<Desc/Clms Page number 1>
BESCHRIJVING behorende bij een
UITVINDINGSOCTROOIAANVRAGE ten name van :
SEUREF A. G., gevestigd te :
Vaduz, Liechtenstein, voor : Farmaceutische preparaten met cardiale en metabolische beschermende werking op het energetische spiermetabolisme.
EMI1.1
- ----- Onder inroeping van het recht van voorrang op grond van octrooiaanvrage No. 3362/85-1, ingediend in Zwitserland d. d. 6 augustus 1985.
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
Deze uitvinding betreft farmaceutische preparaten die als actief bestanddeel een combinatie van ubichinoncoënzymen, zoals bijvoorbeeld Coënzym Q10'en de als creatinefosfaat of N- (fosfonamidino) sarcosine bekende gefosforeerde organische verbinding bevatten.
De bestanddelen van de combinatie hebben een krachtige synergetische werking die leidt tot verrassende en onverwachte resultaten doordat zij het spiermetabolisme gunstig beinvloeden en in het bijzonder het hart beschermen tegen door anoxie veroorzaakte beschadigingen, die bijvoorbeeld plaatsvinden bij hartinfarct, toestanden na hartinfarct, gedurende cardiovasculaire chirurgie of in het geval van vergrote energiebehoefte van de spieren.
De verrassende farmacologische en therapeutische uitwerking van de farmaceutische preparaten volgens de uitvinding zijn een gevolg van het tussen Coënzym en creatinefosfaat optredende synergisme.
Van Coënzym is inderdaad bekend, dat het een zeer belangrijke rol speelt bij cel-en (Gale P. H. et - Biochem. Biophys., 93, 211 (1961)).
Coënzym speelt een rol bij het mitochondiale transport van elektronen en zuurstofbenutting door de cytochroom-ademhalingsketen (Morton R. A.-Nature, 182, 1764 (1959)).
Coënzym is aanwezig in nagenoeg alle weefsels, in het bijzonder in spieren, hart, hersenen en lever, en een verminderde Coënzym -concentratie is gebleken bij sommige pathologische toestanden van deze organen, zoals hartinfarct, myocardiale insufficiëntie, spierdystrofie en arteriële hypertensie, zodat het bestaan van een verband tussen Coënzym en de bovengenoemde ziekten wordt aangenomen.
Exogene toediening van Coënzym bleek inderdaad de aangetaste weefselconcentraties van dit coënzym te herstellen en tevens een belangrijke therapeutische werking uit te oefenen (Folkers K. et al., - J. Vit. Res. 40, 380 (1970)).
Een aantal ziektetoestanden, zoals myocardiale insufficiëntie, na infarct heersende toestanden, myopathische dystrofieën en hypertentie werden succesvol behandeld door toediening van Coënzym Q (Yamasawa.-
<Desc/Clms Page number 3>
Biomedical and Clinical Aspects of Coënzym Q10 - Elsevier, North Holland Ed., band II, blz. 333, 1980)).
Uit verder biochemisch en farmacologisch onderzoek bleek, dat toediening van Coënzym Q-o'behalve dat het verminderde mitochondriale ademhaling herstelde, de ATP-concentratie in cellen kan vergroten en het celmembraan intact kan houden.
Een soortgelijke belangrijke rol is die wordt gespeeld door creatinefosfaat.
Een kritische concentratie van mitochondriaal ATP, zoals die plaatsvindt via de cytochroomketen en Coënzym Q10'is essentieel voor de vorming van creatinefosfaat, dat wordt gesynthetiseerd in de mitochondriën door mitochondriaal ATP en creatine van het cytoplasma.
Dit molecule kan de zeer energierijke fosforbinding transporteren naar myofibrillen en celmembranen.
Op dit gebied wordt creatinefosfaat inderdaad gebruikt, door middel van creatinefosfokinase, om ATP te vormen uit ADP en om spiercontractie en ionentransport te ondersteunen.
Verschillende proeven hebben aangetoond, dat het creatinefosfaatgehalte van weefsels een regelende factor is voor de cardiale contractiesterkte.
Toediening van creatinefosfaat verlengt de myocardiale contractiefunctie bij ratteharten, onder omkeerbare ischemische stilstandstoestanden (Hearse D. J. et al.-J. Pharm. Pharmac., 26,427 (1974)) en vermindert het optreden van door coronaire afbinding teweeggebrachte ventriculaire extrasystolen (Marshall R. J., Parrat J. R.-NaunynSchmiedebergs'Arch. Pharmacol., 281,437 (1974)).
Bovendien is aangetoond, dat een vermindering van intracellulaire fosfaten van een hoog energieniveau resulteert in beschadiging van sarcolemma en het begin van een onomkeerbare ischemische beschadiging vormt.
