"Procédé de contrôle continu du déroulement d'une réaction enzymatique et
appareil pour sa mise en oeuvre' <EMI ID=1.1>
faisant l'objet du brevet No 809269 ,en vue de pouvoir exploiter ce procédé d'une façon plus efficace à l'échelle industrielle.
Comme on le sait, les conditions réactionnelles ainsi que l'activité catalytique des enzymes peuvent varier notablement au cours d'une réaction enzymatique prolongée. Ainsi, il n'a généralement pas été possible d'assurer un contrôle rapide et précis du déroulement d'une réaction enzymatique en agissant uniquement sur le pH du milieu réactionnel, la température et la concentration du substrat. En effet, la modification de ces paramètres
de réaction ne permet pas de tenir compte des diverses exigences d'une réaction enzymatique faisant partie d'un cycle de fabrication industrielle où des quantités relativement importantes d'enzyme doivent être utilisées d'une manière aussi reproductible et économique que possible.
Or, le procédé de catalyse enzymatique faisant l'objet du brevet
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la possibilité d'un contrôle précis et rapide de la réaction enzymatique désirée, ce contrôle étant obtenu grâce à une"électrocata-
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trode enzymatique dont on règle le potentiel de manière à pouvoir
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période relativement longue. Ce procédé permet d'assurer ainsi une transformation continue ou semi-continue dé façon reproductible.et, par conséquent, d'obtenir un produit final uniforme à l'aide d'une réaction enzymatique.
Ledit procédé consiste donc essentiellement à régler l'activité catalytique d'une enzyme en utilisant une électrode enzymatique,
sur laquelle l'enzyme est fixée sur un support conducteur de manière à pouvoir régler le potentiel électrique de son support, et en effectuant une "électrocatalyse enzymatique- par un réglage du potentiel
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réactionnel, de manière à régler la vitesse de réaction à une valeur ; aésirée. Cela permet de réaliser des avantages techniques importants; en maîtrisant l'action catalytique de l'enzyme au cours de la réaction;
désirée.
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en réglant le potentiel électrique de son support conducteur est évidemment d'un très grand intérêt pratique pour tout procédé industriel dans lequel la catalyse enzymatique pourrait être utilisée.
En effet, la grande sélectivité de chaque enzyme constitue a' priori un atout majeur. Cependant, l'activité catalytique d'une
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action, mais elle présente un caractère essentiellement imprévisible étant donné qu'elle peut varier considérablement au cours du temps et dépend de nombreux facteurs qui,.8 leur tour, sont susceptibles de varier plus ou moins indépendemment les uns des autres. Ainsi, ledit réglage de l'activité enzymatique, par l'intermédiaire du.potentiel électrique du support conducteur de l'enzyme, offre la possibilité de compenser simultanément l'influence de différents facteurs dont le réglage continu est assez difficile dans les meilleurs des cas et impossible à réaliser en pratique dans de nombreux cas.
Or, il est évident que l'application de la catalyse enzymatique
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qui sont bien différentes de celles des réactions enzymatiques réalisées à faible échelle, par exemple à l'échelle du laboratoire.
Ainsi, la proportion d'enzyme effectivement utilisée pour la catalyse, le rendement global et la reproductibilité du procédé, la complexité et le coQt de l'appareillage utilisé, la possibilité d'un fonctionnement plus ou moins continu et la nécessité d'utiliser un personnel très spécialisé, peuvent tous constituer des facteurs déterminants pour l'exploitation efficace et économique d'un procédé industriel.
L'emploi d'une électrode enzymatique comprenant un support d'enzyme sous forme d'un corps solide macroporeux, comme il est décrit dans le brevet principal susmentionné, conduit à une surface de contact relativement restreinte entre l'enzyme fixée sur l'électrode et le milieu réactionnel contenant la substance à transformer.En - effet,la quantité d'enzyme pouvant être fixée sur la surface extérieure d'un corps d'électrode solide est relativement faible et une utilisation vraiment efficace de l'enzyme ainsi fixée nécessite en outre que l'on assure une mise en contact intime de l'ensemble du milieu réactionnel avec l'enzyme fixée sur l'électrode.
En outre, on a découvert par des essais que lorsqu'un maximum d'activité enzymatique est atteint en appliquant un potentiel constant à une électrode enzymatique solide, l'activité de l'enzyme avait tendance à baisser ensuite plus ou moins rapidement de manière à diminuer l'effet du potentiel. En d'autres termes, le maintien d'une.activité maximale ne semble pas possible lorsqu'on soumet le support de l'enzyme à un potentiel fixe, d'où l'intérêt principal d'un réglage du potentiel de manière à pouvoir maintenir une activité moyenne élevée.
