Ala

Gin

Phe

Arg

Lys

Glu

Lys

Glu

Thr

Phe

X>ys

Glu

45

50

55

aaa

gat

aca

tat

aag

eta

ttt

aaa

aat

gga

act

etg

aaa

att

aag

cat

288

Lys

Asp

Thr

Tyr

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Gly

Thr

Leu

Lys

He

Xys

His

60

65

70

etg

aag

acc

gat

cag

gat

ate

tac

aag

gta

tea

ata

tat

gat

aca

336

Leu

Lys

Thr

Asp

Gin

Asp

He

Tyr

Lys

Val

Ser

He

Tyr

.Asp

Thr

75

80

85

aaa

gga

aaa

aat

gtg

ttg

gaa

aaa

ata

ttt

gat

ttg

aag

att

caa

gag

384

Lys

Gly 90

Lys

Asn

3/9

Vai Leu Glu 95

Lys

He

Phe

Asp Leu 100

Lys

He

Gin

Glu

agg

gtc

tea

aaa

cca

aag

ate

tee

tgg

act

tgt

ate

aac

aca

acc

etg

432

Arg

Vai

Ser

Lys

Pro

Lys

lie

Ser

Trp

Thr

Cys

lie

Asn

Thr

Leu

105

110

115

120

acc

tgt

gag

gta

atg

aat

gga

act

gac

ccc

gaa

tta

aac

etg

tat

caa

480

Thr

Cys

Glu

Vai

Met

Asn

Gly

Thr

Asp

Pro

Glu

Leu

Asn

Leu

Tyr

Gin

125

130

13S

gat

ggg

aaa

cat

eta

aaa

ett

tet

cag

agg

gtc

ate

aca

cac

aag

tgg

52 8

Asp

Gly

Lys

His

Leu

Lys

Leu

Ser

Gin

Arg

Val

He

Thr

His

Lys

Trp

140

145

150

acc

age

etg

agt

gca

aaa

ttc

aag

tgc

aca

gca

ggg

aac

aaa

gtc

576

Thr

Ser

Leu

Ser

Ala

Lys

Phe

Lys

Cys

Thr

Ala

Gly

Asn

Lys

val

155

160

165

age

aag

gaa

tee

agt

gtc

gag

cct

gtc

age

tgt

cca

gag

aaa

ggt

etg

62 4

Ser

Lys

Glu

Ser

Vai

Glu

Pro

val

Ser

Cys

Pro

Glu

Lys

Gly

Leu

170

175

180

gac

ate

tat

etc

ate

att

ggc

ata

tgt

gga

ggc

age

etc

ttg

atg

672

Asp

lie

Tyr

Leu

lie

Gly

He

Cys

Gly Gly Gly

Ser

Leu

Met

185

190

¹

195

200

gtc

ttt

gtg

gca

etg

etc

gtt

ttc

tat

ate

acc

aaa

agg

aaa

cag

72 0

Vai

Phe

Vai

Ala

Leu

Val

Phe

Tyr

He

Thr

Lys

Arg

Lys

Gin

205

210

215 a *

agg

agt

egg

aga

aat

gat

gag

etg

gag

aca

aga

gee

cac

aga

gta

76S

Arg

Ser

Arg

Asn

Asp

Glu

Leu

Glu

Thr

Arg

Ala

His

Arg

Val

220

225

230

get

act

gaa

agg

ggc

egg

aag

ccc

cac

caa

att

cca

get

tea

acc

8X6

Ala

Thr

Glu

Arg

Gly Arg

Lys

Pro

His

Gin

He

Pro

Ala

Ser

Thr

235

240

245

cct

cag

aat

cca

gca

act

tee

caa

cat

cct

cca

cct

ggt

cat

864

Pro

Gin

Asn

Pro

Ala

Thr

Ser

Gin

His

Pro

Gly

His

250

255

260

cgt

tee

cag

gca.

