La présente invention concerne des insecticides microbiens. Plus particulièrement, l'invention concerne une nouvelle composition insecticide microbienne, ainsi que sa préparation et son utilisation.
Les insecticides microbiens d'origine virale, bactérienne ou fongique offrent de nets avantages vis-à- vis des insecticides chimiques classiques.
Les organismes pathogènes microbiens pour les insectes sont généralement non toxiques et inoffensifs vis-à-vis d'autres formes de vie. En outre, les insecticides microbiens ont un degré de spécificité relativement élevé, si bien qu'ils ne présentent aucun danger pour les insectes utiles. De plus, l'insecte hôte susceptible acquiert très lentement une résistance aux organismes pathogènes microbiens.
Les insecticides microbiens peuvent être utilisés en doses relativement faibles, ils peuvent être efficacement appliqués sous forme de pulvérisations ou de poudres de saupoudrage et, en outre, ils peuvent être utilisés en combinaison avec des insecticides chimiques.
Par exemple, le virus de polyédrose nucléaire de la mite de l'orgyie du sapin de Douglas est un organisme pathogène microbien pour les insectes et il
est utile pour combattre la mite de l'orgyie. De même, la bactérie Bacillus thuringiensis, qui est
une bactérie formatrice de spores, est un organisme pathogène microbien bien connu pour les insectes et elle est utile contre de nombreux insectes qui mâchent les feuilles à leurs stades larvaires, par exemple, les chenilles de la luzerne, le sphinx de la tomate, le sphinx du tabac, les arpenteuses du chou, les tisseuses du chou, les chenilles de la leucanie, les orgyies Porthetria dispar, les chenilles des noix, les plutelles, les coléoptères verts cosmopolites, les térébrants eu-ropéens des céréales et d'autres membres de l'ordre des lépidoptères.
Malheureusement, l'efficacité et l'utilité de nombreux organismes pathogènes microbiens en tant qu'insecticides sont fortement limitées sur le terrain par suite de leur sensibilité extrême à la lumière solaire. Par exemple, on sait qu'un des problèmes se posant lors de l'utilisation de la bactérie Bacillus thuringiensis comme insecticide, réside dans sa courte période d'efficacité et d'utilité sur le
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nisme est neutralisé par l'action de la lumière solaire. On sait également que les radiations non ionisantes ayant une haute énergie photonique (par exemple, les rayons ultraviolets) exercent un effet neutralisant sur la bactérie Bacillus thuringiensis,
(Voir "Photoprotection Against Inactivation of Bacillus thuringiensis Spores by Ultraviolet Rays",
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volume 25, pages 267-268 (1975)). En particulier,
on sait que des rayons ultraviolets d'une longueur d'onde de 253,7 nm sont la cause d'une neutralisation nette et extraordinaire des spores de Bacillus thuringiensis, si bien que ces spores ne
peuvent ni germer ni croître. Une dose
de 18 m W sec/cm2 de ces radiations d'une longueur d'onde de 253,7 nm neutralise 99,9% des spores de Bacillus thuringiensis. Toutefois, étant donné que les rayons ultraviolets ayant des longueurs d'onde inférieures à environ 285 nm n'atteignent pas la surface de la terre, cette neutralisation à une longueur d'onde de 253,7 nm n'entre guère en considération sur le terrain.
La Demanderesse a déterminé que la demivie de la bactérie Bacillus thuringiensis soumise à la lumière solaire était d'environ 6 minutes. De même, d'autres chercheurs ont déterminé que les demivies de certains virus occlus soumis à la lumière solaire, se situaient entre une demi-heure et une heure. Dès lors, l'efficacité d'une application spécifique de ces insecticides microbiens par pulvérisation est rapidement annihilée sur le terrain.
Etant donné que les acides nucléiques ont un maximum d'extinction proche d'une longueur d'onde de 260 nm, d'autres chercheurs ont suggéré que la mortalité de la bactérie Bacillus thuringiensis sous l'effet de rayons ultraviolets à une longueur d'onde de 253,7 nm, ainsi que de certains virus occlus à des longueurs d'onde comparables, pouvait être la résultante d'une photoréaction de la matière génétique,
en particulier, de l'acide désoxyribonucléi que. Dès lors, il a été suggéré (ibid., page 267) que les spores de la bactérie Bacillus thuringiensis pouvaient être protégées contre la neutralisation par ces ray-
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ment les spores de Bacillus thurin�iensis avec l'acide désoxyribonucléique ou un acide nucléique comparable ayant pour effet d'absorber les rayons ultraviolets. Cet acide nucléique comparable pourrait être l'acide ribonucléique ayant un maximum d'extinction proche
de 260 nm. Toutefois, cette technique s'est avérée
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étant donné que des longueurs d'onde inférieures à environ 285 nm n'atteignent pas la surface de la terre, on n'a pas encore pu prouver l'utilité de l'acide désoxyribonucléique ou de l'acide ribonucléique en tant qu'agent protecteur contre la neutralisation provoquée par la lumière solaire (c'est-à-dire à des longueurs d'onde supérieures à environ 285 nm).
La présente invention concerne une composition insecticide microbienne, de même que des pro-
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comprend un organisme pathogène microbien pour les insectes, cet organisme étant d'origine virale, bactérienne ou fongique en étant également susceptible de subir une neutralisation provoquée par la lumière solaire, cet organisme pathogène étant enrobé dans une perle microscopique d'un produit de coacervation, constituée d'un acide nucléique, plus spécifiquement l'acide ribonucléique, ainsi que d'une matière protéique, afin que la structure de cette perle microscopique elle-même protège efficacement l'organisme pathogène contre la neutralisation provoquée par la lumière solaire. Cette perle microscopique est spécifiquement stabilisée par réticulation chimique.
Un procédé spécifique de préparation de cette composition insecticide microbienne comprend les étapes consistant à : (a) préparer un mélange pâteux comprenant (i) des particules d'un acide nucléique, (ii) des particules d'une matière protéique,
(iii) des organismes pathogènes microbiens vis-à-vis des insectes et d'origine virale, bactérienne ou fongique et (iv) de l'eau en une quantité suffisante pour humidifier (c'est-à-dire hydrater) pratiquement tout le mélange ; et (b) agiter ce mélange pâteux
de façon à le diviser en perles microscopiques distinctes. enrobant ainsi les organismes pathogènes microbiens pour les insectes dans ces perles microscopiques. De préférence, ces perles microscopiques distinctes sont stabilisées par traitement avec un agent de réticulation chimique tel que l'acide tannique, le glut araldéhyde ou un agent analogue. Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, l'agitation du mélange pâteux a lieu dans une solution contenant cet agent de réticulation chimique.
