<EMI ID=1.1>
�nzymatique en fructose d'une partie du glucose contenu dans une "solution glucose�, ainsi qu'une variante du procédé décrit et revendiqué dans le brevet belge N[deg.] 783230 déposé le
10 Mai 1972.
Il existe de nombreux procédés connus dans la technique pour produire des solutions contenant du fructose. ces procédés peuvent être groupée en trois grandes catégories, qui sont décrites dans le brevet mentionné ci-dessus.
En raison des considérations économiques intervenant dans la production de la glucose-isomérase, il est de la plus haute importante d'utiliser l'isomérase dans des conditions permettant d'obtenir un rendement maximal en fructose avec des quantités minimales de glucose-isomér�se. En outre; les conditions d'isomérisation doivent être telles que les quantités de sousproduits indésirables obtenues soient minimales.
<EMI ID=2.1>
intracellulaire par des micro-organismes donnés. Donc, la majeure partie de 1� glucose-isomérase se trouve dans et/ou sur les membranes cellulaires des micro-organismes. Dans certains cas, lorsque ces cellules sont utilisées pour isomériser le glucose en fructose , l'isomérase pendant l'isomérisation en est libérée ou en est extraite. Tel est généralement le cas dans les cellules provenant de micro-organismes du genre Str aptomvces . Lorsque l'isomérase est libérée ou extraite des
<EMI ID=3.1>
mode opératoire plutôt coûteux et compliqué pour récupérer l'isomérase solubilisée de manière à ce qu'elle puisse être utilisée dans une autre réaction d'isomérisation.
<EMI ID=4.1>
la glucose-isomérase provenant d'un micro-organisme appartenant au genre Streptomyces est fixée ou stabilisée sur et/ou à
<EMI ID=5.1>
tion consiste à chauffer les cellules contenant de la glucose-
<EMI ID=6.1> <EMI ID=7.1>
Le principal objectif de la présente invention est de fournir un procédé continu d'isomérisation enzymatique du glucose en fructose à l'aide de cellules de micro-organismes
<EMI ID=8.1>
lement fixée ou stabilisée.
Le brevet belge mentionné ci-dessus décrit
et revendique un procédé de transformation enzymatiqu : dU glucose en fructose qui consiste à former une solution glucosée ayant une viscosité d'environ 0,5 à environ 100 centipoises, un pH situé dans la gamme d'environ 6 à environ 9 et contenant environ 5 à environ 80 pour cent en poids de glucose à chauffer
<EMI ID=9.1>
et à faire passer ladite solution sur un lit contenant des cellules de micro-organismes contenant de la glucose-isomérase intracellulaire qui est naturellement fixée ou stabilisée, dont
<EMI ID=10.1>
environ 50 heures et le rapport de la profondeur à la largeur est inférieur à environ 2,à un débit permettant la transformation
<EMI ID=11.1>
On a désormais trouvé que la transformation enzymatique telle qu'elle est revendiquée dans le brevet
mentionné ci-dessus peut être effectuée avec le même succès à l'aide de cellules provenant de micro-organismes appartenant au genre Arthrobacter.
<EMI ID=12.1>
transformation enzymatique du glucose en fructose consistant à faire passer une solution glucosée sur un lit contenant des cellules de micro-organismes contenant de la glucose-isomérase intracellulaire stabilisée telle que revendiqué dans le brevet mentionné ci-dessus, où les cellules proviennent de micro-organismes appartenant au genre Arthrobacter.
<EMI ID=13.1>
procède et dans la discussion qui suit sont définis dans le brevet mentionné précédemment.
<EMI ID=14.1>
<EMI ID=15.1>
qui peut être réalisé facilement et économiquement dans une opération industrielle. En outre, il est extrêmement efficace du point de vue de l'utilisation de la glucose-isomérase et de la production d'un sirop glucosé-fructosé contenant des cendres et du psicose et ayant le minimum de couleur. En outre, la réaction d'isomérisation peut être réalisée en continu, ce
qui naturellement est un avantage supplémentaire dans toute opération de taro cation.
Les caractéristiques de la solution glucosée . it quelque peu importantes dans la détermination des conditions précises dans lesquelles la réaction d'isomérisation est effectués.
Il existe de nombreux procédés connus dans la technique de production de solutions glucosées. ?ar exemple, les procédés qui sont couramment utilisés industriellement consistent essentiellement à effectuer la saccharification de l'amidon de mars en glucose. ces procédés peuvent etre groupés en trois
<EMI ID=16.1>
une solution d'acide dilué est utilisée pour hydrolyser l'amidon en glucose. Le second est un procédé acide-enzyme dans lequel l'amidon est liquéfié par traitement doux par un acide et ensuite une enzyme est utilisée pour transformer 1.'amidon liquéfié
en glucose. Le troisième est un procédé enzyme-.enzyme dans lequel deux traitements enzymatiques sont utilisés, le premier pour liquéfier l'amidon et le second pour transformer l'amidon liquéfié en glucose. Dans le procédé de la présente invention,
on préfère utiliser une solution glucosée obtenue par l'un ou l'autre des deux derniers procédés étant donné que ces solutions contiennent généralement de plus grandes quantités de glucose
sur une base pondérale de substance sèche, des quantités moindres d'acides qui peuvent être sensiblement neutralisées, des quantités moindres de polyholoside. et elle est moins
<EMI ID=17.1>
par des moyens classiques avant de la soumettre au procédé de la présente invention.