cct

agt

cat

cgt

ccc

ccg

cct

gga

cac

cgt

gtt

912

Arg

Ser

Gin

Ala

Pro

Ser

His

Arg

Pro

Gly

His

Arg

Val

265

270

275

280

cag

cac

cag

cct

cag

aag

agg

cct

get

ccg

teg

ggc

aca

caa

gtt

960

Gin

His

Gin

Pro Gin

Lys

Arg

Pro

Ala

Pro

Ser

Gly

Thr

Gin

Val

285

290

295

cac

cag

aaa

ggc

ccg

ccc

etc

ccc

aga

cct

ega

gtt

cag

cca

aaa

10 08

His

Gin

Lys

Gly

Pro

Leu

Pro

Arg

Pro

Arg

Val

Gin

Pro

Lys

300

305

310

cct

ccc

cat

ggg

gca

gaa

aac

tea

ttg

tee

cct

tee

tet

aat

10 53

Pro

His

Gly

Ala

Glu

Asn

Ser

Lieu

Ser

Pro

Ser

Asn

315

320

325

taa

1056

4/9 <210> б <211> 351 <212> PRT <213 > Homo sapiens <220>

<221> SIGNAL <222> (1) . . . (24) <400> 6

Met

Ser Phe

Pro

Cys -20

Lys

Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu -15

lie

Phe -10

Asn

Val

Ser

Lys

Gly

Ala

Val

Ser

Lys

Glu

He

Thr

Asn

Ala

Leu

Glu

-5

1

5

Thr

Trp

Gly

Ala

Leu

Gly

Gin

Asp

lie

Asn

Leu

Asp

He

Pro

Ser

Phe

10

15

20

Gin

Met

Ser

Asp

lie

Asp

He

Lys

Trp

Glu

Lys

Thr

Ser

Asp

25

30

35

40

Lys

lie

Ala

Gin

Phe

Arg

Lys

Glu

Lys

Glu

Thr

Phe

Lys

Glu

45

50

55

Lys

Asp

Thr

Tyr

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Gly

Thr

Leu

Lys

He

Lys

His

60

65

70

Leu

Lys

Thr

Asp

Gin

Asp

He

Tyr

Lys

Val

Ser

He

Tyr

Asp

Thr

75

80

85

Lys

Gly

Lys

Asn

Val

Leu

Glu

Lys

He

Phe

Asp

Leu

Lys

He

Gin

Glu

90

95 '

