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':'4-;,1i,e.t1on de stéroïdes' et 8téro!e8 obtenus".,..
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ente invention est 'relative à un. procd4 ,%% ilRiaR|[j3.i isitdroldes et plus .particulièrement h un Fo*> :,}", 1-6Bd.rOBéna',rn enzymatique de ct 01 de., HHfera'i M att 1vent1c?!,}I' il ta1 t oonnu 'lue de en 'piO"1,.ifpova1ent' 8tre joumis à une tsByPsr 0 ZY mai'uel agit on 1ntrOdL1Ú)nt le ! .,culture d'Ùn micro-organi.4me @a croir, iunc1e J"L,.,g.6nante, ou en soumettant le E3t.-groïde a l'ticticn:
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de cellules d'un micro-organisme 1-ddehydrosonant ïp ,m-y lieu de erdissance, ou d'un l-dâshydrogénuo en1'.5 des cellulee de cols micro-organismes.
De tels proçd F ,' , désignés d'une manière générale par l'expression "*iÊ8 nation en:rmatique", On a maintenant trouvé qU8.. l ,41 1dhdro d'un 8trorde de la série 1,17-dihYdr* 44-prégnène est le produit désiré, la conversion p *JS lieo plus avantageusement ci un ester 16,17-cyelobore.iub! dann ieru oRt utilia ccaune subntrat stéroida, ..,....( . >,..- dans l'eau est utilisé come ateroïde, ,. daM l'al1u est utilise comme 8ubRtr.t Btero '1:,:"",:{"'<*1 Un but de la présence invention eot pal:' :cOI1.é.', quaft de procurer un procédé amélioré pour la 1-déshydrogépatiot .:
r ennc tique d'un stproïde de IA série du 16o',l-dihydro)ty"3- '.. céto-04 - prcynéne.. y Ce but est atteint crice au proeadé ,j' ' . . 3;1 ..... nI tion qui consiste à soumettre, nous des conditions zip ester 16,17 cycloboratc, soluble dans l'eau, d'un 9,,t @-il la série du 16M,17ot-dihydroxy-3-eeto- -prgnènc a uni ddh1 drogénation en:rym8tique. f; ,'JI La I-drjshydrogénatlon enzymatique pe Ut lisée en incluant le stérolde dans une culture en crolës611Cd ott une culture mûre d'un micro-orcanisme connu pour ri-& 1-deshydrosonation des stéroides, ou en traitant 10;. .. ' avec les cellules ou le myedim d'une telle culture' du 1 ieu de croissance, ou dc 1-deshydronaec etl"11Î\é.':épa...'ti!
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rct ces celluler de tEl.^. :1ilcro-orE.;anismes.. 1iw " .
J.lt.1:''; .("'..y, Des mlcro-orJan1smcs convenables sont c'tïtu6 .'::..' V. par les mcsnbrcs des r,Cnren : Coryncb4c:trlum (par exeniple, . ,i'1ll('x), Nocardia (par exemple, 1i. aurantia et lie oint4ro de RIF Bacterium (par exemple, cyvl2-oyMdAns), KyeobaeterM.çar exempLe rhodofhroutï Sacillua (par exemple, antua execnpe - ;' rho("hlAA' , Nac 111ulI (par ext.'mp 1 e, Seporr.yxt1 (par exemple, S.effin!s), Didymella (pa't)!' :'R,: lycopPt-RJei) . Calonectrin (par exemple, e. decora)'' un 5
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(par exemple, L. o1 t'ni). Cylindrocarpon (par exemple, Q. radi- picola). pseudomonas (par exemple, L. testoAteron)1 Strepto- myces (par exemple, InvpndulAe), et également des espèces choisies des genres : Protnminobacter, Alcfiligenes, Alterneria, Oph10holus et P)'c1nod1thts.
Si le micro-organisme cet utilisé en soi. il est mis à croître de manière aérobie dans un milieu nutritif conve- nable comme il est connu en pratique, le stéroïde à soumettre
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à \-dshydrOE"at10n étant ajoute soit au début du procédé de culture, soit parfois durant ce procédé.
D'une manière générale, les conditions de culture des micro-organismes prévues pour les hesoins de la présente invention sont les mêmes que celles de la culture des micro-
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orsanismer pour la production d'antibiotiques ou de vitarince.
C'est ainsi que le micro-organisme est mis à croître en contact avec (dans ou sur) un milieu nutritif convenable en présence d'une alimentation convenable d'oxygène (air). Un milieu nutri- tif convenable comprend essentiellement une source de facteurs azotés et une source assimilable de carbone et d'énergie. Cette dernièru source peut être constituée parun hydrate de carbone, par exemple du sucrope, des mutasses, du glucose, du mnltone, de l'amidon ou de la dextrine.
La source de facteurs azotée peut être organique (par exemple farine de soya, liqueur de macéra- tion de maïs, extrait de viande, produits solubles de distille-
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rie, peptoner et/ou extrait de levure) ou synthétique (pf.r ç:$TIJ ple constituée de composa simple, organique et inoraninue,, pou- vant être synthétisée, tels que les sels d'ammonium, les mitta- tes alcalins, les amino-acides ou l'urne).
Une forme spécialement avantageuse de mise en oeuvre de l'invention consiste à recueillir et à utiliser des
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cellules préformées de l'un des micro-ornn1Amcs 1-dé9hydrogér nants énumérés précédemment. Dnns ce cas, la 1-déehyc'roénntion
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est de préférence men:e en prér.8nc: d'un composé 1odoac(t.t..