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savoir, qu'une variation alternative du potentiel du support de l'enzyme autour d'une valeur moyenne réglable permettait de maintenir une activité enzymatique moyenne bien plus élevée que lorsqu'on soumet l'enzyme à l'action d'un potentiel à peu près constant.
La présente invention a pour but de réaliser pleinemen�es avantages techniques susmentionnés, qui sont inhérents au réglage
de l'activité enzymatique selon le procédé faisant l'objet dudit brevet principal, et cela de manière à pouvoir assurer une activité enzymatique aussi élevée que possible tout en tenant compte des considérations susmentionnées.
A cette fin, la présente invention a pour objet un procédé de
contrôle continu du déroulement d'une réaction enzymatique servant
à la transformation continue d'un substrat par l'intermédiaire d'une
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ducteur ionique, contenant le substrat à transformer; au contact d'une électrode enzymatique comportant cette enzyme fixée sur on support solide, conducteur électronique, et l'on applique Il cette électrode un potentiel électrique dont on règle la valeur afin de commander l'activité catalytique de l'enzyme de manière que la réaction désirée se déroule à une vitesse déterminée, caractérisé par le fait que l'on applique audit support de l'enzyme un potentiel qui varie alternativement entre deux niveaux de potentiel différents dont on règle la valeur moyenne de manière à maintenir une activité catalytique moyenne de l'enzyme, qui correspond à la vitesse de réaction désirée.
L'invention a en outre pour objet un appareil pour la mise en oeuvre de ce procédé, comprenant une chambre de réaction, au moins une électrode enzymatique comprenant au moins une enzyme, fixée
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d'alimentation électrique permettant d'appliquer une tension réglable entre ces deux électrodes, des moyens d'alimentation de la chambre de réaction en milieu réactionnel liquide contenant le substrat à transformer et des moyens d'évacuation des produits de réaction, caractérisé par le faits
- que l'électrode enzymatique est associée à la source d'alimentation électrique de maniera à pouvoir appliquer au support conducteur de l'enzyme un potentiel qui varie alternativement entre deux niveaux de potentiel différents dont la valeur moyenne est réglable
- et que des moyens de circulation sont associés à la chambre de réaction de manière à y faire circuler le milieu réactionnel liquide, en contact intime avec l'ensemble de la surface du support conducteur de l'enzyme.
Dans ce procédé et dans cet appareil, on se propose en outre d'utiliser une électrode enzymatique composée de deux parties: une partie catalytiquement active, formée de particules enzymatiques, constituées par une enzyme fixée sur un support conducteur et associées à une partie inerte conductrice qui constitue une électrode. inerte de travail servant uniquement à appliquer un potentiel réglable & ces particules enzymatiques afin de régler l'activité de l'enzyme fixé sur celles-ci.
L'emploi d'une telle électrode enzymatique, formée de ces deux parties distinctes, permet de choisir des types de dispositions très différents pour que l'électrode enzymatique puisse remplir ses deux fonctions (support et réglage) dans les meilleures conditions pour chaque application envisagée.
Un avantage important qui est obtenu par une telle électrode munie d'une messe enzymatique divisée réside dans le fait que, contrairement:
à une électrode solide, unitaire portant l'enzyme uniquement sur sa surface externe, une masse de particules enzymatiques permet de réa-
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beaucoup plus importants. De plus, comme on le verra plus loin, il devient possible d'utiliser différents types de réacteurs permettant de réaliser l'électrocatalyse enzymatique de façon très efficace.
Ainsi,par exemple, dans le cas d'une électrode à lit poreux fixe, tassé, formé de particules enzymatiques et disposé en contact avec l'électrode inerte de travail, la surface active spécifique par unité de volume ou de poids sera évidemment beaucoup de fois supérieure à celle d'une électrode unitaire. Cependant, étant donné que le milieu réactionnel liquide doit parcourir l'ensemble de ce lit, il convient de le former à partir de particules relativement
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à travers une partie du lit seulement. De plus, la vitesse du liquide doit être limitée afin d'éviter une perte de charge excessive.