100

Arg

Val

Ser

Lys

Pro

Lys

He

Ser

Trp

Thr

Cys

He

Asn

Thr

Leu

105

110

115

120

Thr

Cys

Glu

Val

Met

Asn

Gly

Thr

Asp

Pro

Glu

Leu

Asn

Leu

Tyr

Gin

125

130

135

Asp

Gly

Lys

His

Leu

Lys

Leu

Ser

Gin

Arg

Val

He

Thr

His

JjyS

Trp

140

145

150

,

Thr

Ser

Leu

Ser

Ala

Lys

Phe

Lys

Cys

Thr

Ala

Gly

Asn

Lys

Val

155

160

165

Ser

Lys

Glu

Ser

Val

Glu

Pro

Val

Ser

Cys

Pro

Glu

Lys

Gly

Leu

170

175

180

Asp

lie

Tyr

Leu

He

Gly

He

Cys

Gly Gly Gly

Ser

Leu

Met

185

190

195

200

Val

Phe

Val

Ala

Leu

Val

Phe

Tyr

He

Thr

Lys

Arg

Lys

Gin

205

210

215

Arg

Ser

Arg

Asn

Asp

Glu

Leu

Glu

Thr

Arg

Ala

His

Arg

Val

220

225

230

Ala

Thr

Glu

Arg

Gly

Arg

Lys

Pro

His

Gin

He

Pro

Ala

Ser

Thr

235

240

245

Pro

Gin

Asn

Pro

Ala

Thr

Ser

Gin

His

Pro

Gly

His

250

255

260

Arg

Ser

Gin

Ala

Pro

Ser

His

Arg

Pro

Gly

His

Arg

Val

265

270

275

280

Gin

His

Gin

Pro

Gin

Lys

Arg

Pro

Ala

Pro

Ser

Gly

Thr

Gin

Val

285

290

295

His

Gin

Lys

Gly

Pro

Leu

Pro

Arg

Pro

Arg

Val

Gin

Pro

Lys

300

305

310

Pro

His

Gly

Ala

Glu

Asn

Ser

Leu

Ser

Pro

Ser

Asn

315 320 325 <210> 7 <211> 1050 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

5/9

<221> CDS	..(1041)
<222>	(1).
<221>	sig_peptide
<222>	(1).	. . (84)