Un autre procédé spécifique pour la préparation de la composition de l'invention comprend les étapes consistant à : (a) préparer une solution aqueu-
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solution aqueuse contenant une matière protéique ,
(c) préparer une suspension aqueuse d'organismes pathogènes microbiens pour les insectes à charge superficielle fortement positive ou négative ; et
(d) mélanger les solutions aqueuses et la suspension préparées respectivement dans les étapes (a), (b) et
(c), formant ainsi spontanément des perles microscopiques dans lesquelles sont enrobés les organismes pathogènes pour les insectes. Dans une forme de réalisation préférée, on mélange tout d'abord la suspension préparée lors de l'étape (c) avec la solution préparée lors de l'étape (a), puis on malaxe ce mélange avec la solution préparée lors de l'étape (b). Dans une autre forme de réalisation préférée, on <EMI ID=8.1>
(b), puis on malaxe ce mélange avec la solution préparée lors de l'étape (a).
Spécifiquement, la charge superficielle
des organismes pathogènes est rendue fortement négative ou fortement positive en ajoutant un agent modificateur de protéinesà une suspension aqueuse tamponnée des organismes pathogènes. Les perles microscopiques sont spécifiquement réticulées.
La présente invention concerne également
un procédé en vue de combattre les insectes parasites dans les zones infestées par ces derniers, ce procédé consistant spécifiquement à appliquer une quantité efficace de la composition insecticide décrite cidessus aux zones infestées par ces insectes.
De plus, la présente invention concerne la composition insecticide préparée par les procédés décrite ci-dessus.
Dans les dessins annexés .
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densité optique (dans la gamme de l'ultraviolet solaire et de la lumière visible)
de deux types spécifiques de perles microscopiques pouvant être utilisées suivant la présente invention ;
les figures 2 à 12 sont des graphiques montrant les résultats expérimentaux comparatifs des exemples 1, 2 et 4-12 ci-après respectivement , dans les figures 2-4, le nombre de spores viables, extrapolé à 1 ml de l'échantillon initial, est représenté en fonction du temps d'exposition aux rayons ultraviolets ; dans les figures 5, 6 et 8, on indique le pourcentage de microbes survivants en fonction du temps d'exposition ; dans les figures 7 et 10, on indique le nombre de spores viables par filtre en fonction du temps d'exposition, tandis que les figures
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en fonction du temps d'exposition.
Suivant la présente invention, des organismes pathogènes microbiens vis-à-vis des insectes, d'origine virale, bactérienne ou fongique et susceptibles de subir une neutralisation provoquée par la lumière solaire, sont enrobés dans des perles microscopiques d'un produit de coacervation, ces perles étant constituées d'un acide nucléique, plus spécifi-
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matière protéique. La Demanderesse a trouvé que ces perles microscopiques assuraient une excellente protection des organismes pathogènes vis-à-vis de la neutralisation provoquée par la lumière solaire. Ces perles microscopiques font office de blindages protecteurs interceptant et bloquant les radiations ayant des longueurs d'onde nuisibles (c'est-à-dire les longueurs d'onde de.la lumière solaire ayant tendance à neutraliser l'organisme pathogène) avant que ces radia-tions n'atteignent la matière photosensible de l'organisme pathogène pour les insectes.
La Demanderesse est parvenue à enrober efficacement, dans les perles microscopiques de la présente invention, les cristaux de toxines, les spores et les cellules de Bacillus thuringiensis., du virus de la polyédrose nucléaire Au�o�rapha californica et du virus de la polyédrose nucléaire de la mite d'orgyie du sapin de Douglas, de même que les cellules bactériennes végétatives suivantes : Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens et Escherichia coli. Partant de là, on pense que n'importe quel organisme pathogène microbien vis-à-vis des insectes (qu'il soit d'origine virale, bactérienne ou fongique, y compris, mais sans aucune limitation, les organismes pathogènes vis-à-vis des insectes qui ont été décrits dans "Microbial Control of Insects and Mites", H.D. Burges et N.W.
Hussey, Eds, Académie Press, 1971), peut être efficacement enrobé dans les perles microscopiques
de la présente invention. De plus, sur la base des résultats expérimentaux repris dans les exemples ciaprès, il n'y a guère de doute quant au fait que n'importe quel organisme pathogène vis-à-vis des insectes, enrobé dans ces perles microscopiques, sera protégé contre la neutralisation provoquée par la lumière solaire.
Différentes matières protéiques peuvent être utilisées en combinaison avec l'acide nucléique pour former les perles microscopiques suivant l'organisme pathogène spécifique (vis-à-vis des insectes) que l'on veut protéger et le système de perles microscopiques que l'on veut employer, notamment (mais sans aucune limitation) : la protamine, le cytochrome c,
la protéine de soya, l'hémoglobine, la gélatine, les polymères d'acides aminés synthétiques, etc. En
règle générale, on peut utiliser n'importe quelle matière protéique pour autant que les conditions soient réglées afin de faciliter la formation des perles microscopiques. Parmi ces conditions, on peut mentionner les techniques de modification de charge, les réglages du pH, les concentrations des composants, etc.
Les perles microscopiques dans lesquelles les organismes pathogènes microbiens vis-à-vis des insectes sont enrobés, peuvent être avantageusement formées en adoptant des techniques connues pour la formation de ce que l'on appelle des perles microscopiques ou des gouttelettes d'un produit de coacervation. Une de ces techniques a été mise au point lors de l'étude des origines de la vie sur terre et elle a été adoptée pour construire des modèles précellulaires (voir, par exemple, Evreinova et al.,
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tion aqueuse contenant une matière protéique appropriée, on mélange une solution aqueuse contenant un acide nucléique (de préférence, l'acide ribonucléique) et, au besoin, un agent tampon (par exemple, le phosphate de sodium ou l'acétate de sodium) conçu pour maintenir le pH à une valeur optimalisant la charge de l'acide nucléique, de la protéine et du microbe, par exemple, vis-à-vis de la valeur pI
(= indice de protection) désirée (à laquelle le microbe est sensible au pH ; cette valeur doit également être prise en considération). Lorsqu'on mélange ces deux solutions, il se forme spontanément des perles microscopiques de protéine/acide nucléique qui sont essentiellement solides et de forme à peu près sphérique. Dans la spécification ci-après, la technique décrite ci-dessus sera appelée "technique de formulation de solutions", tandis que les perles microscopiques obtenues selon cette technique seront appelées t'perles microscopiques de formulation de solutions".
Dans une forme de réalisation tout aussi préférée de l'invention, les perles microscopiques dans lesquelles sont enrobés les organismes pathogènes microbiens vis-à-vis des insectes, peuvent être formées en adoptant une nouvelle technique qui a été élaborée par la Demanderesse. Dans la spécification ci-après, cette nouvelle technique sera appelée "technique de formulation de pâte" et les perles microscopiques formées selon cette technique seront appelées "perles microscopiques de formulation de pâte".
Suivant cette nouvelle technique de formulation de pâte, on prépare un mélange pâteux comprenant des particules d'un acide nucléique (de préférence, l'acide ribonucléique), des particules d'une matière protéique et de l'eau en une quantité suffisante pour humidifier pratiquement tout le mélange, après quoi on agite ce mélange pâteux de façon à diviser le mélange en perles microscopiques distinctes. Cette agitation peut être effectuée par des techniques classiques, par exemple, par agitation ou mélange rapide (dans un mélangeur classique), par sonication, par secousses, par extrusion sous pression, etc.