Toediening van creatinefosfaat kan depletie van fosfaten met een groot potentieel voorkomen en de de vernietiging van sarcolemma veroorzakende processen inhibiteren, zoals dit gebleken is bij proeven uitgevoerd op harten van ischemische ratten of bij experimenteel hartinfarct bij honden, bij welke proeven de toediening van creatinefosfaat niet alleen resulteerde in een verbetering van betekenis van de hart-
<Desc/Clms Page number 4>
functie en op de gehalten aan energierijke fosfaten, maar ook in een betere integriteit van myocardiocytsarcolemma en een gelijktijdige vermindering van door afbraak van membraanfosfolipiden gevormde lysofosfolipiden (Sako V. A. et al.-J. Molecular and Cellular Cardiology-16, suppl. 2 (september 1984) ; Sharov V. G.-J. Cardiovascular Pharmacol.
(1984) ; Fagliemi O.-J. Cardiovascular Pharm., 4,53 (1982)).
De resultaten van de proeven betreffende de myocardiale beschermende werking van creatinefosfaat werden ook klinisch bevestigd bij acuut hartinfarct, waarbij een betekenisvolle vermindering van het optreden van ventriculaire aritmieën bleek ; bij cardiovasculaire chirurgie, waarbij behandelde patiënten een sneller herstel van de hemodynamische en cardiale elektrische activiteit en van biopsie van het rechter ventrikel vertoonden, waarbij het behoud van normale concentraties aan energierijke fosfaten en een duidelijke beschermende werking bij ischemische beschadigingen van sarcolemma werden waargenomen (Robinson L. A., Hearse D. J.-J. of Therapy Cardiovascular Surgery, 87,190 (1984)).
Gevonden werd nu, dat de farmaceutische preparaten volgens de uitvinding opmerkelijke en verrassende farmacologische en therapeutische werking hebben, dankzij de synergetische interactie tussen de ubichinoncomponent en creatinefosfaat, welk synergisme niet kon worden voorzien op grond van wat tot nu toe bekend was of van de simpele optelling van de werkingen van de afzonderlijke componenten.
De resultaten van de met de preparaten volgens de uitvinding uitgevoerde farmacologische en toxicologische proeven worden onderstaand beschreven.
Van Coënzym Q10 en creatinefosfaat is bekend, dat zij een zeer zwakke toxiciteit hebben ; de combinatie daarvan gaf geen veranderingen in de toxiciteit te zien. De beide componenten van de combinatie in verhoudingen van 1 : 10 tot 1 : 100 (d. w. z. in veel grotere hoeveelheden dan die kunnen worden verwacht voor therapeutische toepassing) bevattende oplossingen veroorzaakten bij subcutane of intraperitoneale injectie bij muizen en ratten geen toxische effecten. Onder deze omstandigheden bleek de LD groter te zijn dan 1 g/kg en 500 mg/kg bij subcutane respectievelijk intraperiotoneale toediening.
De proeven op chronische toxiciteit bij ratten, uitgevoerd door orale toediening van de boven-
<Desc/Clms Page number 5>
staande combinatie in een verhouding van 1 : 10 gedurende 30 achtereenvolgende dagen, leverde ook geen pathologische veranderingen op in het lichaamsgewicht en in de verschillende hematochemische parameters.
Beschermende werking tegen door coronaire ligatie veroorzaakte ventriculaire aritmie bij ratten.
De door Selych et al. (Angiology 11,398 (1960) en door Clark C. et al. (J. Pharmacol. Methods 3,357 (1980) beschreven techniek voor chirurgische occlusie van de linker hartkransslagader werd toegepast op mannetjesratten met een lichaamsgewicht van 350-450 g.
De ratten die gedurende de chirurgische operatie en vóór de ligatie verschijnselen van aritmieën of een vermindering van de arteriële druk beneden 75 mmHg vertoonden, werden-uitgesloten. Oplossingen van Coënzym QI0 en creatine werden 15 minuten voor de ligatie van de hartkransslagader langzaam geinjecteerd in de linker ventrikelholte.
Aritmieën bleken 4-7 minuten na de ligatie op te treden ; ectopische ventriculaire contracties werden gedurende 30 minuten na de
EMI5.1
ligatie geteld. Coënzym en creatinefosfaat kunnen het aantal van 10 de door coronaire ligatie teweeggebrachte ectopische contracties verminderen, maar dit effect wordt in betekenisvolle mate en verrassend verbeterd door de combinatie daarvan, waaruit aldus een opmerkelijk synergisme blijkt, zoals duidelijk te zien is in tabel A.