<221> mat_peptide <222> (85)...(1041) <400> 7

atg gtt

get Ala

ggg age Gly Ser -25

gac geg ggg egg gcc etg ggg gtc

etc age gtg Leu Ser Val -15

48

Met

Val

Asp Ala

Gly

Arg Ala -20

Leu Gly

Val

gtc

tgc

etg

cac

tgc

ttt

ggt

ttc

ate

age

tgt

ttt

tee

caa

56

Val

Cys

Leu

His

Cys

Phe

Gly

Phe

lie

Ser

Cys

Phe

Ser

Gin

-10

-5

1

ata

tat

ggt

gtt

gtg

tat

ggg

aat

gta

act

ttc

cat

gta

cca

age

aat

14 4

He

Tyr

Gly

Val

Tyr

Gly

Asn

Val

Thr

Phe

His

Val

Pro

Ser

Asn

5

10

15

20

gtg

cct

tta

aaa

gag

gtc

eta

tgg

aaa

caa

aag

gat

aaa

gtt

gca

192

Val

Pro

Leu

Lys

Glu

Val

Leu

Trp

Lys

Gin

Lys

Asp

Lys

Val

Ala

25

30

35

gaa

etg

gaa

aat

tet

gaa

ttc

aga

get

ttc

tea

tet

ttt

aaa

aat

agg

240

Glu

Leu

Glu

Asn

Ser

Glu

Phe

Arg

Ala

Phe

Ser

Phe

Lys

Asn

Arg

40

45

50

gtt

tat

tta

gac

act

gtg

tea

ggt

age

etc

act

ate

tac

aac

tta

aca

288

val

Tyr

Leu

Asp

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Leu

Thr

He

Tyr

Asn

Leu

Thr

55

60

65

tea

gat

gaa

gat

gag

tat

gaa

atg

gaa

teg

cca

aat

att

act

gat

336

Ser

Asp

Glu

Asp

Glu

Tyr

Glu

Met

Glu

Ser

Pro

Asn

He

Thr

Asp

70

75

80

acc

atg

aag

ttc

ttt

ett

tat

gtc

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

cca

ccg

3 84

Thr

Met

Lys

Phe

Leu

Tyr

Val

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

85

90

95

100

tgc

cca

gca

cct

gaa

etc

etg

ggg

gga

ccg

tea

gtc

ttc

etc

ttc

ccc

4 32

Cys

Pro

Ala

Pro Glu

Leu

Gly Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

105

110

115

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

etc

atg

ate

tee

egg

acc

cct

gag

gtc

aca

4 80

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

-120

125

130

tgc

gtg

gac

gtg

age

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc

aac

528

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

val

Lys

Phe

Asn

135

140

145

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

ccg

egg

576

Trp

Tyr

val

Asp Gly

Val

G1U

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

150

155

160

gag

cag

tac

aac

age

acg

tac

egg

gtg

gtc

age

gtc

etc

acc

gtc

624

Glu

Gin

Tyr Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

165

170

175

180

6/9

ctg cac

cag Gin

gac tgg

ctg aat

ggc aag gag tac aag

tgc aag gtc Cys Lys Val 19S

tee Ser

672

Leu

His

Asp

Trp 185

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu 190

Tyr

Lys

aac

aaa

gcc

etc

cca

gcc

ccc

ate

gag

aaa

acc

ate

tee aaa gcc

aaa

720

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

He

Glu

Lys

Thr

lie

Ser Lys Ala

Lys

200

205

210

999

cag

ccc

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca tee egg

gat

768

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Vai

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro Ser Arg

Asp

215

220

225

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gtc

age

ctg

acc

tgc

ctg

gtc aaa gg-c

ttc

816

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Vai

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val Lys GLy

Phe

230

235

240

tat

ccc

age

gac

ate

gcc

gtg

gag

tgg

gag

age

aat

ggg cag ccg

gag

864

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Vai

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly Gin Pro

Glu

245

250

255

260

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

tee

gac ggc tee

ttc

912

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp Gly Ser

Phe

265

270

275

ttc

etc

tac

age

aag

etc

acc'gtg

gac

aag

age

agg

tgg cag cag

999

960

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Vai

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp Gin Gin

Gly

280

285

290

aac

gtc

ttc

tea

tgc

tee

gtg

atg

cat

gag

get

ctg

cac aac cac

tac

1008

Asn

Vai

Phe

Ser

Cys

Ser

Vai

Met

His

Glu

Ala

Leu

His Asn H*LS

Tyr

295

300

305

acg

cag

aag

age

etc

tee

ctg

tet

ccg

ggt

aaa

tgagtgegg

1050

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly Lys

310 315

<210> 8 <211> 347 <212> PRT <213> Homo	sapiens
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1). .	.(28)

<400> 8

Met Val Ala Gly

Ser Asp

Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu

Ser Val

-25

-20

-15

Val

Cys

Leu

His

Cys

Phe

Gly

Phe

He

Ser

Cys

Phe

Ser

Gin

-10

-5

1

He

Tyr

Gly Val

Val

Tyr

Gly

Asn

Val

Thr

Phe

His

Val

Pro

Ser

Asn

5

10

15

20

Val

Pro

Leu

Lys

Glu

Val

Leu

Trp

Lys

Gin

Lys

Asp

Lys

Val

Ala

25

3.0

35

Glu

Leu

Glu

Asn

Ser

Glu

Phe

Arg

Ala

Phe

Ser

Phe

Lys

Asn

Arg

40

45

50

Val

Tyr

Leu

Asp

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Leu

Thr

lie

Tyr

Asn

Leu

Thr

55

60

65

Ser

Asp

Glu

Asp

Glu

Tyr

Glu

Met

Glu

Ser

Pro

Asn

lie

Thr

Asp

7/9

70

75

80

Thr

Met

Lys

Phe

Leu

Tyr

Vai

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

85

90

95

100

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

105

110

115

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

120

125

130

Cys

Vai

Asp

Vai

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

135

140

145

Trp

Tyr

Vai

Asp

Gly

Vai

Glu

Vai

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

150

155

160

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

165

170

175

180

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

185

190

195

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

Lys

Thr

He

Ser

Lys

Ala

Lys

200

205

210

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Vai

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

215

220

225

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Vai

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

230

235

240

Tyr

Pro

Ser

Asp

He

Ala

Vai

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

245

250

255

260

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Vai

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

265

270

275

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Vai

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

280

285

290

Asn

Vai

Phe

Ser

Cys

Ser

Vai

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

295

300

305

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly Lys

310

315

<210> 9 <211> 1056 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)... (1053) <400> 9