Afin de faciliter la division du mélange en perles microscopiques distinctes, dans certaines formes de réalisation, il peut être souhaitable d'extruder le mélange pâteux en filaments, en pastilles, etc., avant l'agitation. Il est généralement préférable de stabiliser les perles microscopiques distinctes par traitement avec un agent de réticulation chimique (par exemple, l'acide tannique, etc.) pendant ou après l'agitation. Toutefois, la réticulation peut être superflue si la stabilisation peut être effectuée
par d'autres moyens, par exemple, par lyophilisation.
En ce qui concerne la technique de formulation de solutions et, dans une certaine mesure, la technique de formulation de pâtes,il est à noter que, bien que toutes les matières protéiques précitées, ainsi que d'autres puissent être utilisées de manière satisfaisante pour former les perles microscopiques, il convient néanmoins de maintenir le pH du mélange
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de la protéine particulière devant être utilisée, car cette condition est requise pour la formation des perles microscopiques. Par exemple, lorsqu'on utilise une protamine, il convient de maintenir le pH en dessous d'environ il et, lorsqu'on utilise l'hémoglobine, le pH doit être maintenu en dessous d'environ
7. De plus, si l'on utilise une protéine qui est insoluble à un pH donné, le pH peut devoir être amené dans un intervalle dans lequel la protéine est soluble ou l'on peut être amené à prendre d'autres mesures pour rendre la protéine soluble. Ces mesures pourraient être une dégradation partielle, une modification de charge ou une addition d'autres composants dans les agents tampons (par exemple, des détergents, des alcools, des agents tensio-actifs, etc.). Si la formation de mousse d'un ou de plusieurs composants pose un problème, on peut incorporer des agents du type de la siméthicone (brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 2.441.098).
Lorsqu'on utilise l'acide ribonucléique comme acide nucléique dans la technique de formulation de solutions, le pH du mélange des solutions doit être maintenu à une valeur égale ou supérieure à environ 4,3 afin d'empêcher l'acide ribonucléique de précipiter hors des perles microscopiques, la protéine quittant nécessairement ces dernières pour rentrer dans la solution.
Ainsi qu'on peut le constater, dans les techniques ci-dessus de formulation de solutions et
de pâtes pour la formation de perles microscopiques
(c'est-à-dire des gouttelettes d'un produit de coa-cervation), les matières devant être utilisées pour intercepter et absorber les radiations nuisibles forment la structure des perles microscopiques, créant ainsi un revêtement hautement protecteur,
La structure bimoléculaire des perles microscopiques donne lieu à une coopération thermodynamiquement stable entre les composants si bien que, même sans réticulation chimique ultérieure, comme décrit ci-après, les composants ne se diffuseront pas individuellement hors des perles microscopiques. La structure bimoléculai re donne également lieu à la formation d'une charge élevée sur les perles microscopiques. Ces charges ont pour but de faciliter l'adhérence des perles microscopiques à la surface des plantes. Ces charges peuvent être réglées en choisissant la protéine appropriée qui doit être utilisée pour former les perles microscopiques.
Il a été mentionné que l'on pouvait régler la grosseur des perles microscopiques (formulation de solutions) en réglant la concentration de l'acide nucléique et de la protéine dans le récipient de formation des perles microscopiques. Par exemple, la Demanderesse a déterminé que l'on pouvait former des perles microscopiques d'un diamètre de 100 u par la technique de formulation de solutions en mélangeant un volume égal d'acide ribonucléique à 5% et de sulfate de protamine à 10%. Les perles microscopiques se forment et décantent au fond du récipient. La plupart de ces perles microscopiques ont une granularité se situant aux environs de 100 u.
La Demanderesse a également trouvé que l'on pouvait régler la grosseur des perles microscopiques, dans une certaine mesure, par le degré d'agitation au cours de leur formation, une agitation plus forte donnant des perles microscopiques plus petites. Bien que des perles microscopiques ayant un diamètre effectif se situant dans l'intervalle compris entre environ 10 et environ
200 microns soient appropriées pour la présente invention, il est généralement préférable d'utiliser des perles microscopiques ayant un diamètre effectif se situant dans l'intervalle compris entre environ
40 et environ 100 microns. En règle générale, la grosseur désirée des perles microscopiques sera déterminée par le type de végétation (c'est-à-dire les récoltes, les arbres, etc.) à traiter, ainsi que par le procédé d'application.
Bien que, en règle générale, pour réaliser ces perles microscopiques, on puisse utiliser l'acide nucléique et la matière protéique en concentrations se situant dans un intervalle relativement large, lors de la préparation de perles microscopiques destinées
à être utilisées suivant la présente invention (c'est- <EMI ID=15.1> biens vis-à-vis des insectes), il est préférable d'utiliser l'acide nucléique et la protéine dans un rapport se situant dans l'intervalle compris entre
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Dans les formes de réalisation de l'invention dans lesquelles il est souhaitable d'utiliser les perles microscopiques décrites ci-dessus et résultant de la technique de formulation de solutions, les organismes pathogènes microbiens vis-à-vis des insectes peuvent être enrobés (c'est-à-dire enfermés) dans ces perles microscopiques en les mettant simplement en suspension dans l'eau (au besoin, on peut éventuellement ajouter un agent tampon, par exemple, un phosphate, un acétate, etc., afin de régler le pH), puis en mélangeant cette suspension avec une solution aqueuse contenant l'acide nucléique désiré.
Ensuite, on mélange la suspension obtenue avec la solution aqueuse de protéine décrite ci-dessus et lbrganisme pathogène vient a'enrober spontanément dans.les per-les microscopiques qui. se forment et qui sont constituées d'une matière protéique et d'un acide nucléique.
Comme autre procédé, qui est cependant moins préféré, on peut mélanger tout d'abord la suspension tamponnée de microbes avec la solution de matière protéique, après quoi on mélange la suspension obtenue avec une solution aqueuse contenant l'acide nucléique. On a constaté qu'après l'agitation du récipient dans lequel on avait mélangé les solutions, les perles microscopiques subissaient une coalescence et se reformaient spontanément, des organismes pathogènes supplémentaires venant ainsi habituellement s'enrober dans les perles microscopiques.
Dans les formes de réalisation de l'invention dans lesquelles il est souhaitable d'utiliser les perles microscopiques décrites ci-dessus résultant d'une technique de formulation de pâte, les organismes pathogènes microbiens vis-à-vis des insectes peuvent être enrobés dans les perles microscopiques en les mettant simplement en suspension dans l'eau (comme décrit ci-dessus, on peut, au besoin, ajouter un agent tampon), puis en mélangeant cette suspension avec le mélange de particules d'acide nucléique et de particules de matière protéique
(il faut veiller à utiliser l'eau uniquement en une quantité suffisante pour humidifier le mélange et
lui donner une consistance pâteuse). Ensuite, on agite le mélange pâteux obtenu comme décrit cidessus de façon à le diviser en perles microscopiques distinctes. Comme autre procédé, on peut mélanger les particules d'acide nucléique et les particules de matière protéique avec de l'eau en une quantité suffisante pour humidifier le mélange et
lui conférer une consistance pâteuse, les organismes pathogènes microbiens vis-à-vis des insectes pouvant ensuite être mélangea avec ce mélange pâteux pour être enrobés dans les perles microscopiques distinctes par agitation du mélange comme décrit ci-dessus.
