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MÉMOIRE DESCRIPTIF
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DÉPOSÉ A L'APPUI D'UNE DEMANDE DE BREVET D'INVENTION
FORMÉE PAR
GENEX CORPORATION. pour Chymosine de jeune bovin.
Demandes de brevets aux Etats-Unis d'Amérique n 394. 433 du 1 juillet 1982 et n 484. 539 du 13 avril 1983 en faveur de C. A. VASLET.
La présente invention concerne un gène cloné de bovin qui spécifie la biosynthèse de la chymosine de ce bovin. Elle se rapporte, en outre, à un plasmide contenant un gène cloné de chymosine de bovin, de même qu'à un micro-organisme transformé au moyen d'un tel plasmide.
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La chymosyne fiou présure (EC 3. 2. 23. 427 est La chymosyne e une enzyme protéolytique abondante dans le tube digestif des ruminants non sevrés. La chymosine est sécrétée sous forme de zymogène, ou prochymosine, qui est une chaîne polypeptidique simple contenant 365 aminoacides (37. 000 daltons). La prochymosine est convertie en chymosine par l'élimination spécifique de 42 aminoacides N-terminaux au cours d'une réaction autocatalytique dépendante du pH.
La chymosine de veau existe sous la forme de deux isoenzymes (dites A et B), qui peuvent être dédoublées par chromatographie sur DEAE-cellulose de l'enzyme cristalline. L'isoenzyme B, qui peut être catalytiquement moins efficace que l'isoenzyme A, est aussi la forme la plus abondante dans les extraits tissulaires. L'étude de la séquence des aminoacides a été exécutée pour l'isoenzyme B de chymosine de veau et partiellement pour l'isoenzyme A et a révélé uniquement une différence d'un acide aminé au résidu 290 (la glycine dans l'isoenzyme B et l'acide aspartique dans l'isoenzyme A) ±-voir Foltmann, B et al., J. Biol.
Chem., 254 : 8447-8456 (197617.
La chymosine de veau (mélange des isoenzymes) est utilisée depuis des siècles pour la fabrication des fromages. Toutefois, depuis la seconde guerre mondiale, une certaine disette de chymosine de veau est apparue, principalement en conséquence d'une baisse de la consommation de viande de veau. La chymosine extraite du tissu de l'abomasum (caillette) du veau non sevré a été remplacée progressivement par d'autres enzymes d'origine animale ou microbienne, mais dont aucune n'a les propriétés optimales de. l'enzyme de veau.
En conséquence de cette disette, on s'est beaucoup intéressé au clonage bactérien d'un gène de chymosine de veau et à l'isolement d'un micro-organisme
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produisant de la chymosine. Différents chercheurs ont décrit l'extraction du mRNA de chymosine du tissu de la caillette du veau ±-voir H. Uchiyama et al., Agric.
Biol. Chem., 44, 1373-1381 (198017 et le clonage d'un gène de chymosine ou cDNA en double chaîne (ds-cDNA) dans E. coli [voir Beppu T. et al., Recombinant DNA Industrial Applications (The Cetus Symposium) IFS Meeting, p. F-21. 5 (L) (1980) . ishimori K. et al./J.
Biochem., 90, 901-904 (1981) ont décrit des essais de clonage d'un gène de prochymosine dans E. coli et indiquent avoir obtenu un clone contenant une insertion de 1021 paires de bases qui semble avoir une homologie de séquence avec le gène de chymosine de veau (sur base d'observations de traduction arrêtée sur hybride). Cette insertion de 1021 paires de bases représente à peu près 80% de la longueur complète du gène de chymosine, dans l'hypothèse où le segment complet est issu du gène de chymosine. Néanmoins, les auteurs ne mentionnent aucune donnée caractérisante pour le gène, par exemple l'information relative à la séquence ou la carte de restriction, et le degré auquel le fragment cloné est issu du gène de chymosine de veau n'est donc pas connu.
De surcroît, ces auteurs n'indiquent pas avoir observé une expression de protéine par leurs clones bactériens.
Il reste donc nécessaire d'isoler un gène cloné de chymosine de veau de longueur complète et une souche microbienne capable de produire de la chymosine de veau.
La présente invention concerne un gène isolé intact de chymosine de veau, un gène isolé intact de prochymosine de veau, des plasmides contenant ces gènes et des micro-organismes transformés au moyen de ces plasmides. De plus, l'invention concerne un procédé pour produire de la chymosine de veau, suivant lequel
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on cultive un micro-organisme produisant de la chymosine de veau sur un milieu nutritif dans des conditions propres à la production de la chymosine.
