La présente invention concerne des insecticides microbiens. Plus particulièrement, l'invention concerne une nouvelle composition insecticide microbienne, ainsi que sa préparation et son utilisation.
Les insecticides microbiens d'origine virale, bactérienne ou fongique offrent de nets avantages vis-à- vis des insecticides chimiques classiques.
Les organismes pathogènes microbiens pour les insectes sont généralement non toxiques et inoffensifs vis-à-vis d'autres formes de vie. En outre, les insecticides microbiens ont un degré de spécificité relativement élevé, si bien qu'ils ne présentent aucun danger pour les insectes utiles. De plus, l'insecte hôte susceptible acquiert très lentement une résistance aux organismes pathogènes microbiens.
Les insecticides microbiens peuvent être utilisés en doses relativement faibles, ils peuvent être efficacement appliqués sous forme de pulvérisations ou de poudres de saupoudrage et, en outre, ils peuvent être utilisés en combinaison avec des insecticides chimiques.
Par exemple, le virus de polyédrose nucléaire de la mite de l'orgyie du sapin de Douglas est un organisme pathogène microbien pour les insectes et il
est utile pour combattre la mite de l'orgyie. De même, la bactérie Bacillus thuringiensis, qui est
une bactérie formatrice de spores, est un organisme pathogène microbien bien connu pour les insectes et elle est utile contre de nombreux insectes qui mâchent les feuilles à leurs stades larvaires, par exemple, les chenilles de la luzerne, le sphinx de la tomate, le sphinx du tabac, les arpenteuses du chou, les tisseuses du chou, les chenilles de la leucanie, les orgyies Porthetria dispar, les chenilles des noix, les plutelles, les coléoptères verts cosmopolites, les térébrants eu-ropéens des céréales et d'autres membres de l'ordre des lépidoptères.
Malheureusement, l'efficacité et l'utilité de nombreux organismes pathogènes microbiens en tant qu'insecticides sont fortement limitées sur le terrain par suite de leur sensibilité extrême à la lumière solaire. Par exemple, on sait qu'un des problèmes se posant lors de l'utilisation de la bactérie Bacillus thuringiensis comme insecticide, réside dans sa courte période d'efficacité et d'utilité sur le
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nisme est neutralisé par l'action de la lumière solaire. On sait également que les radiations non ionisantes ayant une haute énergie photonique (par exemple, les rayons ultraviolets) exercent un effet neutralisant sur la bactérie Bacillus thuringiensis,
(Voir "Photoprotection Against Inactivation of Bacillus thuringiensis Spores by Ultraviolet Rays",
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volume 25, pages 267-268 (1975)). En particulier,
on sait que des rayons ultraviolets d'une longueur d'onde de 253,7 nm sont la cause d'une neutralisation nette et extraordinaire des spores de Bacillus thuringiensis, si bien que ces spores ne
peuvent ni germer ni croître. Une dose
de 18 m W sec/cm2 de ces radiations d'une longueur d'onde de 253,7 nm neutralise 99,9% des spores de Bacillus thuringiensis. Toutefois, étant donné que les rayons ultraviolets ayant des longueurs d'onde inférieures à environ 285 nm n'atteignent pas la surface de la terre, cette neutralisation à une longueur d'onde de 253,7 nm n'entre guère en considération sur le terrain.
La Demanderesse a déterminé que la demivie de la bactérie Bacillus thuringiensis soumise à la lumière solaire était d'environ 6 minutes. De même, d'autres chercheurs ont déterminé que les demivies de certains virus occlus soumis à la lumière solaire, se situaient entre une demi-heure et une heure. Dès lors, l'efficacité d'une application spécifique de ces insecticides microbiens par pulvérisation est rapidement annihilée sur le terrain.
Etant donné que les acides nucléiques ont un maximum d'extinction proche d'une longueur d'onde de 260 nm, d'autres chercheurs ont suggéré que la mortalité de la bactérie Bacillus thuringiensis sous l'effet de rayons ultraviolets à une longueur d'onde de 253,7 nm, ainsi que de certains virus occlus à des longueurs d'onde comparables, pouvait être la résultante d'une photoréaction de la matière génétique,
en particulier, de l'acide désoxyribonucléi que. Dès lors, il a été suggéré (ibid., page 267) que les spores de la bactérie Bacillus thuringiensis pouvaient être protégées contre la neutralisation par ces ray-
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ment les spores de Bacillus thurin�iensis avec l'acide désoxyribonucléique ou un acide nucléique comparable ayant pour effet d'absorber les rayons ultraviolets. Cet acide nucléique comparable pourrait être l'acide ribonucléique ayant un maximum d'extinction proche
de 260 nm. Toutefois, cette technique s'est avérée
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étant donné que des longueurs d'onde inférieures à environ 285 nm n'atteignent pas la surface de la terre, on n'a pas encore pu prouver l'utilité de l'acide désoxyribonucléique ou de l'acide ribonucléique en tant qu'agent protecteur contre la neutralisation provoquée par la lumière solaire (c'est-à-dire à des longueurs d'onde supérieures à environ 285 nm).
La présente invention concerne une composition insecticide microbienne, de même que des pro-
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comprend un organisme pathogène microbien pour les insectes, cet organisme étant d'origine virale, bactérienne ou fongique en étant également susceptible de subir une neutralisation provoquée par la lumière solaire, cet organisme pathogène étant enrobé dans une perle microscopique d'un produit de coacervation, constituée d'un acide nucléique, plus spécifiquement l'acide ribonucléique, ainsi que d'une matière protéique, afin que la structure de cette perle microscopique elle-même protège efficacement l'organisme pathogène contre la neutralisation provoquée par la lumière solaire. Cette perle microscopique est spécifiquement stabilisée par réticulation chimique.
Un procédé spécifique de préparation de cette composition insecticide microbienne comprend les étapes consistant à : (a) préparer un mélange pâteux comprenant (i) des particules d'un acide nucléique, (ii) des particules d'une matière protéique,
(iii) des organismes pathogènes microbiens vis-à-vis des insectes et d'origine virale, bactérienne ou fongique et (iv) de l'eau en une quantité suffisante pour humidifier (c'est-à-dire hydrater) pratiquement tout le mélange ; et (b) agiter ce mélange pâteux
de façon à le diviser en perles microscopiques distinctes. enrobant ainsi les organismes pathogènes microbiens pour les insectes dans ces perles microscopiques. De préférence, ces perles microscopiques distinctes sont stabilisées par traitement avec un agent de réticulation chimique tel que l'acide tannique, le glut araldéhyde ou un agent analogue. Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, l'agitation du mélange pâteux a lieu dans une solution contenant cet agent de réticulation chimique.
Un autre procédé spécifique pour la préparation de la composition de l'invention comprend les étapes consistant à : (a) préparer une solution aqueu-
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solution aqueuse contenant une matière protéique ,
(c) préparer une suspension aqueuse d'organismes pathogènes microbiens pour les insectes à charge superficielle fortement positive ou négative ; et
(d) mélanger les solutions aqueuses et la suspension préparées respectivement dans les étapes (a), (b) et
(c), formant ainsi spontanément des perles microscopiques dans lesquelles sont enrobés les organismes pathogènes pour les insectes. Dans une forme de réalisation préférée, on mélange tout d'abord la suspension préparée lors de l'étape (c) avec la solution préparée lors de l'étape (a), puis on malaxe ce mélange avec la solution préparée lors de l'étape (b). Dans une autre forme de réalisation préférée, on <EMI ID=8.1>
(b), puis on malaxe ce mélange avec la solution préparée lors de l'étape (a).
Spécifiquement, la charge superficielle
des organismes pathogènes est rendue fortement négative ou fortement positive en ajoutant un agent modificateur de protéinesà une suspension aqueuse tamponnée des organismes pathogènes. Les perles microscopiques sont spécifiquement réticulées.
La présente invention concerne également
un procédé en vue de combattre les insectes parasites dans les zones infestées par ces derniers, ce procédé consistant spécifiquement à appliquer une quantité efficace de la composition insecticide décrite cidessus aux zones infestées par ces insectes.
De plus, la présente invention concerne la composition insecticide préparée par les procédés décrite ci-dessus.
Dans les dessins annexés .
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densité optique (dans la gamme de l'ultraviolet solaire et de la lumière visible)
de deux types spécifiques de perles microscopiques pouvant être utilisées suivant la présente invention ;
les figures 2 à 12 sont des graphiques montrant les résultats expérimentaux comparatifs des exemples 1, 2 et 4-12 ci-après respectivement , dans les figures 2-4, le nombre de spores viables, extrapolé à 1 ml de l'échantillon initial, est représenté en fonction du temps d'exposition aux rayons ultraviolets ; dans les figures 5, 6 et 8, on indique le pourcentage de microbes survivants en fonction du temps d'exposition ; dans les figures 7 et 10, on indique le nombre de spores viables par filtre en fonction du temps d'exposition, tandis que les figures
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en fonction du temps d'exposition.
Suivant la présente invention, des organismes pathogènes microbiens vis-à-vis des insectes, d'origine virale, bactérienne ou fongique et susceptibles de subir une neutralisation provoquée par la lumière solaire, sont enrobés dans des perles microscopiques d'un produit de coacervation, ces perles étant constituées d'un acide nucléique, plus spécifi-
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matière protéique. La Demanderesse a trouvé que ces perles microscopiques assuraient une excellente protection des organismes pathogènes vis-à-vis de la neutralisation provoquée par la lumière solaire. Ces perles microscopiques font office de blindages protecteurs interceptant et bloquant les radiations ayant des longueurs d'onde nuisibles (c'est-à-dire les longueurs d'onde de.la lumière solaire ayant tendance à neutraliser l'organisme pathogène) avant que ces radia-tions n'atteignent la matière photosensible de l'organisme pathogène pour les insectes.
La Demanderesse est parvenue à enrober efficacement, dans les perles microscopiques de la présente invention, les cristaux de toxines, les spores et les cellules de Bacillus thuringiensis., du virus de la polyédrose nucléaire Au�o�rapha californica et du virus de la polyédrose nucléaire de la mite d'orgyie du sapin de Douglas, de même que les cellules bactériennes végétatives suivantes : Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens et Escherichia coli. Partant de là, on pense que n'importe quel organisme pathogène microbien vis-à-vis des insectes (qu'il soit d'origine virale, bactérienne ou fongique, y compris, mais sans aucune limitation, les organismes pathogènes vis-à-vis des insectes qui ont été décrits dans "Microbial Control of Insects and Mites", H.D. Burges et N.W.
Hussey, Eds, Académie Press, 1971), peut être efficacement enrobé dans les perles microscopiques
de la présente invention. De plus, sur la base des résultats expérimentaux repris dans les exemples ciaprès, il n'y a guère de doute quant au fait que n'importe quel organisme pathogène vis-à-vis des insectes, enrobé dans ces perles microscopiques, sera protégé contre la neutralisation provoquée par la lumière solaire.
Différentes matières protéiques peuvent être utilisées en combinaison avec l'acide nucléique pour former les perles microscopiques suivant l'organisme pathogène spécifique (vis-à-vis des insectes) que l'on veut protéger et le système de perles microscopiques que l'on veut employer, notamment (mais sans aucune limitation) : la protamine, le cytochrome c,
la protéine de soya, l'hémoglobine, la gélatine, les polymères d'acides aminés synthétiques, etc. En
règle générale, on peut utiliser n'importe quelle matière protéique pour autant que les conditions soient réglées afin de faciliter la formation des perles microscopiques. Parmi ces conditions, on peut mentionner les techniques de modification de charge, les réglages du pH, les concentrations des composants, etc.