Bien que les perles microscopiques obtenues par les techniques de formulation de solutions et de pâtes décrites ci-dessus possèdent un certain degré de stabilité, il est généralement avantageux d'accroître leur stabilité afin de faciliter la séparation entre les organismes pathogènes enrobés
et les organismes pathogènes non enrobés, tout en facilitant également davantage la manipulation* Cette remarque est particulièrement vraie en ce qui concerne les perles microscopiques résultant d'une technique de formulation de pâte* Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, on effectue cette stabilisation par réticulation chimique des molécules des perles microscopiques en les traitant avec des agents de réticulation tels que, par exemple, l'acide
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esters, le propionate de dithiobissuccimidyle, etc., en adoptant des techniques classiques de réticulation. Si l'on désire utiliser le glutaraldéhyde, il convient
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ou moins ; en effet, la Demanderesse a constaté qu'en augmentant la concentration de glutaraldéhyde, certains organismes pathogènes, en particulier, la bactérie Bacillus thuringiensis, avaient tendance à être neutralisés. On a trouvé que l'acide tannique tam-
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riennes à une concentration de 10% en poids/volume et la Demanderesse pense qu'il est non toxique visà-vis de la plupart des organismes pathogènes microbiens pour les insectes, à des concentrations de 1% en poids/ volume ou moins. Bien que l'on puisse utiliser de l'acide tannique tamponné ayant une concentration se situant dans l'intervalle allant d'environ 0,01
<EMI ID=20.1> concentrations se situant dans l'intervalle allant
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Il est à noter que l'on peut régler assez aisément le degré de réticulation en réglant la durée, la concentration, la température et d'autres conditions de réticulation. Par exemple, on peut régler le degré de réticulation en arrêtant la réaction de réticulation par l'addition d'une petite molécule qui réagit avec l'agent de réticulation (par exemple, une
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le réactif de réticulation en faibles concentrations.
Cette réticulation chimique des perles microscopiques offre plusieurs avantages, notamment :
(1) une stabilisation vis-à-vis des forces de cisaillement créées en appliquant l'insecticide par pulvérisation ; (2) le maintien éventuel de centres fluides à l'intérieur des perles microscopiques ; (3) le maintien éventuel, à l'intérieur des perles microscopiques, d'un pH inférieur à celui du milieu ambiant entourant les perles microscopiques (c'est-à-dire les sucs digestifs alcalins des intestins des insectes) de sorte que l'intérieur des perles microscopiques peut être maintenu à un pH proche du pH optimum pour la viabilité, la conservation, etc., de l'organisme pathogène microbien ;
(4) le contrôle de la position dans les intestins des insectes où l'organisme pathogène est libéré
(c'est-à-dire que, plus la réticulation est forte., plus la libération de l'organisme pathogène s'étendra dans l'intestin et vice-versa),augmentant ainsi l'infectiosité de l'organisme pathogène. En outre, l'utilisation d'acide tannique comme agent de réticulation augmente la densité optique des pelles microscopiques
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une meilleure protection des microbes enrobés contre la neutralisation provoquée par la lumière solaire.
La Demanderesse a également trouvé que l'on pouvait enrober (c'est-à-dire enfermer) l'organisme pathogène microbien vis-à-vis des insectes beaucoup plus aisément et en quantités beaucoup plus grandes dans les perles microscopiques décrites cidessus et résultant d'une technique de formulation de solutions lorsque la charge superficielle globale de cet organisme pathogène est tout d'abord modifiée de façon à la rendre presque totalement (c'est-à-
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tive. La Demanderesse pense qu'il en est également de même en ce qui concerne les perles microscopiques résultant d'une technique de formulation de pâte.
On peut effectuer cette modification de charge superficielle, par exemple, par addition réglée d'un agent modificateur de protéine, par exemple, l'anhydride succinique (pour rendre la charge fortement négative) et des composés semblables (voir, par exemple, Gary E. Means et Robert E. Feeney, "Chemical Modifications of
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faut veiller à choisir un agent modificateur de protéines qui ne neutralise pas ou ne nuit pas à l'organisme pathogène' devant être enrobé. Par exemple, la Demanderesse a trouvé que l'anhydride succinique ne pouvait être utilisé avec des cellules bactériennes végétatives (par exemple, Serratia marsescens, etc.), étant donné qu'il a tendance à neutraliser ces cellules. On peut effectuer une modification en une charge superficielle fortement positive, par exemple, en utilisant de l'acide tannique pour relier des protéines à charge positive (par exemple, une protamine) à la surface de l'organisme pathogène.
Au cours d'études comparatives, la Demanderesse a trouvé qu'en absence de toute modification de charge, environ 1% seulement des spores disponibles de Bacillus thuringiensis étaient enrobées dans les perles microscopi-ques (formulations de solutions) et qu'en utilisant des spores de Bacillus thuringiensis à charge superficielle fortement négative (traitement à l'anhydri-
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spores de Bacillus thuringiensis enrobées dans les perles microscopiques et qu'en utilisant des spores de Bacillus thuringiensis à charge superficielle fortement positive (traitement à l'acide tannique, puis au sulfate de protamine), on obtenait environ
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dans les perles microscopiques. On peut accroître l'efficacité de ces techniques de modification de charge en lavant tout d'abord l'organisme pathogène microbien pour les insectes et, dans certaines formes de réalisation, il peut être souhaitable d'effectuer un lavage dans des solutions organique (par exemple, une solution éthanolique à 60% en poids) et inorganique (par exemple, une solution de chlorure de sodium 1M) séparées, pour autant que l'organisme pathogène utilisé ne soit pas sensible à ces matières. La Demanderesse a trouvé qu'avant d'essayer d'appliquer l'une ou l'autre des techniques de modification de charge décrites ci-dessus à des virus d'insectes, il était généralement préférable de purifier les virus (par exemple, par centrifugation, par filtration, etc.) afin d'éliminer les débris d'insectes.
Etant donné que l'organisme pathogène dont on a modifié la charge, entre apparemment en compétition avec le composant de même charge de la perle microscopique pour les positions occupées dans celle-ci, il peut être nécessaire de réduire la concentration de ce composant de même charge à une
valeur facilitant l'incorporation de l'organisme pathogène dans la perle microscopique. Par exemple, s'il est souhaitable d'enfermer, dans une perle microscopique d'acide ribonucléique/protéines du type décrit ci-dessus, des organismes pathogènes microbiens (pour les insectes) qui ont été modifiés en une charge superficielle fortement négative, il peut être nécessaire de réduire légèrement la concentration de la solution d'acide ribonucléique (l'acide ribonucléique est également chargé négativement) avant de la mélanger avec la solution de protéine.