<EMI ID=18.1>
<EMI ID=19.1>
20 centipoisea. Si la viscosité de la solution est trop élevée, <EMI ID=20.1>
la pression nécessaire pour faire passer ladite solution à travers le lit sera trop élevée. La diminution de la pression a pour résultat une diminution des débits de sorte que la durée pendant laquelle la solution est en contact avec l'isomérase naturellement fixée peut être trop longue pour que l'emploi de l'enzyme soit alors efficace. Du fait que la durée pendant laquelle la solution est maintenue dans les conditions d'isomérisation, par exemple température, pH,etc, peut être excessive, il est également vraisemblable qu'il se produirait une coloration et une quantité de psicose indésirables.
La concentration du glucose dans la solution glucosée doit être située dans la gamme d'environ 5 à environ 80 pour cent en poids et de préférence d'environ 40 à environ 60 pour cent.
Le pH de la solution glucosée doit être située dans la gamme d'environ 6 à environ 9, de préférence d'environ 6,5 à environ 8 et de préférence encore d'environ 7 à �nviron 8. Il est important de maintenir le pH de la solution glucosée dans cette gamme pendant la réaction d'isomérisation étant donné que, si la solution est à l'extérieur de cette gamme, l'isomérase sera rapidement inactivée et/ou de grandes quantités de sousproduits indésirables tels que corps colorés et psicose se formeront. Dans la solution glucosée peuvent se trouver divers activeurs et/ou stabilisants ioniques de l'isomérase, ainsi des sels solubles de cobalt, magnésium, etc.
Les caractéristiques du lit de cellules de micro-organismes contenant la glucose-isomérase naturellement fixée- ou stabilisée sont extrêmement importantes eu égard à la qualité de la solution de fructose et glucose produite et à l'utilisation industrielle du présent procédé. Le lit doit contenir au moins 3 UIGI d'activité de glucose-isomérase par centimètre cube et de préférence contenir au moins 20 UIGI par centimètre cube. Si le li-- contient moins de 3 UIGI d'activité de glucose-isomérase
par centimètre cube, un volume de lit plus élevé peut être nécessaire pour isomériser les quantités équivalentes de glucose. Celui-ci peut présenter divers problèmes concomitants tels que pertes de charge plus élevées dans le J.it, durées de contact
<EMI ID=21.1>
produire le degré désiré de transformation du glucose en fructose et le besoin de capitaux plus grands en raison de la taille plus élevée de l'équipement nécessaire pour contenir le lit de cellules.
En outre, au fur et mesure que la profondeur du lit augmente il y a une tendance plus grande au tassement du lit due aux pressions élevées qui doivent être utilisées pour faire passer la solution glucosée à travers le lit. Par exemple, dans le
cas d'un lit relativement peu profond, le lit ne peut se tasser que jusqu'à un degré faible tandis que dans le cas d'un lit
de profondeur plus importante le tassement peut être plus grand. Dans ce cas la perte de charge dans le lit augmenta à un point tel que la pression nécessaire pour faire passer la solution glucosée à travers le lit peut être extrêmement élevée, et p�ut être si élevée que l'équipement de construction classique ne peut être utilisé pour contenir le lit.
La valeur de la stabilité de la glucose-isomérase fixée
<EMI ID=22.1>
300 heures et de préférence encore d'au moins 400 heures.
Le coefficient d'extractibilité des cellules contenant la glucose-isomérase naturellement fixée ou stabilisée doit etre inférieur à environ 50 pour cent, de préférence inférieur. à environ 20 pour cent et de préférence encore inférieure à environ 10 pour cent.
Le rapport de la profondeur à la largeur (ou diamètre) du lit de micro-organismes contenant la glucoae-isomérase naturellement fixée ou liée aux cellules doit être inférieur à 2, de
<EMI ID=23.1>
de préférence encore dans l'intervalle d'environ 0,02 à environ 0,05. On envisage comme profondeur du lit de cellules contenant la glucose-isomérase par exemple une valeur de moins de 2,5 cm à
<EMI ID=24.1>
sentent l'avantage d'avoir une perte de charge d'un bout à l'autre du lit qui est petite et un tassement du lit qui est minimal. Cependant, étant donné que la profondeur du lit est relativement faible il y a une plus forte tendance à la création de cheminements Cette création de cheminement a pour résultat une utilisation inefficace de la glucos-isomérase. Si au moins deux lits et de préf6rence au moins six lits de glucose-isomérase naturellement fixée ou stabilisée sont placés en série et qu'il est prévu de mélanger l'affluer.t provenant d'un lit antérieur avant de le faire passer
à travers un lit suivant, toute création de cheminements qui pour-
<EMI ID=25.1>
l'utilisation de la glucose-isomérase naturellement fixée ou stabilisée.