Les perles microscopiques dans lesquelles les organismes pathogènes microbiens vis-à-vis des insectes sont enrobés, peuvent être avantageusement formées en adoptant des techniques connues pour la formation de ce que l'on appelle des perles microscopiques ou des gouttelettes d'un produit de coacervation. Une de ces techniques a été mise au point lors de l'étude des origines de la vie sur terre et elle a été adoptée pour construire des modèles précellulaires (voir, par exemple, Evreinova et al.,
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tion aqueuse contenant une matière protéique appropriée, on mélange une solution aqueuse contenant un acide nucléique (de préférence, l'acide ribonucléique) et, au besoin, un agent tampon (par exemple, le phosphate de sodium ou l'acétate de sodium) conçu pour maintenir le pH à une valeur optimalisant la charge de l'acide nucléique, de la protéine et du microbe, par exemple, vis-à-vis de la valeur pI
(= indice de protection) désirée (à laquelle le microbe est sensible au pH ; cette valeur doit également être prise en considération). Lorsqu'on mélange ces deux solutions, il se forme spontanément des perles microscopiques de protéine/acide nucléique qui sont essentiellement solides et de forme à peu près sphérique. Dans la spécification ci-après, la technique décrite ci-dessus sera appelée "technique de formulation de solutions", tandis que les perles microscopiques obtenues selon cette technique seront appelées t'perles microscopiques de formulation de solutions".
Dans une forme de réalisation tout aussi préférée de l'invention, les perles microscopiques dans lesquelles sont enrobés les organismes pathogènes microbiens vis-à-vis des insectes, peuvent être formées en adoptant une nouvelle technique qui a été élaborée par la Demanderesse. Dans la spécification ci-après, cette nouvelle technique sera appelée "technique de formulation de pâte" et les perles microscopiques formées selon cette technique seront appelées "perles microscopiques de formulation de pâte".
Suivant cette nouvelle technique de formulation de pâte, on prépare un mélange pâteux comprenant des particules d'un acide nucléique (de préférence, l'acide ribonucléique), des particules d'une matière protéique et de l'eau en une quantité suffisante pour humidifier pratiquement tout le mélange, après quoi on agite ce mélange pâteux de façon à diviser le mélange en perles microscopiques distinctes. Cette agitation peut être effectuée par des techniques classiques, par exemple, par agitation ou mélange rapide (dans un mélangeur classique), par sonication, par secousses, par extrusion sous pression, etc.
Afin de faciliter la division du mélange en perles microscopiques distinctes, dans certaines formes de réalisation, il peut être souhaitable d'extruder le mélange pâteux en filaments, en pastilles, etc., avant l'agitation. Il est généralement préférable de stabiliser les perles microscopiques distinctes par traitement avec un agent de réticulation chimique (par exemple, l'acide tannique, etc.) pendant ou après l'agitation. Toutefois, la réticulation peut être superflue si la stabilisation peut être effectuée
par d'autres moyens, par exemple, par lyophilisation.
En ce qui concerne la technique de formulation de solutions et, dans une certaine mesure, la technique de formulation de pâtes,il est à noter que, bien que toutes les matières protéiques précitées, ainsi que d'autres puissent être utilisées de manière satisfaisante pour former les perles microscopiques, il convient néanmoins de maintenir le pH du mélange
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de la protéine particulière devant être utilisée, car cette condition est requise pour la formation des perles microscopiques. Par exemple, lorsqu'on utilise une protamine, il convient de maintenir le pH en dessous d'environ il et, lorsqu'on utilise l'hémoglobine, le pH doit être maintenu en dessous d'environ
7. De plus, si l'on utilise une protéine qui est insoluble à un pH donné, le pH peut devoir être amené dans un intervalle dans lequel la protéine est soluble ou l'on peut être amené à prendre d'autres mesures pour rendre la protéine soluble. Ces mesures pourraient être une dégradation partielle, une modification de charge ou une addition d'autres composants dans les agents tampons (par exemple, des détergents, des alcools, des agents tensio-actifs, etc.). Si la formation de mousse d'un ou de plusieurs composants pose un problème, on peut incorporer des agents du type de la siméthicone (brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 2.441.098).
Lorsqu'on utilise l'acide ribonucléique comme acide nucléique dans la technique de formulation de solutions, le pH du mélange des solutions doit être maintenu à une valeur égale ou supérieure à environ 4,3 afin d'empêcher l'acide ribonucléique de précipiter hors des perles microscopiques, la protéine quittant nécessairement ces dernières pour rentrer dans la solution.
Ainsi qu'on peut le constater, dans les techniques ci-dessus de formulation de solutions et
de pâtes pour la formation de perles microscopiques
(c'est-à-dire des gouttelettes d'un produit de coa-cervation), les matières devant être utilisées pour intercepter et absorber les radiations nuisibles forment la structure des perles microscopiques, créant ainsi un revêtement hautement protecteur,
La structure bimoléculaire des perles microscopiques donne lieu à une coopération thermodynamiquement stable entre les composants si bien que, même sans réticulation chimique ultérieure, comme décrit ci-après, les composants ne se diffuseront pas individuellement hors des perles microscopiques. La structure bimoléculai re donne également lieu à la formation d'une charge élevée sur les perles microscopiques. Ces charges ont pour but de faciliter l'adhérence des perles microscopiques à la surface des plantes. Ces charges peuvent être réglées en choisissant la protéine appropriée qui doit être utilisée pour former les perles microscopiques.
Il a été mentionné que l'on pouvait régler la grosseur des perles microscopiques (formulation de solutions) en réglant la concentration de l'acide nucléique et de la protéine dans le récipient de formation des perles microscopiques. Par exemple, la Demanderesse a déterminé que l'on pouvait former des perles microscopiques d'un diamètre de 100 u par la technique de formulation de solutions en mélangeant un volume égal d'acide ribonucléique à 5% et de sulfate de protamine à 10%. Les perles microscopiques se forment et décantent au fond du récipient. La plupart de ces perles microscopiques ont une granularité se situant aux environs de 100 u.
La Demanderesse a également trouvé que l'on pouvait régler la grosseur des perles microscopiques, dans une certaine mesure, par le degré d'agitation au cours de leur formation, une agitation plus forte donnant des perles microscopiques plus petites. Bien que des perles microscopiques ayant un diamètre effectif se situant dans l'intervalle compris entre environ 10 et environ
200 microns soient appropriées pour la présente invention, il est généralement préférable d'utiliser des perles microscopiques ayant un diamètre effectif se situant dans l'intervalle compris entre environ
40 et environ 100 microns. En règle générale, la grosseur désirée des perles microscopiques sera déterminée par le type de végétation (c'est-à-dire les récoltes, les arbres, etc.) à traiter, ainsi que par le procédé d'application.
Bien que, en règle générale, pour réaliser ces perles microscopiques, on puisse utiliser l'acide nucléique et la matière protéique en concentrations se situant dans un intervalle relativement large, lors de la préparation de perles microscopiques destinées
à être utilisées suivant la présente invention (c'est- <EMI ID=15.1> biens vis-à-vis des insectes), il est préférable d'utiliser l'acide nucléique et la protéine dans un rapport se situant dans l'intervalle compris entre
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Dans les formes de réalisation de l'invention dans lesquelles il est souhaitable d'utiliser les perles microscopiques décrites ci-dessus et résultant de la technique de formulation de solutions, les organismes pathogènes microbiens vis-à-vis des insectes peuvent être enrobés (c'est-à-dire enfermés) dans ces perles microscopiques en les mettant simplement en suspension dans l'eau (au besoin, on peut éventuellement ajouter un agent tampon, par exemple, un phosphate, un acétate, etc., afin de régler le pH), puis en mélangeant cette suspension avec une solution aqueuse contenant l'acide nucléique désiré.
Ensuite, on mélange la suspension obtenue avec la solution aqueuse de protéine décrite ci-dessus et lbrganisme pathogène vient a'enrober spontanément dans.les per-les microscopiques qui. se forment et qui sont constituées d'une matière protéique et d'un acide nucléique.
Comme autre procédé, qui est cependant moins préféré, on peut mélanger tout d'abord la suspension tamponnée de microbes avec la solution de matière protéique, après quoi on mélange la suspension obtenue avec une solution aqueuse contenant l'acide nucléique. On a constaté qu'après l'agitation du récipient dans lequel on avait mélangé les solutions, les perles microscopiques subissaient une coalescence et se reformaient spontanément, des organismes pathogènes supplémentaires venant ainsi habituellement s'enrober dans les perles microscopiques.
Dans les formes de réalisation de l'invention dans lesquelles il est souhaitable d'utiliser les perles microscopiques décrites ci-dessus résultant d'une technique de formulation de pâte, les organismes pathogènes microbiens vis-à-vis des insectes peuvent être enrobés dans les perles microscopiques en les mettant simplement en suspension dans l'eau (comme décrit ci-dessus, on peut, au besoin, ajouter un agent tampon), puis en mélangeant cette suspension avec le mélange de particules d'acide nucléique et de particules de matière protéique
(il faut veiller à utiliser l'eau uniquement en une quantité suffisante pour humidifier le mélange et
lui donner une consistance pâteuse). Ensuite, on agite le mélange pâteux obtenu comme décrit cidessus de façon à le diviser en perles microscopiques distinctes. Comme autre procédé, on peut mélanger les particules d'acide nucléique et les particules de matière protéique avec de l'eau en une quantité suffisante pour humidifier le mélange et
lui conférer une consistance pâteuse, les organismes pathogènes microbiens vis-à-vis des insectes pouvant ensuite être mélangea avec ce mélange pâteux pour être enrobés dans les perles microscopiques distinctes par agitation du mélange comme décrit ci-dessus.
Bien que les perles microscopiques obtenues par les techniques de formulation de solutions et de pâtes décrites ci-dessus possèdent un certain degré de stabilité, il est généralement avantageux d'accroître leur stabilité afin de faciliter la séparation entre les organismes pathogènes enrobés
et les organismes pathogènes non enrobés, tout en facilitant également davantage la manipulation* Cette remarque est particulièrement vraie en ce qui concerne les perles microscopiques résultant d'une technique de formulation de pâte* Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, on effectue cette stabilisation par réticulation chimique des molécules des perles microscopiques en les traitant avec des agents de réticulation tels que, par exemple, l'acide
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esters, le propionate de dithiobissuccimidyle, etc., en adoptant des techniques classiques de réticulation. Si l'on désire utiliser le glutaraldéhyde, il convient
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ou moins ; en effet, la Demanderesse a constaté qu'en augmentant la concentration de glutaraldéhyde, certains organismes pathogènes, en particulier, la bactérie Bacillus thuringiensis, avaient tendance à être neutralisés. On a trouvé que l'acide tannique tam-
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riennes à une concentration de 10% en poids/volume et la Demanderesse pense qu'il est non toxique visà-vis de la plupart des organismes pathogènes microbiens pour les insectes, à des concentrations de 1% en poids/ volume ou moins. Bien que l'on puisse utiliser de l'acide tannique tamponné ayant une concentration se situant dans l'intervalle allant d'environ 0,01
<EMI ID=20.1> concentrations se situant dans l'intervalle allant
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Il est à noter que l'on peut régler assez aisément le degré de réticulation en réglant la durée, la concentration, la température et d'autres conditions de réticulation. Par exemple, on peut régler le degré de réticulation en arrêtant la réaction de réticulation par l'addition d'une petite molécule qui réagit avec l'agent de réticulation (par exemple, une
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le réactif de réticulation en faibles concentrations.
Cette réticulation chimique des perles microscopiques offre plusieurs avantages, notamment :
(1) une stabilisation vis-à-vis des forces de cisaillement créées en appliquant l'insecticide par pulvérisation ; (2) le maintien éventuel de centres fluides à l'intérieur des perles microscopiques ; (3) le maintien éventuel, à l'intérieur des perles microscopiques, d'un pH inférieur à celui du milieu ambiant entourant les perles microscopiques (c'est-à-dire les sucs digestifs alcalins des intestins des insectes) de sorte que l'intérieur des perles microscopiques peut être maintenu à un pH proche du pH optimum pour la viabilité, la conservation, etc., de l'organisme pathogène microbien ;
(4) le contrôle de la position dans les intestins des insectes où l'organisme pathogène est libéré
(c'est-à-dire que, plus la réticulation est forte., plus la libération de l'organisme pathogène s'étendra dans l'intestin et vice-versa),augmentant ainsi l'infectiosité de l'organisme pathogène. En outre, l'utilisation d'acide tannique comme agent de réticulation augmente la densité optique des pelles microscopiques
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une meilleure protection des microbes enrobés contre la neutralisation provoquée par la lumière solaire.