De même, dans un système de perles microscopiques de ce type., si la charge superficielle de l'organisme pathogène a été modifiée en une charge superficielle fortement positive, il peut alors être nécessaire de réduire légèrement la concentration de la solution de protéine (la protéine est chargée positivement) avant de la mélanger avec la solution d'acide ribonucléique. Ce dernier système peut être plus intéressant pour l'objet de la présente invention, étant donné qu'il ne nécessite pas une réduction de là quantité de la matière absorbant les radiations (c'est-à-dire l'acide ribonucléique).
Etant donné qu'un objet principal de la présente invention est de protéger les organismes pathogènes photosensibles microbiens pour les insectes contre la neutralisation par les radiations nuisibles du soleil, lors du choix des matières devant être utilisées pour la formulation des perles microscopiques, il est évidemment important de choisir des matières absorbant et/ou réfléchissant fortement
ces radiations nuisibles. Parmi les matières qu'il est préférable d'utiliser pour réaliser les perles microscopiques, il y a l'acide ribonucléique et une matière protéique telle que, par exemple, l'hémoglobine, une protamine ou un polymère d'acide aminé synthétique. La figure 1 des dessins annexés illustre la densité optique (c'est-à-dire l'absorption + la réflexion) des perles microscopiques constituées d'acide ribonucléique et d'une protamine, ces perles étant réalisées conformément à la technique de formulation de solutions décrite ci-dessus. La ligne en trait plein de la figure 1 se rapporte à la densité optique d'une solution de perles microscopiques obtenue en combinant des volumes égaux d'acide ribonucléi-
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du glutaraldéhyde) dans la gamme de l'ultraviolet solaire. La ligne en traits discontinus de la figure 1 se rapporte à la densité optique d'une solution de perles microscopiques obtenue en combinant des volumes égaux d'acide ribonucléique à 0,67% et d'une protamine à 1% (réticulée avec l'acide tannique) dans la gamme de l'ultraviolet solaire et de la lumière visible (jusqu'à 600 nm).
Dans de nombreux cas, la présence d'un acide nucléique dans une perle microscopique offre
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bon nombre de microbes, la détérioration provoquée par la lumière solaire à des longueurs d'onde supérieures à 313 nm était principalement due à la réaction des acides nucléiques des microbes avec des radicaux libres (on pense que la détérioration de la
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son tour, forme des radicaux libres). L'acide nucléique présent dans la structure des perles microscopiques a tendance à réagir spécifiquement avec les ra-
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raient avec les acides nucléiques des microbes, empêchant ainsi toute détérioration.
Etant donné que l'effet pathogène de l'agent microbien ne peut s'exercer aussi longtemps que cet agent reste enrobé dans les perles microscopiques, des précautions doivent être prises dans le choix des matières devant être utilisées pour la formulation de ces perles microscopiques, afin de sélectionner les matières permettant la libération de cet agent après l'ingestion' des perles microscopiques par l'insecte, Bien que l'on puisse choisir d'autres matières, la Demanderesse a trouvé que des perles microscopiques constituées d'une protéine et d'un acide nucléique (par exemple, l'acide ribonucléique) possédaient des caractéristiques de libération très satisfaisantes.
Après l'ingestion des perles microscopiques par l'insecte, les perles microscopiques sont attaquées par les protéases et les nucléases des voies digestives de l'insecte (c'est-à-dire l'intestin), conduisant ainsi à la libération du microbe.
Dès lors, il importe de choisir, pour les perles microscopiques, des matières ne résistant pas à ce type d'attaque. La Demanderesse a trouvé qu'en incubant la bactérie Bacillus thuringiensis (cellules, spores et cristaux de toxines) enrobée dans des perles microscopiques constituées d'acide ribonucléique et d'une protamine (ces perles étant obtenues conformément à la technique de formulation de solutions décrite ci-dessus) à la température ambiante et en présence des sucs digestifs des insectes, la libération de cette bactérie Bacillus thuringiensis commençait au bout de quelques minutes, la libération progressive et complète ayant lieu dans la demi-heure
<EMI ID=32.1>
La Demanderesse a également trouvé qu'en incubant la bactérie Bacillus thuringiensis enrobée dans des perles microscopiques constituées d'acide ribonucléique et d'une protamine (ces perles étant obtenues conformément à la technique décrite cidessus) à la température ambiante et en présence d'acides aminés et/ou de sucres tels que ceux que l'on trouve dans les voies digestives des insectes,
<EMI ID=33.1>
les perles microscopiques en deux heures environ.
Cette dissolution ne se produit pas dans l'eau ou dans un tampon seul, si bien que les perles microscopiques restent alors intactes à la surface des feuilles.
De plus, les résultats expérimentaux repris dans-les figures 9, 11 et 12 indiquent que les virus de la polyédrose nucléaire de la mite d'orgyie du sapin de Douglas et les virus de la polyédrose nucléaire Auto�rapha californica enrobés dans les perles microscopiques de la présente invention étaient, en fait, libérés dans l'intestin des insectes et
qu'en étant libérés de la sorte, ils exerçaient l'effet mortel désiré.
Il est à noter que la présente invention peut être adoptée pour n'importe quel organisme pathogène microbien photosensible pour les insectes, y compris les organismes pathogènes d'origine virale,
<EMI ID=34.1>
ci-après illustrent la possibilité d'appliquer la présente invention à des bactéries spécifiques formatrices de spores (c'est-à-dire les cellules, les spores et les cristaux de toxines de Bacillus thuringien-
<EMI ID=35.1>
sibilité d'appliquer la présente invention à trois espèces de cellules bactériennes végétatives. L'exemple 6 ci-après illustre la possibilité d'appliquer la présente invention à un virus bactérien. Les résul-
<EMI ID=36.1>
présente invention peut être adoptée pour protéger des virus d'insectes non occlus contre la neutralisation provoquée par la lumière solaire. Les exemples 9, 11 et 12 illustrent la possibilité d'appliquer la présente invention à deux espèces de virus d'insectes occlus.
Dans les exemples ci-après et les figures annexées, les organismes pathogènes microbiens pour les insectes qui sont dénommée et/ou désignés par <EMI ID=37.1>
gènes qui n'ont pas été enrobés dans des perle* microscopiques. Dans chaque exemple, les organismes pathogènes "non protégés" ont été soumis à un traitement,, à une exposition et à un essai de viabilité d'une manière aussi identique que possible à celle adoptée pour les organismes pathogènes qui ont été enrobée dans des perles microscopiques (c'est-à-dire que les organismes pathogènes "non protégés" constituent des témoins).
Possibilité d'application industrielle
Les exemples ci-après illustrent différentes formes de réalisation de la présente invention. Il est entendu que ces exemples et la description ci- dessus des formes de réalisation préférées, de même que les figures annexées doivent être interprétés simplement à titre d'illustration et sans aucun caractère limitatif.