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tel que de l'acide iodoacétique, un sel de celui-ci, par exemple
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un sel de mut,-! alcalin (par cv:cmnl de 1' iodoacc'tate de sodium et de l'iodooctte de ootcssium), un sel de métal alcaline* terreux, le rel d'ammonium, et un sel d'acnine;
ou un enter, tel qu'un ester c1';>11<:'1(> Inférieur, par exemple 1 'iodoacétate de méthyle et l'iodopcctatc r"thylc, et un ester d'aralkyle mono- cyclique, le conporf.' iOODC(:tatc ôtant de préférence présent en une concrntrntion d'environ 0,001 molaire Jusqu'à environ 0,1 molaire, de prpft'rsnce d'environ 0,005 nolnire il environ 0,02 molaire. Ure elimcntdion convenable d'oxygène est également prévue durent le "'rocef;r,U8 de 1-dsh5droénation, de préférence par aération ou fitetiop c'u mélange, ou le*' deux.
C"'1mr m;b5trrt do- 1" t<:rofdc, n'importe quel enter 16,17-cycloboratc soluble n6 l'eau d'un rtcroltie de la série du lt'>o,l7a-di.lytiroy-3-ceto-p4rc'nène peut être employé. De tels C'OO1nO(!'! (>n"lo('nt 1er sel*! rie métaux alcalins (par exemple Ion aels de fiodiur et de potl1.!' d,um) et le sel d'ammonium des esters 16,17-cycloborntPS. On préfère tout particulièrement le b Zt'Toide0. do LI formule l'i'm'rnlci
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dnns laquelle- *< est de l'hydrogène, R' est de l'hydrogène ou le radical (3-hy('roYy, ou bien R et R' forment encembte le radical
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-.- '- ',1,"-,:,.
Il 'aétô X.'ïaat da l'hydrocènehaloeène, la radical, hydroxy, un :.', r"dj;..1I(0)()' inférieur ou un radical alkyle inférieur, au moine' un X étant do l'hydrosene, Y est do l'hydrogène, du méthyle du chlore ou du fluor, Z est de l'hydrogône, un h41oCèn. le
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radical hydroxy ou lo radical acyloxy, et R" cet un cation, de #prdférnee un métal alcalin ou de l'ammonium.
<.
. Loa substrats de atéroldes convenables sont les 881. . mètaux alcalins et d'ammonium den entera 16,17-cyclo- #- boratia de ,15a,17ee-dihydraxyproEestcrone, lboc,l7l,21..trihy-
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droxyprogeatérone, 6a-m<<thyi-16a,17bdihydroxyproestrone, 6*chloro-16ri,17rx-dihydrox>,progentérone, 6afluoro-l6oc,17a(iihy droK7PrOcoBtÁrono, 16n,17a.dihydroxy2lfluoroproy,estixone, 16e,17a-dlhydroxy.21-chloronroestirone, 16v-hydroxyhydrîcorti- sono, l6of-hydrqortisone, 9o(-halo-16.hydror.yhydracort npa '.:'<' (par:.Ctxemp1e y-f.luoro-16x-hydrocyhydrocortisone), t 9>-halo-16te :: hydroxyeortison08, 12n-helolb-hydroxyhydrocortieones (par exemple, l2acfluoro-16c.hydror.yhydrocortisone), 12.hala-l6nc- , hydroxycortisones, bx-méthyl-15^c.hydror.yhydrocortisone, 5c- mithyl..16-,c-hydroy.yeortisone, 6fluoro-16'-h)'droyyhydrocorthonc. ;
6c.chlaro-lbx-hydroxyhydrocortisone, 9x-hnlo- 6et mrithyl-l6oc- hydroxyhydrocortinoncoo 12!-hnla-6hG-méthyl-16x-hydror.yhydrocor- tisonoso 9x-hnlo-6aE-fluoro-l6nc-hydroxyhydrocor.tisonea (par exem- ple, 6c,9ordifluoro-Lbc-hydroxyhydrocortisone), 9x-halo-6o(- chloro-16rt-hydroxyhydrocortisones (pAr exemple, 5a,9ardichloro- 16-hydroxyhydrocortinone), llB,lbsc,l7a-trihydroxy;rogc:térone, 11-céto-I6a,17x-dihydroxyprogestérone, <-halo-ll,16oL,17ot- trihydroxyprozestérones (par exemple, 9oc-fluoro-11,16x,17x.:, trihydroxyprocentérone)t 9oc.halo-11-céto-15 l7oc-dih drox 'r i cest<?ron 8, l2oc.hnloll, 16a,17o4.trihydroxyproçeatéroncs, l2rX- halo-11-céto-16a,17oc-dihydroxyproeatérore, 21-halo-ll ,1 6,17- " . trihydroxyproE;
el> tronc8. 9oc,21-dihalo-11,-15,17oC-trihydroxy- progestérones, 6a,9x,21-trifluoro-l1a,16nt,17oc-trihydroxyproes-
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turone et ba,9,?1-trichloro-1l,lfiot,l7x-trihdroxyprogeetcsonet et len optera (!t- ces B t',:rotc\N., ayant un croup* 21.hydrox)'. On
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profère particulièrement les esters formée avec des acides car- boxyliques hydrocarbures de moins de 12 atomes de cabone. tels
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ctu'ox,cnpllficR pnr les nc1t1t'tJ aïkanoïquec de mo1n. de 12 atome. de carbone, les acides Alk(norrue8 de moins de 12 atomes de car- bone, les acides cl1rbo:-:yl iCUl:b aryliques monocycliques, les aci" des alkanoïques inférieurs acryliques monocycliques, Ion acides cycloftlkanccnrhoxy11qucs et Iris acides c:ycloalknc:.rbox,11que..
Com;ne les substrats de stéroïdes delà présente invention, 1 '('ncontre des 8ubt-ttanct"8 stéroïdes courantes, sont
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très soluMcs dnns l'eau, ils peuvent Être ajoutas au milieu de
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1.d(nhydrot:/nl\ t ion sous forme de solutions aqueuree. Cette dif- férenec rpnorte l'un des avantagea du présent proedd par rap- port aux proc,et*,5 connu? en pratique, car elle permet une plus grande concentration de substrat août! forme soluble que Ce nui était possible enterictirement. Avant la présente invention, le etérolde t'tflit ajouta de préférence en solution dans un solvant arertnic,vc, par exemple une solution dans du diméthyl formant ide.