La Demanderesse a également trouvé que l'on pouvait enrober (c'est-à-dire enfermer) l'organisme pathogène microbien vis-à-vis des insectes beaucoup plus aisément et en quantités beaucoup plus grandes dans les perles microscopiques décrites cidessus et résultant d'une technique de formulation de solutions lorsque la charge superficielle globale de cet organisme pathogène est tout d'abord modifiée de façon à la rendre presque totalement (c'est-à-
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tive. La Demanderesse pense qu'il en est également de même en ce qui concerne les perles microscopiques résultant d'une technique de formulation de pâte.
On peut effectuer cette modification de charge superficielle, par exemple, par addition réglée d'un agent modificateur de protéine, par exemple, l'anhydride succinique (pour rendre la charge fortement négative) et des composés semblables (voir, par exemple, Gary E. Means et Robert E. Feeney, "Chemical Modifications of
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faut veiller à choisir un agent modificateur de protéines qui ne neutralise pas ou ne nuit pas à l'organisme pathogène' devant être enrobé. Par exemple, la Demanderesse a trouvé que l'anhydride succinique ne pouvait être utilisé avec des cellules bactériennes végétatives (par exemple, Serratia marsescens, etc.), étant donné qu'il a tendance à neutraliser ces cellules. On peut effectuer une modification en une charge superficielle fortement positive, par exemple, en utilisant de l'acide tannique pour relier des protéines à charge positive (par exemple, une protamine) à la surface de l'organisme pathogène.
Au cours d'études comparatives, la Demanderesse a trouvé qu'en absence de toute modification de charge, environ 1% seulement des spores disponibles de Bacillus thuringiensis étaient enrobées dans les perles microscopi-ques (formulations de solutions) et qu'en utilisant des spores de Bacillus thuringiensis à charge superficielle fortement négative (traitement à l'anhydri-
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spores de Bacillus thuringiensis enrobées dans les perles microscopiques et qu'en utilisant des spores de Bacillus thuringiensis à charge superficielle fortement positive (traitement à l'acide tannique, puis au sulfate de protamine), on obtenait environ
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dans les perles microscopiques. On peut accroître l'efficacité de ces techniques de modification de charge en lavant tout d'abord l'organisme pathogène microbien pour les insectes et, dans certaines formes de réalisation, il peut être souhaitable d'effectuer un lavage dans des solutions organique (par exemple, une solution éthanolique à 60% en poids) et inorganique (par exemple, une solution de chlorure de sodium 1M) séparées, pour autant que l'organisme pathogène utilisé ne soit pas sensible à ces matières. La Demanderesse a trouvé qu'avant d'essayer d'appliquer l'une ou l'autre des techniques de modification de charge décrites ci-dessus à des virus d'insectes, il était généralement préférable de purifier les virus (par exemple, par centrifugation, par filtration, etc.) afin d'éliminer les débris d'insectes.
Etant donné que l'organisme pathogène dont on a modifié la charge, entre apparemment en compétition avec le composant de même charge de la perle microscopique pour les positions occupées dans celle-ci, il peut être nécessaire de réduire la concentration de ce composant de même charge à une
valeur facilitant l'incorporation de l'organisme pathogène dans la perle microscopique. Par exemple, s'il est souhaitable d'enfermer, dans une perle microscopique d'acide ribonucléique/protéines du type décrit ci-dessus, des organismes pathogènes microbiens (pour les insectes) qui ont été modifiés en une charge superficielle fortement négative, il peut être nécessaire de réduire légèrement la concentration de la solution d'acide ribonucléique (l'acide ribonucléique est également chargé négativement) avant de la mélanger avec la solution de protéine.
De même, dans un système de perles microscopiques de ce type., si la charge superficielle de l'organisme pathogène a été modifiée en une charge superficielle fortement positive, il peut alors être nécessaire de réduire légèrement la concentration de la solution de protéine (la protéine est chargée positivement) avant de la mélanger avec la solution d'acide ribonucléique. Ce dernier système peut être plus intéressant pour l'objet de la présente invention, étant donné qu'il ne nécessite pas une réduction de là quantité de la matière absorbant les radiations (c'est-à-dire l'acide ribonucléique).
Etant donné qu'un objet principal de la présente invention est de protéger les organismes pathogènes photosensibles microbiens pour les insectes contre la neutralisation par les radiations nuisibles du soleil, lors du choix des matières devant être utilisées pour la formulation des perles microscopiques, il est évidemment important de choisir des matières absorbant et/ou réfléchissant fortement
ces radiations nuisibles. Parmi les matières qu'il est préférable d'utiliser pour réaliser les perles microscopiques, il y a l'acide ribonucléique et une matière protéique telle que, par exemple, l'hémoglobine, une protamine ou un polymère d'acide aminé synthétique. La figure 1 des dessins annexés illustre la densité optique (c'est-à-dire l'absorption + la réflexion) des perles microscopiques constituées d'acide ribonucléique et d'une protamine, ces perles étant réalisées conformément à la technique de formulation de solutions décrite ci-dessus. La ligne en trait plein de la figure 1 se rapporte à la densité optique d'une solution de perles microscopiques obtenue en combinant des volumes égaux d'acide ribonucléi-
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du glutaraldéhyde) dans la gamme de l'ultraviolet solaire. La ligne en traits discontinus de la figure 1 se rapporte à la densité optique d'une solution de perles microscopiques obtenue en combinant des volumes égaux d'acide ribonucléique à 0,67% et d'une protamine à 1% (réticulée avec l'acide tannique) dans la gamme de l'ultraviolet solaire et de la lumière visible (jusqu'à 600 nm).
Dans de nombreux cas, la présence d'un acide nucléique dans une perle microscopique offre
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bon nombre de microbes, la détérioration provoquée par la lumière solaire à des longueurs d'onde supérieures à 313 nm était principalement due à la réaction des acides nucléiques des microbes avec des radicaux libres (on pense que la détérioration de la
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son tour, forme des radicaux libres). L'acide nucléique présent dans la structure des perles microscopiques a tendance à réagir spécifiquement avec les ra-
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raient avec les acides nucléiques des microbes, empêchant ainsi toute détérioration.
Etant donné que l'effet pathogène de l'agent microbien ne peut s'exercer aussi longtemps que cet agent reste enrobé dans les perles microscopiques, des précautions doivent être prises dans le choix des matières devant être utilisées pour la formulation de ces perles microscopiques, afin de sélectionner les matières permettant la libération de cet agent après l'ingestion' des perles microscopiques par l'insecte, Bien que l'on puisse choisir d'autres matières, la Demanderesse a trouvé que des perles microscopiques constituées d'une protéine et d'un acide nucléique (par exemple, l'acide ribonucléique) possédaient des caractéristiques de libération très satisfaisantes.
Après l'ingestion des perles microscopiques par l'insecte, les perles microscopiques sont attaquées par les protéases et les nucléases des voies digestives de l'insecte (c'est-à-dire l'intestin), conduisant ainsi à la libération du microbe.
Dès lors, il importe de choisir, pour les perles microscopiques, des matières ne résistant pas à ce type d'attaque. La Demanderesse a trouvé qu'en incubant la bactérie Bacillus thuringiensis (cellules, spores et cristaux de toxines) enrobée dans des perles microscopiques constituées d'acide ribonucléique et d'une protamine (ces perles étant obtenues conformément à la technique de formulation de solutions décrite ci-dessus) à la température ambiante et en présence des sucs digestifs des insectes, la libération de cette bactérie Bacillus thuringiensis commençait au bout de quelques minutes, la libération progressive et complète ayant lieu dans la demi-heure
<EMI ID=32.1>
La Demanderesse a également trouvé qu'en incubant la bactérie Bacillus thuringiensis enrobée dans des perles microscopiques constituées d'acide ribonucléique et d'une protamine (ces perles étant obtenues conformément à la technique décrite cidessus) à la température ambiante et en présence d'acides aminés et/ou de sucres tels que ceux que l'on trouve dans les voies digestives des insectes,
<EMI ID=33.1>
les perles microscopiques en deux heures environ.
Cette dissolution ne se produit pas dans l'eau ou dans un tampon seul, si bien que les perles microscopiques restent alors intactes à la surface des feuilles.
De plus, les résultats expérimentaux repris dans-les figures 9, 11 et 12 indiquent que les virus de la polyédrose nucléaire de la mite d'orgyie du sapin de Douglas et les virus de la polyédrose nucléaire Auto�rapha californica enrobés dans les perles microscopiques de la présente invention étaient, en fait, libérés dans l'intestin des insectes et
qu'en étant libérés de la sorte, ils exerçaient l'effet mortel désiré.
Il est à noter que la présente invention peut être adoptée pour n'importe quel organisme pathogène microbien photosensible pour les insectes, y compris les organismes pathogènes d'origine virale,
<EMI ID=34.1>
ci-après illustrent la possibilité d'appliquer la présente invention à des bactéries spécifiques formatrices de spores (c'est-à-dire les cellules, les spores et les cristaux de toxines de Bacillus thuringien-
<EMI ID=35.1>
sibilité d'appliquer la présente invention à trois espèces de cellules bactériennes végétatives. L'exemple 6 ci-après illustre la possibilité d'appliquer la présente invention à un virus bactérien. Les résul-
<EMI ID=36.1>
présente invention peut être adoptée pour protéger des virus d'insectes non occlus contre la neutralisation provoquée par la lumière solaire. Les exemples 9, 11 et 12 illustrent la possibilité d'appliquer la présente invention à deux espèces de virus d'insectes occlus.
Dans les exemples ci-après et les figures annexées, les organismes pathogènes microbiens pour les insectes qui sont dénommée et/ou désignés par <EMI ID=37.1>
gènes qui n'ont pas été enrobés dans des perle* microscopiques. Dans chaque exemple, les organismes pathogènes "non protégés" ont été soumis à un traitement,, à une exposition et à un essai de viabilité d'une manière aussi identique que possible à celle adoptée pour les organismes pathogènes qui ont été enrobée dans des perles microscopiques (c'est-à-dire que les organismes pathogènes "non protégés" constituent des témoins).
Possibilité d'application industrielle
Les exemples ci-après illustrent différentes formes de réalisation de la présente invention. Il est entendu que ces exemples et la description ci- dessus des formes de réalisation préférées, de même que les figures annexées doivent être interprétés simplement à titre d'illustration et sans aucun caractère limitatif.
Exemple 1
<EMI ID=38.1>
<EMI ID=39.1>
spores et les corps asporulés (cristallins), que l'on obtient à partir d'une culture de milieu de sporula-
<EMI ID=40.1>
1,5 ml d'une solution aqueuse tamponnée à 1,34% (en poids) d'acide ribonucléique de levure (qualité B de
<EMI ID=41.1>
mélange 0,4 ml de cette suspension dans 1,9 ml d'une solution aqueuse tamponnée à 0,36% (en poids) de sulfate de protamine (qualité B de "Sigma").
Il se forme spontanément des perles microscopiques d'acide ribonucléique/protamine renfermant chacune certaines cellules bactériennes et/ou des spores et/ou des corps asporulés. En agitant le mélange, il se produit une division avec reforma-tion spontanée ultérieure de perles microscopiques supplémentaires. On dépose ces perles microscopiques dans une boîte de Petri en verre et on les ex-
<EMI ID=42.1>
"General Electric". On dépose les boîtes de Petri sur un agitateur rotatif à une distance de 78 cm en dessous de la lampe et on les agite à 40 tours/minute.
On détermine la viabilité par dépôt en plaques sur un milieu d'agar-agar/infusion cerveau-coeur de "Difco".
Lors d'une exposition à des radiations ultraviolettes germicides (radiations maximum à
254 nm) suffisantes pour tuer 99,99% de n'importe quelle forme de bactérie Bacillus thuringiensis
non protégée, presque toutes les bactéries Bacillus thuringiensis qui ont été enrobées dans les perles microscopiques (c'est-à-dire les cellules bactériennes et/ou les spores et/ou les corps asporulés protégés) survivent. Cette caractéristique est illustrée en figure 2. On pense que la mortalité prématurée représentée par la ligne indiquée par "Bacillus thu-
<EMI ID=43.1>
de bactérie Bacillus thuringiensis réellement enrobée dans les perles microscopiques. Au microscope, on observe que le pourcentage de bactérie Bacillus thuringiensis réellement enrobée se situe dans l'inter-
<EMI ID=44.1>
Exemple 2
On prépare des perles microscopiques dans lesquelles est enrobée la bactérie Bacillus thuringiensis, comme décrit à l'exemple 1, puis on ajoute 1 mg/ml de propionate de dithiobissuccimidyle dans du diméthylsulfoxyde afin de réticuler et de stabiliser les perles microscopiques. On dépose 0,2 ml
<EMI ID=45.1> agitation, on lave les filtres dans un tampon de dilution et on les dépose en plaques comme décrit à l'exemple 1.