Les procédés pour isoler et cloner un gène de chymosine de veau tels qu'ils sont décrits ici sont, sauf indication contraire, exécutés suivant les techniques habituelles de la biologie moléculaire. On peut se référer, par exemple, à Ullrich A. et al., Science, 196, 1313 (1977) et à Seeburg P. H. et al., Nature, 270, 486 (1977).
Les procédés conduisant à un micro-organisme producteur de chymosine de veau peuvent être divisés en les stades majeurs suivants, dont chacun est décrit plus en détail ci-après : (1) extraction du mRNA de prochymosine de la muqueuse garnissant la caillette de veaux nourris au lait, (2) synthèse in vitro de cDNA en double chaîne au moyen du mRNA de prochymosine de veau comme modèle, (3) insertion du cDNA en double chaîne dans un vecteur de clonage approprié et transformation de cellules au moyen de ce vecteur de clonage, et (4) sélection des clones microbiens contenant le gène de prochymosine de veau, sur base de leur aptitude à exprimer la prochymosine de veau.
Les détails expérimentaux relatifs à ces techniques sont discutés ciaprès dans les exemples, mais il convient de noter que ces techniques sont susceptibles de modifications notables tout en conduisant aux résultats désirés dans le cadre de l'invention.
Le mRNA de prochymosine de veau est avantageusement recueilli sous forme de mRNA polysomique après broyage de la muqueuse garnissant la caillette de veaux nourris au lait. Des ribonucléases existent dans ce tissu en concentrations relativement élevées, de sorte que le tissu est conservé par congélation peu après la mort de l'animal et que des substances sont utilisées
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pendant l'extraction pour atténuer l'activité des ribonucléases. De façon générale, le procédé de C. Vaslet et al., Nature, 285, 674-676 (1980) est applicable à l'extraction du mRNA polysomique.
Le tissu congelé peut être pulvérisé et homogénéisé et, après une centrifugation préliminaire éliminant les lipides et les débris cellulaires insolubles, le mRNA polysomique relativement dense est avantageusement séparé par centrifugation sur un gradient de saccharose. Du mRNA polyadénylé peut être isolé aisément de la préparation de mRNA polysomique par élution sur une colonne d'oligo d (T)-cellulose. Voir Green M. et al., Arch. Biochem.
Biophys., 172, 74 (1976).
Pour l'isolement d'une préparation enrichie de mRNA de prochymosine, l'éluat de la colonne d'oligo d (T)-cellulose peut être fractionné par centrifugation sur un gradient de saccharose, de la manière classique.
Les fractions de mRNA obtenues par centrifugation sur gradient de saccharose sont avec avantage sousmises à une vérification de leur teneur en mRNA de prochymosine en vue d'une détermination de leur activité de traduction dans un système de traduction exempt de cellules.
Un certain nombre de systèmes de traduction exempts de cellules ont été mis au point, par exemple l'extrait de germes de froment [Martial J. et collaborateur, Proc.
Nat'l Acad. Sci. USA, 74, 1816 (1977S, un lysat de rétriculocytes dépendant du mRNA Pelham H. R. B. et al.,
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Eur. J. Biochem., 67, 247 zo et des oocytes de Xenopus laevis Lrsioma A. et al., Methods in Enzymology, volume 70 (1981li. Le système avec extrait de germes de froment est préféré pour la recherche du mRNA de prochymosine. Le système aux germes de froment exempt de cellules peut être additionné d'un aminoacide radioactif marqué, comme la S35-méthionine, de manière que les protéines résultantes contiennent un traceur.
La
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teneur en prochymosine des différents produits de germes de froment est alors avantageusement observée par électrophorèse sur gel, puis visualisation par fluorographie et la fraction de mRNA, qui s'est révélée contenir de la prochymosine dans ce système, est utilisée pour la synthèse du ds-cDNA.
La synthèse du cDNA est faite au moyen de la transcriptase inverse du virus de la myéloblastose aviaire. Cette enzyme catalyse la synthèse d'une chaîne unique de DNA à partir des triphosphates de désoxynucléosides sur le mRNA modèle. Voir Kacian D. L. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 73, 2191 (1976). La queue poly r (A) du mRNA permet d'utiliser l'oligo (dT) (environ 12 à 18 nucléotides) comme amorce pour la synthèse du cDNA. L'utilisation d'un triphosphate de désoxynucléoside marqué radio-actif facilite la surveillance de la réaction de synthèse. De manière générale, un triphosphate de désoxynucléoside contenant du 32p, par exemple/-P/dCTP, peut être utilisé avec avantage à cette fin.