On peut en outre envisager d'utiliser une électrode dispersée comprenant lesdites particules enzymatiques qui subissent un contact intermittent avec l'électrode de travail, ce contact pouvant alors être obtenu par un mouvement relatif qui peut être réalisé de différentes manières telles que : par un lit agité mécaniquement,.
un lit fluidisé ou un lit en circulation.
L'emploi d'un lit agité permet d'assurer un mélange intime et
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transformer par la réaction enzymatique et la répartition du produit de réaction dans l'ensemble du liquide.
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continuellement les produits de réaction en dehors du lit, ce qui peut constituer un avantage très important à l'égard de réactions dont le produit constitue un inhibiteur compétitif capable d'entrave:
le déroulement de la réaction.
Quant à l'emploi d'un lit en circulation, il permet d'augmenter pratiquement à volonté la quantité de masse enzymatique ainsi que le
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un recyclage répété.
Le dessin annexé représente schématiquement.et à titre d'exemple, plusieurs formes d'exécution d'un appareil pour la mise en oeuvre du procédé faisant l'objet de la présenté invention:
La fig. 1 est une coupe verticale schématique d'une première forme d'un appareil à lit fixe.
La fige ,2. est une coupe verticale schématique d'un appareil à lit agité.
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lit fluidisé.
L'appareil de la fig. 1 comprend une cellule 1 de réaction con-
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et une électrode inerte E2 (en platine). Une source non-représentée délivre le système réactionnel liquide SR à une entrée 2 de la
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travers l'électrode EE, d'où le liquide P contenant le produit de ' la réaction est évacué par une sortie 3 à l'aide d'une pompe
aspirante 4 à débit réglable.
L'électrode EE comprend une masse enzymatique ME disposée en contact avec une électrode Etl de travail, dans un tube 5 de verre. Cette électrode Etl est formée d'un matériau inerte (graphite) et la masse ME constitue un lit fixe,.poreux composé de particules enzymatiques tassées (pe) formées chacune d'un support conducteur (graphite) sur lequel l'enzyme est fixée par une liaison covalente. Ce lit fixe ME est disposé dans le tube 5 de verre entre
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L'électrode ER peut être, par exemple, une électrode de référence au calomel saturé (ECS). En outre, un tube G sert à faire barboter
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dans la cellule 1.
Les trois électrodes Etl, ER et E2 sont reliées à une source
8 d'alimentation électrique. Cette source comprend un potentiostat
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déterminée sans difficulté au moyen de quelques essais prélables dans lesquels on effectue la réaction enzymatique désirée à peu près dans les conditions réactionnelles moyennes prévues pour le fonc'.ionnement normal de l'appareil.
D'autre part, cette source 8 est agencée de manière à pouvoir <EMI ID=23.1>
entre une valeur de consigne affichée Ps et une valeur instantanée mesurée Pm d'une variable de. sortie qui dépend de la vitesse de
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Ainsi, on a indiqué très schématiquement un instrument de mesure
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mesurée Pm afin de pouvoir régler le potentiel E. en fonction de
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comme il est indiqué en traits discontinus: .
En effet, l'appareil décrit, muni d'un tel instrument de mesure
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l'activité de l'enzyme fixée sur l'électrode enzymatique, de manière a pouvoir maintenir ladite variable de sortie a sa valeur désirée
en éliminant tout écart qui apparaît entre Pm et Ps au cours de la réaction. En d'autres termes, on obtient ainsi assez facilement une régulation en boucle fermée permettant de maintenir Pm.égal a Ps.
Il devient ainsi possible de réaliser, par des moyens relativement simples, un système de régulation automatique en boucle fermée, comprenant la source 8, la cellule 1 et 1'instrument PR de mesure.
L'appareil décrit ci-dessus et représenté sur la fig. 1 peut être utilisé pour effectuer l'électrocatalyse enzymatique de la manière suivante:
(a) On choisit d'abord l'enzyme selon le substrat à transformer par l'intermédiaire de l'électrode enzymatique EE. On prépare alors la masse enzymatique de cette électrode en fixant cette enzyme sur des granules de graphite, d'une taille moyenne de l'ordre de 1500/� par exemple .Cette fixation peut être obtenue de toute manière appropriée et notamment au moyen d'une liaison covalente entre l'enzyme et des groupes réactifs formés par un prétraitement du suppor de graphite. On peut utiliser diverses techniques de fixation telles que celles décrites dans le brevet cité plus haut.
Toutefois, le procédé de fixation ne fait pas partie des perfectionnements selon la présente invention et ne sera donc pas décrit plus en détail.