<Desc/Clms Page number 6>
TABEL A
EMI6.1
<tb>
<tb> Behandeling <SEP> Begin <SEP> van <SEP> aritmieën, <SEP> Totaal <SEP> aantal <SEP> ectopische
<tb> contracties <SEP> gedurende
<tb> minuten <SEP> 30 <SEP> minuten <SEP> na <SEP> ligatie
<tb> Vergelijkingsproeven <SEP> 4-7 <SEP> 994 <SEP> : <SEP> 226
<tb> Creatinefosfaat <SEP> 4-7 <SEP> 870 <SEP> :
<SEP> 206
<tb> 10 <SEP> mg/kg
<tb> Creatinefosfaat <SEP> 5-7 <SEP> 765 <SEP> : <SEP> 215
<tb> 25 <SEP> mg/kg
<tb> Coënzym <SEP> Q <SEP> 5-7 <SEP> 709 <SEP> 196
<tb> 5 <SEP> mg/kg
<tb> Coënzym <SEP> Q <SEP> 6-7 <SEP> 690 <SEP> 222
<tb> 10 <SEP> mg/kg
<tb> Creatinefosfaat <SEP> 6-7 <SEP> 395 <SEP> : <SEP> 176
<tb> 10 <SEP> mg/kg <SEP> +
<tb> Coënzym <SEP> Q
<tb> 5 <SEP> mg/kg
<tb> Creatinefosfaat <SEP> 6-7 <SEP> 165 <SEP> 124
<tb> 25 <SEP> mg/kg <SEP> +
<tb> Coënzym <SEP> Q10
<tb> 10 <SEP> mg/kg
<tb>
Effect op het ATP-gehalte in de papillaire spier van konijnen na ipoxie.
Een groep Nieuw-Zeeland-konijnen met een gemiddeld lichaamsgewicht van 2 kg werd intraveneus behandeld met een 10 mg/kg Coënzym
Qlo of 100 mg/kg creatinefosfaat bevattende oplossing gedurende drie achtereenvolgende dagen.
Een andere groep dieren werd behandeld met de twee geneesmiddelen gecombineerd in dezelfde doseringen als bovenstaand of in de helft van de bovenstaande doseringen. Alle dieren (met inbegrip van de vergelijkingsdieren) werden 2 uur na de laatste injectie gedood, de harten werden verwijderd en gelijke secties van de papillaire spier, met een diameter van 1 mm en een dikte van 4-5 mm werden geïsoleerd.
<Desc/Clms Page number 7>
Dit weefsel werd geanalyseerd in een geschikt bad met constante temperatuur, geperfuseerd met een tot 100% met 02 verzadigde oplossing.
De ipoxietoestand werd tot stand gebracht door 100% N2 in plaats van 02 in het bad te brengen.
Het ATP-gehalte van de papillaire spier werd geanalyseerd volgens de methode beschreven door Strehler B. L. et al. (Methods in Enzymology III, New York-Academic Press, 871 (1957) in weefselmonsters, zowel na een periode van ca 90 minuten voor het tot stand brengen van een evenwichtstoestand bij normale perfusie en 60 minuten ipoxie.
De verkregen resultaten (tabel B) laten zien, dat het ATP-gehalte alleen in het geval van de combinatie van Coënzym Q10 en creatinefosfaat werd gehandhaafd bij normale waarden, zelfs na ipoxie, waaruit aldus het synergisme van de twee verbindingen blijkt.
TABEL B
EMI7.1
<tb>
<tb> Behandeling <SEP> ATP-gehalte <SEP> (mol/g <SEP> weefsel)
<tb> vóór <SEP> ipoxie <SEP> na <SEP> ipoxie
<tb> Vergelijkingsproeven <SEP> 1,73 <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP> 0, <SEP> 48 <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 04
<tb> Creatinefosfaat <SEP> 1,80 <SEP> 0, <SEP> 31 <SEP> 0, <SEP> 65 <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 03
<tb> 100 <SEP> mg/kg
<tb> Coenzyme <SEP> Q10 <SEP> 1,76 <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> 0,80 <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 06
<tb> 10 <SEP> mg/kg
<tb> Creatinefosfaat <SEP> 1,88 <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 0, <SEP> 66 <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 06
<tb> 100 <SEP> mg/kg <SEP> +
<tb> Coenzyme <SEP> Q10
<tb> 10 <SEP> mg/kg
<tb>
Uitwerking op de enzymatische activiteit van de gastrocnemius van aan dagelijkse spieroefening (training) onderworpen ratten.