La synthèse du cDNA est généralement effectuée par incubation d'une solution du mRNA, des triphosphates de désoxynucléosides, de l'oligo (dT) et de la transcriptase inverse. La solution contient de
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préférence aussi de petites quantités d'actinomycine D éférence aus e p et de dithiothréitol favorisant la synthèse en longueur complète. Voir Kacian D. L. et al., supra. Après incubation, de l'acide éthylènediaminetétraacétique est ajouté à la solution et celle-ci est extraite avec du phénol/chloroforme. La phase aqueuse est avantageusement purifiée par chromatographie de filtration sur gel et le complexe cDNA-mRNA de l'éluat est précipité au moyen d'alcool.
Le mRNA peut être hydrolysé sélectivement en présence du cDNA au moyen d'hydroxyde de sodium dilué à une température élevée. La neutralisation de la solu-
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tion alcaline et la précipitation par l'alcool donnent la copie cDNA en chaîne simple.
La copie cDNA en chaîne simple s'est révélée comprendre une queue 5'-poly (dT) et avoir une structure en épingle à cheveux 3'terminale qui procure un segment court de DNA double. Voir Efstratiadis A et al., Cell, 7, 279 (1976). Cette structure en épingle à cheveux 3'peut servir d'amorce pour la synthèse d'une seconde chaîne de DNA. La synthèse de cette seconde chaîne est exécutée sensiblement dans les mêmes conditions que la synthèse de la copie cDNA, la transcriptase inverse étant toutefois remplacée par le fragment Klenow de la polymérase I de DNA de E. coli/Klenow H. et al., Eur. J. Biochem., 22, 371 (197l 7. Le cDNA double isolé de cette façon comprend une boucle 3' provenant de la structure en épingle à cheveux 3'de la copie cDNA en chaîne simple.
Cette boucle 3'peut être détachée par digestion avec une enzyme, à savoir la 81 nucléase, essentiellement suivant la technique de Ullrich A. et al., supra. Le produit de la digestion par la 81 nucléase peut être extrait au phénol/chloroforme et le ds-cDNA résultant peut être précipité de la phase aqueuse par addition d'alcool.
Pour la multiplication et la sélection, le gène de ds-cDNA préparé comme ci-dessus est généralement inséré dans un véhicule de clonage convenable qui est utilisé pour transformer des cellules hôtes appropriées. Des vecteurs de clonage convenables sont notamment différents plasmides et phages, mais la préférence va généralement aux plasmides. Les critères pour le choix d'un véhicule de clonage sont notamment sa dimension, son aptitude à la réplication dans les cellules hôtes, la présence de gènes pouvant être sélectionnés et la présence d'un site pour l'insertion du gène.
Pour ce qui est de la dimension, il est
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avantageux que le vecteur soit relativement petit pour
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permettre l'insertion d'un grand gène et pour ne pas e gaspiller d'importantes quantités d'éléments nutritifs, cellulaires et d'énergie dans la production de macromolécules inutiles. Le vecteur comprend également un réplicon intact qui reste fonctionnel après insertion du gène. Ce réplicon dirige de préférence le mode désiré de réplication du plasmide, c'est-à-dire des copies multiples ou une copie unique par cellule, ou bien un nombre contrôlable de copies par cellule. Les gènes spécifiants pour une ou plusieurs propriétés phénotypiques, de préférence de la résistance à des antibiotiques, facilitent la sélection des transformants.
Le site d'insertion est avantageusement un site de restriction unique pour une endonucléase de restriction. Un vecteur de clonage satisfaisant à tous ces critères est le plasmide pBR322. Voir Bolivar F. et al., Gene, 2, 95 (1977). Ce plasmide est petit (environ 2, 8 x 106 daltons), porte des gènes pour la résistance à l'ampicilline (amp) et à la tétracycline (tet) et est sujet à une réplication relâchée dans E. coli. Ce plasmide comprend également un site de restriction unique pour l'endonucléase PstI, qui existe dans le gène amp. Le ds-cDNA peut être inséré avec avantage dans ce plasmide suivant une technique de fixation en queue homopolymère. Voir Nelson T. et al., Methods of Enzymology, 68, 41 (1980).