(b) Après le montage des électrodes dans l'appareil selon la dis- <EMI ID=28.1>
le liquide réactionnel avec un débit déterminé; la composition moyenne de ce liquide est déterminée au préalable, ainsi que son débit optimal à travers l'appareil, lequel peut cependant fonctionner à différents débits constants.
<EMI ID=29.1> enzymatique au sein de l'électrode EE; l'activité de l'enzyme est alors réglée au cours de la réaction en effectuant un réglage de
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l'électrode EE, par l'intermédiaire de l'électrode Etl de travail.
(d) Afin de maintenir une vitesse de réaction désirée, on pro- cède alors au réglage de la manière suivantes <EMI ID=31.1> mesurer de façon continue ou intermittente au cours de la réaction, ; la.valeur instantanée Pm de la grandeur de sortie déjà mentionnée, . .qui correspond au produit de la réaction;
- on compare continuellement Pm à Ps afin de déterminer tout <EMI ID=32.1>
versa, de manière que cet écart soit annulé continuellement lorsqu'il apparaît au cours de la réaction et que cette dernière se dé-
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signe affichée Ps.
Cet appareil permet ainsi de maintenir une activité enzymatique moyenne sensiblement constante en réglant le potentiel El appliqué
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automatique avec un système de régulation en boucle fermée comprenant la source 8, la cellule 1 munie de l'électrode EE, et l'instrument de mesure PR associé à des moyens conventionnels (comparateurs,
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de compenser simultanément l'influence de divers facteurs variables, tels que pH et température du milieu réactionnel et la diminution d'activité qui peut avoir différentes causes telles que l'inhibition l'empoisonnement ou le vieillissement de l'enzyme.
Or, l'appareillage utilisé à cette fin est relativement simple, comme il ressort de ce qui précède. La source 8 et l'instrument de mesure PR peuvent être constitués par des éléments conventionnels qui n'ont pas été décrits plus en détail étant donné qu'ils ne font pas partie des perfectionnements selon la présente invention.
Il est toutefois évident que le réglage du potention El permettra de compenser des variation*" des paramètres de réaction (pH, temps) seulement dans certaines limites. Ain�i, par exemple, E. ne pourra
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évidemment être maintenu dans une gamme permettant d'assurer un niveau d'activité satisfaisant.
Or, des gammes de réglage du potentiel El peuvent être établie*
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différents débits de liquide réactionnel. On peut ainsi choisir, dans chaque cas, le débit le plus approprié pour assurer le réglage du
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enzymatique à une valeur moyenne satisfaisante.
Dans la forme d'exécution selon la fig. 2, l'appareil comprend également une enceinte 1 de réaction munie d'une entrée 2, 4'une
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de référence ER (type ECS) et une contre-électrode E2.
Toutefois, la disposition des électrodes est bien différente.
Ainsi l'électrode enzymatique comprend ici une masse ME de parti- cules enzymatiques pe mises en suspension dans le système liquide
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agitateur 9.
Ce lit agité est enfermé entre la contre-électrode E2, constituée ici par la paroi (en carbone vitreux) de l'enceinte 1, et l'électrode Etl de tavail est constitué ici par un bloc de graphite massif. Ce ! bloc est fixé à un couvercle isolant 10, relié à une borne 11 et i isolé de la paroi (électrode E2) de l'enceinte 1 par un joint isolant '
12.
L'électrode massive Etl présente ainsi sa surface inférieure au contact avec ledit lit agité et est traversée par l'entrée 2, la sortie 3 et l'électrode ER de référence, qui est. entourée par une
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prend en outre une cavité 13 qui communique avec l'enceinte 1 et constitue un volume tampon qui permet de maintenir la surface
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tation 9 lequel est actionné depuis l'extérieur au moyen d'un champ
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mouvement vertical, circulatoire comme il est indiqué par des flèches ce mouvement produisant ainsi des collisions répétées entre les particules pe en suspension dans le lit agité et, d'une part, la surface inférieure de l'électrode Etl et, d'autre part, la contre-électrode E2 constituée par la paroi de l'enceinte 1.
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d'alimentation électrique qui comprend un potentiostat agencé de manière à appliquer à l'électrode Etl de travail de l'électrode enzymatique un potentiel réglable El par rapport à l'électrode de
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empiriquement au préalable et affichée sur la source 14.
Les particules enzymatiques pe du lit agité circulant verticalement sont ainsi portées alternativement à des potentiels différents,
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avec les électrodes Etl et E2, respectivement.