Les résultats de ce procédé sont indiqués en figure 3.
Exemple 3
On lave tout d'abord 1 x 109 spores de Bacillus thuringiensis que l'on obtient par culture dans
un milieu de sporulation, dans une solution éthanolique à 60%, puis on les lave dans une solution de NaCl 1M, la bactérie Bacillus thuringiensis étant séparée
de ces solutions de lavage par centrifugation. Ensuite, on met la bactérie Bacillus thuringiensis
lavée en suspension dans 20 ml d'une solution tampon
<EMI ID=46.1>
Ensuite, à cette suspension, on ajoute de l'anhydride succinique sec (agent modificateur de pro-
<EMI ID=47.1>
ml chacune. On effectue les additions sous agitation constante et, entre chaque addition, on agite le mélange pendant 10 minutes. On maintient le pH à 8 + 0,1 par addition de NaOH. Lorsque la réaction est achevée (le pH ne change plus), on sépare la bactérie Bacillus thuringiensis (par centrifugation) et on la lave. Ensuite, on incorpore cette bactérie Bacillus thuringiensis modifiée (à change négative) dans des perles microscopiques d'acide ribonucléique/protamine conformément aux procédés décrits à l'exemple 1, après quoi on réticule ces perles microscopiques comme décrit à l'exemple 2.
On constate que cette bactérie Bacillus thuringiensis modifiée pénètre dans les perles microscopiques beaucoup plus aisément et en nombres beaucoup plus élevés que la bactérie Bacillus thuringiensis non modifiée utilisée dans les exemples 1 et 2 et ce, probablement du fait que la charge superficielle de la bactérie Bacillus thuringiensis est modifiée d'une charge neutre en une charge négative..
Exemple 4
Comme décrit à l'exemple 1, on soumet une solution de bactérie Bacillus thuringiensis non protégée (cellules, spores et cristaux de toxines) et de bactérie Bacillus thuringiensis protégée (c'est-à-dire enrobée dans des perles microscopiques comme décrit
<EMI ID=48.1>
rie non protégée et 40% de bactérie protégée ; valeurs déterminées au microscope) à des radiations de 254 nm.
Essentiellement aucune des spores non protégées ne reste viable après avoir subi cette irradiation pendant 15 minutes, tandis que 1 x 106 spores protégées (c'est-à-dire 40% du mélange initial total) restent viables après avoir subi cette irradiation pendant 1 heure. On détermine la viabilité comme décrit à l'exemple 1. Les résultats de cette expérience sont repris dans la figure 4.
Exemple 5
On met une concentration de 1 x 109 spores de Bacillus thuringiensis (y compris des cellules, des spores et des cristaux asporulés) en suspension dans
10 ml d'un tampon de phosphate 0,15N à un pH de 7,5
(on obtient la préparation de Bacillus thuringiensis
et on la modifie comme décrit à l'exemple 3). On
<EMI ID=49.1>
biochem") dans cette suspension et on mélange en malaxant vigoureusement dans un dispositif de mélange à tourbillon ( "Vortex"). Ensuite, on ajoute cette suspension à une solution tamponnée à 10% de sulfate de protamine (% en poids, qualité B, "Calbiochem." et on agite vigoureusement pendant 5 secondes. A cette solution, on ajoute du glutaraldéhyde (25%) de "Sigma") jusqu'à une concentration finale de
0,15% (en volume). Après 30 minutes, il se forme, au fond du tube, une pastille constituée de grosses per-
<EMI ID=50.1> surnageant et on remet la pastille en suspension jusqu'à un volume final de 20 ml par agitation. On dépose
<EMI ID=51.1>
la sèche pendant une nuit sous vide. On expose les filtres à la lumière solaire (à 13 heures ; teneur en humidité relative : 23% ; température : 31,7[deg.]C). Ensuite, on lave les filtres dans un tampon d'acétate
(0,15N, pH : 4) pour diviser les perles micros copiques et libérer la bactérie Bacillus thurin�iensis que l'on dépose en plaques comme décrit 3 l'exemple 1.
Les résultats de cette expérience sont
<EMI ID=52.1>
non protégées sont tuées après 30 minutes,
Exemple 6
Cet exemple a pour but de démontrer la protection d'un virus conformément à la présente invention. Les réactions et les réponses d'un virus d'insecte et d'un virus bactérien (que l'on appelle bactériophage) doivent être semblables, étant donné qu'ils sont tous deux constitués fondamentalement d'un acide nucléique dans un enrobage protéique. En conséquence, on a choisi de modeler le système de l'invention sur le virus bactérien E. coli, bactériophage T-4.
On laisse croître des bactériophages T-4
<EMI ID=53.1>
lon P). On inocule E. coli BB dans 100 ml du bouillon P et on le laisse croître pendant une nuit. Le lendemain matin, on procède à une dilution de 1:100 pour obtenir un bouillon frais et on laisse se dérouler la croissance pendant une heure. A cette culture de
<EMI ID=54.1>
bactériophages et on laisse croître pendant 6 heures
(37[deg.]C, agitation rapide). Au terme de cette période, on ajoute 5 gouttes de chloroforme pour tuer toutes
<EMI ID=55.1>
de la souche de bactériophages.
On prépare des perles microscopiques en mé-
<EMI ID=56.1>
"Calbiochem") dans 10 mi de la souche de bactériophages. On ajoute cette suspension à de l'acide ribonucléi-
<EMI ID=57.1>
copiques se forment spontanément. On effectue l'exposition aux rayons ultraviolets comme décrit à l'exemple 1. On prélève des échantillons à des moments déterminés et on procède à des dilutions dans le bouillon P. On détermine les bactériophages viables par le procédé décrit dans la référence suivante : Grace C. Rovozzo et Carroll N. Burk, "A Manual of Basic Virolo�ical Techniques" . Prentice-Hall Biological Techniques Series, 1973, page 168, en utilisant un milieu d'agar-agar et de bouillon P, ainsi que E. coli BB comme bactérie indicatrice.
Les résultats de cette expérience sont
<EMI ID=58.1>
virus non protégés sont tous tués au bout d'environ 5 minutes. D'autre part, après une chute initiale analogue à celle observée dans les essais bactériens, le virus qui a été enrobé dans les perles microscopiques, manifeste une forte résistance à la lumièreultraviolette (environ 40% des virus sont protégés contre la neutralisation).
Exemple 7
On prépare des perles microscopiques dans
<EMI ID=59.1>
me décrit à l'exemple 3, avec cette exception que l'on n'utilise pas du propionate de dithiobissuccimidyle dans du diméthylsulfoxyde pour réticuler les perles mi croscopiques. Dans cet exemple, on réticule et stabilise les perles microscopiques en ajoutant,
à la suspension de ces perles, 1% en poids/volume d'acide tannique tamponné par un phosphate et en laissant reposer à la température ambiante pendant environ 30 minutes. On dilue la suspension des perles microscopiques réticulées avec un tampon de dilution (phosphate) de façon à obtenir une suspension diluée contenant environ 100 spores par ml, tandis que l'on introduit des échantillons de 1 ml de cette suspension diluée dans des filtres "Milli-
<EMI ID=60.1>
en laissant sécher pendant une nuit. On expose les filtres sous une lampe solaire de "General Electric"
à 1.572 watts/m2 à une distance de 381 mm, cette lampe émettant des radiations d'une longueur d'onde se situant dans l'intervalle allant d'environ 290 nm à 400 nm.
Une heure d'exposition sous cette lampe solaire équivaut à environ 151 heures sous la lumière solaire directe d'un jour du mois de juillet à un endroit
<EMI ID=61.1>
15 jours). Après exposition, on dépose directement les spores sur une plaque d'agar-agar de numération et, après incubation pendant 24 heures, on compte les colonies croissant sur les filtres. Les résultats expérimentaux sont repris en figure 7'
Exemple 8
<EMI ID=62.1>
on traite des cellules bactériennes végétatives des espèces Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens et Escherichia coli avec de l'anhydride succinique
<EMI ID=63.1>
solution tampon de carbonate 1M (pH 8), puis en ajoutant
50 mg d'anhydride succinique. On ne maintient pas le
<EMI ID=64.1>
<EMI ID=65.1>
térienne au cours de la récolte et du lavage. A nouveau dans des essais séparés� on met les cellules des trois espèces traitées à l'anhydride succinique en suspension dans 4 ml d'une solution tampon de phos- <EMI ID=66.1>
cette suspension avec 1 ml d'une solution tamponnée d'acide ribonucléique à 1,34% en poids/volume (de "Sigma"), On mélange la suspension obtenue avec 2 ml
<EMI ID=67.1>
volume (de "Calbiochem."), formant ainsi spontanément les perles microscopiques, après quoi on ajoute 0,4 ml d'une solution d'acide tannique à 10% (en poids/volume) à la suspension des perles microscopiques. (Remarque:
.le tampon mentionné ci-dessus est une solution tampon <EMI ID=68.1>
la suspension de perles microscopiques dans l'acide tannique pendant 30 minutes à la température ambiante, puis on la lave trois fois dans la solution tampon de phosphate décrite ci-dessus, par centrifugation. L'observation au microscope révèle qu'environ 30% de chacune des trois espèces soumises aux essais sont enrobées dans les perles microscopiques.
On expose séparément les suspensions des perles microscopiques obtenues dans les trois séries d'expériences sous la lampe solaire de "General Electric" décrite à l'exemple 7 en, adoptant le procédé expérimental décrit à l'exemple 1 (c'est-à-dire exposition sur un agitateur rotatif), avec cette exception que la suspension contient un plus grand nombre
de perles microscopiques. La figure 8 donne les résultats d'un essai représentatif pratiqué sur les cellules
<EMI ID=69.1>
pratiqués sur les cellules bactériennes Serratia marcenscens et Escherichia coli (non représentées) sont analogues à ceux illustrés en figure 8.
Toutefois, il est à noter qu'en effectuant des expériences à la suite desquelles on a obtenu les résultats repris en figure 8, il est à supposer que n'importe quelle cellule bactérienne de la suspension de perles microscopiques, qui n'a pas été enrobée dans ces dernières, est tuée au cours de l'exposition de cette suspension sur l'agitateur rotatif, Afin de vérifier l'exactitude de cette hypothèse, on a effectué une deuxième expérience témoin (en plus du témoin indiqué en figure 8).
Lors de cette deuxième expérience témoin, on a traité des spores de Bacillus thuringiensis comme décrit ci-dessus, avec cette exception qu'on ne les a pas enrobées dans des perles microscopiques, mais qu'on les a simplement mélangées dans une suspension contenant des perles microscopiques déjà formées (en utilisant à peu près le même nombre de perles microscopiques que dans les expériences décrites ci-dessus), après quoi on a exposé ce mélange sous la lampe solaire décrite ci-dessus. Si cette hypothèse est correcte, la plupart des cellules doivent alors être tuées. Toutefois, on a trouvé que les cellules étaient tuées à peu près au même rythme que les cellules qui avaient été enrobées dans les perles microscopiques.
On attribue cette caractéristique au nombre relativement important de perles microscopiques présentes dans les suspensions qui ont été exposées (c'est-à-dire que les suspensions de perles microscopiques étaient trop épaisses). On pense que le grand nombre de perles microscopiques présentes réduit le mouvement des cellules situées à l'extérieur de ces perles, si bien que les cellules se trouvant éventuellement en dessous d'une perle microscopique, y restent essentiellement tout
au long de l'exposition en étant ainsi protégées.
<EMI ID=70.1>
xième expérience témoin, démontre que les perles microscopiques protègent les cellules contre la neutralisation provoquée par la lumière solaire (que les cellules soient dans ou à l'extérieur des perles microscopiques, mais en dessous). De même, comme on l'a indiqué ci-dessus, l'observation au microscope révèle que les cellules de chacune des trois espèces bactériennes soumises aux essais ont été enrobées dans les perles microscopiques.