Des queues homopolymères, par exemple de poly-dC, sont fixées sur les radicaux 3'-hydroxyle du ds-cDNA par réaction avec le triphosphate de désoxynucléoside approprié, par exemple dCTP, en présence d'une désoxynucléotidyl-transférase terminale [Chang L. M. S. et al., J. Biol. Chem., 246, 909 (1971) 7. Les ds-cDNA à queue de poly d (C) sont de préférence triés par dimension sur des gradients neutres de saccharose [voir Norgard et al., J. Biol.
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Chem., 255, 7665-7672 (198ou7. Les cDNA en double chaîne plus longs que 600 paires de bases sont utilisés aux stades ultérieurs.
Le plasmide est ouvert par digestion avec l'endonucléase appropriée et des queues homopolymères complémentaires, par exemple de poly-dG, sont fixées sur les radicaux 3'-hydroxyle du plasmide ouvert, suivant une technique de fixation de queue homopolymère identique, par exemple au moyen de dGTP. Si la chose est désirée, les réactions de fixation de queue peuvent être surveillées par mise en oeuvre de triphosphates de désoxynucléosides marqués radio-actifs, par exemple
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r /3H/dCTP et/3H/dGTP pour les réactions. En règle /3H7dCTP et Z3H e générale, ces réactions sont exécutées pour former des queues d'une longueur d'environ 10 à 20 nucléotides. Le cDNA augmenté de la queue et le plasmide sont recueillis, par exemple par extraction dans du phénol, puis précipitation par l'alcool.
Les deux espèces de DNA avec"queue"sont épurées par incubation dans une solution tamponnée de concentrations équimolaires des deux espèces de manière à donner un plasmide recombinant contenant le gène de prochymosine de bovin.
Une souche ampS, tetS appropriée de E. coli peut être transformée à l'aide du plasmide recombinant essentiellement suivant la technique de Lederberg, J.
Bacteriology, 119, 1072 (1974). Les transformants sont normalement cultivés sur du bouillon L ordinaire contenant de la tétracycline. Des échantillons de colonies croissant sur le milieu contenant de la tétracycline sont alors transférés dans un second milieu contenant de l'ampicilline. Du fait que le plasmide pBR322 confère aux cellules de la résistance à l'égard de la tétracycline, les colonies qui croissent sur le milieu contenant de la tétracycline doivent contenir le plasmide. D'autre part, la résistance à
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l'ampicilline du plasmide pBR322 est détruite par insertion du gène, de sorte que seules les colonies tetR, ampS sont retenues pour l'analyse ultérieure.
En règle générale, plusieurs centaines à quelques milliers de clones de prochymosine potentiels sont obtenus suivant ces modes opératoires. Pour identifier un groupe plus restreint de colonies qui contiennent le gène de prochymosine, un DNA marqué radio-actif peut être utilisé avec avantage comme indicateur. Voir Grunstein M. et al., Proc. Nat. Acad.
Sci. USA, 72, 3961-3965 (1975). Un tel DNA indicateur peut être préparé avec avantage à partir d'une population fortement enrichie de mRNA de prochymosine au moyen de transcriptase inverse et par incorporation d'un nucléotide radio-actif marqué. De façon générale, le procédé de Grunstein et al. (supra) tel que modifié par Wahl et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 76, 3683- 3687 (1979) constitue un procédé préféré pour analyser l'hybridation de la colonie.
Bien que l'hybridation de la colonie réduise généralement le nombre des clones de prochymosine potentiels, un nombre considérable de ces clones continue d'habitude d'exister. Un procédé qui a été appliqué avec succès pour sélectionner plus finement ces clones est le dosage par immunosorption avec liaison enzymatique (ELISA). Ce dosage permet de détecter la chymosine dans les clones où l'expression de la protéine se fait. L'opération consiste à appli- quer des étalons de chymosine et de produits de lyse de cellules sur la face intérieure des cuvettes de plaques de microtitrage en matière plastique et à réaliser une réaction immunologique entre la chymosine éventuellement présente et un anticorps antichymosine.
Le produit de conjugaison immobilisé est ensuite mis à réagir avec un second anticorps porteur d'enzyme qui
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est spécifique pour le premier anticorps. Après séparation de l'anticorps porteur non combiné, un substrat chromogène est introduit pour déterminer l'enzyme combinée en présence, ce qui constitue une mesure de la concentration en chymosine dans le produit de lyse cellulaire initial. Cette technique s'est révélée fort utile pour isoler un petit nombre de clones dans une grande population de clones identifiés comme positifs lors de l'analyse d'hybridation des colonies.