Comme on le voit sur la fig. 2, l'entrée 2 et la sortie 3 sont reliées à une pompe doseuse 15 à double circulation. Cette pompe comprend une première entrée reliée à un réservoir 16 d'alimentation
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la sortie 3 de cette enceinte comprend une cloison poreuse 18 qui empêche le passage de particules et permet le passage de liquide à partir de l'enceinte 1, à travers la sortie 3, à une seconde entrée
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réservoir d'évacuation 21 par l'intermédiaire d'un tuyau 20 muni d'une vanne 23 à trois voies. Un tuyau 24 de dérivation ("by-pass") est en outre relié à ces deux vannes 22 et 23 de manière à permettre un recyclage comme il sera décrit plus loin. La commande simultanée de ces deux vannes 22, 23 est indiquée schématiquement par une ligne pointillée.
Lorsque la pompe 15 est en marche lors du fonctionnement normal de l'appareil, cette pompe délivre un volume de liquide donné du réservoir 16 à l'enceinte 1 et transfère en même temps un volume égal de cette enceinte 1 au réservoir 21.
Un instrument PR de mesure est enfin associé au tuyau 20 afin de-mesurer la valeur instantanée Pm d'une variable de sortie qui dépend de la vitesse de réaction et correspond au produit de réaction P obtenu à la sortie de l'appareil.. - .
Cet appareil selon la fig. 2 peut être utilisé pour effectuer l'électrocatalyse enzymatique de la manière suivantes
(a) On choisit d'abord l'enzyme et l'on prépare la masse ME de particules enzymatiques pe formées de l'enzyme fixée sur graphite comme il est mentionné plus haut par rapport à la fig. 1.. Toutefois, on peut utiliser dans ce cas du graphite pulvérulent
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par exemple, ce qui permet d'augmenter davantage le taux de fixation (rapport massique enzyme/support) ainsi que la surface active spécifique de l'électrode enzymatique.
(b) Après avoir introduit une masse enzymatique prédéterminée ME dans l'enceinte 1 et assemblé l'appareil selon la disposition représentée sur la fig. 2, on remplit l'enceinte 1 de liquide réactionnel à partir du réservoir 16, on actionne l'agitateur 9 de manière à former ledit lit agité de particules pe et l'on affiche <EMI ID=50.1>
au préalable. Les particules pe du lit agité en circulation sont ainsi soumises alternativement à deux potentiels qui correspondent
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(c) Lors d'une phase de démarrage de l'appareil, les vannes 22 et 23 sont ajustées de manière à.effectuer le recyclage du liquide réactionnel dans l'enceinte 1 par l'intermédiaire de la pompe 15et du tuyau 24. Ce recyclage lors de la phase de démarrage permet d'atteindre rapidement la valeur de consignées de la variable de sortie, comme on peut le constater par des mesures à l'aide de l'instrument PR dans le liquide recyclé dans le tuyau 24.
(d) Une fois que Pm atteint Ps, on arrête le recyclage en commut les vannes 22 et 23 et l'on ajuste le débit de la pompe 15 aune valeur prédéterminée empiriquement qui correspond au fonctionnement normal de l'appareil; le liquide réactionnel contenant du sub-
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l'enceinte 1 pour y subir la réaction et un volume égal de liquide contenant le produit P de réaction (substrat transformé) est évacué de l'enceinte 1 vers le réservoir 21.
(e) Au cours de ce fonctionnement normal, on mesure continuellement Pm, on le compare à Ps afin de déterminer tout écarta =Ps-Pm <EMI ID=53.1>
de manière à annuler cet écart. En d'autres termes, on règle continuellement El par l'intermédiaire*de la source 14, en fonction
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14 de manière que Pm soit maintenue à peu près égal à Pu. On peut ainsi maintenir la vitesse de réaction à.une valoir plus ou moins
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E1 de manière à maintenir une activité enzymatique à peu près constante correspondant à Ps.
L'effet d'électrocatalyse enzymatique obtenu à l'aide du lit agité dans cet appareil selon la fig. 2, peut être expliqué comme suit: <EMI ID=56.1> réaction en agissant sur l'activité enzymatique. Sa valeur initiale E i est donc choisie de manière qu'elle corresponde à une activité relativement élevée permettant d'obtenir une vitesse de réaction satisfaisante. <EMI ID=57.1> l'appareil sert alors à maintenir une activité relativement élevée, correspondant à la vitesse de réaction désirée, car il permet de compenser rapidement des variations d'activité qui apparaissent an cours de la réaction et peuvent provenir soit d'un changement des propriétés de l'enzyme, soit d'un changement des conditions réactionnelles, soit des deux à la fois.