atg Met 1

gtt get ggg age gac

geg ggg egg gee etg ggg gtc etc age

gtg Val

48

Val

Ala

Gly

Ser 5

Asp

Ala

Gly

Arg

Ala 10

Leu

Gly

Val

Leu Ser 15

gtc

tgc

etg

cac

tgc

ttt

ggt

ttc

ate

age

tgt

ttt

tec

caa

96

Val

Cys

Leu

His

Cys

Phe

Gly

Phe

He

Ser

Cys

Phe

Ser

Gin

-.20

25

30

ata

tat

ggt

gtt

gtg

tat

ggg

aat

gta

act

ttc

cat

gta

cca

age

aat

144

lie

Tyr

Gly

Val

val

Tyr

Gly

Asn

Val

Thr

Phe

His

Val

Pro

Ser

Asn

35

40

45

gtg

cct

tta

aaa

gag

gtc

eta

tgg

aaa

caa

aag

gat

aaa

gtt

gca

192

Val

Pro

Leu

Lys

Glu

Val

Leu

Trp

Lys

Gin

Lys

Asp

Lys

Val

Ala

50

55

60

gaa

etg

gaa

aat

tet

gaa

ttc

aga

get

ttc

tea

tet

ttt

aaa

aat

agg

240

Glu

Leu

Glu

Asn

Ser

Glu

Phe

Arg

Ala

Phe

Ser

Phe

Lys

Asn

Arg

65

70

75

80

8/9

gtt tat

tta gac

act gtg

tea ggt age etc act ate

tac Tyr

aac Asn

tta Leu 95

aca Thr

288

Val

Tyr

Leu

Asp

Thr 85

Val

Ser

Gly

Ser

Leu 90

Thr He

tea

gat

gaa

gat

gag

tat

gaa

atg

gaa

teg

cca

aat

att

act

gat

336

Ser

Asp

Glu

Asp

Glu

Tyr

Glu

Met

Glu

Ser

Pro

Asn

He

Thr

Asp

100

105

110

acc

atg

aag

ttc

ttt

ett

tat

gtc

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

cca

ccg

384

Thr

Met

Lys

Phe

Leu

Tyr

Val

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

pro

115

120

125

tgc

cca

gca

cct

gaa

etc

etg

ggg

gga

ccg

tea

gtc

ttc

etc

ttc

ccc

432

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

pro

130

135

140

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

etc

atg

ate

tee

egg

acc

cct

gag

gtc

aca

480

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

145

150

155

160

tgc

gtg

gac

gtg

age

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc

aac

528

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

165

170

175

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gee

aag

aca

aag

ccg

egg

576

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

180

185

190

gag

cag

tac

aac

age

acg

tac

cgt

gtg

gtc

age

gtc

etc

acc

gtc

624

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr Val

195

200

205

etg

cac

cag

gac

tgg

etg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

gtc

tee

672

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

ser

210

215

220

aac

aaa

gee

etc

cca

gee

ccc

ate

gag

aaa

acc

ate

tee

aaa

gee

aaa

720

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

Lys

Thr

He

Ser

Lys

Ala

uys

225

230

235

240

ggg

cag

ccc

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

etg

ccc

cca

tee

egg

gat

768

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

A-sp

•

245

250

255

gag

etg

acc

aag

aac

cag

gtc

age

etg

acc

tgc

etg

gtc

aaa

ggc

etc

816

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

phe

260

265

270

tat

ccc

age

gac

ate

gee

gtg

gag

tgg

gag

age

aat

ggg

cag

ccg

gag

864

Tyr

Pro

Ser

Asp

He

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

275

280

285

aac

tac

aag

acc

acg

cct

CCC

gtg

ttg

gac

tee

gac

ggc

tee

ttc

912

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly’