Les quelques clones identifiés par le système de dosage immunologique avec liaison enzymatique sont caractérisés avec avantage plus en détail par établissement de la carte de restriction et de la séquence des aminoacides. Un clone, dit pGx 1225, a donné des résultats positifs marqués et reproductibles à l'examen ELISA, et a été également confirmé comme contenant le gène de prochymosine par analyse de séquence et établissement de la carte de restriction. La carte de restriction de l'insertion du gène de prochymosine de pGx 1225 constitue la Fig. 1 des dessins. L'insertion consiste en 1289 paires de bases. Le zymogène est spécifié par la région depuis la paire de bases 43 jusqu'à la paire de bases 1137 et le gène de chymosine à maturité est spécifié depuis la paire de bases 169 jusqu'à la paire de bases 1137.
La séquence des nucléotides de ce gène de prochymosine inséré a été déterminée suivant le procédé de Sanger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 74, 5463- 5467 (1977) et cette séquence des nucléotides constitue la Fig. 2 subdivisée en Fig. 2A, Fig. 2B, Fig. 2C et Fig. 2D des dessins. La Fig. 2 montre la chaîne 5'-hua3' des régions non codantes et codantes, de même que la séquence des aminoacides spécifiés par le gène.
Aux fins de l'invention et pour la description de la Fig. 2, les abréviations ont les significations habi-
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tuelles suivantes :
A = désoxyadényle
T = thymidyle
G = désoxyguanyle C = désoxycytosyle
GLY = glycine
ALA = alanine
VAL = valine
LEU = leucine
ILE = isoleucine
SER = sérine
THR = thréonine
PHE = phénylalanine
TYR = tyrosine
TRP = tryptophane
CYS = cystéine
MET = méthionine
ASP = acide aspatique
GLU = acide glutamique
LYS = lysine
ARG arginin
HIS = histidine
PRO = proline
GLN = glutamine
ASN = asparagine Il convient de noter qu'en raison de la dégénérescence du code génétique, la séquence des nucléotides du gène peut varier sensiblement.
Par exemple, certaines parties ou l'ensemble du gène pourraient être synthétisés chimiquement pour produire du DNA ayant une séquence de nucléotides différente de celle indiquée à la Fig. 2, mais la séquence des aminoacides serait conservée à la condition que les attributions codonaminoacide appropriées soient respectées. Bien que la séquence des nucléotides du gène de prochymosine de
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veau et la séquence des aminoacides de la protéine aient été établies, le gène conforme à l'invention n'est pas limité à une séquence particulière des nucléotides et peut subir toutes les variations autorisées par le code génétique.
Une culture de cellules de E. coli, pGx 1225, contenant le gène de prochymosine inséré décrit cidessus a été déposée sous le numéro NRRL B-15061 au U. S. Department of Agriculture, Northern Régional Research Laboratory, Peoria, Illinois, E. U. A.
L'invention a été décrite avec référence à l'utilisation de E. coli comme bactérie hôte pour le DNA recombinant contenant le gène de prochymosine de veau, mais il est évident pour le spécialiste en biologie moléculaire que d'autres bactéries Gram-négatives, par exemple Pseudomonas, et des bactéries Gram-positives, par exemple Bacillus, outre des organismes unicellulaires supérieurs, par exemple des levures et champignons, peuvent être utilisés pour le clonage et/ou l'expression du gène de prochymosine ou de diverses parties de celui-ci.
L'invention est davantage illustrée par les exemples non limitatifs ci-après.
EXEMPLE 1. - Préparation du mRNA polysomique
On recueille les caillettes de veaux nourris au lait à l'abattoir local (Henry Stapf, Inc., Baltimore, Maryland) dans les 30 minutes après que les animaux ont été sacrifiés. On excise la muqueuse intérieure et on la congèle dans l'azote liquide pour la conserver. On prépare le mRNA polysomique suivant une variante du procédé décrit par Vaslet et al.
/' (Nature 285 : 6764-676 (1980L7. On homogénéise 50 g de tissu congelé pulvérisé dans 100 ml de tampon contenant du KCl 0, 25 M, du MgC12 0, 025 M, du Tris-HCl 0, 05 M de
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pH 7, 4, 0, 5% de NP40, 200/ug/ml de cyclohexamide et
250/ug/ml d'héparine. On centrifuge deux fois le produit d'homogénéisation à 10. 000 tours par minute pendant 10 minutes à 4 C pour clarifier une couche lipidique lourde et séparer les débris cellulaires. On recueille les polysomes sous la forme d'un culot en centrifugeant le liquide surnageant à basse vitesse dans une couche de 2, 5 ml de saccharose à 52% dans du tampon d'homogénéisation exempt de NP40, de cyclohexamide et d'héparine à 28. 000 tours par minute pendant 8 heures à 40C dans un rotor Beckman SW28.