(c) Ainsi, chaque fois qu'une particule enzymatique pe entre en collision avec l'électrode Etl dé travail,
l'enzyme fixée sur cette particule est soumise à l'action du potentiel réglable*-..Et et présente:
<EMI ID=58.1> <EMI ID=59.1>
l'enzyme. Ainsi, pendant les intervalles relativement longs qui séparent les collisions successives de chaque particule avec l'électrode Et! de travail, l'enzyme fix�e sur chaque particule circulant au sein du lit agité se trouve à peu près à son epotentiel à circuit ouvert" (OCV), qui correspond à un état d'équilibre de.potentiel avec le liquide réactionnel. L'activité de l'enzyme sera relativement faible, lors de cet équilibre, par rapport à l'activité qui résulte du potentiel E, qui agit de façon intermittente lors desdites collisions successives. De même, l'activité enzymatique sera également plus faible lors des collisions de chaque particule pe avec la contre-électrode E2 car le potentiel E2 de celle-ci correspondra à une activité plus faible que ladite activité relativement élevée qui résulte du potentiel
V
(e) Une circulation uniforme, continue du lit agité, au moyen
-de l'agitateur 9, permet cependant d'obtenir une mise en contact à peu près uniforme des particules pe avec l'électrode Etl et, par conséquent, un effet catalytique moyen pratiquement constant <EMI ID=60.1>
l'ensemble des particules pe du lit agité.
(f) Or, pendant la circulation au sein du lit agité, le système réactionnel liquide est mélangé intimement avec l'ensemble des particules enzymatiques subissant la circulation et ayant une activité relativement faible de sorte que le produit de la <EMI ID=61.1>
transféré très rapidement à l'ensemble du liquide réactionnel au sein du lit agité. De même, ce mélange intime permet d'assurer
un apport continu du substrat à transformer, à partir de l'ensemble du liquide réactionnel vers la surface de chaque particule pe du lit agité.
(g) Cette circulation du lit agité permet ainsi de maintenir
<EMI ID=62.1>
l'action intermittente du potentiel El, d'une part, et auxdits effets obtenus lors du mélange intime au sein du lit agité, d'autre
<EMI ID=63.1>
accompagnée dudit mélange intime, il est possible d'obvier dans une grande mesure au développement de phénomènes d'inhibition <EMI ID=64.1> fig. 3, lès séries de chicanes 29 et d'organes 31 sont disposées en quinconce, et cela de manière que le liquide ascendant présente <EMI ID=65.1>
permettant de maintenir le lit fluidisé de particules pe suspendues dans la colonne . D'autre part, cette disposition sert a dévier
le liquide ascendant alternativement vers la paroi formant
<EMI ID=66.1>
<EMI ID=67.1>
partir d'un support de graphite pulvérulent ou granuleux sur lequel on fixe l'enzyme de toute manière appropriée telle que, mentionnée plus haut.
La porosité (rapport volumétrique liquide/solide) du lit fluidisé peut être d'environ 0,65.
En utilisant des techniques de fluidisation bien connues,
on peut choisir la taille moyenne des particules pe entre 400 et
<EMI ID=68.1>
fonction de cette taille, de manière à former le lit fluidisé,
à le maintenir dans la colonne 1 et à éviter l'entraînement de particules pe en dehors de cette colonne.
Le liquide sortant du lit fluidisé, à l'extrémité ouverte supérieure de la colonne 1 de réaction, se déverse dans le canal
27 où il circule vers le bas et passe dans la sortie 3.
La sortie 3 contient un instrument PR de mesure et est reliée
à un réservoir 21 pour le produit P de la réaction, par l'intermédiaire d'un conduit 20 muni d'une vanne 23 à trois voies. Cette vanne 23 permet en outre de relier la sortie 3 à l'entrée 25 par l'intermédiaire d'un tuyau 24 de dérivation ("by-pass") conduisant à la vanne 22, afin de permettre ainsi le recyclage dans la colonne 1.
La source 28 d'alimentation électrique est agencée de manière
à appliquer entre les deux électrodes Etl et E2 une différence
<EMI ID=69.1> Etl par rapport a une électrode de référence non-représentée sur la fig. 3.
Corme dans les cas précédents, la source 28 permet l'affichage d'une valeur de consigne Ps d'une grandeur de sortie P et le ré-
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mesurée par l'instrument PR.