De tell solvants orbl1riucfi Font inhibiteurs pour la 1-déshydro- , rénn,,ion c.>n:-Y'M t1qut' et limitent par conséquent la concentration de stérolee pouvant être ajoutée a un système de 1-dcehydrogena- i tion. Ou bien, le stérolde est ajoute IIOUR une forme solide, au- quel car In vifrsse et le de-r de la réaction étaient limités pnr l'allure de dipnoiution et la solubilité finale du atérolde.
Par l'utilisation dcg substrats de stéroïde de la présente inven- tion, on peut utiliser, par contre, des concentrations aussi Jle- vées que 0,0025 molaire de substrat de t6rordc, dans des procé- d(:(1 ou le substrat est ajouté à une culture diluée du micro-
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organisme; et une teneur allant Jusqu'à 0,1 molaire de substrat
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de st4,-o!de peut être utilisé* dans des processus on le substrat est ajouté à un système contenant des cellules concentrées &4.
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Are.ou un,.! 1déahydrogénase enryme. La concentration du sub- Ctâàna 10 premier aystctnc est de préférence environ 0,0002 ;,jttaqu'1,! environ O.OC2 molaire; et dans le dernier cas, elle est de préférence d'environ 0,0002 a environ 0,02 molaire.
Le substrat de stéroïde en solution aqueuse,
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i b,ùth avant ou durant la culture du micro-organisme, ci el mai est utiliré en soit ou à un milieu aqueux contenant :oa;,çoltul.es séparées ou le 1-déshydrosénase enzyme exempt de celluloiet le composé iodoacétate, ai ce processus est employé, ,Aprèo* environ 1 a environ 48 heures, suivant la concentration de ce etfiroide et de Ilen?yme, pratiquement tout le substrat , s été converti en non dérivé l.d6hydro. L'ester 16,17-cyclobo- rate résultant du dérivé 1-déhydro peut alors être récupéré.
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#ù De préférence cependant, le milieu est acidifié (après cniève.
,1>'ment des cellules ou du mycélium si on utilise un micio-organis- Mmo).Ljûaquâ un pH d'au moins 4,5, de préférence d'environ 2 à ..,.environ 4, par exemple par traitement avec un acide minéral,
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tel-que de l'acide sulfurique, pour hydrolyser le groupe d'eelcr y 1b,17cycloboxate, ce qui donne ainsi le dérivé l6ot,1'76-dihvdrn libre, Lo stéroïde désiré peut alors être récupéré de la
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.manière habituelle, par exemple par filtration ou centrifuta.
#j; t ion (s'il s'agit d'un solide) ou par une extraction à contre- courant:.
Les exemples suivants illustrent les procède de la présente invention (toutes les températures sont données .en degrés centigrades) : Exemple
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Du Nocardia rentrictue (Collection Waksman N*545, 1} Université de Rutgers, New Bruneu-jek New Jersey) est mis croître pendant quatre semaines à 25 sur une culture couchée
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D,d!agax-aar de la composition suivante!
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<tb> Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> 1,5 <SEP> grnmmes
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 3,0 <SEP> grammes
<tb>
<tb> Peptone <SEP> 6,0 <SEP> grammes
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 1,0 <SEP> gramme
<tb>
Eau distillée jusqu'à 1 litre,
Traitement à l'autoclave pendant 30 minutât à
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1?T 121 " r ilv Dem portiono d'un ml.
d'une suspension obtenue >tV par lavage de la aurfecc d'une culture couchée avec 5 tel, d'eau stérile sont ut.lises pourentemencer des portions de 50 MI. du milieu euivant contenuem dane des flacons d'Erlenmeyer de 250 ml., bouches par du coton :
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<tb> Peptone <SEP> 5 <SEP> , <SEP> 0 <SEP> gramme*
<tb>
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Tr;ptone 3,0 grommen
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<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 5,0 <SEP> grammes
<tb>
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Glucose 20,0 pranmee 1 *-IA:"" caco3 2,3 grammen Eau distillée jusqu'. 1 litre.
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Traitement pendnnt 30 minutes à 1 eutoelave â 121' ,
Les flncons ensemencée sont soumis à incubation à 25 avec un secouement mécanique rotatif d'un rayon de 2 pou- ces, avec 280 cycles par minute. Après 23 heures, 6% (volume par
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volume) sont transfr,s à un autre jeu de flacons prépares conçue les premiers , Le second jeu de flacons est soumis à incubation dels même manière rue le premier jeu, pendant 17 heures, puis on ajoute à chaque flacon 0,25 ml. d'une solution de 16,17-
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cycloborate de lbc,c.hydroxy-9d-fluotohydroeortieone dans du N,N d1mthylfo.amirle. Lr rolution dans le dthylformam1dc con- tient 20 mg. de etérolde par ml. et, par conséquent, 100 micro- 3rammeR de rtérolde/mI. de culture sont prévus.
Dos échantillons sont nrclevc'n 4,5 heures et 29 heures après l'addition du 8térÓt-: de à la culture, ret6" ou pH de 3 + 0,05, et les otdrordas lim
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%\ bret ont extraits avec da la mcthyliaobutyï estent et ournl une chromntoet'ftf'h10 sur papier dans un système bonpéne-éthanolque eau sur Whatman K'1. De ce fait:, on observera 1.d&.hydroCtna- tion est complète à 70% en 4 à 5 heures et qu'elle est prati-
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,,.cusment quantitative on 29 hautcs ou moins.