On remet le culot de polysomes en suspension dans un milieu contenant du Tris-HCl 50 mM de pH9, de l'EDTA 1 mM, du NaOAc 150 mM et 1% de SDS contenant de la protéinase (250/ug/ml). Après 60 minutes d'incubation à 37 C, on extrait la préparation à deux reprises avec du phénol/chloroforme et on précipite le RNA par l'alcool entre 0 et-80 C pendant 1 heure. On recueille le RNA sous forme de culot et on le lave trois fois avec de l'acétate de sodium 3 M pour solubiliser les petits RNA, la mucine et l'héparine. On remet le culot final de RNA polysomique en suspension dans de l'eau désionisée et on le conserve à-80 C.
On prépare du poly (A) + mRNa par hybridation du RNA polysomique avec une colonne d'oligo d (T)-cellulose. On met la colonne à l'équilibre avec du tampon de combinaison contenant du Tris-HCl 10 mM de pH 7, 6, de l'EDTA 1 mM, 0, 1% de SDS et du NaCl 400 mM, et on fait passer l'ensemble de la préparation de RNA polysomique cycliquement à cinq reprises sur la colonne. On élue le RNA non combiné avec plusieurs volumes de colonne de tampon de combinaison. Le tampon d'élution contient du Tris-HCl 10 mM de pH 7, 6, de l'EDTA 1 mM et 0, 1% de SDS et est utilisé pour éluer de la colonne le poly (A) + mRNA combiné. On précipite le poly (A) + mRNA
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par l'alcool et on le conserve à-80 C.
EXEMPLE 2.Fractionnement du poly (A) + mRNA sur un gradient de saccharose
On dépose en couche le poly (A) + mRNA sur un gradient de densité de saccharose continu de 5% à 20% préparé dans du tampon SDS contenant 0, 5% de SDS, du
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NaCl 0, 1 M, du Tris 0, 01 M de pH 7, 5 et de l'EDTA 0, 001 M. On chauffe le RNA à 80 C pendant 2 minutes et on le refroidit rapidement dans de la glace juste avant de former la couche sur le gradient. On introduit des rRNA de présure de veau dans des tubes distincts comme étalons de sédimentation. On centrifuge les gradients à 30. 000 tours par minute pendant 20 heures à 220C dans un rotor Beckman SW40 et on recueille des fractions de 0, 6 ml pour établir un profil A260, qui est illustré par la Fig. 3 des dessins.
On précipite par l'alcool le rMNA de chaque fraction et on la soumet ensuite à un essai de l'activité de traduction dans un système aux germes de froment préparé disponible dans le commerce (BRL) (voir exemple 3). La fraction hachurée indiquée à la Fig. 3 est enrichie en mRNA de prochymosine de veau et sert à la synthèse du ds-cDNA (exemple 4).
EXEMPLE 3.Traduction sur germes de blé des mRNA et électrophorèse sur gel de polyacrylamide
On traduit les échantillons de RNA dans un système aux germes de froment exempts de cellules additionné de S35-méthionine comme suggéré par le fabricant (Bethesda Research Laboratory, Rockville, Maryland). On soumet les produits de germes de froment à l'électrophorèse sur des plaques de gels de polyacrylamide SDS contenant 5% de gel d'accumulation et 12, 5% de gel de séparation LLaemmli, Nature 227 : 680-685 (197027. On visualise les protéines marquées radio-
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actives par fluorographie au moyen d'une pellicule Kodak XR-5/Bonner et Laskey, Eur. J. Biochem., 46 : 83-88 (19748.
EXEMPLE 4.Préparation de plasmides hybrides
On exécute une synthèse de cDNA en double chaîne et une fixation de queue homopolymère avec une modification très faible du procédé détaillé par McCandliss et al. (Methods of Enzymology, volume 70, 1981). On ajoute environ 10 à 20 résidus dG à l'extrémité 3'de pBR322 linéarisé par PstI. On ajoute le même nombre de résidus dC au ds-cDNA synthétisé. On trie par dimension le ds-cDNA à queue C sur des gradients neutres de saccharose comme décrit par Norgard et al.