Exemple 9
<EMI ID=71.1>
de la mite de l'orgyie du sapin de Douglas en suspension
<EMI ID=72.1>
et en procède à un traitement avec six additions de
50 mg d'anhydride succinique. On utilise du NaOH IN
<EMI ID=73.1>
récolte la suspension de virus par centrifugation et
<EMI ID=74.1>
pour la remettre ensuite en suspension dans 1 ml du tampon. On traite ensuite cette suspension comme décrit à l'exemple 8 pour former des perles microscopiques réticulées dans lesquelles sont enrobés les virus.
On expose la suspension sous la lampe solaire de "General Electric" décrite à l'exemple 8, puis on la dilue avec le tampon et on la soumet à un essai d'inf ectiosité comme décrit à l'exemple 12. Les résultats d'in-
<EMI ID=75.1>
présentent la même erreur que celle décrite à l'exemple 8 (c'est-à-dire que la suspension de perles microscopiques qui a été soumise à 1 'exposition, est trop épaisse pour tuer les virus qui n'ont pas été enrobés dans les perles microscopiques). Toutefois, comme indiqué à l'exemple 8, l'observation au microscope révèle qu'environ 30% des virus ont été enrobés dans les perles microscopiques et que ces dernières ont assuré une protection contre la neutralisation provoquée par
la lumière solaire (que les virus soient à l'intérieur ou à l'extérieur des perles microscopiques, mais en dessous).
Exemple 10
On mélange 1 g d'hémoglobine (en poudre
<EMI ID=76.1>
d'une poudre.sèche, On met environ 1 x 109 spores
<EMI ID=77.1> solution tampon (acétate 0,15N, pH 5), puis on ajoute la suspension ainsi obtenue au mélange d'acide ribonucléique et d'hémoglobine. On ajoute une solution tampon supplémentaire en une quantité suffisante pour former une masse hydratée (c'est-à-dire humide) ayant une consistance pâteuse. La quantité totale de solution tampon mélangée avec le mélange d'acide ribonucléique et d'hémoglobine est d'environ 1 ml. Au moyen d'une aiguille ne) 18 (en utilisant une seringue
de 5 cm3), on chasse cette pâte (c'est-à-dire qu'on
<EMI ID=78.1>
0,15N) d'acide tannique à 1% en poids/volume et on la soumet à une agitation magnétique dans un pilon.
Après agitation pendant environ 30 minutes, la pâte extrudée est divisée en perles microscopiques distinctes et réticulées d'une grosseur d'environ
100 u ou moins, dans lesquelles est incorporée la bactérie Bacillus thuringiensis. On dilue cette suspension de perles microscopiques et on l'expose sous une lampe solaire de "General Electric" du type décrit à l'exemple, 7 (c'est-à-dire sur des filtres). Les résultats expérimentaux sont repris en figure 10.
Exemple 11
On enrobe le virus de polyédrose nuclé-
<EMI ID=79.1>
d'inclusions polyédriques) dans des perles microscopiques d'acide ribonucléique/protamine en adoptant
la technique décrite à l'exemple 10. Dans cet exemple, on utilise 1 g de protamine (sous forme d'une
<EMI ID=80.1>
forme d'une-poudre sèche), le tampon est une solution
<EMI ID=81.1>
utilise de l'acide tannique pour réticuler et stabiliser les perles microscopiques. On lave deux fois les suspensions de perles microscopiques dans de l'eau distillée, puis on les dilue à 1:100 dans de l'eau distillée. On expose les suspensions diluées sous une lampe solaire de "General Electric" en adoptant la technique décrite à l'exemple 1, puis on dilue les suspensions exposées dans un tampon de phosphate selon les besoins qu'exigent les essais d'infectiosité décrits ci-après. On utilise des larves de Trichoplusia ni pour mesurer l'infectiosité du virus protégé (c'est-àdire enrobé dans les perles microscopiques) et du virus non protégé (c'est-à-dire le virus témoin). On détermine l'infectiosité en déposant 10 ul de dilutions séparées (1:10<2> à 1:10�) sur un morceau de nourriture de 0,2 g.
On laisse les larves manger tout le morceau de nourriture, puis on dépose un nouveau morceau de nourriture (2 g) dans la fiole. Lorsque toutes les larves témoins (n'ayant pas ingéré les perles microscopiques à virus) se sont métamorphosées en nymphes, on pratique l'autopsie des larves mortes afin de vérifier si la mort est due à l'infection provoquée par le virus Autographa californica (on a constaté que tel était le cas). On a déterminé les doses
<EMI ID=82.1>
vis-à-vis du virus qui avait été protégé par les perles microscopiques, ainsi que vis-à- vis du virus témoin qui n'avait été protégé par aucune perle microscopique. Les procédés généraux en vue de pratiquer les déterminations des doses létales à
<EMI ID=83.1>
639, B.D. Davis et al., Harper and Row, 1973. Les résultats relatifs aux doses létales à 50% sont repris en figure 11.
Exemple 12
On répète l'exemple 11 en utilisant le virus de polyédrose nucléaire de la mite d'orgyie du sapin de Douglas au lieu du virus Autographa californica et les larves de la mite d'orgyie du sapin de Douglas au lieu des larves de Trichoplusia ni, avec cette exception que l'on pratique l'autopsie des larves au bout d'une période de 10 jours. Les résultats relatifs aux doses létales à 50% sont repris en figure 12.
Il est entendu que l'expression "acide nucléique", utilisée tout au long de la présente spécification et dans les revendications ci-après, englobe tous les polynucléotides. De même, il est entendu que l'expression "protéine" englobe tous les polypeptides.
<EMI ID=84.1>
décrite spécifiquement en se référant à des formes de réalisation préférées et à des caractéristiques facultatives, il est entendu que des modifications et variantes peuvent être apportées par l'homme de métier aux concepts décrits., ces modifications et variantes rentrant dans le cadre de l'invention tel qu'il est défini par les revendications ci-après.
REVENDICATIONS
1. Procédé en vue d'enrober des micro-organismes et leurs produits chimiques b iologiquement actifs dans des perles microscopiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à :
a) préparer un mélange comprenant (i) des particules d'un acide nucléique, (ii) des particules d'une matière protéique, (iii) des micro-organismes et leurs produits biologiquement actifs, et (iv) de l'eau en une quantité suffisante pour humidifier pratiquement tout le mélange et lui conférer une consistance pâteuse ; et b) agiter le mélange pâteux de façon à le diviser en perles microscopiques distinctes dans lesquelles sont ainsi enrobés les micro-organismes et leurs produits chimiques biologiquement actifs.
The present invention relates to microbial insecticides. More particularly, the invention relates to a new microbial insecticide composition, as well as its preparation and its use.
Microbial insecticides of viral, bacterial or fungal origin offer clear advantages over conventional chemical insecticides.
Microbial pathogens for insects are generally non-toxic and harmless to other forms of life. In addition, microbial insecticides have a relatively high degree of specificity, so that they pose no danger to beneficial insects. In addition, the susceptible host insect very slowly acquires resistance to microbial pathogens.
Microbial insecticides can be used in relatively low doses, they can be effectively applied in the form of sprays or dusting powders, and in addition they can be used in combination with chemical insecticides.
For example, the Douglas fir moth nuclear polyhedrosis virus is a microbial pathogen for insects and it
is useful to combat the orgyia mite. Likewise, the bacteria Bacillus thuringiensis, which is
a spore-forming bacteria, is a microbial pathogenic organism well known for insects and it is useful against many insects which chew the leaves at their larval stages, for example, alfalfa caterpillars, tomato sphinx, sphinx tobacco, cabbage looperers, cabbage weavers, leukania caterpillars, Porthetria dispar orgyies, walnut caterpillars, plutelles, cosmopolitan green beetles, European cereal terebrates and other members of the order of lepidoptera.
Unfortunately, the effectiveness and usefulness of many microbial pathogens as insecticides is severely limited in the field due to their extreme sensitivity to sunlight. For example, it is known that one of the problems encountered when using Bacillus thuringiensis as an insecticide is its short period of efficacy and
<EMI ID = 1.1>
nism is neutralized by the action of sunlight. It is also known that non-ionizing radiation having a high photonic energy (for example, ultraviolet rays) exerts a neutralizing effect on the bacterium Bacillus thuringiensis,
(See "Photoprotection Against Inactivation of Bacillus thuringiensis Spores by Ultraviolet Rays",
<EMI ID = 2.1>
volume 25, pages 267-268 (1975)). In particular,
we know that ultraviolet rays with a wavelength of 253.7 nm are the cause of a clear and extraordinary neutralization of the spores of Bacillus thuringiensis, so that these spores do not
can neither germinate nor grow. Dose
of 18 m W sec / cm2 of these radiations with a wavelength of 253.7 nm neutralizes 99.9% of the spores of Bacillus thuringiensis. However, since ultraviolet rays having wavelengths less than about 285 nm do not reach the earth's surface, this neutralization at a wavelength of 253.7 nm hardly matters for the ground.
The Applicant has determined that the half-life of Bacillus thuringiensis bacteria subjected to sunlight is approximately 6 minutes. Similarly, other researchers have determined that the half-lives of certain occluded viruses subjected to sunlight are between half an hour and an hour. Consequently, the effectiveness of a specific application of these microbial insecticides by spraying is quickly annihilated in the field.
Since nucleic acids have a maximum extinction close to a wavelength of 260 nm, other researchers have suggested that the mortality of the bacteria Bacillus thuringiensis under the effect of ultraviolet rays at a length of 253.7 nm wave, as well as certain viruses occluded at comparable wavelengths, could be the result of a photoreaction of genetic material,
in particular, deoxyribonucleic acid. It has therefore been suggested (ibid., Page 267) that the spores of the bacterium Bacillus thuringiensis could be protected against neutralization by these rays.
<EMI ID = 3.1>
spores of Bacillus thurin � iensis with deoxyribonucleic acid or a comparable nucleic acid which has the effect of absorbing ultraviolet rays. This comparable nucleic acid could be ribonucleic acid having a close extinction maximum
260 nm. However, this technique has been proven
<EMI ID = 4.1>
since wavelengths below about 285 nm do not reach the earth's surface, the usefulness of deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid has not yet been proven protective against neutralization caused by sunlight (i.e. at wavelengths greater than about 285 nm).
The present invention relates to a microbial insecticidal composition, as well as to
<EMI ID = 5.1> <EMI ID = 6.1>
comprises a microbial pathogenic organism for insects, this organism being of viral, bacterial or fungal origin while also being capable of undergoing neutralization caused by sunlight, this pathogenic organism being coated in a microscopic pearl of a coacervation product, consisting of a nucleic acid, more specifically ribonucleic acid, as well as a protein material, so that the structure of this microscopic pearl itself effectively protects the pathogenic organism against the neutralization caused by sunlight. This microscopic pearl is specifically stabilized by chemical crosslinking.
A specific method for preparing this microbial insecticide composition comprises the steps consisting in: (a) preparing a pasty mixture comprising (i) particles of a nucleic acid, (ii) particles of a protein material,
(iii) microbial pathogenic organisms vis-à-vis insects and of viral, bacterial or fungal origin and (iv) water in an amount sufficient to moisten (i.e. hydrate) practically all mixed ; and (b) shake this pasty mixture
so as to divide it into separate microscopic beads. thus coating microbial pathogens for insects in these microscopic beads. Preferably, these separate microscopic beads are stabilized by treatment with a chemical crosslinking agent such as tannic acid, glut araldehyde or the like. In a preferred embodiment of the invention, the stirring of the pasty mixture takes place in a solution containing this chemical crosslinking agent.
Another specific process for the preparation of the composition of the invention comprises the steps consisting in: (a) preparing an aqueous solution
<EMI ID = 7.1>
aqueous solution containing protein matter,
(c) preparing an aqueous suspension of microbial pathogenic organisms for insects with a strongly positive or negative surface charge; and
(d) mixing the aqueous solutions and the suspension prepared respectively in steps (a), (b) and
(c), thus spontaneously forming microscopic pearls in which the pathogenic organisms for the insects are coated. In a preferred embodiment, the suspension prepared in step (c) is first mixed with the solution prepared in step (a), then this mixture is kneaded with the solution prepared in the step (b). In another preferred embodiment, <EMI ID = 8.1>
(b), then this mixture is kneaded with the solution prepared during step (a).