. .j-' P:>:1'1t' Une culture en fiole lyophile de Coryncbactrjr1um "\. 11mp1ex ATCC 6945 est utilisée pour ensemencer un flocon de 230 ml, contenant 50 ml. du même milieu que celui utilisé *0 \ l'exemple 1. Le flacon ensemencé est soumis à incubation à 25' pendant 24 heures avec un oecouement rotatif par voie mécanique (280 cycles par minute, rayon de 2 pouces), Des portions d'en-
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viron 0,05 ml. du milieu sont ensuite ut4.linéet pour ensemencer plusieurs portions de 50 ml. d'un milieu ayant la composition suivante
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;.t' . Ycas famine gramme KH2P04 1 jjranOTe 1(211PO't 1 gramme Glucose monohydraté 1 gramme
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Euu de ville junqu'à 1 litre.
Traitement à l'autoclave pendant 20 minutée à 1 21# La seconde série de flacons ert soumise z tncu. bation (de la même manière que la première série) pendant 48
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heures, et ensuite den transferts de 67. (volume per volume) sont faite à plusieurs flacons prépares écrase ceux de la secon- de série. 'Les flacons de cette troisième série sont coulis à incubation pendant 24 heures (de la même manière que pour leE prie précédentes), moment auquel chaque flacon est complété
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par 1 ml, d'une solution contenant du t:traboratc de sodium.
::':+ ("OUI forme de borax, 3 m./ml,) et de la 1 6dL-hydro>:y -$><*- fluorohydrocortieone (60 a,/ml.), le etirolde étant en solu. tion sous forme du sel sodique d'ester cycloborate. De ce fait,
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on procure 600 't11cro:'rr,fluI1C'R de !1t,:rotr1c/mt. À la fermentation.
A intervalle.*, on prélevé de petites quantités, on règle au pu de 3 + 0,5 avec de l'c1rlr phoanhoriqup concentre, le stéroide libre cr;t c'':."^t ,"\'C'C c'e In mi'thyllsobutyl côtone et il eut RO\,l:ni l' à une r.nnly rar chro:ator^llde sur papier, Dix.sept heu!'l'!': rj-rcr rj!'itO!1 '!u etroicie, environ R3'!.. du sturoide inti- tial sont "rprntp Four forme de triamcinolone (16ci-hydroxy-9 - fluorop rednicolone) et eprèt 41 heures, la 1-déshydroCénation est prntlquesncnt quantitative, rvoif .3 Une culture de Corynrbactcrium simplex ATCC 6946 est mise R croître "ifnt Fort jourtr à 25 sur une culture cou- chée è 'l1±:nr-c.'lIr pynnt la composition suivante 1
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<tb> Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> 1,5 <SEP> gramme
<tb>
<tb> Extraite <SEP> de <SEP> levure <SEP> 3,0 <SEP> grammes
<tb>
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Pc:
,tO'1C' 6,0 ürl1mmC'8
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<tb> Glucose <SEP> 1,0 <SEP> gramme
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> 15,0 <SEP> çrammes
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
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Trd:c:'1C'nt us l'autoclave pendant 30 minutes à 1210 Des quantité? de 3 ml. d'une suspension obtenue
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par lavage de le croissance murerflcielle d'une culture couchée avec 10 ml. du milieu suivant (Fl) :
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KH 21' 4 1,C CTtt'1'!T1t'
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<tb> Prptonc <SEP> 10,0 <SEP> grammes
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<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 2,5 <SEP> grammes
<tb>
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ilucore 30,0 rrnmmc8
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<tb> Enu <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
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nH rie 7,2 cvant traitement à !'autoclave pendant 30 minutes à 1210 sont utilisées pour ensemencer du f'o:-t:1on! de 50 ml. du m6m. milieu FI contenue? dans dr!n flacon d'rletneyer de 250 ml.,
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ü pervdt¯ coton. Lea flacons sont soumis à incubation pen- itta jours' à 25* sur un appareil à secouer rotatif mar- httï "280creloa par minute avec un rayon de 2 pouces.
Le cont 3totâl,dra flacons est ensuite transféré de manière asep- ",tiqe' '"dea flacons d'Erlemneyer de 4 litres contenant 1 litre u F1:'',Cea flacons (les flacons F2) sont soumis à incuba- . 5 i.o - dantrdéûx jours â 25 sur un appareil à secouer du type t,xl.tax'f if fonctionnant a 120 cycles par minute avec une course .de 1poucë,'Six flacons F2 sont utilisés pour ensemencer 50 Ç8d11 de milieu FI dans un récipient de fermentation soumis atitat on et aère.
Après 48 heures de croissance des cellules, 15 grammes de testostérone dans 300 ml. de méthanol sont ntérili. ses aux filtre et ajoutas à la fermentation. 24 heures plus terd, les cellules sont récoltées par enntrifusation, recueilles soue 0.1 Une pâte et emmagasinées dans un réfricérateti- h .170, W"- '#:'"$ÊêÈ> y ta 1déAhydroCéttation de l'ester 16,17-cyclobora- yka -flvoo-l6uchydroxyhydrocortisone est rèalinée dans un ;¯mil:èontenant ce qui suit
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CtUul.e$ tcfrigercee 3% (poids/volume) . rHPO4 0,05 JH -H0P,07 0,05 M oacétate de sodium 0,003 M
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myh 1; ,2,5, on ajouta 2 supplémentaires de cellules et de le iodoqate de sodium 0,002 M).
La réaction est menée dans un Volume .otal de 50 ml. de milieu dans un flacon dIE.-lenmf ycr de 25 0 reLe stéroïde est préparé en mélangeant 200 mg. d'un mp- ? langea 82% de 9ot-fluorol6or.hydroxyhydrocortiaone et de 12tZi. de 9o(-fluoro-l6c4.hydrotyprodnisolone, 2,4 ml. de méthanol et S 25 mn,,"de Nn2i40.1OH10 dissoue dans 0,4 ml, d'cr.u dans un |flacons et en chauffant 950 au bain-marie bouillant. En envi- on',-qâminutea,"Ia matière est dissoute et l'enter cycloborate -e mt ngc avec 50 ml, du milieu décrit ci-demsuno le pil ert
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réglé à 7,2 et le flacon est placé sur un appar.1t à 250.