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f'J (1980) 7LJBC 255 : 7665-7672 (1980) 7. On dissout le ds-cDNA dans de l'eau distillée et on l'applique en couche sur 12 ml d'un gradient de saccharose de 5% à 12% refroidi contenant du Tris-HCl 50 mM à pH 7, 5 et de l'EDTA 1 mM.
On centrifuge le gradient à 38. 000 tours par minute pendant 17, 5 heures à 5 C dans un rotor Beckman SW40. On traite simultanément un second gradient contenant 10/ug de plasmide pBR322 digéré par l'endonucléase TaqI afin d'obtenir des étalons de dimension. On fractionne les gradients et on les analyse de la manière suivante : a) gradient avec pBR322 digéré par TaqI. On précipite par l'alcool le DNA de chaque fraction de 0, 5 ml et on le remet en suspension dans du
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tampon contenant du Tris-HCl 0, 09 M de pH 8, 5, de l'acide borique 0, 09 M, de l'EDTA 40 mM, 5% de gly- cérol, 0, 025% de cyanol de xylène et 0, 025% de bleu de bromophénol. On soumet chaque échantillon à l'électrophorèse sur une plaque de gel d'acrylamide à 8%.
On photographie les gels colorés par le bromure d'éthidium et on note les bandes contenant du DNA d'une longueur supérieure à 600 paires de bases ; b) gradient avec ds-
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cDNA. On utilise 100/ul de chaque fraction de 1 ml pour le comptage par scintillation. On précipite par l'alcool de DNA de chaque fraction et on utilise pour les stades ultérieurs celles contenant du ds-cDNA d'une longueur supérieure à 600 paires de bases (comme indiqué par l'information apportée sur le gel par le pBR322 digéré par TaqI).
On dilue le DNA de pBR322 à queue oligo d (G) et le ds-cDNA à queue oligo d (C) de dimension calibrée jusqu'à des concentrations équimolaires dans un milieu contenant du Tris-HCl 10 mM à pH 7, 5, du NaCl 100 mM et du Na2EDTA 2, 5 mM. On chauffe les DNA à 700C pendant 10 minutes, puis on les refroidit lentement jusqu'à la température ambiante au cours de la nuit.
EXEMPLE 5.Transformation
On introduit des plasmides recombinants dans E. coli HB101 en substance suivant le procédé de Lederberg et Cohen SJ. Bacti., 119, 1072 (1974L7. On met les transformants en culture sur des plaques normalisées LB à la tétracycline (15/ug/ml) à 370C pendant 24 heures. On repique les colonies sur des plaques LB à l'ampicilline (50/ug/ml) pour déterminer le phénotype. On recueille uniquement les colonies sensibles à l'ampicilline pour la poursuite de l'analyse. On isole à peu près 750 clones.
EXEMPLE 6.Hybridation des colonies
On prépare des transformants pour l'hybridation des colonies suivant une variante du procédé décrit à l'origine par Grunstein et Hogness rPNAS, 72, 3961-3965 (1975. On procède à l'hybridation des filtres combinés au DNA en présence de sulfate de dextrane et de formamide comme suggéré par Wahl et al. /PNAS, 76, 3683-3687 (1979 L7. On soumet les filtres à
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la préhybridation dans 6 volumes de SSC (20X= NaCl 3 M et Na3citrate 0, 3 M), 1 volume de solution de Denhardt (10X-0, 2% BSA, 0, 2% PVP-40 et 0, 2% Ficoll) et 0, 1% de SDS dans un bocal en verre sous agitation modérée à 400C pendant 60 minutes.
On exécute une seconde préhybridation, à raison de 8 ml par filtre, dans 50% de diméthylformamide, 5 volumes SCS, 5 volumes de solution de Denhardt, NaP04 50 mM de pH 5, 6, 1% de glycine et 195/ug/ml d'ADNA de sperme de saumon dénaturé pendant
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2 heures à 45 C sous agitation modérée. On ajoute un témoin de 3P-cDNA (=O, 5xl06 coups par minute et par filtre) à un mélange d'hybridation contenant 50% de formamide, 5 volumes de SSC, 1 volume de solution de Denhardt, du NaP04 de pH 6, 5 20 mM, 10% de sulfate de dextrane, 10/ug/ml de DNA de sperme de saumon dénaturé et on effectue l'incubation avec les filtres à 42"C pendant 18 heures sous agitation modérée.