L'appareil décrit selon la fig. 3 peut servir à la mise en
<EMI ID=71.1>
<EMI ID=72.1> met en marche la pompe 33 avec un débit approprié, prédéterminé empiriquement, de manière que le système réactionnel liquide SP provenant du réservoir 16 circule vers le haut dans la colonne 1 avec une vitesse ascensionnelle prédéterminée permettant d'y former et maintenir un lit fluidisé.
(b) On obtient ainsi la catalyse enzymatique de la réaction désirée au moyen des particules pe de ce lit fluidisé dans la colonne 1 et le liquide contenant le produit P de cette réaction passe dans le canal 27 vers la sortie 3, d'où il est acl.eminé par la vanne 23 au conduit 20 qui l'amène au réservoir 21.
(c) Or, les particules pe du lit fluidisé entrent alternativement en collision avec les électrodes Etl et Et2 et leur activité enzymatique dépend essentiellement du potentiel El appliqué à l'électrode Etl par la source 28.
(d) Pendant que la réaction se déroule dans la colonne 1, on mesure Pm au moyen de l'instrument PR, on détermine tout écarta qui <EMI ID=73.1>
par l'intermédiaire de la source 28,de manière à.maintenir Pm à peu près égal à Ps.
(e) On maintient ainsi une vitesse de réaction moyenne désirée, qui correspond à la valeur de consigne affichée Ps, grâce au réglage�El-2 en combinaison avec l'action du lit fluidisé. En effet, comme dans le cas du lit agité selon la fig. 2, le lit fluidisé selon la fig. 3 permet de soumettre 3'enzyme fixée sur chaque particule <EMI ID=74.1>
collisions successives avec l'électrode Etl de travail, avec des périodes intermédiaires d'activité relativement réduite lorsque
<EMI ID=75.1>
électrode. En outre, les particules enzymatiques pe du lit fluidisé ainsi formé subissent également un mélange très Intime avec le système réactionnel liquide SR, ce qui permet d'assurer un résultat analogue permettant d'obvier au développement du.phénomène d'inhibition compétitive.
L'emploi d'un tel lit fluidisé permet d'utiliser, d'une façon à la fois simple et efficace, une masse relativement importante de
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cilement le développement de phénomènes d'inhibition compétitive qui
<EMI ID=77.1>
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ment la catalyse enzymatique de certaines réactions.
Or, la commutation des vannes 22 et 2 permet le recyclage du liquide à travers la colonne 1, par exemple lors d'une phase initiale
<EMI ID=79.1>
comme:on l'a décrit par rapport a la fig. 2, avant de procéder au fonctionnement continu où le liquide sortant de la colonne 1 est évacué directement dans le réservoir 21. Ce recyclage peut par ailleurs être envisagé pour le fonctionnement normal de l'appareil selon la fig. 3, en alternance avec des phases intermédiaires pour l'évacuation de liquide dans le réservoir 21 et l'alimentation de la colonne 1 à partir du réservoir 16 en liquide SR contenant du substrat frais à transformer. En variante, la source 28 peut comprendreun potentiostat et être associée à une électrode de référence. On
<EMI ID=80.1>
ble par rapport à cette électrode de référence, comme dans le cas de l'appareil selon la fig. 2 .
Il est évident que l'on peut utiliser diverses variantes des appareils décrits ci-dessus. Ainsi, par exemple, l'électrode de travail fixe, inerte associée à la masse enzymatique peut présenter <EMI ID=81.1>
électrique et un mouvement relat:...= satisfaisant entre le système réactionnel liquide, la masse enzymatique divisée et l'électrode de travail fixe. De même, la contre-Electrode peut avoir toute
<EMI ID=82.1>
a l'électrode enzymatique.
De plus, on peut effectuer ledit mouvement relatif de diverses manières. Ainsi, par exemple, on peut envisager, comme variante du lit fluidisé maintenu sur place, de faire circuler une suspension de particules enzymatiques-dans le système réactionnel, de
<EMI ID=83.1>
ceinte de..réaction et soit soumis à un contact intermittent avec l'électrode de travail par des collisions répétées avec cette électrode, soit en un seul passage, soit en plusieurs passages successifs (par recyclage) de chaque particule à travers l'enceinte de réaction.
Les exemples suivants.illustrent.l'application du procédé
selon l'invention.