Des échantillons sont prélevée pour une a,na graphique et ln progression de la dé8hYàrOcért4t10 t|l.l*B vante : '!!'
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Durse 9oT-fluoro-16or-hydroxy- Triaotonf hydrocortisone JIBIWHÉé' 3,5 heures 1,5 mg./ml. 2SE|l 12,5 heures 0,3 m./ml. 3>PSP heures 3 iiwl
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Une analyse du stérolde consiste a a û31 un échantillon acidifié avec de la mrkhylieobutyl ut oxtraire les et,',rolden, à etiromatotrapliier dans un î sé m bcn7.one-(?&h!'nol-enu our du papier pour séparer les composante. a eluer les eonipoMantc et à déterminer la coneant:ati0r ï31- coraparûieon de l'absorption dans l'ultraviolet avoa d1 Dnnn une seconde oxpurienec réalisé', exemple 3, on convertit 4 mg, do l'ester cyclobordt M# .B f luoro.16 .hydroxylivr! rocar timons en 3,4t! mt;
. de tritrie. par ml, en 21 heures, ''fffisl D'une manière semblable, en suivant tel eus nus des exempleg 1, 2 ou 3, los entero cyclnborates dytdtsD zig autre stéroïde 1,17d-dihydroxy de la série du 3-cdto"rA; précnène peuvent être convertie en leur)) dérivé 1cl; . t 36 11 doit être entendu que 1 ' in ven t i- p |j limitée aux détails donnée mais que bien des vartan ti n
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être prevuen ennr. sortir pour autant du cadre du présent brevet
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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':' 4 - ;, 1i, e.t1on of steroids' and 8tero! E8 obtained "., ..
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ente invention relates to a. procd4, %% ilRiaR | [j3.i isitdroldes and more .particularly h a Fo *>:,} ", 1-6Bd.rOBéna ', enzymatic rn of ct 01 de., HHfera'i M att 1vent1c?!,} I 'il ta1 t oonnu' read from en 'piO "1, .ifpova1ent' 8tre enjoyed at a tsByPsr 0 ZY may act on 1ntrOdL1Ú) nt le! ., culture of a micro-organi.4me @a croir, iunc1e J "L,., annoying, or by subjecting the E3t.-groid to the ticticn:
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cells of a 1-ddehydrosonant microorganism ïp, m-y instead of loss, or 1-dehydrogen in1'.5 cells of neck microorganisms.
Such processes F, ', generally designated by the expression "* iÊ8 nation en: rmatique", It has now been found that qU8 .. 1.41 dhdro of an 8trorde of the series 1,17-dihYdr * 44-Pregnene is the desired product, the p * JS conversion lieso more preferably a 16,17-cyelobore.iub ester! dann ieru oRt utilia ccaune subtrate steroid, .., .... (.>, ..- in water is used as ateroid,,. daM al1 is used as 8ubRtr.t Btero '1:,: " ",: {" '<* 1 An object of the present invention is to provide an improved process for 1-dehydrogepatiot:': cOI1.é. ',
rnc tique of a stproid of IA 16o 'series, 1-dihydro) ty "3-' .. keto-04 - prcynéne .. y This goal is achieved through the process, I ''. 3; 1. .... nI tion which consists in subjecting us to conditions zip ester 16.17 cycloboratc, soluble in water, of a 9,, t @ -il the series of 16M, 17ot-dihydroxy-3-eeto- -prgnènc has uni ddh1 drogenation in: rym8tique. f;, 'JI The enzymatic I-drjshydrogenation can be used by including the steroid in a culture in croles611Cd ott a mature culture of a microorganism known for ri- & 1-dehydrosonation steroids, or by treating with the cells or myedim of such a culture of the growth medium, or with 1-dehydronec and the like.
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rct these cell from tEl. ^. : 1ilcro-orE.; Anisms .. 1iw ".
J.lt.1: ''; . ("'.. y, Suitable mlcro-orJan1smcs are c'tïtu6.' :: .. 'V. by mcsnbrcs des r, Cnren: Coryncb4c: trlum (for example,., i'1ll (' x) , Nocardia (for example, 1i. Aurantia et lie oint4ro de RIF Bacterium (for example, cyvl2-oyMdAns), KyeobaeterM.çar exampleLe rhodofhroutï Sacillua (for example, antua execnpe -; 'rho ("hlAA', Nac 111ulI (for ext .'mp 1 e, Seporr.yxt1 (for example, S.effin! s), Didymella (pa't)! ':' R ,: lycopPt-RJei). Calonectrin (for example, e. decora) '' a 5
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(for example, L. o1 t'ni). Cylindrocarpon (eg, Q. radi- picola). pseudomonas (eg L. testoAteron) 1 Streptomyces (eg InvpndulAe), and also species selected from the genera: Protminobacter, Alcfiligenes, Alterneria, Oph10holus and P) 'c1nod1thts.
If the microorganism this used in itself. it is grown aerobically in a suitable nutrient medium as is known in the art, the steroid to be subjected
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to \ -dshydrOE "at10n being added either at the start of the culture process, or sometimes during this process.
In general, the conditions for the culture of microorganisms provided for the purposes of the present invention are the same as those for the culture of microorganisms.
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orsanismer for the production of antibiotics or vitarince.
Thus, the microorganism is grown in contact with (in or on) a suitable nutrient medium in the presence of a suitable supply of oxygen (air). A suitable nutrient medium consists essentially of a source of nitrogenous factors and an assimilable source of carbon and energy. The latter source can be constituted by a carbohydrate, for example sucrope, mutasses, glucose, mnltone, starch or dextrin.
The source of nitrogenous factors may be organic (eg soybean meal, corn steep liquor, meat extract, soluble distillate products).