Exemple 1
<EMI ID=38.1>
<EMI ID=39.1>
spores et les corps asporulés (cristallins), que l'on obtient à partir d'une culture de milieu de sporula-
<EMI ID=40.1>
1,5 ml d'une solution aqueuse tamponnée à 1,34% (en poids) d'acide ribonucléique de levure (qualité B de
<EMI ID=41.1>
mélange 0,4 ml de cette suspension dans 1,9 ml d'une solution aqueuse tamponnée à 0,36% (en poids) de sulfate de protamine (qualité B de "Sigma").
Il se forme spontanément des perles microscopiques d'acide ribonucléique/protamine renfermant chacune certaines cellules bactériennes et/ou des spores et/ou des corps asporulés. En agitant le mélange, il se produit une division avec reforma-tion spontanée ultérieure de perles microscopiques supplémentaires. On dépose ces perles microscopiques dans une boîte de Petri en verre et on les ex-
<EMI ID=42.1>
"General Electric". On dépose les boîtes de Petri sur un agitateur rotatif à une distance de 78 cm en dessous de la lampe et on les agite à 40 tours/minute.
On détermine la viabilité par dépôt en plaques sur un milieu d'agar-agar/infusion cerveau-coeur de "Difco".
Lors d'une exposition à des radiations ultraviolettes germicides (radiations maximum à
254 nm) suffisantes pour tuer 99,99% de n'importe quelle forme de bactérie Bacillus thuringiensis
non protégée, presque toutes les bactéries Bacillus thuringiensis qui ont été enrobées dans les perles microscopiques (c'est-à-dire les cellules bactériennes et/ou les spores et/ou les corps asporulés protégés) survivent. Cette caractéristique est illustrée en figure 2. On pense que la mortalité prématurée représentée par la ligne indiquée par "Bacillus thu-
<EMI ID=43.1>
de bactérie Bacillus thuringiensis réellement enrobée dans les perles microscopiques. Au microscope, on observe que le pourcentage de bactérie Bacillus thuringiensis réellement enrobée se situe dans l'inter-
<EMI ID=44.1>
Exemple 2
On prépare des perles microscopiques dans lesquelles est enrobée la bactérie Bacillus thuringiensis, comme décrit à l'exemple 1, puis on ajoute 1 mg/ml de propionate de dithiobissuccimidyle dans du diméthylsulfoxyde afin de réticuler et de stabiliser les perles microscopiques. On dépose 0,2 ml
<EMI ID=45.1> agitation, on lave les filtres dans un tampon de dilution et on les dépose en plaques comme décrit à l'exemple 1.
Les résultats de ce procédé sont indiqués en figure 3.
Exemple 3
On lave tout d'abord 1 x 109 spores de Bacillus thuringiensis que l'on obtient par culture dans
un milieu de sporulation, dans une solution éthanolique à 60%, puis on les lave dans une solution de NaCl 1M, la bactérie Bacillus thuringiensis étant séparée
de ces solutions de lavage par centrifugation. Ensuite, on met la bactérie Bacillus thuringiensis
lavée en suspension dans 20 ml d'une solution tampon
<EMI ID=46.1>
Ensuite, à cette suspension, on ajoute de l'anhydride succinique sec (agent modificateur de pro-
<EMI ID=47.1>
ml chacune. On effectue les additions sous agitation constante et, entre chaque addition, on agite le mélange pendant 10 minutes. On maintient le pH à 8 + 0,1 par addition de NaOH. Lorsque la réaction est achevée (le pH ne change plus), on sépare la bactérie Bacillus thuringiensis (par centrifugation) et on la lave. Ensuite, on incorpore cette bactérie Bacillus thuringiensis modifiée (à change négative) dans des perles microscopiques d'acide ribonucléique/protamine conformément aux procédés décrits à l'exemple 1, après quoi on réticule ces perles microscopiques comme décrit à l'exemple 2.
On constate que cette bactérie Bacillus thuringiensis modifiée pénètre dans les perles microscopiques beaucoup plus aisément et en nombres beaucoup plus élevés que la bactérie Bacillus thuringiensis non modifiée utilisée dans les exemples 1 et 2 et ce, probablement du fait que la charge superficielle de la bactérie Bacillus thuringiensis est modifiée d'une charge neutre en une charge négative..
Exemple 4
Comme décrit à l'exemple 1, on soumet une solution de bactérie Bacillus thuringiensis non protégée (cellules, spores et cristaux de toxines) et de bactérie Bacillus thuringiensis protégée (c'est-à-dire enrobée dans des perles microscopiques comme décrit
<EMI ID=48.1>
rie non protégée et 40% de bactérie protégée ; valeurs déterminées au microscope) à des radiations de 254 nm.
Essentiellement aucune des spores non protégées ne reste viable après avoir subi cette irradiation pendant 15 minutes, tandis que 1 x 106 spores protégées (c'est-à-dire 40% du mélange initial total) restent viables après avoir subi cette irradiation pendant 1 heure. On détermine la viabilité comme décrit à l'exemple 1. Les résultats de cette expérience sont repris dans la figure 4.
Exemple 5
On met une concentration de 1 x 109 spores de Bacillus thuringiensis (y compris des cellules, des spores et des cristaux asporulés) en suspension dans
10 ml d'un tampon de phosphate 0,15N à un pH de 7,5
(on obtient la préparation de Bacillus thuringiensis
et on la modifie comme décrit à l'exemple 3). On
<EMI ID=49.1>
biochem") dans cette suspension et on mélange en malaxant vigoureusement dans un dispositif de mélange à tourbillon ( "Vortex"). Ensuite, on ajoute cette suspension à une solution tamponnée à 10% de sulfate de protamine (% en poids, qualité B, "Calbiochem." et on agite vigoureusement pendant 5 secondes. A cette solution, on ajoute du glutaraldéhyde (25%) de "Sigma") jusqu'à une concentration finale de
0,15% (en volume). Après 30 minutes, il se forme, au fond du tube, une pastille constituée de grosses per-
<EMI ID=50.1> surnageant et on remet la pastille en suspension jusqu'à un volume final de 20 ml par agitation. On dépose
<EMI ID=51.1>
la sèche pendant une nuit sous vide. On expose les filtres à la lumière solaire (à 13 heures ; teneur en humidité relative : 23% ; température : 31,7[deg.]C). Ensuite, on lave les filtres dans un tampon d'acétate
(0,15N, pH : 4) pour diviser les perles micros copiques et libérer la bactérie Bacillus thurin�iensis que l'on dépose en plaques comme décrit 3 l'exemple 1.
Les résultats de cette expérience sont
<EMI ID=52.1>
non protégées sont tuées après 30 minutes,
Exemple 6
Cet exemple a pour but de démontrer la protection d'un virus conformément à la présente invention. Les réactions et les réponses d'un virus d'insecte et d'un virus bactérien (que l'on appelle bactériophage) doivent être semblables, étant donné qu'ils sont tous deux constitués fondamentalement d'un acide nucléique dans un enrobage protéique. En conséquence, on a choisi de modeler le système de l'invention sur le virus bactérien E. coli, bactériophage T-4.