Specifically, the surface charge
pathogenic organisms is made strongly negative or strongly positive by adding a protein modifier to a buffered aqueous suspension of pathogenic organisms. The microscopic beads are specifically crosslinked.
The present invention also relates to
a process for combating parasitic insects in the areas infested by the latter, this process specifically consisting in applying an effective amount of the insecticidal composition described above to the areas infested by these insects.
In addition, the present invention relates to the insecticidal composition prepared by the methods described above.
In the accompanying drawings.
<EMI ID = 9.1>
optical density (in the range of solar ultraviolet and visible light)
two specific types of microscopic pearls which can be used according to the present invention;
Figures 2 to 12 are graphs showing the comparative experimental results of Examples 1, 2 and 4-12 below respectively, in Figures 2-4, the number of viable spores, extrapolated to 1 ml of the initial sample, is represented as a function of the time of exposure to ultraviolet rays; in FIGS. 5, 6 and 8, the percentage of surviving microbes is indicated as a function of the exposure time; in figures 7 and 10, the number of viable spores per filter is indicated as a function of the exposure time, while the figures
<EMI ID = 10.1>
depending on the exposure time.
According to the present invention, microbial pathogenic organisms vis-à-vis insects, of viral, bacterial or fungal origin and capable of undergoing neutralization caused by sunlight, are coated in microscopic beads with a coacervation product, these pearls being made up of a nucleic acid, more specific
<EMI ID = 11.1>
protein matter. The Applicant has found that these microscopic pearls provide excellent protection for pathogenic organisms against neutralization caused by sunlight. These microscopic beads act as protective shields intercepting and blocking radiation with harmful wavelengths (i.e. wavelengths of sunlight tending to neutralize the pathogen) before these radiation does not reach the photosensitive material of the organism pathogenic to insects.
The Applicant has succeeded in effectively coating, in the microscopic pearls of the present invention, the crystals of toxins, the spores and the cells of Bacillus thuringiensis., Of the nuclear polyhedrosis virus Au � o � rapha californica and Douglas fir moth nuclear polyhedrosis virus, as well as the following vegetative bacterial cells: Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens and Escherichia coli. Based on this, it is believed that any microbial pathogenic organism vis-à-vis insects (whether of viral, bacterial or fungal origin, including, but not limited to, pathogenic organisms vis-à-vis screw insects that have been described in "Microbial Control of Insects and Mites", HD Burges and NW
Hussey, Eds, Académie Press, 1971), can be effectively embedded in microscopic beads
of the present invention. Furthermore, on the basis of the experimental results given in the examples below, there is little doubt that any organism pathogenic towards insects, coated in these microscopic pearls, will be protected against neutralization caused by sunlight.
Different proteinaceous materials can be used in combination with the nucleic acid to form the microscopic pearls according to the specific pathogenic organism (vis-à-vis the insects) that one wants to protect and the microscopic pearl system that one wants employ, in particular (but without any limitation): protamine, cytochrome c,
soy protein, hemoglobin, gelatin, synthetic amino acid polymers, etc. In
as a general rule, any protein material can be used as long as the conditions are set in order to facilitate the formation of microscopic beads. Among these conditions, there may be mentioned the techniques for changing the charge, the pH settings, the concentrations of the components, etc.
The microscopic pearls in which the microbial pathogenic organisms vis-à-vis the insects are coated, can be advantageously formed by adopting known techniques for the formation of so-called microscopic pearls or droplets of a coacervation product. . One of these techniques was developed during the study of the origins of life on earth and it was adopted to build precellular models (see, for example, Evreinova et al.,
<EMI ID = 12.1>
<EMI ID = 13.1>
tion containing an appropriate protein material, an aqueous solution containing a nucleic acid (preferably ribonucleic acid) and, if necessary, a buffering agent (for example, sodium phosphate or sodium acetate) designed to maintain the pH at a value optimizing the charge of the nucleic acid, the protein and the microbe, for example, with respect to the pI value
(= protection index) desired (to which the microbe is sensitive to pH; this value must also be taken into account). When these two solutions are mixed, microscopic protein / nucleic acid beads are formed which are essentially solid and roughly spherical in shape. In the specification below, the technique described above will be called "solution formulation technique", while the microscopic beads obtained by this technique will be called microscopic solution formulation beads ".
In an equally preferred embodiment of the invention, the microscopic beads in which the microbial pathogenic organisms are coated with respect to insects, can be formed by adopting a new technique which has been developed by the Applicant. In the specification below, this new technique will be called "paste formulation technique" and the microscopic beads formed by this technique will be called "microscopic paste formulation beads".
According to this new paste formulation technique, a pasty mixture is prepared comprising particles of a nucleic acid (preferably ribonucleic acid), particles of a protein material and water in an amount sufficient to moisten practically the entire mixture, after which this pasty mixture is stirred so as to divide the mixture into separate microscopic beads. This stirring can be carried out by conventional techniques, for example, by stirring or rapid mixing (in a conventional mixer), by sonication, by shaking, by pressure extrusion, etc.
In order to facilitate the division of the mixture into separate microscopic beads, in some embodiments, it may be desirable to extrude the pasty mixture into filaments, pellets, etc., before agitation. It is generally preferable to stabilize the separate microscopic beads by treatment with a chemical crosslinking agent (for example, tannic acid, etc.) during or after agitation. However, crosslinking may be superfluous if stabilization can be performed
by other means, for example, by lyophilization.
With regard to the solution formulation technique and, to some extent, the pasta formulation technique, it should be noted that although all of the above protein materials, as well as others, can be used satisfactorily for form the microscopic pearls, it is nevertheless advisable to maintain the pH of the mixture
<EMI ID = 14.1>
of the particular protein to be used, as this condition is required for the formation of microscopic beads. For example, when using a protamine, the pH should be kept below about 11 and, when using hemoglobin, the pH should be kept below about
7. In addition, if a protein which is insoluble at a given pH is used, the pH may have to be brought within a range in which the protein is soluble or other measures may have to be taken to make soluble protein. These measures could be a partial degradation, a change in charge or an addition of other components in the buffering agents (for example, detergents, alcohols, surfactants, etc.). If foaming of one or more components is a problem, agents of the simethicone type can be incorporated (United States Patent No. [deg.] 2,441,098).
When ribonucleic acid is used as the nucleic acid in the solution formulation technique, the pH of the mixture of solutions should be kept at or above about 4.3 in order to prevent the ribonucleic acid from precipitating out. microscopic beads, the protein necessarily leaving the latter to enter the solution.
As can be seen, in the above techniques of formulating solutions and
of pastes for the formation of microscopic pearls
(i.e. droplets of a co-cation product), the materials to be used to intercept and absorb harmful radiation form the structure of microscopic beads, thus creating a highly protective coating,
The bimolecular structure of the microscopic beads gives rise to thermodynamically stable cooperation between the components so that, even without subsequent chemical crosslinking, as described below, the components will not individually diffuse out of the microscopic beads. The bimolecular structure also gives rise to the formation of a high charge on the microscopic beads. The purpose of these fillers is to facilitate the adhesion of the microscopic beads to the surface of the plants. These charges can be adjusted by choosing the appropriate protein to be used to form the microscopic beads.
It has been mentioned that the size of the microscopic beads (solution formulation) can be controlled by controlling the concentration of the nucleic acid and the protein in the microscopic bead-forming container. For example, the Applicant has determined that microscopic beads with a diameter of 100 u can be formed by the technique of formulating solutions by mixing an equal volume of 5% ribonucleic acid and 10% protamine sulfate. . Microscopic beads form and settle at the bottom of the container. Most of these microscopic pearls have a granularity of around 100 u.
The Applicant has also found that the size of the microscopic pearls can be controlled, to a certain extent, by the degree of agitation during their formation, stronger agitation giving smaller microscopic pearls. Although microscopic beads with an effective diameter in the range of about 10 to about
200 microns are suitable for the present invention, it is generally preferable to use microscopic pearls having an effective diameter lying in the range between approximately
40 and around 100 microns. As a general rule, the desired size of the microscopic beads will be determined by the type of vegetation (i.e. crops, trees, etc.) to be treated, as well as by the application process.
Although, as a general rule, for producing these microscopic pearls, it is possible to use the nucleic acid and the protein material in concentrations lying within a relatively wide range, when preparing microscopic pearls intended
to be used according to the present invention (i.e. <EMI ID = 15.1> good against insects), it is preferable to use the nucleic acid and the protein in a ratio lying in the interval between
<EMI ID = 16.1>
In the embodiments of the invention in which it is desirable to use the microscopic beads described above and resulting from the technique of formulating solutions, the microbial pathogenic organisms vis-à-vis the insects can be coated (c (i.e. enclosed) in these microscopic beads by simply suspending them in water (if necessary, a buffering agent, for example, a phosphate, an acetate, etc., may be added in order to adjust the pH), then mixing this suspension with an aqueous solution containing the desired nucleic acid.
Then, the suspension obtained is mixed with the aqueous protein solution described above and the pathogenic organism is spontaneously coated in the microscopic perls. form and which consist of a proteinaceous material and a nucleic acid.
As another, but less preferred, method, the buffered suspension of microbes can first be mixed with the protein material solution, after which the resulting suspension is mixed with an aqueous solution containing the nucleic acid. It has been found that after shaking the container in which the solutions were mixed, the microscopic beads underwent coalescence and spontaneously reformed, additional pathogens thus usually becoming embedded in the microscopic beads.
In the embodiments of the invention in which it is desirable to use the microscopic beads described above resulting from a paste formulation technique, the microbial pathogens vis-à-vis the insects can be coated in the microscopic beads by simply suspending them in water (as described above, a buffering agent can be added if necessary), then mixing this suspension with the mixture of particles of nucleic acid and particles of matter protein
(care should be taken to use only enough water to moisten the mixture and
give it a pasty consistency). Then, the pasty mixture obtained is stirred as described above so as to divide it into separate microscopic beads. As another method, the nucleic acid particles and the protein material particles can be mixed with water in an amount sufficient to moisten the mixture and
give it a pasty consistency, the microbial pathogenic organisms vis-à-vis insects can then be mixed with this pasty mixture to be coated in the separate microscopic beads by stirring the mixture as described above.
Although the microscopic beads obtained by the solution and paste formulation techniques described above have a certain degree of stability, it is generally advantageous to increase their stability in order to facilitate the separation between the coated pathogenic organisms.
and uncoated pathogens, while also making handling easier * This remark is particularly true with regard to microscopic beads resulting from a paste formulation technique * In a preferred embodiment of the invention, this stabilization by chemical crosslinking of the molecules of the microscopic pearls by treating them with crosslinking agents such as, for example, acid
<EMI ID = 17.1>
esters, dithiobissuccimidyl propionate, etc., by adopting conventional crosslinking techniques. If you want to use glutaraldehyde, you should
<EMI ID = 18.1>
or less ; in fact, the Applicant has found that by increasing the concentration of glutaraldehyde, certain pathogenic organisms, in particular, the bacterium Bacillus thuringiensis, tended to be neutralized. It has been found that tannic acid tam-
<EMI ID = 19.1>
at a concentration of 10% w / v and the Applicant believes that it is nontoxic to most microbial pathogens for insects, at concentrations of 1% w / v or less. Although buffered tannic acid with a concentration in the range of about 0.01 can be used
<EMI ID = 20.1> concentrations in the range from
<EMI ID = 21.1>
It should be noted that the degree of crosslinking can be fairly easily adjusted by adjusting the duration, concentration, temperature and other crosslinking conditions. For example, the degree of crosslinking can be adjusted by stopping the crosslinking reaction by adding a small molecule that reacts with the crosslinking agent (for example, a
<EMI ID = 22.1>
the crosslinking reagent in low concentrations.
This chemical crosslinking of microscopic pearls offers several advantages, in particular:
(1) stabilization against the shear forces created by applying the insecticide by spraying; (2) the possible maintenance of fluid centers inside the microscopic beads; (3) the possible maintenance, inside the microscopic pearls, of a pH lower than that of the ambient environment surrounding the microscopic pearls (that is to say the alkaline digestive juices of the intestines of insects) so that the the interior of the microscopic pearls can be maintained at a pH close to the optimum pH for the viability, the conservation, etc., of the microbial pathogenic organism;
(4) control of the position in the intestines of insects where the pathogenic organism is released
(that is, the stronger the cross-linking, the more the release of the pathogenic organism will spread in the intestine and vice versa), thus increasing the infectivity of the pathogenic organism. In addition, the use of tannic acid as a crosslinking agent increases the optical density of microscopic shovels.