Gezien het feit, dat dagelijkse training bij ratten leidt tot een versterking van de mitochondriale enzymactiviteit, zowel van het hart als de gastrocnemius, welke versterking een functie is van de duur van de traning en de spierprestaties (Benzi G. et al.-J. Applied
<Desc/Clms Page number 8>
Physiology, 38,565 (1875)) werd de combinatie volgens de uitvinding onderzocht op eventuele verkorting van de werking van de enzymatische aanpassing aan spieroefeningen en derhalve van de functionele prestatie.
Injecties van creatinefosfaat of Coënzym Q10 bleken de mitochondriale enzymatische voorraad van de rattegastrocnemius te vergroten, maar een sterker verkrijgbaar effect bleek bij de combinatie van de twee stoffen. In dit geval was de versterking van de mitochondriale enzymatische activiteit na 7 dagen behandeling groter dan die kan wor-
EMI8.1
den verkregen na 30 dagen training. De dieren (Wistar-ratten) werden getraind op een Rotarod-baan (Rotarod-apparaat Basile, Comerio, Italië) en de motorische activiteit werd iedere dag uitgevoerd bij 20 m/min gedurende 120 minuten.
De enzymatische activiteiten werden beoordeeld na 30 dagen training, na isolering en homogenisering van de gastrocnemius (Oscai L. B.
- J. Biol. Med., 246,6968 (1971)).
De verkregen resultaten (Tabel C) laten zien, dat de toediening van de combinatie volgens de uitvinding een zelfs nog grotere versterking van de mitochondriale enzymatische activiteit teweeg bracht dan die wordt teweeggebracht door training, welk resultaat niet kan worden verkregen wanneer de twee componenten afzonderlijk worden toegepast.
<Desc/Clms Page number 9>
TABEL C
EMI9.1
<tb>
<tb> Behandeling <SEP> Aantal <SEP> dagen <SEP> Citraat-synthetase <SEP> Isocitraat-dehydrogenase <SEP> Succinaat-dehydrogenas
<tb> etraining
<tb> Vergelijkings- <SEP> geen <SEP> training <SEP> 20,8 <SEP> ¯ <SEP> 1,5 <SEP> 2,42 <SEP> ¯ <SEP> 0,19 <SEP> 3,34 <SEP> ¯ <SEP> 0,17
<tb> proeven
<tb> Vergelijkings- <SEP> 7 <SEP> 22,2 <SEP> ¯ <SEP> 1,4 <SEP> 2,75 <SEP> ¯ <SEP> 0,16 <SEP> 3,75 <SEP> ¯ <SEP> 0,15
<tb> Vergelijkings- <SEP> 30 <SEP> 31,7 <SEP> ¯ <SEP> 1,6 <SEP> 3,60 <SEP> ¯ <SEP> 0,22 <SEP> 5,15 <SEP> ¯ <SEP> 0,19
<tb> proeven
<tb> Creatinefosfaat <SEP> geen <SEP> training <SEP> 22,4 <SEP> ¯ <SEP> ¯ <SEP> 0,20 <SEP> 3,80 <SEP> ¯ <SEP> 0,17
<tb> 100 <SEP> mg/kg
<tb> Coënzym <SEP> Q10 <SEP> geen <SEP> training <SEP> 26,7 <SEP> ¯ <SEP> 1,9 <SEP> 3,40 <SEP> ¯ <SEP> 0,21 <SEP> 3,84 <SEP> ¯ <SEP> 0,
20
<tb> 10 <SEP> mg/kg
<tb> Creatinefosfaat
<tb> 100 <SEP> mg/kg <SEP> + <SEP> geen <SEP> training <SEP> 31,1 <SEP> ¯ <SEP> 1,7 <SEP> 3,10 <SEP> ¯ <SEP> 0,21 <SEP> 4,80 <SEP> ¯ <SEP> 0,17
<tb> Coënzym <SEP>
<tb> 10 <SEP> mg/kg
<tb> Creatinefosfaat <SEP> 7 <SEP> 26,7 <SEP> ¯ <SEP> 1,5 <SEP> 2,96 <SEP> ¯ <SEP> 0,21 <SEP> 3,90 <SEP> ¯ <SEP> 0,19 <SEP> ( )
<tb> Q10100 <SEP> mg/kg
<tb> Coënzym <SEP> Q10 <SEP> 7 <SEP> 30,5 <SEP> ¯ <SEP> 1,8 <SEP> 3,35 <SEP> ¯ <SEP> 0,22 <SEP> 4,95
<tb> 10 <SEP> mg/kg
<tb> Creatinefosfaat
<tb> 100 <SEP> mg/kg <SEP> +
<tb> Coënzym <SEP> Q10
<tb> 10 <SEP> mg/kg
<tb>
( ) De enzymatische activiteit wordt uitgedrukt in pm gebruikt substraat per min/g weefselgewicht.