On laisse croître des bactériophages T-4
<EMI ID=53.1>
lon P). On inocule E. coli BB dans 100 ml du bouillon P et on le laisse croître pendant une nuit. Le lendemain matin, on procède à une dilution de 1:100 pour obtenir un bouillon frais et on laisse se dérouler la croissance pendant une heure. A cette culture de
<EMI ID=54.1>
bactériophages et on laisse croître pendant 6 heures
(37[deg.]C, agitation rapide). Au terme de cette période, on ajoute 5 gouttes de chloroforme pour tuer toutes
<EMI ID=55.1>
de la souche de bactériophages.
On prépare des perles microscopiques en mé-
<EMI ID=56.1>
"Calbiochem") dans 10 mi de la souche de bactériophages. On ajoute cette suspension à de l'acide ribonucléi-
<EMI ID=57.1>
copiques se forment spontanément. On effectue l'exposition aux rayons ultraviolets comme décrit à l'exemple 1. On prélève des échantillons à des moments déterminés et on procède à des dilutions dans le bouillon P. On détermine les bactériophages viables par le procédé décrit dans la référence suivante : Grace C. Rovozzo et Carroll N. Burk, "A Manual of Basic Virolo�ical Techniques" . Prentice-Hall Biological Techniques Series, 1973, page 168, en utilisant un milieu d'agar-agar et de bouillon P, ainsi que E. coli BB comme bactérie indicatrice.
Les résultats de cette expérience sont
<EMI ID=58.1>
virus non protégés sont tous tués au bout d'environ 5 minutes. D'autre part, après une chute initiale analogue à celle observée dans les essais bactériens, le virus qui a été enrobé dans les perles microscopiques, manifeste une forte résistance à la lumièreultraviolette (environ 40% des virus sont protégés contre la neutralisation).
Exemple 7
On prépare des perles microscopiques dans
<EMI ID=59.1>
me décrit à l'exemple 3, avec cette exception que l'on n'utilise pas du propionate de dithiobissuccimidyle dans du diméthylsulfoxyde pour réticuler les perles mi croscopiques. Dans cet exemple, on réticule et stabilise les perles microscopiques en ajoutant,
à la suspension de ces perles, 1% en poids/volume d'acide tannique tamponné par un phosphate et en laissant reposer à la température ambiante pendant environ 30 minutes. On dilue la suspension des perles microscopiques réticulées avec un tampon de dilution (phosphate) de façon à obtenir une suspension diluée contenant environ 100 spores par ml, tandis que l'on introduit des échantillons de 1 ml de cette suspension diluée dans des filtres "Milli-
<EMI ID=60.1>
en laissant sécher pendant une nuit. On expose les filtres sous une lampe solaire de "General Electric"
à 1.572 watts/m2 à une distance de 381 mm, cette lampe émettant des radiations d'une longueur d'onde se situant dans l'intervalle allant d'environ 290 nm à 400 nm.
Une heure d'exposition sous cette lampe solaire équivaut à environ 151 heures sous la lumière solaire directe d'un jour du mois de juillet à un endroit
<EMI ID=61.1>
15 jours). Après exposition, on dépose directement les spores sur une plaque d'agar-agar de numération et, après incubation pendant 24 heures, on compte les colonies croissant sur les filtres. Les résultats expérimentaux sont repris en figure 7'
Exemple 8
<EMI ID=62.1>
on traite des cellules bactériennes végétatives des espèces Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens et Escherichia coli avec de l'anhydride succinique
<EMI ID=63.1>
solution tampon de carbonate 1M (pH 8), puis en ajoutant
50 mg d'anhydride succinique. On ne maintient pas le
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<EMI ID=65.1>
térienne au cours de la récolte et du lavage. A nouveau dans des essais séparés� on met les cellules des trois espèces traitées à l'anhydride succinique en suspension dans 4 ml d'une solution tampon de phos- <EMI ID=66.1>
cette suspension avec 1 ml d'une solution tamponnée d'acide ribonucléique à 1,34% en poids/volume (de "Sigma"), On mélange la suspension obtenue avec 2 ml
<EMI ID=67.1>
volume (de "Calbiochem."), formant ainsi spontanément les perles microscopiques, après quoi on ajoute 0,4 ml d'une solution d'acide tannique à 10% (en poids/volume) à la suspension des perles microscopiques. (Remarque:
.le tampon mentionné ci-dessus est une solution tampon <EMI ID=68.1>
la suspension de perles microscopiques dans l'acide tannique pendant 30 minutes à la température ambiante, puis on la lave trois fois dans la solution tampon de phosphate décrite ci-dessus, par centrifugation. L'observation au microscope révèle qu'environ 30% de chacune des trois espèces soumises aux essais sont enrobées dans les perles microscopiques.
On expose séparément les suspensions des perles microscopiques obtenues dans les trois séries d'expériences sous la lampe solaire de "General Electric" décrite à l'exemple 7 en, adoptant le procédé expérimental décrit à l'exemple 1 (c'est-à-dire exposition sur un agitateur rotatif), avec cette exception que la suspension contient un plus grand nombre
de perles microscopiques. La figure 8 donne les résultats d'un essai représentatif pratiqué sur les cellules
<EMI ID=69.1>
pratiqués sur les cellules bactériennes Serratia marcenscens et Escherichia coli (non représentées) sont analogues à ceux illustrés en figure 8.
Toutefois, il est à noter qu'en effectuant des expériences à la suite desquelles on a obtenu les résultats repris en figure 8, il est à supposer que n'importe quelle cellule bactérienne de la suspension de perles microscopiques, qui n'a pas été enrobée dans ces dernières, est tuée au cours de l'exposition de cette suspension sur l'agitateur rotatif, Afin de vérifier l'exactitude de cette hypothèse, on a effectué une deuxième expérience témoin (en plus du témoin indiqué en figure 8).
Lors de cette deuxième expérience témoin, on a traité des spores de Bacillus thuringiensis comme décrit ci-dessus, avec cette exception qu'on ne les a pas enrobées dans des perles microscopiques, mais qu'on les a simplement mélangées dans une suspension contenant des perles microscopiques déjà formées (en utilisant à peu près le même nombre de perles microscopiques que dans les expériences décrites ci-dessus), après quoi on a exposé ce mélange sous la lampe solaire décrite ci-dessus. Si cette hypothèse est correcte, la plupart des cellules doivent alors être tuées. Toutefois, on a trouvé que les cellules étaient tuées à peu près au même rythme que les cellules qui avaient été enrobées dans les perles microscopiques.
On attribue cette caractéristique au nombre relativement important de perles microscopiques présentes dans les suspensions qui ont été exposées (c'est-à-dire que les suspensions de perles microscopiques étaient trop épaisses). On pense que le grand nombre de perles microscopiques présentes réduit le mouvement des cellules situées à l'extérieur de ces perles, si bien que les cellules se trouvant éventuellement en dessous d'une perle microscopique, y restent essentiellement tout
au long de l'exposition en étant ainsi protégées.