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rie, peptoner and / or yeast extract) or synthetic (pf.r ç: $ TIJ ple consisting of simple, organic and inoraninous compounds, which can be synthesized, such as ammonium salts, alkaline mittates , amino acids or urn).
An especially advantageous embodiment of the invention consists in collecting and using
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preformed cells of one of the 1-dehydrogenating micro-ornn1Amcs listed above. In this case, the 1-dehyc'roénntion
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is preferably carried out: e in prér.8nc: of a 1odoac compound (t.t ..
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such as iodoacetic acid, a salt thereof, for example
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a mut salt, -! alkaline (cv: sodium iodoacetate and sodium iodooctte), an alkali earth metal salt, ammonium rel, and an acnine salt;
or an enter, such as a C1 ';> 11 <:' 1 (> Lower ester, eg, methyl iodoacetate and iodopctate, and a mono-cyclic aralkyl ester, Conporf. IOODC (: preferably present in a concretion of about 0.001 molar to about 0.1 molar, of preparation from about 0.005 molar to about 0.02 molar. A suitable oxygen removal is also planned last the "rocef; r, U8 of 1-dsh5droénation, preferably by aeration or fitetiop c'u mixture, or * 'both.
C "'1mr m; b5trrt do- 1" t <: rofdc, any water-soluble 16,17-cycloborate enteric acid from a lt'> o series, l7a-di.lytiroy- 3-keto-p4rc'nene can be used. Such C'OO1nO (! '! (> N "lo (' nt 1st salt *! Rie alkali metals (for example Ion als of fiodiur and potl1.! 'D, um) and the ammonium salt of esters 16 , 17-cycloborntPS. Very particularly preferred is the b Zt'Toide0. Do LI formulate the i'm'rnlci
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dnns which- * <is hydrogen, R 'is hydrogen or the radical (3-hy (' roYy, or else R and R 'form encembe the radical
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-.- '-', 1, "-,:,.
It 'aétô X.'ïaat da hydrocenehaloeène, the radical, hydroxy, a:.', R "dj; .. 1I (0) () 'lower or a lower alkyl radical, to the monk' an X being of the 'hydrosene, Y is hydrogen, methyl, chlorine or fluorine, Z is hydrogen, h41oCene.
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hydroxy radical or lo acyloxy radical, and R "this a cation, # preferred an alkali metal or ammonium.
<.
. The suitable aerosol substrates are 881.. alkali and ammonium metals den enter 16,17-cyclo- # - boratia de, 15a, 17ee-dihydraxyproEestcrone, lboc, l7l, 21..trihy-
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droxyprogaterone, 6a-m << thyi-16a, 17bdihydroxyproestrone, 6 * chloro-16ri, 17rx-dihydrox>, progenterone, 6afluoro-l6oc, 17a (iihy droK7PrOcoBtÁrono, 16n, 17a.dihydroxy2lflua.21hydroxyhydroxone-16e, esteroye -chloronroestirone, 16v-hydroxyhydrîcorti- sono, l6of-hydrqortisone, 9o (-halo-16.hydror.yhydracort npa '.:' <'(by: .Ctxemp1e yf.luoro-16x-hydrocyhydrocortisone), t 9> -halo- 16te :: hydroxyeortison08, 12n-helolb-hydroxyhydrocortieones (eg, l2acfluoro-16c.hydror.yhydrocortisone), 12.hala-l6nc-, hydroxycortisones, bx-methyl-15 ^ c.hydror.yhydrocortisone, 5c-mithyl..16 -, c-hydroy.yeortisone, 6fluoro-16'-h) 'droyyhydrocorthonc .;
6c.chlaro-lbx-hydroxyhydrocortisone, 9x-hnlo- 6et mrithyl-l6oc- hydroxyhydrocortinoncoo 12! -Hnla-6hG-methyl-16x-hydror.yhydrocor- tisonoso 9x-hnlo-6aE-fluoro-l6nc-hydroxyhydrocor.tison (par - ple, 6c, 9ordifluoro-Lbc-hydroxyhydrocortisone), 9x-halo-6o (- chloro-16rt-hydroxyhydrocortisones (pAr example, 5a, 9ardichloro-16-hydroxyhydrocortinone), llB, lbsc, l7a-trihydroxy; rogc: terone, 11 -keto-I6a, 17x-dihydroxyprogesterone, <-halo-11, 16oL, 17ot-trihydroxyprozesterones (eg 9oc-fluoro-11,16x, 17x.:, trihydroxyprocenterone) t 9oc.halo-11-keto-15 l7oc- dih drox 'ri is <? ron 8,12oc.hnloll, 16a, 17o4.trihydroxyproçeatéroncs, l2rX-halo-11-keto-16a, 17oc-dihydroxyproeator, 21-halo-ll,16,17- ". trihydroxyproE;
el> trunk8. 9oc, 21-dihalo-11, -15,17oC-trihydroxy-progesterones, 6a, 9x, 21-trifluoro-l1a, 16nt, 17oc-trihydroxyproes-
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turone and ba, 9,? 1-trichloro-1l, lfiot, l7x-trihdroxyprogeetcsonet and len will opt (! t- ces B t ',: rotc \ N., having a croup * 21.hydrox)'. We
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Especially proffer the esters formed with carboxylic acids hydrocarbons of less than 12 carbon atoms. such
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ctu'ox, cnpllficR pnr the aikanoic nc1t1t'tJ of mon. of 12 atom. carbon, Alk acids (norrue8 of less than 12 carbon atoms, Cl1rbo: -: yl iCUl: b arylic monocyclic acids, aci "of mono-cyclic acrylic lower alkanoic, Ion cycloftlkanccnrhoxy11qucs and Iris acids c: ycloalknc: .rbox, 11that ..