Ser

phe

290

295

300

ttc

etc

tac

age

aag

etc

acc

gtg

gac

aag

age

agg

tgg

cag

^gg

960

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

305

310

315

320

9/9

	aac Asn	gtc ttc tea tgc tec gtg
Val	Phe	Ser	Cys 325	Ser Val
	a eg	cag	aag	age	etc	tcc	ctg
Thr	Gin	Lys	Ser	Leu	Ser	Leu
			340
tga			»·
<210> 10 <211> 351 <212> PRT
	<213> Homo sapiens
<400> 10
Met	Val	Ala	Gly	Ser	Asp	Ala
	1				5
	val	Cys	Leu	Leu	His	Cys	Phe
				20
	He	Tyr	Gly 35	Val	Val	Tyr	Gly
	Val	Pro	Leu	Lys	Glu	Val	Leu
		50					55
	Glu	Leu	Glu	Asn	Ser	Glu	Phe
65					70
Val	Tyr	Leu	Asp	Thr	Val	Ser
				85
Ser	Ser	Asp	Glu	Asp	Glu	Tyr
			100
Thr	Met	Lys	Phe	Phe	Leu	Tyr
		115
Cys	Pro	Ala	Pro	Glu	Leu	Leu
	130					135
Pro	Lys	Pro	Lys	Asp	Thr	Leu
145					150
Cys	Val	Val	Val	Asp	Val	Ser
				165
Trp	Tyr	Val	Asp	Gly	Val	Glu
			180
Glu	Glu	Gin	Tyr	Asn	Ser	Thr
**·		195
Leu	His	Gin	Asp	Trp	Leu	Asn
	210					215
Asn	Lys	Ala	Leu	Pro	Ala	Pro
225					230
Gly	Gin	Pro	Arg	Glu	Pro	Gin
				245
Glu	Leu	Thr	Lys Asn	Gin	Val
			260
Tyr	Pro	Ser	Asp	lie	Ala	Val
		275
Asn	Asn	Tyr	Lys	Thr	Thr	Pro
	290					295
Phe	Leu	Tyr	Ser	Lys	Leu	Thr
305					310
Asn	Val	Phe	Ser	Cys	Ser	Val
				325
Thr	Gin	Lys	Ser	Leu	Ser	Leu
			340

atg	cat	gag	get	ctg	cac	aac	cac tac	100Θ
Met	His	Glu	Ala	Leu	His	Asn	His Tyr
		330					335
tet	ccg	gat	tcc	aac	eta	tgg	aac	1053
Ser	Pro	Asp	Ser	Asn	Leu	Trp	Asn
	345					350

1056

Gly Arg	Ala Leu Gly Val Leu Ser Val
10	15
Gly	Phe 25	He	Ser	Cys	Phe	Ser 30	Gin	Gin
Asn 40	Val	Thr	Phe	His	Val 45	Pro	Ser	Asn
Trp	Lys	Lys	Gin	Lys 60	Asp	Lys	Val	Ala
Arg	Ala	Phe	Ser 75	Ser	Phe	Lys	Asn	Arg 80
Gly	Ser	Leu 90	Thr	lie	Tyr	Asn	Leu 95	Thr
Glu	Met 105	Glu	Ser	Pro	Asn	He 110	Thr	Asp
Val 120	Asp	Lys	Thr	His	Thr 125	Cys	Pro	Pro
Gly Gly	Pro	Ser	Val 140	Phe	Leu	Phe	pro
Met	He	Ser	Arg 155	Thr	Pro	Glu	Val	Thr 160
His	Glu	Asp 170	Pro	Glu	Val	Lys	Phe 175	Asn
Val	His 185	Asn	Ala	Lys	Thr	Lys 190	Pro	Arg
Tyr 200	Arg	Val	Val	Ser	Val 205	Leu	Thr	val
Gly Lys	Glu	Tyr	Lys 220	Cys	Lys	Val	Ser
He	Glu	Lys	Thr 235	He	Ser	Lys	Ala	Lys 240
Val	Tyr	Thr 250	Leu	Pro	Pro	Ser	Arg 255	Asp
Ser	Leu 265	Thr	Cys	Leu	Val	Lys 270	Gly	phe
Glu 280	Trp	Glu	Ser	Asn	Gly 285	Gin	Pro	Glu
Pro	Val	Leu	Asp	Ser 300	Asp	Gly	Ser	Phe
Val	Asp	Lys	Ser 315	Arg	Trp	Gin	Gin	Gly 320
Met	His	Glu 330	Ala	Leu	His	Asn	His 335	Tyr
Ser	Pro 345	Asp	Ser	Asn	Leu	Trp 350	Asn