<EMI ID = 23.1>
better protection of coated microbes against neutralization caused by sunlight.
The Applicant has also found that it was possible to coat (that is to say enclose) the microbial pathogenic organism with respect to insects much more easily and in much larger quantities in the microscopic pearls described above and resulting of a solution formulation technique when the overall surface charge of this pathogenic organism is first modified so as to make it almost completely (i.e.
<EMI ID = 24.1>
tive. The Applicant thinks that it is also the same with regard to microscopic pearls resulting from a paste formulation technique.
This modification of surface charge can be effected, for example, by controlled addition of a protein modifier, for example, succinic anhydride (to make the charge strongly negative) and similar compounds (see, for example, Gary E Means and Robert E. Feeney, "Chemical Modifications of
<EMI ID = 25.1>
care should be taken to choose a protein modifying agent which does not neutralize or harm the pathogenic organism to be coated. For example, the Applicant has found that succinic anhydride cannot be used with vegetative bacterial cells (for example, Serratia marsescens, etc.), since it tends to neutralize these cells. A change to a strongly positive surface charge can be made, for example, by using tannic acid to link positively charged proteins (for example, a protamine) to the surface of the pathogenic organism.
In comparative studies, the Applicant has found that, in the absence of any change in charge, only about 1% of the available spores of Bacillus thuringiensis were coated in microscopic beads (solution formulations) and that using Bacillus thuringiensis spores with a strongly negative surface charge (treatment with anhydrous
<EMI ID = 26.1>
Bacillus thuringiensis spores coated in microscopic pearls and that by using Bacillus thuringiensis spores with a strongly positive surface charge (treatment with tannic acid, then with protamine sulphate), approximately
<EMI ID = 27.1>
in microscopic pearls. The efficiency of these charge modification techniques can be increased by first washing the microbial pathogen for insects, and in some embodiments it may be desirable to wash in organic solutions (for example, example, an ethanolic solution at 60% by weight) and inorganic (for example, a 1M sodium chloride solution) separated, provided that the pathogenic organism used is not sensitive to these materials. Applicants have found that before attempting to apply any of the charge modification techniques described above to insect viruses, it is generally preferable to purify the viruses (for example, by centrifugation, filtration, etc.) to remove insect debris.
Since the pathogenic organism whose load has been modified, apparently competes with the component with the same load of the microscopic pearl for the positions occupied in it, it may be necessary to reduce the concentration of this component by the same charge to a
value facilitating the incorporation of the pathogenic organism into the microscopic pearl. For example, if it is desirable to enclose in a microscopic bead of ribonucleic acid / proteins of the type described above, microbial pathogens (for insects) which have been modified into a strongly negative surface charge, it it may be necessary to slightly reduce the concentration of the ribonucleic acid solution (ribonucleic acid is also negatively charged) before mixing it with the protein solution.
Likewise, in a microscopic bead system of this type., If the surface charge of the pathogen has been changed to a strongly positive surface charge, then it may be necessary to slightly reduce the concentration of the protein solution (the protein is positively charged) before mixing with the ribonucleic acid solution. The latter system may be more advantageous for the subject of the present invention, since it does not require a reduction in the amount of the radiation absorbing material (i.e. ribonucleic acid).
Since a main object of the present invention is to protect microbial photosensitive pathogenic organisms for insects against neutralization by harmful radiation from the sun, when choosing the materials to be used for the formulation of microscopic pearls, it is obviously important to choose strongly absorbing and / or reflecting materials
these harmful radiation. Among the materials which it is preferable to use for making the microscopic beads, there are ribonucleic acid and a protein material such as, for example, hemoglobin, a protamine or a synthetic amino acid polymer. FIG. 1 of the appended drawings illustrates the optical density (that is to say the absorption + the reflection) of the microscopic beads made up of ribonucleic acid and a protamine, these beads being produced in accordance with the formulation technique of solutions described above. The solid line in Figure 1 relates to the optical density of a solution of microscopic beads obtained by combining equal volumes of ribonucleic acid.
<EMI ID = 28.1>
glutaraldehyde) in the solar ultraviolet range. The dashed line in Figure 1 relates to the optical density of a solution of microscopic beads obtained by combining equal volumes of 0.67% ribonucleic acid and a 1% protamine (crosslinked with the tannic acid) in the range of solar ultraviolet and visible light (up to 600 nm).
In many cases, the presence of a nucleic acid in a microscopic pearl provides
<EMI ID = 29.1>
many microbes, the deterioration caused by sunlight at wavelengths greater than 313 nm was mainly due to the reaction of the nucleic acids of the microbes with free radicals (the deterioration of the
<EMI ID = 30.1>
in turn, forms free radicals). The nucleic acid present in the structure of microscopic beads tends to react specifically with ra-
<EMI ID = 31.1>
laugh with the nucleic acids of microbes, thus preventing any deterioration.
Since the pathogenic effect of the microbial agent cannot be exerted as long as this agent remains coated in the microscopic pearls, care must be taken in the choice of materials to be used for the formulation of these microscopic pearls, in order to select the materials allowing the release of this agent after the ingestion of the microscopic pearls by the insect, Although other materials can be chosen, the Applicant has found that microscopic pearls consisting of a protein and of a nucleic acid (for example, ribonucleic acid) had very satisfactory release characteristics.
After ingestion of the microscopic pearls by the insect, the microscopic pearls are attacked by the proteases and nucleases of the digestive tract of the insect (i.e. the intestine), thus leading to the release of the microbe .
Therefore, it is important to choose, for microscopic pearls, materials that do not resist this type of attack. The Applicant has found that by incubating the bacterium Bacillus thuringiensis (cells, spores and crystals of toxins) coated in microscopic beads made up of ribonucleic acid and a protamine (these beads being obtained in accordance with the technique of formulation of solutions described above) at room temperature and in the presence of the digestive juices of the insects, the release of this bacterium Bacillus thuringiensis began after a few minutes, the progressive and complete release taking place within half an hour
<EMI ID = 32.1>
The Applicant has also found that by incubating the bacterium Bacillus thuringiensis coated in microscopic beads made up of ribonucleic acid and a protamine (these beads being obtained according to the technique described above) at room temperature and in the presence of acids amines and / or sugars such as those found in the digestive tract of insects,
<EMI ID = 33.1>
microscopic pearls in about two hours.
This dissolution does not occur in water or in a buffer alone, so that the microscopic beads then remain intact on the surface of the leaves.
Furthermore, the experimental results shown in FIGS. 9, 11 and 12 indicate that the nuclear polyhedrosis viruses of the Douglas fir moth and the nuclear polyhedrosis viruses Auto rapha californica coated in the microscopic pearls of the present invention were, in fact, released into the gut of insects and
that by being liberated in this way, they exerted the desired lethal effect.
It should be noted that the present invention can be adopted for any microbial pathogenic organism photosensitive for insects, including pathogenic organisms of viral origin,
<EMI ID = 34.1>
below illustrate the possibility of applying the present invention to specific spore-forming bacteria (that is to say the cells, spores and crystals of toxins of Bacillus thuringien-
<EMI ID = 35.1>
sibility to apply the present invention to three species of vegetative bacterial cells. Example 6 below illustrates the possibility of applying the present invention to a bacterial virus. The results
<EMI ID = 36.1>
The present invention can be adopted to protect non-occluded insect viruses from neutralization caused by sunlight. Examples 9, 11 and 12 illustrate the possibility of applying the present invention to two species of occluded insect virus.
In the examples below and the appended figures, the microbial pathogenic organisms for insects which are named and / or designated by <EMI ID = 37.1>
genes that have not been coated in microscopic pearls *. In each example, the "unprotected" pathogens were subjected to treatment, exposure and viability testing in a manner as identical as possible to that adopted for pathogens which were coated in beads microscopic (that is, "unprotected" pathogenic organisms are controls).
Possibility of industrial application
The following examples illustrate various embodiments of the present invention. It is understood that these examples and the above description of the preferred embodiments, as well as the appended figures should be interpreted simply by way of illustration and without any limiting character.
Example 1
<EMI ID = 38.1>
<EMI ID = 39.1>
spores and asporulated (crystalline) bodies, which are obtained from a culture of sporula medium-
<EMI ID = 40.1>
1.5 ml of an aqueous solution buffered to 1.34% (by weight) of yeast ribonucleic acid (quality B of
<EMI ID = 41.1>
mixing 0.4 ml of this suspension in 1.9 ml of an aqueous solution buffered to 0.36% (by weight) of protamine sulphate (quality B of "Sigma").
Microscopic beads of ribonucleic acid / protamine spontaneously form, each containing certain bacterial cells and / or spores and / or asporulated bodies. By stirring the mixture, division takes place with subsequent spontaneous reforma-tion of additional microscopic beads. These microscopic beads are placed in a glass Petri dish and ex-
<EMI ID = 42.1>
"General Electric". The Petri dishes are placed on a rotary shaker at a distance of 78 cm below the lamp and shaken at 40 rpm.
The viability is determined by depositing on plates on an agar-agar / brain-heart infusion medium of "Difco".
During exposure to germicidal ultraviolet radiation (maximum radiation at
254 nm) sufficient to kill 99.99% of any form of Bacillus thuringiensis bacteria
unprotected, almost all Bacillus thuringiensis bacteria that have been embedded in microscopic pearls (i.e., bacterial cells and / or protected spores and / or asporulated bodies) survive. This characteristic is illustrated in Figure 2. It is believed that the premature mortality represented by the line indicated by "Bacillus thu-
<EMI ID = 43.1>
Bacillus thuringiensis bacteria actually coated in the microscopic pearls. Under the microscope, it is observed that the percentage of Bacillus thuringiensis bacteria actually coated is in the inter-
<EMI ID = 44.1>
Example 2
Microscopic beads are prepared in which the bacteria Bacillus thuringiensis are coated, as described in Example 1, then 1 mg / ml of dithiobissuccimidyl propionate in dimethyl sulfoxide is added in order to crosslink and stabilize the microscopic beads. 0.2 ml is deposited
<EMI ID = 45.1> stirring, the filters are washed in a dilution buffer and they are placed in plates as described in Example 1.
The results of this process are shown in Figure 3.
Example 3
First of all, 1 × 109 Bacillus thuringiensis spores are washed, which are obtained by culture in
a sporulation medium, in a 60% ethanolic solution, then they are washed in a 1M NaCl solution, the bacteria Bacillus thuringiensis being separated
of these washing solutions by centrifugation. Then we put the bacteria Bacillus thuringiensis
washed in suspension in 20 ml of a buffer solution
<EMI ID = 46.1>
Then, to this suspension is added dry succinic anhydride (
<EMI ID = 47.1>
ml each. The additions are carried out with constant stirring and, between each addition, the mixture is stirred for 10 minutes. The pH is maintained at 8 + 0.1 by addition of NaOH. When the reaction is complete (the pH no longer changes), the bacteria Bacillus thuringiensis are separated (by centrifugation) and washed. Next, this modified (negative exchange) Bacillus thuringiensis bacterium is incorporated into microscopic beads of ribonucleic acid / protamine in accordance with the methods described in Example 1, after which these microscopic beads are crosslinked as described in Example 2.
It is found that this modified Bacillus thuringiensis bacterium penetrates into microscopic pearls much more easily and in much higher numbers than the unmodified Bacillus thuringiensis bacterium used in Examples 1 and 2, probably because the surface charge of the Bacillus bacteria thuringiensis is changed from a neutral charge to a negative charge.
Example 4
As described in Example 1, a solution of unprotected Bacillus thuringiensis bacteria (cells, spores and crystals of toxins) and protected Bacillus thuringiensis bacteria (that is to say coated in microscopic beads as described) is subjected
<EMI ID = 48.1>
unprotected and 40% protected bacteria; values determined under a microscope) at 254 nm radiation.