As the steroid substrates of the present invention, 1 (against common steroids, are
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very soluble in water, they can be added in the middle of
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1.d (hydrot: / nl \ t ion in the form of aqueous solutions. This difference represents one of the advantages of the present procedure over the processes known in the art, because it allows a greater concentration of substrate in soluble form than was possible enterictirement Prior to the present invention, the tflit ether preferably added in solution in an arertnic solvent, eg, solution in dimethyl forming ide.
Such oral solvents act as inhibitors for the 1-dehydro-, renyl ion> n: -Y'M t1qut 'and therefore limit the concentration of sterol that can be added to a 1-dcehydrogenation system. Or, the steroid is added to a solid form, to which the speed and duration of the reaction were limited by the rate of dipnolution and the final solubility of the aerol.
By the use of the steroid substrates of the present invention, on the other hand, concentrations as high as 0.0025 molar of t6rordc substrate can be used in processes (:( 1 or the substrate is added to a dilute culture of the micro-
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organization; and a content of up to 0.1 molar of substrate
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of st4, -o! de can be used * in processes where the substrate is added to a system containing concentrated cells & 4.
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Are. Or a,.! Enrymic deahydrogenase. The concentration of the first sub-Ctana 10 is preferably about 0.0002; about O.OC2 molar; and in the latter case, it is preferably from about 0.0002 to about 0.02 molar.
The steroid substrate in aqueous solution,
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ib, ùth before or during the cultivation of the microorganism, it may be used either in itself or in an aqueous medium containing: oa ;, separated çoltul.es or the cell-free enzyme 1-dehydrosenase and the iodoacetate compound, in this process Is employed, After about 1 to about 48 hours, depending on the concentration of this etfiroide and Ilen? yme, substantially all of the substrate has been converted to non-l.d6hydro derivative. The 16,17-cycloborate ester resulting from the 1-dehydro derivative can then be recovered.
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# ù Preferably however, the medium is acidified (after cniève.
If a micioorganism is used, the cells or mycelium are used. There is a pH of at least 4.5, preferably from about 2 to about 4, for example by treatment. with a mineral acid,
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such as sulfuric acid, to hydrolyze the eelcr y 1b, 17cycloboxate group, thereby yielding the free 16ot, 76-dihvdrn derivative, the desired steroid can then be recovered from the steroid.
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. usual way, for example by filtration or centrifuta.
#j; t ion (if it is a solid) or by countercurrent extraction :.
The following examples illustrate the procedures of the present invention (all temperatures are given in degrees centigrade): Example
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Nocardia rentrictue (Waksman Collection N * 545, 1} Rutgers University, New Bruneu-jek New Jersey) is grown for four weeks at 25 on a lying culture.
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D, d! Agax-aar of the following composition!
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<tb> Extract <SEP> of <SEP> beef <SEP> 1,5 <SEP> grnmmes
<tb>
<tb> Yeast <SEP> <SEP> extract <SEP> 3.0 <SEP> grams
<tb>
<tb> Peptone <SEP> 6.0 <SEP> grams
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 1.0 <SEP> gram
<tb>
Distilled water up to 1 liter,
Autoclaved for 30 minutes at
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1? T 121 "r ilv Dem portiono of one ml.
of a suspension obtained> tV by washing the aurfecc of a lying culture with 5 such sterile water are used to seed 50 ml portions. of the euivating medium contained in the Erlenmeyer flasks of 250 ml., stoppered with cotton:
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<tb> Peptone <SEP> 5 <SEP>, <SEP> 0 <SEP> gram *
<tb>
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Tr; ptone 3.0 grommen
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<tb> Yeast <SEP> <SEP> extract <SEP> 5.0 <SEP> grams
<tb>
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Glucose 20.0 pranmee 1 * -IA: "" caco3 2.3 grammen Distilled water until. 1 litre.
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Treatment for 30 minutes at 1 eutoelave at 121 ',
The seeded flakes are incubated at 25 with mechanical rotary shaking with a radius of 2 inches, with 280 cycles per minute. After 23 hours, 6% (volume per
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volume) are transferred to another set of prepared vials designed first. The second set of vials is incubated in the same way as the first set, for 17 hours, then 0.25 ml is added to each vial. of a solution of 16.17-
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lbc cycloborate, c. hydroxy-9d-fluotohydroeortieone in N, N d1mthylfo.amirle. The solution in dthylformam1dc contains 20 mg. of etérolde per ml. and, therefore, 100 micrograms of rtérolde / ml. of culture are planned.
Dos samples are nrclevc'n 4.5 hours and 29 hours after the addition of the 8térÓt-: de to the culture, ret6 "or pH 3 + 0.05, and the otdrordas lim
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% \ bret were extracted with mcthyliaobutyï estent and submitted a chromntoet'ftf'h10 on paper in a water-alcohol-ethanolic system on Whatman K'1. Therefore :, it will be observed 1.d & .hydroCtna- tion is 70% complete in 4 to 5 hours and that it is practiced
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,,. cusment quantitative on 29 heights or less.
. .j- 'P:>: 1'1t' A lyophilic flask culture of Coryncbactrjr1um "\. 11mp1ex ATCC 6945 is used to inoculate a 230 ml flake, containing 50 ml of the same medium as that used * 0 \ l ' Example 1. The inoculated flask is incubated at 25 'for 24 hours with mechanical rotary shaking (280 cycles per minute, 2 inch radius).
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about 0.05 ml. of the medium are then utilized to inoculate several portions of 50 ml. of a medium having the following composition
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; .t '. Ycas famine gram KH2P04 1 jjjranOTe 1 (211PO't 1 gram Glucose monohydrate 1 gram
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Euu city junqu'à 1 liter.
Autoclave treatment for 20 minutes at 1 21 # The second series of vials is submitted to tncu. bation (in the same way as the first series) for 48
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hours, and then den transfers of 67. (volume per volume) are made to several vials prepared crushes those of the second series. 'The flasks of this third series are incubated for 24 hours (in the same way as for the previous prays), at which time each flask is completed.