<EMI ID=84.1>
On soumet du lactosérum dégraissé et déprotéiné à une hydrolyse catalysée par la lactase et destinée à transformer le lactose en glucose et galactose, dans un appareil selon la fig. 1.
L'électrode enzymatique comprend alors une masse de particules enzymatiques pe formées de particules de graphite (taille moyenne 1 500 LA) portant l'enzyme lactase et constituant un lit fixe poreux disposé en contact avec l'électrode Etl de travail. Ce lit est parcouru par le lactosérum à hydrolyser, fourni à la cellule 1 de réaction dans des conditions (débit, composition, température, pH)
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l'occurrence,la teneur initiale du lactoserum en lactose était de
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Dans ce cas, on soumet l'électrode enzymatique à une polarisation positive périodique, en appliquant à l'électrode Etl un poten-
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V/ECS) .
<EMI ID=88.1> de manière à maintenir une teneur en glucose constante correspondant à la valeur de consigne désirée Ps en l'occurrence 13,5 grammes de glucose par litre.
Cette variation périodique de El et le réglage de sa valeur moyenne permettent de maintenir une activité enzymatique moyenne
<EMI ID=89.1>
peu près constante et fournit ainsi un produit qui présente une composition uniforme, c'est-à-dire une teneur uniforme en glucose et glactose.
En l'occurrence, le gain d'activité dû à l'application du po-
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On effectue l'hydrolyse du lactosérum comme dans l'exemple 1 mais dans un appareil selon la fig. 2, comprenant une électrode enzymatique à lit agité.
L'électrode est également polarisée positivement dans ce cas
<EMI ID=92.1>
Pm de manière à maintenir une activité enzymatique moyenne relativement élevée qui fournit un produit traité uniforme, comme dans l'exemple 1.
<EMI ID=93.1>
était de 100 %. En outre, une hydrolyse à 100 % a été réalisée.
Il est entendu que la catalyse enzymatique effectuée conformément à la présente invention s'applique pratiquement à toutes les réactions catalysées par une enzyme et peut être réalisée dans
tout type d'appareil comprenant une électrode enzymatique appropriée permettant le réglage du potentiel du support de l'enzyme fixée.
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rentes de celles citées ci-dessus. La fréquence des impulsions
de tension peut avoir toute valeur appropriée et elles peuvent
avoir différentes formes (carrée, triangulaire, etc.).
Comme il ressort de ce qui précède, la présente invention
permet d'effectuer une catalyse enzymatique hétérogène réglable
<EMI ID=95.1>
industriel.
En effet, l'invention permet de combiner plusieurs avantages techniques importants tels que :
(i) obtention d'une surface active maximale par unité de volume de l'électrode, la surface disponible pour la fixation de l'enzyme sur l'ensemble des particules et donc pour son utilisation pour effectuer la catalyse réglable étant extrêmement élevée;
(ii) utilisation très efficace de la grande surface active globale de l'enzyme fixée sur des particules, grâce au contact intime obtenu par le mouvement relatif entre le milieu réactionnel liquide et les particules enzymatiques:
(iii) réglage facile de l'activité enzymatique grâce à une polarisation électrique réglable de chaque particule enzymatique,
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satisfaisante grâce à une variation alternative du potention électriqu
de l'enzyme, lors de laquelle :
(a) l'enzyme présente d'une part une activité élevée obtenue par une polarisation intermittente et réglable, afin de pouvoir compenser des variations d'activité, quelle qu'en soit la cause
(vieillissement, conditions réactionnelles variables, etc.);
(b) l'enzyme présente une activité réduite pendant des périodes intermédiaires, permettant d'obvier largement à l'évolution de phénomènes d'inhibition compétitive.
REVENDICATIONS
1. Procédé de contrôle continu du déroulement d'une réaction enzymatique servant à la transformation continue d'un substrat par l'intermédiaire d'une enzyme, selon lequel on amène un milieu réactionnel liquide, conducteur ionique, contenant le substrat à
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enzyme fixée sur un support solide, conducteur électronique, et
l'on applique à cette électrode un potentiel électrique dont on
règle la valeur afin de commander l'activité catalytique de
l'enzyme de manière que la réaction désirée se déroule à une vitesse déterminée, caractérisé par le fait que l'on applique audit
support de l'enzyme un potentiel qui varie alternativement
entre deux niveaux de potentiel différents dont on règle la
valeur moyenne de manière à maintenir une activité catalytique
moyenne de l'enzyme, qui correspond à la vitesse de réaction désirée.