<EMI ID=70.1>
xième expérience témoin, démontre que les perles microscopiques protègent les cellules contre la neutralisation provoquée par la lumière solaire (que les cellules soient dans ou à l'extérieur des perles microscopiques, mais en dessous). De même, comme on l'a indiqué ci-dessus, l'observation au microscope révèle que les cellules de chacune des trois espèces bactériennes soumises aux essais ont été enrobées dans les perles microscopiques.
Exemple 9
<EMI ID=71.1>
de la mite de l'orgyie du sapin de Douglas en suspension
<EMI ID=72.1>
et en procède à un traitement avec six additions de
50 mg d'anhydride succinique. On utilise du NaOH IN
<EMI ID=73.1>
récolte la suspension de virus par centrifugation et
<EMI ID=74.1>
pour la remettre ensuite en suspension dans 1 ml du tampon. On traite ensuite cette suspension comme décrit à l'exemple 8 pour former des perles microscopiques réticulées dans lesquelles sont enrobés les virus.
On expose la suspension sous la lampe solaire de "General Electric" décrite à l'exemple 8, puis on la dilue avec le tampon et on la soumet à un essai d'inf ectiosité comme décrit à l'exemple 12. Les résultats d'in-
<EMI ID=75.1>
présentent la même erreur que celle décrite à l'exemple 8 (c'est-à-dire que la suspension de perles microscopiques qui a été soumise à 1 'exposition, est trop épaisse pour tuer les virus qui n'ont pas été enrobés dans les perles microscopiques). Toutefois, comme indiqué à l'exemple 8, l'observation au microscope révèle qu'environ 30% des virus ont été enrobés dans les perles microscopiques et que ces dernières ont assuré une protection contre la neutralisation provoquée par
la lumière solaire (que les virus soient à l'intérieur ou à l'extérieur des perles microscopiques, mais en dessous).
Exemple 10
On mélange 1 g d'hémoglobine (en poudre
<EMI ID=76.1>
d'une poudre.sèche, On met environ 1 x 109 spores
<EMI ID=77.1> solution tampon (acétate 0,15N, pH 5), puis on ajoute la suspension ainsi obtenue au mélange d'acide ribonucléique et d'hémoglobine. On ajoute une solution tampon supplémentaire en une quantité suffisante pour former une masse hydratée (c'est-à-dire humide) ayant une consistance pâteuse. La quantité totale de solution tampon mélangée avec le mélange d'acide ribonucléique et d'hémoglobine est d'environ 1 ml. Au moyen d'une aiguille ne) 18 (en utilisant une seringue
de 5 cm3), on chasse cette pâte (c'est-à-dire qu'on
<EMI ID=78.1>
0,15N) d'acide tannique à 1% en poids/volume et on la soumet à une agitation magnétique dans un pilon.
Après agitation pendant environ 30 minutes, la pâte extrudée est divisée en perles microscopiques distinctes et réticulées d'une grosseur d'environ
100 u ou moins, dans lesquelles est incorporée la bactérie Bacillus thuringiensis. On dilue cette suspension de perles microscopiques et on l'expose sous une lampe solaire de "General Electric" du type décrit à l'exemple, 7 (c'est-à-dire sur des filtres). Les résultats expérimentaux sont repris en figure 10.
Exemple 11
On enrobe le virus de polyédrose nuclé-
<EMI ID=79.1>
d'inclusions polyédriques) dans des perles microscopiques d'acide ribonucléique/protamine en adoptant
la technique décrite à l'exemple 10. Dans cet exemple, on utilise 1 g de protamine (sous forme d'une
<EMI ID=80.1>
forme d'une-poudre sèche), le tampon est une solution
<EMI ID=81.1>
utilise de l'acide tannique pour réticuler et stabiliser les perles microscopiques. On lave deux fois les suspensions de perles microscopiques dans de l'eau distillée, puis on les dilue à 1:100 dans de l'eau distillée. On expose les suspensions diluées sous une lampe solaire de "General Electric" en adoptant la technique décrite à l'exemple 1, puis on dilue les suspensions exposées dans un tampon de phosphate selon les besoins qu'exigent les essais d'infectiosité décrits ci-après. On utilise des larves de Trichoplusia ni pour mesurer l'infectiosité du virus protégé (c'est-àdire enrobé dans les perles microscopiques) et du virus non protégé (c'est-à-dire le virus témoin). On détermine l'infectiosité en déposant 10 ul de dilutions séparées (1:10<2> à 1:10�) sur un morceau de nourriture de 0,2 g.
On laisse les larves manger tout le morceau de nourriture, puis on dépose un nouveau morceau de nourriture (2 g) dans la fiole. Lorsque toutes les larves témoins (n'ayant pas ingéré les perles microscopiques à virus) se sont métamorphosées en nymphes, on pratique l'autopsie des larves mortes afin de vérifier si la mort est due à l'infection provoquée par le virus Autographa californica (on a constaté que tel était le cas). On a déterminé les doses
<EMI ID=82.1>
vis-à-vis du virus qui avait été protégé par les perles microscopiques, ainsi que vis-à- vis du virus témoin qui n'avait été protégé par aucune perle microscopique. Les procédés généraux en vue de pratiquer les déterminations des doses létales à
<EMI ID=83.1>
639, B.D. Davis et al., Harper and Row, 1973. Les résultats relatifs aux doses létales à 50% sont repris en figure 11.
Exemple 12
On répète l'exemple 11 en utilisant le virus de polyédrose nucléaire de la mite d'orgyie du sapin de Douglas au lieu du virus Autographa californica et les larves de la mite d'orgyie du sapin de Douglas au lieu des larves de Trichoplusia ni, avec cette exception que l'on pratique l'autopsie des larves au bout d'une période de 10 jours. Les résultats relatifs aux doses létales à 50% sont repris en figure 12.
Il est entendu que l'expression "acide nucléique", utilisée tout au long de la présente spécification et dans les revendications ci-après, englobe tous les polynucléotides. De même, il est entendu que l'expression "protéine" englobe tous les polypeptides.
<EMI ID=84.1>
décrite spécifiquement en se référant à des formes de réalisation préférées et à des caractéristiques facultatives, il est entendu que des modifications et variantes peuvent être apportées par l'homme de métier aux concepts décrits., ces modifications et variantes rentrant dans le cadre de l'invention tel qu'il est défini par les revendications ci-après.
REVENDICATIONS
1. Procédé en vue d'enrober des micro-organismes et leurs produits chimiques b iologiquement actifs dans des perles microscopiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à :
a) préparer un mélange comprenant (i) des particules d'un acide nucléique, (ii) des particules d'une matière protéique, (iii) des micro-organismes et leurs produits biologiquement actifs, et (iv) de l'eau en une quantité suffisante pour humidifier pratiquement tout le mélange et lui conférer une consistance pâteuse ; et b) agiter le mélange pâteux de façon à le diviser en perles microscopiques distinctes dans lesquelles sont ainsi enrobés les micro-organismes et leurs produits chimiques biologiquement actifs.