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Използване инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействието, в комбинация с UVB олъчване с тесен диапазон, като лекарствено средство за лечение или профилактика на епидермално или дермално нарушение при индивид с абнормна Т клетъчна активност или пролиферация.
2. Използване съгласно претенция 1, където епидермалното или дермалното нарушение се характеризира с повишена Т клетъчна продукция на IFNy.
3. Използване съгласно претенция 1, където епидермалното или дермалното нарушение е хронично възпалително нарушение.
4. Използване съгласно претенция 1, където епидермалното или дермалното нарушение е автоимунно нарушение.
5. Използване съгласно претенция 1, където епидермалното или дермалното нарушение е псориазис.
6. Използване съгласно претенция 1, където инхибиторът на CD2/LFA-3 взаимодействието е СО2-свързващ агент.
7. Използване съгласно претенция 1, където инхибиторът на CD2/LFA-3 взаимодействието е СО2-свързващ фрагмент от LFA-3, слет с имуноглобулин или негов фрагмент.
8. Използване съгласно претенция 1, където инхибиторът на CD2/LFA-3 взаимодействието е LFA-3/lgG слет полипептид.

Заместваща страница
9. Използване съгласно претенция 1, включващо освен това етап на мониториране на индивида за симптоми, или за промени в цитокинови нива или в имунна клетъчна популация.
10. Използване съгласно претенция 1, включващо освен това етап на въвеждане у индивид на топично приложим агент, подбран от групата състояща се от стероид, витамин, катран, антралин и макролактам.
11. Използване съгласно претенция 1, където индивидът е бозайник, е
12. Използване на слет полипептид, който включва СО2-свързващ фрагмент на IFA-3, слет с фрагмент от контстантната област на IgG, в комбинация с дадено количество UVB с тесен диапазон, достатъчно да намали нивата на интерферон-γ в епидермиса на индивид, като лекарствено средство за лечение или профилактика на псориазис.
13. Използване инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействието, в комбинация с UVB олъчване с тесен диапазон, като лекарствено средство за лечение или профилактика на възпалително ^w нарушение у индивид.
14. Използване на инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействието, в комбинация с UVB олъчване с тесен диапазон, като лекарствено средство за лечение или профилактика на автоимунно нарушение у индивид.

Заместваща страница
15. Използване съгласно претенция 14, където автоимунното нарушение е подбрано от групата състояща се от псориазис, захарен диабет, артрит, ревматоиден артрит, младежки ревматоиден артирт, остеоартрит, псориазен артрит, множествена склероза, енцефаломиелит, myasthenia gravis, systemic lupus erythematosis, автоимунен тиреоидит, дерматит, атопичен дерматит и екзематозен дерматит.
16. Използване на слет полипептид, който включва СО2-свързващ фрагмент от LFA-3, слет с фрагмент от константната област на IgG, в комбинация с известно количество UVB с тесен диапазон, достатъчно да понижи нивата на интерферон^ в епидермиса на индивид, като лекарствено средство за лечение или профилактика на атопичен дерматит у индивида.
17. Използване съгласно претенция 1, където един или двата от инхибиторите на CD2/LFA-3 взаимодействието и UVB олъчване с тесен диапазон, е въвеждан повторно.
18. Използване съгласно претенция 1, където прилагането на UVB олъчване с тесен диапазон, предшества въвеждане на инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействието.
19. Използване съгласно претенция 1, където прилагането на лечение с UVB с тесен диапазон, последва въвеждането на инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействието.
20. Използване съгласно претенция 1, където прилагането на лечение с UVB с тесен диапазон, е едновременно с въвеждане

Заместваща страница на инхибитора на CD2/LFA-3 взаимодействието.
21. Използване съгласно претенция 1, където лечение с UVB с тесен диапазон и инхибитор на CD2/LFA-3 взаимодействието, са прилагани на нееднакви интервали от време.