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per 1 ml, of a solution containing t: sodium traborate.
:: ': + ("YES form of borax, 3 m./ml,) and of 1 6dL-hydro>: y - $> <* - fluorohydrocortieone (60 a, / ml.), The etirolde being in solution . tion in the form of the sodium salt of cycloborate ester.
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we get 600 't11cro:' rr, fluI1C'R de! 1t,: rotr1c / mt. At fermentation.
At intervals. *, Small quantities are taken, adjusted to the pu of 3 + 0.5 with concentrated phoanhoric water, the free steroid cr; t c '':. "^ T," \ 'C'C c'e In mi'thyllsobutyl cotone and he had RO \, l: ni l 'à une r.nnly rar chro: ator ^ llde on paper, Dix.sept er!' l '!': rj-rcr rj! ' ItO! 1 '! uetroicie, about R3'! .. of the initial sturoide are "in the form of triamcinolone (16ci-hydroxy-9 - fluorop rednicolone) and after 41 hours, the 1-dehydroCenation is presently quantitative, reflective. .3 A culture of Corynrbactcrium simplex ATCC 6946 is grown "ifnt Fort daytr at 25 on a culture lying è 'l1 ±: nr-c'lIr pynnt the following composition 1
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<tb> Extract <SEP> of <SEP> beef <SEP> 1.5 <SEP> gram
<tb>
<tb> Extract <SEP> from <SEP> yeast <SEP> 3.0 <SEP> grams
<tb>
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Pc:
, tO'1C '6.0 ürl1mmC'8
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<tb> Glucose <SEP> 1.0 <SEP> gram
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> 15.0 <SEP> çrammes
<tb> Distilled <SEP> water <SEP> 1 <SEP> liter
<tb>
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Trd: c: '1C'nt us the autoclave for 30 minutes at 1210 How many? of 3 ml. a suspension obtained
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by washing the wall growth of a coated culture with 10 ml. from the following middle (Fl):
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KH 21 '4 1, C CTtt'1'! T1t '
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<tb> Prptonc <SEP> 10.0 <SEP> grams
<tb>
<tb> <SEP> extract <SEP> yeast <SEP> 2.5 <SEP> grams
<tb>
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ilucore 30.0 rrnmmc8
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<tb> Enu <SEP> 1 <SEP> liter
<tb>
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nH rie 7.2 hr autoclaving for 30 minutes at 1210 is used to inoculate fo: -t: 1on! of 50 ml. of m6m. FI medium contained? in dr! n 250 ml rletneyer bottle,
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ü pervdt¯ cotton. The vials are incubated for five days at 25 ° on a rotary shaker machine 280 cm per minute with a radius of 2 inches.
The cont 3totâl, dra vials is then transferred asep- ", tiqe" "of 4 liter Erlemneyer vials containing 1 liter of F1: '', these vials (the F2 vials) are incubated. 5 days to 25 days on a t, xl.tax'f type shaker operating at 120 cycles per minute with a 1 inch stroke, 'Six F2 flasks were used to inoculate 50 C8d11 of FI medium into one. fermentation vessel subjected to atitat on and aeration.
After 48 hours of cell growth, 15 grams of testosterone in 300 ml. of methanol are nterili. its to filters and additions to fermentation. 24 hours later, the cells are harvested by entrifusion, collected in 0.1 A paste and stored in a refricerateti- h .170, W "- '#:'" $ ÊêÈ> y ta 1deAhydroCéttation of the ester 16,17-cyclobora - yka -flvoo-l6uchydroxyhydrocortisone is realized in a; ¯mil: containing the following
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CtUul.e $ tcfrigercee 3% (weight / volume). rHPO4 0.05 JH -H0P.0 07 0.05 M sodium acetate 0.003 M
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myh 1; , 2.5, an additional 2 cells and 0.002 M sodium iodoqate were added).
The reaction is carried out in a total volume of 50 ml. of medium in a 25 0 re dIE.-lenmf ycr vial. The steroid is prepared by mixing 200 mg. of a mp-? langea 82% 9α-fluorol6or.hydroxyhydrocortiaone and 12tZi. of 9o (-fluoro-l6c4.hydrotyprodnisolone, 2.4 ml. of methanol and S 25 min., "of Nn2i40.1OH10 dissolved in 0.4 ml, of cr.u in a flask and heating 950 in a bath - boiling water. In about ', - qâminutea, "the material is dissolved and the enteric cycloborate -e mt ngc with 50 ml, of the medium described below, the pil ert
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set to 7.2 and the vial is placed on a device at 250.
Samples are taken for an a, na graph and the progression of the de8hYàrOcért4t10 t | l.l * B touts: '!!'
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Hardness 9oT-fluoro-16or-hydroxy- Triaotonf hydrocortisone JIBIWHÉé '3.5 hours 1.5 mg./ml. 2SE | l 12.5 hours 0.3 m./ml. 3> PSP 3 hours iiwl
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An analysis of the steroid consists of a sample acidified with methylieobutyl to extract the and, ', rolden, to etiromatotrapliier in a se m bcn7.one - (? & H!' Nol-enu or paper to separate the components. to elute the eonipoMantc and to determine the coneant: ati0r ï31- coraparûieon of absorption in the ultraviolet avoa d1 Dnnn a second oxpurienec carried out ', example 3, we convert 4 mg, of the cyclobordt ester M # .B f luoro .16 .hydroxylivr! Rocar tines in 3.4t! Mt;
. of tritrie. per ml, in 21 hours, '' fffisl In a similar manner, following such examples 1, 2 or 3, los entero cyclnborates dytdtsD zig another 1,17d-dihydroxy steroid of the 3-cdto "rA series ; precnene can be converted into their)) derivative 1cl;. t 36 11 should be understood that 1 'in ven t i- p | j limited to the details given but that many vartan ti n
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be prevuen ennr. to depart from the scope of this patent
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