On prépare ce témoin à partir d'une fraction sur gradient de saccharose fortement enrichie en mRNA de prochymosine (exemple 2), qui est la première fraction supérieure adjacente à celle utilisée pour la synthèse du ds-cDNA. On lave les filtres trois fois pendant 10 minutes dans 2 volumes de SSC, 0, 1% de SDS à température ambiante et deux fois pendant 10 minutes dans 0, 1 volume de SSC, 0, 1% de SDS à 500C. On visualise les taches positives par exposition des filtres essorés sur du film Kodak XR-5 à-80 C pendant une nuit, avec filtre intensifiant.
EXEMPLE 7.Dosage par immunosorption avec liaison enzymatique
On applique le dosage par immunoabsorption avec liaison enzymatique (ELISA) établi par Engvall E. et Pearlman P./Immunochemistry, S (, 871-874 (1971 p pour examiner les 135 clones recombinants qui ont été préalablement identifiés comme positifs suivant le mode
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opératoire de l'exemple 6. Pour la préparation de l'anticorps, on repurifie la chymosine (Sigma) sur une colonne à focalisation isoélectrique et on utilise cette chymosine purifiée comme immunogène pour toutes les injections ultérieures. On immunise initialement des lapins blancs de Nouvelle-Zélande au moyen de 1 mg de chymosine dans de l'adjuvant complet de Freund en injection intramusculaire.
Les injections de rappel contiennent 0, 5 à 0, 75 mg de chymosine dans de l'adjuvant incomplet de Freund et sont faites de même à intervalles de 15 jours pendant 3 mois. On collecte ensuite du sang pour préparer le sérum antichymosine.
Dosage : on disperse des cultures âgées d'une nuit des colonies à examiner dans 5 ml de bouillon L contenant 25 mg de tétracycline par litre. On utilise comme témoins négatifs des cultures de HB101 contenant pBR322. On centrifuge les cultures dans un rotor Sorval SM-24 pendant 5 minutes à 40C à 8000 tours par minute. On lave les cellules une fois avec de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate (PBS), on les transfère dans des tubes d'Eppendorf et on les, remet en suspension dans 300 ml de tampon au carbonate/bicarbonate 20 mM de pH 9, 5, puis on les conserve sur glace. On expose chaque tube à l'effet des ultrasons sur glace pendant 10 à 15 secondes à 200 watts. On sépare les débris par centrifugation et on transfère soigneusement le produit de lyse dans un tube d'Eppendorf propre.
On introduit 200/ul de produit de lyse des cellules dans chaque cuvette d'une plaque de microtitrage (Linbro, Flow Labs). Au moyen de chymosine repurifiée, on établit trois jeux de courbes étalons s'échelonnant de 1 à 0, 1/ug/ml par dilution du simple au double. On ajoute 200/ul de chaque étalon dans les cuvettes appropriées de la plaque de microtitrage qu'on met à incuber jusqu'au lendemain à 4"C.
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On aspire les produits de lyse des cellules et les étalons hors des plaques et on les lave trois fois avec de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate à 0, 05% de Tween 20.
On ajoute 200/ul d'albumine de sérum de lapin à 3% au contenu de chaque cuvette et on met le tout à incuber à 37 C pendant 1 heure pour bloquer les sites de combinaison encore actifs sur la matière plastique. On lave la plaque à trois reprises avec le système PBSTween et on introduit 200/ul d'anticorps antichymosine (dilué à 1/32) dans chaque cuvette, à l'exception d'une série de cuvettes étalons dans lesquelles on introduit du sérum préimmune dilué à 1/32. On met la plaque à incuber à 37 C pendant 1 heure et on la lave trois fois avec le système PBS-Tween.
On ajoute 200/ul d'anticorps de chèvre anti-lapin conjugué à de la peroxydase de raifort (Sigma) dilué à 1/500 dans chaque cuvette et on met le tout à incuber à 37 C. Après trois lavages
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avec le système PBS-Tween, on introduit 200/ul de substrat, à savoir de 2, 2'-azino-diL3-éthylbenzothiazoline-sulfonate7 (ABTS) dans chaque cuvette. On observe la plaque à 405 nm sur un appareil Flow Multi-Scanner 15 minutes après l'addition du substrat. On identifie ainsi deux clones donnant de manière reproductible des résultats positifs. L'un de ces clones, noté pGx1225, contient une insertion d'une longueur suffisante pour coder pour un gène de prochymosine de veau complet.
On caractérise le DNA de ce clone en établissant la carte de restriction et l'analyse de séquence, une culture de ces cellules étant ensuite déposée sous le n NRRL N- 15061 à l'U. S. Department of Agriculture, Northern Régional Research Laboratory, Peoria, Illinois.