Essentially none of the unprotected spores remain viable after undergoing this irradiation for 15 minutes, while 1 x 106 protected spores (i.e. 40% of the total initial mixture) remain viable after having undergone this irradiation for 1 hour . Viability is determined as described in Example 1. The results of this experiment are shown in FIG. 4.
Example 5
A concentration of 1 x 109 Bacillus thuringiensis spores (including cells, spores and asporulated crystals) is suspended in
10 ml of 0.15N phosphate buffer at pH 7.5
(we obtain the preparation of Bacillus thuringiensis
and it is modified as described in Example 3). We
<EMI ID = 49.1>
biochem ") in this suspension and mix by vigorous mixing in a vortex mixing device (" Vortex "). Then, this suspension is added to a solution buffered with 10% protamine sulphate (% by weight, quality B, "Calbiochem." And stirred vigorously for 5 seconds. To this solution, glutaraldehyde (25%) of "Sigma") is added to a final concentration of
0.15% (by volume). After 30 minutes, a lozenge consisting of large beads forms at the bottom of the tube.
<EMI ID = 50.1> supernatant and the pellet is resuspended to a final volume of 20 ml by shaking. We deposit
<EMI ID = 51.1>
dry it overnight in vacuum. The filters are exposed to sunlight (at 1 pm; relative humidity content: 23%; temperature: 31.7 [deg.] C). Then, the filters are washed in an acetate buffer
(0.15N, pH: 4) to divide the microscopic pearls and release the bacterium Bacillus thurin � iensis which is deposited in plates as described in Example 1.
The results of this experiment are
<EMI ID = 52.1>
unprotected are killed after 30 minutes,
Example 6
The purpose of this example is to demonstrate the protection of a virus in accordance with the present invention. The reactions and responses of an insect virus and a bacterial virus (so-called bacteriophage) must be similar, since they both basically consist of a nucleic acid in a protein coating. Consequently, it was chosen to model the system of the invention on the bacterial virus E. coli, bacteriophage T-4.
T-4 bacteriophages are allowed to grow
<EMI ID = 53.1>
lon P). E. coli BB is inoculated into 100 ml of broth P and allowed to grow overnight. The following morning, a 1: 100 dilution is carried out to obtain a fresh broth and the growth is allowed to proceed for one hour. To this culture of
<EMI ID = 54.1>
bacteriophages and allowed to grow for 6 hours
(37 [deg.] C, rapid agitation). At the end of this period, 5 drops of chloroform are added to kill all
<EMI ID = 55.1>
of the bacteriophage strain.
We prepare microscopic pearls in
<EMI ID = 56.1>
"Calbiochem") in 10 mi of the bacteriophage strain. This suspension is added to ribonucleic acid.
<EMI ID = 57.1>
copics form spontaneously. The exposure to ultraviolet rays is carried out as described in Example 1. Samples are taken at determined times and dilutions are made in the broth P. The viable bacteriophages are determined by the method described in the following reference: Grace C. Rovozzo and Carroll N. Burk, "A Manual of Basic Virolo � ical Techniques". Prentice-Hall Biological Techniques Series, 1973, page 168, using agar-agar medium and P broth, as well as E. coli BB as indicator bacteria.
The results of this experiment are
<EMI ID = 58.1>
Unprotected viruses are all killed after about 5 minutes. On the other hand, after an initial fall similar to that observed in bacterial tests, the virus which has been coated in microscopic pearls, manifests a strong resistance to ultraviolet light (about 40% of viruses are protected against neutralization).
Example 7
We prepare microscopic beads in
<EMI ID = 59.1>
describes me in Example 3, with the exception that dithiobissuccimidyl propionate in dimethyl sulfoxide is not used to crosslink the semi croscopic pearls. In this example, the microscopic beads are crosslinked and stabilized by adding,
to the suspension of these pearls, 1% by weight / volume of tannic acid buffered by a phosphate and leaving to stand at room temperature for about 30 minutes. The suspension of the microscopic crosslinked beads is diluted with a dilution buffer (phosphate) so as to obtain a diluted suspension containing approximately 100 spores per ml, while samples of 1 ml of this diluted suspension are introduced into "Milli" filters. -
<EMI ID = 60.1>
leaving to dry overnight. The filters are exposed under a "General Electric" solar lamp
at 1,572 watts / m2 at a distance of 381 mm, this lamp emitting radiation of a wavelength in the range from about 290 nm to 400 nm.
One hour of exposure under this solar lamp is equivalent to approximately 151 hours under direct sunlight on a day in July in one place.
<EMI ID = 61.1>
15 days). After exposure, the spores are directly deposited on a counting agar-agar plate and, after incubation for 24 hours, the colonies growing are counted on the filters. The experimental results are shown in Figure 7 '
Example 8
<EMI ID = 62.1>
vegetative bacterial cells of the species Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens and Escherichia coli are treated with succinic anhydride
<EMI ID = 63.1>
1M carbonate buffer solution (pH 8), then adding
50 mg succinic anhydride. We do not maintain the
<EMI ID = 64.1>
<EMI ID = 65.1>
térienne during harvest and washing. Again in separate trials � the cells of the three species treated with succinic anhydride are suspended in 4 ml of a phos- buffer solution <EMI ID = 66.1>
this suspension with 1 ml of a buffered solution of 1.34% w / v ribonucleic acid (from "Sigma"), The suspension obtained is mixed with 2 ml
<EMI ID = 67.1>
volume (from "Calbiochem."), thus spontaneously forming the microscopic beads, after which 0.4 ml of a 10% tannic acid solution (w / v) is added to the suspension of the microscopic beads. (Note:
.the buffer mentioned above is a buffer solution <EMI ID = 68.1>
the suspension of microscopic pearls in tannic acid for 30 minutes at room temperature, then it is washed three times in the phosphate buffer solution described above, by centrifugation. Observation under the microscope reveals that approximately 30% of each of the three species subjected to the tests are coated in the microscopic beads.
The suspensions of the microscopic pearls obtained in the three series of experiments under the solar lamp of "General Electric" described in example 7 are exposed separately, adopting the experimental method described in example 1 (that is to say say exposure on a rotary agitator), with the exception that the suspension contains a greater number
of microscopic pearls. Figure 8 shows the results of a representative cell test
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performed on the Serratia marcenscens and Escherichia coli bacterial cells (not shown) are similar to those illustrated in FIG. 8.
However, it should be noted that by carrying out experiments as a result of which the results given in FIG. 8 have been obtained, it is to be supposed that any bacterial cell in the suspension of microscopic pearls, which has not been coated in the latter, is killed during the exposure of this suspension on the rotary agitator. In order to verify the accuracy of this hypothesis, a second control experiment was carried out (in addition to the witness indicated in FIG. 8).
In this second control experiment, spores of Bacillus thuringiensis were treated as described above, with the exception that they were not coated in microscopic beads, but were simply mixed in a suspension containing microscopic beads already formed (using roughly the same number of microscopic beads as in the experiments described above), after which this mixture was exposed under the sunlamp described above. If this assumption is correct, then most of the cells should be killed. However, it was found that the cells were killed at about the same rate as the cells which had been coated in the microscopic beads.
This is attributed to the relatively large number of microscopic beads present in the suspensions that have been exposed (that is, the microscopic bead suspensions were too thick). It is believed that the large number of microscopic pearls present reduces the movement of the cells located outside of these pearls, so that the cells possibly found below a microscopic pearl remain essentially there.
throughout the exhibition thereby being protected.
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xith control experiment, demonstrates that the microscopic pearls protect the cells against neutralization caused by sunlight (whether the cells are in or outside the microscopic pearls, but below). Likewise, as indicated above, observation under the microscope reveals that the cells of each of the three bacterial species subjected to the tests were coated in the microscopic beads.
Example 9
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of the Douglas fir orgiesia moth in suspension
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and processes it with six additions of
50 mg succinic anhydride. We use NaOH IN
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harvest the virus suspension by centrifugation and
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to then resuspend it in 1 ml of the buffer. This suspension is then treated as described in Example 8 to form microscopic crosslinked beads in which the viruses are coated.
The suspension is exposed under the "General Electric" solar lamp described in Example 8, then diluted with the buffer and subjected to an infectivity test as described in Example 12. The results of in
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have the same error as that described in Example 8 (i.e. the suspension of microscopic pearls which has been subjected to exposure is too thick to kill the viruses which have not been coated in microscopic pearls). However, as indicated in Example 8, observation under the microscope reveals that approximately 30% of the viruses have been coated in the microscopic pearls and that the latter have provided protection against the neutralization caused by
sunlight (whether the viruses are inside or outside the microscopic beads, but below).
Example 10
1 g of hemoglobin is mixed (powder
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of a dry powder, we put about 1 x 109 spores
<EMI ID = 77.1> buffer solution (0.15N acetate, pH 5), then the suspension thus obtained is added to the mixture of ribonucleic acid and hemoglobin. An additional buffer solution is added in an amount sufficient to form a hydrated (i.e. moist) mass having a pasty consistency. The total amount of buffer solution mixed with the mixture of ribonucleic acid and hemoglobin is approximately 1 ml. Using a needle no) 18 (using a syringe
of 5 cm3), we chase this paste (that is to say that
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0.15N) of tannic acid at 1% w / v and is subjected to magnetic stirring in a pestle.
After stirring for approximately 30 minutes, the extruded dough is divided into separate microscopic and crosslinked beads of a size of approximately
100 u or less, in which the bacterium Bacillus thuringiensis is incorporated. This suspension of microscopic pearls is diluted and it is exposed under a "General Electric" solar lamp of the type described in example, 7 (that is to say on filters). The experimental results are shown in Figure 10.
Example 11
We coat the nucleus polyhedrosis virus
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polyhedral inclusions) in microscopic beads of ribonucleic acid / protamine by adopting
the technique described in Example 10. In this example, 1 g of protamine is used (in the form of a
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form of a dry powder), the tampon is a solution
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uses tannic acid to crosslink and stabilize microscopic beads. The microscopic bead suspensions are washed twice in distilled water, then diluted 1: 100 in distilled water. The diluted suspensions are exposed under a "General Electric" solar lamp by adopting the technique described in Example 1, then the exposed suspensions are diluted in a phosphate buffer as required by the infectivity tests described above. after. Larvae of Trichoplusia ni are used to measure the infectivity of the protected virus (that is, coated in the microscopic beads) and the unprotected virus (that is, the control virus). Infectivity is determined by depositing 10 µl of separate dilutions (1:10 <2> at 1: 10)) on a 0.2 g piece of food.
The larvae are allowed to eat the whole piece of food, then a new piece of food (2 g) is placed in the vial. When all the control larvae (not having ingested the microscopic virus pearls) have metamorphosed into nymphs, an autopsy of the dead larvae is performed in order to check whether the death is due to infection caused by the Autographa californica virus ( this has been found to be the case). We determined the doses
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vis-à-vis the virus which had been protected by microscopic pearls, as well as vis-à-vis the control virus which had not been protected by any microscopic pearls. General procedures for practicing lethal dose determinations at
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639, B.D. Davis et al., Harper and Row, 1973. The results relating to the lethal doses at 50% are shown in FIG. 11.
Example 12
Example 11 is repeated using the nuclear polyhedrosis virus of the Douglas fir moth instead of the Autographa californica virus and the larvae of the Douglas fir moth instead of the larvae of Trichoplusia ni, with the exception that an autopsy of the larvae is performed after a period of 10 days. The results relating to the lethal doses at 50% are shown in FIG. 12.
It is understood that the term "nucleic acid", used throughout the present specification and in the claims below, encompasses all polynucleotides. Likewise, it is understood that the expression "protein" encompasses all polypeptides.
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described specifically with reference to preferred embodiments and optional features, it is understood that modifications and variants may be made by those skilled in the art to the concepts described. These modifications and variants coming within the scope of invention as defined by the claims below.
CLAIMS
1. Method for coating microorganisms and their biologically active chemicals in microscopic pearls, characterized in that it comprises the steps which consist in:
a) preparing a mixture comprising (i) particles of a nucleic acid, (ii) particles of a protein material, (iii) microorganisms and their biologically active products, and (iv) water in enough to moisten almost all of the mixture and give it a pasty consistency; and b) agitating the pasty mixture so as to divide it into separate microscopic beads in which the microorganisms and their biologically active chemicals are thus coated.