Les préparations de glucose-isomérase peuvent être divisées en deux grandes catégories selon qu'elles sont thermostables
<EMI ID=26.1>
et de certains autres micro-organismes. Polir que ces préparations de cellules transforment une quantité appréciable de glucose en fructose il faut généralement que des ions arsénate
ou fluorure soient présents pendant la réaction d'isomérisation. Les préparations d'isomérase thermostables ne nécessitent pas
la présence de ces ions pendant l'isomération pour que des quantités appréciables de glucose soient transformées en fructose. Des exemples de micro-organismes qui produisent des préparations de glucose-isomérase; thermostables sont les microorganismes appartenant au genre Arthrobacter. Dans le présent procédé on préfère utiliser des préparations d'iscmérase thermostables. Lorsqu'on utilise de telles préparations on peut employer des températures élevées pour inhiber ou empêcher toute contamination microbienne du lit.
Un appareil connu dans la technique qui peut être utilisé pour réaliser le présent procédé est un filtre-presse à feuillets, filtre qui est clairement décrit dans le brevet cité précédemment.
<EMI ID=27.1>
variera selon les conditions exactes dans lesquelles est réalisa le présent procédé. Le tableau 1 ci-après donne les caractéris-
<EMI ID=28.1>
duites par le présent procédé.
<EMI ID=29.1>
<EMI ID=30.1>
<EMI ID=31.1>
fois, il est bien entendu que cet exemple n'est donné qu'à titre illustratif et ne doit pas être considéré comme limitant le cadre de l'invention ou limitant la portée des revendications annexées.
EXEMPLE
Cet exemple illustre l'utilisation de glucose-isomérase fixée ou stabilisée dans la transformation continue du glucose en fructose.
<EMI ID=32.1>
et un coefficient d'extrabilité de 2,5 pour cent. on mélange 0,644 g des cellules avec 3,0 g d'adjuvant de filtration
(Dicalite Superaid, fabriqué par Grefco, Inc., Los Angeles, Californie), et 40-45 ml d'une solution de glucose contenant
<EMI ID=33.1>
<EMI ID=34.1>
comportant les ingrédients identifiés ci-dessus est utilisée tout au long de cet essai. On agite cette suspension pendant
<EMI ID=35.1>
<EMI ID=36.1>
d'eau (diamètre de 2,5 cm) qui est maintenue à 65[deg.]C. Le bas de la colonne est muni d'un plongeur de colonne Adjusta-Chrom
<EMI ID=37.1>
revêtu de Dicalite. On pompe dans la colonne une solution
de glucose pour former un lit de cellules. Le lit formé a une hauteur de 2,2 cm. On place alors au sommet du lit un ternis d'acier inoxydable à mailles fines et on couvre le tamis d'une couche de perles de verre (de 2-3 cm de diamètre). On garnit de manière lache le dessus des perles de verre jusqu'à une profondeur de 4 à 5 cm avec de la laine de verre trempée
dans la solution de glucose. on place un raccord de débit
(Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, New jersey) relié à une pompe doseuse dans la colonne immédiatement au-dessus de la laine de verre et on pompe la solution de glucose vers le bas à travers le lit à un débit de 0,090 ml/mn. Apr�s
22 heures la transformation du glucose en fructose est de 16,1 pour cent et après 238 heures la transformation est de 10,3 pour cent.
On cultive des micro-organismes Arthrobacter sp. NRRL B-3726 et Arthrobacter sp. NRRL B-3728 dans des conditions d'aércbiose et d'Immersion et on récolte les cellules. Les cellules du premier micro-organisme ont une activité de glucose-isomérase de
124 UIGl/g et un coefficient d'extractibilité de 4,1 pour cent. Les cellules du second micro-organisme ont une activité de 93 UIGI/g et un coefficient d'extractibilité de 7,2 pour cent.
On prépare des lits de cellules de ces micro-organismes de la manière décrite précédemment en utilisant 0,611 g de cellules d'Arthrobacter 3p. NRRL B-3728 et 0,607 g de cellules d'Arthrobacter sp. NRRL B-3726. Dans le cas du premier microorganisme, la profondeur du lit est de 2 cm et dans le car du second la profondeur du lit est de 2,1 cm. On fait passer continuellement une solution de glucose à travers les lits de
<EMI ID=38.1>
Après 21 heures la transformation du glucose en fructose est de 26,6 pour cent et après 361 heures la transformation du glucose en fructose est de 18,2 pour cent. On fait passer par pompage la solution de glucose à travers le lit de cellules d 'Arthrobacter sp. NRRL B-3728 à un débit de 0,090 ml/mn. Après
18 heures la transformation du glucose en fructcse est de 22,4 pour cent et après 378 heures la transformation est de 11,6 pour cent.
REVENDICATIONS
1. Procédé de transformation par voie enzymatique du glucose en fructose consistant à faire passer une solution contenant du glucose à travers un lit contenant des cellules de microorganismes contenant de la glucose-isotnérase intracellulaire